Dokument_44.

Aus der Strahlenklinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
_________________________________________________________
Vergleich der Strahlensensitivität von Zellen aus
oralen Plattenepithelkarzinomen und gesunder
Mundschleimhaut
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Judith Bäumler
aus
Bamberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. J. Schüttler
Referent:
PD Dr. L. Distel
Korreferent:
Prof. Dr. R. Fietkau
Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juli 2010
Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow.
The important thing is not to stop questioning.
Albert Einstein
1
Zusammenfassung ......................................................................1
1.1 Hintergrund und Ziele.....................................................................1
1.2 Methoden .......................................................................................1
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ....................................................2
1.4 Praktische Schlussfolgerungen......................................................2
2
Summary.......................................................................................3
2.1 Background and aims ....................................................................3
2.2 Methods .........................................................................................3
2.3 Results and observations...............................................................4
2.4 Conclusion .....................................................................................4
3
Einleitung......................................................................................5
3.1 Histon H2ax ...................................................................................9
3.2 Pml NBs .......................................................................................15
3.3 Protein p53...................................................................................17
4
Material und Methoden ..............................................................17
4.1 Patienten......................................................................................17
4.2 Immunostaining............................................................................18
4.2.1
Prinzip......................................................................................18
4.2.2
Zellvorbereitung.......................................................................18
4.2.3
Röntgenbestrahlung ................................................................23
4.2.4
Fixierung und Permeabilisierung .............................................20
4.2.5
Fluoreszenzfärbung.................................................................20
4.2.6
Apoptotische Zellen .................................................................27
4.2.7
Auswertung..............................................................................28
5
Ergebnisse..................................................................................26
5.1 H2ax.............................................................................................30
5.2 Pml NBs .......................................................................................32
5.3 Kolokalisation von γ-H2ax- und Pml-Foci.....................................34
5.4 p53 ...............................................................................................35
5.5 Apoptose......................................................................................37
6
Diskussion..................................................................................35
7
Literaturverzeichnis ...................................................................41
8
Abkürzungsverzeichnis.............................................................46
9
Anhang........................................................................................48
9.1 Lösungen .....................................................................................52
10
Danksagung ...............................................................................49
11
Lebenslauf ..................................................................................50
1
1 Zusammenfassung
1.1
Hintergrund und Ziele
Neben einer chirurgischen Intervention und der Chemotherapie stellt
die Behandlung mit ionisierender Strahlung einen weiteren Hauptpfeiler
in der gegenwärtigen Therapie des oralen Plattenepithelkarzinoms dar.
Die Radiotherapie verursacht hochreaktive Sauerstoffmoleküle, die eine
Vielzahl von DNA-Schäden hervorrufen. Als besonders gefährlich für
das Zellüberleben sind hierbei die Doppelstrangbrüche anzusehen, da
die Wahrscheinlichkeit ihrer Reparatur erheblich kleiner ist als bei anderen DNA-Schäden. Durch die hohe Vaskularisierung und die damit verbundene gute Sauerstoffversorgung wird das Tumorgewebe durch eine
Bestrahlung stärker geschädigt als gesundes Gewebe. Außerdem weisen Tumorzellen in der Regel ein schlechteres Reparaturvermögen von
DNA-DSBs auf als Normalgewebe. In dieser Arbeit wird nun der Frage
nachgegangen, ob Gewebe aus oralen PLE-Karzinomen auf ionisierende Strahlung sensitiver reagiert als Gewebe aus gesunder Mundschleimhaut. Zudem wird untersucht, wie sich das Reparaturverhalten
der Tumorzellen von demjenigen der Normalgewebszellen unterscheidet.
1.2
Methoden
Untersucht wird die Verteilung von γ-H2ax-, Pml- und p53Ser20-Protein
mittels Immunostaining an Zellen aus PLE-Karzinomen der Mundhöhle
sowie an Zellen aus gesunder Mundschleimhaut. Hierzu wird jedem
untersuchten Patienten ein Tumor- sowie ein Normalgewebspräparat
entnommen. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops werden die Foci visualisiert und nachfolgend mittels Bildanalyseprogramm ausgewertet.
Die Foci-Anzahl wird jeweils vor sowie nach einer Bestrahlung mit 2 Gy
und 1- bzw. 24-stündiger Reparaturzeit ermittelt.
2
1.3
Ergebnisse und Beobachtungen
Die Bestrahlung mit 2 Gy induziert sowohl im Tumor- als auch im
Normalgewebe einen signifikanten Anstieg der γ-H2ax-Foci-Anzahl auf
durchschnittlich 35,52 (Tumorgewebe) bzw. 32,40 (Normalgewebe)
Foci pro Zelle. Nach 24-stündiger Reparaturzeit verbleiben in den Zellen aus oralen PLE-Karzinomen noch 22,08 Foci, während in den Normalgewebszellen ein Rückgang der Foci-Anzahl auf 10,63 beobachtet
werden kann. Die Verteilung der Pml- sowie p53Ser20-Foci ergibt keine
signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe. Gleiches trifft in Bezug auf die Verteilung der apoptotischen Zellen zu, auch
hier verhält sich das Tumorgewebe nicht eindeutig different im Vergleich zum Normalgewebe.
1.4
Praktische Schlussfolgerungen
Somit lässt sich festhalten, dass Gewebe aus oralen PLE-Karzinomen
auf eine Bestrahlung mit 2 Gy ebenso sensitiv reagiert wie Gewebe aus
gesunder Mundschleimhaut. Das Tumorgewebe verfügt jedoch über ein
signifikant geringeres Reparaturvermögen als das Normalgewebe, da
nach 24-stündiger Reparaturzeit lediglich 47 % der entstandenen DSBs
repariert werden, während das Normalgewebe in der Lage ist, 85 % der
entstandenen Schäden zu beheben. Eine Mutation des p53-Gens im
Bereich der Ser20-Phosphorylierungsstelle kann anhand der Ergebnisse ausgeschlossen werden, nicht jedoch eine eventuelle Mutation in
anderen
Bereichen
des
Gens.
Hinweise
auf
eine
veränderte
Pml-Expression lassen sich in Bezug auf das Tumorgewebe ebenso
wenig finden wie eine abweichende Regulierung der Apoptose nach
24 h Reparaturzeit.
3
2 Summary
2.1
Background and aims
In addition to surgical intervention and chemotherapy, treatment by
ionizing radiation is one of the main methods used in the current
therapy of oral squamous cell carcinoma. Radiotherapy causes highly
reactive oxygen species that induce considerable DNA damage.
Double-strand breaks are particularly dangerous as regards cell survival
because the probability of their repair is considerably smaller than with
other DNA damage. Due to high vascularization and the resulting high
degree of oxygenation, tumor tissue is more strongly affected by
radiation than healthy tissue. In addition, tumor cells tend to have a
poorer capacity for the repair of DNA double-strand breaks than does
normal tissue. In this dissertation we now consider the question as to
whether tissue from oral squamous cell carcinoma reacts more
sensitively to ionizing radiation than tissue from healthy oral mucosa.
Moreover, it is determined in which way the repair behavior of the tumor
cells differs from that of healthy oral mucosa cells.
2.2
Methods
The dissertation explains the distribution of γ-H2ax, Pml and p53Ser20
protein among oral squamous cell carcinoma cells and healthy oral
mucosa cells using immunostaining. Oral squamous cell carcinoma
tissue is collected from every patient studied, as well as tissue from
healthy oral mucosa. The resulting foci are visualized and analyzed
using a fluorescence microscope and an image analysis software. The
foci numbers are determined in each case before and after irradiation
with 2 Gy and repair times of 1 and 24 h.
4
2.3
Results and observations
Irradiation with 2 Gy induces in both tumor and normal tissue a
significant increase in the number of γ-H2ax foci, with averages of
35.52 (tumor tissue) and 32.40 (normal tissue) foci per cell. After 24 h of
repair time, 22.08 foci still remain in the cells of oral squamous cell
carcinoma, whereas in cells of healthy oral mucosa a decline to 10.63
foci is observed. The distribution of Pml and p53Ser20 foci reveals no
significant differences between tumor and normal tissue. The same is
true in relation to the distribution of apoptotic cells, the behavior of the
tumor tissue is also not clearly different in comparison to normal tissue.
2.4
Conclusion
We observe that tissue from oral squamous cell carcinoma reacts to
irradiation with 2 Gy as sensitively as tissue from healthy oral mucosa.
The tumor tissue has however a significantly lower capacity for repair
than normal tissue because it could repair within 24 h only 47 % of the
resulting double-strand breaks, whereas the normal tissue is capable of
repairing 85 % of the incurred damage. A mutation of the p53 gene in
the Ser20-phosphorylation domain can be excluded from the results,
but not a possible mutation in other areas of the gene. Evidence of a
changed Pml expression and a different regulation of apoptosis after
24 h of repair time related to the tumor tissue are not found.
