Klin. Pädiatr. 200 (1988) Bilirubinbestimmungen mit einer direkten photometrischen Methode im Kapillarplasma (DPM, Bilirubinometer) und mit einer chemischen Bilirubinbestimmung (DPD-Methode) im Serum von venösen Blutproben H. Schlebusch l , N. Liappis2 , M. Niesen l 'Universitäts-Frauenklinik Bonn (Direktor: Prof. Dr. D. Krebs) 'Universitäts-Kinderklinik Bonn (Direktor: Prof. Dr. W. Burmeister) Zusammenfassung Die Bestimmung der Bilirubinkonzentration im Serum erfolgte mit der 2,5-Dichlorphenyldiazonium-(DPD)-Methode und im KapiIIarplasma mit der direkten photometrischen Methode (DPM). Beide Methoden zeigten eine gute Präzision und Richtigkeit. Als Untersuchungsmaterial dienten 135 Proben mit einer Bilirubinkonzentration bis 25 mg/dl. Bei 62 untersuchten Proben mit einer Bilirubinkonzentration bis 10 mg/dl ergab der Vergleich der DPD- und DPM-Methode einen Korrelationskoeffizienten r = 0,862 und bei 73 Proben mit einer Bilirubinkonzentration zwischen 10 und 25 mg/dl einen Korrelationskoeffizienten r=0,893. Bei 29 Vergleichen (21,5%) wurden Unterschiede zwischen 1,5 und 4,0 mg/dl, die hauptsächlich (n = 20) im kritischen höheren Konzentrationsbereich lagen festgestellt. Diskussion der Methoden DPD und DPM. Determinitation of Bilirubin with a Direct Photometrie Method (DPM, Bilirubinometer) in Capillary Plasma and a Chemieal Method (DPD method) in Serum of Venous Blood The determination of bilirubin in serum was perfonned by the 2.5-dichlorphenyldiazonium method (DPD) and in capillary plasma by the direct photometrie method (DPM). Both methods showed a good precision and accuracy. The investigation was carried out in 135 sampIes with a bilirubin concentration up to 25 mg/dl. The comparison of the two methods in 62 sampIes with a bilirubin concentration up to 10 mg/dl showed a correlation coefficient of r = 0.862 and in 73 sampIes with a bilirubin concentration between 10 and 25 mg/dl a correlation coefficient of r=0.893. In 29 cases (21.5%) we found differences be- Klin. Pädiat. 200 (1988) 330-334 © 1988 F. Enke Verlag Stuttgart tween the two methods of 1.5-4.0 mg/dl. Most ofthem were in the critical higher range. Discussion of the DPD and DPM methods. Die sichere Diagnose und Differentialdiagnose der Neugeborenengelbsucht (1, 2) erfordert eine präzise und richtige Bestimmung der Gesamtbilirubinkonzentration im Serum. Hierfür stehen mehrere Verfahren zu Verfügung (3). Kupplung mit Diazoniumsalzen. Bilirubin reagiert mit verschiedenen Diazoniumsalzen unter Bildung farbiger Azoverbindungen. Der größte Teil des Serumbilirubins kuppelt erst nach Zusatz eines Accelerators (z. B. Coffein, Diphyllin u. a.); diese Fraktion entspricht wahrscheinlich dem unkonjugierten Bilirubin (BilirubinAlbumin- Komplex). Hier haben sich zwei Modifikationen durchgesetzt. Jendrassik und GrM (4) verwenden Benzoldiazoniumsulfat als Kupplungsreagens und Coffein und Natriumbenzoat als Accelerator. Der entstandene rote Farbstoff wird vor der Messung durch Zusatz von alkalischer Tartratlösung in ein blaugrünes Produkt überführt. Bei der DPD-Methode (5) wird mit 2,5Dichlorbenzoldiazoniumchlorid unter Verwendung von Detergenzien als Accelerator gearbeitet. Wegen der Stabilität der Diazoverbindung hat die Methode gegenüber der Jendrassik-GrM-Methode erhebliche arbeitstechnische Vorteile. Weiterhin werden physikalische Methoden zur Bilirubinbestimmung im Serum von