Untersuchung des kardialen LIM

1
Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik,
Abteilung Innere Medizin III,
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg/Br.
Ärztlicher Direktor Prof. Dr. med. C. Bode
Untersuchung des
kardialen LIM-Domänen Proteins FHL2 im
menschlichen Myokard
Rolle von FHL2 bei der Herzinsuffizienz
INAUGURAL–DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg/Br.
Vorgelegt 2000
von Tobias Breyer
geboren in Braunschweig
2
Dekan
Prof. Dr. med. Dr. h.c. H. E. Blum
1. Gutachter
Prof. Dr. med. C. Holubarsch
2. Gutachter
PD Dr. med. M. Huonker
Jahr der Promotion
2001
3
Meinen Eltern
4
I. EINLEITUNG ........................................................................................................................................... 1
I.1
HERZINSUFFIZIENZ............................................................................................................................... 1
I.2
PHYSIOLOGIE DES HERZMUSKELS UND VERÄNDERUNGEN BEI DER HERZINSUFFIZIENZ ....................... 3
I.3
GENEXPRESSION UND -REGULATION IN EUKARYONTEN ....................................................................... 5
I.4
REGULATION DER KARDIALEN GENEXPRESSION UND VERÄNDERTE GENEXPRESSION BEI
MYOKARDHYPERTROPHIE .................................................................................................................... 8
I.5
LIM-DOMÄNEN PROTEINE ................................................................................................................. 12
I.6
FHL2 UND FRAGESTELLUNG ............................................................................................................. 15
II.
MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................................... 16
II.1
MATERIAL......................................................................................................................................... 16
II.1.1
Gewebeproben ........................................................................................................................ 16
II.1.2
Zellinien und Kulturmedien .................................................................................................... 16
II.1.3
Bakterien und Bakterienmedien.............................................................................................. 17
II.1.4
Transfektionsplasmide ............................................................................................................ 17
II.1.5
Sonden-cDNA ......................................................................................................................... 18
II.1.6
Kits.......................................................................................................................................... 18
II.1.7
Puffer und Lösungen............................................................................................................... 19
II.1.8
Chemikalien und Radiochemikalien ....................................................................................... 20
II.1.9
Enzyme.................................................................................................................................... 20
II.1.10 Geräte ...................................................................................................................................... 20
II.2
METHODEN ....................................................................................................................................... 22
II.2.1
Arbeiten mit Nukleinsäuren (DNA)......................................................................................... 22
II.2.1.1
Herstellung transformationskompetenter Zellen .................................................................................22
II.2.1.2
Transformation von Bakterien ............................................................................................................22
II.2.1.3
Amplifikation von Plasmid-DNA und Plasmid Maxi Präparation ......................................................23
II.2.1.4
Spaltung von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen..............................................................23
II.2.1.5
DNA-Agarose-Gelelektrophorese.......................................................................................................23
II.2.1.6
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ........................................................................24
II.2.1.7
Radioaktive Markierung von cDNA (Labeling)..................................................................................24
II.2.2
Arbeiten mit Nukleinsäuren (RNA) ......................................................................................... 25
II.2.2.1
Isolation von RNA aus Geweben ........................................................................................................25
II.2.2.2
Agarose-Gelelektrophorese von RNA und UV-Photodokumentation.................................................25
II.2.2.3
Transfer von RNA aus Agarose-Gelen auf Membranen (Northern Blotting).....................................26
II.2.2.4
Hybridisierung von RNA-Nylonmembranen mit radioaktiv markierten cDNA-Sonden ....................26
II.2.2.5
Quantifizierung der Northern Blot-Analysen......................................................................................26
II.2.3
Arbeiten mit Zellkulturen ........................................................................................................ 27
II.2.3.1
Allgemeines ........................................................................................................................................27
II.2.3.2
Transiente Transfektion von Säugerzellen ..........................................................................................28
II.2.3.3
Bestimmung der Luciferase-Aktivität .................................................................................................29
II.2.4
Statistische Auswertung .......................................................................................................... 30
5
III.
ERGEBNISSE ..................................................................................................................................... 31
III.1
KLINISCHE PATIENTENDATEN ...................................................................................................... 31
III.2
UNTERSUCHUNGEN DER FHL2 MRNA EXPRESSION ..................................................................... 33
III.2.1
FHL2 mRNA-Expression in insuffizientem Myokard ............................................................... 33
III.2.2
BNP-mRNA-Expression in Patienten und Kontrollen.............................................................. 36
III.2.3
FHL2 mRNA Expression ist bei NYHA IV erniedrigt .............................................................. 38
III.3
IV.
AKTIVIERUNG VON REPORTERGENEN DURCH FHL2 .................................................................... 41
DISKUSSION ................................................................................................................................. 43
IV.1
FHL2 ........................................................................................................................................... 44
IV.2
FHL2-MRNA EXPRESSION .......................................................................................................... 45
IV.2.1
Vorkommen im menschlichen Myokard ................................................................................... 45
IV.2.2
Lokale FHL2 Expression im menschlichen Herz ..................................................................... 46
IV.2.3
FHL2 Expression in insuffizientem Myokard........................................................................... 47
IV.3
FUNKTIONEN VON FHL2 .............................................................................................................. 49
IV.4
KORRELATION ZWISCHEN BNP UND FHL2 EXPRESSION ............................................................. 50
IV.5
FEHLENDE BNP EXPRESSION IN INSUFFIZIENTEM MYOKARD EINES PATIENTEN.......................... 53
V.
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................... 54
VI.
LITERATUR....................................................................................................................................... 55
VII.
ANHANG ........................................................................................................................................ 66
VII.1
DATENTABELLE DER FHL2 UND BNP ANALYSE .......................................................................... 66
VII.2
DANKSAGUNG UND STIPENDIUM ................................................................................................... 67
VII.3
PUBLIKATIONEN ............................................................................................................................ 68
VII.4
LEBENSLAUF ................................................................................................................................. 69
1
I.
EINLEITUNG
I.1 Herzinsuffizienz
Herz-Kreislauferkrankungen gehören, neben Malignomen, zu den bei weitem häufigsten
Ursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt. Etwa 22% der Bevölkerung
leiden unter Herz-Kreislauferkrankungen, der Anteil der Herz-Kreislauferkrankungen an
der Gesamtmortalität liegt bei über 40% und ist damit die führende Todesursache
(American Heart Association, 1999). Die Häufigkeit von Herz-Kreislauferkrankungen und
die sich daraus ergebende Morbidität und Mortalität führen zu einem sehr großen Verlust
an Lebensjahren und -qualität und verursachen ernorme volkswirtschaftliche Folgekosten.
Eine der häufigsten klinischen Manifestationsformen, besonders der chronischen HerzKreislauferkrankungen, stellt die Herzinsuffizienz (Herzpumpschwäche) dar.
Die wichtigsten klinischen Zeichen einer Herzinsuffizienz umfassen neben allgemeinem
Leistungsabfall und Müdigkeit, Luftnot bis hin zum Lungenödem und periphere Ödeme.
Die klinische Diagnose Herzinsuffizienz sagt aber noch nichts über die Genese der
kardialen Funktionsstörung aus, da die Ursache für die unzureichende Zirkulation von
Sauerstoff und Nährstoffen in die Körperperipherie sowohl an mangelndem Sauerstoffoder Nährstoffangebot, mangelndem zirkulatorischen Volumen (präkardiale Ursachen),
oder an mangelnder Pumpleistung des Herzen liegen kann (primär kardiale Ursache).
Letztere soll hier besprochen werden.
„Herzinsuffizienz bedeutet das Unvermögen des Herzens, trotz ausreichender
Oxygenierung des Blutes, den metabolischen und zirkulatorischen Erfordernissen des
Organismus bei normalem enddiastolischen Ventrikeldruck zu genügen.“
(Gross et al., 1994)
Die Pumpleistung hängt dabei im Wesentlichen von der eigentlichen Kontraktionskraft der
Myozyten, der Ventrikelgeometrie und Klappenfunktion, der diastolischen Füllung des
Herzens
und
vom
peripheren
Gesamtwiderstand
des
Kreislaufsystems
ab.
Hauptanpassungsmechanismus des Herzens an chronische hämodynamische Überlastung
ist die meist schon makroskopisch sichtbare, besonders echokardiographisch darstellbare
Myokardhypertrophie. Bei zunehmender Herzinsuffizienz trotz Myokardhypertrophie
spricht man auch von dilatativer Kardiomyopathie (DCM). Dabei spielt eine
Myokardhypertrophie mit Zunahme der Ventrikelwanddicke, eine Gefügedilatation und
auch ein ischämischer Verlust von Myokard eine wichtige Rolle. Diese strukturellen
2
Veränderungen lassen sich auf molekularer Ebene als Veränderungen der kardialen
Genexpression,
physiologischen
der
intrazellulären
Signaltransduktion
Stoffwechselvorgänge,
z.B.
des
und
Veränderungen
Kalziumstoffwechsels
der
der
Herzmuskelzelle, sowohl in den kardialen Myozyten als auch den Nichtmyozyten,
beobachten. Die Herzinsuffizienz bzw. DCM ist letztendlich die gemeinsame Endstrecke
vieler Herz-Kreislauferkrankungen, u.a. der ischämischen Myokardschädigungen, der
idiopathischen
DCM,
der
familiären
hypertrophen
Kardiomyopathie
und
der
hypertoniebedingten hypertrophen Kardiomyopathie. Gelegentlich können als Ursache
einer DCM eine Myokarditis (Nachweis von z.B. Enteroviren-DNA im Myokard),
Autoimmunerkrankungen (z.B. Antikörper gegen β-1-adrenerge Rezeptoren oder
Sarkolemm von Herzmuskelzellen), toxische Myokardschädigungen (z.B. Diphtherietoxin,
Alkohol, Zytostatika), Stoffwechselstörungen oder genetisch determinierte Veränderungen
der kontraktilen Proteine oder anderer subzellulärer Strukturen, wie z.B. des
sarkoplasmatischen Retikulums, nachgewiesen werden. Herzinsuffizienz ist nicht nur eine
häufige Ursache des finalen Herzversagens, sondern darüber hinaus ein eigenständiger,
wichtiger Risikofaktor für die Entstehung von kardialen, besonders ventrikulären
Arrhythmien und des plötzlichen Herztodes.
Schon 1870 wurde von Austin Flint erkannt, daß das Herz als Reaktion auf Überlastung
mit Zunahme der Muskelmasse reagiert und er interpretierte dies als Versuch des Herzens,
ähnlich der Skelettmuskulatur des Athleten, durch höhere Muskelmasse die gestiegene
(hämodynamische) Belastung zu kompensieren (Flint, 1870). William Osler folgerte, daß
das zunehmende Versagen eines chronisch belasteten Herzens durch zunehmende
Schwächung und Degeneration des hypertrophierten Myokards entsteht. Spätere Versuche
belegten, daß das akute Herzversagen von Tieren mit experimenteller Aortenkonstriktion
zunächst kompensatorisch durch Myokardhypertrophie
gemildert, das chronisch
überlastete Myokard aber zunehmend geschädigt wurde und die Tiere später an
chronischem Herzversagen starben (Osler, 1892). Eine mögliche Erklärung bietet das
Linzbach’sche “kritische Herzgewicht”, welches besagt, daß ab einem Herzgewicht von
ca. 500g eine relative Koronarinsuffizienz auftritt, die konsekutiv zu einer zunehmenden
ischämischen Myokardschädigung führt. Darüberhinaus könnte durch die Induktion der
kardialen Genexpression bei chronischer hypertropher Stimulation der Übergang von
reiner Hypertrophie in terminale Herzinsuffizienz gesteuert werden. Die Faktoren, die den
endgültigen Übergang von zunächst günstiger kompensatorischer Anpassungshypertrophie
des Myokards in die Herzinsuffizienz steuern, sind bis heute nicht identifiziert.
3
I.2 Physiologie des Herzmuskels und Veränderungen bei
der Herzinsuffizienz
Das Herzmuskelgewebe (Myokard) setzt sich vereinfacht aus kardialen Myozyten und
kardialen Nicht-Myozyten zusammen. Zu den Nicht-Myozyten gehören neben den
Bindegewebszellen
(kardialen
Fibrozyten),
Gefäßmuskel-
und
Endothelzellen,
immunkompetente Zellen und andere, deren Anteil insgesamt aber sehr gering ist. Die
Kontraktion der Muskelfaser wird von einer funktionellen Einheit, dem Sarkomer
bewerkstelligt. Das Sarkomer setzt sich aus sieben Hauptproteinen zusammen, der Myosin
Schwerkette (MHC), der Myosin Leichtkette (MLC), Tropomyosin (TM), dem TroponinKomplex (TnT, TnI, TnC) und Aktin. Getriggert durch eine elektrische Stimulation, das
Aktionspotential i.d.R. des Sinusknotens, vermitteln Ca2+-Ionen als wichtigste Mediatoren
die Kontraktion der Herzmuskelzelle. Dies ist die sog. elektromechanische Koppelung.
Während der Plateauphase des Herzaktionspotentials strömen Ca2+-Ionen aus dem
Extrazellulärraum
durch
spannungsabhängige
Ca2+-Kanäle,
den
sog.
Dihydropyridinrezeptor, in die Zelle ein. Dadurch werden wiederum weitere Ca2+-Ionen
aus intrazellulären Speichern, dem sarkoplasmatischen Retikulum, durch Ca2+-getriggerte
Ca2+-Kanäle, den sog. Ryanodinrezeptor, freigesetzt. Die Konzentration des intrazellulären
Ca2+ steuert das Ausmaß der Aktivierung des kontraktilen Apparats, des Sarkomers, und
damit die Kraftentwicklung. In der Herzmuskelzelle ist die systolische Kraftentwicklung
inbesondere
vom
extrazellulär
einströmenden
Ca2+
abhängig,
wohingegen
im
Skelettmuskel die Kraftentwicklung von der Menge des intrazellulär freigesetzten Ca2+
bestimmt wird (Klinke und Silbernagl, 1994).
Die diastolische Erschlaffung des Myokards, welche für eine rasche und ausreichende
Füllung des Ventrikels erforderlich ist, wird analog von der Geschwindigkeit bestimmt,
mit der das intrazelluläre Ca2+ wieder auf den Ruhewert von ca. 0.1 µmol/l absinkt, da bei
dieser Ca2+-Konzentration keine neuen Querbrücken zwischen Aktin und Myosin mehr
gebildet werden können und somit der Muskel erschlafft. Dies geschieht, indem Ca2+
wieder in die Speicher des sarkoplasmatischen Retikulums, durch die sarkoplasmatische
Ca2+-ATPase (SERCA) und nach extrazellulär durch den Na+/Ca2+-Austauscher
zurückgepumpt wird. Darüberhinaus existieren noch eine Reihe weniger bedeutsamer,
durch Ca2+-bindende Proteine regulierend in die Ca2+-Homöostase eingreifende Faktoren,
u.a. Calmodulin, Calsequestrin, Calretikulin, und außerdem verschiedene Ionenkanäle.
4
Aus der Bedeutung des Zusammenspiels von Sarkomer und intrazellulärem Ca2+-Spiegel
wird ersichtlich, daß eine z.B. genetisch determinierte Alteration der kontraktilen Proteine
oder der Ca2+-regulierenden Proteine Ursache einer kontraktilen Dysfunktion und damit
einer Herzinsuffizienz sein kann. Genetisch determinierte Ursachen sind z.B. für Formen
der familiären hypertrophen Kardiomyopathie (HOCM) nachgewiesen worden. Es sind
verschiedene Mutationen beschrieben, z.B. für β-MHC (Geisterfer-Lowrance et al. 1990) ,
α-Tropomyosin und kardiales Troponin T (Thierfelder et al., 1994).
Insgesamt kommt es bei Herzinsuffizienz typischerweise zu einer gestörten Ca2+Homöostase und konsekutiv zu systolischer und/oder diastolischer Dysfunktion des
kontraktilen Apparates mit verminderter systolischer Kraftentwicklung bzw. diastolischer
Relaxationsstörung (Morgan et al., 1990). Dabei können diese Veränderungen sowohl
primäre Ursache der Insuffizienz als auch deren Folge sein, z.B. durch kompensatorische
Umbauvorgänge, das sog. Remodeling und durch eine entsprechende Änderung der
kardialen Genregulation.
Die Zunahme des Herzgewichts, der äußeren Form des insuffizienten Herzens und der
Umbau des Myokards beruht in erster Linie auf einer Hypertrophie der kardialen
Myozyten (Muskelzellen des Herzens) aber auch auf einer Proliferation der kardialen
Nicht-Myozyten, besonders der kardialen Fibrozyten, und Zunahme des interstitiellen
myokardialen
Kollagengehalts
(Weber
und
Brilla,
1991).
Allerdings
gibt
es
charakteristische Unterschiede zwischen einer Volumenbelastung des Myokards, welche
typischerweise zu exzentrischer Hypertrophie mit serieller Anordnung der neu
synthetisierten Sarkomere führt und Druckbelastung des Myokards, welches zu
konzentrischer Hypertrophie mit paralleler Anordnung der Sarkomere führt (Anversa et al.,
1983; Gerdes et al., 1988). Auch ist der Kollagenanteil im Myokard bei druckbedingter
Hypertrophie höher als bei Volumenbelastung (Calderone et al., 1995). Es wäre daher
möglich, daß weitere Unterschiede in der Art der Hypertrophie bestehen bei
Wachstumsfaktoren, adrenerger oder Endothelin-1 Stimulation, Wirkung von Zytokinen
oder physiologischem Training im Bezug auf den myokardialen Phänotyp, die kontraktile
Leistung und die Aktivierung von Second-Messenger-Systemen (Cittadini et al., 1996;
Mann, 1996; Thaik et al., 1995; Pennica et al., 1995; Maron et al., 1993). Insbesondere, da
gezeigt wurde, daß sich eine Myokardhypertrophie wieder rückbilden kann, z.B. bei
Leistungssportlern nach Ende des regelmäßigen Trainings (Maron et al., 1993), oder bei
Frauen nach Ende einer Schwangerschaft (Mone et al., 1996). Auf Wachstumsreize, wie
mechanische Belastung oder humorale Faktoren, reagieren adulte Kardiomyozyten nach
5
herrschender Meinung nicht mit Proliferation, sondern mit Hypertrophie und teilweise
auch mit der Induktion der Apoptose, des sog. „programmierten Zelltodes“ (Übersicht in:
Haunstetter und Izumo, 1998). Einige Autoren berichten über eine Proliferation von
adulten Kardiomyozyten, die aber ihrem zahlenmäßigen Umfang nach gering zu sein
scheint und bezüglich ihrer Bedeutung bei Herzerkrankungen kontrovers diskutiert wird
(Anversa und Kajstura, 1998; Soonpaa und Field, 1998). Im Zuge der Ausdifferenzierung
von Kardiomyozyten werden diese im Zellzyklus in der sog. G0-Phase angehalten und
können sich daher nicht mehr teilen bzw. proliferieren. Auch die Transkriptions- und
Proteinsyntheserate wird auf einem niedrigen Niveau stabilisiert, das ausreicht, die Zelle
zu erhalten und zu regenerieren. Bei dieser Ausdifferenzierung ändert sich die Art der
exprimierten Gene: während der Phase der embryonalen Herzentwicklung können die
Kardiomyozyten auf entwicklungsfördernde Einflüsse wie z.B. Wachstumsfaktoren mit
einer hohen Rate an Transkription und Proteinsynthese von fötalen, herzspezifischen
Genen reagieren und die Proliferation durch vollständiges Durchlaufen des Zellzyklus
abschließen. Chronische proliferative Stimulation adulter Kardiomyozyten führt in
geringerem Umfang zur Induktion von Apoptose. Katz interpretierte daher die Induktion
der Apoptose als „Ausweg” des adulten Myozyten, aus der Unfähigkeit den Zellzyklus
vollständig durchlaufen zu können, auf chronische proliferativer Stimulation zu reagieren
(Katz, 1995). Die Differenzierungsphase der Kardiomyozyten von der fötalen,
proliferierenden Muskelzelle, zum ausdifferenzierten Kardiomyozyten im G0-Arrest, steht
unter der Kontrolle eines veränderten Zusammenspiels verschiedener extrazellulärer
Signale und intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden, die die Herzentwicklung steuern.
Zusätzlich steht die Differenzierung der Kardiomyozyten unter dem Einfluß von myogenen
Determinierungsgenen und Tumorsuppressorgenen (siehe hierzu Kap. I.4; Sadoshima und
Izumo, 1997).
I.3 Genexpression und -regulation in Eukaryonten
Die komplexen Anpassungsvorgänge in einem so weit spezialisierten Organ wie dem
Herzen, setzen das koordinierte Zusammenarbeiten einer Vielzahl von spezialisierten
Zelltypen voraus. Die verschiedenen Zellen des Herzens können offenbar Signale aus ihrer
Umwelt aufnehmen, und darauf mit einer Änderung ihrer Stoffwechselaktivitäten oder
Funktion z.B. im Rahmen einer Myokardhypertrophie reagieren, wobei sich dabei oft auch
die Genexpression der Zellen ändert. Genexpression bedeutet die Synthese von Proteinen
anhand der in der DNA codierten “Bauanleitung” (Sequenz). Die Informationen der DNA-
6
Sequenz werden bei der Genexpression in die Boten-RNA (mRNA) abgeschrieben
(Transkription) und anschließend in die korrespondierende Proteinsequenz übersetzt
(Translation). Jeweils 3 Basen der DNA bzw. RNA-Sequenz, Triplet genannt, kodieren für
genau eine Aminosäure der Proteinsequenz. Zwischen diesen Schritten findet noch
zusätzlich
eine
Modifizierung
des
Abschriftresultates,
die
posttranskriptionelle
Prozessierung der mRNA statt. Diese Vorgänge müssen zeitlich, örtlich und oft auch
zelltypspezifisch genau koordiniert werden, was wirkungsvolle Regulationsmechanismen
insbesondere für die Transkription und die Prozessierung des primären Abschriftresultates,
aber auch für den Kernexport der mRNA und die Translation erfordert (Übersichten in:
Latchman,
1995;
Cooper,
1997).
