Doppelmarkierung im CISH: Her2 und Topo2A

Doppelmarkierung im CISH
Her2 und Topo2A
Sonja Urdl und Sigurd Lax
Institut für Pathologie
LKH Graz West
[email protected]; [email protected]
In Situ Hybridisierung (ISH)
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Molekularbiologische Methode, zum Nachweis
einer bekannten Sequenz von Nukleinsäuren
(RNA oder DNA), in Geweben, einzelnen Zellen
oder auf Metaphase-Chromosomen
Einsatz einer künstlich hergestellten Sonde mit
komplementärer Nukleinsäuresequenz
Diese wird an den nachzuweisenden Genabschnitt
hybridisiert
FISH/CISH/SISH
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FISH: Fluoreszenz In Situ Hybridisierung
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CISH: Chromogen In Situ Hybridisierung
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Detektion mittels Fluorochrom
Detektion mittels Chromogen wie bei
Immunhistochemie
SISH: Silber In Situ Hybridisierung
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Detektion mittels Versilberung
Topoisomerase IIα (Topo 2A)
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Gen: Top2A
Protein: TopoIIα
Lokalisiert auf Chromosom 17 in
unmittelbarer Nachbarschaft zu
Her2/neu
Schlüsselrolle im DNAStoffwechsel (Vorbereitung der
Transkription)
Molekulares Target für Topo2
Inhibitoren – Anthrazykline z.B.
Epirubicin und Doxorubicin
17q21.1 – Her2
17q21.3 – TOP2A
Her2/neu
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Gen: Her2, erb-B2, c-erbB2,
Her2/neu
Protein: HER2
Lokalisiert auf Chromosom 17 in
unmittelbarer Nachbarschaft zu
Top2A
Wachstumsrezeptor
Molekulares Target für Herceptin
(Trastuzumab)
17q21.1 – Her2
17q21.3 – TOP2A
Wozu Her2/neu–ISH?
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Nachweis einer Genamplifikation
Voraussetzung für Herceptintherapie
Meist Anwendung in Kombination mit
Immunhistochemie (A, D, USA)
Untersuchung aller Fälle mit
immunhistochemischem Score 2+
Qualitätssicherung für Her2/neu Immunhistochemie
Wozu Topo2A–ISH?
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Nachweis von Amplifikation bzw. Deletion
Verbessertes Ansprechen auf Chemotherapie
(Anthrazykline) bei Top2A Amplifikation
schlechte Übereinstimmung von Topo2A-ISH
und -IHC, daher eher nur ISH eingesetzt
Häufige aber nicht obligate Assoziation mit
Her2/neu Amplifikation
Top2A Alteration: möglicher prädiktiver und
prognostischer Faktor
Dako DuoCISHTM
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Markiert werden Gen (Her2 bzw. Top2A) und
Zentromer mit 2 verschiedenen Sonden
chromogene Zweifarbendarstellung (rot und
blau) jener Signale, die von Dako Texas-Red und
FITC markierten FISH Sonden ausgehen
Nachweis von Amplifikationen, Deletionen und
Translokationen
Dako DuoCISHTM
Tag 1
FISH
Denaturierung &
Hybridisierung
Hybridisierung von TexasRed und FITC markierten
FISH-Sonden
Tag 2
CISH
am Autostainer
Inkubation mit CISH
Antikörpermix (Anti-TexasRed/AP und Anti-FITC/HRP)
Tag X
Auswertung
40x
Inkubation mit Red-, danach
mit Blue-Chromogen-Lösung
Dako DuoCISHTM Protokoll: Tag 1
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Reagenzienvorbereitung:
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Entparaffinierungsreihe frisch richten: 2x Xylol, je 1x
Äthanol (96%, 85%, 70%)
Pre-Treatment-Solution verdünnen (x20), in
Wasserbad (98°C) einstellen
Waschpuffer verdünnen (x20), RT
Stringent Wash Buffer verdünnen (x20), bei 2-8°C
aufbewahren (für den 2. Tag)
Hybridizer auf 37°C einstellen
Dako DuoCISHTM Protokoll: Tag 1
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Entparaffinierung und Rehydrierung
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Vorbehandlung im Wasserbad (95-99°C): 10 min.
