Inflammasome-Dependent and -Independent - ETH E

DISS. ETH NO. 22564
Inflammasome-Dependent and -Independent Roles
of Inflammatory Caspases in Human Keratinocytes
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
GERHARD EGON MARIO STRITTMATTER
MSc ETH Biology, ETH Zurich
born on 21.07.1984
citizen of
Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Sabine Werner, examiner
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt, co-examiner
PD Dr. Hans-Dietmar Beer, co-examiner
2015
Zusammenfassung
Zusammenfassung Keratinozyten sind der Haupt-Zelltyp in der mehrschichtigen Epidermis, welche die äusserste Grenze
des menschlichen Körpers und dessen erste Verteidigungslinie darstellt. Diese Zellen werden
gemeinhin nicht zu den professionellen Immunzellen gezählt, aber sie teilen einige immunologische
Eigenschaften mit Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems. Basale Keratinozyten
exprimieren Komponenten von Inflammasomen. Dies sind Proteinkomplexe, die durch Zellschäden
oder Infektionen ausgelöste Gefahrensignale erkennen. Die Aktivierung von Inflammasomen führt zur
Aktivierung der Protease Caspase-1, die daraufhin die pro-inflammatorischen Zytokine ProInterleukin(IL)-1β und ProIL-18 in ihre aktive Form überführt, was in vivo zu einer Entzündung führt.
Es ist bekannt, dass die Bestrahlung von Keratinozyten mit UVB Inflammasom-Aktivierung und
Apoptose induziert.
In meiner Dissertation untersuchte ich die Rolle von Caspase-1 und Caspase-1-bindenden Proteinen
bei der Inflammasom-Aktivierung und der Apoptose in UVB-bestrahlten und virusinfizierten primären
humanen Keratinozyten. Die Ergebnisse dieser Arbeit können in vier Teile gegliedert werden.
1.) Die inflammatorische Caspase Caspase-1 und Caspase-11, die in Mäusen exprimiert wird, wurden
im Laufe der letzten 20 Jahre intensiv erforscht. Über Caspase-4, das mutmassliche menschliche
Homolog der Caspase-11, ist hingegen wenig bekannt. Wir haben eine mögliche Rolle von Caspase-4
bei der Inflammasom-Aktivierung untersucht und konnten zeigen, dass UVB-induzierte NLRP3Inflammasomaktivierung in primären humanen Keratinozyten von Expression und Aktivität der
Caspase-4 abhängt. Weiter konnten wir zeigen, dass Caspase-4 für die Aktivierung der NLRP3- und
AIM2-Inflammasome
in
der
humanen
monozytischen
Zelllinie
THP-1
benötigt
wird.
Immunpräzipitationsexperimente zeigten eine direkte Interaktion von Caspase-1 mit Caspase-4. Mit
diesen Ergebnissen konnten wir eine wichtige Funktion der bislang nur unzureichend charakterisierten
Caspase-4 in der Inflammasom-Aktivierung in menschlichen Zellen identifizieren.
2.) UVB-Bestrahlung führt zu Inflammasom-Aktivierung in Keratinozyten und zu einer
Hautentzündung in vivo, die als Sonnenbrand bezeichnet wird. Zusätzlich ist UVB ein klassischer
Aktivator der Apoptose von Keratinozyten und anderen Zelltypen. Wir konnten feststellen, dass diese
Prozesse in einer zeitlich gestaffelten Weise auftreten, wobei die Inflammasom-Aktivierung der
Apoptose vorangeht. In menschlichen Zellen sind Caspase-1 und Caspase-4 für diese Vorgänge
notwendig. Mittels verschiedener experimenteller Ansätze konnten wir zeigen, dass die Apoptose
unabhängig von weiteren Inflammasom-Komponenten abläuft. Das anti-apoptotische Protein Bap31
wurde als potenzielles Substrat von Caspase-1 mittels eines iTRAQ-TAILS-Experiments identifiziert.
Durch eine Erhöhung bzw. eine Reduktion der Expression von Bap31 konnte eine wichtige Rolle
dieses Proteins in der UVB-induzierten Apoptose bestätigt werden. Folglich konnten wir eine neue
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Zusammenfassung
und unerwartete Rolle von Caspase-1 in der UVB-induzierten Apoptose unabhängig von
Inflammasomen identifizieren.