5
3 Einleitung
Maligne Neoplasien stellen nach Herz- Kreislauferkrankungen die
zweithäufigste Todesursache in Deutschland dar. Im Jahr 2004 umfasste die Zahl der jährlichen Krebsneuerkrankungen ca. 436 000 Fälle,
wobei Männer etwas häufiger betroffen waren als Frauen. Mit 7 620
Fällen rangieren die Neoplasien von Mundhöhle und Rachen bei den
männlichen Patienten an 7. Stelle, bei weiblichen Patienten auf Platz 15
der Statistik (2 780 Neuerkrankungen/Jahr, basierend auf den Zahlen
der Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland
e. V. in Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut in Berlin). PLEKarzinome stellen mit über 90 % den größten Anteil der bösartigen Erkrankungen der Mundhöhle (Morse et al. 2007), wobei ein Großteil aus
Präkanzerosen hervorgeht (Morse 2007; Scheifele et al. 1998). Ein Ansteigen der 5-Jahres-Überlebensrate konnte trotz intensiver Forschung
in den letzten Jahren nicht festgestellt werden (Ota et al. 2008; Sudbo
2004), sie liegt gegenwärtig bei ca. 50 % (Kah et al. 2007; Sticht et al.
2008). Als Prädilektionsstellen sind der laterale Zungenrand, der Mundboden sowie die Zungenunterseite zu erwähnen. Die Entstehung eines
PLE-Karzinoms ist multifaktoriell, wobei als wichtigste Risikofaktoren
anhaltend erhöhter Tabak- u. Alkoholkonsum hervorzuheben sind
(Campisi et al. 2009; Lagergren et al. 2000; Morse 2007). Obwohl Alkohol selbst nicht als Karzinogen anzusehen ist, besteht bei Menschen
mit gleichzeitigem Alkohol- und Tabakabusus ein erhöhtes Risiko, an
einem oralen PLE-Karzinom zu erkranken (Castellsague et al. 1999).
Als Ursache hierfür ist die durch Alkoholabusus entstehende erhöhte
Permeabilität der Mundschleimhaut gegenüber Karzinogenen des Tabaks anzusehen (vor allem tabakassoziierte Nitrosamine, polyzyklische
Kohlenwasserstoffe). Tabak und Alkohol reagieren somit synergistisch
(Morse 2007). Zudem besteht die Gefahr der Feldkanzerisierung, da
alle oralen Epithelien, die dem Tabakrauch und dem Alkohol ausgesetzt
sind, mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Neoplasie entwickeln als
6
nicht-exponierte Epithelien (Martin et al. 2008). Desweiteren finden Risikofaktoren wie Mangelernährung (speziell Eisenmangel), Immundefizienz oder -suppression, ionisierende Strahlung, Tätigkeiten in der
Holz- u. Nickelindustrie sowie eine Infektion mit Viren (Nachweis von
HPV-DNA in ca. 20 % der PLE-Karzinome) in der Literatur Erwähnung.
Der Verzehr von Obst und Gemüse reduziert hingegen das Risiko, an
einem oralen PLE-Karzinom zu erkranken (King et al. 2007).
Die Tumordiagnostik erfolgt mittels Anamnese, klinischer Untersuchung, bildgebender Verfahren sowie einer Biopsie.
Zur Klassifizierung der Erkrankung wird das von Pierre Denoix entwickelte TNM-System angewendet, welches unter anderem Hilfe bei der
Behandlungsplanung und einen Hinweis auf die Prognose gibt. Die
prätherapeutische klinische Klassifikation (cTNM) ist hierbei von der
posttherapeutischen histopathologischen Klassifikation (pTNM) abzugrenzen. Beurteilt wird die Größe des Primärtumors, der regionäre
Lymphknotenstatus sowie das Vorliegen von Fernmetastasen:
TX:
keine Aussage über den Primärtumor möglich
Tis:
Carcinoma in situ
T0:
kein Hinweis auf einen Primärtumor
T1:
Tumor bis zu 2 cm im Größendurchmesser
T2:
Tumor zwischen 2 und 4 cm im Größendurchmesser
T3:
Tumor mehr als 4 cm im Größendurchmesser
T4:
jeder Tumor, unabhängig von der Tumorgröße, der Nachbarstrukturen infiltriert
NX:
Lymphknotenstatus kann nicht beurteilt werden
N0:
kein Hinweis auf regionäre LK-Metastasen
N1:
LK-Metastasen in einem regionären LK bis 3 cm Durchmesser
auf der ipsilateralen Seite
N2a: LK-Metastasen in einem regionären LK zwischen 3 und 6 cm im
Durchmesser auf der ipsilateralen Seite
7
N2b: LK-Metastasen in mehreren regionären LK bis 6 cm Durchmesser auf der ipsilateralen Seite
N2c: LK-Metastasen in einem oder mehreren regionären LK bis 6 cm
Durchmesser auf der kontralateralen Seite oder bilateral
N3:
LK-Metastasen in einem oder mehreren regionären LK über 6 cm
MX:
das Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden
M0:
es liegen keine Fernmetastasen vor
M1:
Fernmetastasen liegen vor
Mithilfe dieser Parameter erfolgt das sogenannte Tumorstaging, durch
das eine Einstufung des Tumors in die jeweilige Kategorie erfolgt.
Stadieneinteilung nach UICC:
Stadium 0:
Tis N0 M0
Stadium Ia:
T1 N0 M0
Stadium Ib:
T2 N0 M0
Stadium IIa:
T3 N0 M0
Stadium IIb:
T4 N0 M0
Stadium IIIa:
Jedes T, N1, M0
Stadium IIIb:
Jedes T, N2, M0
Stadium IV:
Jedes T, jedes N, M1
Die Behandlung des PLE-Karzinoms stützt sich im Wesentlichen auf
operative Maßnahmen, Strahlen- und Chemotherapie. Alternative Behandlungsoptionen wie die Immun- oder Gentherapie befinden sich
derzeit erst im Initialstadium (Deshpande et al. 2008). Die Entscheidung
über eine kurativ oder palliativ ausgerichtete Therapie sowie über die
jeweiligen Behandlungsmaßnahmen wird maßgeblich von der Art des
Tumors (Typing), der Ausbreitung (Staging) sowie dem Malignitätsgrad
(Grading) bestimmt. Beim Tumorgrading werden insgesamt fünf
Differenzierungsgrade unterschieden (GX-G4), wobei die Prognose
8
umso schlechter ausfällt, je entdifferenzierter der Tumor in Erscheinung
tritt. In der Regel weisen PLE-Karzinome der Mundhöhle eine mäßige
bis gute Differenzierung auf.
Ziel des operativen Vorgehens ist eine sogenannte R0-Resektion
(Resektion im Gesunden), zumeist in Verbindung mit einer kurativen
bzw. prophylaktischen Neck dissection. Die Neck dissection wird in der
Regel konservierend ausgeführt, da durch die größtmögliche Schonung
der nichtlymphatischen Strukturen (N. accessorius, V. jugularis, M.
sternocleidomastoideus) die Beeinträchtigungen für den Patienten möglichst gering gehalten werden können. Begleitend hierzu werden je
nach individueller Behandlungsplanung radiotherapeutische bzw. radiochemotherapeutische
neoadjuvant
Intervention
oder
mit
Maßnahmen
adjuvant
durchgeführt,
erfolgen.
postoperativer
Bei
die
primär
Radiochemotherapie
entweder
chirurgischer
erfolgt
eine
Bestrahlung mit 50-72 Gy sowie eine Chemotherapie, bestehend aus
5-FU 800mg/m² KOF und Cisplatin 20mg/m² KOF. Die auf diese Weise
behandelten
Patienten
haben
eine
durchschnittliche
5-Jahres-
Überlebensrate von 56 %. Bei fehlender Operationsmöglichkeit und definitiver Radiochemotherapie (50-72 Gy, 5-FU 800 mg/m², Cisplatin
20mg/m² KOF) beträgt die 3-Jahres-Überlebensrate nur 45,2 %
(Kessler et al. 2008).
Als Nebenwirkungen der Strahlentherapie sind unter anderem Mukositis, Xerostomie, Geschmacksverlust sowie die Osteoradionekrose bekannt (Samant et al. 2005).
Nach Beendigung der Therapie erfolgt eine engmaschige Betreuung
der Patienten im Rahmen der Tumornachsorge, die ein frühzeitiges Erkennen von etwaigen Tumorrezidiven und/oder Zweittumoren gewährleistet.
9
3.1
Histon H2ax
Das Histon H2ax, eine Variante des Histons H2a, nimmt in Säugerzellen eine wichtige Stellung bei der zellulären Antwort nach Auftreten von
DSBs der DNA ein (Liu et al. 2008).
DNA-DSBs sind äußerst gefährliche Läsionen mit schwerwiegenden
Folgen bezüglich des Zellüberlebens und der Aufrechterhaltung der
genomischen Stabilität (Kinner et al. 2008). Sie können einerseits durch
exogene, DNA-schädigende Einflüsse wie z. B. ionisierende Strahlung
hervorgerufen werden oder aber auch während des normalen zellulären
Stoffwechsels oder der Lymphozytenentwicklung in Erscheinung treten
(Zha et al. 2008). In Säugerzellen initiieren sie die Phosphorylierung
von H2ax an Serin 139 des C-Terminus, es entsteht das sogenannte
γ-H2ax (Kinner 2008). Wurde die Phosphorylierung nicht durch genotoxische Umwelteinflüsse hervorgerufen sondern findet in gesunden,
unbehandelten Zellen statt, spricht man auch von „intrinsischer“ oder
„programmierter“ H2ax-Phosphorylierung (Huang et al. 2006). Die
Phosphorylierung von H2ax wird vermittelt durch Proteinkinasen der
PIKK-Familie, genauer gesagt durch Atm, Atr bzw. DNA-Proteinkinasen
(Zha 2008). Die Aktivierung der Einzelnen erfolgt hierbei durch unterschiedliche DNA-Schäden, so tritt beispielsweise Atm bei DSBs und Atr
bei Schädigungen durch ultraviolettes Licht in Aktion (Zhao et al. 2008).
