Maike Sonnenberg_Dissertation - OPUS-Datenbank

Untersuchungen des Einflusses von Chemotherapie auf Tumorassoziierte Fibroblasten bei Karzinomen der Lunge und Brust in
vivo und in verschiedenen ex vivo Modellen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Fakultät Naturwissenschaften
Universität Hohenheim
Institut für Zoologie, Universität Hohenheim
Dr. Margarete Fischer-Bosch Institut für Klinische Pharmakologie, Stuttgart und
Universität Tübingen
vorgelegt von
Maike Sonnenberg
aus
Fürth
2009
Dekan:
Prof. Dr. H. Breer
1. berichtende Person:
Prof. Dr. W.E. Aulitzky
2. berichtende Person:
Prof. Dr. M. Blum
Eingereicht am:
12. Februar 2009
Mündliche Prüfung am:
06. Juli 2009
Die vorliegende Arbeit wurde am 06.05.2009 von der Fakultät Naturwissenschaften
an der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften“ angenommen.
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
I.
Abkürzungsverzeichnis................................................................................. 6
1.
Einleitung ....................................................................................................... 8
1.1 Architektur solider Tumore ............................................................................... 8
1.2 In vivo und ex vivo Untersuchungen der Wechselwirkungen der verschiedenen
Zelltypen im Tumor ........................................................................................ 10
1.3 Rolle der TAFs im Tumor ............................................................................... 12
1.4 Determinanten der Chemosensitivität ............................................................ 14
1.5 Ziel der Arbeit................................................................................................. 16
2.
Material und Methoden................................................................................ 18
2.1 Zellkultur ........................................................................................................ 18
2.1.1
Gewinnung der primären Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs)..... 18
2.1.2
Verwendete Tumorzelllinien ................................................................ 18
2.1.3
Kulturbedingungen, Medien und Zusätze ............................................ 20
2.1.4
Bestimmung der Lebendzellzahl ......................................................... 21
2.1.5
Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen .............................. 21
2.2 Charakterisierung der Zellen.......................................................................... 22
2.2.1
Durchflusszytometrischer Nachweis des Epithel-spezifischen Antigens
(ESA) und des Fibroblast activated protein (FAP) in den primären TAFs
............................................................................................................ 22
2.2.2
Untersuchung des Karyotyps verschiedener primärer TAFs ............... 23
2.2.3
Molekularbiologische Methoden .......................................................... 23
2.2.3.1 Genotypisierung der Gene p53 und ERCC1 in den primären
isolierten TAFs................................................................................. 23
2.2.3.2 Vergleich der Originalsequenz von p53 und ERCC1 mit den
Sequenzen der primären Fibroblasten ............................................ 25
2.2.3.3 Genotypisierung von mdm2-309 T/G in den primären isolierten TAFs
........................................................................................................ 26
2.2.4
Untersuchung der Chemosensitivität der isolierten TAFs.................... 27
2.2.4.1 MTT–Test zur Bestimmung der Zellviabilität.................................... 27
2.2.4.2 Bestimmung der Sensitivität der isolierten primären TAFs .............. 28
2.3 Etablierung der Frischgewebekultur............................................................... 28
2.3.1
Herstellung und Kultivierung der Frischgewebeschnitte aus
verschiedenen Tumorentitäten ............................................................ 28
2.3.2
Identifikation der verschiedenen Tumorkompartimente in den
Frischgewebeschnitten........................................................................ 30
4
Inhaltsverzeichnis
2.3.3
Test der Diffusionsfähigkeit der Frischgewebeschnitte........................ 31
2.3.4
Untersuchung der Chemosensitivität der Tumore anhand der
Frischgewebeschnitte.......................................................................... 31
2.3.4.1 Fluoreszenzfärbung für die Identifikation lebender und toter Zellen 32
2.3.4.2 Fluoreszenzfärbung zur Untersuchung der Viabilität der Zellen in den
Frischgewebeschnitte...................................................................... 33
2.3.4.3 ATP-/DNA-Gehaltsmessung............................................................ 34
2.3.5
Immunhistochemische Färbungen ...................................................... 34
2.3.5.1 Hämatoxilin - Eosin - Färbung (H&E) für den Vergleich der
Morphologie der Frischgewebeschnitte mit den original OPPräparaten....................................................................................... 35
2.3.5.2 Darstellung verschiedener Zelltypen innerhalb der
Frischgewebeschnitte...................................................................... 35
2.3.5.3 Immunhistochemische Färbungen der Proliferation und des Zelltodes
innerhalb der Frischgewebeschnitte ................................................ 36
3.
2.3.6
Bestimmung der pathologischen Regression der Tumorzellen und des
Stromas nach neoadjuvanter Chemotherapie anhand Präparaten von
Mammakarzinomen ............................................................................. 37
2.3.7
Auswertung des klinischen Ansprechens der MammakarzinomPatientinnen auf die neoadjuvante Chemotherapie............................. 38
Ergebnisse ................................................................................................... 39
3.1 Etablierung von in vivo - und in vitro - Methoden zur Untersuchung der
Wirkung von Chemotherapie.......................................................................... 39
3.1.1
Methodik zu Untersuchung der Chemotherapie-Wirkung in vivo ......... 39
3.1.2
Kultivierung und Charakterisierung der Tumor-assoziierten Fibroblasten
(TAFs) ................................................................................................. 40
3.1.2.1 Expression des Epithel-spezifischen Antigens (ESA)...................... 41
3.1.2.2 Expressionsanalyse des Fibroblast activation protein (FAP)........... 42
3.1.3
Etablierung eines ex vivo-nahen Gewebekultursystems ..................... 43
3.1.3.1 Viabilitäts-Fluoreszenzfärbungen eines etablierten Zellkulturmodells .
........................................................................................................ 44
3.1.3.2 Fluoreszenzfärbung der Frischgewebeschnitte ............................... 48
3.1.3.3 ATP- und DNA-Bestimmung der Frischgewebeschnitte .................. 51
3.1.3.4 Untersuchung von morphologischen Veränderungen der
Frischgewebeschnitte...................................................................... 52
3.1.3.5 Identifikation verschiedener Zelltypen im viablen Gewebe .............. 52
3.1.3.6 Durchlässigkeit und Diffusionsvermögen der Frischgewebeschnitte 54
3.1.3.7 Dosis-abhängiger Einfluss der Chemotherapie ............................... 55
3.1.3.8 Zellproliferation und Zelltod verschiedener Tumorkompartimente ... 58
Inhaltsverzeichnis
5
3.2 Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in vivo und ex vivo in
Mammakarzinomen........................................................................................ 60
3.2.1
Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in vivo........... 61
3.2.2
In vitro - Chemosensitivität gegenüber Taxol und Cisplatin................. 64
3.2.3
Ex vivo - Sensitivität verschiedener Zelltypen gegenüber Taxol in
Frischgewebeschnitten aus Mammakarzinomen................................. 66
3.3 Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in
Bronchialkarzinomen...................................................................................... 69
3.3.1
In vitro - Chemosensitivität primärer isolierter TAFs aus
Bronchialkarzinomen gegenüber Taxol und Cisplatin.......................... 70
3.3.2
Genotypisierung der primären TAFs aus Bronchialkarzinomen .......... 72
3.3.2.1 Somatische Mutationen in p53 ........................................................ 72
3.3.2.2 Genotypisierung der Polymorphismen p53-Arg72Pro, Mdm2-309 T/G
und ERCC1-118C/T ........................................................................ 73
3.3.3
Ex vivo - Chemosensitivität verschiedener Zelltypen gegenüber
Cisplatin in Frischgewebeschnitten aus Bronchialkarzinomen ............ 74
3.3.4
Vergleich der TAFs aus Mamma- und Bronchialkarzinomen............... 77
3.3.5
Vergleich der Chemosensitivität der TAFs in Einzelzellkultur und in
Frischgewebekultur ............................................................................. 78
4.
Diskussion.................................................................................................... 79
5.
Fazit und Ausblick ....................................................................................... 94
6.
Zusammenfassung ...................................................................................... 96
7.
Summary .................................................................................................... 100
8.
Literaturverzeichnis................................................................................... 103
9.
Eigene Veröffentlichungen ....................................................................... 114
10.
Danksagung ............................................................................................... 117
11.
Lebenslauf.................................................................................................. 118
6
I. Abkürzungsverzeichnis
I. Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ATCC
American Type Culture Collection
b bzw. bp
Basen bzw. Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,
Braunschweig
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGF
epidermal growth factor
ESA
Epithel-spezifisches Antigen
et al.
et alii
FACS
fluorescence activated cell sorter
FAP
Fibroblast-activation protein
FCS
fetal calf serum (foetales Kälberserum)
FGF
fibroblast growth factor
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
Gramm
GI50
growth inhibition - die Konzentration, die die mitochondriale
Aktivität zu 50% hemmt
GSTs
Glutathion-S-Transferasen
h
Stunde(n)
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl-)1-piperazinethan-sulfonsäure
kb
Kilobase(n)
m
milli-
µ
mikro-
M
Molar (mol/l)
MDR
multi grug resistance
min
Minute
MMPs
Matrixmetallo-Proteinasen
OP
Operation
I. Abkürzungsverzeichnis
PBS
phosphate buffered saline
PDGF
platelet-derived growth factor
PI3-Kinase
Phosphatidylinositol-3-Kinase
rpm
rounds per minute
RT
Raumtemperatur oder Reverse Transkription
s/sec
Sekunden
SDS
sodium dodecyl sulfate
Tab.
Tabelle
TAFs
Tumor-assoziierte Fibroblasten
TBS
tris buffered saline
TBST
tris buffered saline plus Tween 20
TKI(s)
Tyrosinkinase-Inhibitor(en)
TMRM
Tertramethyl-rhodamin-methylester
u.a.
unter anderem
v/v
Volumen/Volumen
VEGF
vascular endothelial growth factor
w/v
Masse/Volumen
z.B.
zum Beispiel
7
8
1. Einleitung
1. Einleitung
Die Mehrheit der Krebserkrankungen weltweit sind solide Tumore epithelialen
Ursprungs, d.h. Karzinome. Ein großes Problem bei der Therapie dieser
Erkrankungen
stellt
das
heterogene
Ansprechen
der
Tumore
dar.
Die
Untersuchungen nach den molekularen Ursachen dieses heterogenen Ansprechens
haben
sich
in
erster
Linie
auf
epitheliale
Tumorzellen
und
deren
Resistenzmechanismen beschränkt. Allerdings besteht der Tumor nicht nur aus den
genetisch veränderten Tumorzellen, sondern auch aus einem variablen Anteil an
Fibroblasten, extra-zellulärer Matrix und Endothelzellen. Während die Rolle dieses
Tumorstromas für die Entstehung, Progression und Metastasierung der Tumore in
den letzten Jahren immer klarer herausgestellt wurde, ist es bislang weitgehend
unklar, inwieweit diese Zellen auf die Tumortherapie reagieren und welchen Einfluss
diese Reaktion auf das Gesamtansprechen des Tumors hat.
1.1 Architektur solider Tumore
Karzinome sind komplexe Netzwerke, die aus genetisch veränderten epithelialen
Tumorzellen, den sie umgebenden Stromazellen und extrazellulärer Matrix bestehen.
Bereits im gesunden Gewebe der Brust stellt das Stroma mit ca. 80 % den größten
Massenanteil (Drife, 1986).
Das Stroma ist bei der Tumorentstehung, Progression und Invasion des Tumors
durch einen histologisch veränderten „aktivierten“ Phänotyp gekennzeichnet, der sich
durch veränderte extra-zelluläre Matrix, erhöhte Gefäßdichte und modifizierte
Fibroblasten auszeichnet (Sappino et al., 1988; Tlsty et al., 2001; DeWever et al.,
2003; Bhowmick et al., 2005) (Abb. 1.1).
Bereits 1889 machte Stephen Paget die Beobachtung, dass die Umgebung („soil“)
eine große Rolle bei der Entscheidung spielt, wo sich die Tumorzellen („seed“)
absetzen. Somit beeinflusst die Umgebung das Metastasierungsverhalten der
epithelialen Tumorzellen (Stephen Pagets „seed and soil“ Hypothese, 1889; neu
veröffentlicht in: Paget, 1989). Darüber hinaus gibt es viele Beweise dafür, dass
dieses „aktivierte“ Tumorstroma zu einer Veränderung bzw. einer Unterstützung der
1. Einleitung
9
Progression und der Invasion maligner Zellen führt (Pupa et al., 2002; Kiaris et al.,
2004; Mueller et al., 2004; Kalluri et al., 2006; Kopfstein et al., 2006). Tumore und
ihre Umgebung werden auch häufig als „Wunden, die nie heilen“ bezeichnet (Dvorak
et al., 1986). Der offensichtliche Unterschied zwischen der Wundheilung und dem
Tumorwachstum besteht darin, dass die Reparatur des Gewebes sich selbst limitiert.
Abb. 1.1: Architektur eines Karzinoms
Die Abbildung zeigt im oberen Bild eine H&E-Färbung eines Mammakarzinoms und im unteren Bild
eine schematische Darstellung der Einflüsse der verschiedenen Zelltypen innerhalb des Tumors und
deren Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen (verändert nach Hofmeister et al., 2008).
Die epithelialen Tumorzellen produzieren vermehrt Wachstumsfaktoren (WF) wie
VEGF (vascular endothelial cell growth factor), PDGF (platelet-derived growth
factor), EGF (epidermal growth factor) und FGF (fibroblast growth factor) (Mueller et
al., 2004). Diese Wachstumsfaktoren beeinflussen ihre Umgebung so, dass sie das
Tumorwachstum unterstützen (Zigrino et al., 2004). Diese erhöhte Ausschüttung von
WF führt unter anderem zu angiogenetischen Neubildungen und trägt so zu einer
verbesserten Versorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff bei (Shinkaruk
et al., 2003). Darüber hinaus spielen diese Wachstumsfaktoren auch eine wichtige
10
1. Einleitung
Rolle bei der Aktivierung der Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs). Diese
Aktivierung führt dazu, dass die TAFs ihrerseits Wachstumsfaktoren sezernieren und
verschiedene extrazelluläre Matrix-Proteine, wie Kollagen, Integrin und Tenascin
bilden (Hansen et al., 2000; Orimo et al., 2001; Pietras et al., 2008). Durch die
veränderte
extrazelluläre
Matrixmetallo-Proteinasen
Zelladhäsion
und
Matrix,
(MMPs),
somit
zu
insbesondere
kommt
einem
es
auch
zu
durch
einer
veränderten
Sekretion
von
Veränderung
der
Wachstum
und
Metastasierungsverhalten der Tumore und beeinflusst dadurch auch das Ansprechen
auf Chemotherapie (Liotta et al., 2001; Trédan et al., 2007).
Der Anteil des Tumorstromas ist ein sehr variabler, individueller Teil des Tumors
(Mueller et al., 2004). Die oben beschriebenen Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen
und auch die Ausschüttung löslicher Faktoren beeinflussen das Verhalten des
Tumors im Hinblick auf Entstehung, Progression und Invasion (Zigrino et al., 2004).
Damit ist es sehr naheliegend, dass auch das Therapieansprechen des Tumors vom
Tumorstroma mit beeinflusst wird.
1.2 In vivo und ex vivo Untersuchungen der Wechselwirkungen der
verschiedenen Zelltypen im Tumor
Die oben beschriebenen Wechselwirkungen der Zell-Zell Kommunikation und ZellMatrix Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen im Tumor wurden mittels
2D- und 3D-Modellen bereits ausführlich untersucht (Sethi et al., 1999; Weaver et al.,
2002; Schmeichel et al., 2003; Sadlonova et al., 2005).
Bei den 2D in vitro-Modellen werden zunächst nur die epithelialen Tumorzellen
kultiviert. Für die Untersuchung des Einflusses der extrazellulären Matrix auf die
Epithelzellen werden die Zellen auf verschiedenen extrazellulären Matrizes kultiviert.
Für die Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen
werden meist Kokultur-Experimente eingesetzt, in denen etablierte Tumorzelllinien
mit den Stromazellen entweder in direktem Kontakt stehen oder nur über lösliche
Faktoren miteinander kommunizieren können. In 3D-Modellen werden Tumorzellen
und Stroma in verschiedenen Matrizes kultiviert, um so die in vivo-Situation zu
simulieren (Weaver et al., 1999; Schmeichel et al., 2004). Um möglichst nah an die in
vivo Situation heranzukommen, werden Xenograft-Modelle in Mäusen verwendet.
1. Einleitung
11
Hierbei werden meist humane Tumorzelllinien in immundefiziente Mäuse gespritzt
um dort Tumore auszubilden (Mueller et al., 2004; Kuperwasser et al., 2004). Doch
die Wechselwirkungen zwischen den humanen Tumorzellen und dem murinen
Stroma geben die in vivo-Situation im Patienten nur sehr begrenzt wieder.
Diese in vivo- und in vitro-Modelle haben wesentlich dazu beigetragen, den Einfluss
der Zell-Zell-Kommunikation zu untersuchen und die Interaktionen zwischen den
Tumorzellen mit der extrazellulären Matrix und verschiedene intrazellulären
Signalkaskaden der Tumorzellen aufzuklären (Bissell et al., 2002; Schmeichel et al.,
2003; Kim et al., 2004; Heneweer et al., 2005). Aber auch diese relativ komplexen in
vitro- und in vivo-Experimente geben diese Interaktionen nur artifiziell und begrenzt
wieder, denn diese sind in vivo für jeden Tumor individuell verschieden und sehr
komplex (Morin et al., 2003). Eine Möglichkeit, die Gewebearchitektur des Tumors
weitgehend zu erhalten, stellt die ex vivo-Kultivierung von unfixiertem, primärem
Tumorgewebe dar.
Bereits 1967 wurden erste Experimente mit Würfeln von einem Volumen von 1 mm3
aus unfixiertem, primärem Tumorgewebe aus Kolon- und Mammakarzinomen
durchgeführt (Matoska et al., 1967). In diesem Kultursystem war allerdings die
Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen nicht bis in das Zentrum
des Gewebes gewährleistet. Die vollständige Versorgung wurde erst durch die
Entwicklung von Mikrotomen möglich, mit denen dünnere Frischgewebeschnitte
hergestellt werden konnten (Krumdieck et al., 1980). In einzelnen Studien gelang es,
Frischgewebeschnitte aus verschiedenen humanen Karzinomen kurzzeitig zu
kultivieren (Nissen et al., 1983; Mira-y-Lopez et al., 1987; Hood et al., 1998). Durch
dieses in-vivo-nahe Kulturmodell ist es möglich, die Tumorstruktur zu erhalten und
die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Dieses Modell ermöglicht
die Untersuchung der Einflüsse der verschiedenen Zelltypen unter weitgehender
Beibehaltung der Tumorarchitektur. Ein Nachteil dieser Frischgewebekultur ist, dass
es nur über eine relativ kurzen Zeitraum möglich ist, das Gewebe vital zu kultivieren.
Eine gute Möglichkeit, die Reaktion der verschiedenen Zelltypen innerhalb des
Tumors auf Chemotherapie zu untersuchen, stellt die in vivo Beobachtung anhand
neoadjuvant behandelter Karzinome dar. Für die Reaktion der Tumorzellen gibt es
eine Reihe sehr gut etablierter Bewertungsschemata, die die Zellmorphologie und die
Anzahl der epithelialen Tumorzellen bewerten (Übersicht in Kuroi et al., 2006). Die
Reaktion des Tumorstromas auf die Therapie wird in diesen Schemata allerdings
12
1. Einleitung
bislang nicht mit einbezogen. Es gibt vereinzelte Hinweise darauf, dass sich das
Tumorstroma durch die Chemotherapie morphologisch verändert (Fisher et al., 2002;
McCluggage et al., 2002). Eine systematische Untersuchung der Reaktion des
Stromaanteils fehlt bislang jedoch vollständig.
1.3 Rolle der TAFs im Tumor
Wie in Kapitel 1.1 erwähnt, ist die Tumorumgebung durch einen „aktivierten“
Phänotyp
der
Stromazellen
gekennzeichnet.
Insbesondere
die
„aktivierten“
Fibroblasten spielen im Tumorstroma eine wichtige Rolle, da sie den größten
zellulären Anteil im Tumorstroma darstellen (Tlsty et al., 2001; Elenbaas et al., 2001).
Die Arbeitsgruppe um Gabbiani benannte diese modifizierten Fibroblasten im
Tumorstroma
zuerst
als
Myofibroblasten,
die
auch
als
Tumor-assoziierte
Fibroblasten (TAFs) bezeichnet werden (Gabbiani et al., 1971; Majno et al., 1971).
Diese aktivierten TAFs wirken nun auf vielfältige Weise auf die Tumorzellen. Neben
der Sekretion von Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise VEGF und PDGF, sind
diese aktivierten Fibroblasten insbesondere auch für die Bildung der extra-zellulären
Matrix verantwortlich (Hansen et al., 2000; Orimo et al., 2001; Pietras et al., 2008).
Der Einfluss der TAFs auf die Tumorentstehung und Progression konnte in in vitro
Kokulturen und in vivo Xenotransplantat-Studien dadurch gezeigt werden, dass
Faktoren der TAFs zur Transformation und Immortalisierung von Epithelzellen
beitragen (Olumi et al., 1999; Hayward et al., 2001). In diesen Studien wurden
normale Fibroblasten oder TAFs eines Prostatakarzinoms zusammen mit einer
immortalisierten benignen Prostata-Epithelzelllinie kultiviert. Die TAFs stimulierten im
Gegensatz zu den normalen Fibroblasten das Wachstum dieser Epithelzelllinie.
Die TAFs ähneln den Fibroblasten, die im „reaktiven Stroma“ der Wundheilung
vorhanden sind. Die Ähnlichkeit der Wundfibroblasten mit den TAFs zeigt sich sehr
eindrücklich in der Beobachtung, dass Tumorzellen, die in Wunden injiziert wurden,
besser wuchsen, als unter normale Haut gespritzte Tumorzellen (Dingemans et al.,
1993). Eine Arbeitsgruppe hat die Genexpressionsprofile von serum-aktivierten
Fibroblasten als Modell für Wundheilungsfibroblasten mit den Profilen verschiedener
Tumoren
verglichen
(Chang
et
al.,
2004).
Dabei
wurden
vergleichbare
Genexpressionsmuster zwischen den serum-aktivierten Fibroblasten und den
1. Einleitung
13
Tumoren gefunden. Diese „Wundheilungs-Signatur“ der Fibroblasten ist prädiktiv für
ein schlechtes Gesamtüberleben und ein erhöhtes Risiko für Metastasierung in
Mamma-, Bronchial- und Gastrointestinal-Karzinomen (Chang et al., 2004 und 2005).
Noch klarer wird die Rolle der TAFs für die Tumorprogression in neueren
Untersuchungen, die eine deutliche Korrelation zwischen Genexpressionsprofilen
isolierter TAFs aus Mammakarzinomen und dem Krankheitsverlauf zeigen, während
die Genexpressionsprofile des gesamten Tumorgewebes diesen Zusammenhang
nicht wiedergeben konnten (Finak et al., 2008).
Ein Hinweis dafür, dass TAFs für die Reaktion der Tumorzellen auf zellulären Stress
einen Einfluss haben können, wurde in einer kürzlich erschienenen Arbeit erbracht.
In dieser Arbeit wurden epitheliale Tumorzellen aus Bronchialkarzinomen in
konditioniertem Medium von TAFs kultiviert und mit Taxol oder Cisplatin behandelt.
Dieses konditionierte Medium schützte die Tumorzellen vor dem Zelltod durch Taxol,
aber nicht vor dem Cisplatin-induzierten Zelltod (Bartling et al., 2008). Darüber
hinaus zeigen Studien, dass Mutationen des Tumorsuppressor-Gens p53 nicht nur in
den Tumorzellen sondern auch in TAFs vorkommen können (Lafkas et al., 2008).
Retrospektive
Studien
an
Paraffinschnitten
von
Mamma-,
Ovarial-
und
Kolonkarzinomen zeigten in beiden Kompartimenten eine große Anzahl an
funktionellen p53 Mutationen (Moinfar et al., 2000; Wernert et al., 2000; Kurose et al.,
2002; Patocs et al., 2007). Interessanterweise handelte es sich bei den Mutationen
im Stromakompartiment um andere als in den entsprechenden Tumorzellen
desselben Präparats. Ein Hinweis dafür, dass solche genetische Alterationen in den
TAFs für den veränderten Phänotyp verantwortlich sein könnten, konnte in
Mausmodellen nachgewiesen werden. Darin konnten Epithelzellen Tumore bilden,
wenn sie mit genetisch veränderten Fibroblasten kultiviert wurden (Barcellos-Hoff et
al., 2000; Kuperwasser et al., 2004).
Die Tatsache, dass die Zahl der Fibroblasten in verschiedenen Tumoren extrem
variabel ist und sie im Stromaanteil des Tumors den größten zellulären Anteil
darstellen, lässt vermuten, dass im Falle eines klinischen Ansprechens auf eine
Therapie nicht nur der epitheliale Tumoranteil reagiert, sondern vielmehr auch der
Fibroblastenanteil anspricht und zurückgeht. Inwieweit die Chemotherapie aber direkt
auf TAFs wirkt und welche Rolle dies beim Ansprechen des Gesamttumors auf die
Therapie letztlich hat, wurde bislang nicht systematisch untersucht.
14
1. Einleitung
1.4 Determinanten der Chemosensitivität
Ursachen für ein heterogenes Therapie-Ansprechen sind neben der natürlichen
genetischen Variabilität somatische Mutationen und epigenetische Veränderungen.
Das Resultat daraus ist eine veränderte Expression bzw. Aktivität von Genen, die für
Transport, Metabolismus und/oder DNA-Schadensprozessierung entscheidend sind.
Dass z.B. Genexpressionsprofile von Tumoren auch eine Vorhersage auf das
Ansprechen auf verschiedene Chemotherapeutika machen können, zeigte eine
Studie der Arbeitsgruppe um Nevins (Potti et al., 2006).
Mechanismen, die zu Resistenz mancher Tumore auf Chemotherapie führen, ist z.B.
eine veränderte Expression bzw. Aktivierung von membranständigen TransporterProteinen, die zu einer verminderten Medikamenten-Konzentration in der Zelle
führen. Ein Beispiel dafür sind MDR (multi drug resistance) Proteine, zu denen z.B.
die ABC Transporter (ATP-binding cassette) gehören (Tan et al., 2000; PérezTomás, 2006). Durch verschiedene Inhibitoren dieser Efflux-Pumpen wird versucht,
diesen Resistenzmechanismus zu überwinden. Ein weiteres Beispiel sind Enzyme,
die zytostatische Therapeutika metabolisch inaktivieren können, wie z.B. GlutathionS-Transferasen (GSTs) (Townsend et al., 2003).
Auch epigenetische Veränderungen, wie unterschiedliche Methylierungsmuster der
DNA, haben einen Einfluss auf das Ansprechen der Tumore auf Chemotherapie.
(Grønbaek et al., 2007). Die Methylierungsmuster gesunder Zellen sind völlig
unterschiedlich zu denen von Tumoren. Dies führt dann zu einer veränderten
Genexpression und somit auch zu einem unkontrollierten Verhalten der Tumore
(Toyota et al., 2005; Shelton et al., 2008). Ein Beispiel, dass zu einem schlechteren
Ansprechen auf die Therapie bei Tumoren mit wildtyp p53 führt, ist die
Hypermethylierung von ASPP1 (apoptosis-stimulating protein of p53), die zu einer
geringeren mRNA Expression von ASPP1 führt (Liu et al., 2005). Durch diese
verminderte mRNA Expression wird die Aktivierung des Tumorsuppressor-Gens p53
verhindert.