Neugeborenen eingesetzt. Im Vordergrund steht hier die Absorptionsphotometrie des Bilirubins. Da das Serum Neugeborener keine Lipochrome wie Carotin oder Xanthophyllester enthält, ist die Absorption des Serums im Maximum bei 461 nm der Bilirubinkonzentration proportional. Um die spektrale Interferenz von Hämoglobin zu berücksichti- Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 330 Bilirubinbestimmungen mit einer direkten photometrischen Methode im Kapillarplasma Die direkte Spektrometrie nach Hertz und Dybkaer (6) wird häufig als Referenzmethode angesehen. Die Probe wird mit Borat-Puffer verdünnt und bei 466 nm und 522 nm gemessen. Die vielfachen Varianten dieser Methode unterscheiden sich im wesentlichen im Verdünnungspuffer und anderen Meßwellenlängen (7). Zuverlässige Ergebnisse können nur mit hochwertigen und exakt geeichten Spektralphotometern erzielt werden. Besonders ergonomisch sind "Bilirubinometer" (8-11), die die bei 455 nm und 575 nm gemessenen Extinktionen direkt in Bilirubinkonzentration umrechnen können. Neben prinzipiellen Schwierigkeiten bei der Kalibration dieser Geräte wird jedoch vielfach übersehen, daß in der Routinediagnostik mit diesen Geräten im allgemeinen Kapillarblutproben gemessen werden, während den verschiedenen Diagrammen zur Austauschtransfusion (12-14) und Phototherapie (15-17) die Serum-Bilirubinkonzentration zugrunde liegt. In der vorliegenden Arbeit sollen zwei in der Neonatologie gebräuchliche Bilirubinbestimmungsmethoden verglichen werden, da in der Praxis die Ergebnisse beider Methoden der therapeutischen Entscheidung (z. B. Phototherapie) zugrunde gelegt werden. Methodik Für die direkte photometrische Messung wurde in unserer Studie ein Bilirubinometer* verwendet. Nach Angaben des Herstellers mißt das Gerät bei 455 nm und 575 nm. Das Gerät wurde mit Dade Bilirubin-Control Lot. Nr. 971 unter Verwendung des dort angegebenen Wertes für das "Bilimeter" kalibriert. Es ist nicht bekannt, welcher Algorithmus der Berechnung des Ergebnisses zugrunde liegt; der Benutzer führt vor jeder Messung lediglich einen Nullabgleich durch. Für die Blutabnahme aus der Ferse wurden die vom Hersteller empfohlenen Kapillaren verwendet; die Probe wurde 5 Minuten in einer HämatokritZentrifuge zentrifugiert, mit einem Tupfer gereinigt und sofort gemessen. Zeitlich parallel wurde Venenblut abgenommen. Die Probe wurde 2 Minuten bei etwa 6000 g (Eppendorf-Zentrifuge) zentrifugiert; Seren mit makroskopisch sichtbarer Hämolyse wurden verworfen. Die Bestimmung der Bilirubinkonzentration erfolgte mit Hilfe der DPD-Methode unter Verwendung von Reagentien der Fa. Boehringer Mannheim (Testkombination Nr. 123943). Es wurden je 20 111 für Probe und Leerwert verwendet, die Lösungen mit einem Endvolumen von 1020 111 wurden bei Hg 546 nm im Photometer 1101 M bzw. 6115 der Fa. Eppendorf-Gerätebau gemessen. Die Berechnung erfolgte über den Extinktionskoeffizienten des gebildeten Azobilirubins. Der Berechnung der Aus- * "Bilimeter" der Fa. Ortho Diagnostic Systems GmbH, D-6903 Neckargemünd gleichsgeraden liegt die "Standardisierte Hauptkomponenten-Analyse" (20, 21) zugrunde. Für die Richtigkeitskontrolle wurden folgende Kontrollseren verwendet: 1. Dade Bilirubin-Control, Lot. Nr. 972 2. Fisher Elevated Bilirubin, Lot. Nr. 070-054 3. Merck Controbil, Lot. Nr. 703 4. Goedecke Versatol Pediatric Calibration, Lot. Nr. 4659033 