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Enzymatische Vorbehandlung mit Pepsin: 2 min.
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Dehydrierung: Ethanol (70%, 85%, 96%)
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Aufbringen der Her2/CEN-17 bzw.
TOP2A/CEN-17 Sonden
Denaturierung und Hybridisierung im Hybridizer
Dako DuoCISHTM Protokoll: Tag 2
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Reagenzienvorbereitung:
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Stringent Wash Buffer: 1 Küvette ins Wasserbad
(66°C) stellen, 1 Küvette bei RT belassen
Waschpuffer S3006 für Autostainer verdünnen (10x)
Blue-Chromogen-Lösung richten
Hematoxylin S3301 verdünnen (10x)
Achtung: Red-Chromogen-Lösung erst
unmittelbar vor Gebrauch richten
Dako DuoCISHTM Protokoll: Tag 2
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Stringentes Waschen
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Schnitte in stringentem Waschpuffer bei RT einstellen
– Deckgläser schwimmen ab
Schnitte in stringentem Waschpuffer bei 65°C 10 min.
inkubieren
Autostainer Färbelauf
Trocknen im Hybridizer: 37°C, 30 min.
Eindeckeln
Auszählung im Lichtmikroskop
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20 Zellkerne aus eindeutigen Tumorbereichen
Bestimmung der Ratio: Her2/CEN-17 oder
Top2A/CEN-17
Ratio ≥ 2,2: Amplifikation
Ratio ≤ 1,8: keine Amplifikation
Cut-off-Wert 1,8 – 2,2: Auszählung weiterer 20
Zellkerne
Her2/neu
Topo2A
Topo2A
Richtlinien für die Auszählung im
Genamplifikationsassay
1
2
3
4
5
6
7
8
Keine Zählung. Zellkerne überlappen, nicht alle Zellkernbereiche sind sichtbar.
Es werden 3 blaue und 12 rote Signale gezählt (Schätzung bei Cluster)
Es werden 2 blaue Signale und 1 rotes Signal gezählt. Signale, die mehr als einen
Entstehungspunkt haben, werden als zwei Signale gezählt.
Keine Zählung (zu stark angedaute Zellkerne)
Es werden 2 blaue und 5 rote Signale gezählt. Signale, die mehr als einen
Entstehungspunkt haben, werden als zwei Signale gezählt.
Es werden 1 blaues Signal und 5 rote Signale gezählt.
Es werden 3 blaue Signale (1 blaues ist unscharf) und 3 rote Signale gezählt.
Ein Cluster von roten Signalen, die blauen Signale überdecken. Eine höhere
Vergrößerung einstellen, um das Vorhandensein oder Fehlen von blauen Signalen zu
bestätigen. Falls Zweifel bestehen, nicht mitzählen.
Vergleich FISH und CISH
CISH
FISH
Goldstandard, Grundlage für klinisches
Management
Neue Methode, keine klinischen Daten
Lagerung der OT im Dunkeln bei -20 C
Lagerung der OT bei RT
Abdunkeln des Arbeitsplatzes beim
Arbeiten mit dem Sondenmix und DAPI
Kein Abdunkeln des Arbeitsplatzes
Fluoreszenzmikroskop
Lichtmikroskop
Morphologie: verändert gegenüber HE,
Orientierung eingeschränkt
Gut erhaltene Morphologie – gute
Orientierung im Präparat
Große, sich überlagernde Signale, werden
nicht erkannt
Gute Einzelsignalauswertung (Filter)
Standardisierte Auswertung (CAP)
Auswertung wie FISH
Fazit
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Dako DuoCISHTM ist machbar und relativ einfach
Aufwand (zeitlich/technisch) entspricht FISH
Auswertung bequem (Lichtmikroskop)
Problemlose Archivierung (wie IHC)
Begrenzte Erfahrung betreffend Grenzfälle
Zunehmende klinische Bedeutung von Topo2A
FIS(C)H und C(QU)IS(C)H(E)
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit !