Veränderungen der Quervernetzungen im

8/20
© 2004
Schattauer GmbH
Veränderungen der Quervernetzungen
im kollagenen Bindegewebe bei
Dermatoliposklerose
Y. Gaber1, K. Tiedemann 2, D. P. Reinhard 2, J. Brinckmann 1
1
Klinik für Dermatologie und Venerologie (Leiter: Prof. Dr. H. H. Wolff),
2
Institut für Medizinische Molekularbiologie (Leiter: Prof. Dr. P. K. Müller),
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
Mots-clés
Schlüsselwörter
Keywords
Dermatoliposklerose, Quervernetzungen, Kollagen
Lipodermatosclerosis, cross-link, collagen
Lipodermatosclérose, liaisons croisées, collagène
Zusammenfassung
Summary
Résumé
Ziel: Die Dermatoliposklerose im Rahmen der chronischen venösen Insuffizienz ist durch die Akkumulation
von Kollagen und den Anstieg trifunktioneller skeletttypischer Quervernetzungen gekennzeichnet. Mit dieser
Untersuchung wird die Frage geklärt, ob dieser Anstieg
durch einen Anstieg aller Quervernetzungen zu erklären
ist oder ob es sich hierbei um einen isolierter Prozess
handelt. Patienten, Methode: Hautexzidate von 15
Patienten mit Dermatoliposklerose und venösem Ulkus
wurden untersucht. Die Konzentrationen Hydroxylysinund Lysin-abhängiger di- und trifunktioneller Quervernetzungen wurden nach Hydrolyse der Proben durch
Aminosäureanalyse bestimmt. Ergebnisse: Die Konzentration der Hydroxylysin-abhängigen, skeletttypischen
Quervernetzungen zeigt einen deutlichen Anstieg.
Dagegen sinkt die Gesamtkonzentration der Lysinabhängigen, hauttypischen Verbindungen signifikant ab.
Schlussfolgerung: Bei der Dermatoliposklerose kommt
es zum charakteristischen Wechsel im Quervernetzungsmuster, wodurch es zur Majorität skeletttypischer
Verbindungen in der Haut kommt.
Aim: Lipodermatosclerosis in the context of chronic
venous insufficiency is characterized by an accumulation
of collagen and an increase of trifunctional collagen
cross-links typical for skeletal tissues. In the study
presented here, the question is answered, whether this
increase is due to an increase of all collagen cross-links
or whether it is an isolated process. Method: Skin
biopsies from 15 patients with lipodermatosclerosis and
venous leg ulcer were analysed. The concentration of
hydroxylysine- and lysine-derived di- and trifunctional
crosslinks were analysed after hydrolysis of the specimens by amino acid analysis. Results: The concentration of hydroxylysine-derived collagen crosslinks showed
a marked increase. In contrary, the concentration of total lysine-derived crosslinks decreased significantly.
Conclusion: Lipodermatosclerosis is marked by a
characteristic change of collagen crosslinks leading to
the majority of skeletal-type crosslinks in the skin.
Changes in crosslinks in the collagenous connective
tissue of lipodermatosclerosis
Phlebologie 2004; 33: 8–11
But: La lipodermatosclérose, dans le cadre de l’insuffisance veineuse chronique, se caractérise par l’accumulation de collagène et l’augmentation des liaisons croisées
trifonctionnelles propres aux tissus squelettiques. La présente étude a permis de résoudre la question de savoir
si cette augmentation s’explique par une augmentation
de toutes les liaisons croisées ou s’il s’agit, en l’occurrence, d’un processus isolé. Patients, méthode: Des
biopsies cutanées provenant de 15 patients souffrant de
lipodermatosclérose et d’ulcères veineux ont été réalisées. Les concentrations en liaisons croisées bi- et trifonctionnelles formées à partir de la lysine et de l’hydroxylysine, typiques des tissus squelettiques ont été déterminées après hydrolyse des échantillons, par l’analyse des acides aminés. Résultats: La concentration en
liaisons croisées, caractéristiques des tissus squelettiques
et formées à partir de l’hydroxylysine, présente une
augmentation marquée. En revanche, la concentration
totale en liaisons formées à partir de la lysine et caractéristiques de la peau, diminue de manière significative.
