Metabolic decision making by protein-metabolite - ETH E

 DISS. ETH NO. 23107 Metabolic decision making by protein-metabolite
interactions in Escherichia coli
A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich) presented by Karl Andreas Kochanowski
Dipl. Biol., RWTH Aachen, Germany born on 24.10.1983, citizen of Germany Accepted on the recommendation of:
Prof. Dr. Uwe Sauer, examiner
Prof. Dr. Matthias Heinemann, co-examiner
Prof. Dr. Martin Ackermann, co-examiner 2015 Abstract Abstract Metabolism lies at the core of microbial life and fuels all cellular activities with building blocks, reducing power, and energy. To regulate metabolic activity, microbes utilize a complex network of regulatory layers, such as transcriptional regulation, covalent posttranslational modifications, and allostery. Importantly, metabolism is not merely the endpoint of regulation, but can also provide feedback in form of metabolites that modulate the activity of regulatory proteins. However, how this complex interplay of regulatory layers and metabolic feedback ultimately gives rise to a coordinated metabolic response is currently only poorly understood. The aim of this thesis is to elucidate the role of protein‐metabolite interactions in making metabolic decisions in the model bacterium Escherichia coli. Specifically, we focus on protein‐metabolite interactions in two regulatory layers, namely transcriptional (chapters 2 to 5) and posttranslational (chapters 5 to 7) enzyme regulation. In chapter 2, we review our current understanding of the role of transcription in regulating microbial fluxes, focusing on central metabolism. We highlight recent works that investigated the impact of altering enzyme abundance, for example through perturbations of the transcriptional regulatory network, on central metabolic fluxes, and discuss the trade‐off between efficient metabolic operation in a given environment and resilience against inevitable internal and external fluctuations. In chapter 3, we develop a combined experimental‐computational approach to dissect the contribution of specific transcription factors and global transcriptional regulation to E. coli’s gene expression. Using the L‐arginine biosynthesis pathway as an example, we show that global transcriptional regulation sets each promoter’s maximal capacity in a largely growth‐dependent manner. Specific regulation then decides how much of this capacity is being used based on the current demand for the pathway’s end product. In chapter 4, we expand our analysis to quantify the impact of specific and global transcriptional regulation on central metabolic promoters. We find that global transcriptional regulation dominates the steady state response of many metabolic promoters, explaining about 70% of the total variance across various conditions. We further relate each promoter’s remaining specific transcriptional regulation with the cell’s metabolome response across the same conditions to identify metabolites which serve as potential regulatory signals. We show that few metabolites ‐ cyclic AMP, fructose‐1,6‐
bisphosphate (FBP) and fructose‐1‐phosphate (F1P) ‐ explain most of this specific regulation through their interaction with the transcription factors Crp and Cra. In chapter 5, we aim to unravel the regulatory mechanisms that coordinate E. coli’s metabolic response to nutrient limitation. By integrating E. coli’s steady state response to genetically implemented 4 Abstract limitation of external glucose supply and internal glutamate production in the framework of regulation analysis, we obtain a quantitative picture of the relationship between metabolic fluxes, metabolites, and proteins, at single reaction resolution. We find that this metabolic response is largely established by two mechanisms, namely an approximate transcriptional program, which rarely controls fluxes alone, as well as passive regulation of enzyme activity through changes in enzyme saturation. Surprisingly, this approximate program is implemented by a single transcription factor, Crp, that directly activates catabolic enzymes, and indirectly represses anabolic enzymes by sequestering the cellular resources available for their expression. In chapter 6, we review our current understanding of how microbial metabolism is shaped by posttranslational regulation, focusing on covalent posttranslational modifications and allosteric interactions. Recent technological advances have now made the systematic genome‐wide mapping of covalent posttranslational modifications possible. In contrast, a lack of analogous methods for the investigation of allosteric interactions remains a major obstacle in understanding their regulatory role. For both regulatory layers, the current key challenge is to identify those posttranslational regulatory events that are actually relevant in a given condition. In chapter 7, we develop an experimental in vitro approach to systematically identify protein‐