Darüberhinaus
ergeben
sich
noch
weitere
Komplexitätsstufen, da auch die Koordination des räumlichen Ablaufes der Transkription
kompliziert reguliert ist. DNA liegt in der (eukaryoten) Zelle in der Regel nicht “nackt”,
sondern
in
einer
äußert
komplexen
räumlichen
Struktur
vor:
das
lineare
Doppelhelixmolekül DNA ist um Histone (spezialisierte Proteinkomplexe) gewickelt und
dieser zusammen als Chromatin bezeichnete Komplex hat seinerseits wiederum eine
räumliche Struktur. Um die DNA der Transkription zugänglich zu machen ist es daher
erforderlich, zuerst die DNA zu “entwinden” und von den Proteinkomplexen zu befreien.
Dieser Prozeß selbst ist ebenfalls reguliert, u.a. durch das Enzym Topoisomerase.
Zur Regulation der Transkription eines bestimmten Genes sind auf der DNA
regulatorische Elemente kodiert, die in unmittelbarer Nähe zum Transkriptionsstartpunkt
ihres spezifischen Zielgenes liegen, sogenannte Promotoren. Die Grundstruktur eines
Genes besteht also aus dem Promoter und dem nachfolgenden eigentlichen Gen.
Promotoren sind sozusagen das Bindeglied zwischen intrazellulärer Signaltransduktion und
Genexpression. Regulative DNA-Sequenzen, die über eine größere Distanz hinweg die
Expression eines Zielgenes beeinflussen, werden, wenn sie expressionsfördernd wirken,
Enhancer, oder, falls abschwächend, Silencer genannt. Dabei scheint es keine Rolle zu
spielen, ob ein Enhancer tausende Basenpaare vor oder hinter oder sogar in dem Gen liegt,
dessen Promoter er aktiviert.
Transkriptionsfaktoren einerseits und die RNA-Polymerase II andererseits binden an
spezifische Sequenzmotive innerhalb des Promotors, wie z.B. die TATA-, die CAAT- oder
GC-Sequenz, welche ca. 50-200 Basenpaare vom Startpunkt der Transkription eines Genes
entfernt liegen, und bestimmen so die „basale“ Expression eines Genes. Weitere
aktivierende Proteine binden an andere Sequenzen in der Nähe des Promoters und
„aktivieren“ die Genexpression des entsprechenden Genes über das „basale“ Niveau
7
hinaus. Spezifische Sequenzen sind verantwortlich für die z.B. gewebe- oder
entwicklungsspezifische Expression von Genen (aus: Stryer, 1991).
Weitere Beispiele für regulatorische DNA-Sequenzen, die mit intrazellulären Proteinen,
sekundären Botenstoffen oder Transkriptionsfaktoren interagieren, sind u.a. das TPAresponsive-element TRE (TPA: 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat), welches mit dem
Transkriptionsfaktor AP-1 interagiert, oder das cAMP-responsive-element (CRE) mit dem
Transkriptionsfaktor CREB (CRE-bindende Protein). So steuern diese Sequenzen über die
Interaktion mit Transkriptionsfaktoren die Expression eines Zielgenes in Abhängigkeit von
intrazellulären Signalen, z.B. zyklischem Adenosinphosphat (cAMP). Ein solcher
multifaktorieller Transkriptionskomplex bestimmt die basale Expression eines Genes
(s.o.). Diese Kettenreaktion von nacheinandergeschalteten Aktivierungsschritten kann
weiter kompliziert sein durch Kofaktoren, die z.B. synergistisch, antagonistisch oder
permissiv regulierend in diese Abläufe eingreifen. Auch hormonsensitive Elemente können
Bestandteile
eines
Hormonrezeptoren.
Transkriptionskomplexes
Diese
gehören
zu
sein,
den
so
z.B.
sog.
bei
den
nukleären
ligandeninduzierbaren
Transkriptionsfaktoren, die spezifische DNA-Sequenzen binden, die sog. “hormoneresponsive-elements” (HREs), und so letztlich die Transkription eines Zielgenes
ligandenabhängig, also hier hormonabhängig, über einen Transkriptionsfaktor in Form
eines Hormon-Hormonrezeptor-Komplexes durch Bindung an das spezifische HRE auf der
DNA bestimmen. Die nukleären Rezeptoren haben häufig noch weitere Bindungsdomänen,
die ihrerseits hemmende oder aktivierende Kofaktoren binden können. Zu diesen
Kofaktoren von nukleären Hormonrezeptoren gehören z.B. LIM-Domänen Proteine (s.
Kap. I.5.), eine Gruppe von Zinkfinger-Proteinen, von denen einige in Muskelzellen
exprimiert sind und z.T. eine Rolle bei der Muskelentwicklung zu spielen scheinen (vgl.
Kap. I.5). Beispielsweise bindet der Androgenrezeptor (AR) im Zytosol an Androgen und
dieser Komplex aus AR und Hormon transloziert in den Nukleus, läßt sich über seine
Bindungsstelle für das LIM-Domänen Protein FHL2, einen Kofaktor des AR, durch FHL2
beeinflussen und bindet im Nukleus an seine spezifische DNA-Sequenz, das Androgenresponsive-element (ARE) und steuert so die Expression seines Zielgenes (oder mehrerer
Zielgene) (Müller et al., 2000).
8
I.4 Regulation der kardialen Genexpression und veränderte
Genexpression bei Myokardhypertrophie
Aufgrund der komplexen Umbauvorgänge des auf Belastungen reagierenden Myokards,
die einerseits diese Belastungen z.T. kompensieren können, andererseits aber auch zu
chronischem Herzversagen (Herzinsuffizienz) führen können, ist die Kenntnis der
kardialen
Genregulation
und
der
entsprechenden
Veränderungen
bei
der
Myokardhypertrophie wichtig zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Obwohl
bereits einiges über die myogene Regulation der Skelettmuskulaturentwicklung bekannt
ist, sind erst einzelne Faktoren der Herzmuskelentwicklung entdeckt worden, u.a.
Homöodomäne-Proteine, GATA-Faktoren, Retinol-Rezeptoren, herzspezifische “HelixLoop-Helix”-Proteine und MEF-Proteine. Diese verschiedenen Gruppen von Faktoren
werden im folgenden vorgestellt.
Untersuchungen der Genregulation in der Taufliege, Drosophila melanogaster, haben
durch die Entdeckung der Homöodomäne-Proteine sehr zu den bisherigen Erkenntnissen
beigetragen. Die Homöodomäne oder Homöobox ist ein hochkonserviertes Motiv, das in
Genen gefunden wird, die die Embryonalentwicklung steuern. In Homöodomäne-Genen
wurden Mutationen gefunden, bei denen ein Körperteil in einen anderen umgewandelt
wurde, sogenannte “homöotische Mutationen”, (Stryer, 1991). Beispielsweise scheint das
tinman Homöobox-Protein eine wichtige Rolle bei der frühen Herzentwicklung zu spielen,
da es in der Drosophila bei einem Verlust von tinman nicht zur Ausbildung von Herz- und
glatter Muskulatur kommt, ein Wiederherstellung der tinman-Expression aber teilweise
wieder zu einem Auftreten von Herzmuskelzellen führt (Bodmer, 1995; Azpiazu und
Frasch, 1993). In Mäusen wurden Proteine mit derselben Homöodomäne wie tinman
gesucht und man fand die (murinen) Homöodomäne-Proteine Nkx-2.5 und Csx, welche
ganz überwiegend im adulten Myokard exprimiert werden, ohne eine wesentliche
Expression in anderen Muskeln zu zeigen (Komuro und Izumo, 1993; Lints et al., 1993).
Da Nkx-2.5/Csx sehr früh während der fötalen Entwicklung exprimiert werden (ab Tag
E8,5 pc), vor anderen herzspezifischen Genen, wird ihnen eine besondere Rolle bei der
Differenzierung der myokardialen Vorläuferzellen und der Aufrechterhaltung des kardialen
Phänotyps zugeschrieben. Bei gezieltem Ausschalten der Nkx-2.5-Expression kommt es zu
einem letalen kardialen Phänotyp (Tag E9-10) (Lyons et al., 1995). Es entwickeln sich
zwar myokardiale Zellen, aber die für die Herzentwicklung unerläßliche Drehung des
Herzschlauches bleibt aus (Tag E8,25-8,5).
9
Die Gruppe der GATA-Transkriptionsregulatoren wird gewebespezifisch exprimiert.
GATA-4 wird insbesondere in endokardialen Zellen exprimiert und GATA-5 in sehr
frühen Entwicklungsphasen in mesodermalen Zellen. Die Faktoren GATA-4 (-5 und -6)
scheinen eine Rolle bei der Herzentwicklung zu spielen, da Zellen in denen sie exprimiert
werden, sich später in myokardiale Zellen weiterdifferenzieren (Heikinheimo et al., 1994;
Laverriere et al., 1994; Huang et al., 1995). Außerdem ist gezeigt worden, daß die
Expression der kardialen Gene für Troponin C und α-MHC durch die Expression von
GATA-4 beeinflußt wird. Auch die Promotoren der kardialen natriuretischen Peptide ANF
und BNP (s.u.) enthalten GATA Motive und können in kultivierten neonatalen
Rattenkardiomyozyten durch die Expression von GATA-4 aktiviert werden (Molkentin et
al., 1994; Grepin et al., 1994; Thuerauf et al., 1994).
Eine weitere Gruppe von myogenen Determinierungsgenen kodiert für „basic Helix-LoopHelix“-Proteine (bHLH), wie z.B. das MyoD oder das Myogenin, welche sowohl
Proliferation als auch Differenzierung von Skelettmuskelzellen steuern. In der Familie gibt
es aber auch zwei Mitglieder, eHAND und dHAND, die wichtig für die kardiale
Organogenese zu sein scheinen: eHAND wird zwar nicht herzspezifisch exprimiert, es
kommt auch in vielen anderen Geweben vor, aber es wird zuerst im Herz exprimiert (ab
Tag E8,5) (Cserjesi et al., 1995). dHAND dagegen wird im Gesamten sich entwickelnden,
embryonalen Herz exprimiert.
Mäuse, in denen durch Expression von antisense RNA bHLH funktionell nicht exprimiert
wurden, haben hier interessante Erkenntnisse erbracht: der Verlust der Funktion von
dHAND oder eHand bewirkte keine wesentliche Beeinträchtigung der embryonalen
Herzentwicklung, waren allerdings beide Gene funktionell ausgeschaltet, kam es zu einem
Entwicklungsstop im Stadium der Herzdrehung (Srivastava et al., 1995). Die bHLHFaktoren reichen aber für die Steuerung der Myogenese offenbar nicht aus.
Es sind zusätzlich die MEF2-Faktoren der Familie der MADS-Box-Transkriptionfaktoren
notwendig (Shore und Sharrocks, 1995). In Drosophila bleibt jegliche Myogenese aus,
wenn das Drosophila-eigene D-MEF-2 nicht exprimiert wird. MEF-2 ist somit zwar kein
herzspezifisches Gen, aber es kontrolliert entscheidend auch die kardiale Myogenese,
möglicherweise durch die nachgewiesene Interaktion mit einem herzspezifischen Faktor,
BBF-1, der an MEF-2 bindet. BBF-1 wird in kardialen Myozyten noch vor MEF-2
exprimiert, sodaß auch eine wichtige Rolle zur Determinierung der kardiogenen Zellinie
diskutiert wird (Mably und Liew, 1996).
10
Nach der Beschreibung regulativer Faktoren der Kardiomyogenese, soll anschließend
exemplarisch die Expression des kardialen Strukturproteins Myosin, besonders die der
beiden kardialen Isoformen α- und β-MHC, erläutert werden. Diese wird hormonell durch
die Schilddrüsenhormone T3 und T4 reguliert. Die Gene beider Isoformen dieses Elements
des kontraktilen Apparates des Herzens (vgl. Kap. I.4) liegen nur durch ca. 4500
Basenpaare (bp) voneinander getrennt auf Chromosom 14q12 als Tandem kodiert vor
(Mahdavi et al., 1984; Saez et al., 1987) und weisen weitgehende Strukturhomologien auf
(ca. 93,2% übereinstimmende Proteinsequenz bei der Ratte) (McNally et al., 1989). Dies
weist auf einen entwicklungsbiologisch gemeinsamen Ursprung beider Gene hin (Mahdavi
et al., 1984). Trotzdem sind die Expression und die physiologischen Eigenschaften beider
Gene sehr unterschiedlich. Auch die regulatorischen Elemente oberhalb der eigentlichen
MHC-Gene weisen große Unterschiede zwischen α- und β-MHC auf. Diese Unterschiede
sind zwischen verschiedenen Spezies, wie Ratte und Mensch allerdings weitgehend
konserviert. Daher ist es wahrscheinlich, daß die jeweilige Regulation ähnlich ist (Morkin,
1993). Beim Menschen kommt α-MHC im Wesentlichen im atrialen, β-MHC im
ventrikulären Myokard vor (Bouvagnet et al., 1984; Kubabayashi et al., 1988). Das
Myosinmolekül liegt als Hexamer aus 2 MHC und 4 Myosin Leichtketten (MLC) vor. Die
Unterschiede ergeben sich dabei hauptsächlich durch die Zusammensetzung der schweren
Myosinketten (MHC). Man unterscheidet V1-Myosin (α-α-MHC), V3 (β-β-MHC) und V2
(α-β-MHC). V1 besitzt die höchste ATPase-Aktivität, kontrahiert somit schneller und
verbraucht mehr Sauerstoff (Swynghedauw, 1986). Experimente mit Proteinen, die im
Skelettmuskel die skelettale MHC-Expression regulieren, wie z.B. MyoD, Myogenin, oder
myf-5, haben gezeigt, daß die MHC-Expression im Herz unabhängig von der der
Skelettmuskel-MHC reguliert ist (Tabscott und Weintraub, 1991). Es konnte gezeigt
werden, daß die Schilddrüsenhormone T3/T4 spezifisch in der Lage sind, die Expression
von α-MHC zu aktivieren und gleichzeitig die β-MHC Expression zu hemmen (Ladeson et
al., 1992; Morkin et al., 1983; Izumo und Mahdavi, 1988 ). Daneben steuern auch andere
Faktoren die Expression von α-MHC, wie z.B. MEF-2, der M-CAT-bindende-Faktor
(Molkentin und Markham, 1994), Endothelin (Wang et al., 1992), Egr-1, ein serumindizierbares, Zinkfinger-haltiges “early-response”-Gen (Gupta et al., 1991) und
mechanische Belastung (Izumo et al., 1988b). Der α-MHC-Promoter enthält beim
Menschen zwei T3/T4-responsive Elemente (TREs; s.o.), wovon Eines, TRE1, über 2
Oktamere (5’-C(T/A)GGAGG(T/A)-3’) den TR-T3/T4-Komplex bindet (TR = T3/T4Rezeptor) (Flink und Morkin, 1990). Dieses Oktamer findet sich an vergleichbarer Stelle,
11
etwa 160 bp oberhalb des α-MHC-Promotors, auch im Genom der Ratte. Ein weiteres
Element TRE2 findet sich nur beim Menschen und seine funktionelle Bedeutung ist noch
unklar. Darüberhinaus sind gibt es noch weitere, expressionsfördernde Elemente oberhalb
des α-MHC-Promotors (Flink und Morkin, 1990).
Die Region oberhalb des β-MHC-Promotors enthält verschiedene wichtige regulatorische
Elemente, u.a. zur Repression durch T3/T4, eine Kopie des sog. M-CAT Motivs zur
muskel-spezifischen Expression von Troponin-T (Mar und Ordahl, 1990), ein MyoDunabhängiges aktivierendes Element (Jones et al., 1988) und einen hormon-unabhängigen
Repressor (Flink et al., 1992).
Besondere Bedeutung erhalten diese Erkenntnisse über die genaue kardiale Genregulation
durch mögliche therapeutische Ansätze: ein T3-induzierter Wechsel der Myosin-Isoform,
oder die Stimulation der Expression anderer unter T3-Kontrolle stehender Gene z.B.
Na/Ka-ATPase oder SERCA, könnte die kardiale Leistungsfähigkeit verbessern, da z.B. in
Fällen von familiärer hypertropher Kardiomyopathie mit defektem kardialen β-MHC-Gen,
durch die Induktion der kardialen α-MHC-Expression die kontraktilen Eigenschaften des
Myokards eventuell gezielt verbessert werden könnten.
Bei der Myokardhypertrophie findet auf der Ebene der Genexpression die Induktion
verschiedener Gruppen von Genen statt. Als erste Gruppe von Genen werden sogenannte
“immediate early genes”, insbesondere c-jun, c-myc, c-fos und Egr-1 (s.o.) exprimiert, die
für basale Transkriptionsfaktoren kodieren, wie z.B. AP-1 (aktivierendes Protein-1,
gebildet aus jun und fos) (Izumo et al., 1988). Danach werden Gene exprimiert, die
während der Fötalentwicklung exprimiert wurden. Dies sind u.a. die Gruppe der
natriuretischen Peptide, ANF und BNP, und α-skelettales Aktin. ANF wird
physiologischerweise nur in den Vorhöfen, BNP überwiegend in den Ventrikeln
exprimiert. Während einer hypertrophen Stimulation des Myokards wird ANF in den
Ventrikeln reexprimiert und die ventrikuläre Expression von BNP steigt stark an. Die
BNP-mRNA-Expression steigt innerhalb 30 Minuten nach Einsetzen verschiedener
hypertropher Stimuli, wie mechanische Belastung durch stärkere Dehnung des Myokards,
Stimulation durch Katecholamine oder Angiotensin II u.a., um ein mehrfaches des
Ausgangswertes an (Wiese et al., 1997; Radicke et al., 1997). BNP wird in geringen
Mengen auch in nicht-insuffizientem, nicht-belasteten Ventrikeln exprimiert. In nichtinsuffizienten Vorhöfen ist die Expression nur sehr gering. BNP wird inzwischen als
Marker der myokardialen Belastung, mechanisch oder humoral, angesehen (Ogawa et al.,
1995; Bruneau und de Bold, 1994; Takahashi et al., 1992). Die dritte Gruppe von Genen
12
kodiert für die Bestandteile des kontraktilen Apparates (vgl. Kap. I.2). Bei der
Myokardhypertrophie ist das Expressionsmuster dieser Proteine verändert. Die Expression
einiger dieser Gene ist bei Hypertrophie selektiv sowohl auf Ebene des prä-mRNA
Spleißens als auch auf post-transkriptioneller Ebene induziert, z.B. bei β-MHC (s.o.),
atrialem MLC, glatt- und quergestreift muskulärem α-Aktin und bei β-Tropomyosin
(Yamazaki et al., 1995; Nadal-Ginard und Mahdavi, 1989). Bei Nagetieren, z.B. Mäusen
und Ratten, kommt es zudem zu einer Induktion der β-MHC-Isoform auf Kosten der bei
kleinen Nagern physiologischen α-MHC Expression. Dieser Isoformwechsel findet beim
Menschen allerdings nicht statt, da beim Menschen die β-MHC Isoform physiologisch ist
(Izumo et al., 1988).
Anhand der komplexen Veränderungen des Myokards bei der Entwicklung der
Herzinsuffizienz
wird deutlich, daß es sich auf molekularbiologischer Ebene um
multifaktorielle regulative Vorgänge handelt, die zunächst den Versuch darstellen, die
gestiegenen
zirkulatorischen
Belastungen
des
Organismus
durch
entsprechende
Anpassungsvorgänge des Myokards zu kompensieren. Diese Veränderungen sind z.T.
über Jahre hinweg durch Entzug des hypertrophen Stimulus reversibel, bevor sich eine
nicht
mehr
reversible
Leistungsverbesserung,
Myokardveränderung
sondern
fortschreitend
entwickelt,
zum
die
nicht
Versagen
des
mehr
zur
Herzens
(Herzinsuffizienz) führt. Derzeit ist nicht bekannt, welches die Faktoren sind, die den
Übergang der initialen nützlichen funktionellen Anpassung des Myokards über einen
„point-of-no-return“ hinweg in die terminale Herzinsuffizienz regulieren.
I.5 LIM-Domänen Proteine
LIM-Proteine sind beteiligt an der Ausbildung von Zellidentität, Zelldifferenzierung und
der Kontrolle von Zellwachstum (Dawid et al., 1994). Der Name LIM setzt sich aus den
Anfangsbuchstaben der zuerst gefundenen LIM-Proteine zusammen, nämlich Lin-11, Isl-1
und Mec-3 (Liebhaber et al., 1990). LIM-Domänen sind Doppelzinkfingerstrukturen, die
Protein-Protein-Interaktionen vermitteln können (Feuerstein et al., 1994). Der sogenannte
“Zinkfinger“ erhielt seinen Namen, da dieses Protein, über zwei Histidin- und zwei
Cysteinreste tetraedrisch koordiniert, einen Komplex mit einem zentralen Zinkatom bildet
und dadurch räumlich eine fingerähnliche Form erhält (Sanchez-Garcia und Rabbits,
1994). Neben LIM-Domänen können LIM-Proteine noch andere funktionelle Domänen
enthalten (s.u.). Darüberhinaus wäre die Struktur dieses “Fingers” prinzipiell mit der
13
Bindung von etwa fünf Basenpaaren DNA vereinbar, wodurch sowohl die kleine wie auch
die große Furche der DNA-Doppelhelix gebunden werden könnte (Stryer, 1991), wofür es
allerdings noch keine direkten experimentellen Belege gibt (Dawid et al., 1998). Daher
könnten LIM-Domänen intrinsisch oder als Interaktionspartner von Transkriptionsfaktoren
transkriptionsregulierende
Eigenschaften
besitzen.