Conclusion: La lipodermatosclérose se caractérise par
une modification du profil des liaisons croisées du
collagène qui se manifeste sous la forme d’une évolution vers une majorité de liaisons typiques des tissus
squelettiques dans la peau.
Modification des liaisons croisées dans le tissu
conjonctif du collagène en présence de
lipodermatosclérose
D
ie Dermatoliposklerose (DLS) ist
ein typischer Befund am Unterschenkel bei Patienten mit chronischer Veneninsuffizienz und gekennzeichnet durch funktionelle und morphologische
Veränderungen (7, 10, 15-17, 19). Die län-
Phlebologie 1/2004
gerfristig bestehende venöse Hypertonie
führt zu Störungen der Makro- und Mikrozirkulation sowie zu chronisch persistierenden Entzündungen und nachfolgendem
Gewebeumbau. Die DLS geht mit einer
Akkumulation der extrazellulären Matrix
einher, die zu einem Verlust der normalen
Architektur und der mechanischen Eigenschaften und damit zur Störung der biologischen Funktion des Gewebes führt.
Eine qualitativ und quantitativ korrekt
zusammengesetzte extrazelluläre Matrix ist
Eingegangen: 2. Oktober 2003; angenommen nach Revision: 18. November 2003
Downloaded from www.phlebologieonline.de on 2017-08-20 | IP: 88.99.70.242
For personal or educational use only. No other uses without permission. All rights reserved.
9/21
Kollagenvernetzung bei Dermatoliposklerose
Patienten, Material, Methoden
Hautexzidate von 15 Patienten (11 Frauen,
4 Männer) mit DLS und venösem Ulkus
wurden untersucht (Lebensalter: 52-88 Jahre; Durchschnittsalter: 70 Jahre). Alle Patienten wiesen klinisch eine deutliche DLS
und so genannte therapieresistente (d. h.
trotz konsequenter Behandlung nicht innerhalb von 12 Monate abgeheilte) Ulzera
auf. Exzidate normaler Unterschenkelhaut
von 7 Patienten mit plastisch-rekonstruktiven Eingriffen wurden als gesunde Kontrollen untersucht. Eine positive Stellungnahme der örtlichen Ethikkommission lag
vor Beginn der Untersuchungen vor.
Analyse der Quervernetzungen
Abb. 1 Chromatogramme der Quervernetzungen (HP: Hydroxylysylpyridinolin, HHL: Histidinohydroxylysinonorleucin,
DHLNL: Dihydroxylysinonorleucin, HLNL: Hydroxylysinonorleucin)
Grundvoraussetzung für die strukturelle
und funktionelle Integrität eines Gewebes.
Das Bindegewebe besteht neben Elastin
und mikrofibrillären Proteinen, Proteoglykanen, Glykosaminoglykanen und Glykoproteinen vornehmlich aus Kollagen (4).
Die adäquate Ausbildung von Quervernetzungen zwischen den Kollagenmolekülen
ist von wesentlicher Bedeutung für die mechanische Stabilität des Bindegewebes. Je
nach Anzahl der miteinander vernetzten
Kollagenmoleküle werden di- und trifunktionelle Verbindungen unterschieden. Je
nach Gewebe lassen sich hauttypische von
skeletttypischen Quervernetzungsmustern
unterscheiden.
Der Ausgangspunkt der Quervernetzungen bilden bestimmte Lysin- oder Hydroxylysinreste in den Telopeptiden der
Kollagenketten. Je nach Aminosäurerest
wird zwischen Lysinaldehyd(Lys)- und
Hydroxylysinaldehyd(Hyl)-Weg der Quervernetzungsbildung unterschieden.