Auch Polymorphismen in verschiedenen DNA-Schadensreparatur-Genen führen zu
einem veränderten Ansprechen des Tumors und beeinflussen somit auch das
Gesamtüberleben des Patienten (Patocs et al., 2007). Es wurden bereits in
insgesamt 20 verschiedenen DNA-Schadensreparatur-Genen Polymorphismen
untersucht, die alle im Zusammenhang mit einer veränderten Antwort auf die
1. Einleitung
15
Chemotherapie stehen (Zienolddiny et al., 2006; Han et al., 2008; Kamikozuru et al.,
2008). Zusätzlich dazu können auch somatische Mutationen eine Rolle bei der
veränderten Chemosensitivität spielen. Ein gutes Beispiel für eine genetische
Alteration, die das Ansprechen des Tumors verändert, ist das Tumorsuppressor-Gen
p53, das in 50 % aller Tumore in mutierter Form vorliegt (Pietsch et al., 2006). Ein
weiteres Beispiel für eine genetische Alteration stellen Mutationen im BRCA1 (breast
cancer susceptibility gene 1) Gen dar (Kim et al., 2008). Mutationen dieses Gens
korrelieren mit einem erhöhten Risiko an Mamma- und Ovarialkarzinomen zu
erkranken und führen zu einer veränderten DNA-Schadensreparatur (Lux et al.,
2006).
Neben diesen intrinsischen Resistenzmechanismen der Tumorzellen nehmen auch
die Zell-Zell Kommunikation und Zell-Matrix Interaktionen einen großen Einfluss auf
die Chemosensitivität des Tumors. Ein Hinweis dafür, dass die Zell-Zell
Kommunikation zwischen Zellen des gleichen Zelltyps einen Einfluss auf die
Chemosensitivität nehmen kann, zeigen Experimente mit der MammakarzinomZelllinie MDA-231, die in einem 3D-Spheroid-Modell höhere Proteinmengen der CdK
(cyclin-dependent kinase) Inhibitoren p21 und p27 zeigen (Ohmori et al., 1998). Dies
führt zu einem Zellzyklus-Arrest und somit einer geringeren Sensitivität der Zellen
gegenüber Cisplatin in einem 3D-Spheroidmodell im Vergleich zu einer 2DMonolayer-Kultur.
Des Weiteren kann die Umgebung des Tumors das Eindringen des Medikaments in
den Tumor vermindern (Tannock et al., 2002). Die Tumorzellen können ihre
Umgebung so beeinflussen, dass sie Matrixproteine produzieren, die vor den
Therapeutika schützen (Rintoul et al., 2002). Es wurde bereits beobachtet, dass
erhöhte Mengen der Matrix-Proteine Kollagen IV, Fibronektin und Tenascin Kleinzellige Lungenkarzinome vor Chemotherapie-vermittelter Apoptose schützen (Sethi
et al., 1999). Die gleiche Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass spezifische Antikörper
gegen Integrine diese durch extra-zelluläre Matrix-Proteine unterstützte Resistenz
durch die Inaktivierung von PI3 (Phosphatidylinositol-3) -Kinase vermindern kann
(Hodkinson et al., 2007). Diese durch Integrine vermittelte Inaktivierung der PI3Kinase setzt den Therapie-induzierten Zellzyklus-Arrest und die Apoptose außer
Kraft und führt so zu einer Resistenz gegenüber der Therapie.
Diese Hinweise zeigen, dass die Tumorumgebung und deren verschiedene Zelltypen
einen wichtigen Einfluss auf das Ansprechen der Tumore haben. Inwieweit die
16
1. Einleitung
verschiedenen Zelltypen auf eine Chemotherapie reagieren und inwieweit dies einen
Einfluss auf das Ansprechen des gesamten Tumorgewebes hat, ist bisher noch
weitgehend unklar.
1.5 Ziel der Arbeit
Es gibt sichere Hinweise darauf, dass TAFs einen wesentlichen Einfluss auf die
Entstehung, die Progression und das Metastasierungsverhalten der Tumore haben.
Ihre Rolle für das Ansprechen eines Tumors auf Chemotherapie ist jedoch
weitgehend ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte deshalb der Frage
nachgegangen werden, ob und wie TAFs auf Chemotherapie reagieren.
Dies sollte in vivo und anhand von verschiedenen ex vivo-Modellen untersucht
werden.
1. Die einer operativen Entfernung des Tumors vorausgehende neoadjuvante
Chemotherapie stellt die einzige Möglichkeit dar, die Reaktion des Tumors auf
die Chemotherapie im Patienten in vivo zu untersuchen. Daher sollten in
dieser Arbeit durch retrospektive Studien die Reaktion der TAFs auf
Chemotherapie anhand von Mammakarzinompräparaten vor und nach der
neoadjuvanten Chemotherapie untersucht werden. Für die pathologische
Bewertung der TAFs musste hierfür ein Bewertungsschema erarbeitet
werden, das eine Einteilung der Reaktion der TAFs auf Chemotherapie
erlaubt.
Da es in dieser retrospektiven Untersuchung nicht möglich ist, Aussagen über die
akute Reaktion der einzelnen Zelltypen auf Chemotherapie machen zu können,
sollten in einem weiteren Schritt ex vivo-Modelle etabliert werden. Mit Hilfe dieser ex
vivo-Modelle ist es möglich, die direkte Reaktion der TAFs auf die Therapie zu
beobachten.
2. TAFs sollten aus primärem Mamma- und Bronchialkarzinomgeweben isoliert
und kultiviert und im Hinblick auf Zelltyp und Sensitivität auf Chemotherapie
charakterisiert werden.
1. Einleitung
17
3. Um die Reaktion der Zellen möglichst in vivo-nah in ihrer originalen
Umgebung zu untersuchen, sollte ein Gewebekulturmodell erarbeitet werden.
4. Anhand dieses Gewebekulturmodells sollte das Ansprechen der einzelnen
Zelltypen auf die Kurzzeitbehandlung mit Chemotherapeutika untersucht
werden.
2. Material und Methoden
18
2. Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Gewinnung der primären Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs)
Für die Gewinnung primärer Fibroblasten wurde frisches Tumorgewebe aus der
Brust und aus der Lunge verwendet, für dessen Verwendung ein Ethikvotum vorliegt
und das Einverständnis der Patienten eingeholt wurde. Das Tumorgewebe wurde mit
einem Skalpell mechanisch zerkleinert und in einer sterilen Lösung aus Protease,
Kollagenase und DNase in Cell Rinse Puffer für 1,5 h bei 37°C enzymatisch verdaut
(Tab. 2.1). Danach wurde das verdaute, zerkleinerte Gewebe durch ein Zellsieb mit
einer Porengröße von 70 µm gefiltert und der Durchfluss bei 1400 rpm für 5 min
abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in sterilem
Zellkulturmedium aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Nach 24 h
wurden die adhärenten Zellen mit 1x PBS gewaschen und in frischem Medium
aufgenommen. Das Medium wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt.
Tab. 2.1: Material zur Isolierung primärer Fibroblasten aus Tumorgewebe
Cell Rinse Puffer
120 mM NaCl
15,6 mM Glucose
2,5 mM MgCl2 x 6H2O
5,4 mM KCl
1 mM NaH2PO4
20 mM HEPES
pH 7,2
Protease (0,25 mg/ml)
Sigma, Taufkirchen
Kollagenase (167 U/ml)
Sigma, Taufkirchen
DNase (250 U/ml)
Sigma, Taufkirchen
Cell Strainer 70 µm
Becton Dickinson, USA
2.1.2 Verwendete Tumorzelllinien
Für den Vergleich der Chemosensitivität wurden die isolierten primären Fibroblasten
mit einer Anzahl von bereits etablierten Tumorzelllinien verglichen. Die in dieser
2. Material und Methoden
19
Arbeit verwendeten Tumorzelllinien verschiedener Entitäten sind in Tab. 2.2
aufgelistet.
Tab. 2.2: Verwendete etablierte Tumorzelllinien
Zelllinie
Entität
Herkunft
MCF7
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 134
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 175
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 157
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 231
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 330
Mammakarzinom
PD Dr. Helmut Deißler*
MDA MB 361
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 435
Mammakarzinom
ATCC
MDA MB 436
Mammakarzinom
PD Dr. Helmut Deißler*
BT 20
Mammakarzinom
ATCC
T47D
Mammakarzinom
ATCC
A549
Bronchialkarzinom
ATCC
H1299
Bronchialkarzinom
ATCC
NCI-H23
Bronchialkarzinom
ATCC
NCI-H460
Bronchialkarzinom
ATCC
A427
Bronchialkarzinom
ATCC
A2780
Ovarialkarzinom
ATCC
IGROV 1
Ovarialkarzinom
ATCC
UACC 893
Ovarialkarzinom
ATCC
SKOV 3
Ovarialkarzinom
ATCC
ADR RES
Ovarialkarzinom
ATCC
OVCAR 3
Ovarialkarzinom
ATCC
OVCAR 4
Ovarialkarzinom
ATCC
OVCAR 5
Ovarialkarzinom
ATCC
OVCAR 8
Ovarialkarzinom
ATCC
H 12.5
Hodenkarzinom
ATCC
2102 EP
Hodenkarzinom
ATCC
BaF 3 p185
Chronisch Myeloische Leukämie
Prof. Justus Duyster**
K 562
Chronisch Myeloische Leukämie
DSMZ
LAMA 84
Chronisch Myeloische Leukämie
DSMZ
Meg 01
Megakaryoblastische Leukämie
DSMZ
* Universitäts-Frauenklinik Ulm, Arbeitsgruppe Molekulare Onkologie; ** III. Med. Klinik und Poliklinik
des Klinikums rechts der Isar der TU München, Hämatologie und Internistische Onkologie
2. Material und Methoden
20
2.1.3 Kulturbedingungen, Medien und Zusätze
Für die Kultivierung der Zellen wurde RPMI 1640 Medium mit den in Tab. 2.3
genannten Zusätzen verwendet. Das Kulturmedium für die Tumorzelllinien wurde mit
10 % FCS, das der primären TAFs mit 20 % FCS supplementiert.
Tab. 2.3: Zellkulturmedium für die verwendeten Tumorzelllinien und primären Fibroblasten
RPMI 1640
Biochrom AG, Berlin
500 ml wurden supplementiert mit:
10% bzw. 20% (v/v) FCS (Foetal Bovine Serum)
Gibco, Karlsruhe
0,1 g/l Penicillin/Streptomycin
Gibco, Karlsruhe
10 mM HEPES, pH 7,4
Merck, Darmstadt
2 mM L-Glutamin
Biochrom AG, Berlin
0,13 mM L-Asparagin
Serva, Heidelberg
0,05 mM β-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt
1 mM Natriumpyruvat
Gibco, Karlsruhe
3 ml 100 x nicht-essentielle Aminosäuren
Biochrom AG, Berlin
Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden an einer sterilen Werkbank und mit sterilen
Geräten
durchgeführt
(Tab.
2.4).
Die
Kultivierung
der
Zellen
erfolgte
in
Zellkulturflaschen im CO2-Inkubator bei 37°C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
Ein- bis zweimal wöchentlich wurden die Zellen in einem definierten Verhältnis in
frischem Medium aufgenommen. Für die Subkultivierung mussten die adhärenten
Zellen zunächst mit Hilfe von Trypsin/EDTA (Tab. 2.4) vom Boden der Kulturflasche
abgelöst werden.
Tab. 2.4: Materialien für die Zellkultur
Sterile Werkbank
Heraeus, Hanau
2
25-, 75-, 150 cm Zellkultur-Flaschen
Corning, USA
5-, 10-, 25 ml Stripette Costar
Corning, USA
-

15-, 50 ml Polypropylen Röhrchen, steril
Becton Dickinson, USA
CO2-Inkubator
Heraeus, Hanau
Trypsin/EDTA
Gibco, Karlsruhe
2. Material und Methoden
21
2.1.4 Bestimmung der Lebendzellzahl
Die Lebendzellzahl wurde mit Hilfe des Vitalfarbstoffs Trypanblau bestimmt. Durch
Trypanblau werden die toten Zellen blau angefärbt und können so von den
ungefärbten vitalen Zellen unterschieden werden. Zur Zellzahlbestimmung wurde
eine 1:10 Verdünnung der Zellsuspension mit einer Trypanblau-Lösung (Tab. 2.5)
hergestellt. Mit Hilfe einer Zählkammer (Tab. 2.5) wurden die vitalen Zellen unter
dem Mikroskop ausgezählt.
Tab. 2.5: Materialien zur Bestimmung der Zellzahl
Trypan Blau 0,5% (w/v)
Biochrom AG, Berlin
Zählkammer: Neubauer improved
Roth, Karlsruhe
Hellfeldmikroskop
Zeiss, Jena
2.1.5 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen
Um Veränderungen der Zellen bei längerer Kulturdauer verhindern zu können,
wurden die Zellen zwischen Passage 1 und 3 in flüssigem Stickstoff bei -196°C
konserviert. Dazu wurden die Zellen in einer definierten Zelldichte in FCS mit 10 %
DMSO aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml Aliquots in KryoRöhrchen überführt und sofort mit Hilfe einer speziellen Einfrierbox (Tab. 2.6) mit
einer definierten Abkühlungsgeschwindigkeit von 1°C pro Minute auf -80°C
heruntergekühlt. Nach ca. 24 h wurden die Zellen zur Dauerkonservierung in
flüssigen Stickstoff überführt.
Zur Wiederaufnahme der Zellen in Kultur wurden die eingefrorenen Zellen im
Wasserbad bei 37°C angetaut, dann in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml
Kulturmedium überführt und bei 1400 rpm 5 min abzentrifugiert. Anschließend wurde
das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert und in Zellkulturflaschen überführt.
Nach ca. 24 h wurde das Medium noch einmal gewechselt, um evtl. noch
vorhandenes DMSO und abgestorbene Zellen zu entfernen. Alle verwendeten
Materialien sind in Tab. 2.6 aufgelistet.
2. Material und Methoden
22
Tab. 2.6: Materialien für die Kryokonservierung der Zellen
Dimethyl Sulfoxid (DMSO)
TM
Sigma, Taufkirchen
1,8 ml CryoTube
Nalgene Nunc International, Wiesbaden
5100 Cryo 1°C Einfrierbox ‚Mr. Frosty‘
Nalgene Nunc International, Wiesbaden
2.2 Charakterisierung der Zellen
2.2.1 Durchflusszytometrischer Nachweis des Epithel-spezifischen
Antigens (ESA) und des Fibroblast activated protein (FAP) in den
primären TAFs
Die für die Färbung benötigten 0,5x106 Zellen wurden für 5 min bei 1400 rpm
zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS-BSA (PBS + 1% BSA, Tab. 2.7)
gewaschen und dann wiederum abzentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes
wurden zum Zellpellet 100 µl PBS-BSA zugegeben und der spezifische ESA-FITC
Antikörper (Tab. 2.7) zugegeben und für 1 h bei 4°C inkubiert. Als Negativkontrolle
wurde ein isotypischer FITC-konjugierter Antikörper (Tab. 2.7) mitgeführt. Nach
einem weiteren Waschschritt mit 1 ml PBS-BSA wurde das Zellpellet in 500 µl PBSBSA resuspendiert und am Durchflusszytometer gemessen.
Die FACS-Analyse des für TAFs spezifischen Proteins FAP (Fibroblast activated
protein) (Tab. 2.7) wurde am Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität
Stuttgart unter der Leitung von Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier durchgeführt.
Tab. 2.7: Fixierung und Färbung der Zellen für die durchflusszytometrische Messung
BSA
Sigma, Steinheim
ESA-FITC Antikörper
Biomeda, 5 µl eingesetzt
FAP Antikörper
Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier, Institut für Zellbiologie
und Immunologie, Universität Stuttgart
PBS
Biochrom AG, Berlin
isotypischer Antikörper IgG1-FITC
Coulter Clone , 20 µl eingesetzt
®
2. Material und Methoden
23
Das in der Arbeit verwendete Durchflusszytometer kann 5 optische Parameter
gleichzeitig messen: Vorwärtsstreulicht (FSC), Seitwärtsstreulicht (SSC) und drei
verschiedene Fluoreszenzspektralbereiche (Tab. 2.8).
Tab. 2.8: FACS-Analyse
Fluorescence Activated Cell Analyzer ‚FACScan‘
Becton Dickinson, USA
Laser:
15 mW, 488 nm, Argon-Ionen Laser
Detektoren/Filter:
530 nm (FITC)
585 nm (PE/PI)
650 nm (rote Fluoreszenz)
Software:
TM
CELLQuest
Software
Becton Dickinson, USA
2.2.2 Untersuchung des Karyotyps verschiedener primärer TAFs
Es wurde bei vier verschiedenen primären TAFs eine Analyse des Karyotyps
durchgeführt. Die Zellen wurden in einer Zellkulturflasche mit einer Konfluenz von ca.
30 – 40 % zur Firma Bioscientia (Ingelheim) geschickt. Unter Leitung von Frau Dr. C.
Neuhaus wurde eine Chromosomenanalyse durchgeführt.
2.2.3 Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1 Genotypisierung der Gene p53 und ERCC1 in den primären isolierten
TAFs
Für die Genotypisierung von p53 und ERCC1 wurde unter Verwendung des
RNeasy-Mini Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers zunächst
Gesamt-RNA aus den primären TAFs isoliert. Die Reverse Transkription erfolgte mit
dem RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. LeonRot) nach Anleitung des Herstellers. Ca. 500 ng der erhaltenen cDNA wurden dann
als Matrize für eine PCR-Analyse eingesetzt (siehe Tab. 2.9 - 12).
2. Material und Methoden
24
Tab. 2.9: PCR-Reaktionsmix
H20
33,5 µl
forward Primer (10µM)
1 µl
reverse Primer (10µM)
1 µl
10 x Reaktionspuffer
5 µl
dNTP-Mix (2 mM)
5 µl
Taq DNA Polymerase
0,5 µl
cDNA
4 µl
Tab. 2.10: Thermocycler-Programm für die PCR
95°C
94°C
60°C
72°C
72°C
12°C
2 min
30 sec
30 sec
30 sec
10 min
„for ever“
40 Zyklen
Tab. 2.11: Verwendete Primer für die p53 und ERCC1 Genotypisierung
p53 PCR
sense: CGT CCA GGG AGC AGG TAG
antisense: CCA CAA CAA AAC ACC AGT GC
p53 zusätzlich für Sequenzierung
sense: CAC ATG ACG GAG GTT GTG AG
ERCC1-118 C/T
sense: CCT CAG ACC TAC GCC GAA TA
PCR und Sequenzierung
antisense: GCT GGT TTC TGC TCA TAG GC
Über eine elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte in einem 1%igen
Agarosegel (Tab. 2.12) wurden sie auf ihre Qualität und Länge geprüft.
2. Material und Methoden
25
Tab. 2.12: Materialien für die RT-PCR
Taq DNA Polymerase
Invitrogen, Karlsruhe
Primer
Metabion, Martinsried
dCTP; dATP; dGTP, dTTP (je 100 mM)
Amersham Biosciences, Freiburg
10 x PCR Puffer
Invitrogen, Karlsruhe
RevertAid™ H Minus First Strand
Fermentas, St. Leon-Rot
cDNA Synthesis Kit
Mastercycler Gradient
Eppendorf, Hamburg
Agarose, ultra-pur
Gibco, Karlsruhe
Tris-Base
Roth, Karlsruhe
0,5 M EDTA pH 8
Roth, Karlsruhe
Eisessig
Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid
Roth, Karlsruhe
UV-Detektion
LTF Labortechnik, Wasserburg
Filme: Thermopapier
Mitsubishi, Flensburg
Sämtliche Sequenzierungen wurden von GENterprise GmbH, Sequenzierservice
(Mainz) als so genannte „Home run“-Reaktionen durchgeführt. Die Vorbereitung der
Probe erfolgte nach Angaben der GENterprise GmbH.
2.2.3.2 Vergleich der Originalsequenz von p53 und ERCC1 mit den Sequenzen
der primären Fibroblasten
Nach der Sequenzierung der Zelllinien wurde die erhaltene Sequenz mit den
publizierten Originalsequenzen von p53 bzw. ERCC1 verglichen. Der Genotyp wurde
durch den Vergleich der Chromatogramme mit den Originalsequenzen mittels der
Software Chromas geprüft. Die Sequenz von p53 und ERCC1 wurde aus der
Gendatenbank entnommen (Tab. 2.13).
Tab. 2.13: Sequenzierung und Vergleich der Sequenzen
Chromas 1.62
Technelysium
p53
GenBank, Pubmed, Gene ID 7157
ERCC1
GenBank, Pubmed, Gene ID 2067
2. Material und Methoden
26
2.2.3.3 Genotypisierung von mdm2-309 T/G in den primären isolierten TAFs
Um das mdm2 Gen auf den Polymorphismus 309 T/G zu untersuchen, musste
zunächst die genomische DNA aus den primären Fibroblasten isoliert werden. Dafür
wurde das DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) verwendet.
Für die Untersuchung der TAFs auf den mdm2-309 T/G Polymorphismus wurde eine
PCR-RFLP-basierte Technik angewandt. Dafür wurde mit 15 ng der DNA eine PCR
(Tab. 2.14 und 2.15) mit den in Tab. 2.16 aufgeführten Primern durchgeführt. Danach
das PCR-Produkt mit 5 units MspA1I enzymatisch für 16 h bei 37°C (Tab. 2.16)
verdaut. Danach wurde das verdaute PCR-Produkt in einem 2 %igen Agarosegel
aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Tab. 2.14: PCR-Reaktionsmix
forward Primer (100 pmol/µl)
0,05 µl
reverse Primer (100 pmol/µl)
0,05 µl
Hot Start Taq Master Mix Kit (Qiagen)
12,5 µl
Tab. 2.15: Thermocycler-Programm für die PCR für mdm2-309 T/G
95°C
95°C
64°C
72°C
72°C
12°C
15 min
20 sec
20 sec
50 sec
10 min
„for ever“
40 Zyklen
Tab. 2.16: Verwendete Primer und Enzyme für die mdm2-309 T/G Genotypisierung
sense: CGC GGG AGT TCA GGG TAA AG
Primer für mdm2-SNP309 T/G
antisense: ACT ACG CGC AGC GTT CAC AC
MspA1
New England Biolabs, Frankfurt a. M.
2. Material und Methoden
27
2.2.4 Untersuchung der Chemosensitivität der isolierten TAFs
2.2.4.1 MTT–Test zur Bestimmung der Zellviabilität
Die Zellviabilität nach Chemotherapie kann mit Hilfe der MTT-Reaktion bestimmt
werden. Dabei wird durch eine in den Mitochondrien stoffwechselaktiver Zellen
vorkommende Dehydrogenase das Tetrazoliumsalz MTT zu einer violett gefärbten
Formazanverbindung (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan) umgesetzt.
Die Zellen wurden dazu in einer 96-Loch-Platte mit 10.000 Zellen pro Loch ausgesät
und nach 24 h Kultivierung für weitere 48 h mit verschiedenen Zytostatika in
verschiedenen Konzentrationen behandelt (Tab. 2.16). Zur Detektion der Zellviabilität
wurde in jedes Loch 10 µl einer MTT-Lösung (10 mg/ml MTT in PBS) gegeben und
2 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden pro Loch 90 µl eines MTT-Lysepuffers (15 %
SDS in DMF-Wasser (1:1) gelöst, pH 4,5) zugegeben und die Platte mindestens über
Nacht unter Lichtabschluss bei RT geschüttelt. Am folgenden Tag erfolgte die
photometrische Messung der Färbung am ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von
570 nm. Alle verwendeten Materialien und Geräte sind in Tab. 2.17 aufgeführt.
Tab. 2.16: Verwendete Konzentrationen der Zytostatika im MTT-Test
Taxol
0 – 100 µM
Cisplatin
0 – 200 µM
Tab. 2.17: Materialien für den MTT-Test
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
Sigma, Taufkirchen
diphenyltetrazoliumbromid))
Gewebekulturplatte 96-Loch
Greiner Labortechnik, Frickenhausen
ELISA-Reader‚ Wallac Victor 1420 multilabel
Wallac, Perkin Elmer, USA
counter
GraphPad Prism 4.0 Software
GraphPad Software, USA
2. Material und Methoden
28
2.2.4.2 Bestimmung der Sensitivität der isolierten primären TAFs
Mithilfe des MTT-Assays wurden die GI50-Werte der isolierten primären TAFs und
der etablierten Tumorzelllinien bestimmt. Diese Werte zeigen eine Hemmung der
Zellviabilität um 50%. Aus diesen Werten wurden die Mittelwerte und deren
Standardabweichungen (SD) bestimmt. Nach einer gängigen Methode wurden alle
Zellen, die unter dem Wert des Mittelwerts - SD der etablierten Tumorzelllinien lagen,
als sensitiv eingestuft und die Zellen, deren Werte oberhalb dieses Mittelwerts + SD
lagen, als resistent bezeichnet (Potti et al., 2006).
2.3 Etablierung der Frischgewebekultur
2.3.1 Herstellung und Kultivierung
verschiedenen Tumorentitäten
der
Frischgewebeschnitte
aus
Das frische Gewebe von soliden primären Karzinomen aus der Brust und aus der
Lunge wurde mit Hilfe des Pathologischen Instituts des RBK direkt nach der OP
geschnitten und für die Kultivierung bereitgestellt (siehe Tab. 2.19). Nach
Einverständniserklärung des Patienten/der Patientin wurde das Gewebe, das nicht
für die Routine-Diagnose verwendet werden musste, auf Eis in speziellem
Transportmedium gelagert (Tab.2.20).
Für die Herstellung der Frischgewebeschnitte wurde das Tumorgewebestück unter
einer
sterilen
Werkbank
gestanzt
und
es
entstanden
so
zylinderförmige
Gewebestücke mit einem Durchmesser von 5 mm. Daraus wurden dann mit dem
vorher mit 70% igem Ethanol gereinigten Krumdieck Tissue Slicer (Tab. 2.20) in
kaltem, sterilem 1x PBS 200 µm dicke Frischgewebeschnitt hergestellt (Abb. 2.1).
Diese Gewebeschnitte wurden einzeln in je eine Vertiefung einer 24 Loch Platte
gesetzt und über 96 h mit 1 ml des jeweiligen Kulturmediums (Tab. 2.20) bei 37°C
und 5% CO2-Gehalt kultiviert und nach 24 h für weitere 72 h mit verschiedenen
Zytostatika, je nach Entität, behandelt (Tab. 2.20). Die Herstellung der Slices wird in
Abb. 2.1 gezeigt. Die Konzentrationen der verschiedenen Zytostatika sind den
Testkonzentrationen des käuflich erwerbbaren Tumor-Chemosensitivitäts-Assay
entnommen (Tab. 2.20).
2. Material und Methoden
29
Tumorgewebe
Routinediagnostik
Histologie
Gewebestanze
Krumdieck Tissue Slicer
24 Loch Platte
Kultivierung der Gewebeschnitte in Gegenwart der
1 Gewebeschnitt/Loch
Substanzen über 72 h
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Herstellung der Frischgewebeschnitte
Dargestellt ist die Herstellung von Frischgewebeschnitten aus Tumorgewebe. Zuerst wurden mit einer
Stanze Gewebezylinder hergestellt, die dann mit Hilfe des Krumdieck Tissue Slicers in 200 µm dicke
Frischgewebeschnitte geschnitten wurden. Für die weitere Kulitvierung wurden diese Schnitte in 24
Loch Platten überführt und je nach Entität mit dem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Es folgte die
Behandlung mit den verschiedenen Substanzen über 72 h.
Tab.