Insgesamt
kommen
sie
als
Komponenten der intrazellulären Signaltransduktion in Frage.
Aufgrund ihrer Struktur wurden Sie in drei Untergruppen klassifiziert (Dawid et al., 1998):
(1) LIM + Homöobox–Proteine (LHX), die außer der LIM-Domäne noch eine Homöobox
(s.o.) enthalten,
(2) LIM + funktionelle Domäne-Proteine, wie LIM-Proteine mit
zusätzlichen funktionellen Domänen und (3) Proteine, die nur LIM-Domänen enthalten,
sog. LIM-only (LMO) Proteine. Die neun Zinkfinger in FHL2 haben die konservierte
Sequenz (Chan et al., 1998): C-X2-C-X3-I-X11-15-W-H-X2-C-F-X-C-X2-C-X3-(I/L)-X4(F/Y)-X8-C-X2-C. (C, Cystein; H, Histidin; I, Isoleucin; W, Tryptophan; F, Phenylalanin;
L, Leucin; Y, Tyrosin; X, eine beliebige Aminosäure; konservierte Aminosäuren sind fett
gedruckt).
Es sind muskelspezifische LIM Proteine beschrieben (vgl. Tabelle 1), wie z.B. das MuskelLIM-Protein (MLP), das Skelettmuskel-LIM-Protein SLIM-1, -2 und SLIM-3, welches
auch als DRAL oder FHL2 beschrieben ist. MLP, kommt offenbar eine wichtige Rolle bei
der Skelettmuskel-, und wahrscheinlich auch der Herzentwicklung zu. Interessanterweise
entwickeln Mäuse, d ie kein MLP exprimieren (MLP-/--“knockout”-Mäuse) u.a. eine
dilatative Kardiomyopathie (DCM) und Herzinsuffizienz. Dabei kommt es histologisch zu
einer veränderten Architektur des Zytoskeletts der Kardiomyozyten. Allerdings ist MLP
nicht spezifisch für das Herz, sondern wird ebenso auch in Skelettmuskulatur exprimiert
(Arber et al., 1994; Arber et al., 1997; Jain et al., 1996; Morgan et al.,1995; Morgan und
Madgwick, 1996a; Morgan und Madgwick, 1996b). Mäuse, die weder MLP noch
Phospholamban, ein Regulator des Ca2+-Stoffwechsels, exprimieren, haben dagegen
erstaunlicherweise
keine
Kardiomyopathie
(Minamisawa
et
al.,
1999).
Überraschenderweise verlieren diese Doppelknockout-Mäuse alle durch den isolierten
MLP-knockout entstandenen klinischen und molekularbiologischen Charakteristika der
Myokardhypertrophie und Herzinsuffizienz. Minasawa et al. interpretierten dies als Beleg
für die pathophysiologische Bedeutung einer gestörten SERCA/Ca2+-Regulation (vgl. Kap.
I.2) als zentrales Ereignis der Myokardinsuffizienz und ihrer Folgen.
14
funktionelle
Protein
Spezies
Expression
Assoziation
Referenz
FHL1 (Slim1)
Mensch
Skelettmuskel (adult), Herz,
Myogenese,
Brown et al., 1999
Xq27.2
Plazenta, Ovar, Dünndarm, Herzentwicklung
Lee et al., 1998
Prostata
Hase
Maus
FHL3 (Slim2)
Maus
nur Atria, Aorta,
Myogenese,
Skelettmuskel
Herzentwicklung
kardialer Ausflußtrakt links
Herzentwicklung,
und rechts (Tag E8,5-11),
Separation der
Neuralrohr, Somiten
Ausflußtrakte
Skelettmuskel
Myogenese
Morgan and
Madgwick, 1999
FHL2
Mensch, Maus
(Slim3/DRAL)
2q12-q13
Herz, Ovar, Prostataepithel
Herzentwicklung
Müller et al., 2000
Myogenese
Chan et al., 1998
Genini et al., 1997
LIMK1
Mensch
?
Williams-Beuren-
Frangiskakis et al.,
Syndrom: u.a. versch.
1996
angeb. Herzfehler, Vit.D-Stoffwechselst.,
Gesichtsdysmorphie,
CRP3/MLP
Maus
Herz, Skelettmuskel
Myogenese,
Arber et al., 1997
Herzentwicklung
Dilatative
Kardiomyopathie
Cypher1/2
Maus
Zytoskelett,
α-Aktinin 2, PKC;
Kardiomyozyten
Verbindung von
und Skelettmuskelzellen
Zytoskelett und PKC-
Zhou et al., 1999
Signalling
(Mechanosensor?)
CRP2/
Maus
SmLIM
Lin-11
Islet/Isl 1
Glatte Gefäßmuskelzellen
Tabelle 1.
Jain et al., 1998
LHX,
Freyd et al., 1990
Zelldifferenzierung
Dawid et al., 1998
Axonale Identität und
Karlsson et al., 1990
(VSMC) ab Tag E9, Herz
C. elegans
Drosophila,
Vulva, thermoreg. Neurone
Neurone
Maus
Mec-3
Myogenese
C. elegans
Ausrichtung
mechanosens. Neurone
LHX,
Way und Chalfie, 1988
Zelldifferenzierung
Dawid et al., 1998
Übersicht in Myozyten exprimierter LIM-Proteine.
Dargestellt ist die Spezies, Lokalisation der Expression und die (vermutete) funktionelle Bedeutung der bisher bekannten,
in Muskeln exprimierten LIM-Domänen Proteine. Außerdem Lin-11, Islet und Mec-3, die ersten drei gefundenen
Proteine, die der Familie den Namen LIM gaben.
15
I.6 FHL2 und Fragestellung
Auf der Suche nach Kofaktoren, d.h. möglichen funktionellen Interaktionspartnern des
Androgenrezeptors (AR), einem Mitglied der Gruppe der nukleären Hormonrezeptoren,
fand sich mittels eines sog. „Yeast-two-hybrid-screen“-Systems ein Protein, das 4 1/2 LIM
Domänen enthält. Diese Methode nutzt eine bekanntes Protein, in diesem Fall den
Androgenrezeptor, als Köder und „angelt“ aus einem Protein-Pool aufgrund von ProteinProtein-Bindungen einen (noch unbekannten) Interaktionspartner heraus. Durch die
Verwendung dieses Systems wurde nicht nur das Protein selbst gefunden, sondern
gleichzeitig auch eine wichtige Eigenschaft dieses Proteins bekannt, nämlich die der
Bindung bzw. physikalischen Interaktion zwischen Köderprotein und Bindungspartner.
Das gefundene Protein erwies sich als identisch mit den zuvor beschriebenen Proteinen
SLIM3, DRAL bzw. FHL2. Deshalb kommt das LIM-Domäne Protein FHL2 auch als
physiologischer Interaktionspartner des Androgenrezeptors in Frage. Funktionelle
Interaktionsanalysen bestätigten diesen Befund. FHL2 bindet sowohl in vitro als auch in
vivo spezifisch den Androgenrezeptor und steigert die transkriptionelle Aktivität (vgl. Kap.
I.3) des Androgenrezeptor-Androgen-Komplexes, sodaß mit dem LIM-Protein FHL2 ein
selektiver Koaktivator des Androgenrezeptors identifiziert wude (Müller et al., 2000).
Untersuchungen von Chan et al. (1998) mit SLIM3 (=FHL2) hatten gezeigt, daß SLIM3
fast ausschließlich im Herz exprimiert wird. Dies und die häufige Assoziation der LIMProteine mit der Myo- bzw. Organogenese (vgl. Tabelle 1) legen die Möglichkeit einer
physiologischen Relevanz dieses LIM Proteins für die Herzentwicklung nahe. Auch bei der
Entwicklung der Myokardhypertrophie (und –insuffizienz ?) der adulten Myozyten ist der
Androgenrezeptor beteiligt, sodaß auch hierbei FHL2 beteiligt sein kann (Marsh et al.,
1998). Die Fragestellung dieser Dissertation lautete deshalb, ob (1) dieses neue LIM
Protein FHL2 auch im adulten menschlichen Herz exprimiert wird und wo es im Herz
exprimiert wird. Bei anderen LIM Proteinen wurde gefunden, daß sie nur in bestimmten
Geweben des Körpers exprimiert werden, was ein Hinweis auf eine mögliche Relevanz für
die Herzentwicklung oder das Aufrechterhalten eines bestimmten Gewebetyps sein könnte.
Außerdem sollte die Frage beantwortet werden, ob (2) sich Hinweise finden, daß die
Expression in insuffizientem menschlichen Myokard
verändert ist gegenüben nicht-
insuffizientem Myokard. Als letzter Punkt (3) sollte untersucht werden, ob FHL2 eine
intrinsische, vom Androgenrezeptor unabhängige, die DNA Transkription eines Zielgenes
beeinflussende transaktivierende Aktivität hat.
16
II.
MATERIAL UND METHODEN
II.1
Material
II.1.1
Gewebeproben
Menschliches Myokard entstammt Patienten des Herz- und Diabeteszentrums NRW, Bad
Oeynhausen, und der Universitätsklinik Freiburg, die sich einer Herztransplantation bei
terminaler
Herzinsuffizienz
(NYHA
III/IV)
unterschiedlicher
Genese
oder
Herzoperationen wegen angeborener Herzfehler unterziehen mußten. Das Myokard wurde
intraoperativ innerhalb von maximal 10 Minuten nach Entnahme in Stückchen von ca. 100
mg portioniert, abtupftrocken in 1,5 ml Eppendorf Röhrchen überführt und sofort in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Analyse bei –80°C gelagert, um
einer Degradation der RNA vorzubeugen.
Als Normalkollektiv wurde kommerziell erhältliche Gesamt-RNA von 12 Herzen von
Menschen (Gesamtherzpool, männlich und weiblich, Alter zwischen 19 und 50 Jahren, Fa.
ClonTech) untersucht. Weitere klinische Angaben waren von Fa. ClonTech nicht
erhältlich.
II.1.2
Zellinien und Kulturmedien
CV-1:
Affen-Nierenzellinie (ATCC Nr.: CLL 70)
Medium: DMEM mit 10% FKS.
HL-1:
Erste immortalisierte Zellinie atrialer Maus-Kardiomyozyten (Claycomb et
al., 1998); Medium: ExCell 320 Medium mit 10% FKS, 10 ug/mL Insulin
(Gibco/BRL #680-330-7AC), zusätzlich 1x Nicht-essentielle Aminosäuren
(Gibco/BRL
#320-1140
AG),
50ug/mL
Endothelial
Cell
Growth
Supplement (ECGS) (Upstate Biotechnology #02-101), 10-6M Retinolsäure
(Sigma #R2625) und 10-4M Norepinephrin (Sigma #A0937).
Alle Medien enthalten zusätzlich mit 2mM Glutamin , 100IE/mL Penicillin und 100 ug/mL
Streptomycin.
17
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
Bio Whittaker (Verviers, Belgien)
Fötales Kälberserum (FKS)
Bio Whittaker (Verviers, Belgien)
Penicillin/Streptomycin (100x konzentriert)
Gibco/BRL, Eggenstein
Glutamin (200mM)
Gibco/BRL, Eggenstein
Trypsin/EDTA (10x konzentriert)
Gibco/BRL, Eggenstein
II.1.3
Bakterien und Bakterienmedien
E.coli NM554
F- araD139 ∆(ara-leu)7696 galE15 galK16 ∆(lac)X74 rpsL (Strr)
hsdR2 (rK- mK+) mcrA mcrB1 recA13. (Raleigh et al., 1988)
Bakterien werden in LB-Medium (Luria Bertani-Medium) bei 37°C in Kultur gehalten:
1% (w/v) Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 1% (w/v) NaCl, pH 7,0 mit NaOH
eingestellt. Zur Herstellung fester Nährböden wird 1,5% (w/v) Agar zugewogen. Als
Selektionsmedium wird LB-Medium mit einem Zusatz von 100 µg Ampicillin/ml
verwendet (LBamp -Medium bzw. LBamp -Platten). Das Medium wird autoklaviert und
vor Zugabe des Selektionsantibiotikums auf unter 50°C abgekühlt.
II.1.4
Transfektionsplasmide
pGAW-G5E1bluc
Luciferase-Expressionsvektor fusioniert mit 5 Gal4Bindungsstellen und der E1b TATA-Box (Hagen et al., 1995).
pCMX-Gal4
Expressionsvektor, der zur Kontrolle der basalen Luciferase-aktivität
nur die Gal4-DNA-bindende Domäne enthält. Plasmidsammlung
Labor Schüle (Umesono et al., 1991).
pGal4-FHL2
Expressionsvektor, der FHL2 in Fusion mit der Gal4-DNAbindenden Domäne enthält (Müller et al., 2000).
pGAL4-Src1a
Expressionsvektor, der Fusionsprotein aus Src1a und Gal4-DNAbindender Domäne (Gal4-DBD) exprimiert. Src1 ist ein Koaktivator
verschiedener nukleärer Steroidrezeptoren(Onate et al., 1998).
pGal4-TIF2.1
Expressionsvektor, der Fusionsprotein aus TIF2.1 und Gal4-DNAbindender Domäne (Gal4-DBD)
exprimiert. TIF2.1 ist ein
Koaktivator verschiedener nukleärer Steroidrezeptoren und des
Androgenrezeptors (Voegel et al., 1996).
18
II.1.5
Sonden-cDNA
FHL2
Full-length cDNA von FHL2 als 1kb EcoRI-Fragment des Plasmids
pACT-F; Plasmidsammlung Labor Schüle.
BNP
cDNA als RT-PCR-Produkt (humanes BNP), aus humaner GesamtRNA mittels bekannter Primer gewonnen (Seilhamer et al., 1989).
β-Aktin
Kommerziell erhältliche cDNA (Fa. ClonTech).
GAPDH
1,2 kb Pst-I Fragment der humanen Glyzerinaldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase (GAPDH). cDNA freundlicherweise überlassen von
Fr. Prof. H. Pahl, Freiburg.
TBP
Humanes TATA-bindendes-Protein-cDNA als zellkernspezifische
RNA-Sonde. Amplifikationsplasmid pXJ-TBP freundlicherweise
überlassen von Dr. Lazlo Tora, Straßburg.
II.1.6
Kits
Plasmid Maxi Präparations Kit
Qiagen, Hilden
Genenclean II Kit
Bio101 Inc., La Jolla, USA
Strip-EZ TM DNA Kit
Ambion, AMS Biotechnology, Frankfurt
ExpressHyb Solution
ClonTech, Heidelberg
RNAzol B
AMS Biotechnology, Frankfurt
RNAse Away
Fa. Roth
19
II.1.7
Puffer und Lösungen
Allgemeine Lösungen und Puffer:
TAE-Puffer (50x)
2M Tris/HCl; 5,7% (v/v) Eisessig; 50mM EDTA; pH 8,1.
Agarose-DNA-Ladepuffer
50% (w/v) Saccharose; 50mM EDTA (pH 8,0); 0,5% (v/v)
SDS; 0,06% (w/v) Bromphenolblau; 0,06% (w/v) Xylencyanol
Formaldehyd-Laufpuffer
2,2M Formaldehyd; 0,4M MOPS; 0,1M Natriumacetat;
0,01M EDTA
Formaldehyd-RNA-
1mM EDTA pH 8,0; 0,25% (w/v) Bromphenolblau; 0,25%
Ladepuffer (5x)
(w/v) Xylencyanol; 50% Glycerol
Plasmidpräparation (Qiagen Maxi Prep Kit):
P1
50 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, 100µg/ml RNase, pH 8,0
P2
200 mM NaOH, 1% SDS (w/v)
P3
3M K-Acetat/Acetat, pH 5,5
Zellkultur:
Luciferasepuffer
200 mM Tricine, 1,07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2, 0,1 M MgSO4,
10 mM EDTA pH 8,0 , 33 mM DTT, 0,5 M ATP, 270 mM
Acetyl Coenzym A, 470 mM Glühwürmchen-Luciferin.
PBS
137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,8mM KH2PO4
Transformationskompetente Zellen:
TFB I
TFB II
30 mM K-Acetat, 50 mM MnCl2, 100 mM RbCl2, 10 mM
CaCl2, 15% (v/v) Glycerol, pH 5,8
10 mM MOPS pH 7,0, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 15 % (v/v)
Glycerol
Weitere verwendete Puffer und Lösungen werden im Rahmen der angewendeten Methoden
beschrieben.
20
II.1.8
Chemikalien und Radiochemikalien
Alle Chemikalien wurden im Reinheitsgrad p.a. verwendet. Allen nicht aufgeführten
Grundchemikalien wurden von den Firmen Fluka (Neu-Ulm) oder Roth (Karlsruhe) bezogen.
Agarose, RNAse-frei (Gibco)
Ethanol p.a. (Roth)
BSA (Sigma-Aldrich)
Ethidiumbromid (Roth)
Chloroform p.a. (Roth)
HEPES (Roth)
DEPC (Fluka Chemika)
Isopropanol p.a. (Roth)
DOTAP (Boehringer Mannheim)
Luciferin (Promega)
DNA Marker „1 kb ladder“ (Gibco)
SDS (Serva)
EDTA (Serva)
α-32P-dATP (Amersham)
Effectene Transfection Reagent (Qiagen)
II.1.9
Enzyme
Die verwendeten Restriktionsendonuklease-Enzyme (EcoRI) wurden von New England
Biolabs (Schwalbach) bezogen und in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer verwendet.
Weitere Enzyme sind Teil verschiedener verwendeter Kits (s.dort) und werden hier nicht
gesondert aufgeführt.
II.1.10
Geräte
Neben der laborüblichen Ausstattung wurden folgende Geräte verwendet:
Bakterienschüttler (Heraeus)
Gelelektrophorese Kammern (BioRad)
Begasungsinkubatoren (Heraeus)
GenePulser II-Elektroporator (BioRad)
Corex-Zentrifugenröhrchen (Corex)
Gewebekulturschalen (Greiner)
Entwicklermaschine Curix 60 (Agfa)
Heizblock (Techne Driblock)
Falcon Röhrchen (Becton-Dickinson)
Luminometer ML 3000 (Dynatech)
Feinwaage (Mettler)
Magnetrührer (Ikamag)
Geiger-Müller-Zähler LB 122 (Berthold)
Mikroskope (Wilovert)
Gel-Dokumentationsanlage Eagle Eye
Neubauer-Zählkammer (Brand)
(Stratagene)
21
Nylonmembranen Nytran 0,2
Röntgenfilm-Kassetten (Cawo)
(Schleicher&Schuell)
Röntenfilme (Kodak und Fuji)
Parafilm (American National Can)
Spannungsquellen (BioRad)
pH-Meter (Beckmann) PhosphoImager
Turboblotter (Schleicher und Schuell)
BAS 1000 (Fuji)
UV-StrataLinker (Stratagene)
Photometer MR 7000 (Dynatech)
Vortex Genie II (Bender und Hohbein)
Polytron Ultraturrax T25 (Janke und
Whatmann 3MM-Papiere (Schleicher und
Kunkel)
Schuell)
Reaktionsröhrchen
1,5
und
2,0
mL
Zentrifugen:
(Eppendorf)
Eppendorf Tischzentrifugen 5415C und
Rotoren: JA10, JA20, TI70 (Beckmann)
5417C, Beckmann J2-HS.
22
II.2
Methoden
II.2.1
Arbeiten mit Nukleinsäuren (DNA)
II.2.1.1
Herstellung transformationskompetenter Zellen
Zellen können durch chemische Behandlung oder durch einen Strompuls zur Aufnahme von
Fremd-DNA gebracht werden (Transformation). Für jedes Transformationsprotokoll werden
spezifisch kompetent gemachte Zellen benötigt.
Chemokompetente E.coli-Zellen: Bakterien können durch Behandlung mit Calzium sowie mit
Rubidium- und Mangansalzen zur Aufnahme von Fremd-DNA gebracht werden. Die
Aufnahme der DNA durch die kompetent gemachten Zellen wird durch einem Hitzeschock
erleichtert. 500 ml einer Kultur von E.coli NM554 werden bis zu einer OD600 von 0,4 bis 0,55
unter Schütteln bei 37°C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Die Zellen werden 10
Minuten bei 4°C mit 2000 U/min pelletiert (J2HS-Zentrifuge, JA 10-Rotor), in 30 ml
eisgekühltem TFB-I-Puffer resuspendiert und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen
werden erneut 10 Minuten bei 2000 U/min bei 4°C pelletiert und in 4 ml TFB-II-Puffer
aufgenommen. Die kompetenten Zellen werden in Aliquots zu 50 µl bei –80°C gelagert.
II.2.1.2
Transformation von Bakterien
Unter dem Begriff Transformation versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in Zellen.
Die Methoden der Elektroporation und der Transformation durch einen Hitze-schock werden
sowohl für Bakterien als auch für Hefen verwendet.