metabolite interactions. In a proof‐of‐concept study, we use ligand‐detected Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to identify metabolite binders of four well‐characterized proteins (AroG, Eno, PfkA, BSA) among mixtures comprising up to 33 metabolites. We retrieve most previously reported interactions, and identify several novel ones, such as promiscuous binding of nucleotide phosphates and citrate to all tested proteins, and binding of L‐tryptophan and L‐tyrosine to AroG. We functionally validate these novel interactions for AroG using in vitro enzymatic assays and find that both L‐
tryptophan and L‐tyrosine inhibit AroG activity. Finally, in chapter 8 we summarize the key findings in this thesis and conclude that metabolic decisions in E. coli emerge from a regulatory division‐of‐labor between transcriptional and posttranslational regulation. An approximate transcriptional program partitions the cellular resources based on information provided by few intracellular regulatory metabolites, such as FBP, cyclic AMP, and keto‐
acids, and uses only a small fraction of the cell’s repertoire of transcription factors in a given condition. To ultimately establish the metabolic response, additional posttranscriptional regulation is necessary. We envisage that the approaches and concepts developed in this thesis may allow to systematically identify and characterize novel regulatory metabolites in E. coli as well as other organisms, and may further help to guide efforts in the metabolic engineering of microbes. 5 Zusammenfassung Zusammenfassung Stoffwechsel spielt eine zentrale Rolle in Mikroorganismen und versorgt sie mit biosynthetischen Bausteinen, Reduktionsäquivalenten und Energie. Um ihren Stoffwechsel zu regulieren, können Zellen auf ein komplexes Netzwerk mit verschiedenen Regulationsebenen, wie zum Beispiel Transkription, posttranslationale Modifikationen und Allosterie, zurückgreifen. Dabei fungiert der mikrobielle Stoffwechsel nicht nur als regulatorischer Endpunkt, sondern kann auch selbst Informationen an das die anderen zellulären Netzwerke senden, beispielswiese in Form von Metaboliten, die die Aktivität von regulatorischen Proteinen verändern. Allerdings ist weitgehend unklar, wie Zellen basierend auf dieser Vielzahl an molekularen Interaktionen koordinierte metabolische Entscheidungen treffen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von Protein‐Metabolit Interaktionen in solchen metabolischen Entscheidungen am Beispiel des Modellbakteriums Escherichia coli aufzuschlüsseln. Insbesondere fokussieren wir uns auf zwei Regulationseben: Transkription (Kapitel 2 bis 5) und posttranslationale Regulation (Kapitel 5 bis 7). In Kapitel 2 fassen wir unser aktuelles Verständnis der Rolle von Transkription in der Regulation von mikrobiellen Stoffwechselflüssen. Hierbei fokussieren wir uns auf den Zentralstoffwechsel und beleuchten wichtige aktuelle Arbeiten, die den Effekt von Veränderungen in Enzymkonzentrationen, beispielsweise durch Perturbationen des Transkriptionsnetzwerks, untersuchten. Ausserdem schlagen wir vor, dass das transkriptionelle Regulationsprogramm womöglich einen Kompromiss zwischen effizienter metabolischer Aktivität in einer bestimmten Umgebung und der Robustheit gegenüber zwangsläufigen internen und externen Fluktuationen darstellt. In Kapitel 3 entwickeln wir eine neue Methode die es erlaubt, die regulatorischen Anteile spezifischer Transkriptionsfaktoren, sowie globaler transkriptioneller Regulation, an der Expression von Genen in E. coli getrennt voneinander zu quantifizieren. Wir nehmen den Biosyntheseweg der Aminosäure Arginin als Beispiel und zeigen, dass globale transkriptionelle Regulation die maximale