2.19:
Entitäten
und
Anzahl
der
Tumorgewebe
für
die
Herstellung
der
Frischgewebeschnitte
Entität
Anzahl
der
Tumorgewebestücke
Herstellung der Frischgewebeschnitte
Mammakarzinome
27
Bronchialkarzinome
34
für
die
2. Material und Methoden
30
Tab. 2.20: Verwendete Medien, Zytostatika und TKIs für die Frischgewebekultur
Transportmedium: Eurocollins
Fresenius medical care, Bad Homburg
Krumdieck Tissue Slicer
Krumdieck, Alabama Research and Development
Corp., Munford, USA
Tumor-Chemosensitivitäts-Assay
TCA-100; DCS Innovative Diagnostic systems,
Hamburg
Verwendete Zytostatika/TKIs:
Eingesetzte Konzentrationen:
Taxol
1,7 µg/ml, 6,8 µg/ml, 13,6 µg/ml
Cisplatin
13 µM
Erlotinib
2 µM
2.3.2 Identifikation der verschiedenen Tumorkompartimente in den
Frischgewebeschnitten
Um das Epithel und das Endothel innerhalb der Frischgewebeschnitte getrennt
darzustellen,
wurden
verschiedene
Oberflächenantigene
mit
spezifischen
Fluoreszenz-markierten Antikörpern sichtbar gemacht.
Das Epithel wurde mit einem FITC-markierten anti-HEA-Antikörper dargestellt,
während das Endothel mit einem PE-markierten CD34 Antikörper sichtbar gemacht
wurde. In weiteren Experimenten wurde für das Endothel noch FITC-markiertes Ulex
europaeus Agglutinin I (UEA-1) verwendet (Tab. 2.21). Zuerst wurden die
Gewebeschnitte in 1 ml 1xPBS /1% BSA überführt und für 30 min bei 37°C mit
Syto®63 (siehe oben) inkubiert. Danach wurde das Volumen auf 100 µl reduziert und
die konjugierten Antikörper und das UEA-1 zugegeben und für 20 min bei 4°C
inkubiert. Dann wurden die Frischgewebeschnitte mit frischem kalten PBS/BSA
gewaschen und für weitere 10 min mit PI inkubiert (Tab. 2.21). Die Schnitte wurden
dann auf Objektträger überführt, die mit ca. sieben Schichten Tesa-Film beklebt
waren, um ein Quetschen der Schnitte zu vermeiden. Die Färbungen wurden dann
mit einem CLSM sichtbar gemacht (siehe oben).
2. Material und Methoden
31
Tab. 2.21: Antikörper für die Detektierung verschiedener Kompartimente im Gewebe
FITC-markierter anti-HEA-Antikörper
Biomeda, Foster City, CA, USA
Verdünnung: 1:20
PE-markierter CD34 Antikörper
BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg
Verdünnung: 1:20
FITC-markiertes UEA-1
Alexis, Grunberg
Verdünnung: 1:50
2.3.3 Test der Diffusionsfähigkeit der Frischgewebeschnitte
Zur Überprüfung der Durchlässigkeit der Frischgewebeschnitte wurden sie mit einem
Fluoreszenz-markierten Paclitaxel (Tab. 2.22) und einem FITC-konjugierten AntiHEA-125-Antikörper inkubiert (Tab. 2.21). Mit Hilfe des CLSM wurden die
Frischgewebeschnitte
von
oben
nach
unten
in
verschiedenen
Ebenen
aufgenommen.
Tab. 2.22: Substanzen zur Untersuchung der Diffusionsfähigkeit der Frischgewebeschnitte
Paclitaxel Oregon-Green
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
Eingesetzte Konzentration:
Stammlösung 1 mg/ml, daraus 2 µl/ml
2.3.4 Untersuchung der Chemosensitivität der Tumore anhand der
Frischgewebeschnitte
Nach der Kultivierung der Gewebeschnitte mit verschiedenen Zytostatika und TKIs
für72 h wurden Vitalität, Proliferation und Zelltod auf verschiedene Arten untersucht.
Es wurde die Viabilität der Frischgewebeschnitte mit einer Fluoreszenzfärbung am
konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM) untersucht und verschiedene
2. Material und Methoden
32
spezifische Antigene in Paraffinschnitten nachgewiesen. Zusätzliche wurde der ATPund DNA-Gehalt im Homogenat des Frischgewebeschnittes mit Hilfe von
Lumineszenz- und Fluoreszenz-Messungen gemessen.
2.3.4.1 Fluoreszenzfärbung für die Identifikation lebender und toter Zellen
Für die Identifikation lebender Zellen innerhalb der Frischgewebeschnitte wurden
verschiedene
Fluoreszenzfarbstoffe
eingesetzt.
Zur
Validierung
wurden
in
Zellkulturexperimenten herkömmliche Färbungen für Zelltod und Zellviabilität
durchgeführt.
Für die Etablierung wurde ein einfaches Zelllinienmodell verwendet. Es wurde die
hämatopoetische Zelllinie BaF3-p185 verwendet, die mit dem Onkogen Bcr-Abl
transfiziert wurde und dadurch unabhängig von externen Wachstumsfaktoren
proliferieren kann. Das Onkogen Bcr-Abl kann mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)
Imatinib gehemmt werden, wodurch es zu einer Hemmung des Wachstumssignals
kommt und Zelltod induziert wird.
Die Zellen wurden für 8 h mit 1 µM Imatinib behandelt um Bcr-Abl zu hemmen und so
Zelltod auszulösen. Für die Anfärbung vitaler Zellen wurde der Farbstoff
Tetramethylrhodamin-Methyl-Ester
(TMRM)
verwendet,
der
von
aktiven
Mitochondrien umgesetzt wird (Floryk et al., 1999). Zur Färbung der toten Zellen
wurde der -Farbstoff Picogreen verwendet, der durch die Membran toter Zellen
hindurch diffundieren kann und die DNA anfärbt (Singer et al., 1997). Für die
Anfärbung aller Zellen wurde der DNA-Farbstoff Syto®63 verwendet (Wlodkowic et
al., 2008). Alle drei Farbstoffe konnten gleichzeitig im Kulturmedium für 45 min bei
37°C inkubiert werden. Die verwendeten Konzentrationen sind in Tab. 2.23
aufgelistet. Als Referenz der Picogreen-Färbung wurde noch der Farbstoff
Propidium-Iodid (PI) in einer 1x PBS/1% BSA-Lösung eingesetzt. Die Zellen wurden
durch Zentrifugation aufkonzentriert und auf Objektträger getropft.
Diese Färbungen wurden am konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM)
ausgewertet (Tab. 2.23). Es wurde anhand der Bilder der Anteil der lebenden und
toten Zellen gezählt. Dafür wurden pro Objektträger ca. 10 Gesichtsfelder mit
mindestens 20 Zellen von zwei unabhängigen Beobachtern ausgezählt.
2. Material und Methoden
33
Zur Validierung dieser Methode wurde die Färbung mit einer bereits gut etablierten
durchflusszytometrischen Methode zur Quantifizierung der lebenden und toten Zellen
verglichen. Dafür wurden die etablierten Farbstoffe AnnexinV-FITC (Tab. 2.23), der
die toten, bzw. apoptotischen Zellen anfärbt und TMRM für die Färbung der viablen
Zellen verglichen (Tab. 2.23).
Tab. 2.23: Materialien und Geräte für die Fluoreszenzfärbung zur Bestimmung der Zellviabilität
PI (0,2 µg/ml)
Sigma, Taufkirchen
TMRM (0,5 µM)
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
®
Syto 63 (1,25 µM)
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
Picogreen (1:1500)
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
Inverses CLSM:
Leica Lasertechnik, Wetzlar
Leica DM IRBE
Laser:
Argon und Helium/Neon Laser
Detektoren/Filter:
488 nm (Picogreen/FITC)
560 - 590 nm (TMRM/PI)
®
650 - 700 nm (Syto 63)
2.3.4.2 Fluoreszenzfärbung zur Untersuchung der Viabilität der Zellen in den
Frischgewebeschnitte
Um die lebenden Zellen innerhalb der Frischgewebeschnitte anzufärben, wurden die
Gewebeschnitte in den Vertiefungen der 24-Loch Platte mit 0,5 µM TMRM für 30 min
inkubiert. Zeitgleich wurde zur Färbung der DNA aller Zellen 1,25 µM Syto®63
verwendet, für die Anfärbung der toten Zellen wurde nach 20 min Inkubation mit
TMRM und Syto®63 bei 37°C 0,7 µl Picogreen zugegeben und für weitere 10 min bei
37°C inkubiert (Tab. 2.23). In der Zwischenzeit wurden Objektträger für die
Gewebeschnitte vorbereitet. Dazu wurden die äußeren Ränder der Objektträger mit
ca. sieben Schichten Tesa-Film umwickelt um einen Abstand zum Deckglas zu
gewährleisten und damit den Gewebeschnitt nicht zu quetschen. Nach der Färbung
wurden die Gewebeschnitte mit einem Tropfen Medium auf die vorbereiteten
2. Material und Methoden
34
Objektträger gelegt und mit einem Deckglas fixiert. Das Deckglas wurde mit TesaFilm fixiert und die Färbung des Frischgewebeschnitts mit Hilfe des inversen CLSM
(Tab. 2.23) detektiert.
2.3.4.3 ATP-/DNA-Gehaltsmessung
Für die Untersuchung der Viabilität wurde auch der ATP-Gehalt in den einzelnen
Frischgewebeschnitten untersucht. Dafür wurden die Schnitte in eine Lösung aus
2 mM EDTA (pH 10,9) in 70% igem Ethanol überführt und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die Frischgewebeschnitte wurden dann mit Hilfe einer FastPrep
Zentrifuge in Lysing Matrix D gefüllten Röhrchen in 3 mal 20 sec homogenisiert (Tab.
2.24). Vom Homogenat wurden 50 µl mit 450 µl Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5)
verdünnt und 50 µl in eine weiße, undurchsichtige 96 Loch Platte überführt. Zum
Homogenat
wurden 50 µl des
Luciferin-Luciferase-Reagenz aus dem ATP
Bioluminescence Assay Kit zugegeben und am ELISA-Reader gemessen. Zum
Abgleich der unterschiedlichen Zellzahl der einzelnen Gewebeschnitte wurde mit
dem Homogenat der DNA-Gehalt mit Hilfe des Picogreen DNA quantification system
(Tab. 2.24) am ELISA-Reader bestimmt.
Tab. 2.24: Materialien für die ATP/DNA-Gehaltsmessung
®
FastPrep Zentrifuge
Qbiogene, Heidelberg
Lysing Matrix D tubes
Qbiogene, Heidelberg
ATP Bioluminescence Assay Kit
DSC Diagnostics, Hamburg
Picogreen DNA quantification system
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
2.3.5 Immunhistochemische Färbungen
Für immunhistochemische Analysen wurden die Gewebeschnitte nach der Kultur zur
weiteren Einbettung in Paraffin in 4% igem Formalin fixiert. Die Einbettung wurde im
Pathologischen Institut des Robert Bosch Krankenhauses, Stuttgart durchgeführt.
Aus den Gewebeblöcken der in Paraffin eingebetteten Frischgewebeschnitte wurden
dann mit einem Rotationsmikrotom (Tab. 2.25) 3 µm dicke Paraffinschnitte
2. Material und Methoden
35
hergestellt, die dann für verschiedene immunhistochemische Färbungen verwendet
werden konnten.
2.3.5.1 Hämatoxilin - Eosin - Färbung (H&E) für den Vergleich der Morphologie
der Frischgewebeschnitte mit den original OP-Präparaten
Um die Morphologie der Frischgewebeschnitte mit der des OP-Präparates
der/desselben Patientin/en zu vergleichen, wurde eine Hämatoxilin-Eosin-Färbung
(H&E-Färbung) durchgeführt. Dafür wurden die Paraffinschnitte mittels Xylol
entparaffiniert und durch eine absteigende Alkoholreihe (100% Ethanol, 96%
Ethanol, 70% Isopropanol, H2O) rehydriert. Anschließend wurden die Schnitte 5 min
mit Hämatoxilin gefärbt und anschließend gut gewässert. Danach wurde für 1 min mit
Eosin inkubiert und mit darauffolgender aufsteigender Alkoholreihe für die
Eindeckung dehydriert. Die Schnitte wurden mit DEPEX Mounting Medium
eingedeckt und so haltbar gemacht. Die verwendeten Materialien sind in Tab. 2.25
aufgeführt.
Tab. 2.25: Materialien zur Herstellung und Färbung der Paraffinschnitte
Rotationsmikrotom RM 2055
Leica Microsystems, Wetzlar
Xylol, 100% Ethanol, 96% Ethanol,
Merck, Darmstadt
70% Isopropanol
Citratpuffer, pH 6
DakoCytomation, Dänemark
Gurr DEPEX Medium
Merck, Darmstadt
Hämatoxilin
Merck, Darmstadt
Eosin
Merck, Darmstadt
2.3.5.2 Darstellung verschiedener Zelltypen innerhalb der Frischgewebeschnitte
Die verschiedenen Zelltypen innerhalb der Frischgewebeschnitte wurden in
immunhistochemischen
Färbungen
mit
Antikörpern
gegen
Zelltyp-spezifische
Oberflächenmarker sichtbar gemacht. Die Endothelien wurden mit einem anti-CD34-
2. Material und Methoden
36
Antikörper und die Epithelzellen mit einem anti-HEA-Antikörper sichtbar gemacht
(Tab. 2.26). Die Vorbehandlung der Paraffinschnitte für die anti-CD34- und anti-HEAAntikörper wurde für 15min in einem Dampfgarer in einer 2 M HCl / 0,1 M BoraxLösung durchgeführt. Die Färbung von CD34 und HEA wurde mit dem Dako Envision
Kit mit einem DakoCytomation Stainer durchgeführt. Die verwendeten Verdünnungen
der Antikörper sind in Tab. 2.26 aufgeführt.
Tab. 2.26: Materialien für die immunhistochemischen Färbungen zur Darstellung verschiedener
Zelltypen
CD34-Antikörper (1:50)
M7165; DakoCytomation, Hamburg
HEA-Antikörper (1:100)
M0804, DakoCytomation
Dako Envision Kit
DakoCytomation, Dänemark
DakoAutomation Stainer
DakoCytomation, Dänemark
2.3.5.3 Immunhistochemische Färbungen der Proliferation und des Zelltodes
innerhalb der Frischgewebeschnitte
Um
innerhalb
der Frischgewebeschnitte die
Proliferation
und
den
Zelltod
nachzuweisen, wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Für die
spezifische Färbung für proliferierende Zellen wurde ein KI67-Antikörper eingesetzt.
Der Zelltod wurde mit einem Antikörper gegen das Caspase-3 Spalt-Produkt
nachgewiesen und zusätzlich wurde noch die TUNEL-Färbung angewendet. Für die
Färbung von KI67 wurden die 3 µm dicken Paraffinschnitte für 20 min mit
Citratpuffer,
pH
6,
im
Dampfgarer
vorbehandelt.
Die
Vorbehandlung
der
Paraffinschnitte für die Färbung mit dem Caspase-3 Spalt-Produkt-Antikörper wurde
für 15min in einem Dampfgarer in einer 2 M HCl / 0,1 M Borax-Lösung durchgeführt.
Die Vorbehandlung der Schnitte für die TUNEL-Färbung erfolgte durch eine
20minütigen Proteinase K Vorinkubation (Tab. 2.27). Die Färbung von KI67 und
Caspase-3
Spalt-Produkt
wurde
mit
dem
Dako
Envision
Kit
mit
einem
DakoAutomation Stainer durchgeführt (Tab. 2.26). Die verwendeten Verdünnungen
der Antikörper sind in Tab. 2.25 aufgeführt. Die TUNEL-Methode wurde nach
Anleitung des Herstellers durchgeführt (Tab 2.27).
2. Material und Methoden
37
Tab. 2.27: Materialien für die immunhistochemischen Färbungen der Proliferation und des
Zelltodes
Proteinase K (20 µg/ml)
Qiagen, Hilden
anti-KI67 Antikörper, M7240 (1:75)
DakoCytomation, Dänemark
Caspase-3 cleavage product (1:50)
Cell Signalling Technology, USA
®
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis
Chemicon
Detection Kit (TUNEL)
2.3.6 Bestimmung der pathologischen Regression der Tumorzellen und
des Stromas nach neoadjuvanter Chemotherapie anhand
Präparaten von Mammakarzinomen
Anhand von Hämatoxilin-Eosin-Färbungen (H&E) von Paraffinschnitten neoadjuvant
behandelter Mammakarzinome wurde die pathologische Regression des Tumors und
des Stromas bestimmt. Dazu wurden H&E gefärbte Paraffinschnitte der Biopsie vor
der Therapie mit H&E-Färbungen des OP-Präparates nach mehreren Zyklen
Chemotherapie verglichen.
Die Regression der Tumorzellen wurde mit Hilfe des Pathologen Herrn Dr. Fritz nach
Sinn (Sinn et al., 1994) beurteilt. Tumore mit einem Tumorregressionsgrad von 2, 3
oder 4 wurden als Tumore mit einem pathologischen Ansprechen definiert.
Um die Regression des Tumorstromas bewerten zu können, wurde mit Hilfe des
Pathologen Herrn Dr. Fritz ein Schema für die Einteilung des Aktivitätsgrads
entwickelt.
Das
Tumorstroma
wurde
in
4
Aktivitätsgrade
eingeteilt.
Die
verschiedenen Aktivitätsgrade wurden anhand der Zellzahl und der Morphologie der
einzelnen Stromazellen pro Gesichtsfeld eingeteilt. Grad 0 repräsentiert Tumore mit
sehr inaktivem, ruhigem Stroma mit der geringsten Zelldichte mit weniger als 10
Fibrozyten pro Gesichtsfeld. Diese Fibrozyten sind charakterisiert durch sehr
schmale, spindelförmige Zellkerne. Grad 1 wurde als meist inaktives Stroma mit
mehr als 10 Fibrozyten pro Gesichtsfeld und 1-3 vesikulären Zellen (Fibroblasten
oder endothelialen Zellen mit vergrößerten, blasigen Zellkernen) eingeteilt. Grad 2 ist
durch mittelmäßig reaktives Stroma charakterisiert, dass mehr als 10 Fibrozyten und
2. Material und Methoden
38
3-10 vesikuläre Zellen pro Gesichtsfeld zeigt. Tumore mit der höchsten zellulären
Dichte im Stromabereich werden durch Grad 3 klassifiziert. Sie enthalten mehr als 10
Fibrozyten und mehr als 10 vesikuläre Zellen pro Gesichtsfeld. Der Rückgang des
Aktivitätsgrads von Grad 3 oder 2 im Biopsiepräparat vor der neoadjuvanten
Therapie auf Grad 1 oder 0 nach der neoadjuvanten Therapie im OP-Präparat wurde
als pathologisches Ansprechen des Tumorstromas bewertet.
2.3.7 Auswertung des klinischen Ansprechens der MammakarzinomPatientinnen auf die neoadjuvante Chemotherapie
Das klinische Ansprechen der Patientinnen auf die neoadjuvante Chemotherapie
wurde anhand der klinischen Daten in der Datenbank der Gynäkologie des Robert
Bosch Krankenhauses Stuttgart unter der Leitung von Professor Dr. Wolfgang Simon
bestimmt. So war es möglich, anhand der Daten die Tumorgröße vor und nach der
Therapie die klinische Response des Tumors zu bestimmen. Die Tumorgröße wurde
vor und nach der Therapie durch Sonographie oder MRT gemessen und die
Tumorgröße durch den längsten horizontalen und den längsten vertikalen
Tumordurchmesser bestimmt. Die Patienten wurden anhand ihres Ansprechens auf
die Therapie in partielle klinische Responder (cPR), in Non-Responder (cNR) und in
klinische Complete-Responder (cCR) eingeteilt. Die Definition der cPR wurde durch
eine mehr als 50 %ige Reduktion der Tumorgröße bestimmt. Patienten mit einer
geringeren
Reduktion
wurden
als
cNR
Resttumorgewebe wurden als cCR definiert.
geführt.
Patienten
mit
keinerlei
3. Ergebnisse
39
3. Ergebnisse
Karzinome bestehen aus einem Netzwerk verschiedener Zelltypen, wie epitheliale
Tumorzellen, Fibroblasten und Endothelien sowie aus extrazellulärer Matrix. Die
Kommunikation zwischen den verschiedenen Bestandteilen spielt eine wichtige Rolle
beim Tumorwachstum, der Invasion und der Metastasierung. Damit ist es
naheliegend, dass nicht nur die Tumorzellen selbst, sondern auch das zelluläre
Stroma einen Einfluss auf die Effizienz der Tumortherapie hat. Um diesen Einfluss zu
untersuchen, wurde das Ansprechen des Tumor- und des Stromakompartiments in
vivo beobachtet und verschiedene in vitro Modelle entwickelt um den direkten Effekt
der Chemotherapie auf das Tumorstroma zu untersuchen.
3.1 Etablierung von in vivo - und in vitro - Methoden zur
Untersuchung der Wirkung von Chemotherapie
3.1.1 Methodik zu Untersuchung der Chemotherapie-Wirkung in vivo
Für die Einschätzung des pathologischen Ansprechens der Tumorzellen auf die
Chemotherapie gibt es bereits einige etablierte Schemata (Übersicht in Kuroi et al.,
2006). Um das Ansprechen des Stromakompartiments im Tumor beschreiben zu
können, wurde ein Schema entwickelt, das den Aktivitätsgrad des Stromas
beschreibt (siehe auch Kapitel 2.3.6). Der Rückgang des Aktivitätsgrads von Grad 3
oder 2 auf Grad 1 oder 0 wurde als pathologisches Ansprechen des Tumorstromas
bewertet. Beispielbilder für die verschiedenen Aktivitätsgrade zeigt die Abbildung 3.1.
3. Ergebnisse
40
Grad 0
Grad 1
20µm
Grad 2
Grad 3
20µm
50µm
20µm
50µm
20µm
50µm
50µm
Abb. 3.1: Einteilung des Aktivitätsgrades des Tumorstromas
Dargestellt sind Beispielbilder für die Einteilung der einzelnen Aktivitätsgrade des Tumorstromas
innerhalb neoadjuvant behandelter Mammakarzinome. Die obere Bildreihe zeigt Ausschnitte aus
H&E-Färbungen von Paraffinschnitten in 400facher Vergrößerung, während die untere Bildreihe eine
Übersicht mit 200facher Vergrößerung zeigt. Von links nach rechts (Grad 0 bis Grad 3) zeigt sich eine
erhöhte Aktivität in Form einer höheren Zelldichte und einer morphologischen Veränderung der
Zellkerne.
3.1.2 Kultivierung und Charakterisierung
Fibroblasten (TAFs)
der
Tumor-assoziierten
Zur Untersuchung der Chemosensitivität von Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs)
in vitro wurden zunächst aus frischem Tumormaterial, das nicht für diagnostische
Zwecke
notwendig
war
und
mit
Einverständnis
der
Patienten/innen
für
Forschungszwecke verwendet werden konnte, Fibroblasten isoliert und in Kultur
gebracht. Durch enzymatischen Verdau konnten die Zellen aus dem Gewebeverband
herausgelöst und in eine Zellkulturflasche überführt werden. Die TAFs erreichten
bereits nach ca. 8 Tagen eine 80 - 90%ige Konfluenz in Passage 1 (Beispielbild in
Abb. 3.2). Ein Teil der Zellen wurde dann für spätere Untersuchungen
kryokonserviert. Der andere Teil wurde für die Charakterisierung weiter kultiviert.
3. Ergebnisse
41
Abb. 3.2: Primäre isolierte TAFs in Kultur
Beispielbild für proliferierende isolierte primäre TAFs aus Bronchialkarzinomgewebe in einer
Zellkulturflasche mit ca. 40%iger Konfluenz.
Damit sichergestellt werden konnte, dass es sich bei den isolierten Fibroblasten um
Tumor-assoziierte Fibroblasten (TAFs) handelt, wurden sie auf verschiedene
Oberflächenmarker untersucht. Zum einen wurde die Expression des Epithelspezifischen Antigens (ESA) untersucht. ESA ist spezifisch für Epithelzellen und wird
nicht von Zellen mesenchymalen Ursprungs exprimiert (Simon et al., 1990).
Zusätzlich wurde die Expression des Oberflächenantigens FAP (Fibroblast activation
protein) untersucht, das ausschließlich in Tumor-assoziierten Fibroblasten exprimiert
wird (Rettig et al., 1993).
3.1.2.1 Expression des Epithel-spezifischen Antigens (ESA)
Der
Oberflächenmarker
Epithel-spezifisches
Antigen
(ESA)
wurde
am
Durchflusszytometer bestimmt. Bei allen 17 getesteten isolierten primären TAFs
konnte keine ESA-Expression nachgewiesen werden. Ein exemplarisches Beispiel
der durchflusszytometrischen Untersuchung der ESA-Expression der TAFs eines
Mammakarzinoms zeigt Abb. 3.3 a. Im Vergleich dazu zeigte die epitheliale
Mammakarzinomzelllinie MCF7 eine ESA-Expression in der gesamten Population
(Abb. 3.3. b).
3. Ergebnisse
42
a
b
Abb. 3.3: Durchflusszytometrische Expressionsanalyse des Epithel-spezifischen Antigens
(ESA) der TAFs eines Mammakarzinoms.
Abb. 3.3 a zeigt die fehlende ESA-Expression exemplarisch von TAFs eines Mammakarzinoms,
während Abb. 3.3 b die ESA-Expression der epithelialen Mammakarzinomzelllinie MCF7 zeigt.
3.1.2.2 Expressionsanalyse des Fibroblast activation protein (FAP)
Um sicherzustellen, dass es sich bei den hier isolierten primären Fibroblasten um
TAFs handelt, wurden in Kooperation mit dem Institut für Zellbiologie und
Immunologie der Universität Stuttgart unter der Leitung von Prof. K. Pfizenmaier 16
primäre TAFs auf ihre Fibroblast activation protein (FAP) Expression mittels
Durchflusszytometer untersucht. Alle 16 getesteten TAFs zeigten eine FAPExpression. Ein exemplarisches Beispiel der FAP-Expression der TAFs eines
Bronchialkarzinoms zeigt Abb. 3.4.
3. Ergebnisse
43
Abb. 3.4: Nachweis von FAP auf der Zelloberfläche von TAFs
Dargestellt ist die Verschiebung der Fluoreszenz durch Bindung des FITC-markierten FAPspezifischen Antikörpers in TAFs eines Bronchialkarzinoms im Vergleich zur IgG-Kontrolle.
3.1.3 Etablierung eines ex vivo-nahen Gewebekultursystems
Da innerhalb solider Tumore die Zell-Zell-Kommunikation eine besondere Rolle
spielt, wurde nach einem Modell gesucht, das die Mikroumgebung des Tumors
möglichst gut widerspiegelt. Um die Rolle des Stromas im Tumor besser untersuchen
zu können, wurde ein Gewebekulturmodell entwickelt, das die Tumor-StromaInteraktion möglichst naturgetreu wiedergeben kann. Durch Kultivierung frischer
Gewebeschnitte bleibt der Gewebeverband intakt und die Zellen können weiterhin
mit dem umliegenden Gewebe kommunizieren. Mit den im Folgenden beschriebenen
Untersuchungsmöglichkeiten gelang es durch dieses Modell, die Reaktion der
epithelialen Tumorzellen und der Stromazellen auf die Chemotherapie zu
beobachten.
In Kooperation mit dem Pathologischen Institut des Robert-Bosch-Krankenhauses in
Stuttgart konnte unter Vorlage der Einverständniserklärung des Patienten Gewebe
aus Mamma- und Bronchialkarzinomen für Forschungszwecke verwendet werden.
