Malatdehydrogenasen unterschiedlicher Her kunft

783
NOTIZEN
Stoffe aufgefunden. Bei diesen handelt es sich weit­
gehend um natürlich vorkommende Verbindungen und
Stoffwechselprodukte. Zur Aufarbeitung wurden die
Bananen der Sorte Gros Michel, etwa 10 Tage nach
dem Maximum der Atmung (Lagertemperatur + 1 5 °C ),
was einem Maximum gewisser Aromakomponenten ent­
spricht, mit Methanol homogenisiert. Der Preßsaft des
Homogenats wurde mit Pentan/Methylenchlorid (2/1)
extrahiert und nach schonendem Einengen die Kompo­
nenten auf verschiedenen Trennsäulen präparativ
angereichert. Die weitere Trennung und Identifizierung
erfolgte auf Mikropack bzw. Kapillarsäulen teilweise
in Kopplung mit einem Massenspektrometer. Zusätz­
liche Identifizierung wurde durch Retentionsvergleiche,
chemische Ausscheidungsanalyse und IR-Mikrotechnik
erzielt.
Von den bisher ca. 350 gaschromatographisch ge­
trennten Komponenten konnten die angegebenen 183
Verbindungen identifiziert werden.
Möglicherweise sind einige Methylester auf die Auf­
arbeitung mit Methanol zurückzuführen.
M alatdehydrogenasen unterschiedlicher H er­
kunft: Hem m ung durch Thyroxin
sondern auf der unterschiedlichen Konzentration der
Begleitproteine. In Fig. 1 sind die Konzentrationen an
DL-Thyroxin, die für 50% Hemmung des Enzyms aus
Flußkrebs- und Säuger-Präparationen benötigt wer-
K . G r a s z y n s k i , D. S i e b e r s , I. T o f a u t e u n d I. B r u n n e r
If. Zoologisches Institut. Freie U niversität Berlin
(Z. Naturforschg. 24 b, 783— 784 [1969] ; eingegangen am 13. März 1969)
S c h w e in e h e rz -M a la td e h y d ro g e n a se w ird du rch L-Thyroxin w eit s tä rk e r g e h e m m t a ls a n d e re D e h y d ro g en a se n
u n d zw ar b e re its b e i p h y sio lo g isch e n T h yroxin-K onzentra tio n e n 1. Im H in b lic k a u f d ie A n n a h m e , d aß d ies eine
P rim ä rw irk u n g des H o rm o n s a u f d en Stoffw echsel d a r ­
ste llt, scheinen u n s d ie fo lg e n d e n B eo b ac h tu n g e n a n
M a la td e h y d ro g e n a se n u n te rsc h ie d lic h e r H e rk u n ft in te r­
e ssa n t.
Die Enzympräparationen wurden folgendermaßen
gewonnen: Homogenisiert in 0 , 2 5 m Rohrzucker mit
P o t t e r - E l v e j h e m - Homogenisator mit TeflonStempel, zentrifugiert 30 min bei 20 000 g, im Über­
stand das Enzym mit Ammonsulfat (50 — 65 % Sätti­
gung) gefällt, 20 000 g-Partikelfraktion („Mitochondrien“) gewaschen, mit Messerhomogenisator (UltraTurrax) in 0,05 M Phosphatpuffer extrahiert, zentrifu­
giert, Enzym gefällt mit Ammonsulfat (50 — 65 % Sät­
tigung) . Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit 20
bis 40 sec nach Start in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0
bei 25 C. Bei Präparationen aus dem Flußkrebs Orconectes limosus erhielten wir so folgende spezifische Ak­
tivitäten (//Mol/mg Protein • min) : 6,5 (Schwanzmuskel-Überstand) ; 12,0 (Schwanzmuskel-Mitochondrien) ;
260 (Herz-Mitochondrien) ; gegenüber dem Gesamthomogenat Reinigungen um den Faktor 6 (Schwanzmuskel-Überstand) bis 20 (Herz-Mitochondrien). Nach
10 min Präinkubation1 hemmten 3 — 10 • 10-5 M DLThyroxin die Malatdehydrogenase aus Gesamthomogenaten (Ammonsulfatfällung 30 — 65 % Sättigung)
von Apis mellifica, Chironomus-Larven, OrconectesSchwanzmuskel, Tubifex und Spinatblättern um 15 bis
40 Prozent. Im L i n e w e a v e r - B u r k - Plot erwies
sich diese Hemmung als gemischt bis kompetitiv. Die
bei diesen Enzympräparationen benötigten ThyroxinKonzentrationen liegen weit über denen, die für die
MDH aus Schweineherz benötigt werden x. Dies beruht
jedoch nicht auf einem Unterschied in den Enzymen,
1 J. W o l f f and E. C. W o l f f ,
[Am sterdam ] 26, 387 [1957].