5. BioMerieux Ictotrol, Lot. Nr. 01407 Die Untersuchungen zur Präzision wurden mit Kontrollserum I. durchgeführt. Zur Überprüfung der Linearität des Bilimeters wurden die Kontrollseren 1., 2. und 3. in 10 Stufen mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und anschließend sofort gemessen. Um die Kompensation des Hämolyseeinflusses auf das Bilimeter-Ergebnis zu überprüfen, wurden gewaschene Neugeborenen-Erythrocyten mit destilliertem Wasser Iysiert; die Hämoglobin-Konzentration des Lysats wurde mit der Hämicyanid-Methode bestimmt. Ein hämolysefreies Neugeborenen-Serum wurde dann mit steigenden Mengen des Lysats versetzt und im Bilimeter gemessen. Sämtliche Arbeiten wurden bei gedämpften Tageslicht und ausgeschalteter Laborbeleuchtung durchgeführt. Ergebnisse Die Ergebnisse für die Präzision in der Serie und von Tag zu Tag sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tab. 1 Präzision in der Serie und von Tag zu Tag für die DPM-Methode (Bilimeter) und die DPD-Methode Präzision in der Serie Präzision von Tag zu Tag Bilimeter x = 17,8 mg/dl VK = 1,2% n = 20 x = 17,9 mg/dl VK = 2,3% n = 20 DPD-Methode x x = 20,1 mg/dl VK=1,2% n = 20 = 20,2 mg/dl VK =0,99% n = 20 x= Mittelwert, VK = Variationskoeffizient, n = Anzahl der Analysen Für die Wiederfindung in Kontrollseren wurden - bezogen auf die methodenabhängigen Sollwerte - bei der DPD-Methode Abweichungen zwischen -3,1% und + 1,8% und für das Bilimeter zwischen + 0,3% und + 8,9% ermittelt. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. gen, muß eine Korrektur bei einer zweiten Wellenlänge durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren muß zwischen Methoden mit und ohne Probenverdünnung unterschieden werden. Klin. Pädiatr. 200 (1988) 331 H. Schfebusch et af. Klin. Pädiatr. 200 (1988) Tab.2 mgldl Kompensation des Hämolyseeinflusses beim Bilimeter 2S HämoglobinKonzentration in der Probe (mg/dl) Gemessene Konzentration (mg/dl) 50 (leichte Hämolyse) 100 (mäßige Hämolyse) 300 (starke Hämolyse) 16.7 16.6 16.5 15.4 Abweichung in (%) 0.6 1.2 7.8 . . .. '" ..~:",. 20 15 ....... 41 ",''" ....... / . .- .. 10 :::: Q5 • • o' 0 .~ 5 Die Untersuchungen zur Linearität ergaben für die verschiedenen Kontrollseren eine sehr gute Übereinstimmung zwischen erwarteten und gemessenen Werten im überprüften Bereich (2,0-21,0 mg/dl). Die Korrelationskoeffizienten lagen zwischen r = 0,98 und 0,99. Die Ergebnisse zur Kompensation des Hämolyseeinflusses sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. , 0"'' ' ' ' ,'" '". . e.. _. 41 E , • • ",'I*" '" '" 5 25 mgldl 20 15 10 DPD - Methode Abb.1 Für den Vergleich zwischen venösem und Kapillarblut wurden 135 Proben analysiert (61 Proben aus der Univ.-Frauenklinik und 74 Proben aus der Univ.Kinderklinik). Bei 62 Proben wurden mit der DPD-Methode Konzentrationen < 10 mg/dl gemessen, für die restlichen 73 Proben, lag die Konzentration zwischen 10 und 25 mg/dl. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 (xy-Plot) und Abbildung 2 (Differenzen-Plot) dargestellt. Die statistischen Kenngrößen für die Regressionsgeraden y = a + bx sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Bilirubinkonzentration in 135 Proben in Serum (DPDMethode) und Kapillarplasma (Bilimeter). 5.0 • • 2.5 .... " Tab.3 • o .. 