Die Herstellung der Frischgewebeschnitte aus diesen Gewebestücken ist in Kapitel
2.3 beschrieben. Zunächst wurde die Viabilität der Frischgewebeschnitte mit
verschiedenen Methoden geprüft.
3. Ergebnisse
44
3.1.3.1 Viabilitäts-Fluoreszenzfärbungen eines etablierten Zellkulturmodells
Um die optimalen Bedingungen für eine simultane Fluoreszenzfärbung für lebende
und tote Zellen innerhalb der unfixierten Frischgewebeschnitte zu etablieren, wurde
die Fluoreszenzfärbung zunächst an einem einfachen Zellkulturmodell getestet.
Dafür wurde die hämatopoetische Zelllinie BaF3-p185 verwendet, die mit dem
Onkogen Bcr-Abl transfiziert wurde und dadurch unabhängig von externen
Wachstumsfaktoren proliferieren kann. Durch den Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)
Imatinib kann Bcr-Abl blockiert werden, wodurch es zu einer Hemmung des
Wachstumssignals kommt und Zelltod induziert wird (Moehring et al., 2005).
Abbildung 3.5 zeigt die simultane Einzellzellfärbung mit drei verschiedenen
Fluoreszenzfarbstoffen, dargestellt mittels konfokalen Laser Scanning MikroskopAufnahmen in 400facher Vergrößerung. TMRM (rot) wird durch seine positive
Ladung
in
den
negativ
geladenen
Mitochondrien
akkumuliert.
Bei
einer
Depolarisation der Mitochondrienmembran, wie sie beim Zelltod stattfindet, geht die
Akkumulation in den Mitochondrien wieder verloren. Der Fluoreszenzfarbstoff
Picogreen kann nur durch die zerstörten Plasmamembranen toter Zellen in die Zelle
hinein diffundieren und interkaliert dann in doppelsträngige DNA. Syto®63 ist
ebenfalls ein DNA-Farbstoff, diffundiert aber passiv durch die Membranen vitaler und
toter Zellen. Wie in der Abbildung 3.5 zu sehen ist, schließen sich die TMRMFärbung (Abb. 3.5, oben links) und die Picogreen-Färbung (Abb. 3.5, unten links)
gegenseitig aus, während alle Zellen eine Färbung mit Syto®63 (Abb. 3.5, oben Mitte)
zeigen. Die überlagerte Färbung (Abb. 3.5, unten rechts) mit dem Hellfeldbild (Abb.
3.5, oben rechts) macht die Spezifität der einzelnen Farbstoffe innerhalb der Zellen
noch einmal deutlicher. Syto®63 und Picogreen befinden sich ausschließlich im
Zellkern, während TMRM nur im Cytoplasma zu sehen ist.
3. Ergebnisse
45
®
Abb. 3.5: Simultane Einzelzellfluoreszenzfärbung mit TMRM, Syto 63 und Picogreen
Dargstellt sind Bcr-Abl positive BaF3-p185 Zellen, in denen durch den TKI Imatinib Zelltod induziert
wurde. Die lebenden Zellen akkumulierten TMRM (oben links), die toten Zellen Picogreen (unten
®
links). Als Referenz wurden die lebenden und toten Zellen mit dem DNA-Farbstoff Syto 63 (oben
Mitte) angefärbt. Zusätzlich ist noch das Hellfeldbild (HF, oben rechts) und die Überlagerung aller
Färbungen dargstellt (unten Mitte und unten rechts). Die Bilder sind bei einer 630fachen Vergrößerung
aufgenommen worden.
Die Zuverlässigkeit der Färbung der toten Zellen mit dem Farbstoff Picogreen wurde
durch den Vergleich mit dem Farbstoff Propidium-Iodid (PI) überprüft (Abb. 3.6).
Dieser Farbstoff ist gut etabliert und wird häufig zur Detektion von toten Zellen
eingesetzt (Arndt-Jovin et al., 1989). Es wurde wiederum die Bcr-Abl positive BaF3p185
Zelllinie
verwendet,
in
der
der
Zelltod
durch
die
Hemmung
des
Wachstumssignals des Onkogens Bcr-Abl durch den TKI Imatinib induziert wurde.
Die mit PI gefärbten toten Zellen werden im oberen linken Bild der Abbildung 3.6
gezeigt. Zusätzlich wurde hier die DNA ebenfalls mit Syto®63 (Abb. 3.6, oben rechts)
angefärbt. Zusätzlich werden die Zellen im Durchlicht dargestellt (Abb. 3.6, unten
links) und die Überlagerung der Färbungen mit dem Durchlichtbild ist in Abbildung
3.6 im unteren rechten Bild zu sehen.
3. Ergebnisse
46
Abb. 3.6: Einzelzellfärbung mit Propidium-Iodid (PI)
Dargstellt sind Bcr-Abl positive BaF3-p185 Zellen, in denen durch den TKI Imatinib Zelltod induziert
®
wurde. Die toten Zellen wurden mit PI (oben links) und alle Zellen mit Syto 63 (oben rechts) angefärbt.
Unten links ist zusätzlich noch das Hellfeld (HF) dargestellt und die Überlagerung aller Färbungen ist
im Bild unten rechts zu sehen. Die Bilder sind bei einer 400fachen Vergrößerung aufgenommen
worden.
Abbildung 3.7 zeigt den Vergleich der Rate der mit PI/Syto®63 zu den mit
Picogreen/TMRM gefärbten BaF3-p185 Zellen durch die Auszählung von zehn
verschiedenen Bildern mit mindestens 20 Zellen. Dargestellt sind die ausgezählten
PI bzw. Picogreen positiven toten Zellen in Prozent zu allen gezählten Zellen. Der
Vergleich der verschiedenen Färbungen zeigt, dass die Färbung mit Picogreen
genauso gut geeignet ist, um die Anzahl der toten Zellen zu bestimmen, wie die
bereits etablierte Färbung mit PI.
3. Ergebnisse
47
Abb. 3.7: Vergleich der PI- und Picogreen-Färbung
Dieses Diagramm zeigt den Vergleich der Anzahl der toten Zellen der PI bzw. Picogreen-Färbung in
Bezug auf die Zellzahl aller gezählten Zellen in Prozent. Es wurden zehn verschiedene Gesichtsfelder
mit mindestens 20 Zellen bei einer 400fachen Vergrößerung ausgezählt. Die Balken zeigen die
Standardabweichung der zehn verschiedenen Gesichtsfelder.
Eine
weitere
Möglichkeit
der
Verifizierung
der
Zuverlässigkeit
der
Fluoreszenzfärbung mit Picogreen und TMRM ist der Vergleich mit der bereits lang
etablierten Methode der Zelltod-spezifischen Färbung mit AnnexinV-FITC (Creutz,
1992). Hierfür wurden wiederum Bcr-Abl positive BaF3-p185 Zellen mit dem TKI
Imatinib behandelt. Mit Hilfe des Durchflusszytometers wurden die Raten der
fluoreszierenden Zellen bestimmt.
Die Rate der AnnexinV-FITC-positiven und somit toten Zellen lag bei 36,6% (Abb.
3.8, links). Die Färbung mit Picogreen zeigte eine Rate der toten Zellen bei
vergleichbaren 37,1 % positiven Zellen (Abb. 3.8, Mitte). Zum weiteren Vergleich
zeigte die Färbung der viablen Zellen mit TMRM eine Rate von 35,6 % TMRM
negativen Zellen, d.h. die Probe hatte einen Anteil von 35,6 % toten Zellen (Abb. 3.8,
rechts), da TMRM nur in Zellen mit aktiven Mitochondrien akkumuliert. Die
gemessenen Raten der verschiedenen Färbungen stimmen alle überein, so dass die
Färbung mit TMRM und Picogreen auch in weiteren Fluoreszenzfärbungen der
Frischgewebeschnitte verwendet werden kann.
3. Ergebnisse
48
37.1%
35.6%
Zellzahl
36.6 %
AnnexinV-FITC
Picogreen
TMRM
Abb. 3.8: Durchflusszytometrische Bestimmung der Rate der toten Zellen
Das Diagramm links zeigt die etablierte AnnexinV-FITC Färbung der toten Zellen, im mittleren Bild ist
die Färbung der toten Zellen mit dem Farbstoff Picogreen dargestellt und rechts ist die Färbung der
lebenden Zellen mit TMRM zu sehen. Die Rate der toten Zellen wird bei allen drei Färbemethoden in
Prozent dargestellt und zeigen vergleichbare Werte.
3.1.3.2 Fluoreszenzfärbung der Frischgewebeschnitte
Die in der Einzelzellkultur etablierten Fluoreszenzfarbstoffe wurden nun für die
Untersuchung der Viabilität der Frischgewebeschnitte von Mammakarzinomen
verwendet. Abbildung 3.9 zeigt exemplarische Bilder der Fluoreszenz-gefärbten
Frischgewebeschnitte im konfokalen Laser-Scan-Mikroskop (CLSM) nach einem und
vier Tagen in Kultur. Die viablen Zellen wurden mit TMRM (rot) angefärbt. Die toten
Zellen wurden mit dem Farbstoff Picogreen (grün) dargestellt. Zusätzlich wurden alle
Zellen mit dem Farbstoff Syto®63 angefärbt. Die Vitalität lässt nach vier Tagen Kultur
nicht sichtbar nach, da die Anzahl der TMRM-positiven viablen Zellen nicht abnimmt
und gleichzeitig auch kein Anstieg der Picogreen-gefärbten toten Zellen zu
beobachten ist. Somit kann davon ausgegangen werden, dass eine Kultur der
Frischgewebeschnitte
gewährleistet ist.
über
mindestens
vier
Tage
ohne
Viabilitätsverlust
3. Ergebnisse
49
20µm
20µm
d1
d4
Abb. 3.9: Viabilitätsfärbung der Frischgewebeschnitte eines Mammakarzinoms
Exemplarische Bilder von Frischgewebeschnitten eines Mammakarzinoms am CLSM mit der
Viabilitätsfärbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen TMRM (rot) für die viablen Zellen, Picogreen (grün)
®
für die toten Zellen und die Färbung aller Zellen mit Syto 63 (blau). Es werden Frischgewebeschnitte
nach einem Tag (d 1) und nach vier Tagen (d 4) in Kultur verglichen. Es konnte auch nach vier Tagen
in Kultur kein Anstieg der Anzahl der toten Zellen beobachtet werden. Die Balken links unten in den
Bildern geben 20 µm des Schnittes wieder.
Zusätzlich wurde die Anzahl der Picogreen positiven toten Zellen nach einem und
nach vier Tagen in Kultur im Vergleich zu allen mit Syto®63 gefärbten Zellen
bestimmt. Dafür wurden Bilder der Fluoreszenzfärbung im CLSM in drei
verschiedenen Gesichtsfeldern von sechs verschiedenen Mammakarzinomen
ausgezählt. Das Verhältnis der Picogreen positiven toten Zellen zu allen durch
Syto®63 angefärbte Zellen wurde bestimmt und in Prozent dargestellt (Abb. 3.10).
Auch hier kann kein deutlicher Rückgang der Viabilität der Zellen nach vier Tagen in
Kultur festgestellt werden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die
Frischgewebeschnitte
für
mindestens
Kulturbedingungen kultiviert werden können.
vier
Tage
unter
den
gegebenen
3. Ergebnisse
50
Abb. 3.10: Auszählung der vitalen und toten Zellen anhand der Viabilitätsfärbung
Diese Abbildung zeigt die Rate der toten Zellen im Vergleich zu allen Zellen in Prozent an d 1 und d 4
nach Kultur. Es wurden drei verschiedene Gesichtsfelder in Frischgewebeschnitten von sechs
verschiedenen Mammakarzinomen ausgezählt. Dargestellt ist die Standardabweichung der sechs
verschiedenen Mammakarzinome.
Auch
mit
Frischgewebeschnitten
Fluoreszenzfärbung
getestet.
aus
Bronchialkarzinomgewebe
Diese
zeigten
aber
eine
wurde
sehr
die
starke
Hintergrundfärbung der Kollagenfasern der Extra-zellulären Matrix des Gewebes, so
dass diese Auswertung nicht für die Bronchialkarzinom-Gewebeschnitte genutzt
werden konnte. Exemplarisches Beispiel der Fluoreszenzfärbung mit TMRM (rot,
Abb. 3.11 links), Syto®63 (blau, Abb. 3.11 zweites Bild von links) und Picogreen
(grün,
Abb.
3.11
zweites
Bild
von
rechts).
Die
Überlagerung
der
drei
Fluoreszenszfarbstoffe zeigt das rechte Bild.
Abb. 3.11: Fluoreszenzfärbung eines Frischgewebeschnittes eines Bronchialkarzinoms
Die exemplarischen Bilder eines Bronchialkarzinoms zeigen die Fluoreszenzfärbung eines
Frischgewebeschnittes eines Bronchialkarzinoms. Das linke Bild zeigt die TMRM-Färbung (rot), das
®
zweite von links zeigt die Färbung mit Syto 63 (blau) und das zweite von rechts die Färbung mit
Picogreen (grün). Im rechten Bild ist die Überlagerung der drei Farbstoffe zu sehen. Die Bilder sind bei
400facher Vergrößerung aufgenommen worden.
3. Ergebnisse
51
3.1.3.3 ATP- und DNA-Bestimmung der Frischgewebeschnitte
Eine weitere Möglichkeit, die Vitalität der Zellen innerhalb der Frischgewebeschnitte
zu untersuchen, bietet die Bestimmung des ATP- und DNA-Gehalts (Labarca et al.,
1980; Hunter et al., 1993).
Dafür wurden die Frischgewebeschnitte der Mammakarzinome homogenisiert und
der ATP-Gehalt mit Hilfe einer Luciferin-Luciferase-Reaktion gemessen. Der DNAGehalt der Gewebeschnitte wurde als Maß der Zellzahl innerhalb der einzelnen
Frischgewebeschnitte herangezogen, um die Heterogenität der verschiedenen
Schnitte zu berücksichtigen. Die DNA-Gehaltsbestimmung wurde mit Hilfe des
Fluoreszenzfarbstoffs Picogreen, der in die DNA interkaliert, photometrisch bestimmt.
Abb. 3.12 zeigt ein exemplarisches Beispiel eines Mammakarzinoms. Es wurde die
Viabilität der Frischgewebeschnitte einen, vier und sechs Tage nach Kultur bestimmt.
Die Viabilität an Tag vier ist nicht geringer als an Tag eins, aber sie lässt nach 6 d
Kultur erheblich nach. Dieses Ergebnis ist mit dem Ergebnis der Fluoreszenzfärbung
(Abb. 3.9 und 3.10) vergleichbar und zeigt, dass die Vitalität der Zellen innerhalb vier
Tagen unter den gegebenen Kulturbedingungen erhalten bleibt. Alle weiteren
Untersuchungen der Wirkung von Chemotherapeutika wurden innerhalb einer
Kulturdauer von vier Tagen durchgeführt.
Ratio ATP/DNA
1.2
0.8
0.4
0.0
d1
d4
d6
Abb. 3.12: ATP/DNA-Bestimmung der Frischgewebeschnitte eines Mammakarzinoms
Dargestellt ist ein exemplarisches Beispiel der Ratio der ATP/DNA-Gehaltsbestimmung einen (d 1),
vier (d 4) und sechs (d 6) Tage nach Kultur anhand Frischgewebeschnitten eines Mammakarzinoms.
Das Balkendiagramm zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung technischer Triplikate.
3. Ergebnisse
52
3.1.3.4 Untersuchung von morphologischen Veränderungen der
Frischgewebeschnitte
Um zu klären, ob sich die Morphologie der Frischgewebeschnitte durch die
mechanische Belastung des Schneidens und die viertägige Kultivierung im Vergleich
zur Morphologie des Präparates, welches unmittelbar nach der OP für die
Routinediagnostik in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet wird, verändert,
wurden Paraffinschnitte der Frischgewebeschnitte nach vier Tagen Kultivierung mit
Hämatoxilin & Eosin (H&E) gefärbt. Diese H&E gefärbten Frischgewebeschnitte
wurden mit den H&E-Färbungen der Routineschnitte desselben Mammakarzinoms
aus dem Pathologischen Institut des Robert-Bosch-Krankenhauses in Stuttgart
verglichen (Abb. 3.13). Es zeigte sich keinerlei Veränderung in der Morphologie
innerhalb der Frischgewebeschnitte. Damit konnte die Tauglichkeit der verwendeten
Kulturbedingungen zusätzlich bestätigt werden.
Abb. 3.13: Vergleich der Morphologie der Frischgewebeschnitte mit dem Originalpräparat
Die Abbildung zeigt die H&E-Färbungen eines exemplarischen Frischgewebeschnittes eines
Mammakarzinoms (links) im Vergleich zu dem entsprechenden Originalpräparat desselben
Tumorgewebes aus der Routinediagnostik eines Mammakarzinoms (rechts).
3.1.3.5 Identifikation verschiedener Zelltypen im viablen Gewebe
Zur Darstellung der epithelialen Tumorzellen im vitalen Frischgewebeschnitt eines
Mammakarzinoms wurde dieser mit einem FITC-konjugierten Anti-ESA-Antikörper
(grün) und dem DNA-Farbstoff Syto®63 (blau) für die Darstellung der Zellkerne
gefärbt
(Abb.
3.14,
links).
Zum
Vergleich
zeigt
Abbildung
3.14
die
3. Ergebnisse
53
immunhistochemische
Paraffinschnittes
Pathologischen
Färbung
desselben
Instituts
der
epithelialen
Tumorgewebes
am
aus
Zellen
der
innerhalb
Routinediagnostik
Robert-Bosch-Krankenhaus
in
Stuttgart.
des
des
Die
Tumorzellen werden spezifisch mit einem Epithel-spezifischen Antigen (ESA)Antikörper (Abb. 3.14, Mitte) oder einem Cytokeratin 18 (CK18)-Antikörper (Abb.
3.14, rechts) gefärbt.
Frischgewebeschnitt
Tumorpräparat der Routinediagnostik
ESA
ESA-FITC
+Syto®63
CK18
Abb 3.14: Färbung von epithelialen Tumorzellen in Gewebeschnitten.
Im linken Bild ist die Fluoreszenzfärbung mit einem FITC-konjugierten Anti-ESA-Antikörper (grün) in
Kombination
mit
dem
DNA-Farbstoff
®
Syto 63
(blau)
eines
Frischgewebeschnittes
eines
Mammakarzinoms dargestellt. Im Vergleich dazu wurden immunhistochemische Färbungen mit den
Epithel-spezifischen Anti-ESA- und Anti-CK18-Antikörpern des dazugehörigen Tumorpräparates aus
der Routinediagnostik herangezogen.
Zur Darstellung der Endothelien innerhalb der Frischgewebeschnitte eines
Mammakarzinoms wurde ein PE-konjugierter Anti-CD34-Antikörper (Abb. 3.15, links)
bzw. ein FITC-konjugiertes UEA (Abb. 3.15, Mitte) verwendet. Zum Vergleich mit
dem
Originalpräparat
aus
der
Routinediagnostik
wurde
ein
Paraffinschnitt
immunhistochemisch mit einem Anti-CD34-Antikörper angefärbt (Abb. 3.15, rechts).
Der Vergleich zeigt, dass auch die Endothelien in ihrer ursprünglichen Morphologie
erhalten bleiben und durch die Herstellung der Frischgewebeschnitte nicht
beeinträchtigt werden.
3. Ergebnisse
54
Frischgewebeschnitt
Tumorpräparat der
Routinediagnostik
40µm
CD34-PE
UEA-FITC
CD34
Abb. 3.15: Vergleich der Morphologie der Endothelien in Gewebeschnitten.
Im linken und rechten Bild sind die Endothel-spezifischen Färbungen mit einem PE-markierten AntiCD34-Antikörper (rot) und mit einem FITC-kojugierten UEA (grün) eines Frischgewebschnittes eines
Mammakarzinoms dargestellt. Im Vergleich dazu wird im rechten Bild das Originalpräparat desselben
Tumorgewebes aus der Routinediagnostik mit einer immunhistochemischen Färbung eines
Paraffinschnittes mit einem Anti-CD34-Antikörper gezeigt.
3.1.3.6 Durchlässigkeit und Diffusionsvermögen der Frischgewebeschnitte
Für die Untersuchung, inwieweit trotz kollabiertem Gefäßsystem innerhalb der
Frischgewebeschnitte die Nährstoffe und auch die zu testenden Medikamente an die
Zellen innerhalb des Gewebeverbandes gelangen, wurden die Frischgewebeschnitte
eines Mammakarzinoms mit Fluoreszenz-markierten Substanzen inkubiert. Zum
einen wurde mit einem Oregon-Green markierten Taxol (Abb. 3.16 a) und zum
anderen mit einem FITC-markierten Anti-ESA-Antiköper (Abb 3.16 b) inkubiert. Es
wurden in einem Tumornest innerhalb eines 200 µm dicken Frischgewebeschnitt
mittels CLSM alle 3 µm ein Bild eines optischen Schnittes aufgenommen. Sowohl
das Fluoreszenz-markierte Taxol (Abb. 3.16 a), als auch der FITC-markierte ESAAntikörper (Abb. 3.16) sind in allen optischen Schnitten nachweisbar. Die Abbildung
3.16 zeigt, dass sowohl größere Moleküle wie Antikörper, als auch kleine organische
Moleküle durch Diffusion in alle Bereiche des Gewebeschnittes gelangen, daher
kann davon ausgegangen werden, dass auch andere Zytostatika und auch die
Nährstoffe aus dem Kulturmedium bis ins Innere der Frischgewebeschnitte gelangen.
3. Ergebnisse
a
55
b
Abb. 3.16: Durchlässigkeit der Frischgewebeschnitte
Dargestellt sind die einzelnen optischen Schnitte im Abstand von 3 µm eines Tumornestes eines
exemplarischen Frischgewebeschnittes eines Mammakarzinoms mithilfe des CLSM. Die Färbung mit
Oregon-Green-markiertem Taxol (a) zeigte ebenso eine Anreicherung in den Tumorzellarealen wie die
Färbung mit FITC-markiertem ESA-spezifischen Antikörper (b). Die Bilder sind bei einer 100fachen
Vergrößerung aufgenommen worden und geben ca. 10% des Frischgewebeschnittes wieder.
3.1.3.7 Dosis-abhängiger Einfluss der Chemotherapie
Um den dosis-abhängigen Einfluss der Chemotherapie auf die Frischgewebeschnitte
aus den Mammakarzinomen zu untersuchen, wurden Frischgewebeschnitte über
72 h mit verschiedenen Taxol-Konzentrationen inkubiert.
Abbildung 3.17 zeigt exemplarisch die Bilder der Fluoreszenzfärbung mit TMRM
(rot), Picogreen (grün) und Syto®63 (blau) von Frischgewebeschnitten eines
Mammakarzinoms nach drei Tagen Kultivierung in An- oder Abwesenheit von drei
verschiedenen Taxolkonzentrationen. Die zunehmend toxische Wirkung der
steigenden Taxolkonzentrationen zeigt sich sowohl im CLSM (Abb. 3.17 oben und
Mitte) als auch in den H&E-Färbungen der aus den Frischgewebeschnitten
gewonnenen Paraffinschnitten (Abb. 3.17 unten). Wie gut zu erkennen ist, steigt die
3. Ergebnisse
56
Anzahl
der
Picogreen-positiven
toten
Zellen
(grün)
mit
der
steigenden
Taxolkonzentration an, während gleichzeitig die Anzahl der TMRM-positiven Zellen
(rot) abnimmt. Innerhalb der H&E-Färbungen ist auch eine deutliche Zunahme
nekrotischer Bereiche zu erkennen.
40µm
200µm
100µm
Kontrolle
Taxol 1,7 µg/ml
Taxol 6,8 µg/ml
Taxol 13,6 µg/ml
Abb. 3.17: Fluoreszenz- und H&E-Färbung der Frischgewebeschnitte eines Mammakarzinoms
nach Taxol-Behandlung
Die Abbildung zeigt von links nach rechts die Frischgewebeschnitte eines Mammakarzinoms nach
Behandlung mit steigenden Taxolkonzentrationen. In der oberen Bildreihe ist die 400fache, in der
mittleren Bildreihe die 100fache Vergrößerung der Fluoreszenz-gefärbten Frischgewebeschnitte zu
sehen. In rot sind die vitalen TMRM-positiven Zellen dargestellt, in grün die Picogreen-positiven toten
Zellen und als Referenz alle mit Syto®63 gefärbten Zellen in blau. Die untere Bildreihe zeigt die H&EFärbungen der Paraffinschnitte der Frischgewebeschnitte in 200facher Vergrößerung.
Anhand der im CLSM aufgenommenen Bilder der Frischgewebeschnitte wurden die
lebenden und die toten Zellen ausgezählt. Es wurden pro Schnitt mindestens 50
Zellen in drei verschiedenen Bildern ausgezählt. Abb. 3.18 a zeigt die Anzahl der
TMRM- und Syto®63-positiven, d.h. lebenden Zellen in Bezug zu allen Zellen in
Prozent. In Abb. 3.18 b sind die toten Zellen, d.h. die Picogreen-positiven Zellen in
Prozent zu allen gezählten Zellen dargestellt. Mit steigender Taxolkonzentration
nimmt der Prozentsatz der vitalen Zellen immer mehr ab, d.h. von ca. 85 % der
3. Ergebnisse
57
TMRM-positiven Zellen in der unbehandelten Kontrolle sinkt der Prozentsatz der
viablen Zellen in den mit der höchsten Taxolkonzentration von 13,6 µg/ml
behandelten Frischgewebeschnitten auf ca. 5 % ab (Abb. 3.18 a). Der Prozentsatz
der toten Zellen, d.h. der Picogreen-positiven Zellen steigt von ca. 15 % in der
unbehandelten Kontrolle auf ca. 90 % mit der höchsten Taxolkonzentration von
13,6 µg/ml
(Abb.
3.18 b).
Die
angebebenen
Werte
sind
Mittelwerte
±
Standardabweichung.
b
tote Zellen [%]
viable Zellen [%]
a
Taxol [µg/ml]
Taxol [µg/ml]
Abb. 3.18: Auszählung der lebenden und toten Zellen nach Behandlung mit Taxol.
Pro Behandlung wurden mindestens 50 Zellen in drei verschiedenen Gesichtsfeldern anhand der im
®
CLSM gemachten Bilder ausgezählt. Dargestellt sind die vitalen TMRM- und Syto 63-positiven Zellen
im Vergleich zu allen ausgezählten Zellen in Prozent (a). (b) zeigt die Anzahl der Picogreen-positiven
Zellen im Vergleich zu allen ausgezählten Zellen in Prozent.
Eine Zusammenfassung von Frischgewebeschnitten aus sechs verschiedenen
Mammakarzinomen wird in Abb. 3.19 gezeigt. Das linke und das mittlere Diagramm
zeigen die ausgezählten Daten der Fluoreszenzfärbungen. Das linke Diagramm zeigt
den Anteil lebender Zellen mit steigender Taxolkonzentration. Im mittleren Diagramm
sieht man den Anstieg des Anteils der toten Zellen in den Schnitten mit steigender
Taxolkonzentration. Im rechten Diagramm wird zusätzlich noch das Verhältnis des
ATP-Gehalts zum DNA-Gehalt in Prozent nach ansteigender Taxolkonzentration
dargestellt. Alle Diagramme der Abb. 3.19 zeigen einen Anstieg des Zelltods mit
zunehmender Taxolkonzentration.