Innerhalb weniger Minuten nach Auftreten einer DNA-Läsion werden
mehrere tausend H2ax-Proteine phosphoryliert, wobei die Phosphorylierung in unmittelbarer Nähe des Schadens initiiert wird und sich
nachfolgend radial ausbreitet. Somit finden sich γ-H2ax-Proteine auch
noch in bis zu einigen Megabasen Entfernung zum ursprünglichen
Strangbruch (Rogakou et al. 1999). Gemeinsam mit Checkpoint- und
Reparaturproteinen wie z. B. 53BP1, MDC1, BRCA1 und Rad51 bildet
γ-H2ax Komplexe, die als nukleäre Foci bezeichnet werden.
10
Abbildung 1: Vereinfachte Darstellung der Nukleosomenstruktur in
der Umgebung von DNA-DSBs (Carpenter, University Texas-Houston Medical School).
Stellen die Foci eine zytologische Manifestation als Antwort auf ionisierende Strahlung dar, so findet der Terminus „IR-induzierte“ Foci Anwendung in der Literatur (Takahashi et al. 2008). Ionisierende Strahlung
verursacht reaktive Formen des Sauerstoffs, welche wiederum die DNA
angreifen und zu Strangbrüchen führen (Pandita et al. 2009). Für die
Reparatur von DSBs sind in diesem Fall sowohl Atm als auch DNAProteinkinasen verantwortlich, die zu einer Phosphorylierung von H2ax
in der Umgebung des DSBs führen. Die Bedeutung der beiden Enzyme
lässt sich auch daran erkennen, dass Atm- bzw. DNA-PK-defiziente
Zellen auf ionisierende Strahlung hypersensitiv reagieren und zudem
DNA-Reparatur-Defekte aufweisen (Bassing et al. 2002). γ-H2ax fungiert somit als Marker für die Strahlenempfindlichkeit einer Zelle. Durch
die Entwicklung eines Antikörpers, der spezifisch an γ-H2ax bindet, ist
11
es nun möglich, diese nukleären Foci mit Hilfe von immunhistochemischen
Methoden
sichtbar
zu
machen
und
unter
dem
Fluoreszenzmikroskop zu betrachten (Huang 2006). Ein Großteil der
DSBs wird innerhalb einiger Stunden repariert, die Anzahl der Foci
reduziert sich somit ebenso (Yoshikawa et al. 2009). Während dieser
Reparaturprozesse
scheint
γ-H2ax
die
Funktion
eines
Ankers
wahrzunehmen, der für die Rekrutierung und korrekte sterische Anordnung der Reparaturkomplexe erforderlich ist. Außerdem hat γ-H2ax
die Aufgabe, die Bruchenden zu fixieren und die Reparatur in Richtung
der fehlerfreieren homologen Rekombination zu lenken. Durch die
sogenannten Checkpointproteine vermittelt es zudem das Signal, dass
eine potentiell letale Läsion vorhanden ist, die der Reparatur bedarf
(Fernandez-Capetillo et al. 2003). Es existiert somit ein komplexes
Protein-Netzwerk innerhalb der Zelle, das in der Lage ist, DNASchäden aufzuspüren, zu reparieren und gegebenenfalls die Apoptose
einzuleiten, falls sich der Schaden als irreparabel erweist (Zha 2008).
Die Bedeutung, die H2ax innerhalb der zellulären Struktur einnimmt
lässt sich an Mäusen verdeutlichen, die eine H2ax-Defizienz aufweisen.
Bei
diesen
ist
eine
genomische
Instabilität
und
Strahlungs-
empfindlichkeit nachweisbar, außerdem sind sie wachstumsretardiert
und immundefizient (Huang 2006).
3.2
Pml NBs
Promyelocytic leukaemia nuclear bodies (Pml NBs) sind kugelförmige,
subnukleäre Zellkompartimente, die auch unter einer Vielzahl von anderen Namen wie z. B. Kremer bodies oder Pml oncogenic domains
bekannt sind (Borden 2002; Dundr et al. 2002). Studien deuten darauf
hin, dass die Pml NBs u. a. an Transkription, Replikation und Reparatur
der DNA, Tumorsuppression, Wachstumskontrolle, Apoptose und
Seneszenz der Zelle beteiligt sind, wobei ihre genaue Funktion derzeit
noch Gegenstand der Forschung ist (Dellaire et al. 2006; Matsuo et al.
12
2008; McNally et al. 2008; Reineke et al. 2009b). In den meisten
gesunden und neoplastischen Geweben sind Pml NBs enthalten
(Matsuo 2008), für gewöhnlich in einer Anzahl von 10-30 pro Kern und
einer durchschnittlichen Größe von 0,2-1,0 µm (Borden 2002; Dundr
and Misteli 2002). Ein Ansteigen der Kernkörperchen lässt sich beispielsweise in der S-Phase der Zelle, nach DNA-Schädigung oder einer
Behandlung mit Interferon nachweisen (Dellaire 2006; Hodges et al.
1998). Das Pml-Protein, welches durch alternatives Spleißen am
C-terminalen Exon in mehreren Isoformen vorliegt, ist essentiell für die
Formierung von Pml-NBs. Darüberhinaus existieren mind. 50 weitere
Proteine wie z. B. SP100, SUMO, p53, CBP und Daxx, die mit diesen
Kernkörperchen assoziiert sein können. Es konnte nachgewiesen
werden, dass einige von ihnen in der Lage sind, direkt an Pml zu
binden, viele jedoch durch Interaktion mit einem anderen Bestandteil
des NBs rekrutiert werden (Moran et al. 2009). Aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung der NBs stellte man die These auf,
dass sie in der Zelle nur eine Speicherfunktion einnehmen und selbst
nicht aktiv sind (Borden 2002). Pml NBs sind innerhalb des Nukleoplasmas mobil, wobei der Großteil räumlich begrenzte, langsame Bewegungen ausführt und nur 12 % in der Lage sind, sich energieabhängig
schneller fortzubewegen; 25 % der NBs sind gänzlich immobil (Muratani
et al. 2002). Es existiert weiterhin eine lösliche Form des Pml-Proteins
in Nukleo- und Zytoplasma, welche sich allerdings durch die zu geringe
Konzentration nicht mit Antikörpern detektieren lässt (Kiesslich et al.
2002). Wichtigste Proteindomäne des Pml-Proteins ist das sog. RBCCMotiv in der N-terminalen Hälfte, welches zu den Cystein-reichen ZinkBinde-Motiven gehört und in allen Isoformen enthalten ist. Es bestheht
aus einer RING-Domäne, zwei B-Boxen und einer Coiled-Coil-Domäne
und vermittelt unter anderem die Interaktion von Pml mit anderen Proteinen (Moran 2009). Wie bereits oben erwähnt wird den Pml NBs auch
eine Rolle bei der DNA-Reparatur zugeschrieben. So erfolgt nach dem
Auftreten eines DNA-Schadens eine Koakkumulation von p53, CBP und
HIPK2 in den Pml NBs, welche einen Beitrag zur geregelten
13
Phosphorylierung (durch HIPK2) und Acetylierung (durch CBP) von p53
leistet. Weiterhin spielt Pml wahrscheinlich auch eine Rolle bei der
Übermittlung von DNA-Schäden. Unklar ist jedoch, ob diese Modifikationen von Pml und Pml NBs für das Fortschreiten der DNAReparatur entscheidend sind oder ob sie nur eine Konsequenz der anhaltenden Reparaturmaßnahmen darstellen. Mit Hilfe von FibroblastenZelllinien konnte des Weiteren nachgewiesen werden, dass die Anzahl
der Kernkörperchen nach Induktion von DSBs zunimmt. Nach DSBInduktion wurde zudem festgestellt, dass sich der Zeitpunkt der größten
Anzahl an Pml NBs mit jenem der höchsten H2ax-Phosphorylierung
deckt (Dellaire 2006).
Das Pml-Gen ist zum Überleben nicht essentiell (Borden et al. 2002).
Pml-„Knock out“-Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, allerdings
anfälliger für virale Infektionen und neoplastische Ereignisse (Wang et
al. 1998). In Tumorzelllinien von z. B. Adeno-, Brust- oder Lungenkarzinomen findet sich eine reduzierte Expression des Pml-Proteins,
eine Tatsache, die auf die tumorsuppressive Wirkung von Pml hinweist
(Moran 2009). Eine Erkrankung, die ebenfalls mit Pml NBs assoziiert
wird, ist die Akute Promyelozytische Leukämie (APL). Ursache der Erkrankung ist eine Fusion der Gene Pml und RARalpha. Bei Patienten,
die an APL erkrankt sind, konnte eine Zerstörung der Kernkörperchen
in den Promyelozyten festgestellt werden, die Proteine der NBs finden
sich dispers im Zellkern verteilt. Ein weiterer Hinweis darauf, dass die
Integrität der Pml NB-Struktur für die Gesunderhaltung der Zelle von
Bedeutung ist (Kiesslich 2002).