41 QI Die Problematik der Bilirubinbestimmung beginnt bereits bei der Art der Blutentnahme. Die meisten Universitäts-Kinderkliniken (18) verwenden venöses Blut, da bei der kapillären Blutentnahme Verdünnungsfehler durch Abpressen von Gewebsflüssigkeit auftreten. Außerdem sind die Kapillarblutproben häufig beträchtlich hämolytisch. Kapillär-venöse Konzentrationsunterschiede sind jedoch weder bei der meßtechnischen Überprüfung von Bilirubinometem (19) noch durch laborinteme Qualitätskontrolle oder Ringversuche zu eruieren. Die Ergebnisse zur Präzision in der Serie und von Tag zu Tag zeigen, daß die DPD-Methode eine etwas bessere Präzision aufweist als das Bilimeter. Für beide Verfahren sind jedoch die Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätskontrolle (22, 23) erfüllt. • • 0 ~ ~ Diskussion •• . -2.5 o' -5.0 L...---.,----,---.----r----. 5 10 15 JO 25 mgldl DPD - Methode Abb. 2 Abweichung der im Kapillarblutplasma mit dem Bilimeter gemessenen Bilirubinkonzentrationen von der Serumkonzentration (D PD- Methode). Dasselbe gilt auch für die Wiederfindung in Kontrollseren. Nur das Kontrollserum 5 zeigte für das Bilimeter eine Abweichung von D% > 5%. Die teilweise stark methodenabhängigen Sollwerte (s. Tab. 1) lassen jedoch den Schluß zu, daß nur wenige handelsübliche Kontrollseren zur Überprüfung der Richtigkeit von direkt messenden "Bilirubinometem" geeignet sind. Statistische Kenngrößen für den Vergleich venöser und kapillärer Blutproben Steigung b Achsenabschnitt a Mittelwert von x Mittelwert von y Korrelationskoeffizient r alle Werte n=135 Werte< 10 mg/dl n=62 1.01 0,21 10.50 10.77 0.943 1.04 -0.18 7.66 7.78 0.862 Werte> 10 mg/dl n=73 0.99 0.35 13.01 13.32 0.893 Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 332 Bilirubinbestimmungen mit einer direkten photometrischen Methode im Kapillarplasma Klin. Pädiatr. 200 (1988) Eine ähnliche Problematik ergibt sich bei der Kalibration. Das Gerät muß mit einer sekundären Standardlösung kalibriert werden; dazu dienen "Kontrollseren", für die ein gerätespezifischer Sollwert angegeben ist. Es ist jedoch unbekannt, wie dieser Sollwert ermittelt wurde - er unterscheidet sich bis zu 30% von der Konzentration, die mit einer Referenzmethode bestimmt wurde (7). Diese Situation ist aus analytischer Sicht in höchstem Maße unbefriedigend (24). Das Fehlen eines definierten Standards zur Kalibration direkt messender Bilirubinometer ist sicher ein entscheidender Grund für die in Ringversuchen beobachteten großen Streuungen der Meßergebnisse. Auch in der neuesten Literatur (26) wird die direkte Spektrophotometrie als Standardmethode zur Bestimmung des Neugeborenenbilirubins empfohlen. Dabei wird nicht berücksichtigt, daß auch bei Verwendung qualitativ guter Geräte große und im Einzelfall nicht voraussehbare kapillär-venöse Differenzen ein sicheres Ergebnis in Frage stellen. Direkte photometrische Bilirubinbestimmungen im Kapillarblut haben deshalb eher orientierenden Charakter; sie können eine zuverlässige chemische Bestimmung in venösem Serum nicht ersetzen. Die Linearität des Gerätes ist ausgezeichnet; ähnliche Ergebnisse wurden von Kupke (19) mitgeteilt. Frau B. Dürkop und Frau A. Starke danken wir für die wertvolle Mitarbeit. Beim Vergleich der Ergebnisse in Kapillar- und Venenblutproben zeigt die Regressionsgerade y=0,21 + 1,01x eine ideale Steigung und einen minimalen Achsenabschnitt von 0,21 mg/dl. Die Daten sind mit r = 0,943 sehr gut miteinander korreliert (Abb. I, Tab. 3). Teilt man den Meßbereich in