3. Ergebnisse
58
Abb. 3.19: Anteile der lebenden und toten Zellen nach steigender Taxolkonzentration
Die Abbildung zeigt den Anstieg des Zelltods innerhalb der Frischgewebeschnitte von 6
verschiedenen Mammakarzinomen mit steigenden Taxolkonzentrationen. Im linken Diagramm sind
die viablen Zellen der ausgezählten Fluoreszenzfärbungen dargestellt. Das mittlere Diagramm zeigt
die Anzahl der toten Zellen innerhalb der Fluoreszenz-gefärbten Frischgewebeschnitte. Das rechte
Diagramm zeigt die ATP/DNA-Gehaltsbestimmung in Prozent. Dargestellt ist jeweils der Median, 25 %
und 75 %, sowie der höchste und der niedrigste Wert.
3.1.3.8 Zellproliferation und Zelltod verschiedener Tumorkompartimente
Mit der vorher etablierten Fluoreszenzfärbung für viable und tote Zellen ist es nicht
möglich, die verschiedenen Zelltypen innerhalb des Tumors zu identifizieren, um so
das Ansprechen der einzelnen Tumorkompartimente zu untersuchen. Daher war es
nötig, andere Möglichkeiten für die Untersuchung der Chemosensitivität zu finden. Es
wurden
an
Paraffinschnitten
der
Frischgewebeschnitte
aus
Mamma-
und
Bronchialkarzinomen immunhistochemische Färbungen durchgeführt, die spezifisch
die toten oder die lebenden Zellen identifizieren. Zur Detektion proliferierender Zellen
wurde das KI67-Antigen gefärbt, das in allen Phasen des Zellzyklusses in
proliferierenden Zellen exprimiert wird. Zur Färbung der toten Zellen wurde die
TUNEL-Methode verwendet, bei der durch Doppelstrangbrüche entstehende freie
3´OH-Enden mit markierten Nukleotiden verlängert werden.
In Abbildung 3.20 sind exemplarisch Paraffinschnitte von Frischgewebeschnitten
eines Mammakarzinoms dargestellt, die über drei Tage mit 6,8 µg/ml Taxol
behandelt wurden. Die immunhistochemischen Färbungen mit dem KI67-Antigen
(links) und dem TUNEL-Enzym (rechts) zeigen proliferierende und tote Zellen.
Innerhalb dieser Paraffinschnitten ist es durch die Gegenfärbung mit Hämatoxilin
möglich, die einzelnen Tumorkompartimente und somit auch die einzelnen Zelltypen
3. Ergebnisse
59
morphologisch zu unterscheiden. In der oberen Bildreihe in Abbildung 3.20 wird ein
Stromaareal gezeigt, in dem gefärbte TAFs und Endothelien zu sehen sind.
Die untere Bildreihe zeigt ein Areal mit vielen KI67-positiven Tumorzellen. Es ist ein
Verlust des KI67-Antigens und ein Anstieg der toten Zellen durch TUNEL-positive
Zellen
in
beiden
Arealen,
sowohl
im
Tumor-
als
auch
innerhalb
des
Stromakompartiments zu sehen.
Abb. 3.20: Immunhistochemische Färbungen der proliferierenden und toten Zellen
In der oberen Bildreihe ist ein Stromaareal innerhalb der Paraffinschnitte eines Frischgewebeschnittes
eines Mammakarzinoms zu sehen, während in der unteren Reihe ein Tumorareal gezeigt wird (jeweils
mit schwarzen Linien markiert). Links in der Abbildung ist die Anti-KI67-Antigen-Färbung in
unbehandelten Frischgewebeschnitten im Vergleich zu einem mit 6,8 µg/ml Taxol behandelten
Frischgewebschnitt zu sehen. In der rechten Hälfte der Abbildung werden wiederum unbehandelte
und Taxol-behandelte Frischgewebeschnitte gezeigt, die mit der TUNEL-Methode gefärbt wurden.
Die Abbildung 3.21 zeigt exemplarische Bilder der gleichen immunhistochemischen
Färbungen der toten und der proliferierenden Zellen in unbehandelten und mit
Cisplatin behandelten Frischgewebeschnitten eines Bronchialkarzinoms. Auch hier
ist eine morphologische Unterscheidung zwischen Tumor- und Stromazellen möglich.
3. Ergebnisse
60
Abb. 3.21: Immunhistochemische Färbungen der proliferierenden (KI67) und toten Zellen
(TUNEL) innerhalb Cisplatin-behandelter Frischgewebeschnitte eines Bronchialkarzinoms
In der oberen Bildreihe ist die immunhistochemische KI67-Färbung in unbehandelten und mit 13 µM
Cisplatin behandelten Frischgewebeschnitten eines Bronchialkarzinoms dargestellt. In der unteren
Bildreihe ist die immunhistochemische TUNEL-Färbung zu sehen. In allen Bildern ist jeweils das
Tumorareal mit schwarzen Linien markiert.
Diese immunhistochemischen Methoden machen es möglich, innerhalb der
Frischgewebeschnitte sowohl von Mamma- als auch von Bronchialkarzinomen, das
Ansprechen der verschiedenen Zelltypen auf die Chemotherapie zu untersuchen.
3.2 Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in vivo
und ex vivo in Mammakarzinomen
Unter Anwendung der in Kapitel 3.1 beschriebenen Methoden wurde im Folgenden
die
Wirkung
verschiedener
Chemotherapeutika
auf
die
unterschiedlichen
Tumorkompartimente bei Mamma- und Bronchialkarzinomen untersucht.
3. Ergebnisse
61
3.2.1 Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in vivo
Um den Einfluss der Chemotherapie auf das Stroma in vivo zu untersuchen, wurde
ein Kollektiv von 22 Mammakarzinom-Patientinnen verwendet, die zwischen 2004
und 2006 eine neoadjuvante Chemotherapie erhalten hatten. Die H&E-Färbungen
von Paraffinschnitten dieser 22 neoadjuvant behandelten Mammakarzinome wurden
aus der Gewebebank der Pathologie des Robert-Bosch-Krankenhauses entnommen.
In dieser retrospektiven Untersuchung wurden unter Mithilfe des Pathologen Herrn
Dr. P. Fritz die H&E gefärbten Paraffinschnitte der Biopsien vor der Therapie mit den
Schnitten der operativen Präparate derselben Mammakarzinom-Patientinnen nach
der neoadjuvanten Chemotherapie verglichen. Mit Hilfe des in Kapitel 2.3.6
beschriebenen Schemas wurden die Chemotherapie-bedingten morphologischen
Veränderungen bewertet. Exemplarische Beispielbilder für die Veränderung des
Aktivitätsgrades des Tumorstromas vor (links) und nach der neoadjuvanten Therapie
(rechts) zeigt Abb. 3.22.
Abb. 3.22: Vergleich der Morphologie des Tumorstromas vor und nach der neoadjuvanten
Therapie
Das linke Bild zeigt die H&E-Färbung eines Paraffinschnittes aus der Stanzbiopsie eines
Mammakarzinoms vor der Therapie. Das rechte Bild zeigt das OP-Präparat des Tumors derselben
Patientin nach der neoadjuvanten Chemotherapie. Vergrößerung 200x.
3. Ergebnisse
62
Für die Einteilung des pathologischen Therapieansprechens der epithelialen
Tumorzellen wurde das etablierte Grading-System nach Sinn zu Grunde gelegt (Sinn
et al., 1994). Zusätzlich wurden die pathologischen Auswertungen noch mit dem
klinischen Ansprechen der Tumore korreliert.
Das klinische Ansprechen wurde durch die Veränderung der Tumorgröße bestimmt.
Hierfür wurde im Zentrum für Operative Medizin am Robert-Bosch-Krankenhaus in
Stuttgart in der Abteilung Gynäkologie und Geburtshilfe unter der Leitung von
Prof. W. Simon
durch
die
bildgebenden
Verfahren
der
Sonografie
und
Magnetresonanztomografie (MRT) vor und nach der neoadjuvanten Chemotherapie
die Tumorgröße bestimmt.
In neun der 22 untersuchten Fälle konnte in den Paraffinschnitten der
Biopsiepräparate ein hoher Aktivitätsgrad des Stromas von 2 oder 3 identifiziert
werden. Diese neun Fälle zeigten alle einen Rückgang der Aktivität des Stromas auf
Grad 0 oder 1 nach neoadjuvanter Chemotherapie in den dazugehörigen OPPräparaten (Abb. 3.23 a, schwarze Balken). Histologisches Tumorzell-Ansprechen,
eingeteilt nach Sinn von Grad 2 bis 4, wurde in 10 der 22 Fälle beobachtet
(Abb. 3.23 b, schwarze Balken). Die rot unterlegte Fläche in den Diagrammen der
Abbildung 3.23 verdeutlicht die Fälle, die einen Rückgang der Tumorgröße um mehr
als 50% nach der neoadjuvanten Therapie aufweisen und damit klinisch auf die
Chemotherapie durch die Veränderung der Tumorgröße angesprochen haben. Es
besteht in diesem kleinen Patienten-Kollektiv kein offensichtlicher Zusammenhang
zwischen dem pathologischen Stroma- bzw. Tumor-Ansprechen und dem klinischen
Ansprechen der Tumore.
3. Ergebnisse
63
a
b
Abb. 3.23: Korrelation des pathologischen Tumor- und Stroma-Ansprechens mit dem
klinischen Ansprechen neoadjuvant behandelter Mammakarzinom-Patientinnen
Die Abbildung zeigt das pathologische Ansprechen des Stromas (a, schwarze Balken) und das
pathologische Ansprechen des Tumors (b, schwarze Balken) in den 22 untersuchten neoadjuvant
behandelten Mammakarzinom-Patientinnen im Vergleich zur Veränderung der Tumorgröße in Prozent
auf der y-Achse. Die rot unterlegte Fläche verdeutlicht den Rückgang der Tumorgröße um mindestens
50%. Dieser Rückgang wurde als klinisches Ansprechen bewertet.
In 6 von 9 Fällen mit einem Ansprechen des Stromas wurde kein Ansprechen der
Tumorzellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Stromaansprechen nicht
unbedingt abhängig von der Tumorregression ist (Tabelle 3.1).
3. Ergebnisse
64
Tabelle 3.1: Zusammenhang des pathologischen Stroma- und Tumoransprechens
Rückgang des
Kein Rückgang des
Stromaaktivitätsgrades
Stromaaktivitätsgrades
3
6
6
7
Regression
der Tumorzellen
Keine Regression
der Tumorzellen
3.2.2 In vitro - Chemosensitivität gegenüber Taxol und Cisplatin
Um die direkte Wirkung der Chemotherapie auf das Tumorstroma zu untersuchen,
wurde
die
Viabilität
von
isolierten
primären
TAFs
nach
Behandlung
mit
verschiedenen Konzentrationen von Taxol bzw. Cisplatin mit Hilfe des MTT-Assays
untersucht. Mit dem MTT-Assay lässt sich der GI50-Wert der Substanzen ermitteln.
Der GI50-Wert zeigt die Konzentration an, bei der die Rate der Zellen mit aktiven
Mitochondrien im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um 50% reduziert ist. Die
primären
TAFs
aus
Mammakarzinomen
wurden
dazu
mit
verschiedenen
Konzentrationen Taxol oder Cisplatin über 48 h behandelt. Zum Vergleich der
Heterogenität
der
Chemosensitivität
wurden
darüber
hinaus
etablierte
Tumorzelllinien mit diesen Chemotherapeutika behandelt. Eine gängige Methode zur
Bestimmung der Sensitivität bzw. Resistenz der zu testenden Zellen im Vergleich zu
etablierten Zelllinien ist die Bestimmung des Mittelwerts der GI50-Werte ± SD (Potti
et al., 2006). D.h. alle Werte, die unterhalb des Mittelwerts - SD liegen, wurden als
sensitiv definiert, während alle Werte, die oberhalb des Mittelwerts + SD liegen, als
resistent eingestuft wurden.
3. Ergebnisse
65
Abbildung 3.24 zeigt die GI50-Werte von Taxol in µM von 9 isolierten primären TAFs
aus Mammakarzinomen im Vergleich zu den GI50-Werten von 14 etablierten
Tumorzelllinien verschiedener Entitäten (9 Mammakarzinome, 4 Ovarialkarzinome
und 1 Hodenkarzinom). Die TAFs der Mammakarzinome sind im Vergleich zu den
getesteten etablierten Tumorzelllinien signifikant resistenter gegenüber Taxol
(p<0,0001). Der Mittelwert der GI50-Werte liegt bei den TAFs mit 41 µM signifikant
höher als der Mittelwert der GI50-Werte der Tumorzelllinien mit 11 µM; die SD der
Mittelwerte liegt bei 4,14 µM. Die GI50-Werte streuen bei den Tumorzelllinien um den
Faktor 7,4 zwischen 2,3 µM und 17 µM, während die Streuung der Werte der TAFs
von 25 µM bis 67 µM das 2,7fache beträgt.
Abb. 3.24: Vergleich der GI50 Werte von Taxol der isolierten, primären TAFs aus Mammakarzinomen und der Tumorzelllinien
Dargestellt sind die GI50-Werte von Taxol in µM der 9 getesteten isolierten primären TAFs aus
Mammakarzinomen im Vergleich zu 14 etablierten Tumorzelllinien verschiedener Entitäten (9
Mammakarzinome, 4 Ovarialkarzinome und 1 Hodenkarzinom). Die Linien stellen den Mittelwert dar,
t-test p<0,0001.
Die GI50-Werte von Cisplatin in µM zeigt Abbildung 3.25. Auch hier werden die GI50Werte von 5 primären isolierten TAFs aus Mammakarzinomen mit den GI50-Werten
von 28 etablierten Tumorzelllinien verschiedener Entitäten (8 Mammakarzinome, 9
Ovarialkarzinome, 5 Bronchialkarzinome, 2 Hodenkarzinome und 4 CML) verglichen.
Die Heterogenität liegt bei den TAFs im 3,5fachen Bereich (9 µM bis 31,5 µM),
während die Tumorzelllinien eine 9,4fache Streuung (5 µM bis 47,4 µM) aufweisen.
Die TAFs aus den Mammakarzinomen zeigen im Vergleich zu den etablierten
66
3. Ergebnisse
Tumorzelllinien keine geringere Sensitivität gegenüber Cisplatin (p = 0,55). Die
Mittelwerte der GI50-Werte liegen bei den TAFs bei 21,8 µM und bei den etablierten
Tumorzelllinien bei 18,3 µM und deren SD bei 8,7µM. Nur die TAFs eines
Mammakarzinoms liegen mit dem GI50-Wert von 9 µM im Bereich der GI50-Werte
der Tumorzelllinien.
Abb. 3.25: Vergleich der GI50 Werte von Cisplatin der isolierten, primären TAFs aus Mammakarzinomen und der Tumorzelllinien
Dargestellt sind die GI50-Werte von Cisplatin der 5 getesteten isolierten primären TAFs aus
Mammakarzinomen im Vergleich zu den GI50-Werten von 28 etablierten Tumorzelllinien
verschiedener Entitäten (8 Mammakarzinome, 9 Ovarialkarzinome, 5 Bronchialkarzinome, 2
Hodenkarzinome und 4 CML). Die Linien zeigen die Mittelwerte aller GI50-Werte (t-test p = 0,55).
3.2.3 Ex vivo - Sensitivität verschiedener Zelltypen gegenüber Taxol in
Frischgewebeschnitten aus Mammakarzinomen
Innerhalb der Frischgewebeschnitte wurde die Chemosensitivität sowohl des Tumorals auch des Stromakompartiments anhand von immunhistochemisch gefärbten
Paraffinschnitten beobachtet. Die Frischgewebeschnitte der Mammakarzinome
wurden über drei Tage in Kultur mit 6,8 µg/ml Taxol behandelt und danach fixiert und
in Paraffin eingebettet. Durch die immunhistochemische Färbung des KI67-Antigens
konnten die proliferierenden Zellen identifiziert werden. Für die Detektion der toten
Zellen wurde die TUNEL-Methode angewendet. Durch Auszählung der positiv
gefärbten Zellen gelang es, die Reaktion der Zellen sowohl im Tumor- als auch im
Stromakompartiment zu bewerten.
3. Ergebnisse
67
Die Abbildung 3.26 zeigt die Analyse von Paraffinschnitten der Frischgewebeschnitte
aus 17 Mammakarzinomen. Pro Mammakarzinom wurden Paraffinschnitte aus ein
bis drei Frischgewebeschnitten gefärbt. Für jeden gefärbten Schnitt wurden
mindestens 50 Zellen in drei bis fünf Gesichtsfeldern ausgezählt. Die Daten wurden
zusätzlich unter Mithilfe des Pathologen Dr. P. Fritz validiert. Die Abbildung 3.26 a
zeigt die Veränderung des Prozentsatzes der KI67-positiven, proliferierenden
epithelialen Tumorzellen nach dreitägiger Behandlung mit 6,8µg/ml Taxol im
Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Abbildung 3.26 b zeigt die gleiche
Darstellung für das Stromakompartiment. Wie zu erwarten war, zeigen die
Tumorzellen in den unbehandelten Kontrollen eine höhere Proliferationsrate als die
Stromazellen. Das Diagramm in Abb. 3.26 c stellt die Abnahme der Proliferationsrate
des Tumorkompartiments der im Stromakompartiment gegenüber (∆KI67).
Um die Variabilität der Färbung und der anschließenden Auszählung der Zellen
auszugleichen, wurde bei einer Abnahme der Proliferationsrate von mehr als 10 %
von einem Ansprechen des Gewebes auf die Behandlung mit Taxol ausgegangen.
Neun der 17 Mammakarzinome zeigten ein Ansprechen auf die Taxol-Behandlung
sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment (Abb. 3.26 c).
a
b
c
Abb. 3.26: Proliferationsänderung in Frischgewebeschnitten der Mammakarzinome nach
Taxolbehandlung
Dargestellt ist die Änderung der Rate der proliferierenden KI67-positiven Tumorzellen (a) und der
KI67-positiven Stromazellen (b) in unbehandelten Frischgewebeschnitten (Kontrolle) im Vergleich zu
den jeweiligen mit Taxol behandelten Schnitten (Taxol). In Diagramm (c) ist der Rückgang der KI67positiven Zellen (∆KI67) im Tumorkompartiment im Vergleich zum Rückgang der KI67-positiven
Stromazellen nach Taxol-Behandlung gezeigt. Die schwarzen Linien grenzen die Fälle ein, die einen
Rückgang um mehr als 10% zeigen.
3. Ergebnisse
68
Zur Detektion des durch Taxol induzierten Zelltods in den Frischgewebeschnitten der
Mammakarzinome wurde die TUNEL-Methode angewendet. Die Markierung und
somit Sichtbarmachung der DNA-Doppelstrangbrüche wurde sowohl innerhalb der
Tumor-
als
auch
der
Stromazellen
ausgezählt.
Insgesamt
wurden
Frischgewebeschnitte von 14 Mammakarzinomen ausgezählt. Es wurden für jedes
Mammakarzinom Paraffinschnitte aus ein bis drei Frischgewebeschnitten gefärbt.
Innerhalb jedes gefärbten Schnitts wurden mindestens 50 Zellen in drei bis fünf
Gesichtsfeldern ausgezählt. Zusätzlich wurden die Daten unter Mithilfe des
Pathologen Dr. P. Fritz kontrolliert.
In der Abbildung 3.27 wird in den unbehandelten Kontrollen und den entsprechenden
mit 6,8 µg/ml Taxol behandelten Frischgewebeschnitten die Änderung des
Prozentsatzes der TUNEL-positiven Tumorzellen (a) im Vergleich zu den
Stromazellen (b) dargestellt. Da die TUNEL-Färbung im Vergleich zur KI67-Färbung
(3.26) eine stärkere unspezifische Hintergrundfärbung aufwies und dadurch die
Auswertung einer höheren Variabilität unterlag, wurde hier erst bei einer Zunahme
der TUNEL-positiven, toten Zellen von mehr als 20 % von einem Ansprechen auf die
Taxolbehandlung ausgegangen (∆TUNEL). Die Abbildung 3.27 c zeigt durch die
Abgrenzung mit den schwarzen Linien die Fälle, deren Todesrate einen Anstieg der
TUNEL-positiven Zellen um mehr als 20% sowohl im Tumor- als auch im
Stromakompartiment zeigt.
Sieben der 14 Mammakarzinome zeigen ein Ansprechen auf die Taxolbehandlung
um mehr als 20% sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment.
3. Ergebnisse
69
a
Abb.
b
3.27:
Veränderung
der
Rate
c
der
toten
Zellen
in
Frischgewebeschnitte
von
Mammakarzinomen nach Taxolbehandlung.
Die Veränderung der Rate der TUNEL-positiven Zellen nach Taxolbehandlung im Vergleich zu den
unbehandelten Kontrollen ist in (a) dargestellt für die Tumorzellen und in (b) für die Stromazellen. Der
Vergleich der Reduktion der TUNEL-positiven Tumorzellen zu den Stromazellen der mit Taxol
behandelten Frischgewebeschnitte im Vergleich zu den entsprechenden unbehandelten Kontrollen ist
in (c) gezeigt (∆TUNEL). Die schwarzen Linien grenzen die Fälle ein, die einen Rückgang um mehr
als 20% zeigten.
3.3 Chemosensitivität verschiedener Tumorkompartimente in
Bronchialkarzinomen
Zusätzlich
zum
Mammakarzinom
wurde
die
Chemosensitivität
gegenüber
Chemotherapeutika in einer anderen Tumorentität untersucht. Es wurden isolierte
primäre TAFs und Frischgewebeschnitte aus Bronchialkarzinomen auf ihre
Sensitivität gegenüber Taxol und Cisplatin untersucht.
3. Ergebnisse
70
3.3.1 In vitro - Chemosensitivität primärer isolierter TAFs aus
Bronchialkarzinomen gegenüber Taxol und Cisplatin
Um die direkte Wirkung der Chemotherapie auf isolierte primäre TAFs zu
untersuchen, wurde die Viabilität der Zellen nach Behandlung mit Hilfe des MTTAssays untersucht. Die primären TAFs aus Bronchialkarzinomen wurden dazu mit
verschiedenen Konzentrationen Taxol oder Cisplatin über 48 h behandelt, um so den
GI50-Wert der Zytostatika zu bestimmen.
Zum Vergleich der Heterogenität der Chemosensitivität wurden zusätzlich etablierte
Tumorzelllinien mit diesen Zytostatika behandelt (siehe auch Abb. 3.24 und 3.25).
Mithilfe des Mittelwerts der GI50-Werte und dessen Standardabweichung wurde die
Sensitivität bzw. Resistenz bestimmt (Potti et al., 2006).
Abbildung 3.28 zeigt die GI50-Werte von Taxol in µM bestimmt in 16 isolierten
primären TAFs aus Bronchialkarzinomen im Vergleich zu den GI50-Werten bestimmt
in 14 etablierten Tumorzelllinien verschiedener Entitäten (9 Mammakarzinome, 4
Ovarialkarzinome und 1 Hodenkarzinom). Die TAFs der Bronchialkarzinome sind im
Vergleich zu den getesteten etablierten Tumorzelllinien signifikant resistenter
gegenüber
Taxol
(p<0,0001).
Der
Mittelwert
liegt
bei
den
TAFs
der
Bronchialkarzinome bei 27 µM und der Mittelwert der GI50-Werte der Tumorzelllinien
liegt bei 11 µM. Die SD der GI50-Mittelwerte beträgt hier 4,14 µM. Die Streuung der
GI50-Werte der TAFs beträgt das 4,2fache (10 µM bis 42 µM). Die Streuung der
Tumorzelllinien beträgt von 2,3 µM bis 17 µM das 7,4fache.
3. Ergebnisse
71
Abb. 3.28: GI50-Werte der Taxol-behandelten isolierten TAFs aus Bronchialkarzinomen und der
Tumorzelllinien
Dargestellt sind der Mittelwert und die einzelnen GI50-Werte in Prozent von Taxol der 16 getesteten
isolierten primären TAFs aus Bronchialkarzinomen im Vergleich zu 14 etablierten Tumorzelllinien
verschiedener Entitäten (9 Mammakarzinome, 4 Ovarialkarzinome und 1 Hodenkarzinom; t-test,
p<0,0001).
Primäre isolierte TAFs aus Bronchialkarzinomen wurden mit verschiedenen
Konzentrationen Cisplatin behandelt und mittels MTT-Assay wurden die GI50-Werte
in
µM
bestimmt.
Die
GI50-Werte
der
primären
isolierten
TAFs
aus
Bronchialkarzinomen wurden in 25 verschiedenen TAFs bestimmt und mit den GI50Werten
von
28
etablierten
Tumorzelllinien
verschiedener
Entitäten
(8 Mammakarzinome, 9 Ovarialkarzinome, 5 Bronchialkarzinome, 2 Hodenkarzinome
und 4 CML) verglichen (Abb. 3.29). Die Abbildung 3.29 zeigt die einzelnen GI50Werte von Cisplatin in µM sowie auch den Mittelwert der TAFs bzw. der etablierten
Tumorzelllinien. Die Mittelwerte sind miteinander vergleichbar mit 12,6 µM in den
TAFs und 18,3 µM in den etablierten Tumorzelllinien. Die SD der Mittelwerte der
Tumorzelllinien liegt bei 8,7 µM. Auch die Heterogenität ist mit einer Streuung von
10,4 bei den TAFs (2,8 µM bis 29 µM) vergleichbar mit den Tumorzelllinien mit einer
9,4fachen Streuung der GI50-Werte von 5 µM bis 47,4 µM. Somit besteht in der
Sensitivität und der Heterogenität der untersuchten TAFs im Vergleich zu den
Zelllinien kein signifikanter Unterschied (t-test > 0,05), die Heterogenität der TAFs ist
sogar noch größer als die der Tumorzelllinien.
72
3. Ergebnisse
Abb. 3.29: GI50-Werte von Cisplatin der isolierten TAFs aus Bronchialkarzinomen und der
Tumorzelllinien
Dargestellt sind die einzelnen GI50-Werte und die Mittelwerte von Cisplatin in 25 getesteten primären
isolierten TAFs aus Bronchialkarzinomen im Vergleich zu 22 etablierten Tumorzelllinien verschiedener
Entitäten (8 Mammakarzinome, 9 Ovarialkarzinome, 5 Bronchialkarzinome, 4 CML und 2
Hodenkarzinome; t-test > 0,05).
3.3.2 Genotypisierung der primären TAFs aus Bronchialkarzinomen
Es ist bereits bekannt, dass verschiedene Mutationen und Polymorphismen im
Zusammenhang mit dem klinischen Ansprechen auf Cisplatin stehen (Han et al.,
2008; Kamikozuru et al., 2008). Deshalb wurde im Folgenden untersucht, ob die
Heterogenität der Sensitivität gegenüber Cisplatin der primären isolierten TAFs aus
den Bronchialkarzinomen auf genetische Alterationen in verschiedenen DNASchadensreparaturgenen zurückzuführen ist.
3.3.2.1 Somatische Mutationen in p53
Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt eine große Rolle bei der Kontrolle des
Zellzyklus, der Reparatur von DNA-Schäden und der Apoptose und ist somit ein
zentrales Glied in der zellulären Reaktion auf genotoxischen Stress.
Eine große Anzahl an somatischen Mutationen im p53 Gen wurde im Stroma von
Mammakarzinomen bereits identifiziert (Kurose et al., 2002; Patocs et al., 2007). Da
3. Ergebnisse
73
die TAFs der Bronchialkarzinome eine sehr variable Sensitivität auf Cisplatin zeigten,
wurde untersucht, ob diese Heterogenität mit genetischen Veränderungen in
Verbindung
gebracht
werden
kann.
Deshalb
wurden
alle
28
TAFs
aus
Bronchialkarzinomen auf somatische Mutationen im p53 Gen untersucht. In den 28
untersuchten TAFs der Bronchialkarzinome fand sich keine somatische Mutation im
p53 Gen (Daten nicht gezeigt). Des Weiteren wurde untersucht, ob Polymorphismen
eine Rolle im Zusammenhang mit der Heterogenität spielen.