● In der Haut liegen vornehmlich Lysinreste im Telopeptid vor. Die difunktionelle Verbindung D-Hydroxylysinonorleucin (D-HLNL) entsteht und als reife,
trifunktionelle, Verbindung Histidinohydroxylysinonorleucin (HHL).
●
Im Knochenkollagen sind die Lysinreste im Telopeptid des Kollagenmoleküls hydroxyliert, Quervernetzungen
werden somit über den Hyl-Weg gebildet. Als difunktionelle Verbindung entsteht D-Dihydroxylysinonorleucin (DDHLNL) und als trifunktionelle Quervernetzungen werden die Pyridinoline
Hydroxylysylpyridinolin (HP) und Lysylpyridinolin (LP) gebildet (6).
Bei Erkrankungen, die mit einer Fibrose
der Haut (hypertrophe Narben, Sklerodermie) oder von Organen (Leber-, Lungenfibrose) einhergehen, konnte ein Anstieg
Hydroxylysin-abhängiger Quervernetzungen nachgewiesen werden (12, 14). Auch
bei der DLS wurden hohe Konzentrationen
an skeletttypischen Quervernetzungen im
kollagenen Bindegewebe gefunden (5).
Ziel dieser Studie ist es, die Frage zu beantworten, ob es im Rahmen der DLS zu
einem generellen Anstieg aller Quervernetzungen im Gewebe kommt oder ob der
Anstieg Hydroxylysin-abhängiger Verbindungen ein isolierter Prozess ist.
Nach Reduktion des Gewebes mit Natriumborhydrid (0,05 mol/l NaH2PO4/0,15
mol/l NaCl, pH 7,4, 1 h auf Eis, 1,5 h bei
Raumtemperatur) wurden die Proben denaturiert (95°C, 5 min) und mit bakterieller
Kollagenase degradiert (Sigma, Germany;
1 U/l, 37°C, 12 h). Nach saurer Hydrolyse
der Proben (6 mol/l HCl, 110°C, 24 h) wurde der Hauptteil nicht quervernetzter Aminosäuren auf CF-11-Zellulosesäulen abgetrennt. Die Eluate wurden mit einem Aminosäurenanalyser (Biochrom 20, Biochrom,
GB) analysiert (Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung). Die Quantifizierung erfolgte durch eine Farbreaktion mit Ninhydrin, wobei als interner Standard Leucin
verwendet wurde (Farbwerte: 1,7 für
HP/LP, 1,8 für DHLNL und HLNL, 1,97
für HHL).
Die Kollagenmenge wurde berechnet
aus dem Gehalt an Hydroxyprolin im Säurehydrolysat bezugnehmend auf den Gehalt von 14 mg Hydroxyprolin in 100 mg
Kollagen. Die Messung von Hydroxyprolin
erfolgte mittels eines Farbassays. Nach saurer Hydrolyse der Proben wurden lyophilisierte Aliquots mit Chloramin T oxidiert
und mit Dimethylaminobenzaldehyd versetzt. Der Farbreaktion wurde bei einer
Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
U-Test nach Mann und Whitney.
Downloaded from www.phlebologieonline.de on 2017-08-20 | IP: 88.99.70.242
For personal or educational use only. No other uses without permission. All rights reserved.
Phlebologie 1/2004
10/22
Gaber et al.
b
Abb. 2 Kollagenquervernetzungen
a) Hydroxylysin-abhängig (HP: Hydroxylysylpyridinolin, DHLNL: Dihydroxylysinonorleucin); b) Lysin-abhängig (HHL: Histidinohydroxylysinonorleucin, HLNL: Hydroxylysinonorleucin)
Diskussion
Eine adäquate Generierung von Quervernetzungen zwischen einzelnen Kollagenmolekülen ist eine wichtige Voraussetzung
für die biomechanische Kapazität der Fibrillen und des Gewebes. Kommt es zu
Störungen in diesem Prozess, so resultiert
eine Einschränkung der Gewebefunktion,
wie Untersuchungen zum kyphoskoliotischen Typ des Ehlers-Danlos-Syndroms
Phlebologie 1/2004
a
Quervernetzungen/Kollagen (mol/mol)
Die Sklerosierung der Haut bei der
DLS geht mit einem deutlichen Anstieg
Hydroxylysin-abhängiger Quervernetzungen einher, während die Konzentration der
Lysin-abhängigen Verbindungen insgesamt
sinkt (Abb. 1). Hierdurch steigt der relative
Anteil der skeletttypischen Quervernetzungen des Kollagens von 10% in der
gesunden Haut auf über 65% bei der DLS
an. Dieser Wechsel im Quervernetzungsmuster tritt sowohl bei den unreifen,
difunktionellen Verbindungen wie auch
bei den reifen Quervernetzungen auf.