Transformation von E.coli: Durch einen kurzzeitigen Hitzeschock nach vorheriger Kühlung
wird die Aufnahme von DNA durch chemokompetent gemachte Bakterien erleichtert. Alle
verwendeten Plasmide exprimieren als positiven Selektionsfaktor die Lactamase, so daß
transformierte Klone über LBamp-Medium selektioniert werden können. Zu 50 µl
chemokompetenten Bakterien werden 0,1 bis 1 µg DNA gegeben. Der Ansatz wird 20
Minuten auf Eis inkubiert. Es folgt ein Hitzeschock über 2 Minuten bei 42 °C und eine
Inkubation über 10 Minuten auf Eis. Die Zellen werden auf LBamp-Platten ausplattiert und
bei 37°C inkubiert.
23
II.2.1.3
Amplifikation von Plasmid-DNA und Plasmid Maxi Präparation
150mL LBamp-Medium werden mit ein bis zwei Kolonien transformierter E. coli beimpft
und übernacht bei 37°C und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Die Zellen werden nach
12-16h durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 6000g in 4°C geerntet und danach in 10mL
Puffer P1 resuspendiert. Anschließend wird 10mL Puffer P2 dazu gegeben, vorsichtig durch
mehrmaliges Schwenken gemischt und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert. Danach
wird 10mL kalter Puffer P3 hinzugegeben, vorsichtig durch Schwenken gemischt und für 20
Minuten auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation bei 20.000g oder mehr für 30 Minuten bei
4°C erhält man den die Plasmid-DNA enthaltenden Überstand, der sofort abgegossen werden
muß. Jetzt folgt ein weiterer Zentrifugationschritt bei den selben Bedingungen wie voher für
15 Minuten, um auch Reste zellulärer Bestandteile vollständig zu entfernen. Nun folgt die
Isolierung der Plasmid-DNA mit Hilfe einer Adsorptionssäule, entsprechend des
Herstellerprotokolles (Qiagen). Kurz beschrieben wird dabei die Plasmid-DNA an eine
spezifisch DNA bindende Säule gebunden, gewaschen und weitgehend frei von
Verunreinigungen von der Säule eluiert. Danach wird die DNA in Ethanol gefällt, vorsichtig
getrocknet und dann die Konzentration und Ausbeute der präparierten DNA durch Messung
der Absorption einer verdünnten Lösung bei 260nm (A260) bestimmt (1 A260-Einheit
entspricht 50 ug/mL Plasmid-DNA). Die Reinheit der DNA-Lösung wurde anhand des
Quotienten der Absorption bei 260nm und 280nm (A260/A280) ermittelt.
II.2.1.4
Spaltung von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
Um das gewünschte Sonden-DNA-Fragment (full-length-FHL2-cDNA) zu erhalten, mußte
diese aus der Plasmid-DNA mittels einer für die entsprechenden Schnittstellen spezifischen
Restriktionsendonuklease EcoRI ausgeschnitten werden. Hierzu wurden 20ug Plasmid-DNA
und 25 Units EcoRI in vom Hersteller empfohlenen Puffer für 2h bei 37°C inkubiert.
II.2.1.5
DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt durch horizontale Gelelektrophorese. Die
Agarosekonzentration beträgt je nach Größe der zu trennenden Fragmente zwischen 0,4 und
2% (w/v). Die entsprechende Agarosemenge wird in 1x TAE-Puffer aufgekocht und in eine
Gelkammer gegossen. Das fertige Gel wird in der Elektrophoresekammer mit 1xTAE-Puffer
überschichtet. Zur Größenabschätzung der aufgetrennten DNA-Fragmente wird ein
24
Längenstandard (1 kb-Leiter, Gibco) verwendet. Die Elektrophorese wird mit 2 bis 10 Volt
pro cm Elektrodenabstand durchgeführt. Anschließend wird das Gel für 10 Minuten in einem
Ethidiumbromidbad (10 µg/ml) gefärbt und unter UV-Licht photographiert.
II.2.1.6
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
Es wird der GeneClean II ®- Kit verwendet. Das Prinzip der Reinigung besteht in der
Adsorption von DNA an eine Quarzmatrix in Gegenwart eines chaotropen Salzgemisches.
Die Glasmatrix mit gebundener DNA wird pelletiert, gewaschen und die DNA in ddH2O
eluiert. Die DNA-Fragmente werden zunächst durch Agarose-Gelelektrophorese in einem
präparativen Gel aufgetrennt (s. dort). Die gewünschte Bande wird unter UV-Licht (366 nm)
in
einem
möglichst
geringen
Volumen
aus
dem
Ethidiumbromid-gefärbten
Gel
ausgeschnitten, und das Gelstück in einem dreifachen Volumen einer 6M NaI-Lösung bei 50
°C gelöst. Es werden 8-10 µl der als Glasmilch bezeichneten Quarzsuspension pro 10 µg
DNA zugesetzt. Zur Adsorption der DNA an die Glasmilch werden die Ansätze 5 Minuten
auf Eis inkubiert. Der Ansatz wird 5 sec bei 14000 U/min zentrifugiert, der Überstand wird
entfernt und das Pellet aus Glasmilch und adsorbierter DNA mit 500 µl NewWash™-Puffer,
einer hochmolaren ethanolischen Salzlösung, gewaschen und erneut 5 sec pelletiert. Der
Waschschritt wird insgesamt zweimal wiederholt. Das Pellet wird in 15 µl ddH2O
aufgenommen, und die DNA durch Inkubation über 5 Minuten bei 55°C eluiert. Die
Quarzsuspension wird 10 sec bei 14000 U/min pelletiert und der DNA-haltige Überstand
abgenommen. Der Elutionsschritt wird wiederholt und das zweite Eluat mit dem ersten
vereinigt.
II.2.1.7
Radioaktive Markierung von cDNA (Labeling)
Die jeweilige cDNA (Sonde) wurde mittels Random Priming und Klenow-DNA-Polymerase
unter Verwendung des StripEZ DNA Kits (AMS Biotechnologie) nach Herstellervorschrift
radioaktiv mit Phosphor-32 markiert. Das Prinzip basiert auf einer de-novo Synthese von
DNA entlang einzelsträngiger Matrizen-DNA durch die DNA-Polymerase („KlenowEnzym“). Dabei wird radioaktives dATP in die de-novo-synthetisierte DNA eingebaut. Die
Besonderheit des StripEZ-Kits besteht zusätzlich in einem Einbau chemisch spaltbarer
dNTPs, welche es erlauben, zum Schmelzen der RNA / Sonden-cDNA-Doppelstränge eine
niedrigere Temperatur (60°C) als üblich (95°C) zu verwenden. Dies ist gut für die Erhaltung
der RNA-Qualität und der Nylonmembran bei wiederholten Hybridisierungen.
25
II.2.2
Arbeiten mit Nukleinsäuren (RNA)
II.2.2.1
Isolation von RNA aus Geweben
Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Myokardgewebe wurde die überarbeitete Methode der
Phenol-Chloroform-Extraktion nach Herstellerprotokoll (RNAzol-B, AMS Biotechnology,
Frankfurt)
angewendet:
50-100mg
tiefgefrorenen
Gewebes
wurden
mit
einem
Homogenisator/Polytron in 2 ml RNAzol-B 1 Minute im Eisbad gekühlt homogenisiert, das
Homogenat sofort auf Eis gelagert. Zum Homogenat wurden je 200 µl Chloroform gegeben,
15sec von Hand geschüttelt, 5 Minuten auf Eis inkubiert und danach bei 4° C, 14000 U/min 1
Minute zentrifugiert. Die oberste (wäßrige) Phase (ca. 1 ml) wurde nochmals mit 1 ml
RNAzol-B gemischt und 200 µl Chloroform zugegeben und der Zentrifugierschritt
wiederholt. Jetzt wurde die oberste Phase (ca. 1,5 ml) in zwei Portionen mit 600 µl und eine
mit 100 µl in neue Eppendorf-Röhrchen überführt und die Gesamt-RNA mit einer gleich
großen Menge Isopropanol bei –80° C übernacht gefällt. Die gefällte Gesamt-RNA wurde bei
4° C, 14000 U/min 30 Minuten abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit 70%
Ethanol gewaschen und bei 4° C, 8000 U/min 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend der
überstehende 70% Ethanol vollständig verworfen. Das so entstandene Pellet wurde sofort,
ohne auszutrocknen, in RNA-Ladepuffer gelöst. RNA, die nicht sofort analysiert wurde,
wurde als Isopropanolfällung bei –80° C gelagert. Pellets aus 100 µl wäßriger Phase wurden
ebenso gewaschen, anschließend das noch verbleibende Ethanol restlos verdunstet und das
Pellet in DEPC-behandeltem Wasser gelöst und die UV-Absorption bei 260 bzw. 280 nm
gemessen.
II.2.2.2
Agarose-Gelelektrophorese von RNA und UVPhotodokumentation
Die in RNA-Ladepuffer gelöste RNA wurde bei 55°C 10 Minuten. denaturiert, mit
Ethidiumbromid
versetzt
und
auf
Formaldehyd-Agarosegele
(1%
Agarose,
2,2M
Formaldehyd, 0,4M MOPS, 0,1M Natriumacetat, 0,01M EDTA) geladen. Die Laufzeit der
Gele betrug ca. 2,5h bei 90-100V, nach ca. 20 Minuten wurde der Formaldehyd-Laufpuffer
durch frischen Laufpuffer ersetzt. Die Gele wurden anschließend unter UV-Licht
photographiert, wobei in jedem Fall scharfe Banden für 18S (1,9kb) und 28S (4,7kb)
ribosomale RNA dokumentiert wurden, um eine Degradation der RNA auszuschließen.
26
II.2.2.3
Transfer von RNA aus Agarose-Gelen auf Membranen (Northern
Blotting)
Die oben beschrieben RNA-Agarose-Gele wurden 3 x 10 Minuten in DEPC-behandeltem
Wasser
gewaschen
und
anschließend
die
RNA
mittels
des
Turboblotters
auf
Nylonmembranen (Nytran 0,2, Schleicher&Schuell, 0,2 µm Porenweite) nach dem Prinzip
des Kapillarblots mittels 20-fach SSC als Laufmittel übertragen. Laufzeit mindestens 3h bis
zu 10h. Die RNA wurde mittels UV-Lichts auf der Membran fixiert (UV-Stratalinker) und die
Blots bis zur weiteren Analyse bei –20° C gelagert.
II.2.2.4
Hybridisierung
von
RNA-Nylonmembranen
mit
radioaktiv
markierten cDNA-Sonden
Northern Blot Membranen wurden in 7 ml Hybridisierungslösung (ExpressHyb, Fa.
ClonTech) 30 Minuten bei 68° C inkubiert, anschließend die Lösung durch neue 7 ml
Hybridisierungslösung ersetzt, die die jeweilige, radioaktiv markierte cDNA Sonde enthielt
und weitere 60 Minuten bei 68° C inkubiert. Danach wurde der Blot je 2 x 15 Minuten in 2fach SSC, 0,05% SDS bei Raumtemperatur, danach 2 x 20 Minuten in 0,1-fach SSC, 0,1%
SDS bei 50° C gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Blots sofort in haushaltsübliche
Frischhaltefolie eingepackt und entweder auf Photomaterial bei –80° C oder auf Fujix
Bas1000 Imaging Plates bei Raumtemperatur für 2-48h exponiert.
II.2.2.5
Quantifizierung der Northern Blot-Analysen
Die quantitative Messung der RNA-Signale abzüglich des jeweiligen, unspezifischen
Hintergrundsignals wurde mittels eines Fujix Bas1000 PhosphoImagers (Fa. Fuji Photofilm)
durchgeführt. Zur Analyse wurde der Quotient aus gemessenem Signal für FHL2 und für
GAPDH verwendet. Als Größenmaßstab für die RNA-Signale wurden die Banden für
ribosomale 18S bzw. 28S RNA verwendet, die eine Länge von 1,9 kb bzw. 4,7 kb haben. Die
Blots wurden sowohl auf Photomaterial bei –80° C (Kodak Xomat-Film) als auch auf Fujix
BAS 1000 Imaging Plates (Fa. Fuji Photofilm) bei Raumtemperatur exponiert, welche mittels
eines Phosphor-32-Scanners (Fujix BAS 1000, Fuji Photofilm) computerunterstützt im
linearen Bereich quantitativ analysiert wurden. Mittels verschiedener Kontroll-RNAs, die
jeweils auf mehrere Blots parallel aufgetragen wurden, wurde die Reproduzierbarkeit der
Methode dokumentiert und eine Möglichkeit geschaffen, Signale verschiedener Northern
Blots direkt miteinander in Beziehung setzen zu können.
27
Nur bei einem Northern Blot ergaben sich trotz dieses Verfahrens diskrepante Werte für
einige Patienten, die noch auf anderen Blot analysiert worden waren (vgl. mit *-markierte
Meßwerte in Datentabelle im Anhang). Bei den durchgeführten Analysen, wurden jedoch alle
gemessenen Werte einbezogen.
Das Entfernen der Sonden von den Blots geschah durch 2 x 10 Minuten Inkubation in “Probe
Degradation Solution”
bei 68° C und nachfolgend 10 Minuten Inkubation in “Blot
Reconstitution Buffer” (StripEZ DNA Kit, Fa. AMS Biotechnologie). Mehr als 90% der
hybridisierten cDNA Sonde wurden nach dieser Methode abgewaschen. Gewaschene Blots
wurden für 10h auf Fujix Bas1000 Imaging Plates exponiert und so der Erfolg der Methode
in jedem Einzelfall kontrolliert und gegebenenfalls der Waschschritt wiederholt bis auch
nach mehr als 10h Exposition auf der Imaging Plate kein relevantes Signal mehr meßbar war.
II.2.3
Arbeiten mit Zellkulturen
II.2.3.1
Allgemeines
Zellkulturen wurden nur in einem ausschließlich für Zellkulturarbeiten reservierten Raum in
einer Sterilwerkbank (Variolab Mobilien W 90, Firma Waldner) ausgeführt. Die Zellen
wurden in den angegebenen Medien in 10 bzw. 6 cm Zellkulturschälchen (Greiner) in
Begasungsinkubatoren bei 37°C und einer mit 5% Kohlendioxid angereicherten
Raumluftathmosphäre kultiviert. Sobald die Zellen konfluierend wuchsen, wurden sie etwa im
Verhältnis 1:3-5 subkultiviert. Hierzu wurde das Medium abgesaugt und die Platte mit einer
Trypsin/EDTA-Lösung (0,25% Trypsin; 0,04% EDTA in PBS-Puffer) kurz gewaschen und
danach mit 2 mL Trypsin/EDTA pro 10cm Schälchen für etwa 5 Minuten bei 37°C inkubiert,
danach die gelösten Zellen in Medium vereinzelt und in neuem Medium neu ausplattiert. Das
Medium wurde alle 24h gewechselt.
II.2.3.2
Transiente Transfektion von Säugerzellen
Unter Transfektion versteht man das Einschleusen von Fremd-DNA in (eukaryote) Zellen.
Die Zellen werden mit einem Reporterplasmid und einem Expressionsplasmid für einen
Transkriptionsfaktor kotransfiziert, welcher an DNA-Bindestellen im Promotorbereich des
Reporterplasmids bindet und die Transkription des Reporters verstärkend oder hemmend
beeinflußt. Es gibt verschiedene Techniken DNA, aber auch RNA oder Proteine, in lebende
Zellen einzuschleusen., u.a. über Kalzium-Phosphat oder andere bivalente Kationen,
Liposomen, Retroviren, Mikroinjektion oder Elektroporation. Über transiente Transfektionen
28
werden Protein-DNA- oder Protein-Protein-Interaktionen in vivo untersucht. In allen
Transfektionen wurde als Reporter ein Expressionsplasmid für Luciferase verwendet. Die
Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin unter Emission von Lichtquanten der
Wellenlänge 526 nm. Die meßbare Ausbeute an Lichtquanten ist in Abhängigkeit vom
verwendeten Promotor proportional zu der transkriptionellen Aktivität des transfizierten
Expressionsplasmides.
Da
das
Reporterplasmid
von
den
basalen,
zelleigenen
Transkriptionsfaktoren beeinflußt wird, wird bei jeder Transfektion der Basalwert als
Abgleich ermittelt, der durch Transfektion des verwendeten, leeren Expressionsvektors
bewirkt wird, und die erhaltenen Ergebnisse werden in Relation dazu ausgewertet.
Die Transfektion von HL-1-Zellen erfolgt mittels eines Lipid-Transfektionssystems, Effectene
(Qiagen, Hilden), welches hochkondensierte DNA in Effectene-Micellen einschließt, die dann
von den zu transfizierenden Zellen endozytotisch aufgenommen werden. 1 x 105 Zellen
werden pro Loch einer 24 Loch-Platte in 0,5 ml Medium gleichmäßig ausplattiert. Die Zellen
werden 18 bis 24 Stunden bei 37° C und 5% CO2 kultiviert, das Medium gewechselt und die
Zellen dann transfiziert und nach weiteren 24h
geerntet und
analysiert. Eine
Standardtransfektion mittels Effectene setzt sich zusammen aus:
250 ng Reporter-Plasmid pG5E1bluc
ca. 10 – 100 ng des Expressionsvektors
ad 500 ng DNA mittels pUC 18 DNA
5 µl Effectene (Qiagen)
2 µl Enhancer (Qiagen)
ad 67 µl Volumen mit Buffer EC (Qiagen)
Mit dem Ansatz werden jeweils Doppelwerte bestimmt. Je Loch der 24-Loch-Zellkulturplatte
werden 30 µl des Ansatzes verwendet. Der Ansatz wird nach Herstellerprotokoll hergestellt
und vor der Transfektion das Medium (nach 24h) einmal gewechselt. Der Transfektionsansatz
mit dem frischen Zellkulturmedium wird 24h auf den Zellen belassen und die Zellen 24
Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, damit die Proteine der transfizierten
Expressionsplasmide exprimiert werden und die Transkription des Reporters beeinflussen
können. Die Zellen werden lysiert und die Luciferaseaktivität wird durch Messung der
emittierten Lichtquanten bestimmt.
Die Transfektion von CV-1-Zellen erfogte mittels DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]N,N,N-trimethylammonium methylsulfat; Boehringer Mannheim). Das kationische Lipid
DOTAP formt in wäßriger Lösung unilamellare Vesikel, sog. Liposomen. Diese bilden mit
29
der negativ geladenen DNA spontan stabile Komplexe. Diese Komplexe verschmelzen
spontan mit den Zellmembranen und die DNA gelangt in das Zytoplasma. 0,5 x 105 CV-1
Zellen werden pro Loch einer 12 Loch-Platte in 1,0 ml Medium gleichmäßig ausplattiert. Eine
Standardtransfektion mittels DOTAP setzt sich zusammen aus:
1 µg Reporter-Plasmid pG5E1bluc
20 ng des Expressionsvektors
2 µg pUC 18
18 µl DOTAP (1mg/ml, Boehringer)
42 µl HEPES-KOH (20 mM pH 7,4)
Mit dem Ansatz werden ebenfalls Doppelwerte bestimmt, und je der halbe Ansatz (40µl )
wird in ein Loch der 12-Loch-Platte gegeben. Der Ansatz wird nach Herstellerprotokoll
hergestellt, da DOTAP sehr leicht oxidiert werden kann, wird es aber immer erst direkt vor
der Transfektion dazugegeben. Die Zellen werden 18 bis 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2
kultiviert, das Medium wird vor der Transfektion mit DOTAP nicht gewechselt, die Zellen
transfiziert, nach 6h mit PBS gewaschen und mit neuem Medium versorgt. Geerntet werden
diese CV-1 Zellen nach weiteren 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO2.
II.2.3.3
Bestimmung der Luciferase-Aktivität
Das Medium wird abgesaugt und die Zellen werden mit PBS gewaschen. In jedes Loch
werden 50 µl Lyse- und Reporter-Puffer (Promega) gegeben. Die Ansätze werden 10 Minuten
bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, damit die Zellmembranen zerstört werden.
Noch anhaftende Zellen werden mit einem Silikon-Zellschaber von der Unterlage abgelöst,
und der Ansatz wird in Eppendorf-Reaktionsröhrchen überführt. Die unlöslichen Zelltrümmer
werden 2 Minuten bei 13000 U/min pelletiert, und der Überstand wird für die Bestimmung
der Luciferase-Aktivität verwendet.
Die Luciferase-Aktivität wird in einem Dynatech-Luminometer ML3000 bestimmt. Je 10 µl
des Zellaufschlusses werden mit 40 µl Luciferase-Puffer versetzt, und die Quantenemission
wird über einen Zeitraum von 10 sec integriert. Mit dem Zellaufschluß wird zusätzlich eine
Bestimmung der Proteinkonzentration durchgeführt, um Ungenauigkeiten bei
der
Aufarbeitung der Zellysate zu detektieren. Diese Werte werden mit den Ergebnissen des
Luciferase-Tests abgeglichen, um die Quantenausbeute in Abhängigkeit von der vorhandenen
Zellmenge zu bestimmen.
30
II.2.4
Statistische Auswertung
Die Daten der quantitativen Northern Blot Analyse wurden als Mittelwerte +/Standardabweichung dargestellt. In Abbildung 4 sind zur Veranschaulichung der Streuung der
Werte die Daten als Boxplot mit Median und 25 bzw. 75% Intervall dargestellt. Die
Normalverteilung der Daten wurde mit dem t-Test untersucht. Da die Daten nicht
normalverteilt waren, erfolgten Vergleiche zwischen verschiedenen Myokardgruppen (vgl.