3.) Die UVB-induzierte Inflammasom-Aktivierung in Keratinozyten führt zur Caspase-1-abhängigen
unkonventionellen Sekretion von Proteinen ohne Signalsequenz, welche die klassische Route durch
das endoplasmatische Retikulum und den Golgiapparat umgehen. Wir führten ein iTRAQ-TAILSExperiment durch, um sezernierte Proteine und Caspase-1-Substrate zu identifizieren, welche die
Caspase-1-Aktivierung und die unkonventionelle Proteinsekretion regulieren. Mögliche Kandidaten
schlossen verschiedene unkonventionell sezernierte Proteine ein, unter anderem auch Mitglieder der
Annexin-Proteinfamilie. Weitere Experimente bestätigten die Caspase-1-abhängige Sekretion
verschiedener Annexine und anderer Kandidaten. Die Expression von drei Mitgliedern der
Annexinfamilie wurde für die Inflammasom-Aktivierung in menschlichen Keratinozyten benötigt.
Interessanterweise interagieren Annexin A2, das am besten charakterisierte Familienmitglied, und sein
Bindungspartner S100A10 mit Caspase-1 auf endogener Ebene. Experimente mit dendritischen Zellen
die durch Differenzierung von Knochenmarkszellen von S100A10-defizienten Mäuse erhalten
wurden, oder mit Makrophagen von Annexin A2-defizienten Mäuse zeigten, dass die Expression von
S100A10 für eine effiziente Inflammasom-Aktivierung nötig ist. Annexin A2 scheint zur
Inflammasom-Aktivierung in Mausmakrophagen nicht beizutragen.
4.) Die Infektion von Keratinozyten mit den DNA-Viren Modified vaccinia Ankara (MVA) und
Herpes simplex virus (HSV)-1 induziert die Sekretion von IL-1β und IL-18. Die Sekretion ist dabei
hauptsächlich von der Expression der Komponenten des AIM2 Inflammasoms abhängig, aber auch
andere Inflammasome tragen zur Zytokinaktivierung bei. Die HSV-1-induzierte IL-1β-Produktion ist
sehr niedrig, kann aber mittels Vorstimulation der Keratinozyten mit IFN-γ stark erhöht werden.
Zusätzlich sind Keratinozyten durch die IFN-γ-Stimulation resistenter gegenüber MVA-und HSV-1Infektionen. Wir konnten zeigen, dass HSV-1 die ProIL-1β-Expression und die InflammasomAktivierung unterdrückt. Dies geschieht hauptsächlich über posttranskriptionelle Mechanismen, die
von viraler Genexpression abhängen. Mit der HSV-1-Infektion ex vivo in humaner Haut haben wir ein
physiologisch relevantes Modell etabliert. Unsere Resultate legen nahe, dass von Keratinozyten
sezerniertes IL-1β/IL-18 und von NK- oder T-Zellen, ausgeschleustes IFN-γ einen positiven Feedback
Loop bilden, um eine HSV-1-Infektion von Keratinozyten der Haut unter Kontrolle zu bringen.
Zusätzlich könnte IFN-γ eine neue Behandlungsmöglichkeit für immunsupprimierte Patienten mit
wiederkehrenden HSV-1-induzierten Hautläsionen darstellen.
Zusammengefasst liefern die in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse einen wichtigen Beitrag
zum Verständnis der Fähigkeit von Keratinozyten, auf inflammatorische Reize, wie zum Beispiel
UVB-Strahlung oder Virusinfektion, mit Caspase-1- und Caspase-4-abhängigen Mechanismen zu
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Zusammenfassung
antworten. Dies schliesst die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, aber auch den
apoptotischen Zelltod ein.
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Summary
Summary Keratinocytes are the major cell type of the multi-layered epidermis, which is the outermost part of the
human body and its first line of defense. These cells are generally not considered as professional
immune cells, but they share immunological properties with cells of the innate and adaptive immune
system. Basal keratinocytes express components of inflammasomes, which are multiprotein complexes
sensing danger signals caused by cell damage or infection. Assembly of inflammasomes results in
activation of the protease caspase-1, which in turn processes the proinflammatory cytokines prointerleukin(IL)-1β and proIL-18 to their active forms, resulting in inflammation in vivo. Irradiation of
keratinocytes with UVB is known to induce inflammasome activation but also apoptosis.