Die Konzentration von HP steigt von
0,020 ± 0,017 mol/mol bei den gesunden
Kontrollen auf 0,090 ± 0,04 mol/mol im
erkrankten Gewebe an. Noch deutlicher ist
der Anstieg bei der difunktionellen Verbindung DHLNL. Hier steigt die Konzentration von 0,02 ± 0,02 mol/mol auf
0,29 ± 0,17 mol/mol an (Abb. 2a).
Bei den Lysin-abhängigen Quervernetzungen hingegen lässt sich ein Abfall der
Konzentration nur bei der Verbindung
HHL nachweisen. Hier nimmt die Konzentration von 0,31 ± 0,06 mol/mol im gesunden Gewebe auf 0,13 ± 0,09 mol/mol bei
DLS ab. Die Konzentration der difunktionellen Verbindung HLNL steigt von
0,03 ± 0,013 mol/mol in gesunder Haut auf
0,07 ± 0,03 mol/mol in sklerotischer Haut
an (Abb. 2b). Durch den starken Anstieg
von DHLNL kommt es auch zu einem
Anstieg der Summe aller analysierten
Quervernetzungen. Die Konzentration
erhöht sich von 0,39 ± 0,03 mol/mol in gesunder Haut auf 0,58 ± 0,22 mol/mol bei
der DLS.
Quervernetzungen/Kollagen (mol/mol)
Ergebnisse
und zum Bruck-Syndrom zeigen (1, 3). In
der Haut konnten Veränderungen der
Quervernetzungen im Rahmen der extrinsischen und intrinsischen Alterung sowie
bei Fibrosen nachgewiesen werden.
Während bei der Alterung quantitative
Veränderungen im Vordergrund stehen, ist
die Fibrose durch qualitative Veränderungen gekennzeichnet (23, 24).
Bei der umschriebenen Sklerodermie,
beim Keloid und bei der DLS konnte
jeweils ein Anstieg von Hydroxylysinabhängigen Quervernetzungen im Gewebe
nachgewiesen werden. Diese Verbindungen vom Pyridinolin-Typ – in gesunder
Haut nur in Spuren vorhanden – sind
charakteristisch für Hartgewebe (6, 11, 18).
Theoretisch kann der Anstieg der Pyri-
Downloaded from www.phlebologieonline.de on 2017-08-20 | IP: 88.99.70.242
For personal or educational use only. No other uses without permission. All rights reserved.
11/23
Kollagenvernetzung bei Dermatoliposklerose
dinolinkonzentration auf zwei Arten entstehen:
● Die Zunahme rührt von einem generellem Anstieg aller Quervernetzungen
her.
● Bei einem spezifischen Prozess werden
vor allem Hydroxylysin-abhängige Verbindungen synthetisiert.
Danksagung
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Gesellschaft für Phlebologie gefördert.
Unsere Analysen belegen eindrücklich,
dass es im Rahmen der DLS zu einem weitestgehend selektiven Anstieg skeletttypischer Verbindungen in der Haut kommt.