3.3.2.2 Genotypisierung der Polymorphismen p53-Arg72Pro, Mdm2-309 T/G und
ERCC1-118C/T
Die Polymorphismen p53-Arg72Pro, Mdm2-309T/G und ERCC1-118C/T haben
Einfluss auf das klinische Ansprechen der Tumore auf Cisplatin (Han et al., 2008;
Kamikozuru et al., 2008). Deshalb wurde untersucht, ob die Chemosensitivität der
TAFs aus Bronchialkarzinomen gegenüber Cisplatin durch diese Polymorphismen
erklärt werden kann. Es wurden die GI50-Werte für Cisplatin gegen den Genotyp
dargestellt (Abb. 3.30). Es zeigte sich nur bei dem Polymorphismus p53-Arg72Pro
ein nicht-signifikanter Trend in einer niedrigeren Sensitivität gegenüber Cisplatin bei
dem variablen Genotyp, insbesondere des homozygoten Genotyps (Abb. 3.30 a). Die
Polymorphismen Mdm2-309T/G (Abb. 3.30 b) und ERCC1-118C/T (Abb. 3.30 c)
konnten nicht mit der heterogenen Chemosensitivität gegenüber Cisplatin in
Verbindung gebracht werden.
3. Ergebnisse
74
Abb. 3.30: Korrelation zwischen dem GI50-Wert von Cisplatin mit dem Status der
Polymorphismen der isolierten primären TAFs aus Bronchialkarzinomen
Dargestellt sind die Polymorphismen p53-Arg72Pro (a), Mdm2-309T/G (b) und ERCC1-118C/T (c) von
TAFs aus Bronchialkarzinomen. Die Diagramme zeigen die Polymorphismen korreliert mit den GI50Werten für Cisplatin in µM und die Mediane der GI50-Werte aller untersuchten TAFs (n=27, bzw.
n=26).
3.3.3 Ex vivo - Chemosensitivität verschiedener Zelltypen gegenüber
Cisplatin in Frischgewebeschnitten aus Bronchialkarzinomen
Innerhalb der Frischgewebeschnitte konnte die Chemosensitivität sowohl des Tumorals auch des Stromakompartiments anhand von immunhistochemisch gefärbten
Paraffinschnitten
untersucht
werden.
Die
Frischgewebeschnitte
der
Bronchialkarzinome wurden dazu über drei Tage mit 13 µM Cisplatin behandelt,
danach in Formalin fixiert um anschließend in Paraffin eingebettet werden zu
können. Mit der Quantifizierung durch Auszählung der immunhistochemischen
Färbungen der proliferierenden Zellen mit dem KI67-spezifischen Antikörper und der
toten Zellen mit der TUNEL-Methode gelang es, die Reaktion der Zellen sowohl im
Tumor- als auch im Stromakompartiment zu bewerten.
Die Abbildung 3.31 zeigt die Veränderung der Rate der KI67-positiven Zellen in
Paraffinschnitten der Frischgewebeschnitte aus 16 Bronchialkarzinomen. Pro
Bronchialkarzinom wurden Paraffinschnitte von ein bis drei Frischgewebeschnitten
3. Ergebnisse
75
für die Färbung verwendet. Für jeden gefärbten Paraffinschnitt wurden mindestens
50 Zellen in drei bis fünf Gesichtsfeldern ausgezählt. Unter Mithilfe des Pathologen
Dr. P. Fritz wurden die Daten zusätzlich validiert. In der Abbildung 3.31 werden
Änderungen der Proliferationsraten in Prozent der Tumorzellen (a) und der
Stromazellen (b) dargestellt durch den Vergleich der unbehandelten Kontrollen mit
den
entsprechenden
mit
Cisplatin
behandelten
Frischgewebeschnitten.
Die
Tumorzellen in den unbehandelten Kontrollen zeigten eine hohe Proliferationsrate
(a), während die Stromazellen fast gar keine KI67-positiven Zellen zeigten (b). Das
Diagramm in Abb. 3.31 c zeigt den Rückgang der Proliferationsrate der KI67positiven Zellen sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment (∆KI67). Die
Reduktion der Proliferationsrate um mehr als 10 % wurde als Ansprechen definiert.
Da das Stromakompartiment kaum proliferiert, ist hier auch keine Reaktion im
Stroma
hinsichtlich
der
Reduktion
der
Proliferation
zu
erwarten.
Nur
im
Tumorkompartiment ist eine Reduktion der Proliferation um mehr als 10 % in 9 von
16 Fällen zu sehen.
a
b
c
Abb. 3.31: Proliferationsänderung in Cisplatin-behandelten Frischgewebeschnitten der
Bronchialkarzinome
Dargestellt ist die Änderung der Proliferationsrate in Prozent der unbehandelten Frischgewebeschnitte
aus Bronchialkarzinomen im Vergleich zu den jeweiligen Cisplatin-behandelten Schnitten sowohl im
Tumor- (a) als auch im Stromakompartiment (b). Die Proliferationsreduktion der Tumorzellen im
Vergleich zu den Stromazellen der Cisplatin-behandelten Frischgewebeschnitten im Vergleich zu den
unbehandelten Kontrollen wird in (c) gezeigt (∆KI67). Die schwarzen Linien grenzen die Fälle ein, die
einen Rückgang um mehr als 10% zeigen.
3. Ergebnisse
76
Zur
Detektion
des
Zelltods
innerhalb
der
Frischgewebeschnitte
der
Bronchialkarzinome wurde die TUNEL-Methode angewendet. Der Zelltod wurde
durch die Behandlung über drei Tage mit 3 µM Cisplatin induziert. Die sichtbare
Markierung der DNA-Doppelstrangbrüche durch die TUNEL-Methode in den
Paraffinschnitten der Frischgewebeschnitte wurde sowohl innerhalb der Tumor- als
auch der Stromazellen quantifiziert. Insgesamt wurden Paraffinschnitte der
Frischgewebeschnitte aus 15 Bronchialkarzinomen ausgezählt. Es wurden für jedes
Bronchialkarzinom ein bis drei Paraffinschnitte mit und ohne Cisplatin-Behandlung
ausgewertet. Innerhalb jedes gefärbten Paraffinschnitts wurden mindestens 50
Zellen in drei bis fünf Gesichtsfeldern ausgezählt. Zusätzlich wurden die Daten auch
noch unter Mithilfe des Pathologen Dr. P. Fritz kontrolliert. Die Abbildung 3.32 stellt
die Veränderung der toten Zellen in Prozent der Tumorzellen (a) und der
Stromazellen (b) im Vergleich der mit Cisplatin behandelten Frischgewebeschnitten
zu den entsprechenden unbehandelten Kontrollen dar. Zwei der 15 untersuchten
Bronchialkarzinome zeigten ein Ansprechen auf die Cisplatin-Behandlung um mehr
als 20% sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment (Abb. 3.32 c, ∆TUNEL).
a
b
c
Abb. 3.32: Änderung der Rate der toten Zellen in Cisplatin-behandelten Frischgewebeschnitten
der Bronchialkarzinome
Dargestellt ist die Veränderung der Rate der toten Zellen in Prozent der unbehandelten
Frischgewebeschnitte aus Bronchialkarzinomen im Vergleich zu den jeweiligen Cisplatin-behandelten
Schnitten sowohl im Tumor- (a) als auch im Stromakompartiment (b). Der Anstieg der toten
Tumorzellen im Vergleich zu den Stromazellen in den Cisplatin-behandelten Frischgewebeschnitten
zu den unbehandelten Kontrollen wird in (c) gezeigt (∆TUNEL). Die schwarzen Linien grenzen die
Fälle ein, die einen Anstieg um mehr als 20% zeigen.
3. Ergebnisse
77
3.3.4 Vergleich der TAFs aus Mamma- und Bronchialkarzinomen
Der Vergleich der GI50-Werte von Taxol der TAFs aus den Mamma- und aus den
Bronchialkarzinomen zeigt, dass die TAFs der Mammakarzinome signifikant
resistenter als die TAFs der Bronchialkarzinome sind (p<0,05, Abb. 3.33). Der
Mittelwert der TAFs der Mammakarzinome liegt mit 41 µM deutlich über dem
Mittelwert der TAFs der Bronchialkarzinome mit 27 µM. Auch die Heterogenität der
TAFs der verschiedenen Entitäten ist mit einer Streuung der TAFs aus den
Mammakarzinomen
um das 2,7fache nicht vergleichbar mit einer Streuung der
GI50-Werte der TAFs der Bronchialkarzinome um das 4,2fache.
Abb. 3.33: GI50-Werte der mit Taxol behandelten primären isolierten TAFs aus Bronchial- und
Mammakarzinomen
Dargestellt ist der Vergleich der GI50-Werte von Taxol der TAFs aus Mammakarzinomen und aus
Bronchialkarzinomen. Die Abb. zeigt die einzelnen GI50-Werte und die jeweiligen Mittelwerte (t-test,
p<0,05).
Des
Weiteren
wurden
die
GI50-Werte
von
Cisplatin
der
TAFs
aus
Mammakarzinomen mit den Werten der TAFs aus Bronchialkarzinomen verglichen
(Abb. 3.34). Zwischen dem Mittelwert der TAFs aus den Bronchialkarzinomen von
13 µM und dem Mittelwert der TAFs aus den Mammakarzinomen von 22 µM besteht
ein signifikanter Unterschied (p<0,05).
78
3. Ergebnisse
Abb. 3.34: GI50-Werte der mit Cisplatin behandelten primären isolierten TAFs aus Bronchialund Mammakarzinomen
Dargestellt ist der Vergleich der GI50-Werte von Cisplatin der TAFs aus Mammakarzinomen und aus
Bronchialkarzinomen. Die Abb. zeigt die einzelnen GI50-Werte und die jeweiligen Mittelwerte (t-test,
p<0,05).
3.3.5 Vergleich der Chemosensitivität der TAFs in Einzelzellkultur und in
Frischgewebekultur
Um die Chemosensitivität des Tumorstromas in Abhängigkeit der Umgebung zu
untersuchen, wurde die Sensitivität der TAFs in Einzelzellkultur der Sensitivität der
TAFs innerhalb der Frischgewebeschnitte gegenübergestellt. Die Chemosensitivität
der isolierten primären TAFs in Einzelzellkultur wurde so definiert, dass der GI50Wert der TAFs über dem Mittelwert der getesteten Tumorzelllinien lag. Hierbei zeigte
sich gegenüber Taxol keine Sensitivität (Abb. 3.24) und gegenüber Cisplatin waren
40 % (10 von 25, Abb. 3.25) der getesteten isolierten primären TAFs sensitiv. In den
Frischgewebeschnitten wurden diejenigen als sensitiv eingestuft, die einen Anstieg
der TUNEL-positiven Zellen im Tumorstroma um mehr als 20 % in den behandelten
Frischgewebeschnitten im Vergleich zu den entsprechenden unbehandelten
Kontrollen zeigten. In den Frischgewebeschnitten aus Mammakarzinomen sind
gegenüber Taxol 50 % (7 von 14) der Fälle sensitiv (Abb. 3.27 c), während in den mit
Cisplatin behandelten Frischgewebeschnitten aus Bronchialkarzinomen nur 13 % (2
von 15) der mit Cisplatin behandelten Frischgewebeschnitte gegenüber den
unbehandelten Kontrollen sensitiv waren (Abb. 3.32 c).
79
4. Diskussion
4. Diskussion
Karzinome machen etwa 80% aller bösartigen Tumore aus und sind nach wie vor die
häufigste Todesursache bei Krebserkrankungen (WHO). Ein Grund hierfür ist, dass
es bislang keine zuverlässigen Therapieformen für diese Tumore gibt. Innerhalb
einer Tumorentität gibt es bereits zahlreiche morphologische und genetische
Unterschiede, so dass ein extrem heterogenes Ansprechen der Tumore auf die
Therapie das größte Problem bei der Behandlung darstellt. Durch die Heterogenität
der Tumore innerhalb einer Entität ist es nur selten möglich, das Ansprechen auf
eine Therapie vorherzusagen.
Der Fokus der onkologischen Forschung lag bisher auf den epithelialen Tumorzellen,
es gibt aber immer mehr Hinweise dafür, dass auch die unmittelbare Umgebung der
Tumorzellen bei der Chemosensitivität des Tumors eine Rolle spielt. Dieses Tumorassoziierte Stroma, das sogenannte „reaktive Stroma“, das durch einen „aktivierten“
Phänotyp mit veränderter EZM, erhöhter Gefäßdichte, vielen Entzündungszellen und
modifizierte
Fibroblasten
charakterisiert
ist,
wurde
bereits
in
Karzinomen
verschiedener Entitäten identifiziert (Sappino et al., 1988, DeWever et al., 2003). Die
Arbeitsgruppe um Gabbiani bezeichnete diese modifizierten Fibroblasten zuerst als
Myofibroblasten (Gabbiani et al., 1971; Majno et al., 1971). In verschiedenen
Arbeiten wurde gezeigt, dass dieses Tumorstroma, insbesondere die TAFs zu einer
Veränderung bzw. einer Unterstützung der Progression und der Invasion maligner
Zellen führen (Pupa et al., 2002; Kiaris et al., 2004; Mueller et al., 2004; Kalluri et al.,
2006; Kopfstein et al., 2006). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, aufzuklären, ob die
TAFs ein direktes Ziel der Chemotherapie sind und wie sie auf die Therapie
reagieren.
Um das Ansprechen eines individuellen Tumors pathologisch zu charakterisieren,
sind
entsprechende
Bewertungskriterien
notwendig.
Für
die
Reaktion
der
Tumorzellen auf die Therapie gibt es bereits einige gut etablierte pathologische
Bewertungsschemata, die die Tumorzellen anhand ihrer Morphologie und der
Zellzahl bewerten (Sinn et al., 1994; Kuroi et al., 2006). Das umliegende Gewebe
wird bei diesen Bewertungsschemata nicht berücksichtigt. Es gibt allerdings auch
vereinzelte
Hinweise
darauf,
dass
sich
das
Stromakompartiment
durch
Chemotherapie morphologisch verändert (Fisher et al., 2002; McCluggage et al.,
80
4. Diskussion
2002). In diesen Arbeiten wurde beispielsweise beobachtet, dass es im
Stromakompartiment zu einer erhöhten Entzündungsreaktion aber auch zu einer
stärkeren Fibrose des Gewebes kommt. Eine systematische Untersuchung der
Wirkung
von
Chemotherapie
auf
Stromazellen
fehlt
bislang.
Um
diese
morphologische Veränderung erfassen zu können, musste deshalb im Rahmen
dieser Arbeit unter fachlicher Mithilfe des Pathologen Dr. P. Fritz zunächst ein
Bewertungsschema für das Tumorstroma entwickelt werden. Fokussiert wurde dabei
insbesondere auf die Reaktion der TAFs auf Chemotherapie. Anhand Hämatoxilin &
Eosin (H&E) gefärbter Paraffinschnitte wurde das Tumorstroma hierfür in vier
Aktivitätsgrade eingeteilt, die ähnlich wie die bereits etablierten Bewertungsschemata
der epithelialen Tumorzellen auf Zellzahl und Zellmorphologie basieren. Mittels
dieses neu entwickelten Schemas konnte das Tumorstroma systematisch bewertet
werden. Parallel wurde der Regressionsgrad der epithelialen Tumorzellen mit einem
bereits etablierten pathologischen Bewertungsschema nach Sinn ermittelt (Sinn et
al., 1994).
Durch den Vergleich des Aktivitätsgrads im Biopsiepräparat vor der Therapie mit
dem Aktivitätsgrad des OP-Präparats nach der Therapie konnte an einem Kollektiv
neoadjuvant behandelter Mammakarzinome beobachtet werden, dass sich nach der
Therapie die Morphologie der Tumorumgebung stark verändert. So ging in den
meisten Fällen der Aktivitätsgrad des Stromas im Hinblick auf die Zellzahl und
Zellmorphologie der TAFs und der Endothelien nach der Therapie im OP-Präparat im
Vergleich zum Biopsie-Präparat wesentlich zurück. Interessanterweise war die
Reaktion des Tumorstromas auf
die Chemotherapie unabhängig von der
Tumorzellregression. Dies zeigt, dass die einzelnen Kompartimente des Tumors
unabhängig voneinander auf Chemotherapie reagieren. Die pathologische Reaktion
der neoadjuvant behandelten Mammakarzinome wurde auch mit dem klinischen
Ansprechen dieser Tumore verglichen, wobei keine Korrelation des Ansprechens
beobachtet werden konnte. Aufgrund der niedrigen Fallzahl des in dieser Arbeit
untersuchten
Kollektivs
aus
22
neoadjuvant
behandelten
Mammakarzinompräparaten konnte hier nur unzuverlässig eine Aussage über einen
Zusammenhang des pathologischen und des klinischen Ansprechens getroffen
werden. Darüber hinaus kann es durchaus möglich sein, dass die klinische
Bewertung der Tumorgröße durch bildgebende Verfahren, wie Ultraschall oder
Magnetresonanz-Tomographie (MRT) relativ ungenau ist. Beispielsweise geht die
81
4. Diskussion
Tumormasse signifikant zurück, ein resistenter Teil der Zellen die Therapie aber
überlebt, der pathologisch aber nicht durch diese bildgebenden Verfahren sichtbar
ist. Diese Diskrepanz zwischen pathologischem und klinischem Ansprechen wurde
auch in größeren Studien beobachtet, in denen Patienten mit klinisch kompletter
Remission in nur ca. 30 - 40 % aller Fälle auch pathologisch keinen Tumor zeigten
(Brain et al., 1997; Fisher et al., 1998; Chollet et al., 2002, Fisher et al., 2002; Gajdos
et al., 2002; Ring et al., 2004; Kurosumi et al., 2004).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die gegenseitige Abhängigkeit der einzelnen
Tumorkompartimente keine übergeordnete Rolle bei der Chemosensitivität spielt, die
TAFs also unabhängig von den epithelialen Tumorzellen auf Chemotherapie
reagieren. Ob TAFs ein direktes Ziel der Chemotherapie sind, konnte allerdings
anhand der neoadjuvant behandelten Mammakarzinome nur unzulänglich untersucht
werden, da die gesamte Zeitspanne der Therapie ca. sechs Monate beträgt und auch
zwischen dem letzten Zyklus der Chemotherapie und der OP einige Wochen liegen
und somit eine akute Reaktion der Zellen nicht erfasst werden kann. Um eine direkte
Reaktion der TAFs auf die Therapie untersuchen zu können, war es notwendig,
geeignete ex-vivo-Modelle zu entwickeln. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit
sowohl primäre Fibroblasten aus Karzinomen isoliert und kultiviert, als auch ein
Gewebekulturmodell
entwickelt,
das
es
ermöglicht,
anhand
von
Frischgewebeschnitten die Chemosensitivität der TAFs in ihrer natürlichen
Umgebung zu untersuchen.
Es wurde bereits gezeigt, dass isolierte Fibroblasten aus Tumoren ihren TAFspezifischen Phänotyp und ihre Fähigkeit zur Proliferation auch unabhängig von der
Anwesenheit von Tumorzellen über zehn Passagen behalten (Orimo et al., 2005).
Auch in dieser Arbeit gelang es, die isolierten primären TAFs über ca. zehn
Passagen
ohne
Wachstumsverlust
kultivieren
zu
können.
Um
mögliche
kulturbedingte Veränderungen des TAF-spezifischen Phänotyps auszuschließen,
wurden alle Experimente in Passage zwei bis fünf durchgeführt. Die isolierten
Fibroblasten wurden als TAFs charakterisiert, indem zunächst exemplarisch anhand
der ersten 4 isolierten, primären TAFs der Karyotyp der Metaphasechromosomen als
normal befunden wurde, was darauf schließen lässt, dass es sich ursprünglich nicht
um
genetisch
alterierte
Tumorzellen
handelt,
da
diese
in
aller
Regel
Chromosomenanomalien zeigen (Albertson et al., 2003). Zusätzlich wurden die
isolierten, primären TAFs in dieser Arbeit auf die Anwesenheit verschiedener
82
4. Diskussion
Oberflächenmarker untersucht. So wurde zum einen die Expression des Epithelspezifischen Antigens (ESA) kontrolliert, das nur in epithelialen Zellen und nicht in
Zellen mesenchymalen Ursprungs exprimiert wird (Simon et al., 1990). Zum anderen
wurde die Expression des TAF-spezifischen Fibroblast activation protein (FAP)
untersucht, das ausschließlich von TAFs gebildet wird (Rettig et al., 1993). Durch
diese Analysen konnte sichergestellt werden, dass es sich bei den isolierten
Fibroblasten durch die vorhandene FAP-Expression um TAFs handelt und sich durch
das Fehlen von ESA keine Epithelzellen in der TAF-Kultur befinden. Die Sensitivität
der primären isolierten TAFs gegenüber den Chemotherapeutika Taxol und Cisplatin
wurde durch die Bestimmung der GI50-Werte mittels MTT-Assay getestet und mit der
Sensitivität etablierter Tumorzelllinien aus Mamma-, Bronchial-, Ovarial- und
Hodenkarzinomen sowie einiger CML-Linien verglichen. Diese beiden verwendeten
Chemotherapeutika
werden
bereits
seit
langem
erfolgreich
zur
Therapie
verschiedener solider Tumore eingesetzt (Siddik, 2003; Muggia et al., 2004; Wang et
al., 2005; Marupudi et al., 2007).
Die GI50-Werte der etablierten Tumorzelllinien wurden mittels t-test mit den Werten
der isolierten, primären TAFs verglichen. Um die TAFs als sensitiv oder resistent
einzustufen, wurde eine gängige Methode verwendet, die die Mittelwerte der GI50Werte sowie deren Standardabweichung (SD) verwendet (Potti et al., 2006). Dabei
werden die Zellen, deren GI50-Wert unterhalb des Mittelwerts abzüglich der SD liegt,
als sensitiv eingestuft, während die Zellen, deren GI50-Wert oberhalb des Mittelwerts
zuzüglich der SD liegt, als resistent eingeteilt werden.
Während die primären TAFs aus den Mamma- und den Bronchialkarzinomen im
Vergleich zu den verschiedenen Tumorzelllinien gegenüber Taxol einen signifikant
höheren GI50-Mittelwert zeigten, reagierten die TAFs der Bronchialkarzinome im
Vergleich zu den Tumorzelllinien genauso heterogen auf Cisplatin. Die TAFs der
Mammakarzinome zeigten sich auch gegenüber Cisplatin meist resistent. In einer
kürzlich erschienenen Arbeit, in der zehn TAFs aus Mammakarzinomen auf ihre
Sensitivität gegenüber Bestrahlung und Cisplatin untersucht wurden, zeigte sich nur
eine der zehn getesteten TAFs aus Mammakarzinomen sensitiv gegenüber Cisplatin
(Hawsawi et al., 2008). Damit übereinstimmend zeigte sich auch in der vorliegenden
Arbeit nur eine der getesteten primären, isolierten TAF-Kulturen aus einem
Mammakarzinom in ihrer Sensitivität gegenüber Cisplatin vergleichbar zu den
einzelnen GI50-Werten der etablierten Tumorzelllinien. Diese Ergebnisse zeigen,
83
4. Diskussion
dass die TAFs heterogen auf verschiedene Chemotherapeutika reagieren und auch
der Ursprung der TAFs einen großen Einfluss auf die Chemosensitivität hat. Das
heterogene Ansprechen der isolierten TAFs aus Bronchialkarzinomen bleibt trotz der
Kultur
über
mehrere
Passagen
stabil.
Da
die
Tumorzellen
in
den
Frischgewebeschnitten parallel mit den TAFs auf die Chemotherapie reagieren,
scheinen die Stromazellen die epithelialen Tumorzellen zu beeinflussen. Dass die
Sensitivität der TAFs innerhalb einer Entität und auch zwischen verschiedenen
Tumorentitäten so unterschiedlich ist, kann möglicherweise an genetischen
Alterationen liegen. In einer Arbeit wurde bereits gezeigt, dass genetische
Alterationen in den TAFs einen Einfluss auf den Genotyp der epithelialen
Tumorzellen haben können (Moinfar et al., 2000). Somit spielt das Tumorstroma eine
ganz entscheidende Rolle bei der Progression und Regression des Tumors.
Da es bekannt ist, dass somatische Mutationen und Polymorphismen in
verschiedenen Genen, die die Reparatur von DNA-Schäden beeinflussen, zu einem
veränderten klinischen Ansprechen des Tumors führen können und somit auch das
Gesamtüberleben des Patienten beeinflussen können (Patocs et al. 2007), sollte im
Rahmen dieser Arbeit in weiteren Untersuchungen der Frage nachgegangen werden,
ob die gegenüber Cisplatin beobachtete heterogene Chemosensitivität der TAFs aus
Bronchialkarzinomen durch somatische Mutationen in p53 erklärt werden können. Es
wurde bereits gezeigt, dass das Ansprechen von Fibroblastenlinien gegenüber
verschiedenen Chemotherapeutika, einschließlich des in dieser Arbeit verwendeten
Cisplatins, vom p53-vermittelten Zelltod abhängt (Lowe et al., 1993). Das
Tumorsuppressor-Gen p53 ist in 50 % aller Tumore mutiert (Pietsch et al., 2006).
Auch im Bronchialkarzinom treten Mutationen im p53-Gen mit 50 % relativ häufig auf.
Durch diese Mutationen kann das Ansprechen auf Chemotherapie vorhergesagt
werden. In diesen Studien wurde allerdings nicht zwischen Tumor- und
Stromakompartiment
unterschieden,
vielmehr
wurde
das
Tumorgewebe
im
Gesamten analysiert (Ahrendt et al., 1999; Skaug et al., 2000; Kandioler et al., 2008).
Isolierte TAFs aus Bronchialkarzinomen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit
erstmals auf somatische p53-Mutationen untersucht. Dabei fanden sich bei den 28 in
dieser Arbeit untersuchten
primären TAFs
aus
Bronchialkarzinomen
keine
somatischen Mutationen in p53 und somit keine Korrelation zu dem Ansprechen auf
Cisplatin. Interessanterweise gibt es aber für andere Tumorentitäten wie Karzinomen
der Brust und Prostata Hinweise dafür, dass p53-Mutationen durchaus auch in TAFs
84
4. Diskussion
vorkommen und auch einen Einfluss auf die Sensitivität des Tumors gegenüber
Chemotherapie, insbesondere gegenüber Cisplatin, haben können (Lafkas et al.,
2008). Retrospektive Studien an Paraffinschnitten von Mamma-, Ovarial- und
Kolonkarzinomen, aus denen das Stromakompartiment durch Mikrodissektion isoliert
wurde, zeigten in beiden Kompartimenten eine große Anzahl an funktionellen p53
Mutationen (Moinfar et al., 2000; Wernert et al., 2000; Kurose et al., 2002; Patocs et
al., 2007). Hierbei zeigten sich interessanterweise im Stromakompartiment andere
p53 Mutationen als in den entsprechenden Tumorzellen desselben Präparats was
wiederum ein Hinweis darauf ist, dass das Tumorstroma unabhängig von den
epithelialen Tumorzellen reagieren kann. Allerdings konnten bei einer weiteren
Studie, bei der Myofibroblasten von den epithelialen Tumorzellen aus frischen
Mammakarzinomgeweben getrennt wurden, keine genetischen Alterationen in den
Myofibroblasten detektieren, während in den epithelialen Zellen einige somatische
Gain- und Loss-of-Function-Mutationen gefunden wurden (Allinen et al., 2004). In
Verbindung mit den bereits veröffentlichten Daten anderer Arbeitsgruppen lassen die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf schließen, dass somatische Mutationen in
TAFs anderer Entitäten, wie z.B. Mamma- und Kolonkarzinomen, deutlich häufiger
vorkommen, während TAFs der Bronchialkarzinome mit hoher Wahrscheinlichkeit
wildtyp p53 sind. Dies könnte das unterschiedliche Ansprechen der TAFs in den
verschiedenen Entitäten erklären. Nicht auszuschließen ist allerdings, dass das
Auftreten einer hohen Mutationsfrequenz abhängig vom untersuchten Material ist. So
wurde in der Mehrzahl der Studien, die eine hohe Mutationsfrequenz gefunden
haben, Paraffin-Material verwendet. Es konnte bereits festgestellt werden, dass die
Detektion verschiedener somatischer Mutationen von der Aufarbeitung, dem Alter
und dem Zustand des in Paraffin eingebetteten Gewebes abhängt (Jacobs et al.,
2007). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass somatische Mutationen in TAFs, die
durch Mikrodissektion aus gefrorenem Gewebe aus Mamma- und Ovarialkarzinomen
isoliert wurden, sehr selten sind (Qiu et al., 2008). Da in dieser Arbeit mit unfixiertem
Zellmaterial gearbeitet wurde, können Artefakte der Aufarbeitung ausgeschlossen
werden.
