Analysis of the biogenesis and dynamics of the membrane protein

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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Photosystem I ist eine von zwei lichtgetriebenen Elektronenpumpen, die in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und Cyanobakterien lokalisiert, und dort für die oxygene
Photosynthese essentiell ist. Während Struktur und Funktion von PSI bereits gut bekannt
sind,
werden
die
Assemblierung,
Dynamik
sowie
der
Abbau
dieses
Membran-
proteinkomplexes erst seit kürzerer Zeit untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurden die putativen Biogeneseproteine Ycf3, Ycf4 und BtpA
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nur Ycf3 für die Assemblierung von funktionellem PSI essentiell ist. Sowohl Ycf4 wie auch BtpA scheinen eine regulatorische oder
stabilisierende Funktion zu haben, da der Photosystem I Gehalt in den entsprechenden
Deletionsstämmen lediglich reduziert ist. Aus
ycf4 und
btpA isolierte PSI-Komplexe
sind mittels SDS-Gelelektrophorese, MALDI-ToF Massenspektroskopie und Funktionsanalysen nicht von denen des Wildtyps zu unterscheiden. Dies deutet darauf hin, dass alle
Untereinheiten in ihrer maturen Form vorhanden sind und Ycf4 bzw. BtpA keine für bestimmte Untereinheiten spezifische Chaperone darstellen.
Alle Deletionsstämme konnten mit episomalen Plasmiden komplementiert werden, auf
denen das jeweilige Protein kodiert war. Dies zeigt an, dass der Phänotyp in der Tat auf
die gerichtete Deletion des entsprechenden Gens und nicht auf etwaige sekundäre Effekte zurückzuführen ist.
Ycf3 ist in der Thylakoidmembran von Synechocystis sp. PCC 6803 lokalisiert und in die
frühen Schritte der PSI Biogenese involviert. Es bildet durch die TPR-Domänen vermittelte Homooligomere, während der N-Terminus mit anderen Proteinen, wahrscheinlich mit
PsaA/B oder PsaD interagiert. Durch Affinitätschromatographie mit rekombinantem HYcf3
konnten keine eindeutigen an der PSI-Assemblierung beteiligten Interaktionspartner gefunden werden, obwohl GroEL zusammen mit HYcf3 gereinigt werden konnte.
Für Ycf4 scheint eine Rolle in der Antwort auf oxidativen Stress wahrscheinlich zu sein.
Demnach könnte Ycf4 in der Anpassung der Elektronentransportkette in Abhängigkeit von
Umwelteinflüssen, die den Redoxzustand der Zelle verändern, beteiligt sein. Gestützt
wird diese Annahme durch die Entdeckung, dass zwei Peroxidasen in der
ycf4-
Deletionsmutante weniger stark exprimiert waren. In dieser Mutante ist die Akkumulation
von Photosystem I von photoautotrophem Wachstum abhängig. Dies ist ein bisher noch
nicht für Synechocystis sp. PCC 6803 beschriebener Phänotyp.
Proteomanalysen der
btpA-Mutante zeigen eine weitere Funktion von BtpA in der CO2-
Fixierung auf. Dies zeigt auch die subzelluläre Lokalisierung von BtpA, welches zum einen
an die Thylakoidmembranen gebunden zu sein scheint, aber auch in Carboxysomen auftritt. BtpA bildet Oligomere, die unabhängig von der Verteilung der Photosysteme in den
Membranen von Synechocystis auftreten. Eine Möglichkeit ist, dass BtpA große Komplexe
an spezifischen Stellen der Zelle bildet, zu denen dann verschiedene Zielproteine geleitet
werden.
Zusammenfassung
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Es wurde eine Methode etabliert, um differentielle Proteinexpression in Synechocystis
Wildtyp und Deletionsmutanten zu analysierien. Mit Hilfe der vorgestellten Vorfraktionierung, zweidimensionalen Gelelektrophorese und Identifikation der Proteine mittels
MALDI-ToF Massenspektroskopie kann ein Großteil des Proteoms von Synechocystis dargestellt werden.
Erste Betrachtungen löslicher Proteine aus dem Wildtyp und den Deletionsmutanten zeigten bereits unterschiedlich regulierte Proteine auf.
Mittels blau-nativer Gelelektrophorese konnte jedes der drei Biogeneseproteine in unterschiedlichen hochmolekularen Komplexen der Membranen von Synechocystis nachgewiesen werden.
In Zusammenarbeit mit J. Dekker (Freie Universität Amsterdam), konnte ein effizienter
Energietransfer zwischen der membran-intrinsischen IsiA-Antenne und PSI-Trimeren in
Synechococcus sp. PCC 7942 nachgewiesen werden. Der durch Eisenstress induzierte
IsiA-Ring fügt ca. 290 Chlorophylle zu dem trimeren Komplex hinzu, wodurch die Antenne um 100 % vergrößert wird.