Kapazität dieser Promotoren basierend auf der Wachstumsrate einstellt. Wieviel von dieser Kapazität die Zelle letztlich benutzt, wird durch spezifische transkriptionelle Regulation bestimmt und hängt vom aktuellen Bedarf am Stoffwechselendprodukt ab. In Kapitel 4 erweitern wir unseren Blickwinkel auf den gesamten Zentralstoffwechsel, um den Anteil spezifischer und globaler transkriptioneller Regulation zu bestimmen. Unsere Analysen zeigen dass globale transkriptionelle Regulation einen dominierenden Einfluss auf viele Promotoren hat und etwa 70% aller gemessenen Veränderungen in einer Vielzahl an Bedingungen erklären kann. Zudem identifizieren wir Metabolite die als potentielle regulatorische Signale wirken können, indem wir sie systematisch gegen die spezifische Regulationskomponente jedes Promotors testen. Wir zeigen dass 6 Zusammenfassung drei Metabolite – zyklisches AMP, Fruktose‐1,6‐Bisphosphat (FBP) und Fruktose‐1‐Phosphat (F1P) ausreichen, um den Grossteil dieser spezifischen Regulation zu erklären. In Kapitel 5 untersuchen wir die Mechanismen, die die metabolische Antwort von E. coli auf Nährstofflimitierung koordinieren. Indem wir die stationäre Antwort auf genetisch implementierte Limitierung der Glukoseaufnahme und Glutamatproduktion mittels integrierter Regulationsanalyse untersuchen, erhalten wir ein quantitatives Abbild des Wechselspiels zwischen Stoffwechselflüssen, Proteinen und Metaboliten für jede einzelne Reaktion. Wir zeigen dass E. colis metabolische Antwort weitgehend durch eine Kombination aus einem ungenauen transkriptionellen Regulationsprogramm, sowie passiver Regulation der Enzymsättigung beeinflusst wird. Interessanterweise wird dieses ungenaue Regulationsprogramm durch einen einzelnen Transkriptionsfaktor, Crp, umgesetzt, der direkt katabolische Enzyme induziert, und zudem auf indirekte Weise auch die Konzentration anabolischer Enzyme reduziert, in dem er die verfügbaren zellulären Ressourcen für ihre Expression beschränkt. In Kapitel 6 fassen wir unser Verständnis des Effekts posttranslationaler Regulation auf den mikrobiellen Stoffwechsel zusammen, mit Fokus auf kovalente posttranslationale Modifikationen und Allosterie. Während technologische Fortschritte es uns jetzt ermöglichen, posttranslationale Modifikationen genomweit zu kartieren, herrscht immer noch Mangel an entsprechenden Methoden für die Kartierung allosterischer Interaktionen. In beiden Fällen liegt die Herausforderung im Moment darin, herauszufinden, welche der beobachteten Modifikationen/Interaktionen tatsächlich relevant sind in einer bestimmten Umgebung. In Kapitel 7 entwickeln wir einen experimentellen in vitro Ansatz, um Protein‐Metabolit Interaktionen systematisch aufzuspüren. In dieser Konzeptstudie benutzen wir Kernspinresonanzspektroskopie, um für vier bereits gut charakterisierte Proteine (AroG, Eno, PfkA, BSA) aus einer Mischung aus bis zu 33 Metaboliten diejenigen zu identifizieren, die an die Proteine binden. Wir können die Mehrzahl bereits bekannter Interaktionen wiederfinden, und finden zudem mehrere neue, beispielsweise die unspezifische Bindung von Nukleotidphosphaten und Citrat, sowie die spezifische Bindung von Tryptophan und Tyrosin an AroG. Wir nutzen Enzymassays, um diese neuen Interaktionen für AroG funktionell zu validieren, und zeigen dass sowohl Tryptophan als auch Tyrosin AroG inhibieren. Im abschliessenden Kapitel 8 fassen wir die Ergebnisse dieser Arbeit zusammen und schlussfolgern dass E. colis metabolische Entscheidungen weitgehend das Ergebnis einer regulatorischen Arbeitsteilung zwischen Transkription und posttranslationaler Regulation sind. Ein ungenaues Transkriptionsprogramm teilt die zellulären Ressourcen basierend auf wenigen internen Metabolitsignalen, wie zum FBP, zyklisches AMP, und Ketosäuren, ein, und nutzt nur einen Bruchteil 7 Zusammenfassung der verfügbaren Transkriptionsfaktoren in einer Bedingung. Um letzten Endes eine metabolische Antwort zu bestimmen, ist zusätzliche posttranslationale Regulation nötig. Die Erkenntnisse und Methoden in dieser Arbeit könnten in Zukunft dazu verwendet werden, systematisch neue regulatorische Metabolite in E. coli und anderen Organismen zu finden und charakterisieren. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse Anwendung in zukünftigen biotechnologischen Arbeiten finden. 8