3.3
Protein p53
Das Tumorsuppressor-Protein p53, benannt nach seinem Molekulargewicht von 53 kDa (Darnton 1998), ist ein nukleär lokalisierter
Transkriptionsfaktor (Ruiz et al. 2008), welcher als ein zentrales Protein
der Zellzykluskontrolle anzusehen ist. Zu den vielen Zielgenen von p53
14
zählen unter anderem Gene, die bei der Reparatur von DNA-Schäden,
der Regulierung der Apoptose oder der Anti-Angiogenese eine Rolle
spielen (Zhao 2008). In genomisch unauffälligen Zellen liegt p53 in
inaktiver Form, das heißt gebunden an eine E3-Ubiquitin-Ligase vor
(Carter et al. 2008; Lukashchuk et al. 2007; Ruiz 2008). Von allen E3Ubiquitin-Ligasen wurde bisher MDM-2 am besten untersucht (Almazov
et al. 2007; Chumakov 2007). Sie interagiert hierbei mit der N-terminalen Domäne des Proteins und inhibiert somit seine Funktion als
Transkriptionsfaktor (Adams et al. 2006; Lukashchuk and Vousden
2007). Erfolgt jedoch eine Schädigung der DNA, wird p53 durch
Phosphorylierung (u.a. durch Atm, DNA-Pks oder Chk2) in den aktiven
Zustand überführt, wobei sich der Konformitätszustand von p53 ändert
und MDM-2 abdiffundiert (Zhao 2008). In der Zelle erfolgt somit eine
Stabilisierung und Akkummulation des Proteins (Adams and Carpenter
2006).
Abbildung 2: DNA-Schäden führen zu einer Aktivierung von
Proteinkinasen der PIKK-Familie (Atm, DNA-PK und Atr). Diese
aktivieren wiederum die Checkpointkinasen (CHK1 und CHK2) und
p53.
Aktiviertes
p53
vereinigt
die
Ergebnisse
des
Signalnetzwerkes und ist für das weitere Schicksal der Zelle
verantwortlich (Rodier et al. 2007).
Nachfolgend existieren für die normale Säugerzelle vier Optionen, den
entstandenen Schaden zu reparieren und damit die Integrität des
15
Genoms sicherzustellen (Rodier 2007; Zhang et al. 2009). Zuerst erfolgt
in allen Fällen eine Arretierung des Zellzyklus, um somit die Proliferation einer genomisch entarteten Zelle zu verhindern und selbiger
Zeit für eine entsprechende Reparatur einzuräumen (Darnton 1998).
Dieser Zellzyklus-Stop ist assoziiert mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren wie z. B. dem Protein p21, welches nach DNASchädigung und nachfolgender Akkumulation von p53 vermehrt
synthetisiert wird (Darnton 1998). p21 bindet die CDK2 und CDK4 und
hemmt somit die Phosphorylierung ihrer Substrate, so z. B. des Rb105.
Der Rb105-E2F-DP1-Komplex bleibt dadurch intakt und die Zelle wird
so an einem Eintreten in die S-Phase gehindert (Chumakov 2007). Im
günstigsten Falle handelt es sich um einen Schaden von eher geringem
Ausmaß, der von der Zelle angemessen behoben werden kann. Die
Arretierung des Zellzyklus wird nach erfolgreicher Reparatur durch ein
Abfallen des p53-Spiegels wieder aufgehoben, die Zelle ist somit
wieder zur Proliferation befähigt. Handelt es sich jedoch um einen
schwerwiegenden DNA-Schaden der sich nachfolgend als irreparabel
herausstellt, so wird entweder der programmierte
Zelltod,
die
sogenannte Apoptose, oder die zelluläre Seneszenz eingeleitet (Zhang
2009). Hierbei ist es unter anderem von Bedeutung, von welcher
Gewebeart die betroffenen Zellen abstammen. So leiten Zellen mit
lymphoider Abstammung nach schwerwiegendem DNA-Schaden für
gewöhnlich die Apoptose ein, während sich Stromazellen der Seneszenz unterziehen (Rodier 2007). Die Proliferation von Zellen mit
geschädigtem Erbgut wird somit entweder durch das Absterben der
Zelle oder im Falle der Seneszenz durch einen dauerhaften
Wachstumsstop verhindert. Im für den Organismus ungünstigsten Fall
erlangt eine Zelle mit irreparablem DNA-Schaden wieder die Fähigkeit
zur Proliferation. Es besteht bei einer Zellteilung somit das Risiko einer
erhöhten Mutationsfrequenz, ein Szenario, welches die Entstehung von
Krebs begünstigen kann (Rodier 2007).
16
Aufgrund seiner essentiellen Funktion zur Erhaltung der genomischen
Integrität bezeichnet man p53 auch als Wächter des Genoms (Bauer et
al. 2006; Darnton 1998; Rodier 2007).
Eine Mutation von p53 findet sich in ca. 50-60 % aller menschlichen
Tumoren (Adams and Carpenter 2006; Darnton 1998; Lukashchuk and
Vousden 2007; Riley et al. 2007), wobei das defekte Protein nicht die
Ursache der Erkrankung ist, sondern das Unvermögen des Körpers,
gegen eine Zellentartung frühzeitig vorzugehen und somit die Entstehung eines Tumors zu verhindern. p53 ist das Gen, welches in
menschlichen Tumoren am häufigsten eine Mutation aufweist (Pietsch
et al. 2008).
Bestrahlungs- u. Chemotherapie bei Patienten mit mutiertem p53 zeigen weniger Wirkung, da die so entstehenden genomgeschädigten
Zellen nicht mehr mit Hilfe des p53-Pathways und der Apoptose eliminiert werden können (Ferrari et al. 2009).
Intention dieser Arbeit ist die Untersuchung der Strahlenempfindlichkeit
von Zellen aus oralen PLE-Karzinomen und gesunder Mundschleimhaut. Es wird der Frage nachgegangen, wie viele DSBs nach einer
Bestrahlung mit 2 Gy in den Zellen auftreten. Außerdem ist es Ziel
herauszufinden, ob das Reparaturvermögen der Tumorzellen ebenso
effizient wie jenes der Normalgewebszellen ist. Als Marker für die DSBs
und somit als Maß für die Strahlenempfindllichkeit dient in den
Versuchen γ-H2ax. Desweiteren wird die Verteilung von Pml- und
p53Ser20-Protein sowie der Anteil der apoptotischen Zellen untersucht.
17
4 Material und Methoden
4.1
Patienten
n
Alter (Jahren) Mittelwert
63 (45-80)
Geschlecht
männlich
13
weiblich
7
Tumorlokalisation
Mundboden anterior
6
OK
1
Oropharynx
1
UK
7
Unterlippe
1
Wange
2
Zunge
2
Primärtumor
T1
6
T2
6
T3
1
T4
7
LK-Status
N0
4
N1
6
N2
10
Fernmetastasen
M0
20
Differenzierung
G1
3
G2
14
G3
3
18
4.2
4.2.1
Immunostaining
Prinzip
Das Immunostaining stellt eine Methode dar, mit welcher bestimmte
Kernproteine unter Zuhilfenahme von Antikörpern sichtbar gemacht
werden können. In dieser Arbeit kommt die indirekte Methode der
Immunfluoreszenz zur Anwendung, d. h. es wird zuerst ein sogenannter
Primärantikörper verwendet, der aus einer bestimmten Tierart gewonnen wird und gegen das zu untersuchende Protein (Epitop) gerichtet ist.
Dieser Antikörper soll sich durch eine möglichst hohe Affinität und
Spezifität auszeichnen und keine Reaktionen mit anderen Epitopen
zeigen. Im zweiten Schritt wird nun der Sekundärantikörper aufgetragen, welcher mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist und
gegen den Primärantikörper gerichtet ist. Erst hierdurch können die
durch den Primärantikörper markierten Proteine als Foci unter dem
Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.
4.2.2
Zellvorbereitung
Die Versuche wurden in Zusammenarbeit mit der Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgischen Klinik in Erlangen durchgeführt, wobei Zellen aus
Gewebeproben von PLE-Karzinomen der Mundhöhle und gesunder
Schleimhaut untersucht wurden. Hierzu wurde jedem Patienten ein Tumor- sowie ein Normalgewebspräparat entnommen, wobei letzteres aus
unmittelbarerer Umgebung zum PLE-Karzinom stammte. Nach Zerkleinerung des Gewebes mittels Skalpell und anschließender Überführung
in gentleMACS C-Tubes erfolgte die Zugabe von 5 ml Enzymlösung
bestehend aus 1xPBS, Collagenase 0,1 %, Trypsin 0,1 % sowie Hyaluronidase 0,2 %. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten wurden die
C-Tubes nun auf den gentleMACS Dissociator aufgesteckt und der Dis-
19
soziationsvorgang gestartet. Daraufhin erfolgte eine 15-minütige Inkubation auf dem Rüttler im Brutschrank bei 37 °C (5 % CO2). Die Suspension wurde anschließend für 8 Min. bei 170 g zentrifugiert und der
hierduch entstehende Überstand in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert.