Abbildung 3) mittels Varianzanalyse und dem Kruskal-Wallis Test für Ränge. Die
Korrelation zwischen zwei Variablen (vgl. Abbildungen 7 und 8) erfolgte mittels der Pearson
Produkt Moment Korrelation. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 wurde als
statistisch signifikant angesehen.
31
III.
ERGEBNISSE
III.1
Klinische Patientendaten
Insgesamt wurde RNA von Myokardproben von 15 terminal herzinsuffizienten Patienten (115), klassifiziert nach der New York Heart Association (NYHA) Grad III-IV, drei neonatalen
Patienten
(16-18)
analysiert.
Die
bei
den
Paienten
1-15
im
Rahmen
von
Herzkatheteruntersuchungen gemessenen objektiven Parameter erfüllen die Kriterien der
höchstgradigen Herzinsuffizienz NYHA III-IV. Die drei wichtigsten objektiven Parameter zur
Beurteilung des Zustandes eines Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz sind (1) der
Herzindex (CI). Der Herzindex beschreibt das Herzminutenutenvolumen pro m2
Körperoberfläche,
dessen
unterer
Normgrenzwert
2,5
l/min/m2
beträgt.
(2)
Die
Ejektionsfraktion (EF) beschreibt die Größe des Anteils des aus dem Ventrikel ausgeworfenen
Blutvolumens in Bezug auf das enddiastolische Ventrikelvolumen. Dieser Anteil liegt
physiologischerweise bei 66 +/- 6 %, unterhalb von 30 % liegt ein schweres Pumpversagen
des Herzens vor. (3) Der pulmonale Kapillarverschlußdruck (PCWP) ist ein indirektes Maß
für den Druck im linken Atrium und damit ein weiterer Indikator für die Auswurfleistung des
linken Ventrikels. Die Parameter sind in Tabelle 2, soweit verfügbar, aufgeführt und die
Durchschnittswerte in Abbildung 1 mit den jeweiligen Normparametern in Beziehung gesetzt
(Gross et al., 1994). Die linksventrikuläre EF betrug durchschnittlich 26,5%. Die untere
Normgrenze des CI mit durchschnittlich 1,98 l/min/m2 deutlich unterschritten. Der PCWP ist
mit durchschnittlich 24,1 mmHg erhöht.
>2,5
1,98
24,1
66 +/- 6
26,5
Cardiac
Index
(l/min/m2)
Ejektionsfraktion
(%)
<14
PCWP
(mmHg)
Abbildung 1. Vergleich der Patientendaten (1-15) mit Normalwerten für CI, EF, PCWP .
Darstellung der arithmetischen Mittelwerte +/- Standardabweichung (SD) des Herzindex (Cardiac Index), der
Ejektionsfraktion und des pulmonalen Kapillarverschlußdrucks (PCWP) in Beziehung zu den jeweiligen, der Literatur
entnommenen Normwerte (daher keine Angabe der SD). Normwerte sind hellgrau, Patientendaten dunkel dargestellt.
32
Das durchschnittliche Alter der herzinsuffizienten Patienten (1-15) beträgt 56,2 (18-78) Jahre,
die parallel analysierte RNA der Kontrollgruppe, welche von der Fa. ClonTech erworben
wurde, entstammt nicht herzinsuffizienten Unfallopfern im Alter von 19 bis 50 Jahren.
Nähere klinische Informationen waren von Fa. ClonTech nicht erhältlich. Daher wurde, wie in
Kap. III.2.2 beschrieben, die BNP mRNA-Expression als Marker Ventrikelmyokardspezifischer Belastung untersucht.
Patient
Alter
CI
PCWP
Nr.
Diagnose
Geschl.
1
DCM
m
69
2
DCM
m
64
3
DCM
w
18
1,96
26
nv
ACE, DIU, DIG, KAT, AAR
4
DCM
m
71
2,53
15
28
ATR, DIG, AAR
5
DCM
w
59
1,48
22
nv
KAT
6
DCM
m
53
2,49
8
nv
ACE, DIU, AAR
7
DCM
m
67
1,11
28
22
ACE, DIG, DIU, BET, KAT
8
DCM
m
48
2,88
15
25
ACE, DIG, AAR, ASS, Assist
9
DCM
m
58
1,17
37
29
ACE, DIU, DIG, AAR
10
DCM
m
55
nv
nv
nv
DIU, Assist
11
DCM
m
40
1,22
34
27
ACE, BET, AAR
12
DCM
m
78
nv
nv
nv
nv
13
KHK
w
68
1,85
34
nv
DIU, DIG, VDL, AAR
14
KHK
m
34
2,10
nv
30
DIU, KAT
15
KHK
w
62
2,56
30
21
DIU, DIG, VDL, ASS
w (n=4)
m (n=11)
w 51,7
m 57,9
w 1,96
m 2,01
w 28
m 21,6
w nv
m 27,3
Mittel
-werte
(Jahre) (l/min/m2) (mmHg)
LVEF
2,60
nv
%
Medikation
30
ACE, DIU, AAR
DIU
16 (x)
nv
w
7 Mon.
nv
nv
nv
nv
17 (x)
VSD
w
8 Wo.
3,4
nv
nv
nv
18 (y)
DCM
w
4 Mon.
3,0
nv
20
nv
Tabelle 2. Klinische Charakteristika von Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz
CI, Herzindex (Cardiac Index); PCWP, pulmonaler Kapillarverschlußdruck; LVEF, links-ventrikuläre Ejektionsfraktion; RV,
rechter Ventrikel; PA, Pulmonalarterie; AO, Aorta; LA, linkes Atrium; DCM, dilatative Kardiomyopathie; ICM, ischämische
Kardiomyopathie; nv, Daten nicht verfügbar; (x), neonatale, nicht-insuffiziente Patienten; (y) neonatale, terminalinsuffiziente Patientin mit DCM, die transplantiert wurde; Medikamente: AAR, Antiarrhythmika; ACE, AngiotensinConverting-Enzymhemmer;
ASS,
Acetylsalizylsäure;
ATR,
Angiotensin
II-Rezeptorantagonisten;
BET,
Betarezeptorenantagonisten; DIG, Digitalis; DIU, Diuretika; KAT, Katecholamine; VDL, Vasodilatatoren/Nitrate; Assist,
mechanische, herzentlastende Unterstützungspumpe, die zur Überbrückung der Wartezeit bis zur Herztransplantation
eingesetzt wird (z.B. ThoraTec). Mittelwerte wurden nur berechnet, wenn von mehr als drei Patienten Daten vorlagen.
(*)bei diesem Patienten lagen invasiv gemessene Druckwerte vor (systolischer Druck/ diastolischer Druck/ Mitteldruck in
mmHg): RV 73/11/32; PA 75/32/48; AO 71/39/53; LA nv/nv/14.
33
III.2 Untersuchungen der FHL2 mRNA Expression
III.2.1
FHL2 mRNA-Expression in insuffizientem Myokard
Um die Bedeutung des LIM-only Proteins FHL2 im Herz zu untersuchen, wurden Northern
Blot Analysen der FHL2-mRNA Expression in menschlichem Myokardproben, sowohl
Ventrikel als auch Vorhöfe, von insgesamt 18 Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz
untersucht. In Abbildung 2 ist parallel die mRNA-Expression von FHL2 und β-Aktin,
welches ein spezifischer Marker für quergestreifte und Herzmuskulatur ist, dargestellt. Die
Abbildung zeigt einen Northern Blot, auf dem exemplarisch RNA-Proben von drei Patienten
mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) aufgetragen wurden, jeweils linker und rechter
Ventrikel und linker und rechter Vorhof (Patient 8 nur rechter Vorhof), und als Kontrolle
Gesamtherz-RNA (mutmaßlich Ventrikel und Vorhöfe von n=10 Patienten gepoolt) von
nicht-insuffizienten Patienten (K).
Abbildung 2. Northern Blot Analyse der regionalen mRNA-Expression von FHL2, β -Aktin und GAPDH im
menschlichen Myokard.
LV, linker Ventrikel; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechtes Atrium; K/Kontrolle, als Kontrollgruppe
untersuchte RNA von Patienten ohne klinische Herzinsuffizienz. Auf diesem Northern Blot (Northern Blot 10) sind die
Patienten 6-8 jeweils getrennt nach Vorhöfen und Ventrikeln untersucht worden.
34
Es zeigen sich keine wesentlichen Unterschiede in der GAPDH Expression zwischen den
Patienten 6-8. Eine Ausnahme bildet der rechte Vorhof des Patienten 6, bei dem somit
offensichtlich eine etwas geringere Menge RNA geladen wurde. Auch β-Aktin, sowohl in
Vorhöfen als auch Ventrikeln und auch in der Kontrollprobe K, ist bis auf den rechten Vorhof
von Patient 6 deutlich exprimiert. Insgesamt finden sich keine wesentlichen Unterschiede
zwischen den verschiedenen Proben für die Expression von GAPDH, als ubiquitär
exprimiertes Protein relatives Maß der geladenen RNA Gesamtmenge, und β-Aktin. Die
Expression von FHL2-mRNA ist vorwiegend auf die Ventrikel beschränkt. In den Vorhöfen
aller untersuchten Patienten findet sich nur eine sehr viel geringere, kaum erkennbare
Expression.
100
% FHL2 (K)
80
60
40
20
0
LV
RV
LA
RA
Abbildung 3. Quantitative Analyse der regionalen mRNA-Expression von FHL2 im menschlichen Myokard.
LV, linker Ventrikel; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechtes Atrium; K/Kontrolle, als Kontrollgruppe
untersuchte RNA von Patienten ohne klinische Herzinsuffizienz. Die Grafik zeigt die Unterschiede der FHL2-mRNA
Expression zwischen Ventrikeln und Vorhöfen von insgesamt 15 NYHA III-IV Patienten (LV, n=28; RV, n=22; LA, n=7;
RA, n=8; NYHA I Kontrolle, n=10 Gesamtherz gepoolt; bei LV und RV z.T. Doppelmessungen). Die Unterschiede zwischen
den Ventrikeln gegenüber den Vorhöfen sind signifikant (p= <0,05).
Bei der quantitativen Auswertung dieser Northern Blots mit Hilfe eines PhosphoImagerSystems läßt sich die geringe Expression von FHL2-mRNA in den Vorhöfen nachweisen (vgl.
Abbildung 3). Diese liegt, bezogen auch gleiche Mengen GAPDH-Signal, im in Abbildung 3
dargestellten Verhältnis von Faktor 8,1 höher in den Ventrikeln als in den Vorhöfen der
35
untersuchten insuffizienten Patienten. Die Unterschiede der FHL2-mRNA Expression
zwischen Ventrikel (rechts/links) zu Vorhöfen waren statistisch signifikant (p <0,05). Es
finden sich aber keine signifikanten Unterschiede in der FHL2 Expression zwischen Männern
und Frauen mit terminaler Herzinsuffizienz (vgl. Abbildung 4), auch wenn der Median bei
den Männern mit 41.0% unter dem der Frauen mit 56,9% liegt. (Männer: n = 36, Frauen: n =
16, jeweils LV + RV). Dargestellt ist in Abbildung 4 der Median der FHL2 Expression, sowie
das 50% bzw. 90% Konfidenzintervall für Männer und Frauen bezogen auf die FHL2
Expression der Kontrollgruppe K (=100%).
120
% FHL2 (K)
100
80
60
40
20
0
Männer
Frauen
Abbildung 4. Vergleich der FHL2 Expression bei Männern und Frauen NYHA IV.
Die Expression der FHL2-mRNA unterscheidet sich nicht signifikant zwischen Männern und Frauen mit terminaler
Herzinsuffizienz. Dargestellt ist die Expression in Relation zur Expression in der Kontrollgruppe K (=100%). Der Median in
der Gruppe der Männer liegt mit 41,0% unter dem der Frauen mit 56,9%.
36
III.2.2
BNP-mRNA-Expression in Patienten und Kontrollen
In Northern Blot Analysen aller untersuchter Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz fand
sich eine deutlich erhöhte BNP-mRNA Expression. Die BNP-mRNA Expression war
gegenüber der Kontrollgruppe K um durchschnittlich Faktor 10,1 erhöht. Diese Erhöhung
kann als molekularbiologisches Zeichen der myokardialen Belastung des untersuchten
Myokards gedeutet werden, welche mit den vorhandenen klinischen Angaben übereinstimmt
(vgl. Tabelle 2). BNP wird physiologisch vorwiegend in ventrikulärem Myokard exprimiert
und die Expression steigt bei Belastung des Myokard stark an (Takahashi et al., 1992). In
insuffizientem atrialem Myokard war die BNP-mRNA Expression jedoch ebenfalls deutlich
höher exprimiert als in nicht-insuffizientem Myokard (Abb. 5 und 6, Pat 7). Bei den nichtinsuffizienten Patienten 16 und 17, sowie der Kontrollgruppe aus 10 erwachsenen
Unfallopfern findet sich in Übereinstimmung mit den klinischen Angaben eine nur geringe,
physiologische BNP-Expression.
Abbildung 5. mRNA-Expression von FHL2 und BNP in insuffizientem und nicht-insuffizientem menschlichen
Myokard (Northern Blot).
Dargestellt ist der Vergleich der BNP- und FHL2-mRNA-Expression in beiden Patientengruppen exemplarisch bei 6
Patienten. In der NYHA I-Gruppe findet sich nur eine geringe BNP-mRNA Expression, die als Marker kardialer Belastung
dient. In der NYHA III-IV Gruppe findet sich bei drei der exemplarisch dargestellten Patienten eine deutlich erhöhte BNPExpression, in den Ventrikeln ist die Expression z.T. links oder rechts uneinheitlich stark erhöht. Bei Patient 7 findet sich
zusätzlich eine erhöhte BNP-Expression in beiden Vorhöfen.
(*) Patient 8 leidet an einer terminalen Herzinsuffizienz NYHA IV, es findet sich aber nur eine mit den nicht-insuffizienten
Kontrollen vergleichbare BNP-mRNA Expression.
37
Abbildung 6. Quantitative Analyse der mRNA-Expression von FHL2 und BNP in insuffizientem und nichtinsuffizientem menschlichen Myokard.
Analog zur Abb. 5 ist die FHL2- und BNP-Expression bezogen auf gleiche Mengen GAPDH-Expression dargestellt, wie sie
durch die quantitative Analyse des in Abbildung 5 dargestellten Northern Blots ermittelt wurden. Die Expression in der
Kontroll-RNA (K) wurde jeweils als Maßstab verwendet. Bei FHL2 entspricht die Expression in der Kontroll-RNA 100%
FHL2-mRNA Expression, bei BNP entspricht die Expression in der KontrollRNA der einfachen BNP-mRNA Expression.
Interessanterweise wird BNP bei manchen Patienten vorzugsweise nur in einem Ventrikel
deutlich erhöht exprimiert, z.B. Patient 3, besonders im rechten Ventrikel, bzw. Patient 18 im
linken Ventrikel. Demgegenüber steht Patient 7, bei dem die Expression nicht nur in beiden
Ventrikeln deutlich erhöht war, sondern in ebenso auch in beiden Vorhöfen, was
ungewöhnlich ist, zumal die Expression in den Vorhöfen sogar höher war als in den
Ventrikeln (vgl. Abbildung 6). Bei Patient 8, der ebenfalls an terminaler Herzinsuffizienz
leidet, findet sich eine sogar unter der Kontrollgruppe liegende ventrikuläre BNP-mRNAExpression. Lediglich im rechten Vorhof findet sich eine um das 1,8-fache erhöhte BNPExpression.
38
III.2.3
FHL2 mRNA Expression ist bei NYHA IV erniedrigt
Um einschätzen zu können, ob eine Verminderung der FHL2-mRNA Expression durch eine
hypertrophiebedingte relative GAPDH Überexpression erklärt werden kann, wurde als
Kontrolle die mRNA Expression des nukleären Proteins TBP (TATA-binding protein)
untersucht. In Korrelation zur FHL2-mRNA Expression findet sich keine statistisch
signifikante Korrelation (vgl. Abbildung 7). Zwischen der Höhe der BNP-mRNA Expression
und der FHL2-mRNA Expression findet sich dagegen eine signifikante, negative Korrelation
(Abbildung 8; p=0,02; r=-0,43).
3
Abbildung 7. Korrelation zwischen FHL2- und TBP-mRNA
Expression.
Bei 30 untersuchten Proben von herzinsuffizienten Patienten
findet sich keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der
mRNA-Expression von TBP und FHL2.
TBP
2
1
0
0
20
40
60
80
100 120 140
% FHL2 (K)
16
Abbildung 8. Korrelation zwischen FHL2- und BNP-mRNA
Expression.
Die mRNA-Expression von BNP (Kontrolle K=1) korreliert
negativ mit der Expression von FHL2 (Kontrolle K=100%) (Test:
Pearson Produkt Moment Korrelation, r= -0.43, p= 0.02).
14
12
BNP
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
% FHL2 (K)
100 120 140
39
Während bei Patienten ohne Herzinsuffizienz (NYHA I, Patienten K, 16, 17) die ventrikuläre
FHL2-mRNA Expression durchschnittlich 104,6% der untersuchten, adulten Kontroll-RNA
entspricht, ist die Expression bei Patienten NYHA IV auf durchschnittlich 56,4% +/Standardabweichung von 28,9% gesunken (vgl. Abbildung 9). Wenn man die FHL2-mRNA
Expression in adultem und neonatalem Myokard separat analysiert, erhält man folgendes
Ergebnis. Wie in Abbildung 10 dargestellt, ist die FHL2-mRNA Expression in neonatalem
Myokard durchschnittlich höher als in adultem Myokard. Da ein neonataler Patient mit
terminaler Herzinsuffizienz untersucht werden konnte, ist zu erkennen, daß die bei adulten
insuffizienten Patienten nachweisbare Verringerung der FHL2-mRNA Expression gegenüber
nicht-insuffizienten Kontrollen auch in diesem untersuchten neonatalen Patient (Patient 18)
beobachtbar ist.
140
Abbildung 9. FHL2 mRNA-Expression in Myokard
NYHA I-II und DCM NYHA III-IV.
Die FHL2-mRNA Expression in nicht-insuffizientem
Myokard beträgt durchschnittlich 104,6% +/- 10,5%
Standardabweichung (SD), die Expression in
insuffizientem Myokard 56,4% +/- 28,9% SD. Hierbei
sind jeweils adulte und neonatale Patienten
zusammengefaßt.
120
% FHL2 (K)
100
80
60
40
20
0
NYHA I-II
NYHA III-IV
140
Abbildung 10. FHL2 mRNA-Expression in KontrollMyokard und DCM.
Die FHL2-mRNA Expression ist in der adulten
Patientengruppe (dunkle Balken, Pat, n=52) signifikant
niedriger als in der adulten Kontrollgruppe (K, n=10). In
der Patientengruppe wurden Meßwerte sowohl der
linken als auch rechten Ventrikel zusammengefaßt, die
teilweise doppelt analysiert wurden. Da nur 5 Proben mit
Ventrikelmyokard von drei Säuglingen/Kleinkindern
untersucht werden konnten, sind die entsprechenden
Einzelmeßwerte
dargestellt.
Diese
sind
in
Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei adulten
Patienten in den NYHA IV Proben (Punkte, Pat)
gegenüber den Kontrollen (K) erniedrigt.
120
% FHL2 (K)
100
80
60
40
20
0
K
Pat
K
Pat
40
Es lagen insgesamt 5 Proben von drei neonatalen Patienten vor (Punkte in Abb. 10, K, n=3;
Pat, n=2; Balken, K, n=10 gepoolt; Pat, n=52). Die n=52 adulten Proben (Balken)
entstammen insgesamt 15 Patienten (vgl. Tabelle 2), jeweils Proben vom rechten und linken
Ventrikel, teilweise doppelt untersucht. Es zeigt sich eine deutliche Abnahme der FHL2mRNA Expression bei terminal herzinsuffizienten Patienten gegenüber der Kontrollgruppe. In
Abbildungen 9 und 10 wurden die FHL2-mRNA Expression in der adulten Kontroll-RNA als
Maßstab genommen und die entsprechende FHL2-mRNA Expression willkürlich als 100%
betrachtet. Demgegenüber steht die Darstellung des arithmetischen Mittelwertes (+/Standardabweichung) der anteiligen FHL2-mRNA Expression der terminal herzinsuffizienten
Patienten. Eine exakte Angabe der statistische Unterschiede zwischen der adulten Kontrolle
und der Patientengruppe ist nicht möglich, da in der adulten Kontrollgruppe K zwar RNA von
10 Patienten untersucht wurde, diese aber bereits auf RNA-Ebene gepoolt wurden und somit
keine Einzelwerte in die Analyse eingehen können. Die Analyse der neonatalen Proben ergab,
wie bei den adulten Patienten, eine Abnahme der FHL2-mRNA Expression auch bei einem
neonatalen, terminal herzinsuffizienten Patienten.
41
III.3
Aktivierung von Reportergenen durch FHL2
G5E1b-LUC
Gal
Gal-FHL2
Gal-TIF2.1
Gal-Src1a
CV-1
60
60
50
50
40
30
40
30
20
20
10
10
0
0
+
+
+
+
HL-1
70
Induktion
Induktion
70
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Abbildung 11. FHL2 induziert Reportergenexpression in HL-1 und CV-1 Zellen.