Biochim. biophysica Acta
P ro te in k o n z e n tra tio n [/x g /m l ] — ►
Abb. 1. A bhängigkeit der für 50% Hem mung der M alat­
dehydrogenase benötigten K onzentration DL-Thyroxin von der
Proteinkonzentration im Ansatz. Enzym präparationen aus:
o K rebsherz-M itochondrien; • Schweineherz-M itochondrien;
A K rebssdiw anzm uskel-M itochondrien; □ Krebsschwanzm uskel-Ü berstand; ■ R attenskelettm uskel-Ü berstand.
den, aufgetragen gegen die Proteinkonzentration. Im
Bereich von 0,026 bis 20 /ug Protein/ml erhält man für
alle Enzympräparationen gemeinsam eine Gerade. Die
berechnete Ausgleichsgerade schneidet die Ordinate bei
3 -1 0 ” 6 m, dieser Schnittpunkt ist jedoch nicht signifi­
kant von 0 verschieden. Aus der Tatsache, daß sich
mit Werten von Säugerenzymen und Krebsenzymen
eine gemeinsame Gerade ergibt, schließen wir, daß die
Krebs-MDH die gleiche Empfindlichkeit gegen Thyr­
oxin besitzt wie die MDH von Säugern. Bei einigen
Proteinkonzentrationen bestimmten wir im Diagramm
[l/v] gegen [I] mit verschiedenen Substratkonzentra­
tionen die scheinbaren Hemmkonstanten für DL-Thyr­
oxin. Diese liegen bei 0,14 /ug Protein/ml (Schweine­
herz-Mitochondrien) in guter Übersteinstimmung mit
I . e . 1 bei 1 ,5 - 1 0 ~ 6 m ; mit 0,93 //g Protein/ml jedoch
bei 6 -IO- 6 (Krebs-Herzmitochondrien und KrebsSchwanzmuskel-Mitochondrien) ; mit 0,026 //g Protein/
ml bei nur 1 - 1 0 ~ 6 m (Krebsherz-Mitochondrien). Die
hohe Affinität der Begleitproteine zu Thyroxin, und
die dagegen offenbar nicht bedeutend höhere Affinität
des Enzyms zum Hormon scheint uns gegen eine spe­
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 1:26 PM
783
NOTIZEN
Stoffe aufgefunden. Bei diesen handelt es sich weit­
gehend um natürlich vorkommende Verbindungen und
Stoffwechselprodukte. Zur Aufarbeitung wurden die
Bananen der Sorte Gros Michel, etwa 10 Tage nach
dem Maximum der Atmung (Lagertemperatur + 1 5 °C ),
was einem Maximum gewisser Aromakomponenten ent­
spricht, mit Methanol homogenisiert. Der Preßsaft des
Homogenats wurde mit Pentan/Methylenchlorid (2/1)
extrahiert und nach schonendem Einengen die Kompo­
nenten auf verschiedenen Trennsäulen präparativ
angereichert. Die weitere Trennung und Identifizierung
erfolgte auf Mikropack bzw. Kapillarsäulen teilweise
in Kopplung mit einem Massenspektrometer. Zusätz­
liche Identifizierung wurde durch Retentionsvergleiche,
chemische Ausscheidungsanalyse und IR-Mikrotechnik
erzielt.
Von den bisher ca. 350 gaschromatographisch ge­
trennten Komponenten konnten die angegebenen 183
Verbindungen identifiziert werden.
Möglicherweise sind einige Methylester auf die Auf­
arbeitung mit Methanol zurückzuführen.