Zu den verbliebenen Gewebestückchen in den C-Tubes wurde 2 ml
Medium gegeben und erneut der Dissoziationsvorgang gestartet. Nach
abermaligem Zentrifugieren für 8 Min. bei 170 g wurde der Überstand
ebenfalls in das Zentrifugenröhrchen abpipettiert. Die somit erhaltene
Zellsuspension wurde in der Zentrifuge in Zellpellet und Überstand aufgetrennt, wobei letzterer verworfen wurde und das Zellpellet mit 1,5 ml
Medium (Dulbeccos-Mem: 3,7 g/l NaHCO3, 4,5 g/l D-Glucose, Na-Pyruvate, L-Glutamine, Phenol red, 10 % FKS, 1 % Penicillin, 1 % Streptomycin) resuspendiert wurde. Anschließend erfolgte ein Verteilen der
Suspension auf drei Zentrifugenröhrchen, die der Reparaturzeit entsprechend beschriftet wurden.
4.2.3 Röntgenbestrahlung
Bestrahlt wurden die Zellen, mit Ausnahme der Kontrollen, mit einer
Isovolt Titan Röntgenröhre (120 kV; General Electrics, Ahrensburg,
Deutschland) mit 2 mm Aluminium-Filter, wobei die Dosis 2 Gy betrug.
Nach dieser Strahlenbehandlung wurden die Zellen für 1 h bzw. 24 h
zurück in den Brutschrank gestellt. Die Kontrollproben konnten sofort
mit Hilfe der Cytofuge (Cytospin 2, Fa. Shandon) bei 10 000 Umdrehungen pro Minute auf StarFrost-Objektträger aufzentrifugiert werden,
die restlichen Proben nach entsprechender Reparaturzeit. Der Zentrifugiervorgang dauerte jeweils 10 Min., wobei pro Objektträger 100 µl
Suspension mit ca. 150 000 Zellen verwendet wurden.
20
4.2.4
Fixierung und Permeabilisierung
Zur Fixation der Zellen und Permeabilisierung der Zellmembranen
wurde eine 4%-ige Formaldehyd-Lösung mit 0,1% TritonX-100 zu den
Objektträgern gegossen und die Küvette für 15 Min. unter den Abzug
gestellt. Nach Abdekantieren der Fixierlösung erfolgte ein dreimaliger
Waschvorgang mit 1xTBS-Lösung für jeweils 5 Min. auf dem Rüttler. Zu
den gewaschenen Objektträgern wurde nun ein Blockierpuffer gegossen, der über Nacht oder länger in der Küvette verblieb.
4.2.5
Fluoreszenzfärbung
Nachdem der Blockierpuffer aus der Küvette entfernt wurde schloss
sich ein erneuter dreimaliger Waschvorgang mit 1xTBS-Lösung auf
dem Rüttler an. Die Objektträger wurden nun auf Papiertücher gelegt
und vorsichtig getrocknet. Jetzt erfolgte das Auftragen der Primärantikörper, welche in einer zuvor ausgetesteten Konzentration mit 1 % BSA
in 1xTBS-Lösung angesetzt wurden. Pro Objektträger kamen 10 µl der
Primärantikörperlösung zum Einsatz, die jeweils mit einem Coverslip
bedeckt wurden. Hierbei konnten jeweils zwei verschiedene Antikörper
gleichzeitig aufgetragen werden, jedoch nur, wenn die Antikörper nicht
von derselben Tierart gewonnen wurden.
21
Tabelle 1: Primärantikörper für Immunostaining
Antikörper
Hersteller
Anti-H2ax Ser139 (mouse)
Upstate,
Konz.
New
York, 1:1500
New
York, 1:50
U.S.A.
Anti-Pml (rabbit)
Upstate,
U.S.A
Anti-p53Ser20 (rabbit)
Cell Signaling, Danvers, 1:50
Ma, U.S.A.
Zur Inkubation der Primärantikörper wurden die Objektträger über
Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die
Coverslips wurden anschließend von den Objektträgern entfernt und
letztere abermals dreimal mit 1xTBS-Lösung für je 5 Min. auf dem
Rüttler gewaschen. Nach anschließendem Trocknen konnte nun der mit
Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte
Sekundärantikörper
aufgetragen
werden, der analog zum Primärantikörper je nach ausgetesteter Konzentration mit 1 % BSA in 1xTBS-Lösung angesetzt wurde. Es wurden
wiederum 10 µl Flüssigkeit pro Objektträger aufgetragen und mit einem
Coverslip bedeckt.
Tabelle 2: Sekundärantikörper (fluoreszierend) für Immunostaining
Antikörper
Hersteller
Konz.
Alexa Fluor 488 goat anti- Molecular
Probes, 1:200
mouse
Göttingen, Deutschland
Alexa Fluor 555 donkey anti- Molecular
rabbit
Probes, 1:500
Göttingen, Deutschland
22
Bei zwei verschiedenen gleichzeitig aufgetragenen Primärantikörpern
war zu beachten, jeweils einen Sekundärantikörper mit grünem Farbstoff gegen den einen und einen Sekundärantikörper mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gegen den anderen der beiden Primärantikörper zu verwenden. Nach 3,5 h Inkubation in der feuchten Kammer und anschließendem dreimaligem Waschen mit 1xTBS-Lösung erfolgte jetzt die Gegenfärbung mit DAPI, welches den Zellkern unter dem Fluoreszenzmikroskop blau erscheinen lässt. Jeder Objektträger wurde mit 20 µl Flüssigkeit beschickt und für 1 Min. mit einem Coverslip bedeckt. Nach Entfernung derselbigen wurden die Objektträger mehrmals in destilliertem
Wasser geschwenkt und unter Alufolie zum Trocknen aufgestellt. Das
Eindecken erfolgte mit 20 µl Vectashield (Linaris GmbH, Wertheim,
Deutschland), welches auf die Objektträger pipettiert und mit Deckgläsern abgedeckt wurde.
DAPI
Pml
Merged
Abbildung 3: Beispiel für Immunostaining mit PLE-Karzinom-Zellen. Der Zellkern erscheint durch ein Anfärben mit DAPI unter dem
Fluoreszenzmikroskop blau, die Pml-NBs durch eine Färbung mit
anti-Pml rot. Das Zytoskelett der Zelle wurde mit anti-α-Tubulin
grün angefärbt. Gut erkennbar ist die Verschiebung der KernPlasma-Relation zugunsten des Zellkerns.
23
4.2.6 Apoptotische Zellen
Abbildung 4: Bildanalyseprogramm Biomas: Im Vordergrund ist
der Zellkern einer apoptotischen Zelle abgebildet, welcher fast
vollständig mit γ-H2ax-Protein ausgefüllt ist.
Eine Zelle, deren Kern fast vollständig mit γ-H2ax-Protein ausgefüllt
war, wurde als apoptotische Zelle definiert. Dies wurde durch die Tatsache begründet, dass in jenen Zellen die Schäden an der DNA so
komplex und schwerwiegend waren, dass eine Reparatur nicht mehr
möglich war und daraufhin die Einleitung der Apoptose erfolgte. Abschließend wurde bestimmt, wie groß der Prozentsatz der Apoptosezellen gemessen an der vorher bestimmten Gesamtzellzahl war.
24
4.2.7 Auswertung
Die Auswertung der Versuche erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop
sowie dem Bildanalyseprogramm Biomas.
Biomas-Software, Version 4.5 1/2008, PD Dr. med. L. Distel, Erlangen,
Deutschland
Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops wurden zuerst drei Bilder aufgenommen: zwei Bilder mit den rot bzw. grün angefärbten Proteinen sowie ein Bild des mit DAPI blau gefärbten Zellkerns. Das Programm Biomas selektierte und umrandete die Zellkerne und legte somit deren genaue Lage fest. Es erfolgte eine Fusion des blauen und roten Bildes
sowie eine Überprüfung der korrekten Lage beider Bilder, welche gegebenenfalls korrigiert wurde. Analog wurde mit dem roten Bild im Vergleich zum grünen Bild verfahren. Nun erfolgte das Markieren der Foci
durch das Programm, wobei nicht erkannte Foci manuell hinzugefügt
bzw. zu viel markierte Foci wieder entfernt wurden. Nach Bestätigung
der Eingabe wurden folgende Daten für beide Proteine in eine ExcelTabelle übertragen:
- Anzahl der Foci
- Kolokalisation der Proteine
- Fläche der Foci (µm²)
- Durchschnittliche Helligkeit der Foci (Luminance in Graustufen)
- Maximale Helligkeit (Luminance in Graustufen)
- Fläche der Kerne (µm²)
- Helligkeit der Kerne (Luminance in Graustufen)
25
Abbildung 5: Darstellung der Auswertung mit Hilfe des Bildanalyseprogramms Biomas. Im Vordergrund ist eine Normalgewebszelle
abgebildet, deren p53Ser20-Foci rot markiert sind.
26
5
Ergebnisse
Ziel der nachfolgenden Arbeit war es aufzuzeigen, ob und inwiefern
sich die Anzahl der DSBs nach Bestrahlung und entsprechender Reparaturzeit in Tumorzellen und humanen Keratinozyten unterscheidet.
Desweiteren wurde die Interaktion zwischen γ-H2ax- und Pml-Protein
sowie die Verteilung der apoptotischen Zellen untersucht. Außerdem
wurde mit Hilfe des Proteins p53 der Frage nachgegangen, wie die Reparatur der DNA-DSBs in Tumorzellen und Keratinozyten reguliert wird.