Mittels eines Luciferase-Reportergenes wurde die FHL2-induzierte Genexpression in verschiedenen Zelltypen untersucht. In
der kardialen Zellinie HL-1 wurde die Reportergenexpression durch FHL2 um Faktor 4,1 gesteigert und durch die
Aktivatoren Src1a um Faktor 5,1 und TIF2.1 um Faktor 9,9. In CV-1 Zellen wurde die Reportergenexpression durch FHL2
um Faktor 33, durch TIF2.1 um Faktor 13,5 und Src1a um Faktor 11 gesteigert.
Es wurden Transfektionsexperimente in verschiedenen Zelltypen durchgeführt, um zu testen,
ob FHL2 selbst in der Lage ist, die Expression eines Zielgenes zu induzieren. In
Vorversuchen mit FHL2 war keine DNA-Bindung durch FHL2 beobachtet worden. Deshalb
wurde als Reporterplasmid G5E1b-LUC verwendet, bei dem dem Reportergen Luciferase
fünf Kopien der Gal-bindenden DNA-Sequenz und die E1b-TATA-Box als Promoter in 5’Richtung vorangestellt sind. Dadurch können Fusionsproteine, die die DNA-bindende
Domäne des Gal4-Transkriptionsfaktors enthalten, dieses Reportergen beeinflussen.
Es
wurden sowohl FHL2, als auch die bekannten Aktivatoren Src1a und TIF2.1 als GalFusionsproteine getestet (Onate et al., 1998; Voegel et al., 1996). Gegenüber der Gal4-DNA-
42
bindenden Domäne alleine fand sich in CV-1 Zellen eine 33-fache Induktion der
Reportergenexpression
durch
FHL2,
wohingegen
durch
Src1a
und
TIF2.1
die
Luciferasegenexpression 11,0- bzw. 13,5-fach induziert wurde. In HL-1 Zellen war eine 4,1fache Induktion durch FHL2 nachweisbar, die allerdings geringer ist als in CV-1 Zellen.
TIF2.1 induzierte in HL-1 Zellen die Reportergenexpression 9,9-fach und und Src1a 5,1-fach.
43
IV.
DISKUSSION
Die klinische Diagnose Herzinsuffizienz ist eine sehr häufige Erkrankung und ist prinzipiell
durch einen partiellen Funktionsverlust des Myokards (Herzmuskelgewebe) gekennzeichnet.
Dieser Verlust beruht entweder auf einem akuten, umschriebenen ischämischen Verlust des
Myokards bzw. auf einem chronischen diffusen Untergang von kardialen Myozyten oder
einer globalen kontraktilen Dysfunktion der kardialen Myozyten. Hinzu kommt das regelhafte
Auftreten einer progredienten kontraktilen Dysfunktion der zunächst noch unveränderten
Myozyten, die den Funktionsverlust der betroffenen Myozyten zu kompensieren haben. Im
Rahmen dieser Kompensationsvorgänge kommt es zu einer Hypertrophie der kardialen
Myozyten, aber auch zu weiterem Zelluntergang, z.B. auch durch Induktion von Apoptose.
Insgesamt scheint das Auftreten einer Hypertrophie der kardialen Myozyten das zentrale
Ereignis bei der Entwicklung einer Herzinsuffizienz zu sein. Dabei kommt es zu einer
veränderten Genexpression kardialer Gene, z.B. fötaler Gene wie des ANF (atrial natriuretic
factor), α-skelettales Aktin, β-MHC (myosin heavy chain) in Nagetieren und anderer Gene
wie z.B. BNP (brain natriuretic peptide) (vgl. Einleitung Kap. I.4). Es müssen aber noch eine
Reihe weiterer Veränderungen auftreten, da z.B. auch der kardiale Ca2+-Stoffwechsel
verändert ist, was wiederum für die kontraktile Dysfunktion der kardialen Myozyten
mitverantwortlich ist. Man kann also sehr komplexe Veränderungen in den hypertrophierten,
insuffizienten Myozyten beobachten, die interessanterweise nur teilweise und nur innerhalb
eines bestimmten Zeitraumes reversibel zu sein scheinen. Danach kommt es zu einer noch
unumkehrbaren Entwicklung einer terminalen Herzinsuffizienz über das Stadium der
funktionellen Anpassungshypertrophie hinaus. Das Verständnis der Hypertrophieentstehung
und der damit verbundenen Veränderungen der kardialen Genexpression und –regulation
erscheint daher von besonderem Interesse. Außerdem scheint die Beobachtung wichtig, daß
diese Veränderungen bei der Herzhypertrophie scheinbar primär nur das Herz selbst betreffen.
Es ist noch weitgehend unverstanden, wie eine solche organ- bzw. gewebespezifische
Genexpression reguliert und realisiert wird. Xu et al. (1999) schlagen gewebespezifische
Koaktivatoren bzw. Kofaktoren von Transkriptionsfaktoren als eine Möglichkeit einer
Kontrolle der gewebespezifischen Genregulation vor. Diese Frage erscheint nicht nur in
Bezug auf konkrete organbezogene Krankheitsbilder interessant, sondern insbesondere auch
in Bezug auf die Organogenese selbst. Außerdem könnte ein besseres Verständnis der
kardialen Genregulation einen zukünftigen Ansatzpunkt neuer therapeutischer Strategien
darstellen. Möglicherweise finden sich Transkriptionsfaktoren, Promotoren oder andere direkt
44
oder indirekt genregulierende Faktoren, die selbst so gewebespezifisch exprimiert werden,
daß damit eine Steuerung der nachfolgenden Genregulation eines Organes oder Gewebes auch
in therapeutischer Hinsicht möglich wäre.
IV.1
FHL2
Die Arbeitsgruppe des Freiburger Biochemikers Prof. R. Schüle, in der ich im Rahmen einer
Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. C. Holubarsch die experimentellen Arbeiten
dieser Dissertation durchführen konnte, arbeitet u.a. an der Erforschung sog. nukleärer
Hormonrezeptoren. Dieses sind im wesentlichen die Rezeptoren der Steroidhormone wie z.B.
Cortisol, Progesteron, Östrogene und Androgene. Diese Rezeptoren wirken in Verbindung
mit ihrem spezifischen Hormon als Transkriptionsfaktoren und induzieren die Expression
bestimmter Zielgene, indem sie vom Zytosol, wo sie das Hormon binden, anschließend in den
Nukleus translozieren und dort als Transkriptionsfaktor wirken. Daher kommt die
Bezeichnung „nukleäre“ Rezeptoren.
Auf der Suche nach zusätzlichen Kofaktoren des Androgenrezeptors fanden Mitarbeiter der
Arbeitsgruppe um Prof. R. Schüle ein Protein, welches mehrere LIM-Domänen enthält und,
wie sich später herausstellte, identisch ist mit dem zuvor beschriebenen Protein Slim-3,
DRAL bzw. FHL2, dessen Funktion allerdings noch unbekannt war. Da es bereits Hinweise
gab, daß FHL2 im Herz exprimiert wird (Chan et al., 1998), und außerdem bekannt ist, daß
Androgene die Hypertrophie kardialer Myozyten induzieren können (Marsh et al., 1998),
entstand die Kooperation zwischen den Arbeitsgruppen von Prof. R. Schüle und Prof. C.
Holubarsch, Kardiologie, um die Bedeutung von FHL2 im menschlichen Myokard zu
erforschen und um Hinweise auf eine mögliche pathophysiologische Rolle von FHL2 bei der
Herzhypertrophie in vivo zu erhalten. Da die bisherigen Arbeiten zu FHL2 nicht an
menschlichem Myokard durchgeführt worden waren, erschien dies besonders wichtig, um
überhaupt
einschätzen
zu
können,
pathophysiologische Bedeutung hat.
ob
FHL2
im
menschlichen
Myokard
eine
45
IV.2
FHL2-mRNA Expression
IV.2.1
Vorkommen im menschlichen Myokard
Die entscheidende Frage lautete zunächst, ob FHL2 im menschlichen insuffizienten Myokard
exprimiert wird. Diese Frage ist von Bedeutung, da es in der Genexpression durchaus
wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Spezies wie Maus und Mensch gibt, z.b. bei
den kardialen Myosin-Isoformen (vgl. Einleitung), so daß nicht automatisch von den
vorliegenden Arbeiten auf die Verhältnisse am Patienten rückgeschlossen werden konnte.
Die Northern Blot Analysen der myokardialen RNA Expression zeigen, daß FHL2-mRNA im
insuffizienten menschlichen Myokard exprimiert wird (vgl. Abbildung 2); somit muß die
weitere Bedeutung von FHL2 genauer ermittelt werden. Ergänzend wurden in der
Arbeitsgruppe Schüle weitere Northern Blot Untersuchungen durchgeführt. Analog zur Arbeit
von Chan et al. (1998) wurden kommerziell erhältliche Northern Blots verschiedener fötaler
und adulter menschlicher Gewebe auf FHL2-mRNA Expression untersucht und eine sogar
noch stärker herzspezifische mRNA-Expression von FHL2 beim Menschen festgestellt als
dies in der Arbeit von Chan et al. (1998) beschrieben war. Desweiteren wurde untersucht, ob
FHL2 auch in anderen Muskeltypen, oder nur in Herzmuskelgewebe exprimiert wird. Dazu
wurde wiederum mittels Northern Blot RNA verschiedener menschlicher Muskeltypen
untersucht und neben der bekannten kardialen Expression von FHL2 keine weitere Expression
in Muskelgewebe gefunden (Müller et al., 2000). Zusammenfassend ist gezeigt worden, daß
FHL2-mRNA im Menschen überwiegend im Herzmuskel exprimiert wird, sowohl während
der fötalen Herzentwicklung als auch in adultem Myokard. In anderen Muskeltypen war
FHL2 nicht nachweisbar. Dies ist bemerkenswert, da andere Mitglieder der Familie der im
Herz exprimierten LIM-Domänen Proteine, z.B. Slim 1, smLIM/CRP2, Cypher1/2 oder MLP
auch in Skelettmuskulatur exprimiert werden (vgl. Tabelle 1). Mittels immunhistochemischer
Methoden konnte in Mäusen von FHL2-Protein im Nukleus und im Zytosol von kardialen
Myozyten, aber auch in Epithelzellen der menschlichen Prostata nachgewiesen werden
(Müller et al., 2000).
46
IV.2.2
Lokale FHL2 Expression im menschlichen Herz
Da bei einigen Mitgliedern der im Herzen exprimierten LIM-Domänen Proteine ein
charakteristisches lokales Expressionmuster beschrieben ist, sie z.B. nur in bestimmten
Arealen des Herz-Kreislaufsystems zu bestimmten entwicklungsrelevanten Phasen exprimiert
werden (vgl. Tabelle 1), wurde von mir untersucht, wo genau im adulten, insuffizienten
Myokard FHL2-mRNA exprimiert wird. Die mir zur Verfügung stehenden Proben
menschlichen ventrikulären Myokards entstammten alle intramuralem Gewebe, d.h. es kann
keine Aussage über die endo- bzw. epikardiale Expression gemacht werden. Die atrialen
Myokardproben enthalten alle transmuralen Wandschichten. Da atriales Gewebe sehr dünn
ist, wurde auf eine Präparation einzelner Wandschichten verzichtet, um keine zusätzlichen
Präparationsartefakte der kardialen Genexpression zu riskieren.
Im menschlichen insuffizienten Myokard fand sich eine hochspezifische Expression von
FHL2-mRNA: Während in rechten und linken insuffizienten Ventrikeln eine sehr deutliche
FHL2-mRNA Expression feststellbar war, war diese in links-, wie rechts-atrialen Proben,
wenn überhaupt sichtbar, nur sehr viel geringer (Faktor 8,4) meßbar (vgl. Abbildung 3 und
Datentabelle siehe Anhang). Dieses ventrikelspezifische Expressionsmuster war sehr gut
übereinstimmend bei allen untersuchten Patienten. Insgesamt wurden 53 ventrikuläre und 17
atriale Blots untersucht, die von insgesamt 15 terminal herzinsuffizienten, und einem nichtinsuffizienten Patienten, der sich einer aortokoronaren Bypassoperation unterzog, gewonnen
worden waren. Die Zeichen einer sehr lokalisierten und organspezifischen Expression
könnten auf eine wichtige Rolle bei der Herzentwicklung, aber auch der Hypertrophie, z.B.
der Differenzierung der kardialen Vorläuferzellen, oder der Aufrechterhaltung des kardialen
Phänotyps der kardialen Myozyten hindeuten. Insbesondere, da FHL2-Protein schon während
der Kardiogenese im Myokard von Mäusen immunhistochemisch nachweisbar ist. Zu
beachten ist allerdings, daß diese entwicklungsbiologischen Daten nicht in menschlichem
Myokard gewonnen wurden, sodaß nicht automatisch auf die Verhältnisse beim Menschen
geschlossen werden kann. Die immunhistochemisch nachgewiesene, isolierte Lokalisation der
FHL2 Proteinexpression in den Epithelzellen der Prostata kann höchstwahrscheinlich in
Zusammenhang mit der funktionellen Bedeutung der Androgene für den männlichen
Urogenitaltrakt und dessen Entwicklung gebracht werden. Die genaue Bedeutung dieses
Resultates muß noch weiter untersucht werden.
Da FHL2 ein spezifischer Kofaktor des Androgenrezeptors ist, wurde von mir die Frage
bearbeitet, ob FHL2 unterschiedlich hoch im Myokard von Männern und Frauen mit
47
terminaler Herzinsuffizienz exprimiert wird. Falls dies der Fall wäre, wäre es ein gewichtiges
Argument, die allgemeine Bedeutung von FHL2 für die Herzinsuffizienz a priori in Frage zu
stellen, da in diesem Fall die Herzinsuffizienz bei Frauen nicht in gleichem Maße mit FHL2
in Zusammenhang stehen könnte wie bei Männern. Die quantitative Analyse der FHL2mRNA Expression getrennt nach dem Geschlecht der Patienten ergab allerdings keine
signifikanten Expressionsunterschiede der FHL2-mRNA, wie in Abbildung 3 dargestellt ist.
Allerdings haben Frauen normalerweise weniger zirkulierende Androgene, so daß letztlich die
genaue Rolle von FHL2 noch weiter untersucht werden muß. Möglicherweise gibt es aber
auch nicht-humorale, lokale Effekte von Androgenen im Myokard, wie sie z.B. für
Angiotensin gezeigt werden konnten (Sadoshima und Izumo, 1997).
IV.2.3
FHL2 Expression in insuffizientem Myokard
Um die Frage nach einer klinisch relevanten Rolle der bisherigen Ergebnisse über FHL2 am
menschlichen Herzen zu beantworten, wurden von mir Myokardproben von explantierten,
terminal insuffizienten Herzen untersucht und diese Ergebnisse mit denen von kardialer RNA
von nicht-insuffizienten menschlichen Herzen verglichen. Auf diese Weise sollte ein Hinweis
zu erhalten sein, ob es FHL2-mRNA Expressionsunterschiede gibt. Diese wären insbesondere
deshalb von Bedeutung, da es sich bei FHL2 um einen Kofaktoren des Androgenrezeptors
handelt und dieser nukleäre Rezeptor offenbar Einfluß auf die kardiale Genexpression nimmt.
Als nicht-insuffiziente Kontrolle wurde die Gesamt-RNA von insgesamt 12 Patienten
genommen, welche im Rahmen von Unfällen durch Traumata gestorben waren. Diese RNA
ist kommerziell erhältlich (Fa. ClonTech), nähere klinische Angaben sind außer der Angabe
des Alters und Geschlechts der verunfallten Patienten nicht verfügbar. Interessanterweise
zeigte sich in insuffizientem menschlichen Myokard eine signifikante Verminderung der
FHL2-mRNA Expression um bis zu 50% gegenüber der analysierten Kontroll-RNA, wie in
den Abbildungen 4 und 5 dargestellt ist. Die FHL2-mRNA Expression war in insuffizientem
Myokard in 53 analysierten ventrikulären Proben auf durchschnittlich 54,6 % der Expression
in der Kontroll-RNA vermindert. Insgesamt wurden 15 terminal insuffiziente Patienten
untersucht, jeweils rechter und linker Ventrikel, die z.T. doppelt analysiert wurden. Zusätzlich
lagen ventrikuläre Myokardproben von drei Säuglingen vor, von denen ein Patient (Nr. 18)
bereits im Alter von vier Monaten aufgrund einer terminalen Herzinsuffizienz bei dilatativer
Kardiomyopathie (DCM) transplantiert werden mußte. Dieses Myokard stellt somit eine
seltene Vergleichsmöglichkeit dar, die im adulten Myokard festgestellte Abnahme der FHL2-
48
mRNA bei terminaler Herzinsuffizienz auch in neonatalem Myokard zu untersuchen. Die
zwei weiteren neonatalen Ventrikelproben bestanden aus nicht-insuffizientem Myokard von
Säuglingen (Nr. 16 und 17), die aufgrund anlagebedingter, anatomischer Herzfehler ohne
Zeichen der chronischen Herzinsuffizienz oder myokardialen Hypertrophie operiert wurden.
In Abbildung 6 ist dargestellt, daß sich die in adultem insuffizientem Myokard feststellbare
Abnahme der FHL2-mRNA auch in vergleichbarer Größenordnung auf insgesamt etwas
höherem Niveau in neonatalem Myokard nachweisen läßt. Da es sich aber um nur sehr
wenige neonatale Proben handelt, ist dieses Ergebnis nicht statistisch analysierbar. Dennoch
steht es in überzeugender Übereinstimmung zu den Vorergebnissen in adultem Myokard.
Daher ist in Abbildung 6b zusammenfassend dargestellt, daß die FHL2-mRNA in
ventrikulärem, menschlichen, terminal insuffizientem Myokard gegenüber einer nichtinsuffizienten Kontrollgruppe um etwa 50% vermindert ist. In diese Analyse gingen alle
adulten und neonatalen Ventrikelmeßwerte ein, so daß die Kontrollgruppe in dieser
Darstellung etwas mehr als 100% der rein adulten Kontrollgruppe in Abbildung 6 aufweist.
In diesem Zusammenhang muß gefragt werden, ob die zu beobachtende Abnahme der FHL2mRNA Menge in insuffizientem Myokard tatsächlich auf eine quantitativ verminderte
Transkription dieses Genes oder lediglich auf eine hypertrophiebedingte Abnahme der
Gesamtzellzahl in insuffizientem Myokard zurückzuführen ist. Deshalb wurde die mRNA von
zwei weiteren Genen untersucht. Zum Einen β-Aktin, welches als Muskelstrukturprotein nur
in Skelettmuskulatur und Myokard vorkommt, zum Anderen ein rein nukleäres Protein, das
TATA-bindende Protein TBP als nukleärer Marker. TBP korreliert dabei nicht mit der
Gesamtzellmasse, sondern mit der Zahl der Zellkerne. In einer definierten Menge
hypertrophierten Myokards sind durch die Zunahme der Masse der einzelnen Myozyten
insgesamt weniger Myozyten vorhanden. Dies könnte irrtümlicherweise als eine Abnahme der
FHL2-mRNA Expression interpretiert werden. β-Aktin dient als Beweis, daß tatsächlich
kardiale Myozyten in den untersuchten Proben vorlagen, eine Kontamination mit
Skelettmuskulatur ist rein anatomisch auszuschließen.
In Abbildung 2 ist deutlich zu sehen, daß β-Aktin-mRNA in allen Proben in ähnlichem
Umfang exprimiert wird. Eine Ausnahme stellt der rechte Vorhof von Patient 6 dar, bei dem
insgesamt offensichtlich wenig RNA geladen wurde, da sowohl die GAPDH-, als auch die βAktin-mRNA Expression vermindert sind. Die TBP-mRNA Expression wurde in 30
ventrikulären Proben quantitativ untersucht und die erhobenen Daten mit der Expression von
FHL2 in Beziehung gesetzt, ohne dabei eine statistisch signifikante Korrelation nachweisen
49
zu können. Somit ergibt sich kein Anhalt, daß die Abnahme der FHL2-mRNA Expression auf
eine Verminderung der Zahl der kardialen Myozyten zurückgeführt werden kann.
Auch wenn die Abnahme der FHL2-mRNA Expression keine direkten Rückschlüsse auf die
Art der Beeinflussung der kardialen Hypertrophie und Herzinsuffizienz durch eine
verminderte Expression von FHL2 zuläßt, insbesondere da nicht klar ist, ob die beobachteten
Effekte Ursache oder Folge einer Herzinsuffizienz sind, so zeigen diese Daten dennoch, daß
es eine wichtige Verbindung zwischen der Herzinsuffizienz und der veränderten FHL2Expression gibt und dies somit von klinischem Interesse ist.
IV.3
Funktionen von FHL2
Um die Art des Einflußes von FHL2 auf den Androgenrezeptor und die kardiale
Genregulation zu erforschen, wurden zwei parallele Ansätze verfolgt. Zum Einen ist durch die
Verwendung des „Two Hybrid Screen“-Systems eine physische, funktionelle Interaktion
zwischen FHL2-Protein und Androgenrezeptor bekannt. Zum Anderen ist bekannt, daß der
Androgenrezeptor
in
hormongebundenem
Zustand
als
nukleärer
Rezeptor
transkriptionsregulierende Funktion besitzt. Somit mußte die Frage beantwortet werden, wie
die Bindung von FHL2 an den Androgenrezeptor die transkriptionelle Aktivität des
aktivierten
Androgenrezeptors
beeinflußt.