M alatdehydrogenasen unterschiedlicher H er­
kunft: Hem m ung durch Thyroxin
sondern auf der unterschiedlichen Konzentration der
Begleitproteine. In Fig. 1 sind die Konzentrationen an
DL-Thyroxin, die für 50% Hemmung des Enzyms aus
Flußkrebs- und Säuger-Präparationen benötigt wer-
K . G r a s z y n s k i , D. S i e b e r s , I. T o f a u t e u n d I. B r u n n e r
If. Zoologisches Institut. Freie U niversität Berlin
(Z. Naturforschg. 24 b, 783— 784 [1969] ; eingegangen am 13. März 1969)
S c h w e in e h e rz -M a la td e h y d ro g e n a se w ird du rch L-Thyroxin w eit s tä rk e r g e h e m m t a ls a n d e re D e h y d ro g en a se n
u n d zw ar b e re its b e i p h y sio lo g isch e n T h yroxin-K onzentra tio n e n 1. Im H in b lic k a u f d ie A n n a h m e , d aß d ies eine
P rim ä rw irk u n g des H o rm o n s a u f d en Stoffw echsel d a r ­
ste llt, scheinen u n s d ie fo lg e n d e n B eo b ac h tu n g e n a n
M a la td e h y d ro g e n a se n u n te rsc h ie d lic h e r H e rk u n ft in te r­
e ssa n t.
Die Enzympräparationen wurden folgendermaßen
gewonnen: Homogenisiert in 0 , 2 5 m Rohrzucker mit
P o t t e r - E l v e j h e m - Homogenisator mit TeflonStempel, zentrifugiert 30 min bei 20 000 g, im Über­
stand das Enzym mit Ammonsulfat (50 — 65 % Sätti­
gung) gefällt, 20 000 g-Partikelfraktion („Mitochondrien“) gewaschen, mit Messerhomogenisator (UltraTurrax) in 0,05 M Phosphatpuffer extrahiert, zentrifu­
giert, Enzym gefällt mit Ammonsulfat (50 — 65 % Sät­
tigung) . Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit 20
bis 40 sec nach Start in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0
bei 25 C. Bei Präparationen aus dem Flußkrebs Orconectes limosus erhielten wir so folgende spezifische Ak­
tivitäten (//Mol/mg Protein • min) : 6,5 (Schwanzmuskel-Überstand) ; 12,0 (Schwanzmuskel-Mitochondrien) ;
260 (Herz-Mitochondrien) ; gegenüber dem Gesamthomogenat Reinigungen um den Faktor 6 (Schwanzmuskel-Überstand) bis 20 (Herz-Mitochondrien). Nach
10 min Präinkubation1 hemmten 3 — 10 • 10-5 M DLThyroxin die Malatdehydrogenase aus Gesamthomogenaten (Ammonsulfatfällung 30 — 65 % Sättigung)
von Apis mellifica, Chironomus-Larven, OrconectesSchwanzmuskel, Tubifex und Spinatblättern um 15 bis
40 Prozent. Im L i n e w e a v e r - B u r k - Plot erwies
sich diese Hemmung als gemischt bis kompetitiv. Die
bei diesen Enzympräparationen benötigten ThyroxinKonzentrationen liegen weit über denen, die für die
MDH aus Schweineherz benötigt werden x. Dies beruht
jedoch nicht auf einem Unterschied in den Enzymen,
1 J. W o l f f and E. C. W o l f f ,
[Am sterdam ] 26, 387 [1957].
Biochim. biophysica Acta
P ro te in k o n z e n tra tio n [/x g /m l ] — ►
Abb. 1. A bhängigkeit der für 50% Hem mung der M alat­
dehydrogenase benötigten K onzentration DL-Thyroxin von der
Proteinkonzentration im Ansatz. Enzym präparationen aus:
o K rebsherz-M itochondrien; • Schweineherz-M itochondrien;
A K rebssdiw anzm uskel-M itochondrien; □ Krebsschwanzm uskel-Ü berstand; ■ R attenskelettm uskel-Ü berstand.