5.1
H2ax
Phosphoryliertes H2ax (γ-H2ax) dient als Marker von DNA-DSBs im
Zellkern, wobei die Phosphorylierung nach Bestrahlung durch Atm an
Ser139 am C-Terminus erfolgt. Mit Hilfe immunhistochemischer
Methoden werden die DNA-DSBs als γ-H2ax-Foci unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, wodurch nun auf die Anzahl der DSBs im
Zellkern geschlossen werden kann. Deshalb wurde die Induktion von
γ-H2ax-Foci nach 1 h und 24 h im Immunostaining betrachtet, sowohl
bei Tumorzellen als auch bei gesunden Schleimhautzellen. Die Anzahl
der Foci in den unbestrahlten Kontrollen war im Tumor- und im Normalgewebe mit 6,72 bzw. 6,55 Foci nahezu identisch (p=0,702), es konnte
somit kein Unterschied in der Anzahl der spontan autretenden DSBs in
den verschiedenen Geweben festgestellt werden. Betrachtete man die
Foci-Anzahl nach Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit, so war
ein signifikanter Anstieg in beiden Geweben zu verzeichnen, wobei in
Tumorzellen der Wert mit durchschnittlich 35,52 Foci pro Zelle
(p<0,001)
noch
etwas
höher
ausfiel
als
im
Normalgewebe
(N: 32,40 Foci/Zelle; p<0,001). Nach Bestrahlung der Gewebeproben
mit 2 Gy und anschließender 24-stündiger Reparaturzeit war zwischen
Tumor- und Normalgewebe ein deutlicher Unterschied erkennbar, da
27
die γ-H2ax-Foci-Anzahl im Tumorgewebe mehr als doppelt so hoch
ausfiel wie bei gesunder Schleimhaut (p<0,001). Bei letzterer betrug die
durchschnittliche Foci-Anzahl 10,63, wohingegen im Tumorgewebe ein
Wert von 22,08 ermittelt wurde (Abb. 6/7). Es konnte somit festgestellt
werden, dass in den untersuchten Tumorzellen nach 24 h weit weniger
DNA-DSBs repariert wurden als in den Zellen der gesunden
Mundschleimhaut.
Abbildung 6: Immunostaining mit Tumor- und Normalgewebszellen. Anzahl der γ-H2ax-Foci nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf. Dargestellt sind sowohl die Einzelwerte aller untersuchten Patienten als auch die Mittelwerte.
* Besonders hervorzuheben ist der signifikante Unterschied nach
Bestrahlung mit 2 Gy und 24-stündiger Reparaturzeit zwischen
Tumor- und Normalgewebe (p<0,001).
28
DAPI
H2ax
Merged
Kontrolle
2 Gy/1h
2 Gy/24h
Abbildung 7: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-γ-H2ax. Darstellung der γ-H2ax-Foci pro
Zelle nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.
5.2
Pml NBs
Neben den γ-H2ax-Foci wurde des Weiteren die Verteilung der
Pml NBs nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf betrachtet
sowie die Kolokalisation beider Proteine. Pml NBs sind in nahezu allen
gesunden und neoplastischen Geweben enthalten und an einer Vielzahl
von Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt, unter anderem auch an
Reparaturprozessen der DNA. Betrachtete man nun die Anzahl der
Pml-NBs in den unbestrahlten Kontrollproben, so war zwischen Tumorund Normalgewebe kein signifikanter Unterschied festzustellen. Die
29
durchschnittliche Foci-Anzahl im Tumorgewebe betrug 8,11, während
im Normalgewebe 7,92 Foci pro Zelle ermittelt wurden (p=0,112). Nach
Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit verdoppelte sich die Anzahl
der Foci bei den Tumor- sowie Normalgewebszellen auf 15,55 (Tumorzellen) bzw. 16,75 (gesunde Schleimhautzellen), eine signifikante Differenz zwischen Tumor- und Normalgewebe war hierbei ebenso nicht zu
beobachten (p=0,554). Im weiteren Verlauf nahm die Zahl der Pml-Foci
wieder ab und erreichte in beiden Geweben wieder den Ausgangswert
der Kontrollproben bzw. lag leicht darunter (T: 6,22 Foci/Zelle; N: 7,07
Foci/Zelle; Abb. 8/9). Ein signifikanter Unterschied lag hier zwischen
Tumor- und Normalgewebe ebenfalls nicht vor (p=0,549).
Abbildung 8: Immunostaining mit Tumorzellen und Zellen aus gesunder Mundschleimhaut. Anzahl der Pml NBs nach Bestrahlung
mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.
30
DAPI
Pml
Merged
Kontrolle
2 Gy/1h
2 Gy/24h
Abbildung 9: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-Pml, Darstellung der Foci-Anzahl im zeitlichen Verlauf.
5.3
Kolokalisation von γ-H2ax- und Pml-Foci
Eine nennenswerte Kolokalisation von γ-H2ax- und Pml-Foci war bei
keinem der untersuchten Patienten zu beobachten, weder bei Zellen
aus PLE-Karzinomen noch bei Zellen der gesunden Mundschleimhaut
(Abb. 10). Lediglich nach Bestrahlung und einstündiger Reparaturzeit
stieg die Kolokalisation in beiden Gewebearten an, was jedoch durch
die große Anzahl der γ-H2ax-Foci eher auf ein zufälliges Übereinanderliegen hindeutete.
31
DAPI
Pml
Merged
Abbildung 10: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI, anti-γ-H2AX und anti-Pml. Darstellung der γ-H2ax(grün) und Pml-Foci (rot) sowie deren Kolokalisation nach Bestrahlung und 24-stündiger Reparaturzeit.
5.4
p53
Neben γ-H2ax und Pml NBs wurde außerdem die Verteilung von
p53Ser20-Foci untersucht. p53 ist ein wichtiger Tumorsuppressor, der
unter anderem auch eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von
DNA-Schäden spielt. So erfolgt nach genotoxischem Stress, wie z. B.
einer Bestrahlung der Zellen, eine Phosphorylierung durch Atm an
Ser20, wodurch p53 stabilisiert wird und im Zellkern akkumuliert. Dies
war sowohl im Tumor- als auch im Normalgewebe zu erkennen, da die
Anzahl der p53Ser20-Foci nach Bestrahlung mit 2 Gy und einstündiger
Reparaturzeit auf 17,60 (Tumorzellen) bzw. 15,82 (Zellen aus gesundem Gewebe) anstieg. Somit war in beiden Geweben ein signifikanter
Anstieg der Foci-Anzahl im Vergleich zu den Kontrollen zu verzeichnen
(T: p=0,019; N: p=0,029). Diese Werte nahmen im weiteren Verlauf
wieder ab, womit sich nach 24 h Reparaturzeit in den Tumorzellen noch
eine durchschnittliche Anzahl von 8,89 und in den gesunden Schleimhautzellen ein Wert von 10,12 ergab (Abb. 11/12).
32
Abbildung 11: Immunostaining mit Tumorzellen und Zellen aus
gesunder Mundschleimhaut. Anzahl der p53Ser20-Foci nach Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.
33
DAPI
p53Ser20
Merged
Kontrolle
2 Gy/1h
2 Gy/24h
Abbildung 12: Immunostaining mit humanen Keratinozyten. Färbung mit DAPI und anti-p53Ser20. Darstellung der p53Ser20-Foci
pro Zelle nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im zeitlichen Verlauf.
5.5
Apoptose
Abschließend wurde untersucht, wie groß der Anteil apoptotischer Zellen an den insgesamt ausgewerteten Zellen war.
Mit durchschnittlich 1,03 % (T) bzw. 3,02 % (N) fiel der Anteil der apoptotischen Zellen in den Kontrollproben beider Gewebe gering aus, die
Differenz war hierbei nicht signifikant (p=0,188). Betrachtete man den
Anteil nach Bestrahlung und einer Stunde Reparaturzeit, so stieg im
Fall der Tumorzellen der Wert leicht an bzw. fiel bei den Zellen der gesunden Schleimhaut geringfügig ab (T: 3,21 %; N: 2,73 %). Ein signifi-
34
kanter Anstieg im Vergleich zu den Kontrollproben war in beiden Geweben erst nach 24-stündiger Reparaturzeit erkennbar, der Anteil der
apoptotischen
Zellen
lag
hier
bei
8,5 %
bzw.
9,9 %
(T: p<0,001; N: p=0,007; Abb. 13).
Abbildung 13: Zahl der apoptotischen Zellen nach Bestrahlung
mit 2 Gy und entsprechender Reparaturzeit in %.
35
6
Diskussion
Neben
chirurgischer
Intervention
und
Chemotherapie
stellt
die
Behandlung mit ionisierender Strahlung eine weitere Option im
Therapiekonzept des oralen PLE-Karzinoms dar. Sie wird meist mit
chemotherapeutischen Maßnahmen kombiniert eingesetzt, da Radiound Chemotherapie auf verschiedene Weise interagieren und somit ein
effektiveres Vorgehen gegen den Tumor ermöglichen (van Heijl et al.