Von
mir
wurde
in
Ergänzung
dieser
Untersuchungen die Frage bearbeitet, ob FHL2 auch unabhängig vom Androgenrezeptor
transkriptionelle Eigenschaften besitzt. Dazu wurde die Wirkung von FHL2 auf die
Transkription eines Reportergenes untersucht. In Transfektionsexperimenten testete ich die
Induktion der Expression des Luciferase-Reportergenes G51b-LUC in verschiedenen
Zelltypen auf die Stimulierbarkeit durch kotransfiziertes FHL2 oder bekannte Aktivatoren der
Reportergenexpression, Src1a und TIF2.1. Diese Experimente wurden sowohl in Zellen einer
bekannten Affennierenzellinie (CV-1), als auch in der ersten verfügbaren Zellinie
immortalisierter atrialer Mauskardiomyozyten (HL-1) durchgeführt. Versuche mit von mir
hergestellten Primärkulturen ventrikulärer Mauskardiomyozyten nach einem modifizierten
Protokoll von Sadoshima und Izumo, Ann Arbor, MI, USA, scheiterten an einer zu geringen
Transfektionseffektivität. Daher wurden als kardiales Myozytenmodell HL-1 Zellen
untersucht.
In Abbildung 8 ist dargestellt, wie die Luciferaseexpression in den jeweiligen Zelltypen durch
FHL2, Src1a und TIF2.1, sowie in der entsprechenden Kontrolle induziert wird. Während die
alleinige Transfektion von Gal nur eine geringe, willkürlich als 1 bezeichnete
50
Luciferaseexpression induzierte, steigerte sich die entsprechende Luciferaseexpression durch
FHL2 in CV-1 Zellen um durchschnittlich Faktor 33 ganz erheblich, geringer auch durch die
beiden bekannten Aktivatoren dieses Reporters Src1a und TIF2.1. In HL-1 Zellen war dieser
Effekt auf wesentlich niedrigerem Niveau jedoch auch eindeutig nachweisbar. FHL2 steigerte
die Expression durchschnittlich um Faktor 4,5. Lediglich
TIF2.1 steigerte sie um
durchschnittlich Faktor 9,9 deutlicher. Der relativ große Unterschied zwischen den
beobachteten Zelltypen läßt allerdings keine Rückschlüsse auf eine verminderte Relevanz
dieses Ergebnisses in HL-1 Zellen zu, sondern entscheidend ist der eindeutige Nachweis der
Effektivität von FHL2 auf die Induktion der Luciferaseexpression. Die beobachteten
Unterschiede liegen in den jeweiligen Gegebenheiten der untersuchten Zelltypen begründet.
Diese Systeme können daher untereinander nicht quantitativ, sondern nur qualitativ
verglichen werden.
Mit diesen Experimenten konnte ich zeigen, daß das LIM-only Protein FHL2 unabhängig
vom Androgenrezeptor eine eigene Fähigkeit zur Regulation der Transkription eines Genes
hat. Damit ist sogar eine gänzlich vom Androgenrezeptor unabhängige Funktion von FHL2
z.B. im Myokard möglich. Dies macht deutlich, daß die fehlenden Unterschiede der FHL2mRNA Expression und die Unterschiede der Androgenwirkung bei Männern und Frauen
keine Rückschlüsse auf eine womöglich verminderte Bedeutung von FHL2 für weibliches
Myokard zulassen.
IV.4 Korrelation zwischen BNP und FHL2 Expression
Da über die Patienten der untersuchten Kontroll-RNA keine vollständigen klinischen
Angaben zum genauen Zustand des Myokards vorlagen und bei den terminal insuffizienten
Patienten letztlich auch keine endgültige Aussage über den wirklichen Belastungsgrad des
untersuchten Myokards gemacht werden konnte, wurde die als Marker kardialer Belastung
beschriebene „Brain-Natriuretic-Pepetide“-mRNA (BNP) in allen Patientengruppen und
Kontrollen untersucht (Nakagawa et al., 1995). BNP ist ein überwiegend in den kardialen
Ventrikeln exprimiertes, ursprünglich aus Schweinehirn isoliertes Peptidhormon mit
natriuretischer Wirkung. Außerdem hemmt es das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System.
Auf mechanische, aber auch andere allgemein schädigende Einflüsse auf das Myokard bzw.
hypertrophe Stimuli wird es in den Ventrikeln wesentlich höher exprimiert als unter
Ruhebedingungen (Nakagawa et al., 1995). Wie von der Arbeitsgruppe Holubarsch gezeigt
werden konnte, reagiert die BNP-mRNA Expression aber nicht nur auf humorale oder
51
mechanische Faktoren, sondern z.B. auch auf Energiemangel durch Hypoxie und
gleichzeitigem Glucoseentzug. Auch Angiotensin II stimuliert die BNP-mRNA Expression
(vgl. Kap. I.4).
Interessanterweise
wurden
bei
den
untersuchten
Patienten
sehr
unterschiedliche
Expressionsmuster der BNP-mRNA Expression gefunden. Es fand sich bei Patient Nr. 3 eine
im rechten Ventrikel wesentlich höhere Expression als im linken Ventrikel, umgekehrt
hingegen bei z.B. Patienten Nr. 18: Bei diesem Patienten fand sich im rechten Ventrikel
überhaupt keine, aber im linken Ventrikel eine um fast Faktor 3 erhöhte Expression.
Im Myokard eines Patienten (Nr. 7) fand sich sogar untypischerweise eine in allen vier
Herzkammern global erhöhte BNP-RNA Expression. Im rechten Vorhof wurde mit einer bis
zu Faktor 24 erhöhten BNP-mRNA Expression sogar der höchste Wert aller Patienten
gemessen. Bei den Kontrollen, der Kontroll-RNA adulter Patienten und den beiden
Säuglingspatienten Nr. 16 und 17, findet sich lediglich eine sehr geringe, basale BNP-mRNA
Expression, wie es als physiologisch beschrieben ist. Diese wurde bei quantitativen
Betrachtungen gemittelt und willkürlich als 1 festgelegt. Die festgestellten lokalen BNPmRNA Expressionsschwerpunkte könnten gut mit der tatsächlichen myokardialen
Belastungssituation des betreffenden Areals korrelieren. Leider ließ sich diese interessante
Hypothese anhand der zur Verfügung stehenden klinischen Daten nicht überprüfen.
Allerdings läßt sich schlußfolgern, daß die Induktion der BNP-mRNA Expression nicht auf
humoral-systemischen Wege reguliert sein wird, da sonst keine so deutlichen regionalen
Unterschiede der Expression zu erwarten wären, sondern eher lokal. In in vitro Experimenten
mit murinen ventrikulären Kardiomyozytenprimärkulturen konnte Sadoshima und Izumo
(1997) zeigen, daß es durch mechanische Dehnung der Myozyten ohne direkte
Zellschädigung zu einer Angiotensin II-abhängigen Induktion der BNP-mRNA Expression
kommt. Angiotensin II ist außerdem ein bekannter Induktor der kardiomyozytären
Hypertrophie. Es wird unabhängig von systemischem Angiotensin II lokal im Myokard
synthetisiert und als fertiges Hormon in intrazellulären Vesikeln gespeichert, aus welchen es
durch Dehnung der Zelle freigesetzt wird. Diese Vorarbeiten stellen daher eine mögliche
Erklärung für die beobachtete schwerpunktmäßige BNP-mRNA Expression. Dies erklärt, wie
durch selektive Angiotensin II Rezeptor Blocker wie u.a. Losartan die durch Dehnung
induzierte Induktion der kardialen BNP-Expression unterbunden werden kann. Allerdings
zeigen die o.g. Ergebnisse der Arbeitsgruppe Holubarsch auch, daß nicht nur Dehnung bzw.
Angiotensin II, sondern auch nicht mechanische Faktoren, wie Hypoxie und Glucoseentzug
neben anderen hypertrophen Stimuli die BNP-Expression induzieren können. Die
52
durchgeführten Experimente zur BNP-mRNA Expression ergänzen die klinischen Angaben
und zeigen, daß in den Kontrollproben und den nicht terminal insuffizienten Säuglingsproben
keine erhöhte BNP-Expression nachweisbar ist und somit dieser molekularbiologische Marker
einer Hypertrophieinduktion bzw. Herzinsuffizienz in den als Kontrollen verwendeten Proben
nicht nachweisbar ist. Hingegen ist in allen Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz
mindestens in einem Ventrikel eine deutlich erhöhte BNP-Expression feststellbar.
Wenn man die BNP-mRNA Expression mit der parallel untersuchten FHL2-mRNA
Expression aller untersuchter Proben korreliert, ergibt sich
interessanterweise eine
signifikante (p < 0,03) negative Korrelation ( r = - 0,43) zwischen beiden Parametern, wie in
Abbildung 7 dargestellt ist. Dies bedeutet anschaulich, eine niedrige BNP-Expression (NYHA
I-II) korreliert mit einer normal hohen FHL2-Expression (=100%) und umgekehrt. In dieser
Korrelation ist noch unberücksichtigt, daß aufgrund der z.T. inhomogenen BNP-Expression
zwischen linken und rechten Ventrikeln auch Datenpunkte in die Rechnung einflossen, die
eine einerseits niedrige BNP-, andererseits auch eine niedrige FHL2 Expression bedeuten.
Dies sind die bei den herzinsuffizienten Patienten gefundenen Ventrikel, die offenbar weniger
von der erhöhten BNP-Expression betroffen sind, aber dennoch im gesamten Herz eine
erniedrigte FHL2-Expression haben. Somit dürfte die tatsächliche Korrelation zwischen
beiden Parametern sogar noch strenger sein als hier dargestellt. Die Ursache dieser
Korrelation ist damit aber noch ungeklar. Auch ist so noch kein kausaler Zusammenhang
zwischen BNP und FHL2 beweisbar, sondern nur eine Korrelation. Auch die funktionelle
Bedeutung einer erniedrigten FHL2-mRNA Expression ist noch unbekannt. Experimente an
transgenen Tieren, die kein FHL2 exprimieren, könnten hier wichtige Hinweise geben,
insbesondere solche, in denen die FHL2 Expression erst im adulten Tier auf einen bestimmten
Stimulus hin gezielt abgeschaltet werden könnte. So könnte man beobachten, ob eine
plötzliche Erniedrigung von FHL2 zu einer kardialen Funktionsstörung führt oder andere
Effekte auf das Herz oder andere Organe hat.
53
IV.5
Fehlende
BNP
Expression
in
insuffizientem
Myokard eines Patienten
Bei der Beobachtung der BNP-mRNA Expression bei terminaler Herzinsuffizienz stellt sich
die Frage, inwieweit durch Entzug des auslösenden Stimulus auch eine Reduktion einer initial
erhöhten Expression beobachtet werden kann.
Die Analyse der BNP-mRNA Expression eines Patienten (Nr. 8) ergab einen besonders
interessanten
Befund:
obwohl
dieser
Patient
wegen
terminaler
Herzinsuffizienz
herztransplantiert werden mußte, fand sich eine deutlich unter der Kontrollgruppe liegende
BNP-mRNA Expression in beiden Ventrikeln. Es fand sich sogar im rechten Vorhof eine
höhere Expression als in den Ventrikeln, obwohl BNP als weitgehend ventrikelspezifisch
exprimiert beschrieben ist. Tatsächlich ergab die Analyse der klinischen Angaben zu diesem
Patienten,
daß
dieser
etwa
5
Monate
vor
der
Herztransplantation
mit
einer
ventrikelunterstützenden, implantierten Blutpumpe versorgt worden war, die den Ventrikel so
wirkungsvoll entlastete, daß die Wartezeit des Patienten bis zur Transplantation überlebt
werden konnte (sog. “Kunstherz”). Die im rechten Vorhof zu beobachtende höhere BNPmRNA Expression als in den Ventrikeln könnte am ehesten daran liegen, daß der rechte
Vorhof relativ weniger vom Einsatz dieser Pumpe profitieren kann als die Ventrikel. Die
Befunde dieses Patienten zeigen deutlich, daß durch eine wirkungsvolle funktionelle
Entlastung
des
terminal
geschädigten
Myokards
durch
eine
mechanische
Kreislaufunterstützung die BNP-mRNA Expression sich wieder normalisieren kann. Die
Befunde dieses Patienten unterstützen die Hypothese, daß ein terminal geschädigtes Herz
möglicherweise in der Lage ist, sich durch konsequente Entlastung von der hypertrophen
Stimulation zu erholen.
54
V.
ZUSAMMENFASSUNG
Auf der Suche nach zusätzlichen Kofaktoren des Androgenrezeptors wurde von der
Arbeitsgruppe um Prof. R. Schüle ein LIM-only Protein identifiziert, welches bisher als
FHL2/Slim3/DRAL mit unbekannter Funktion beschrieben war (Müller et al., 2000). Da
Androgene zu Myokardhypertrophie führen können (Marsh et al., 1998), bestand die Aufgabe
dieser Dissertation darin, die mögliche pathophysiologische Bedeutung von FHL2 im
menschlichen Herz zu untersuchen. Dazu wurde mittels Northern Blot die FHL2-mRNA
Expression im menschlichen insuffizienten und nicht-insuffizienten Myokard analysiert und
funktionelle Analysen zur transkriptionellen Aktivität von FHL2 in vitro durchgeführt. Dabei
wurde der Einfluß von FHL2 auf die Expression eines Androgen-unabhängigen
Reportergenes in Transfektionsexperimenten in verschiedenen Zellinien untersucht.
Es zeigte sich, daß FHL2 auch im insuffizienten menschlichen Myokard exprimiert wird.
Dabei ist die mRNA Expression fast ausschließlich in den beiden Ventrikeln feststellbar, in
beiden Vorhöfen wurden nur viel geringere Mengen FHL2-mRNA nachgewiesen.
Interessanterweise fand sich im insuffizienten neonatalen und adulten Myokard eine deutliche
Abnahme der FHL2-mRNA Expression um durchschnittlich 46,2% gegenüber nichtinsuffizientem Myokard. Diese Abnahme konnte nicht auf die Hypertrophie der
Kardiomyozyten zurückgeführt werden, wie Kontrollexperimente zeigten. Es fanden sich
keine Unterschiede der FHL2-mRNA Expression bei Frauen und Männern der 18
untersuchten Patienten. Die BNP-mRNA Expression als Marker kardialer Belastung zeigte in
insuffizientem Myokard durchschnittlich eine Erhöhung um Faktor 10 gegenüber den
Kontrollen und korrelierte signifikant negativ mit der FHL2-mRNA Expression.
In Transfektionsexperimenten konnte in CV-1 und HL-1 Zellen gezeigt werden, daß FHL2 in
der Lage ist, die Expression eines Reportergenes zu induzieren. Somit besitzt FHL2 eine
autonome transaktivierende Funktion. Da FHL2
auch im embryonalen Mausherz
nachweisbar ist, deuten zusammenfassend diese Ergebnisse auf eine wichtige Rolle von FHL2
bei der Herzentwicklung und der Entwicklung der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz hin.
Um die Genregulation bei myokardialer Hypertrophie besser zu verstehen, wird es besonders
interessant sein, Faktoren der Regulation des FHL2 Genes zu identifizieren, um zu erkennen,
ob die beobachtete Veränderung bei Herzinsuffizienz ursächlich oder Folge der veränderten
kardialen Genregulation bei Myokardhypertrophie ist. Die FHL2-Regulation könnte somit
Ziel neuer therapeutischer Strategien sein, außerdem läßt die hohe ventrikelspezifische FHL2Expression an eine Nutzung z.B. des FHL2-Promotors als Vektor neuer therapeutischer
Strategien denken.
55
VI.
LITERATUR
American
Heart
Association
(1999).
Cardiovascular
disease
statistics.
http://www.americanheart.org/Heart_and Stroke_A_Z_Guide/cvds.html.
Anversa P, Levicky V, Beghi C, McDonald SL, Kikkawa Y (1983). Morphometry of
exercise-induced right ventricular hypertrophy in the rat. Circ Res 52: 57-64.
Anversa P, Kajstura J (1998). Ventricular myocytes are not terminally differentiated in the
adult mammalian heart. Circ Res 83: 1-14.
Arber S, Halder G, Caroni P (1994). Muscle LIM protein, a novel essential regulator of
myogenesis, promotes myogenic differentiation. Cell 79: 221-231.
Arber S, Hunter JJ, Ross J, Hongo M, Sansig G, Borg J, Perriard J-C, Chien KR, Caroni P,
(1997). MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization,
dilated cardiomyopathy and heart failure. Cell 88: 393-403
Azpiazu N, Frasch M (1993). tinman and bagpipe: two homeo box genes that determine cell
fates in the dorsal meoderm of Drosophila. Genes Dev 7: 1325-1340.
Bodmer R (1995). Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.
Trends Cardiovasc Med 5: 21-28.
Bouvagnet P, Leger J, Pons F, Deschesne C, Leger JJ (1984). Fiber types and myosin types in
human atrial and ventricular myocardium: An anatomical description. Circ Res 55: 794-804.
Brown S, Biben C, Ooms LM, Maimone M, McGrath MJ, Gurung R, Harvey RP, Mitchell
CA (1999). The cardiac expression of striated muscle LIM protein 1 (Slim1) is restricted to
the outflow tract of the developing heart. J Mol Cell Cardiol 31(4): 837-43.
Bruneau BG, de Bold AJ (1994). Selective changes in natriuretic peptide and early response
gene expression in isolated rat atria following stimulation by stretch or endothelin-1.
Cardiovasc Res 28: 1519-1525.
56
Calderone A, Takahashi N, Izzo NJ, Thaik CM, Colucci WS (1995). Pressure- and volumeinduced left ventricular hypertrophies are associated with distinct myocyte phenotypes and
differential induction of peptide growth factor mRNAs. Circulation 92: 2385-2390.
Chan KK, Tsui SKW, Lee SMY, Luk SCW, Liew CC, Fung KP, Waye MMY, Lee CY
(1998). Molecular cloning and characterization of FHL2, a novel LIM domain protein
preferentially expressed in human heart. Gene 210: 345-350.
Cittadini A, Strömer H, Katz SE, Clark R, Moses AC, Morgan JP, Douglas PS (1996).
Differential cardiac effects of growth hormone and insulin-like growth factor-1 in the rat.
Circulation 93: 800-809.
Claycomb WC, Lanson NA Jr, Stallworth BS, Egeland DB, Delcarpio JB, Bahinski A, Izzo
NJ Jr (1998). HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic
characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci USA (95): 2979-2984.
Cooper S (1997). G1 and S phase gene expression cannot be analyzed in mammalian cells
synchronized by inhibition. Microb Comp Genomics 2(4):269-273.
Cserjesi P, Brown D, Lyons GE, Olson EN (1995). Expression of the novel basic helix-loophelix gene eHAND in neural crest derivatives and extraembryonic membranes during mouse
development. Dev Biol 170: 664-678.
Dawid IB, Toyama R, Taira M (1994). LIM domain proteins. C R Acad Sci 318: 295-306.
Dawid I, Breen J, Toyama R (1998). LIM domains: multiple roles as adapters and functional
modifiers in protein interactions. Trends Genet 14(4): 156-162.
Feuerstein R, Wang X, Song D, Cooke NE, Liebhaber SA (1994). The LIM/double zincfinger motif functions as aprotein dimerization domain. Proc Natl Acad Sci 91: 10655-10659.
Flink IL, Morkin E (1990). Interaction of thyroid hormone receptors with strong and weak
cis-acting elements in the human α-myosin heavy chain gene promoter. J Biol Chem 265:
11233-11237.
57
Flink IL, Edwards JG, Bahl JJ, Liew CC, Sole M, Morkin E (1992). Characterization of a
strong positive cis-acting element of the human β-myosin heavy chain gene in fetal rat heart
cells. J Biol Chem 267: 9917-9924.
Flint A (1870). Diseases of the Heart. Lea HC (Hrsg.). 2. Aufl., Philadelphia, Seite 33ff.
Frangiskakis JM, Ewart AK, Morris CA, Mervis CB, Bertrand J, Robinson BF, Klein BP,
Ensing GJ, Everett LA, Green ED, Proschel C, Gutowski NJ, Noble M, Atkinson DL,
Odelberg SJ, Keating MT (1996). LIM-kinase1 hemizygosity implicated in impaired
visuospatial constructive cognition. Cell 86(1): 59-69.
Freyd G, Kim SK, Horvitz HR (1990). Novel cysteine-rich motif and homeodomain in the
product of the Caenorhabditis elegans cell lineage gene lin-11. Nature 344(6269): 876-879.
Geisterfer-Lowrance AAT, Kass S, Tanigawa G, Vosberg HP, McKenna W, Seidman CE,
Seidman JG (1990). Amolecular basis for familial hypertrophic cardiomyopathy: a β cardiac
myosin heavy chain gene missense mutation. Cell 62: 999-1006.
Genini M, Schwalbe P, Scholl FA, Remppis A, Mattei MG, Schafer BW (1997). Substractive
kloning and characterization of DRAL, a novel LIM-domain protein down-regulated in
rhabdo-myosarcoma. DNA Cell Biol 16: 433-442.
Gerdes AM, Campbell SE, Hilbelink DR (1988). Structural Remodeling of cardiac myocytes
in rats with arteriovenous fistulas. Lab Invest 59: 857-861.
Grepin C, Dagnino L, Robitaille L, Haberstroh L, Antakly T, Nemer M (1994). A hormoneencoding gene identifies a pathway for cardiac but not skeletal muscle gene transcription. Mol
Cell Biol 14: 3115-3129.
Gross R, Schölmerich P, Gerok W (1994). Die Innere Medizin. Stuttgart, Verlag Schattauer.
8. Aufl. Hrsg. Gross.
58
Gupta MP, Gupta M, Zak R, Sukhatme VP (1991). Egr-1, a serum-inducible zinc finger
protein, regulates transcription of the rat cardiac alpha-myosin heavy chain gene. J Biol Chem
266: 12813-12816.