Hiervon ist in erster Linie die difunktionelle Verbindung DHLNL betroffen, die erst
im Verlauf zu HP ausreift. Die difunktionellen Verbindungen DHLNL und HLNL
geben einen Hinweis auf das Ausmaß der
Kollagenneusynthese (2). Während in gesunder Haut beide Verbindungen in sehr
niedriger Konzentration vorhanden sind,
steigt ihre Konzentration im Rahmen der
DLS an. Dabei kommt es aber zu einem
ganz ausgeprägten Überwiegen der
Hydroxylysin-abhängigen Quervernetzung
DHLNL. Während insgesamt in gesunder
Haut nur ca. 10% der Quervernetzungen
über den Hydroxylysin-Weg gebildet werden, steigt dieser Anteil bei der DLS auf
über 65%.
Da zur Bildung von HP und DHLNL
Hydroxylysinreste im Telopeptid vorliegen
müssen, muss es bei der DLS zu vermehrter
Hydroxylierung von Lysinresten im Telopeptid kommen. Neue Untersuchungen
zeigen, dass hierfür die Lysylhydroxylase 2
verantwortlich ist. Ebenfalls nachgewiesen
wurde, dass Zellen aus sklerotischer Haut
bei systemischer Sklerodermie eine gesteigerte mRNA-Expression der Lysylhydroxylase 2 aufweisen und dass der Anteil an
Quervernetzungen vom HP-Typ im neu
synthetisierten Kollagen steigt (20).
Welche Folgen ein Wechsel im Quervernetzungsmuster hat, ist unklar. Denkbar ist,
dass Quervernetzungen die Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber proteolytischem Abbau beeinflussen (21). Die verstärkte Expression und Aktivierung von
Matrix-Metalloproteinasen wurde sowohl
in der Wundflüssigkeit venöser Ulzera als
auch in DLS-Gewebe gefunden (8, 9, 13,
22). Ob dies mit den qualitativen Veränderungen der Quervernetzungen in einem
1. Acil Y,Vetter U, Brenner R, Müller PK, Brinckmann J. Diagnosis of Ehlers-Danlos syndrome
type VI. Cross-link pattern in tissue and urine
sample as a diagnostic marker. J Am Acad
Dermatol 1995; 33: 522-4.
2. Bailey AJ, Paul RG, Knott L. Mechanisms of
maturation and ageing of collagen. Mech
Ageing Dev 1998; 106: 1-56.
3. Bank RA, Robins SP, Wijmenga C, BreslauSiderius LJ, Bardoel AF, van der Sluijs HA,
Pruijs HE, TeKoppele JM. Defective collagen
crosslinking in bone, but not in ligament or
cartilage, in Bruck syndrome: indications for a
bone-specific telopeptide lysyl hydroxylase on
chromosome 17. Proc Natl Acad Sci 1999; 96:
1054-8.
4. Brand-Saberi B, Christ B. Die extrazelluläre
Matrix – ein multifunktionelles dynamisches
System. Phlebologie 1995; 24: 66-73.
5. Brinckmann J, Acil Y, Tronnier M, Bätge B,
Schmeller W, Müller PK, Wolff HH. Skeletttypische Quervernetzungen im kollagenen Bindegewebe bei Dermatoliposklerose. Phlebologie 1996; 25: 193-6.
6. Eyre DR, Paz MA, Gallop PM. Cross-linking in
collagen und elastin. Annu Rev Biochem 1984;
537: 717-48.
7. Gaber Y, Gehl HB, Schmeller W. Magnetresonanz- und Computertomographie vor und nach
Shave-Therapie venöser Ulzera. Phlebologie
1999; 28: 87-92.
8. Heroy Y, May AE, Heisterkamp T, Hartmann
M, Schöpf E, Norgauer J,Vanscheidt W. Genexpression von Matrix-Metalloproteinasen und
deren Inhibitoren bei Dermatoliposklerose.
Phlebologie 1997; 26: 150-4.
9. Heroy Y, May AE, Pornschlegel G, Stetter C,
Grenz H, Preissner KT, Schöpf E, Norgauer J,
Vanscheidt W. Lipodermatosclerosis is characterized by elevated expression and activation
of matrix metalloproteinases: implications for
venous ulcer formation. J Invest Dermatol
1998; 111: 822-7.