Neben somatischen Mutationen können Polymorphismen verschiedener DNASchadensreparatur-Gene eine Erklärung für die heterogene Sensitivität der TAFs
gegenüber Cisplatin sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf drei Polymorphismen
fokussiert.
Es
sollte
geklärt
werden,
ob
die
Sensitivität
der
TAFs
aus
85
4. Diskussion
Bronchialkarzinomen gegenüber Cisplatin von den Polymorphismen p53-Arg72Pro,
ERCC1-118C/T und Mdm2-309T/G abhängt. Die Polymorphismen p53 Arg72Pro und
Mdm2 309T/G stehen im Zusammenhang mit einem verändertem Gesamtüberleben
der Patienten nach Chemotherapie (Zienolddiny et al., 2006; Han et al., 2008;
Kamikozuru et al., 2008). Der Genotyp Arg/Arg des p53-Arg72Pro Polymorphismus
induziert Apoptose wesentlich besser als der homozygote Pro/Pro Genotyp (Dumont
et al., 2003; Sullivan et al., 2004). Der ERCC1-118C/T Polymorphismus wird in
Zusammenhang mit unterschiedlichen mRNA Mengen von ERCC1 genannt; die
Genotypen C/T und T/T stehen im Gegensatz zum C/C Genotyp im Zusammenhang
mit einem kürzeren Gesamtüberleben bei Kolonkarzinompatienten, die eine auf
Cisplatin basierende Chemotherapie erhalten (Park et al., 2003). Es wurde gezeigt,
dass das G-Allel des Polymorphismus Mdm2-309T/G in der Promotorregion des
Mdm2-Gens mit einer erhöhten Mdm2 Proteinmenge zusammenhängt und dieses
dann durch Chemotherapie zu einem veränderten p53-vermittelten DNA-Schaden
führt (Arva et al., 2005).
In der vorliegenden Arbeit konnte weder zwischen dem Polymorphismus ERCC1118C/T noch dem Mdm2-309T/G ein Zusammenhang mit der Sensitivität gegenüber
Cisplatin in den isolierten, primären TAFs beobachtet werden. Im Zusammenhang
mit dem p53-Arg72Pro Polymorphismus wurde allerdings ein nicht-signifikanter
Trend beobachtet, der die geringste Sensitivität gegenüber Cisplatin im homozygoten
Pro/Pro Genotyp zeigt. Dieser Polymorphismus könnte somit bei TAFs aus
Lungenkarzinomen einen Hinweis auf das Ansprechen des Tumors auf die
Chemotherapie vorhersagen und somit als prädiktiver Marker dienen. Aufgrund der
geringen Anzahl der TAFs, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden konnten,
kann allerdings keine endgültige Aussage über einen Effekt der verschiedenen
Genotypen der TAFs auf die Sensitivität gemacht werden. Darüber hinaus könnten
Polymorphismen anderer Gene eine Rolle für die Sensitivität der TAFs gegenüber
Cisplatin spielen. So wurden in einer Studie Polymorphismen aus insgesamt 20
verschiedenen
DNA-Schadensreparatur-Genen
untersucht,
die
alle
in
Zusammenhang mit einer veränderten Antwort auf die Chemotherapie stehen
(Zienolddiny et al., 2006). Bei diesen Genen handelte es sich unter anderem um
Nukleotid-Austausch-Reparatur-Gene wie z.B. XPA und einige Gene der ERCCFamilie (ERCC1 ERCC2/XPD, ERCC4/XPF and ERCC5/XPG), Basen-AustauschReparatur-Gene wie z.B. XRCC1 und PCNA und Doppelstrangbruch-Reparatur-
86
Gene
4. Diskussion
wie
XRCC2,
XRCC3,
XRCC9,
NBS1
und
ATR.
Inwieweit
diese
Polymorphismen für das heterogene Ansprechen der TAFs auf Chemotherapie
wichtig sind, müssen künftige Untersuchungen zeigen.
Da die Experimente mit isolierten primären TAFs die mögliche gegenseitige
Beeinflussung der verschiedene Tumorkompartimente und dessen Einfluss auf die
Sensitivität gegenüber Chemotherapie nicht zeigen, war ein weiteres Ziel dieser
Arbeit, eine Möglichkeit zu finden, um die Stromazellen in ihrer natürlichen
Umgebung untersuchen zu können.
Um der in-vivo-Situation der Tumore gerecht zu werden, wurden bereits
verschiedene 3D-Matrix-Modelle entwickelt. Eine Arbeit zeigte, dass es im
Gegensatz zu einem 2D-Modell in einem 3D-Matrix-Modell gelang, bei primären
normalen Fibroblasten eine desmoplastische Differenzierung zu induzieren, durch
die sich vermehrt Fasern im Stroma bilden (Amatangelo et al., 2005). Auch die
Chemosensitivität ist in verschiedenen Modellsystemen unterschiedlich. Die Gruppe
um Arteaga zeigte, dass die Mammakarzinomzelllinie MDA-231 in der MonolayerZellkultur sensitiver gegenüber Cisplatin ist, als in einem 3D-Sheroid-Modell (Ohmori
et al., 1998). Diese in vitro Modelle, die aus 2D oder 3D-Kokulturen von
Tumorzelllinien zusammen mit Fibroblasten-Linien bzw. primären Fibroblasten
bestehen,
haben
wesentlich dazu
beigetragen
den
Einfluss
der Zell-Zell-
Kommunikation zu untersuchen und die Interaktionen zwischen den Tumorzellen mit
der extrazellulären Matrix, den Integrinen und verschiedenen intrazellulären
Signalkaskaden in Epithelzellen in Tumoren aufzuklären (Bissell et al., 2002;
Schmeichel et al., 2003; Kim et al., 2004; Heneweer et al., 2005). Aber auch diese
relativ komplexen Modellsysteme geben die Zell-Zell und Zell-Matrix-Interaktionen
nur artifiziell und begrenzt wieder, denn diese sind in vivo für jeden Tumor individuell
verschieden und sehr komplex (Morin et al., 2003). Alle diese Modelle führen zu dem
Ergebnis, dass das Tumorstroma eine Rolle bei der Chemosensitivität des Tumors
spielt. Um den Einfluss der Zell-Zell und Zell-Matrix-Interaktionen innerhalb des
Tumors auf die Sensitivität gegenüber Chemotherapie zu untersuchen, eignet sich
die ex-vivo-Kultivierung von primärem Tumorgewebe. Mithilfe dieses Modellsystems
kann die Gewebearchitektur in-vivo-nah erhalten werden.
Bereits 1967 wurden erste Experimente in diese Richtung mit Würfeln aus primärem
Tumorgewebe verschiedener Entitäten, wie Kolon- und Mammakarzinomen, von
einem Volumen von 1 mm3 durchgeführt (Matoska et al., 1967). Ein großes Problem
87
4. Diskussion
war hierbei die schlechte Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des Tumors bis
ins Innere des Gewebes, da der aktive Transport nicht mehr funktioniert und die
Distanz
für
die
Diffusion
zu
groß
war.
Auch
stellten
hier
spätere
Gewebequetschungen ein großes Problem bei der Aufarbeitung dar. Diese Probleme
wurden durch die Entwicklung von Mikrotomen gelöst, die es ermöglichten aus
primärem Gewebe dünnere Frischgewebeschnitte herzustellen (Krumdieck et al.,
1980). Diese Technik wurde ursprünglich angewandt für die Herstellung von
Frischgewebeschnitten
aus
Lebergewebe
zur
Untersuchung
von
Stoffwechselvorgängen (Smith et al., 1985; Barr et al., 1991, a und b). In diesen
Arbeiten wurden die Frischgewebeschnitte nur über einen Zeitraum von 24 h
kultiviert.
In
einzelnen
älteren
Studien
gelang
es
darüber
hinaus
auch
Frischgewebeschnitte aus humanen Kolon- und Mammakarzinomen und auch
Xenotransplantat-Tumore über mehrere Tage zu kultivieren (Nissen et al., 1983;
Mira-y-Lopez et al., 1987; Hood und Parham, 1998). Mira-y-Lopez et al. konnten
bereits nach 48 h einen Rückgang der Viabilität in Form von LDH-Verlust
nachweisen (Mira-y-Lopez et al., 1990). In der vorliegenden Arbeit konnte nach 96 h
kein
signifikanter
Viabilitätsverlust
beobachtet
werden.
Es
gelang
auch,
Frischgewebeschnitte aus normalem Lungengewebe herzustellen, allerdings wurde
das Gewebe vor dem Schneiden in Agarose eingebettet und nur über 24 h kultiviert
(Fisher et al., 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst für das Mammakarzinom ein exvivo-Gewebekulturmodell
entwickelt,
dass
es
ermöglicht,
durch
dünne
Frischgewebeschnitte die verschiedenen Zelltypen in ihrer natürlichen Umgebung
kultivieren
zu
können
und
die
Wirkung
verschiedener
Chemotherapeutika
auszutesten (van der Kuip et al., 2006). Um die optimalen Kulturbedingungen der
200 µm dicken Frischgewebeschnitte herauszufinden, wurde zunächst getestet, ob
eine ausreichende Diffusion gewährleistet ist und über welchen Zeitraum die
Experimente durchgeführt werden können. Als Beispiel für die Diffusion kleiner
Moleküle wie z.B. Glucose oder Aminosäuren wurde eine kurzzeitige Inkubation mit
Fluoreszenz-markiertem Taxol verwendet. Um die Diffusion größerer Moleküle wie
Antikörper sicherzustellen, wurde ein Fluoreszenz-markierter Antikörper gegen das
Epithel-spezifische Antigen (ESA) eingesetzt, dass spezifisch die epithelialen
Tumorzellen
anfärbt.
Diese
Untersuchungen
der
Diffusionsfähigkeit
der
88
4. Diskussion
Frischgewebeschnitte zeigten, dass es bei der Versorgung des gesamten Schnittes
mit Nährstoffen und Sauerstoff keine Probleme gibt.
Um innerhalb der nicht-fixierten, vitalen Frischgewebeschnitte die lebenden von den
toten Zellen unterscheiden zu können, wurde zunächst eine Vitalitätsfärbung anhand
eines
einfachen
Zellmodells
etabliert.
Dafür
wurde
eine
gut
etablierte
hämatopoetische Zelllinie verwendet, die das Onkogen Bcr-Abl exprimiert. Bcr-Abl
wird durch den Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib gehemmt, wodurch in Abwesenheit
exogener Wachstumsfaktoren ein sehr schnell eintretender Zelltod induziert wird
(Moehring et al., 2005). Anhand dieses einfachen Modells konnten geeignete
Fluoreszenzfarbstoffe und Färbebedingungen getestet und mit anderen, gut
etablierten Nachweismethoden für lebende und tote Zellen verglichen werden. Für
die vitalen Zellen wurde der Farbstoff TMRM (Tetramethylrhodamin-Methyl-Ester)
eingesetzt, der von aktiven Mitochondrien umgesetzt wird (Floryk et al., 1999). Da
dies bei hochproliferativen Zellen der Fall ist, eignete sich dieser Farbstoff besonders
gut zur Anfärbung der vitalen epithelialen Tumorzellen. Für die Färbung der toten
Zellen innerhalb des Frischgewebeschnittes wurde Picogreen eingesetzt. Dieser
Farbstoff diffundiert passiv durch die Zellmembranen toter Zellen (Singer et al.,
1997). Um alle Zellkerne anzufärben, wurde der DNA-Farbstoff Syto®63 verwendet
(Wlodkowic et al., 2008). Die verwendeten Farbstoffe zeichnen sich durch eine
starke Fluoreszenz aus und sind für eine simultane Färbung geeignet.
Konfokale Laserscan-Mikroskop-Bilder von Imatinib behandelten BaF3-Zellen, die
mit diesen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, zeigten eine vergleichbare
Anzahl toter und lebender Zellen wie in den parallel durchgeführten bereits gut
etablierten Detektionsmethoden mittels durchflusszytometrischer Analysen (Creutz,
1992). Diese Vitalfärbung konnte somit auf die Frischgewebeschnitte der
Mammakarzinome übertragen werden. Es wurde zusätzlich noch die Viabilität
anhand des ATP-Gehalts im Homogenat der Frischgewebeschnitte mittels einer
Luciferin-Luciferase-Reaktion bestimmt (Andreotti et al., 1995). Mittels dieser
verschiedenen Tests konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass
über eine Kulturdauer von vier Tagen kein signifikanter Viabilitätsverlust stattfindet.
Nach Bestimmung des möglichen Experimentierzeitraums wurde mithilfe der oben
genannten Tests untersucht, ob die Frischgewebekultur sich auch zur Untersuchung
der Wirkung von Chemotherapeutika eignet. So sollte eine Kurzzeitbehandlung der
Frischgewebeschnitte der primären Mammakarzinome mit steigenden Taxol-
89
4. Diskussion
Konzentrationen über drei Tage einen dosisabhängigen Zelltod zeigen. Mittels der
simultanen Fluoreszenzfärbung und der ATP-Gehaltsbestimmung konnte ein dosisabhängiger Zelltod innerhalb der Frischgewebeschnitte beobachtet werden. Beide
hier verwendeten Techniken zur Bestimmung der Viabiliät der Zellen haben
allerdings
gravierende
Laserscanmikroskop
Nachteile.
Die
aufgenommenen
Auswertung
Bilder
der
der
mittels
konfokalem
Frischgewebeschnitte
der
Mammakarzinome als sehr aufwendig und zeitintensiv herausgestellt. Es zeigten
sich Probleme bei der Detektion der Zellen mit dem DNA-Farbstoff Syto®63 und der
simultanen Färbung mit TMRM. Die Zellen, die durch hochaktive Mitochondrien
TMRM gut umsetzen konnten, ließen eine Diffusion von Syto®63 in den Zellkern nicht
zu. Eine Aussage über die Vitalität der Zellen konnte aber allein anhand der TMRMFärbung gemacht werden. Da die Intensität der Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt,
war es notwendig, verschiedene Areale des Frischgewebeschnittes aufzunehmen
und später die Auswertung anhand der aufgenommenen Bilder durchzuführen. Eine
Nachbewertung der Schnitte ist nicht möglich, da sie nach der Fluoreszenzfärbung
nicht länger in Kultur behalten werden können. Darüber hinaus konnte die
Viabilitätsfärbung nicht problemlos auf das Bronchialkarzinom übertragen werden, da
sich die Hintergrund-Färbung im Lungengewebe als zu stark erwies, sodass eine
Färbung der einzelnen Zellen nicht mehr deutlich abgrenzbar war. Außerdem ist es
weder mit der hier etablierten Vitalfärbung noch mit der ATP-Bestimmung möglich,
die Reaktionen der TAFs von denen der Tumorzellen zu unterscheiden.
Morphologisch ist es anhand der Vitalfärbung nicht möglich, einzelne Zelltypen
innerhalb des Frischgewebeschnittes zu unterscheiden. Eine spezifische Färbung
der
unterschiedlichen
Zelltypen
z.B.
mittels
Fluoreszenz-markierter
Oberflächenmarker ist schlecht möglich, da für die Vitalfärbung bereits drei
verschiedene Farben verwendet wurden. Außerdem wären die Antikörper-Färbungen
im Gegensatz zu den intensiven Vitalfarbstoffen sehr schwach und dadurch kaum
abgrenzbar.
Somit musste eine Technik erarbeitet werden, die es erlaubt, zwischen lebenden und
toten Zellen zu unterscheiden und auch die TAFs von den Tumorzellen getrennt
auszuwerten. Deshalb wurden die Frischgewebeschnitte nach der Kultur in An- oder
Abwesenheit der Chemotherapeutika fixiert und in Paraffin eingebettet. Mit dieser
Technik ist es möglich, die Morphologie der Frischgewebeschnitte zu erhalten. Ein
entscheidender Vorteil dieser Methode ist, innerhalb der Paraffinschnitte der
90
4. Diskussion
Frischgewebeschnitte die verschiedenen Zelltypen durch gleichzeitige H&E-Färbung
der Präparate morphologisch unterscheiden zu können. So konnte innerhalb des
Tumorgewebes die Wirkung der Chemotherapeutika sowohl auf die Tumorzellen als
auch auf die Stromazellen, insbesondere die TAFs, simultan beobachtet werden.
Außerdem können von einem Gewebekulturschnitt eine ganze Reihe von
Paraffinschnitten hergestellt und somit mehrere Parameter ausgewertet werden. Die
Auswertung muss im Gegensatz zu der Vitalfärbung für das konfokale LaserscanMikroskop nicht zeitnah zur Kultur erfolgen. Um die toten und viablen Zellen
innerhalb der Paraffin-eingebetteten Frischgewebeschnitte zu unterscheiden, wurden
verschiedene immunhistochemische Färbungen angewendet. Es wurden die
proliferierenden,
viablen
Zellen
mit
einem
KI67-spezifischen
Antikörper
immunhistochemisch angefärbt und die toten Zellen mittels TUNEL-Methode
markiert. Die KI67-Markierung ist eine gängige Methode in der Routinediagnose und
ist Teil des pathologischen Tumor-Gradings (Beresford et al., 2006). Auch die
TUNEL-Methode ist ein weit verbreiteter Ansatz, der zur Detektion toter Zellen
sowohl in Zellkultur als auch in Gewebeschnitten unterschiedlichster Aufarbeitung
sehr häufig verwendet wird (Gavrieli et al., 1992). Die Kombination beider Parameter
wurde beispielsweise auch verwendet, um die Chemotherapiewirkung während einer
neoadjuvanten Behandlung in einem Mammakarzinomkollektiv zu untersuchen
(Burcombe et al., 2006). Bei diesen Untersuchungen wurde aber nicht zwischen
epithelialen Tumorzellen und dem Tumor-assoziierten Stroma unterschieden.
Nach Anfertigung von Paraffin-eingebetteten Schnitten der Frischgewebeschnitte der
Bronchialkarzinome konnte anhand der H&E-Färbung kein Verlust der Viabilität
durch morphologische Veränderungen beobachtet werden. So konnte zwar die
Kulturmethode erfolgreich auf die Frischgewebeschnitte der Bronchialkarzinome
übertragen werden, nicht aber die Vitalfärbung der Frischgewebeschnitte, da sie eine
zu starke Hintergrundfärbung aufweist. Nach Einbettung der Frischgewebeschnitte
nach
der
Kultur
in
Paraffin
konnten
auch
die
immunhistochemischen
Untersuchungen für Bronchialkarzinomgewebe etabliert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden anhand der Paraffin-eingebetteten
Frischgewebeschnitte sowohl die Reaktion der epithelialen Zellen als auch die der
TAFs auf die Behandlung ausgewertet und miteinander verglichen. Dafür wurden die
jeweils positiv gefärbten Zellen im Vergleich zu den nicht-gefärbten Zellen ausgezählt
und das Ansprechen auf die Kurzzeitbehandlung durch den Rückgang der viablen
4. Diskussion
91
Zellen, bzw. den Anstieg der toten Zellen innerhalb der behandelten Schnitte im
Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgewertet.
Eine gängige pathologische Einteilung für die Expression verschiedener Marker in
immunhistochemisch gefärbten Schnitten definiert eine positive Expression ab 10 %
positiver Zellen im gesamten Schnitt (Koda et al., 2007). In vorliegender Arbeit wurde
das Ansprechen der Frischgewebeschnitte für die KI67-Färbung ab einer Reduktion
der Proliferationsrate im Vergleich der behandelten Schnitte zu den unbehandelten
Kontrollen um mehr als 10 % definiert. Da die TUNEL-Färbung oft eine technisch
bedingte stärkere Hintergrundfärbung aufwies, wurde hier die Induktion der Rate der
toten Zellen um mehr als 20 % als sicheres Ansprechen ausgewertet. Wie auch bei
den isolierten primären TAFs zeigte sich auch hier ein Unterschied in der
Chemosensitivität zwischen den Entitäten und den verschiedenen getesteten
Chemotherapeutika. In den 17 mit Taxol behandelten Frischgewebeschnitten aus
Mammakarzinomen zeigten neun eine Reduktion der Proliferation um mehr als 10 %.
Interessanterweise konnte in den Fällen, in denen das Tumorkompartiment durch
eine Reduktion der Anzahl der proliferierenden Zellen reagiert, auch eine Reduktion
der Proliferationsrate der TAFs beobachtet werden. Im Falle eines Ansprechens auf
die Behandlung reagierten also stets Tumor- und Stromakompartiment parallel. Für
die TUNEL-Färbung konnten aufgrund starker Hintergrundfärbung in drei Fällen nur
14 Mammakarzinome ausgewertet werden, sieben dieser 14 Fälle zeigten eine
Zunahme der toten Zellen um mehr als 20 %. Auch hier zeigte sich eine Zunahme
der TUNEL-positiven Zellen simultan in beiden Zellkompartimenten. In den
Frischgewebeschnitten der Bronchialkarzinome zeigten die Stromazellen schon in
den unbehandelten Kontrollen eine geringere Proliferationsaktivität, so dass hier
keine Reduktion nach Behandlung mit Cisplatin erwartet werden konnte. Die
Tumorzellen zeigten in neun von 16 Fällen eine Reduktion der proliferierenden
Zellen. Die Induktion der Rate der toten Zellen wurde nur in einer geringen Anzahl im
Tumorkompartiment beobachtet, zwei der 15 untersuchten Fälle zeigten eine
Induktion um mehr als 20 % sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment.
Dieser eindeutige Zusammenhang im Ansprechen beider Zellkompartimente in akut
behandelten Tumorgeweben wurde in den retrospektiv analysierten neoadjuvant
behandelten Mammakarzinomen nicht beobachtet. Eine sehr plausible Erklärung
dafür ist, dass im Gegensatz zu den ex vivo behandelten Tumorgeweben, bei denen
sich die akute Reaktion auf die Therapie zeitnah beobachtet lässt, bei den
92
4. Diskussion
retrospektiv analysierten Proben aus den in vivo behandelten Mammakarzinomen
zwischen der letzten Behandlung und der Tumorresektion mehrere Monate liegen,
eine akute Wirkung also nicht untersucht werden kann.
Der Vergleich der Chemosensitivität der isolierten, primären TAFs in Einzelzellkultur
und der Reaktion der TAFs innerhalb der Frischgewebeschnitte weist darauf hin,
dass die Sensitivität gegenüber den Chemotherapeutika nicht nur von intrinsischen
Faktoren, sondern auch von der Umgebung der Zellen abhängig ist. Die Behandlung
der Frischgewebeschnitte aus Mammakarzinomen mit Taxol führte zu einem Anstieg
der toten Zellen um bis zu 70 % sowohl in den Tumor- als auch in den Stromazellen,
während alle isolierten primären TAFs relativ resistent gegenüber Taxol waren. Auch
in den mit Cisplatin behandelten Bronchialkarzinomen zeigte sich eine zentrale Rolle
der Tumorumgebung auf die Chemosensitivität. Während die isoliert kultivierten
TAFs sehr heterogen auf Cisplatin reagierten und sich ein großer Anteil als
erstaunlich sensitiv erwies, waren die TAFs innerhalb ihrer natürlichen Umgebung in
den Frischgewebeschnitte deutlich besser geschützt und reagierten nur in 2 Fällen
parallel mit den Tumorzellen auf die Cisplatinbehandlung.
Ein möglicher Grund für dieses unterschiedliche Ansprechen könnte das verwendete
Kulturmedium sein. Während für die Frischgewebeschnitte ein serumfreies Medium
speziell für primäre epitheliale Tumorzellen verwendet wurde, wurde für die isolierten
TAFs serumhaltiges RPMI1640 mit verschiedenen Zusätzen verwendet. Dies könnte
die unterschiedliche Proliferationsaktivität der TAFs im Falle der Bronchialkarzinome
erklären. Im Fall der Mammakarzinome kam es jedoch in beiden Systemen zu
keinerlei Proliferationsverlust der TAFs, so dass das unterschiedliche Ansprechen
eher auf die unterschiedliche Mikroumgebung zurückzuführen ist, die in den
unterschiedlichen Tumorentitäten vorliegt. Dass sich die einzelnen Zelltypen
innerhalb
eines
Tumors
gegenseitig
beeinflussen
wurde
vielfach
in
Kokulturexperimenten nachgewiesen. In 2D-Kokulturen mit epithelialen Tumorzellen
und TAFs bzw. Serum-aktivierten Fibroblasten zeigte sich im Gegensatz zur Kokultur
mit normalen Fibroblasten ein wachstumshemmender Effekt auf die Tumorzellen
(Samoszuk et al., 2004; Sadlonova, 2005). Auch in vivo bilden die TAFs eine
unterstützende Umgebung für die epithelialen Tumorzellen und beeinflussen so das
Tumorwachstum (Olumi et al., 1999; Orimo et al., 2005). Wie wichtig die Umgebung
der Tumorzellen ist, zeigt auch die in verschiedenen Arbeiten beobachtete, durch
extra-zelluläre Matrix vermittelte Resistenz der Tumore gegenüber Chemotherapie
93
4. Diskussion
(Sethi et al., 1999; Tannock et al., 2002). Ein Hinweis darauf, dass die epithelialen
Tumorzellen ihrerseits auch das Tumorstroma, insbesondere die TAFs beeinflussen,
zeigt die Arbeitsgruppe um Moshe Oren. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die
Tumorzellen Einfluss auf die Stabilität von p53 in TAFs haben und diese nach
genotoxischem Stress modulieren (Bar et al., 2008). Hemmung von p53 in den
Fibroblasten kann somit ein protektiver Mechanismus der epithelialen Tumorzellen
sein, der die TAFs vor p53-abhängigem Tod schützt. Dass TAFs gegenüber
Chemotherapie durch die Anwesenheit der Tumorzellen geschützt werden, zeigen
auch erste Beobachtungen in Kokulturexperimenten mit den in der vorliegenden
Arbeit
isolierten,
primären
TAFs
aus
Bronchialkarzinomen
und
einer
Bronchialkarzinomzelllinie (noch nicht publizierte Daten der Arbeitsgruppe). Dies
könnte eine plausible Erklärung für die in dieser Arbeit beobachtete diskrepante
Reaktion der TAFs in isolierter Kultur bzw. im Gewebeverband sein.