den, aufgetragen gegen die Proteinkonzentration. Im
Bereich von 0,026 bis 20 /ug Protein/ml erhält man für
alle Enzympräparationen gemeinsam eine Gerade. Die
berechnete Ausgleichsgerade schneidet die Ordinate bei
3 -1 0 ” 6 m, dieser Schnittpunkt ist jedoch nicht signifi­
kant von 0 verschieden. Aus der Tatsache, daß sich
mit Werten von Säugerenzymen und Krebsenzymen
eine gemeinsame Gerade ergibt, schließen wir, daß die
Krebs-MDH die gleiche Empfindlichkeit gegen Thyr­
oxin besitzt wie die MDH von Säugern. Bei einigen
Proteinkonzentrationen bestimmten wir im Diagramm
[l/v] gegen [I] mit verschiedenen Substratkonzentra­
tionen die scheinbaren Hemmkonstanten für DL-Thyr­
oxin. Diese liegen bei 0,14 /ug Protein/ml (Schweine­
herz-Mitochondrien) in guter Übersteinstimmung mit
I . e . 1 bei 1 ,5 - 1 0 ~ 6 m ; mit 0,93 //g Protein/ml jedoch
bei 6 -IO- 6 (Krebs-Herzmitochondrien und KrebsSchwanzmuskel-Mitochondrien) ; mit 0,026 //g Protein/
ml bei nur 1 - 1 0 ~ 6 m (Krebsherz-Mitochondrien). Die
hohe Affinität der Begleitproteine zu Thyroxin, und
die dagegen offenbar nicht bedeutend höhere Affinität
des Enzyms zum Hormon scheint uns gegen eine spe­
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 1:26 PM
785
NOTIZEN
3.4-tetrahydronaphthylessigsäureäthylester (4) in 62%
Ausbeute (Schmp. 74 —76" aus Äther/Petroläther). Da
eine Dehydrierung von 4 mit Palladium/Kohle keine
definierten Produkte lieferte, wurde 4 zunächst durch
5 Min. Erhitzen in wasserfreier Ameisensäure bei 100°
dehydratisiert und das aus zwei, sich wahrscheinlich in
der Lage der neu entstandenen Doppelbindung unter­
scheidenden Verbindungen bestehende Reaktionspro­
dukt durch 1-stdg. Erhitzen mit Schwefel auf 200 —210°
dehvdriert. Die Ausbeute an 5-Acetoxy-6-methoxy-lnaphthvlessigsäureäthylester (5) (Schmp. 98° aus
Äther/Petroläther) betrug nach Reinigung des Reak­
tionsgemisches durch präparative Schichtchromatogra­
phie in Benzol/Methanol 95:5 48% der Theorie. Die
Verbindung zeigte folgendes UV-Spektrum: Amax
(log f) 230 nm (4,70), 273 nm (3,71), 284 nm (3,74),
299 nm (3,65), 323 nm (3,29) und 336 nm (3,35). 5
wurde durch 2-stdg. Erhitzen auf 80° in 2 N Natron­
lauge unter Stickstoff zur 5-Hydroxy-6-methoxy-l-naphthylessigsäure (6) verseift. Die aus Äther/Petroläther
in farblosen Nadeln (Schmp. 203 —205°) kristallisie­
rende Säure färbte sich an der Luft bald braun.
6
erwies sich bei der Dünnschichtchromatographie in
Benzol/Aceton, Methanol/Eisessig 90:5:2:2 mit Rf =
0,33 als deutlich verschieden von der 5-Hydroxy-lnaphthylessigsäure (Rf = 0,27) 6 konnte also nicht das
vermutete zweite Stoffwechselprodukt sein, da das da­
mals untersuchte Produkt chromatographisch einheitlich
war.
Da mit dem in 1. c. 2 erwähnten UV-Spektrum auch
die
5.6-Dihydroxy-l-naphthylessigsäure
vereinbar
schien, wurde sie ebenfalls synthetisiert. Aus 2.3-Dimethoxyhydrozimtsäure5 wurde wie bei 2 angegeben
die y- (2.3-Dimethoxyphenyl) -buttersäure dargestellt
(Ausb. 86%, Schmp. 60°) und diese wie vorher über
das Säurechlorid mit SnCl4 in das 5.6-Dimethoxy-l5 H. v. K r a n n i c h f e l d t ,
[1913],
Ber. dtsch. chem. Ges. 46, 4023
tetralon übergeführt (Ausb. 97%, Schmp. 105° aus
Äther/Petroläther). R e f o r m a t z k i - Reaktion und
direkte Dehydrierung mit Palladium/Aktivkohle bei
300° unter C 0 2 ergab nach Reinigung des Reaktions­
produktes durch präparative Schichtchromatographie
in Benzol/Methanol 99:1 und alkalischer Verseifung
des öligen Athylesters die 5.6-Dimethoxy-l-naphthvlessigsäure in 45% Ausbeute (Schmp. 123 —125° aus
Äther/Petroläther). UV-Spektrum: Amax (löge) 233
nm (4,72), 288 nm (3,74), 299 nm (3,71, 327 nm
(3,38) und 338 nm (3,40). Abspaltung der Methyl­
gruppen durch 2-stdg. Erhitzen mit 22-proz. HBr in
50-proz. Essigsäure auf 110° ergab die 5.6-Dihydroxy1-naphthylessigsäure (Schmp. 205 —208°) in 50% Aus­
beute.