10. Jünger M, Steins A, Hahn M, Häfner HM.
Microcirculatory dysfunction in chronic venous
insufficiency. Microcirculation 2000; 7: S3-S12.
11. Knott L, Bailey AJ. Collagen cross-links in mineralizing tissues: a review of their chemistry,
function and clinical relevance. Bone 1998; 22:
181-7.
12. Moriguchi T, Fujimoto D. Crosslinks of collagen in hypertrophic scar. J Invest Dermatol
1979; 72: 143-5.
13. Nwomeh BC, Liang HX, Cohen IK, Yager DR.
MMP-8 is the predominant collagenase in
healing wounds and nonhealing ulcers. J Surg
Res 1999; 81: 189-95.
Zusammenhang steht, muss in weiteren
Untersuchungen geklärt werden.
Literatur
14. Ricard-Blum S, Esterre P, Grimaud JA. Collagen cross-linking by pyridinoline occurs in nonreversible skin fibrosis. Cell Mol Biol 1993; 39:
723-7.
15. Schmeller W, Roszinski S, Tronnier M, Gmelin
E. Combined morphological and physiological
examinations in lipodermatosclerosis. In: Raymond-Martimbeau P, Prescott R, Zummo M
(eds). Phlebology 1992. Paris: Libbey 1992;
172-4.
16. Schmeller W, Roszinski S, Huesmann M.
Gewebeoxygenierung und Mikrozirkulation
bei Dermatoliposklerose mit unterschiedlich
stark ausgeprägtem Erythem im Randbereich
venöser Ulzera. VASA 1997; 26: 18-24.
17. Tronnier M, Schmeller W, Wolff HH. Morphological changes in lipodermatosclerosis and
venous ulcers: Light microscopy, immunohistochemistry and electron microscopy. Phlebology
1994; 9: 48-54.
18. Uzawa K, Marshall MK, Katz EP, Tanzawa H,
Yeowell HN, Yamauchi M. Altered posttranslational modifications of collagen in keloid. Biochem Biophys Res Commun 1998; 249: 652-5.
19. Valencia IC, Falabella A, Kirsner RS, Eaglstein
WH. Chronic venous insufficiency and venous
leg ulceration. J Am Acad Dermatol 2001; 44:
401-21.
20. Van der SlotAJ, Zuurmond AM, Bardoel AF,
Wijmenga C, Pruijs HE, Sillence DO, Brinckmann J, Abraham DJ, Black CM, Verzijl N,
DeGroot J, Hanemaaijer R, TeKoppele JM,
Huizinga TW, Bank RA. Identification of
PLOD2 as telopeptide lysyl hydroxylase, an
important enzyme in fibrosis. J Biol Chem 2003
(in press).
21. Vater CA, Harris ED, Siegel RC. Native crosslinks in collagen fibrils induce resistance to
human synovial collagenase. Biochem J 1979;
181: 639-45.
22. Weckroth M, Vaheri A, Lauharanta J, Sorsa T,
Konttinen YT. Matrix metalloproteinases, gelatinase and collagenase, in chronic leg ulcers.
J Invest Dermatol 1996; 106: 1119-24.
23. Yamauchi M, Woodley DT, Mechanic GL.
Aging and cross-linking of skin collagen.
Biochem Biophys Res Commun 1988; 152:
898-903.
24. Yamauchi M, Prisayanh P, Haque Z, Woodley
DT. Collagen cross-linking in sun-exposed and
unexposed sites of aged human skin. J Invest
Dermatol 1991; 97: 938-41.
Korrespondenzadresse:
Dr. med Yvonne Gaber
Klinik für Dermatologie und Venerologie
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein
Ratzeburger Allee 160
23538 Lübeck
E-Mail: [email protected]
Downloaded from www.phlebologieonline.de on 2017-08-20 | IP: 88.99.70.242
For personal or educational use only. No other uses without permission. All rights reserved.
Phlebologie 1/2004