Werte größer und kleiner 10 mg/dl auf, so ändert sich das Bild im Prinzip nicht. Die Steigung b ist in beiden Bereichen nicht signifikant von eins verschieden und a ist vernachlässigbar klein. Die statistischen Daten täuschen jedoch über das Ausmaß der Streuung der Meßergebnisse um die Ausgleichsgerade hinweg; dies wird aus Abbildung 2 deutlich. Bei 29 Proben (21,5%) waren die Differenzen größer als 1,5 mg/dl, bei 12 Proben (8,9%) sogar größer als 2,5 mg/dl, bis 4,0 mg/dl. Von den 29 Proben lagen 9 Wertepaare im Konzentrationsbereich bis 10 mg/dl und 20 im klinisch bedeutsameren Bereich zwischen 10 und 25 mg/dl. Bei 18 Proben waren die Kapillarblutwerte höher, bei II Proben niedriger als die Ergebnisse in den venösen Proben. Diese Differenzen ließen sich nicht auf Einflüsse wie schlechte Blutung oder Hämolyse zurückführen. Sie zeigten sich häufiger in den Vergleichsuntersuchungen, die in der Kinderklinik durchgeführt wurden, da dort die überwiegende Zahl der höheren Bilirubinkonzentrationen (10-25 mg/dl) anfiel. Wahrscheinlich spielt hier auch der allgemeine Krankheitszustand der Kinder eine Rolle, der sicherlich in der Kinderklinik erheblich schlechter war. Danksagung Literatur (1) Gemeinsame Empfehlung der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe, der Deutschen Gesellschaft für Kinderheilkunde und der Berufsverbände zur Frage der Fototherapie bei der Neugeborenen- Hyperbilirubinämie 1983 (2) Wille. L .. M. Obladen: Neugeborenen-Intensivpflege, Grundlagen und Richtlinien. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg- New York-Tokyo 1984 (3) Keller. 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Der Hämoglobin-Einfluß wird nur bis 100 mg Hb/dl gut kompensiert; darüber hinaus muß mit einer Überkompensation gerechnet werden. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von dem anderer Autoren (19), die erst über 300 mg Hb/dl einen deutlichen Einfluß fanden. Eine Erklärung ergibt sich möglicherweise aus der Tatsache, daß bei unseren Versuchen ein echtes Neugeborenenserum, im anderen Fall ein Kontrollserum mit Hämoglobin versetzt wurde. Ringversuche der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie, bei denen mit Hämoglobin versetzte Kontrollproben verschickt wurden, deuten ebenfalls auf eine nicht vollständige Kompensation des Hämolyseeinflusses hin (25). 333 Klin. Pädiatr. 200 (1988) H. Schlebusch et al.: Bilirubinbestimmungen mit einer direkten photometrischen Methode (21) Haeckel. R.: Statistische Verfahren beim Methodenvergleich. Med. Lab. 34 (1981) 8 (22) Richtlinien der BundesärLtekammer zur Durchführung von Maßnahmen der statistischen Qualitätskontrolle und von Ringversuchen im Bereich der Heilkunde. Dtsch. ÄrLtebl. 68 (1971) 2228 (23) Ausführungsbestimmungen und Erläuterungen zu den Richtlinien der BundesärLtekammer zur Durchführung von Maßnahmen der statistischen Qualitätskontrolle und von Ringversuchen im Bereich der Heilkunde. Dtsch. ÄrLtebl. 71 (1974) 961 (24) Stamm. D.. in: H. Greiling. A. M. Gressner: Lehrbuch der klinischen Chemie und Pathobiochemie. Schattauer Verlag, Stuttgart-New York 1987 (25) Röhle. G.: Persönliche Mitteilung (26) Gressner, A. M.. K.-H. Pick-Kober, in: H. Greiling. A. M. Gressner: Lehrbuch der klinischen Chemie und Pathobiochemie. Schattauer Verlag, Stuttgart-New York 1987 Prof. Dr. med. N. Liappis, Klinisch-chemisches Laboratorium der Universitäts-Kinderklinik. Adenauerallee JJ9, D-5300 Bonn 1 Buchbesprechung Gutjahr, P.: Krebs bei Kindern und Jugendlichen. Klinik und Praxis der pädiatrischen Onkologie. Unter Mitarbeit von M. Hertl und Johannes Oehme. 