2008). So verhindert beispielsweise die Chemotherapie die Neubesiedlung der Tumorzellen nach erfolgter Bestrahlung oder verbessert
durch
Verkleinerung
des
Tumors
die
Reoxygenierung,
welche
wiederum förderlich für die Radiotherapie ist (van Heijl 2008). Die
Anwendung ionisierender Strahlung zur Therapie von neoplastischen
Ereignissen beruht darauf, dass sie in der Lage ist, direkte Schäden der
DNA zu induzieren (Burdak-Rothkamm et al. 2009). Hierbei sind vor
allem die DSBs von Bedeutung, da die Wahrscheinlichkeit ihrer Reparatur erheblich kleiner ist als bei anderen DNA-Schäden. Die Wirkung
der Strahlentherapie beruht im Wesentlichen auf der Toxizität von
reaktiven Sauerstoffmolekülen, die durch die Radiolyse von Wasser
entstehen.
Studien
zeigen,
dass
durch
ionisierende
Strahlung
geschädigte Zellen Signale an ihre ungeschädigten Nachbarzellen
aussenden können, die in diesen ähnliche Effekte wie die Strahlung
selbst hervorrufen. Dieses Phänomen wird auch als „bystander effect“
bezeichnet (Rzeszowska-Wolny et al. 2009). Neoplastisches Gewebe
wird auf Grund seiner guten Vaskularisierung und der damit
verbundenen Versorgung mit Sauerstoff stärker geschädigt als
gesundes Gewebe (Lee et al. 2008). Zudem weisen Tumorzellen in der
Regel eine schlechtere Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden auf als
nicht-neoplastische Zellen (Bolderson et al. 2009). Ob Zellen aus oralen
PLE-Karzinomen ebenfalls eine verminderte Reparaturfähigkeit von
DNA-Schäden aufweisen und damit strahlenempfindlicher sind als
Zellen aus der benachbarten, gesunden Schleimhaut, war das
wesentliche Ziel dieser Arbeit. Um dieser Frage nachzugehen, wurde
36
die Anzahl von DNA-DSBs nach einer Bestrahlung mit 2 Gy im
zeitlichen
Verlauf
ermittelt,
jeweils
in
einem
Tumor-
sowie
Normalgewebspräparat desselben Patienten. Ein sensitiver Marker für
strahleninduzierte DNA-DSBs stellt γ-H2ax dar (Avondoglio et al. 2009).
Nach Induktion von DSBs der DNA wird in Säugerzellen H2ax, eine
Variante des Histons H2a, rasch an Ser139 phosphoryliert. Das
entstehende γ-H2ax kann nun mit Hilfe von Antikörpern detektiert
werden und dient somit als Indikator für die DNA-DSBs (Dickey et al.
2009). Nach einer Bestrahlung mit 2 Gy und 1-stündiger Reparaturzeit
war in den Tumorzellen die γ-H2ax-Foci-Anzahl mit durchschnittlich
35,52 Foci nur geringfügig höher als bei den Zellen der gesunden
Schleimhaut. Bei der Induktion von DSBs war zwischen Tumor- und
Normalgewebe somit kein signifikanter Unterschied zu erkennen
(p=0,433), das Tumorgewebe aus den oralen PLE-Karzinomen
reagierte somit nicht wesentlich strahlenempfindlicher als das gesunde
Gewebe. Betrachtet man nun die Foci-Anzahl nach 24 h Reparaturzeit,
so lässt sich eine Aussage bezüglich der Reparaturfähigkeit beider
Gewebe treffen. Hierbei war nun ein signifikanter Unterschied
feststellbar, da im Tumorgewebe die Anzahl der verbliebenen DNADSBs wesentlich höher ausfiel als im gesunden Gewebe (p<0,001).
Somit ist festzuhalten, dass die Tumorzellen innerhalb von 24 h
lediglich 47 % der entstandenen DSBs reparieren konnten, während die
gesunden Zellen in der Lage waren, 85 % der Schäden zu beheben.
Das Reparaturvermögen der Zellen aus oralen PLE-Karzinomen ist
somit als wesentlich geringer einzustufen als jenes von nichtneoplastischen Schleimhautzellen. Obwohl auch nach 24 h noch eine
Reparatur von DNA-DSBs stattfindet, so ist es im Fall der Tumorzellen
doch sehr unwahrscheinlich, dass die Anzahl der γ-H2ax-Foci wieder
bis auf den Wert der unbestrahlten Kontrollproben absinkt. Es ist
nämlich zu vermuten, dass es sich bei den verbliebenen Defekten um
komplizierte Läsionen handelt, da sie ja noch nicht repariert werden
konnten. So ist davon auszugehen, dass sich viele DSBs als irreparabel
erweisen, woraufhin die Zelle die Apoptose einleitet und abstirbt. Diese
37
Erkenntnis lässt darauf schließen, dass die ionisierende Strahlung eine
sinnvolle therapeutische Maßnahme bei der Behandlung des oralen
PLE-Karzinoms
darstellt,
da
die
Tumorzellen
aufgrund
ihres
schlechteren Reparaturvermögens in größerem Maße zugrunde gehen
als die Zellen der umgebenden gesunden Schleimhaut.
Nun stellt sich die Frage, worauf diese verminderte Reparaturfähigkeit
der Zellen des oralen PLE-Karzinoms zurückzuführen ist. Ein Faktor,
der in dieser Fragestellung Aufschluss geben kann, ist das Protein p53,
da dieses Protein eine zentrale Stellung in der DNA-Schadens-Antwort
einnimmt. Die Aufhebung der p53-Funktion ist außerdem eine der
häufigsten molekularen Veränderungen im oralen PLE-Karzinom (Poeta
et al. 2007). Es wurde in den Versuchen gezeigt, dass sich die Anzahl
der p53Ser20-Foci nach Bestrahlung und einer Stunde Reparaturzeit in
etwa verdoppelt und nach 24 h wieder auf den Wert der unbestrahlten
Kontrollproben absinkt. Das Ansteigen der Foci-Anzahl resultiert
dadurch, dass nach der Bestrahlung mit 2 Gy p53 durch Atm an Ser20
phosphoryliert wird und dadurch im Zellkern akkumuliert (Wang 2005).
Signifikante Unterschiede bezüglich der p53Ser20-Foci-Anzahl im
Tumor- und Normalgewebe wurden weder in den Kontrollproben
(p=0,943), noch nach Bestrahlung und 1- (p=0,711) bzw. 24-stündiger
Reparaturzeit (p=0,764) beobachtet. Lediglich der Anstieg nach Bestrahlung und 1 h Reparaturzeit war in beiden Geweben als signifikant
zu
bezeichnen
(T: p=0,019; N: p=0,029).
Daraus
lässt
sich
schlussfolgern, dass nach Einwirkung ionisierender Strahlung die
Phosphorylierung von p53Ser20 im Tumorgewebe somit ebenso wie im
Normalgewebe erfolgt. Auch eine p53-Defizienz kann bei den
untersuchten
Patienten
ausgeschlossen
werden,
da
in
allen
untersuchten Präparaten p53Ser20-Foci erkennbar waren. Trotz fast
identischer Anzahl an p53-Protein sind die Tumorzellen dennoch nicht
in der Lage, die aufgetretenen DNA-Schäden ebenso effektiv zu
reparieren wie die Zellen der gesunden Schleimhaut. So wäre es
denkbar, dass die Ursache hierbei unter anderem in einer beschädigten
p53-Funktion zu suchen ist. Eine Mutation von p53 findet sich in vielen
38
Tumoren, eine Tatsache, die eine veränderte Regulierung von mehr als
100 Genen zur Folge hat (Meek 2009; Menendez et al. 2009). Nach
Eintreten eines DNA-Schadens reguliert p53 die Expression von
Genen, die an der Kontrolle des Zellzyklus, an der Induktion der
Apoptose und auch der Reparatur der DNA beteiligt sind. Die Reparatur
eines DSBs in Eukaryonten erfolgt nach heutigem Wissensstand
entweder durch Nicht-homologes end joining (NHEJ) oder durch
Homologe Rekombination (HR). So ist es beispielsweise denkbar, dass
die Expression von Genen, die an der Reparatur der DNA beteiligt sind,
von p53 nicht mehr angemessen reguliert wird. Werden so etwa
weniger Proteine exprimiert, die beim NHEJ bzw. der HR beteiligt sind,
so können folglich auch weniger DSBs beseitigt werden.
p53 ist nach erfolgter Schädigung der DNA unter anderem in Pml NBs
lokalisiert, die ebenso wie p53 eine Rolle bei der Zellzyklusprogression,
der Transkriptionsregulation, der DNA-Schadens-Antwort sowie der
Apoptose spielen (Reineke and Kao 2009b; Shen et al. 2006). Obwohl
Pml eigentlich als Tumorsuppressor in APL entdeckt wurde, ist die Bedeutung der Pml NBs in Neoplasien anderer Genese noch weitgehend
unklar. Neueste Studien zeigen jedoch, dass in vielen Tumorgeweben
die Expression von Pml verringert ist, wobei die ursächlichen
Mechanismen noch unbekannt sind (Reineke et al. 2009a). Mit einer
verringerten Expression von Pml NBs kann unter anderem ein Verlust
der Zellzykluskontrolle und eine Unterbindung der Apoptose einhergehen, ferner kann sie die Entstehung eines neoplastischen Ereignisses
begünstigen (Reineke and Kao 2009a). Im Falle der für diese Arbeit
untersuchten Patienten lässt sich eine verringerte Expression von
Pml NBs ausschließen, da die Anzahl der Pml-Foci im Tumorgewebe
nicht signifikant von derjenigen im Normalgewebe abweicht. Dies gilt
sowohl
für
die
Kontrollproben
(T: 8,11
Foci/Zelle; N: 7,92
Foci/Zelle; p=0,911) als auch für die bestrahlten Proben nach 1 h
(T: 15,55 Foci/Zelle; N: 16,75 Foci/Zelle; p=0,554) und 24 h Reparaturzeit (T: 6,22 Foci/Zelle; N: 7,07 Foci/Zelle; p=0,549). Das orale PLEKarzinom scheint somit nicht zu jenen Neoplasien zu gehören, in denen
39
die Expression der Pml NBs verringert ist. Auch ein Zusammenhang mit
der verminderten Reparaturfähigkeit lässt sich ausschließen, da in den
Versuchen gezeigt wurde, dass kein signifikanter Unterschied bezüglich
der Pml-Expression im Tumor- und Normalgewebe besteht.