Sensitive TAFs könnten durch die Anwesenheit relativ resistenter Tumorzellen vor
genotoxischem Stress geschützt werden. Während die Anwesenheit sensitiver
Tumorzellen dazu führen könnte, dass es dann zu der beobachteten parallelen
Reaktion beider Kompartimente kommt. Resistente TAFs könnten auch einen
protektiven Einfluss auf die Tumorzellen haben. Wenn jedoch eines der beiden
Kompartimente zugrunde geht, kann auch das andere Kompartiment nicht mehr
überleben. In dieser Arbeit konnte in den Frischgewebeschnitten der Tumore
beobachtet werden, dass beide Kompartimente fast parallel auf die Chemotherapie
angesprochen haben. Das deutet sehr darauf hin, dass das Stromakompartiment
einen Einfluss auf das Ansprechen des Tumors hat.
Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Tumorstroma, insbesondere die
TAFs, auf Chemotherapie ansprechen und somit ein zukünftiges Ziel der
Antitumortherapie sein können um den gesamten Tumor anzugreifen.
94
5. Fazit und Ausblick
5. Fazit und Ausblick
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass nicht nur epitheliale
Tumorzellen selbst sondern auch Tumor-assoziierte Fibroblasten (TAFs) ein Ziel der
Chemotherapie sind. Interessanterweise weisen die TAFs in Abhängigkeit vom
Zytostatikum aber auch abhängig von der Tumorentität eine extreme Heterogenität in
ihrer Reaktion auf. Dieses variable Ansprechen auf Chemotherapie ist in seiner
Heterogenität vergleichbar mit den etablierten Tumorzelllinien und wird offensichtlich
von epigenetischen und/oder genetischen Veränderungen determiniert, da das
Ansprechen über mehrere Passagen und in Abwesenheit von Tumorzellen
beibehalten wird.
In weiteren Arbeiten sollte die molekulare Ursache dieser Heterogenität des
Ansprechens der TAFs in größeren Kollektiven an verschiedenen Parametern
untersucht werden. So kann mittels neuer High-Throughput-Verfahren zeitgleich eine
relativ große Zahl unterschiedlicher TAFs auf epigenetische Veränderungen, aber
auch auf somatische Mutationen und Polymorphismen getestet werden. Durch die
Korrelation mit der Chemosensitivität kann ein möglicher Zusammenhang hergestellt
werden.
Darüber hinaus gibt die vorliegende Arbeit klare Hinweise für eine wichtige Rolle der
direkten zellulären Umgebung für die beobachtete heterogene Reaktion dieser Zellen
auf Chemotherapie. Mit den im Rahmen dieser Arbeit isolierten, primären TAFs
können nun gezielt Kokulturexperimente mit GFP-markierten Tumorzelllinien
durchgeführt werden. Interessant dabei ist, ob die Reaktion der Tumorzellen auf
Chemotherapie von der Sensitivität der mitkultivierten TAFs abhängig ist.
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass in Tumoren, die auf
Chemotherapie
angesprochen
haben,
sowohl
das
Tumor-
als
auch
das
Stromakompartiment reagiert. Somit ist es naheliegend, dass beide Kompartimente
in einer gegenseitigen Abhängigkeit voneinander das Ansprechen des gesamten
Tumors determinieren. Die pharmakologische Hemmung eines der beiden
Kompartimente könnte somit die Wirkung der Chemotherapie auf den Gesamttumor
deutlich verbessern. So werden für die Hemmung des Tumorzell-Wachstums z.B.
Antikörper und sogenannte small molecule Inhibitoren u.a. gegen den EGF-Rezeptor
(epidermal growth factor receptor) eingesetzt (Grünwald et al., 2003; Arora et al.,
2005). Die meisten Therapieansätze zur Hemmung des Stromas zielen heute auf die
5. Fazit und Ausblick
95
Hemmung der Endothelneubildung innerhalb des Tumors, deren Konsequenz dann
die Unterversorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff ist (Hofmeister et
al., 2007). Die direkte Hemmung der TAFs könnte beispielsweise durch den Einsatz
von PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) -Inhibitoren gelingen (Östmann,
2004). In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurden die PDGFR-Inhibitoren Dasatinib
und Nilotinib bereits zur Hemmung der Synthese der extra-zellulären Matrix
eingesetzt um das Tumor-unterstützende Stroma zu hemmen (Akhmetshina et al.,
2008). Durch die Umsetzung dieser Therapiemöglichkeiten in der Klinik könnte die
Behandlung solider Tumore effizienter werden. Darüber hinaus könnten die
Nebenwirkungen der Therapie durch Ausnutzen der Wechselwirkungen zwischen
den einzelnen Kompartimenten im Tumor eingeschränkt werden.
6. Zusammenfassung
96
6. Zusammenfassung
Karzinome sind komplexe Gewebe, in denen genetisch alterierte epitheliale
Tumorzellen von extrazellulärer Matrix (EZM) und Stromazellen umgeben sind. Diese
Umgebung spielt eine zentrale Rolle im Wachstum und Überleben der Tumore.
Damit ist es naheliegend, dass für einen Therapieerfolg nicht nur die Sensitivität der
malignen Tumorzellen, sondern auch die Reaktion der Stromazellen wichtig ist. Im
Rahmen dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob und wie der Hauptbestandteil des
Tumorstromas, die Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs), auf Chemotherapie
reagieren.
Da es bisher nur Schemata gibt, die zwar das Ansprechen der Tumorzellen aber
nicht die Reaktion der TAFs auf die Chemotherapie bewerten, wurde zunächst mit
fachlicher Unterstützung eines Pathologen ein Bewertungsschema für das
Tumorstroma entwickelt. Basierend auf Zellzahl und Morphologie der TAFs im
Stromaanteil des Tumors wurden vier Aktivitätsgrade definiert. Mit Hilfe dieser
Einteilung konnte anhand eines Biopsieproben-Kollektivs von 22 neoadjuvant
behandelten Mammakarzinomen vor und nach Chemotherapie die Reaktion der
TAFs auf Chemotherapie in vivo bewertet werden. Es wurde in dieser Arbeit erstmals
nachgewiesen, dass es in Fällen, die durch einen hohen Aktivitätsgrad der TAFs vor
der Therapie charakterisiert sind, zu einem deutlichen Aktivitätsverlust nach Therapie
kommt.
Interessanterweise
besteht
kein Zusammenhang der Reaktion auf
Chemotherapie zwischen TAFs und den epithelialen Tumorzellen.
Aufgrund der langen Zeitspanne zwischen dem letzten Zyklus der Chemotherapie
und der Tumorresektion konnte mit dieser in-vivo-Untersuchung nicht geklärt werden,
ob das Tumorstroma ein direktes oder indirektes Ziel der Chemotherapie ist. Daher
wurden in dieser Arbeit verschiedene ex-vivo-Kultursysteme entwickelt, die es
ermöglichen, die direkte Reaktion des Tumorstromas auf die Therapie zu
beobachten und mit dem Ansprechen der Tumorzellen zu vergleichen.
Zum Einen wurden primäre TAFs aus frischem Tumorgewebe isoliert und in
Einzelzellkultur die Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika getestet. Das
Ansprechen der TAFs auf Chemotherapie wurde mit dem Ansprechen von
etablierten Tumorzelllinien verglichen. Zum anderen wurde ein Gewebekultursystem
97
6. Zusammenfassung
etabliert, um das direkte Therapieansprechen der TAFs und der Tumorzellen in ihrer
natürlichen Gewebeumgebung zu untersuchen.
Für die Einzelzellkultur wurden primäre TAFs aus frischem Gewebe von 9 Mammaund 31 Bronchialkarzinomen isoliert. Alle TAFs konnten über zehn Passagen ohne
signifikanten Wachstumsverlust kultiviert werden. Alle getesteten TAFs waren
negativ für das Epithel-spezifische Antigen (ESA) und positiv für das TAF-spezifische
Fibroblast activation protein (FAP), wodurch eine von Epithelzellen freie homogene
Kultur der TAFs nachgewiesen werden konnte.
Die Chemosensitivität der primären isolierten TAFs gegenüber Cisplatin und Taxol
wurde bestimmt und mit etablierten Tumorzelllinien verglichen. Die TAFs zeigten sich
gegenüber Taxol sehr resistent, während sie auf Cisplatin heterogen reagierten.
Auch die Entität spielt bei der Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika eine große
Rolle. Die primären, isolierten TAFs aus Mammakarzinomen waren im Vergleich zu
den etablierten Tumorzelllinien relativ resistent gegenüber Cisplatin, während die
TAFs aus den Bronchialkarzinomen sich gegenüber der Behandlung genauso
heterogen zeigten, wie die etablierten Tumorzelllinien.
Eine mögliche Erklärung für dieses heterogene Ansprechen gegenüber Cisplatin
können somatische Mutationen oder Polymorphismen innerhalb von DNASchadensreparatur-Genen sein. Somatische Mutationen im p53-Gen spielen bei
Tumorzellen eine wichtige Rolle für das Ansprechen auf Chemotherapeutika.
Darüber hinaus wurden in anderen Arbeiten bereits somatische p53-Mutationen in
TAFs aus Mamma-, Kolon- und Ovarialkarzinomen identifiziert. In der vorliegenden
Arbeit konnte in 28 untersuchten TAFs aus Bronchialkarzinomen keine somatische
p53-Mutation detektiert werden und somit ein Zusammenhang mit dem heterogenen
Ansprechen gegenüber Cisplatin ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurden die
Polymorphismen p53-Arg72Pro, ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 untersucht,
die in anderen Arbeiten bereits mit der Sensitivität gegenüber zytotoxischem Stress
in
Verbindung
gebracht
werden.
Es
wurde
dabei
ein
nicht-signifikanter
Zusammenhang zwischen der Chemosensitivität der TAFs aus Bronchialkarzinomen
und dem p53-Arg72Pro Polymorphismus gefunden, während die ERCC1-Asn118Asn
und Mdm2-T/G309 Polymorphismen keine Rolle zu spielen scheinen.
Die Chemosensitivität der TAFs wurde innerhalb ihrer natürlichen Umgebung anhand
von
Frischgewebeschnitten
aus
17
Mamma-
und
16
Bronchialkarzinomen
untersucht. Die Viabilität der Schnitte wurde über vier Tage Kultivierung sichergestellt
6. Zusammenfassung
98
und es konnte keine Veränderung der Morphologie des Gewebes während dieser
Zeit beobachtet werden. Die Kurzzeitbehandlung mit Chemotherapeutika über drei
Tage
reichte
aus,
um
Tumorkompartimente
zu
die
Wirkung
untersuchen.
der
Die
Therapie
auf
die
einzelnen
Frischgewebeschnitte
aus
Mammakarzinomen wurden mit Taxol behandelt, während anhand von Schnitten aus
Bronchialkarzinomen das Ansprechen auf Cisplatin getestet wurde. Um die
Wirkungen der verwendeten zytotoxischen Substanzen auf die einzelnen Zelltypen
innerhalb
der
Frischgewebeschnitte
der
Mamma-
und
Bronchialkarzinome
untersuchen zu können, wurden proliferierende und tote Zellen immunhistochemisch
sowohl im Tumor- als auch im Stromakompartiment morphologisch nachgewiesen
und quantifiziert.
Die Frischgewebeschnitte der Mammakarzinome zeigten nach Taxol-Behandlung in
neun von 17 Fällen einen Rückgang der Proliferation und in sieben von 14 Fällen
einen Anstieg der Anzahl toter Zellen in beiden Zellkompartimenten. Die
Frischgewebeschnitte aus Bronchialkarzinomen zeigten in neun von 16 Fällen einen
Rückgang der proliferierenden Tumorzellen nach Cisplatin-Behandlung. Da das
Tumorstroma hier kaum proliferierte, konnte auch kein Ansprechen auf die
Behandlung erwartet werden. In den Fällen, die auf die Cisplatin-Behandlung mit
Zelltod reagierten, wurde der Anstieg des Zelltods in beiden Zellkompartimenten
detektiert.
Der Vergleich der Frischgewebekultur mit der Kultur der TAFs anhand der
Mammakarzinome zeigte im Gewebe ein heterogenes Ansprechen gegenüber Taxol,
während die isolierten, primären TAFs relativ resistent waren. Gegenüber Cisplatin
waren die isolierten, primären TAFs aus Bronchialkarzinomen wesentlich sensitiver
als die TAFs in den Frischgewebeschnitten. Somit spielt die Umgebung des Tumors
bei der Chemosensitivität eine entscheidende Rolle.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, dass nicht nur die
epithelialen Tumorzellen, sondern auch die TAFs ein wichtiges Ziel der
Chemotherapie sind. Die Reaktion der TAFs auf die Chemotherapie ist in
unterschiedlichen Entitäten, aber auch innerhalb einer Entität sehr heterogen. Zum
einen spielt die Umgebung eine große Rolle beim Ansprechen des Tumorstromas
und zum anderen kann davon ausgegangen werden, dass auch der Genotyp
Einfluss auf die Reaktion der TAFs gegenüber Chemotherapie nimmt. Die
Beobachtung, dass im nativen Tumorgewebe die Tumorzellen parallel mit den TAFs
6. Zusammenfassung
99
reagieren, lässt die Vermutung zu, dass beide Zelltypen für das Überleben des
Tumors wichtig sind. Die gezielte Hemmung eines der Tumorkompartimente könnte
die Chemosensitivität des Tumors somit erheblich steigern.
100
7. Summary
7. Summary
Carcinomas are complex tissues in which the genetically altered epithelial tumor cells
interact with their surrounding microenvironment including extra-cellular matrix and
stromal cells. This microenvironment plays a pivotal role in growth and survival of the
whole tumor. Therefore, not only the chemosensitivity of the malignant clone, but
also the response of the tumor stroma, in particular the response of tumor-associated
fibroblasts (TAFs) may be important for the therapeutic success. The aim of the study
was to clarify how these TAFs respond to chemotherapy.
Several grading systems have been established for evaluating the response of the
epithelial tumor cells. However, there was no grading system available for the
response of the stroma compartment to chemotherapy. We established a grading
system for the activity of the TAFs based on cell counts and cell morphology. This
was kindly supported by a pathologist with a great experience in this area. With this
grading system we investigated 22 biopsy samples from neoadjuvant treated breast
cancer patients. We compared both the stromal compartment and the tumor
compartment before and after therapy to evaluate the response to the neoadjuvant
chemotherapy. In this in vivo study a response of the stromal compartment was
detected in samples with a high stromal activity grade before neoadjuvant
chemotherapy. However, because of the long time lag between the last cycle of
chemotherapy and the surgery it could not be clarified, if the tumor stroma, in
particular the TAFs are a direct target of chemotherapy.
To investigate the direct, more acute response of TAFs we established different
ex vivo systems. On the one hand, the response to chemotherapy was tested in
primary isolated TAFs from tumor tissue using the MTT-assay. The response of the
TAFs was compared with the response of established tumor cell lines. On the other
hand, a tumor tissue slice culture was established to investigate the direct effect of
the chemotherapy on TAFs and tumor cells within their intact microenvironment after
a short-term drug exposure.
For the cell culture experiments freshly isolated TAFs from 9 breast tumors and 31
lung tumors were used. These TAFs grew for up to ten passages without significant
loss of proliferative activity. All tested TAFs were found to be negative for the
101
7. Summary
epithelial specific antigen (ESA) and positive for the TAF specific Fibroblast activation
protein (FAP), assuring an epithelial cell free homogeneous TAF culture.
The chemosensitivity to Cisplatinum and Paclitaxel of the primary isolated TAFs was
determined and compared with the chemosensitivity of a panel of established human
tumor cell lines. The TAFs turned out to be resistant to Paclitaxel, whereas they
showed a heterogeneous response to Cisplatinum. Interestingly, sensitivity to
Cisplatinum is also dependent on the tumor entity. Isolated primary TAFs from breast
carcinomas were more resistant to Cisplatinum in comparison to the majority of the
tumor cell lines, whereas TAFs from lung carcinomas showed the same
heterogeneity as the tumor cell line panel.
One reason for this heterogeneous response to Cisplatinum could be the existence
of somatic mutations and/or polymorphisms within DNA-damage response genes.
Somatic mutations within the p53 tumor suppressor gene play a critical role in the
response of tumor cells to chemotherapeutics. In other studies, such mutations have
been identified in TAFs from breast, colon and ovarian carcinomas. In this study,
however, no somatic exon mutation was detected in any of the 28 TAFs from lung.
Also these results showed no interdependency of somatic mutations and the
heterogeneous response to Cisplatinum.
In other studies, the polymorphisms p53-Arg72Pro, ERCC1-Asn118Asn and Mdm2T/G309 could be correlated with the sensitivity to cytotoxic stress. In this study, a
non-significant trend towards the chemosensitivity of TAFs from lung carcinomas and
the p53-Arg72Pro polymorphism could be observed, whereas the ERCC1Asn118Asn
und
Mdm2-T/G309
polymorphisms
had
no
influence
on
the
chemosensitivity.
The chemosensitivity of the TAFs was also determined within their microenvironment
on the basis of tumor tissue culture experiments performed with 17 breast
carcinomas and 16 lung carcinomas. Over a culture period of four days of the tumor
tissue slices there was no decrease in viability and no changes in tissue architecture
and cell morphology detectable. This time frame of four days allowed to investigate
acute response of the different tumor compartments to chemotherapy. Tumor tissue
slices from breast carcinomas were treated for 72 h with Paclitaxel, whereas the
tissue slices from lung carcinomas were treated with Cisplatinum. To investigate the
response of the different cell types to the tested chemotherapeutic drugs within the
intact tumor microenvironment, the tissue slices were fixed and stained
102
7. Summary
immunhistochemically for proliferative active and dead TAFs and epithelial cells. Nine
of 17 of the cultivated tissue slices from breast carcinomas showed a decrease in cell
counts of proliferating cells, whereas seven of 14 cases showed an increase of dead
cells after the treatment with Paclitaxel in both, tumor and stroma cell compartment.
The tissue slices of the lung carcinomas showed a decrease in proliferating tumor
cells after Cisplatinum treatment in comparison to the untreated controls. The stroma
compartment showed no proliferative activity so one could not expect a response
regarding a decrease of proliferating stroma cells. Two cases showed a response to
Cisplatinum regarding an increase in cell death in both tumor and stroma cell
compartment.
An interesting finding is that this short term exposure to Paclitaxel led to a parallel
reaction of both tumor and stromal cells in tissue culture experiments, whereas
isolated cultured CAFs from breast tumors turned out to be resistant to Paclitaxel. In
contrast, isolated TAFs from lung carcinomas are significantly more sensitive to
Cisplatinum than TAFs within their intact microenvironment.
Consequently, the microenvironment of the tumor plays a crucial role in
chemosensitivity. Regarding tissue culture, survival of CAFs may be more dependent
on supportive factors provided by the individual tumor environment. In contrast,
optimized single cell culture conditions for isolated fibroblasts may protect the cells in
a more artificial manner. The central role of the microenvironment for response of
CAFs to cytotoxic drugs is also demonstrated by our results obtained with lung
cancer tissues. These observations indicate that, in addition to intrinsic factors, the
microenvironment determines the sensitivity of CAFs to cytotoxic therapy.
In summary, this work demonstrates for the first time, not only the tumor cells but
also the stromal cells are an important target for the chemotherapy. The response of
TAFs is heterogeneous within different tumor entities and within one entity. Intrinsic
and extrinsic factors play an important role in chemosensitivity. On the one hand, the
tumor microenvironment is responsible for therapy response of TAFs and on the
other hand the genotype may play a crucial role in chemosensitivity. Both, tumor and
stroma cells react in parallel to chemotherapy, so you can assume that both cell
types are responsible for the chemosensitivity. Some therapeutic approaches could
be the inhibition of either the tumor or stromal cell compartment to increase the
chemosensitivity of the whole tumor.
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114
9. Eigene Veröffentlichungen
9. Eigene Veröffentlichungen
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden veröffentlich in:
Originalarbeiten:
van der Kuip H, Murdter TE, Sonnenberg M, McClellan M, Gutzeit S, Gerteis A,
Simon W, Fritz P, Aulitzky WE: Short term culture of breast cancer tissues to study
the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.
BMC Cancer, 2006, 6:86
Sonnenberg M, van der Kuip H, Fritz P, Haubeiß S, Schroth W, Friedel G, Simon W,
Mürdter TE, Aulitzky WE: Highly variable response to cytotoxic chemotherapy in
carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) from lung and breast.
BMC Cancer, 2008, 8:364
Abstracts/Vorträge:
Sonnenberg M, van der Kuip H, Fritz P, Gerteis A, Linder S, Hägg Olofsson M,
Nordheim A, Friedel G, Aulitzky WE, and Mürdter TE: Cancer tissue model to study
anti cancer drug effects and to identify predictive markers.
European Journal of Cancer Supplements, Vol 4, No. 12, Nov 2006, 99-100 [A318]
Sonnenberg M, van der Kuip H, Fritz P, Gerteis A, Lamkemeyer T, Nordheim A,
Friedel G, Aulitzky WE, Muerdter TE: Cancer tissue model to identify potential marker
proteins for prediction of drug efficacy in individual tumors.
Proc Amer Assoc Cancer Res; 2007 Apr 14-18; Los Angeles, CA. [A 3147]
Sonnenberg M, Henkes M, Fritz P, Friedel G, Mürdter TE, van der Kuip H, Aulitzky
WE: Cancer associated fibroblasts are a target of chemotherapy.
Onkologie 2007; 30(suppl 3): 1-244 [P570]
9. Eigene Veröffentlichungen
115
Sonnenberg M, Mürdter TE, Fritz P, Simon W, van der Kuip H, Aulitzky WE:
Chemotherapy affects tumor stroma.
Proc Amer Assoc Cancer Res; 2008 Apr 12-16; [V 2581]
Sonnenberg M, Mürdter TE, Haubeiß S, Fritz P, Gerteis A, Simon W, Friedel G, van
der Kuip H, Aulitzky WE: Both intrinsic variability and the microenvironment play
important roles in the response of cancer associated fibroblasts (CAFs) to
chemotherapy.
Onkologie 2008, Vol. 31, Suppl. 4; P381
Haubeiß S, Sonnenberg M, Friedel G, Mürdter TE, van der Kuip H, Aulitzky WE:
Imatinib and Dasatinib inhibit cancer associated fibroblasts (CAFs) from lung
carcinomas.
Onkologie 2008, Vol. 31, Suppl. 4; P396
AstraZeneca Scholar-in-Training Award, 99th Annual Meeting AACR, San Diego 2008
Sonnenberg M, Mürdter TE, Fritz P, Simon W, van der Kuip H, Aulitzky WE:
Chemotherapy affects tumor stroma.
Proc Amer Assoc Cancer Res; 2008 Apr 12-16; [V 2581] oral presentation
Weitere Veröffentlichungen:
Originalarbeiten:
Olofsson MH, Ueno T, Pan Y, Xu R, Cai F, van der Kuip H, Muerdter TE,
Sonnenberg M, Aulitzky WE, Schwarz S, Andersson E, Shoshan MC, Havelka AM,
Toi M, Linder S. Cytokeratin-18 is a useful serum biomarker for early determination of
response of breast carcinomas to chemotherapy.
Clinical Cancer Research, 2007, 13(11):3198-206
116
9. Eigene Veröffentlichungen
Fanta S, Sonnenberg M, Skorta I, Duyster J, Miething C, Aulitzky WE, van der
Kuip H: Pharmacological inhibition of c-Abl compromises genetic stability and DNA
repair in Bcr-Abl negative cells.
Oncogene, 2008, 27(31):4380-4
Abstracts/Vorträge:
van der Kuip H, Skorta J, Fiesel F, Sonnenberg M, Gawronski K, Moehring A,
Aulitzky WE. Imatinib mesylate (STI571) compromises p53 dependent DNA damage
response in Bcr-Abl positive cells in spite of presence of exogenous growth factors.
Proc Amer Assoc Cancer Res 2006, 47 April 2006 [A3335].
Skorta I, van der Kuip H, Sonnenberg M, Gawronski K, Aulitzky W: Imatinib mesylate
(STI571, Gleevec) switches Bcr-Abl into a dominant negative inhibitor of growth
factor signaling pathways.
Onkologie 2006; 29(suppl 3): 1-236 [P495]
Skorta I, Sonnenberg M, Fiesel F, van der Kuip H, Aulitzky W: Effect of kinaseinactive Bcr-Abl on DNA damage response in imatinib-treated cells.
Onkologie 2006; 29(suppl 3): 1-236 [P496]
Fanta S, Sonnenberg M, Skorta I, Duyster J, Miething C, Aulitzky WE, van der
Kuip H: Imatinib (STI571) kompromittiert die genetische Stabilität Bcr-Abl negativer
Zellen durch Hemmung der c-Abl-Kinaseaktivität.
Onkologie 2007; 30(suppl 3): 1-244 [V52]
Fanta S, Skorta I, Sonnenberg M, Aulitzky WE, van der Kuip H: c-Abl inhibition
affects DNA repair kinetics and genetic stability.
Proc Amer Assoc Cancer Res; 2008 Apr 12-16; [A 4871]
10. Danksagung
117
10. Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Walter E. Aulitzky für die Möglichkeit, dieses interessante
Thema zu bearbeiten und für sein stetes Interesse am Fortgang der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Martin Blum danke ich für die Bereitschaft, die Betreuung der
Dissertation von Seiten der Universität Hohenheim zu übernehmen.
Herrn Prof. Dr. Matthias Schwab danke für die Möglichkeit diese Dissertation an
seinem Institut anfertigen zu können.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Heiko van der Kuip für seine unermüdliche
Hilfsbereitschaft und hervorragende Betreuung rund um die Arbeit.
Ich danke allen Mitarbeitern des IKP für die immerwährende Hilfsbereitschaft,
insbesondere Herrn Dr. Peter Fritz, durch ihn wurde ein großer Teil dieser Arbeit erst
möglich gemacht.
Und natürlich bei allen „Aulis“: Frau Ioanna Skorta, Frau Silke Fanta, Frau Silke
Haubeiß, Frau Kerstin Willecke, Frau Tabea Peußer und Frau Dr. Alexandra Eckhoff.
Der Robert-Bosch-Gesellschaft danke ich für die finanzielle Unterstützung durch ein
Stipendium während der Durchführung dieser Arbeit.
Meinen Eltern danke ich für ihren Zuspruch und ihre Unterstützung während der
Anfertigung dieser Dissertation.
118
11. Lebenslauf
11. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Maike Sonnenberg
Geburtsdatum:
20.07.1981
Geburtsort:
Fürth, Bayern
Anschrift:
Goerdelerstr. 4
70806 Kornwestheim
Schulausbildung:
09/1987 - 07/1991
Riedschule, Karlsruhe
08/1991 - 06/2000
Max-Planck-Gymnasium, Karlsruhe
Studium:
10/2000 - 08/2005
Universität Hohenheim, Studium der Biologie
Schwerpunkte: Zoologie, Parasitologie, Medizinische
Mikrobiologie
Diplomarbeit am Dr. Margarete Fischer-Bosch Institut für
Klinische Pharmakologie
Titel: „Etablierung eines Zellmodells zur Untersuchung von
Resistenzmechanismen gegenüber Iressa (Gefitinib)“
Abschluss als Diplom Biologin
119
11. Lebenslauf
Promotion:
09/2005 - 01/2009
Dissertation am Dr. Margarete Fischer-Bosch Institut für
Klinische Pharmakologie
(Unterstützung der Dissertation durch ein Stipendium der
Robert Bosch Stiftung, Stuttgart)
AstraZeneca International Scholar-in-Training Award:
American Association for Cancer Research (AACR) 99th Annual Meeting, 2008, San
Diego
Sonnenberg M, Mürdter TE, Fritz P, Simon W, van der Kuip H, Aulitzky WE:
Chemotherapy affects tumor stroma. Proc Amer Assoc Cancer Res; 2008 Apr 12-16;
[V 2581]
120
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und unter
ausschließlicher Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und der Ratschläge von
jeweils namentlich aufgeführten Personen angefertigt habe
Maike Sonnenberg
Stuttgart, den 11.07.2009