2. völlig neu bearb. Aufl. 1987.375 S., 132 Abb. in 175 Teilabb., davon 12 in Farbe, 88 Tab. geb., DM 124,-. Deutscher Ärzte-Verlag, Köln ISBN 3-7691-1077-3 Das Buch, das jetzt in zweiter Auflage erscheint - 1. Auflage 1981 als Taschenbuch -, dient, so das Vorwort, "als aktuelle Einführung und als Übersicht über die inzwischen hochspezialisierte und sehr erfolgreich gewordene Pädiatrische Onkologie". Die zweite Auflage wurde wegen der raschen Entwicklung in Diagnostik und Therapie seit 1981 notwendig. Gegliedert ist das Buch in einen allgemeinen und einen speziellen Teil. Im allgemeinen Teil werden in 6 Kapiteln Epidemiologie, Ätiologie, immunologische Aspekte, Pathologie, allgemeine Aspekte der Therapie dargestellt und in einem gesonderten Kapitel die Zytostatika. Die einzelnen Kapitel sind ausführlich und klar gegliedert. Mit übersichtlichen Tabellen und Abbildungen wird das Wesentliche des Textes hervorgehoben. Im knapp gehaltenen Kapitel über Histopathologie/Klassifizierung wird auf die Bedeutung und Schwierigkeiten einer sicheren pathologischen Diagnose eingegangen. Die Pathologie spezieller Tumoren wird erst in den entsprechenden speziellen Kapiteln über diese Tumoren dargestellt, die Knochenmarkstransplantation im Abschnitt über allgemeine Aspekte der Therapie. Die in der Pädiatrie verwendeten Zytostatika sind in alphabetischer Reihenfolge stichpunktartig beschrieben. Im zweiten, speziellen Teil des Buches sind die Leukämien, die Non-Hodgkin-Lymphome, der M. Hodgkin, die Histiozytosis X, die primären Tumoren des ZNS, das Nephro- und Neuroblastom, das Rhabdomyosarkom, das Osteo- und Ewingsarkom, Retinoblastom, Schilddrüsenkarzinom, Lebertumoren, Keimzelltumoren und Hauttumoren jeweils in einem Kapitel ausführlich geschildert. Andere seltene Malignome sind in einem Kapitel zusammen abgehandelt. Es werden neben internationalen Referenzen die laufenden Therapiestudien innerhalb der Gesellschaft für pädiatrische Onkologie e. V. und der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Leukämieforschung und -behandlung im Kindesalter e. V. besonders hervorgehoben. In den Abschnitten über die Klinik der einzelnen Tumoren erkennt man die reichhaltige Erfahrung der Autoren. Weitere Kapitel beschäftigen sich mit Supportivmaßnahmen, psychosozialen Problemen, Spätfolgen und umstrittenen Behandlungsmethoden und runden den Inhalt des Buchen so gut ab. Besonders hervorzuheben ist die ausgezeichnete Darstellung der psychosozialen Probleme und ihre Bewältigung (Hertl). Ein eigenes kritisches Kapitel über umstrittene Behandlungsmaßnahmen ist im Gesamtkonzept dieses Buches sehr positiv zu bewerten. Die Literaturangaben sind den einzelnen Kapiteln nachgestellt, ausführlich und auf dem neuesten Stand, wobei insbesondere die Gliederung in verwendete Literatur und weitere empfohlene Literatur hervorzuheben ist. Zusammenfassend liegt mit diesem Buch ein hervorragendes deutschsprachiges Werk über die gesamte pädiatrische Onkologie vor. Diesem Buch ist auch hinsichtlich seines günstigen Preises von DM 124,- eine weite Verbreitung nicht nur unter Pädiatern zu wünschen. N. Graf. Homburg/Saar Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 334