During my thesis, I investigated the role of caspase-1 and of caspase-1-binding proteins in
inflammasome activation and apoptosis using UVB-irradiated and virus-infected human primary
keratinocytes. The results can be summarized in four parts.
1.) The inflammatory caspase-1 and murine caspase-11 have been intensely studied in the last 20
years. However, not much was known about caspase-4, the putative human homolog of caspase-11.
We investigated a possible role of caspase-4 in inflammasome activation and could demonstrate that
UVB-induced NLRP3 inflammasome activation in human primary keratinocytes is dependent on
caspase-4 expression and activity. Further, we could demonstrate that caspase-4 is required for the
activation of the NLRP3 and AIM2 inflammasomes in the human monocytic THP-1 cell line. Coimmunoprecipitation experiments revealed a direct interaction of caspase-1 with caspase-4. With these
results, we identified an important function of the so far poorly characterized caspase-4 in
inflammasome activation in human cells.
2.) UVB irradiation induces inflammasome activation in keratinocytes and an inflammatory response
in the skin in vivo, known as sunburn. Further, UVB is a classical inducer of apoptosis in keratinocytes
and other cell types. Interestingly, we observed that these processes occur in a timely separated
manner with inflammasome activation preceding apoptosis. Caspase-1 and caspase-4 are both required
for these processes in human cells. Using different approaches, we demonstrated that the induction of
apoptosis occurs independently of other inflammasome components. The antiapoptotic protein Bap31
was identified as a putative substrate of caspase-1 by an iTRAQ-TAILS approach. Gain- and loss-offunction experiments demonstrated a critical role of Bap31 in UVB-induced apoptosis. Therefore, we
identified a novel and unexpected role of caspase-1 in UVB-induced apoptosis of keratinocytes that is
independent of inflammasomes.
3.) UVB-induced inflammasome activation in keratinocytes results in caspase-1-dependent
unconventional secretion of leaderless proteins, which bypasses the classical route through the
endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. We performed an iTRAQ-TAILS screen to identify
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Summary
secreted proteins and caspase-1 substrates regulating caspase-1 activation and non-classical protein
secretion. Obtained candidate proteins include several unconventionally secreted proteins, among
them members of the annexin family. Additional experiments confirmed a caspase-1-dependent
unconventional secretion of annexins and other candidate proteins. Most importantly, expression of
three annexin family members was required for inflammasome activation in human keratinocytes.
Interestingly, annexin A2, the best characterized family member, and its binding partner S100A10
interacted with caspase-1 at the endogenous level. Experiments with macrophages and bone marrowderived dendritic cells isolated from mice lacking annexin A2 or S100A10 expression, respectively,
revealed a requirement of S100A10 expression for efficient inflammasome activation. However,
annexin A2 is dispensable for IL-1β production in murine macrophages.
4.) Infection of keratinocytes with the double-stranded (ds) DNA viruses Modified vaccinia Ankara
(MVA) and Herpes simplex virus (HSV)-1 induces secretion of IL-1β and IL-18. This secretion is
mainly dependent on expression of the AIM2 inflammasome. However, also other types of
inflammasomes contribute to cytokine activation. HSV-1-induced IL-1β production is extremely low,
but can be strongly enhanced by IFN-γ priming of keratinocytes. In addition, IFN-γ priming renders
keratinocytes more resistant to MVA and HSV-1 infection. We could demonstrate that HSV-1
suppresses proIL-1β expression and inflammasome activation mainly by posttranscriptional
mechanisms that depend on viral gene expression. We established with ex vivo HSV-1-infected human
skin a physiologically relevant infection model. Our results suggest that IL-1/IL-18 produced by
keratinocytes and IFN-γ derived from NK or T cells form a positive feedback loop for the control of
HSV-1 infection of keratinocytes in human skin. In addition, IFN-γ may represent a novel treatment
option for immunocompromised patients suffering from recurrent HSV-1 skin lesions.
Taken together, the findings described in this thesis further elucidate the ability of keratinocytes to
respond to inflammatory stimuli, such as UVB irradiation or viral infection, with caspase-1- and
caspase-4-dependent responses, including release of proinflammatory cytokines but also apoptotic cell
death.
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