Neben der Verteilung von γ-H2ax-, Pml- und p53Ser20-Protein wurde
zusätzlich das Verhältnis von apoptotischen Zellen und insgesamt
ausgewerteten Zellen betrachtet. Dies ist insofern interessant, da in
Tumorzellen oftmals Mechanismen beobachtet werden, die den programmierten Zellltod unterbinden können (Scheper et al. 2008). Zu
diesen
Mechanismen
zählen
z. B.
die
Expression
von
anti-
apoptotischen Proteinen wie Bcl-2 oder die Downregulation oder
Mutation von Proteinen wie Bax (Elmore 2007). Studien zeigen, dass
die Expression von Anti-Apoptose-Proteinen wie Bcl-2 am größten in
schlecht-differenzierten oralen PLE-Karzinomen ist, während die
Expression von Pro-Apoptose-Proteinen wie Bax mit gut-differenzierten
oralen PLE-Karzinomen korreliert (Bradley et al. 2007). Abweichungen
in der Regulierung der Apoptose spielen eine entscheidende Rolle in
der Entstehung von Neoplasien, da erbgutgeschädigte Zellen somit
nicht mehr an einer Proliferation gehindert werden können. Außerdem
gestaltet sich die Therapie schwieriger, da diese Tumorzellen trotz
erfolgter Erbgutschädigung, ausgelöst beispielsweise durch ionisierende Strahlung, nicht die Apoptose einleiten. Betrachtet man nun die
Ergebnisse, so lässt sich kein Hinweis darauf finden, dass die
untersuchten Tumorzellen in der Lage sind, die Apoptose zu umgehen.
Weder in den Kontrollproben, noch nach Bestrahlung und 1- bzw. 24stündiger Reparaturzeit unterscheiden sich die Werte zwischen Tumorund Normalgewebe signifikant. Das Tumorgewebe eliminiert ebenso
wie das Normalgewebe Zellen, deren DNA-Schäden so komplex sind,
dass die Zellen nicht mehr in der Lage sind diese zu reparieren. Dies
beweist das Ansteigen der apoptotischen Zellen nach Bestrahlung und
24-stündiger Reparaturzeit auf 8,5 % (Tumorgewebe) bzw. 9,9 %
(Normalgewebe). Da 85 % der untersuchten PLE-Karzinome gut- bis
mäßig-differenzierte PLE-Karzinome waren, kann der Zusammenhang
40
zwischen der Expression von Pro-Apoptose-Proteinen und guter
Differenzierung bestätigt werden.
Abschließend kann somit festgehalten werden, dass die Anwendung
von ionisierender Strahlung eine sinnvolle Maßnahme im Therapiekonzept des oralen PLE-Karzinoms darstellt. Der Grund hierfür liegt nicht in
der größeren Strahlensensitivität, sondern in der verringerten Reparaturfähigkeit des Tumorgewebes. Eine Mutation des Gens p53 im
Bereich der p53Ser20-Stelle konnte ebenso ausgeschlossen werden
wie eine veränderte Expression des Pml-Proteins. Zudem untermauern
die Ergebnisse die Korrelation zwischen Differenzierungsgrad und
Apoptoseverhalten des oralen PLE-Karzinoms.
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8
Abkürzungsverzeichnis
APL
Akute Promyelozytische Leukämie
Atm
Ataxia-Teleangiektasia mutated (Protein)
Atr
Ataxia-Teleangiektasia related
B-Box
Zink finger in Pml NBs
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
BRCA1
Breast Cancer 1
BSA
Bovine Serum Albumin
CBP
CREB-Binding Protein
Chk2
Checkpoint Kinase 2 (Protein)
Chk4
Checkpoint Kinase 4 (Protein)
C-Terminus
Carboxyl-Terminus
Cys
Cystein
DAPI
Diamidino-2-phenylindol
Daxx
Death associated protein 6
DNA
deoxyribonucleic acid
DNA-PK
DNA-Proteinkinase (Protein)
DSB
Doppelstrangbruch
E2F
Electro-acoustic 2 Factor
FKS
Fötales Kälberserum
Gy
Gray
H2ax
Histon Protein 2ax
HIPK2
Homeodomain interacting protein kinase 2
HPV
Humane Papillomviren
HR
Homologe Rekombination
IR
ionizing radiation
kDa
Kilodalton
KOF
Körperoberfläche
LK
Lymphknoten
MDC1
Mediator of DNA damage checkpoint 1
MDM-2
Double minute 2 protein
47
NHEJ
Non homologous end joining
N-Terminus
Amino-Terminus
OK
Oberkiefer
p21
Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
p53
Transformation-Related Protein 53
PBS
Phosphate buffered saline
PIKK
Phosphoinositide 3-kinase-related kinases
PLE
Plattenepithel
Pml
Promyelocytic leukaemia
Pml-NBs
Promyelocytic leukaemia nuclear bodies
RARalpha
Retinoic acid receptor alpha
Rb105
Retinoblastoma 105
RBCC
RING-B-box-coiled-coil
RING
Zink-Finger-Domäne in Pml NBs
Ser
Serin
Sp100
Speckled 100kDa (Protein)
SUMO
Small Ubiquitin-Like Modifier
TBS
Tris buffered saline
TRIS
Trishydroxymethylaminomethan
UICC
Union internationale contre le cancer
UK
Unterkiefer
γ-H2ax
Phosphoryliertes Histon Protein 2ax
53BP1
p53-binding protein 1
5-FU
5-Fluoruracil
48
9
Anhang
9.1 Lösungen
Tabelle 3: 4%-ige Formaldehyd-Lösung mit 0,1% TritonX-100
Substanz
Menge
Formaldehyd, 37%
10,8ml
TritonX-100
100µl
1xPBS
89,2ml
Tabelle 4: Blockierpuffer
Substanz
Menge
FKS
10ml
BSA
1g
1xPBS
90ml
Natriumazid (1M)
300µl
Tabelle 5: 10xTBS-Waschlösung
Substanz
Menge
Tris
12,114g
NaCl
87,66g
Destilliertes Wasser
Auf 1000ml auffüllen
49
10 Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Rainer Fietkau,
Direktor der Strahlenklinik der Universität Erlangen-Nürnberg, dafür
bedanken, dass er mir die Möglichkeit eröffnete, diese Arbeit im
strahlenbiologischen Labor der Strahlenklinik auszuführen.
Ein großer Dank gebührt meiner Betreuerin, Frau Dr. Dorota Lugban,
die mir während der Anfertigung dieser Arbeit immer tatkräftig zur Seite
stand und ein offenes Ohr für mich hatte. Durch die Einführung in die
Laborarbeit und ihre unermüdliche Geduld, mir die computertechnische
Aufarbeitung der Daten näher zu bringen, hat sie für das Gelingen der
Arbeit einen großen Teil beigetragen. Ebenso möchte ich mich beim
Leiter des strahlenbiologischen Labors, Herrn PD Dr. Luitpold Distel, für
seine Anregungen und seine ständige Bereitschaft zur Hilfe bedanken.
Ein großer Dank gilt allen Mitarbeitern des strahlenbiologischen Labors,
die mich sowohl praktisch als auch durch das hervorragende Arbeitsklima unterstützten.
Einen besonderen Dank möchte ich zuletzt meinen Eltern aussprechen,
ohne deren beständige Unterstützung mein Studium und diese Arbeit
niemals möglich gewesen wären.
50
11 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Judith Bäumler
Geburtsdatum:
30.05.1983
Geburtsort:
Bamberg
Eltern:
Wendelin Bäumler
Elfriede Bäumler, geb. Hofmann
Geschwister:
Sylvia Lehmann, Gerald Bäumler, Gregor Bäumler
Familienstand:
ledig
Schulausbildung
1989-1993
Hans-Schüller Schule Hallstadt
1993-2002
E.T.A. Hoffmann-Gymnasium Bamberg
2002
Abitur
Hochschulausbildung
2002-2003
Studium der Kunstgeschichte an der Otto-FriedrichUniversität Bamberg
2003-2009
Zahnmedizinstudium an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
08/2004
Naturwissenschaftliche Vorprüfung
03/2006
Zahnärztliche Vorprüfung
12/2008
Zahnärztliche Prüfung
51
Promotion
Seit 01/2009
Experimentelle Doktorarbeit an der Strahlenklinik
der Universität Erlangen-Nürnberg