Auch diese Säure erwies sich bei der Dünnschicht­
chromatographie mit 7?/ = 0,15 in dem o.a. System als
verschieden von dem Hauptstoffwechselprodukt.
Wir untersuchten deshalb eine neu aus Weizenkeim­
lingen isolierte Probe der 5-Hydroxy-l-naphthvlessigsäure im Massenspektrometer. Außer den Massenpeaks
der synthetisch hergestellten Vergleichsprobe (MolekülIn m/e 202) trat nur eine sehr schwache Gruppe von
peaks bei m/e 502 auf, für die keine Erklärung gege­
ben werden kann. Zwischen diesen peaks und m/e 502
konten keine weiteren Ionen beobachtet werden, so daß
eine weitere Substitution der 5-Hydroxysäure durch ein­
fache Sauerstoff-Funktionen unwahrscheinlich ist.
Alle neu synthetisierten Verbindungen wurden
durch Elementaranalyse sowie durch IR- und NMRSpektren charakterisiert. In allen Fällen wurde die mit
der Summenformel übereinstimmende Zusammen­
setzung gefunden und konnten die auf Grund der an­
gegebenen Strukturen zu erwartenden Absorptionen
beobachtet werden.
Der eine von uns (V. U. A.) dankt dem DAAD für ein Sti­
pendium. H errn Dr. H.-D. K l ä m b t danken wir für die Isolie­
rung der 5-Hydroxy-l-naphthylessigsäure, H errn Dr. H.-W.
F e h l h a b e r für die Aufnahme des M assenspektrum s.
Die großen Internodienzellen der Süßwasseralge
Nitella flexilis zeigen wie Nervenfasern als Folge eines
Reizes (elektrischer Strom, mechanische Beanspruchung,
Licht, Bestrahlung u. a.) Aktionspotentiale. Die Ruhe­
spannung ist bei beiden Objekten eine Kaliumdiffu-
sions-Spannung, jedoch besteht ein Unterschied außer
im Zeitmaßstab darin, daß das Aktionspotential bei den
Algenzellen nicht auf einen Einstrom von Na®-Ionen,
sondern auf einen Ausstrom von CI6 -Ionen zurückzu­
führen ist 11 2.
Insofern erscheinen die Ergebnisse der Untersuchun­
gen bemerkenswert, die in Abb. 1 dargestellt sind. Die
Lokalanästhetika Xylocain (0,04%), Butacain (0,08%)
und Baycain (0,08%) beeinflussen den Erregungs­
medianismus bei den angegebenen Konzentrationen in
der Badflüssigkeit bei Nitella in ähnlicher Weise wie
den der Nervenfaser. Abb. 1 a zeigt, daß die genannten
Lokalanästhetika den temporären Einwärtsstrom, der
bei Nitella von Anionen getragen wird, ähnlich dem
der Nervenfaser, der von Kationen getragen wird, ver-
1 C. T. G a f f e y and L. J.
505 [1958].
2 A. B. H o p e and G. P.
377 [1964],
W irkung einiger L okalanästhetika auf IS itella
O tto -E r ic h
S c h u ltz
Pharm azeutisches Institut, U niversität Kiel
U lf - P e t e r H a n se n und K u r t V a n s e lo w
Institut für Angewandte Physik, Universität Kiel
(D ir.: Prof. Dr. W. K r o e b e l )
(Z. Naturforschg. 24 b, 785—786 [1969] ; eingegangen am 1. A pril 1969)
M u l l in s,
J. Physiol. [London] 144,
F in d l a y ,
Pland & Cell Physiol. 5,
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 1:26 PM