Hagen G, Dennig J, Preiss A Beato M, Suske G (1995). Functional analysis of the
transcription factor Sp4 reveal properties distinct from Sp1 and Sp3. J Biol Chem 270: 2498924994.
Haunstetter A, Izumo S (1998). Apoptosis. Basic mechanisms and implications for
cardiovascular disease. Circ Res 82: 1111-1129.
Heikinheimo M, Scandrett JM, Wilson DB (1994). Localization of transcription factor
GATA-4 to regions of the mouse embryo involved in cardiac development. Dev Biol 164:
361-373.
Huang WY, Cukerman E, Liew CC (1995). Identification of a GATA motif in the cardiac
alpha myosin heavy chain encoding gene and isolation of a human GATA-4 cDNA. Gene
155: 219-223.
Izumo S, Lompre AM, Matsuoka R, Koren G, Schwartz K (1988a). Myosin heavy chain
messenger RNA and protein isoform transitions during cardiac hypertrophy: Interaction
between hemodynamic and thyroid hormone-induced signals. J Clin Invest 79: 970-977.
Izumo S, Nadal-Ginard B, Mahdavi V (1988b). Protooncogene induction and reprogramming
of the cardiac gene expression produced by pressure overload. Proc Natl Acad Sci 85: 339343.
Izumo S, Mahdavi V (1988). Thyroid hormone receptor alpha isoforms generated by
alternative splicing differentially activate myosin HC gene transcription. Nature 334: 539542.
59
Jain MK, Fujita KP, Hsieh CM, Endege WO, Sibinga NES, Yet SF, Kashiki S, Lee WS,
Perrella MA, Haber E, Lee ME (1996). Molecular cloning and characterization of SmLIM, a
developmentally regulated LIM protein preferentially expressed in aortic smooth muscle cells.
J Biol Chem 271: 10194-10199.
Jain MK, Kashiki S, Hsieh CM, Layne MD, Yet SF, Sibinga NE, Chin MT, Feinberg MW,
Woo I, Maas RL, Haber E, Lee ME (1998). Embryonic expression suggests an important role
for CRP2/SmLIM in the developing cardiovascular system. Circ Res 83(10): 980-985.
Jones NC, Rigby PWJ, Ziff EB (1988). Trans-acting protein factors and the regulation of
eukaryotic transcription: Lessons from studies on DNA tumor viruses. Genes Dev 2: 267-281.
Katz AM (1995). The cardiomyopathy of overload. Eur Heart J 16(Suppl O): 110-114.
Karlsson O, Thor S, Norberg T, Ohlsson H, Edlund T (1990). Insulin gene enhancer binding
protein Isl-1 is a member of a novel class of proteins containing both a homeo- and a Cys-His
domain. Nature 344(6269): 879-882.
Klinke R, Silbernagl S (1994). Lehrbuch der Physiologie. 1. Aufl. Thieme Verlag, New
York/Stuttgart, S. 107.
Komuro I, Izumo S (1993). Csx: a murine homeobox-containing gene specifically expressed
in the developing heart. Proc Natl Acad Sci USA 90: 8145-8149.
Kubabayashi M, Tsuchimochi H, Komuro I, Takaku F, Yazaki Y (1988). Molecular cloning
and characterization of human α- and β-myosin cDNA clones: Regulation of expression
during development and pressure overload in human atrium. J Clin Invest 82: 524-531.
Ladenson PW, Sherman SI, Baughman KL, Ray PE, Feldman AM (1992). Reversible
alterations in myocardial gene expression in a young man with dilated cardiomyopathy. Proc
Natl Acad Sci USA 89: 5251-5255.
Latchman DS (1995). Cell stress genes and neuronal protection. Neuropathol Appl Neurobiol
21(6):475-477.
60
Laverriere AC, MacNeill C, Mueller C, Poelmann RE, Burch JBE, Evans T (1994). GATA4/5/6, a subfamily of three transcription factors transcribed in developing heart and gut. J Biol
Chem 269: 23177-23184.
Lee SMY, Tsui SKW, Chan KK, Garcia-Barcelo M, Waye MMY, Fung KP, Liew CC, Lee
CY (1998). Chromosomal mapping, tissue distribution and cDNA sequence of four-and-a-half
LIM domain protein 1. Gene 216(1): 163-170.
Liebhaber SA, Emery JG, Urbanek M, Wang X, Cooke NE (1990). Characterization of a
human cDNA encoding a widely expressed and highly conserved cysteine-rich protein with
an unusual zinc-finger motif. Nucleic Acids Res 18: 3871-3879.
Lints TJ, Parsons LM, Hartley L, Lyons I, Harvey RP (1993). Nkx-2.5 a novel murine
homeobox-containing gene expressed in early heart progenitor cells and their myogenic
descendants. Development 119: 419-431.
Lyons I, Parsons LM, Hartley L, Li R, Andrews JE, Robb L, Harvey RP (1995). Myogenic
and morphogenic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeobox gene
Nkx2-5. Genes Dev 9: 1654-1666.
Mably JD, Liew CC (1996). Factors involved in cardiogenesis and the regulation of cardiacspecific gene expression. Circ Res 79: 4-13.
Mahdavi V, Strehler EE, Periasamy M, Wieczorek DF, Izumo S, Nadal-Ginard B (1984).
Cardiac myosin heavy chain genes are organized in tandem. Proc Natl Acad Sci USA 81:
2626-2630.
Mann DL (1996). The effect of tumor necrosis factor-alpha on cardiac structure and function:
a tale of two cytokines. J Card Failure 2 (4S): S165-S172.
Mar JH, Ordahl CP (1990). M-CAT binding factor, a novel trans-acting factor governing
muscle-specific transcription. Mol Cell Biol 10: 4271-4283.
61
Maron BJ, Pelliccia A, Spataro A, Granata M (1993). Reduction in left ventricular wall
thickness after deconditioning in highly trained Olympic athletes. Br Heart J 69: 125-128.
Marsh JD, Lehmann MH, Ritchie RH, Gwathmey JK, Green GE, Schiebinger RJ (1998).
Androgen Receptors Mediate Hypertrophy in Cardiac Myocytes. Circulation 98: 256-261.
McNally EM, Kraft R, Bravo-Zehnder M, Taylor DA, Leinwand LA (1989). Full length rat
alpha and beta cardiac myosin heavy chain sequences: comparison suggests a molecular basis
for functional differences. J Mol Biol 210: 665-671.
Minamisawa S, Hoshijima M, Chu G, Ward CA, Frank K, Gu Y, Martone ME, Wang Y, Ross
J Jr, Kranias EG, Giles WR, Chien KR (1999). Chronic phospholamban-sarcoplasmic
reticulum calcium ATPase interaction is the critical calcium cycling defect in dilated
cardiomyopathy. Cell 99(3): 313-322.
Molkentin JD, Kalvakolanu DV, Markham BE (1994). Transcription factor GATA-4
regulates cardiac muscle-specific expression of the α-myosin heavy-chain gene. Mol Cell
Biol 14: 4947-4957.
Molkentin JD, Markham BE (1994).An M-CAT binding factor and an RSRF-related A-rich
binding factor positively reguate expression of the α-cardiac myosin heavy-chain gene in
vivo. Mol Cell Biol 14: 5056-5065.
Mone SM, Sanders SP, Colan SD (1996). Control Mechanisms for Physiological Hypertrophy
of Pregnancy. Circulation 94: 667-672.
Morgan JP, Erny RE, Allen PD, Grossman W, Gwathmey JK (1990). Abnormal intracellular
calcium handling, a major cause of systolic and diastolic dysfunction in ventricular
myocardium from patients with heart failure. Circulation 81(Suppl III): 21-32.
Morgan MJ, Madgwick AJ, Charleaton B, Pell JM, Loughna PT (1995). The developmental
regulation of a novel muscle LIM-protein. Biochem Biophys Res Commun 212: 840-846.
Morgan MJ, Madgwick AJ (1996a). GenBank accession number U60117.
62
Morgan MJ, Madgwick AJ (1996b). Slim defines a novel family of LIM-proteins expressed in
skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun 225: 632-638.
Morgan MJ, Madgwick AJ (1999). The LIM proteins FHL1 and FHL3 are expressed
differently in skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun 255(2): 245-50.
Morkin E, Flink IL, Goldman S (1983). Biochemical and Physiologic effects of thyroid
hormone on cardiac performance. Prog Cardiovasc Dis 25: 435-464.
Morkin E (1993). Regulation of Myosin Heavy Chain Genes in the Heart. Circulation 87:
1451-1460.
Müller JM, Isele U, Metzger E, Rempel A, Moser M, Pscherer A, Breyer T, Holubarsch C,
Buettner R, Schüle R (2000). FHL2, a novel tissue-specific coactivator of the androgen
receptor. EMBO J 19(3): 359-369.
Nadal-Ginard B, Mahdavi V (1989). Molecular basis of cardiac performance. Plasicity of the
myocardium generated through protein isoform switches. J Clin Invest 84: 1693-1700.
Nakagawa O, Ogawa Y, Itoh H, Suga S, Komatsu Y, Kishimoto I, Nishino K, Yoshimasa T,
Nakao K (1995). Rapid Transcriptional Activation and Early mRNA Turnover of Brain
Natriuretic Peptide in Cardiocyte Hypertrophy. J Clin Invest 96:1280-1287.
Ogawa Y, Itoh H, Nakao K (1995). Molecular biology and biochemistry of natriuretic peptide
family. Clin Exp Pharm Physiol 22: 49-53.
Onate SA, Boonyaratanakornkit V, Spencer TE, Tsai SY, Tsai MJ, Edwards DP, O’Malley
BW (1998). The steroid receptor coactivator-1 contains multiple receptor interacting and
activation domains that cooperatively enhance the activation function 1 (AF1) and AF2
domains of steroid receptors. J Biol Chem 273: 12101-12108.
Osler W (1892). The Principles and Practice of Medicine. New York: D. Appleton & Co.,
Seite 634ff.
63
Pennica D, Shaw KJ, Swanson TA, Moore MW, Shelton DL, Zioncheck KA, Rosenthal A,
Taga T, Paoni NF, Wood WI (1995). Cardiotrophin-1: biological activities and binding to the
leukemia inhibitory factor receptor/gp130 signaling complex. J Biol Chem 270: 10915-10922.
Radicke D, Wiese S, Breyer T, Füchtbauer E-M, Just H, Holubarsch C (1997). GenExpression des Brain Natriuretic Peptide BNP in menschlichen Vorhofpräparaten. Einfluß der
diastolischen Muskelfaserlänge (Abstract). Z Kardiol 86(2): 336.
Raleigh EA, Murray NE, Revel H, Blumenthal RM, Westaway D, Reith AD, Rigby
PW, Elhai J, Hanahan D (1988). McrA and McrB restriction phenotypes of some E. coli
strains and implications for gene cloning. Nucleic Acids Res 16(4):1563-75.
Sadoshima J, Izumo S (1997). The Cellular and Molecular Response of Myocytes to
Mechanical Stress. Annu Rev Physiol 59: 551-571.
Saez LJ, Gianola KM, McNally EM, Feghali R, Eddy R, Shows TB, Leinwand LA (1987).
Human cardiac myosin heavy chain genes and their linkage in the genome. Nucleic Acids Res
15: 5443-5459.
Sanchez-Garcia I, Rabbits TH (1994). The LIM domain: a new structural motif found in zincfinger-like proteins. Trends Genet 10: 315-320.
Seilhamer JJ, Arfsten A, Miller JA, Lundquist P, Scarborough RM, Lewicki JA, Porter JG
(1989). Human and canine gene homologs of porcine brain natriuretic peptide. Biochem
Biophys Res Commun 165(2): 650-658.
Shore P, Sharrocks AD (1995). The MADS-box family of transcription factors. Eur J
Biochem 229: 1-13.
Soonpaa MH, Field LJ (1998). Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA
synthesis. Circ Res 83: 15-26.
Srivastava D, Cserjesi P, Olson EN (1995). A subclass of bHLH proteins required for cardiac
morphogenesis. Science 270: 1995-1999.
64
Stryer L (1991). Biochemie. Aus dem Amerikanischen übersetzt von Pfeiffer B und
Guglielmi J. Korr. Aufl., Spektrum Akad. Verlag Heidelberg/Berlin/New York.
Swynghedauw B (1986). Developmental and functional adaptions of contractile proteins in
cardiac and skeletal muscles. Physiol Rev 66: 710-771.
Tabscott SJ, Weintraub H (1991). MyoD and the regulation of myogenesis by helix-loophelix proteins. J Clin Invest 87: 1113-1138.
Takahashi T, Allen PD, Izumo S (1992). Expression of A-, B-, and C-Type Natriuretic
Peptide Genes in Failing and Developing Human Ventricles. Circ Res 71: 9-17.
Thaik CM, Calderone A, Takahashi N, Colucci WS (1995). Interleukin-1β modulates the
growth and phenotype of neonatal rat cardiac myocytes. J Clin Invest 96: 1093-1099.
Thierfelder L, Watkins H, MacRae C, Lamas R, McKenna W, Vosberg HP, Seidman JG,
Seidman CE (1994). α-Tropomyosin and cardiac troponin T mutations cause familial
hypertrophic cardiomyopathy: a disease of sarcomere. Cell 77: 701-712.
Thuerauf DJ, Hanford DS, Glembotski CC (1994). Regulation of rat brain natriuretic peptide
transcription: a potential role for GATA-related transcription factors in myocardial cell gene
expression. J Biol Chem 269: 17772-17775.
Umesono K, Murakami KK, Thompson CC, Evans RM (1991). Direct repeats as selective
response elements for the thyroid hormone, retinoic acid, and vitamin D3 receptors. Cell 65:
1255-1266.
Voegel JJ, Heine MJ, Zechel C, Chambon P, Gronemeyer H (1996). TIF2, a 160kDa
transcriptional mediator for the ligand-dependent activation function AF-2 of nuclear
receptors. EMBO J 15: 3667-3675.
Wang DL, Chen JJ, Shin NL, Kao YC, Hsu KH, Huang WY, Liew C-C (1992). Biochem
Biophys Res Commun 183: 1260-1265.
65
Way JC, Chalfie M (1988). mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation
of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell 54(1): 5-16.
Weber KT, Brilla CG (1991). Pathological Hypertrophy and Cardiac Interstitium. Circulation
83: 1849-1865.
Wiese S, Radicke D, Breyer T, Füchtbauer E-M, Just H, Holubarsch C (1997). Angiotensin II
stimuliert die Gen-Expression von Brain Natriuretic Peptide BNP in menschlichen
Vorhofpräparaten (Abstract). Z Kardiol 86(2): 170.
Xu L, Glass CK, Rosenfeld MG (1999). Coactivator and corepressor complexes in nuclear
receptor function. Curr Opin Genet Dev 9: 140-147.
Yamazaki T, Shiojima I, Komuro I, Nagai Y, Yazaki Y (1995). Interaction of cardiac
myocytes and non-myocytes in mechanical stress-induced hypertrophy. Herz 20: 109-117.
Zhou Q, Ruiz-Lozano P, Martone ME, Chen J (1999). Cypher, a striated muscle-restricted
PDZ and LIM domain-containing protein, binds to alpha-actinin-2 and protein kinase C. J
Biol Chem 274(28): 19807-13.
66
VII.
ANHANG
VII.1
Datentabelle der FHL2 und BNP Analyse
Patient FHL2 (in % der Kontrolle)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
LV
38
30
49,0
37
53
55,8
84,0*
RV
81
27,3
58,0
25
35
132,4
LA
RA
1,6
7,8
44
41
3,0
24,8
54,6
120*
39,6
96*
43,4
113*
39,5
118
45
39
34
37
15
21
59,2
80*
36,7
128*
41,0
97*
59,1
73
40
40
17
20
41
49
3,1
9,4
2,5
3,9
40
31
61,9
92*
84
54
50,1
68
107
118
17
18
BNP (Kontrolle = 1,0)
LV
RV
LA
RA
2,6
2,8
11,0
13,0
6,9
0,66
1,22
5,1
9,0
4,5
10,0
14,0
15,0
24,0
15,4
0,2
0,2
1,8
1,4
0,4
0,26
6,0
0,9
3,8
7,9
2,0
3,2
62
65*
9,7
7,8
0,4
34,1
43
5,5
6,1
0,5
0,5
135
58
84
3,8
4,4
0,5
0,5
0,5
0,56
Einige Patientenproben doppelt untersucht. Alle Werte sind Bestandteil der statistischen Analysen.
*) Northern Blot, dessen Werte insgesamt höher gemessen wurden, als dies bei Kontrollmessungen der Fall war.
67
VII.2
Danksagung und Stipendium
Allen, die mich bei der Arbeit an dieser Dissertation unterstützt haben, schulde ich großen
Dank! Da diese Arbeit aus einer Kooperation zwischen Prof. C. Holubarsch, Kardiologie,
und Prof. R. Schüle, KTB Tumorforschungsges. mbH Freiburg und Universitäts-Frauenklinik,
enstanden ist, danke ich sowohl Prof. C. Holubarsch als auch Prof. R. Schüle für die
Überlassung des spannenden Themas. Prof. Dr. R. Schüle danke ich außerdem ganz
besonders für die Möglichkeit in seinem Labor mitzuarbeiten, allen Mitarbeitern seiner
Arbeitsgruppe für die breite Unterstützung und ständige Bereitschaft, alle meine Fragen
geduldig zu beantworten! Auch danke ich Adrian Dragu, der z.T. nächtelang das menschliche
Myokard in Bad Oeynhausen für mich präpariert und eingefroren hat, ohne das die Arbeit
nicht hätte erstellt werden können. Besonders Dr. Judith Müller danke ich für die erstklassige
Zusammenarbeit, viele gute Diskussionen und ihren unermüdlichen Einsatz bei der kritischen
Durchsicht dieser Arbeit.
Durch ein Stipendium des Biomedical Exchange Program (BMEP) und des Deutschen
Akademischen Austauschdienstes (DAAD) 1996/97, welches mir einen achtmonatigen
Aufenthalt an der University of Michigan, Ann Arbor, MI, U.S.A., ermöglichte, hatte ich
Gelegenheit, im Labor von Prof . S. Izumo und Prof. J. Sadoshima wertvolle Erfahrungen auf
dem Gebiet der molekularen Kardiologie und der Molekular- und Zellbiologie zu machen und
die Methoden zu erlernen, die mir diese Dissertation ermöglichten.
68
VII.3
Publikationen
Wiese S, Breyer T, Dragu A, Wakili R, Burkard T, Schmidt-Schweda S, Fuchtbauer EM,
Dohrmann U, Beyersdorf F, Radicke D, Holubarsch CJ (2000).
Gene expression of brain natriuretic peptide in isolated atrial and ventricular human
myocardium : influence of angiotensin II and diastolic fiber length.
Circulation. 2000 Dec 19;102(25):3074-9.
Teile dieser Dissertation sind Bestandteil folgender Publikationen:
Breyer T, Müller JM, Dragu A, Schüle R, Holubarsch C (1999).
Neues kardiales LIM-Domänen Protein im menschlichen Myokard (Abstract).
Vortrag anläßlich der 65. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie,
Mannheim. Z Kardiol 88(1): 249.
Judith M Müller, Ulrike Isele, Eric Metzger, Annette Rempel, Markus Moser, Armin
Pscherer, Tobias Breyer, Christian Holubarsch, Reinhard Buettner und Roland Schüle (2000).
FHL2, a novel tissue-specific coactivator of the androgen receptor.
EMBO J 19(3): 359-369.
69
VII.4
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Geboren
Familienstand
Tobias J. Breyer
08.11.1971 in Braunschweig
ledig
Mutter
Vater
Bruder
Dipl. Psych. Ursula Breyer, geb. Müller, geb. 05.06.1941
Dipl. rer. pol. Jürgen Breyer, geb. 31.08.1937
Cand. iur. Felix Breyer, geb. 12.10.1975
Schulbildung
1978-1991
1991
1991-1992
Schulausbildung in Lübeck und Ludwigsburg
Abitur am Friedrich-Schiller-Gymnasium Ludwigsburg
Bundeswehr
Studium/Stipendium
seit Okt. 1992
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Medizinische Fakultät
1996-1997
Forschungs- und Studienaufenthalt an der University of
Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA als Stipendiat des
Biomedical Exchange Program (BMEP) und des DAAD
seit März 1999
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung und Praktisches Jahr im
Klinikum der Albert-Ludwigs-Universität (Wahlfach Neurologie)
April 2000
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung in Freiburg
Wissenschaftliche Tätigkeit
1990-1994
Mitglied im Kepler-Seminar für Naturwissenschaften, Stuttgart
(Robert-Bosch-Stiftung)
Aug. 1996-April 1997
Im Rahmen des Forschungsaufenthaltes an der University of
Michigan Forschungsprojekt: Protein-Protein Interaktionen und
Koaktivierungen kardialer Transkriptionsfaktoren, Mentor: Prof.
Dr. Seigo Izumo, Acting Director Center of Organogenesis,
Chief Division of Cardiology, Cardiovascular Research Center,
University of Michigan, Ann Arbor, MI, U.S.A.
1997-2001
Promotion an der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg bei
Prof. Dr. med. C. Holubarsch, Innere Medizin III, Kardiologie
und Angiologie.
seit Juli 2000
Arzt im Praktikum
Deutsches Herzzentrum München des Freistaates Bayern
Klinik an der Technischen Universität München
Ärztlicher Direktor Prof. Dr. med. A. Schömig