Zusammenfassung englisch/deutsch

Dipl.-Biol. Schweitzer, Barbara Christina
“The effect of the extracellular environment on the composition and function of
synapses”
The balance between stability and plasticity has to be regulated to maintain proper functionality of
the brain and to promote learning and memory processes. In the adult, the extracellular matrix
(ECM) that is formed by glia cells and neurons enwraps and stabilizes synapses and neuronal
networks. ECM molecules as well as transmembrane proteins are cleaved by extracellular proteases
and subsequently yield new signaling molecules that are important mediators of synaptic plasticity.
The huge variety of ECM and transmembrane proteins and extracellular proteases lead to many
unanswered questions about their involvement in the precise regulation of synapses throughout
development and plasticity processes. In this thesis, the involvement of the hyaluronan based ECM
on the regulation of postsynaptic NMDA receptors was investigated. Further, the signaling
mechanism of the extracellular cleaved cadherin superfamily member Calsyntenin (Cst) is
investigated.
In late postsynaptic development when neuronal networks are established (roughly P70 in mice), a
drop in structural plasticity can be observed. On the molecular level, neurotransmitter receptors are
recruited and stabilized at synaptic contacts, which determine the mature properties of synaptic
transmission. Key events are changes in the subunit composition of NMDA receptors from
predominantly GluN1/GluN2B- to GluN1/GluN2A-NMDA receptors, which alters plasticity processes
of the synapses. At the same time the hyaluronan-based ECM matures, stabilizes synaptic contacts
and limits plasticity processes. Removal of the ECM induces an increased and juvenile form of
plasticity. In this thesis I hypothesized a causal link between the two developmental changes, and
thus an influence of the ECM on the characteristics of the GluN2B-NMDA receptors. Indeed I found
that enzymatic digestion of the ECM by the glycosidase hyaluronidase (Hya) increased the surface
expression and synaptic currents of GluN2B-NMDA receptors in mature cultured dissociated
hippocampal neurons. This was due to an altered phosphorylation state of GluN2B upon ECM
digestion which led to a lower endocytosis rate. Further experiments demonstrated that this effect
was
-integrin dependent. Finally lateral mobility of surface GluN2B was more confined after
prolonged ECM removal. Taken together, these results suggest that ECM molecules regulate surface
abundance of GluN2B-NMDA receptors and an increased surface abundance of GluN2B-NMDA
receptors may mimic juvenile states. This may be one mechanism underlying the observed
increased neuronal plasticity after ECM removal.
In the second part the cellular function and signaling of the postsynaptic, transmembrane protein
Cst and especially of its shed ectodomain were investigated. In humans, the Cst gene is known to
have strong influence on episodic memory. C. elegans lacking Cst show impaired associative
learning, which can be rescued by application of the ectodomain of Cst. It was suggested that Cst-1
binds secreted frizzled related protein 1 (sFRP-1), a protein involved in wnt signaling (Leuthäuser
et al., unpubl.). So far no effect of Cst-1 on canonical wnt signaling could be shown. Furthermore Cst1 did not directly bind to Frizzled-1, which was tested due to the close homology between sFRP-1
and the extracellular domain of Frizzled-1. Wnt signaling affects presynaptic activity and therefore I
tested whether Cst-1 has a potential influence in this context. Synaptotagmin antibody uptake
experiments demonstrated that the ectodomain of Cst-1 increased neurotransmitter release in
cortical neurons which was prevented by either blocking wnt signaling or inhibiting -nAChRs
that were shown to be involved in wnt signaling-dependent effects on presynaptic activity. Taken
together the results suggest that the ectodomain acts as a trans-synaptic messenger, whose exact
function needs to be further clarified.
Dipl.-Biol. Schweitzer, Barbara Christina
“The effect of the extracellular environment on the composition and function of
synapses”
Die Fähigkeit zu plastischen Veränderungen im Gehirn, sowohl struktureller als auch
funktioneller Art, wandelt sich während der Entwicklung und wird als Reaktion auf
Aktivitätsveränderungen oder Verletzungen angepasst. Die Balance zwischen Stabilität und
Plastizität muss ein Leben lang reguliert werden, um die Gehirnfunktionen aufrecht zu
erhalten, und Lern- und Gedächtnisprozesse zu ermöglichen. Im adulten Gehirn sind die
Synapsen von einer extrazellulären Matrix (ECM) ummantelt und stabilisiert, die
gemeinsam von Gliazellen und Neuronen produziert wird. Sowohl ECM-Moleküle, als auch
transmembranale Proteine werden durch extrazelluläre Proteasen gespalten, was neue
Signalmoleküle hervorbringt, die wichtige Mediatoren für plastische Prozesse an der
Synapse sind. Die große Bandbreite an extrazellulären und transmembranalen Molekülen
birgt viele offene Fragen über deren Einfluss in der präzisen Regulation von Synapsen
während der Entwicklung und Plastizitätsprozessen im Gehirn.
Diese Arbeit behandelt die Funktionen von zwei Komponenten der ECM. Zum einen wurde
der Einfluss der Hyaluronsäure-basierten ECM auf die Regulation von postsynaptischen
NMDA Rezeptoren untersucht. Andererseits wurde das Spaltungsprodukt des
transmembranalen Proteins Calsyntenin (Cst), das Mitglied der Cadherin Superfamilie ist,
auf dessen Signalweg sowie mögliche Rezeptoren erforscht.
In der postnatalen Entwicklung, zu einem Zeitpunkt an dem neuronale Netzwerke gefestigt
werden (in Mäusen ~P70), ist ein Abfall der strukturellen Plastizität zu beobachten. Auf
molekularer Ebene werden Neurotransmitterrezeptoren an den Synapsen stabilisiert, die
die adulten Eigenschaften einer Synapse mitbestimmen. Ein Rezeptor, dessen
Zusammensetzung sich in juvenilen und adulten Synapsen unterscheidet, ist der NMDA
Rezeptor. Postnatale Synapsen sind hauptsächlich von GluN2B-NMDA-Rezeptoren
dominiert, während adulte Synapsen vornehmlich GluN2A-NMDA-Rezeptoren aufweisen.
Ob ein NMDA-Rezeptor die GluN2A oder GluN2B Untereinheit enthält bestimmt maßgeblich
dessen Eigenschaften und beeinflusst damit auch das Plastizitätspotential einer Synapse.
Parallel zum Wechsel der NMDA-Rezeptorzusammensetzung bildet sich die adulte Form
der ECM aus. Das Erscheinen dieser reifen ECM wird als Endpunkt für eine juvenile,
hochplastische Phase im Gehirn betrachtet. Die ECM stabilisiert Synapsen und verhindert
bis zu einem gewissen Grad plastische Prozesse im Gehirn. Durch die Behandlung mit
Enzymen, die die Struktur der Matrix zerstören, können juvenile, plastische Prozesse
wieder induziert werden. Auf Grund der zeitlichen Überlappung dieser zwei beschriebenen,
entwicklungsabhängigen Prozesse und des gemeinsamen Einwirkens auf die Plastizität
neuronaler Netzwerke wurde ein möglicher Einfluss der ECM auf die Zusammensetzung
von NMDA-Rezeptoren postuliert. Das Enzym Hyaluronidase (Hya) spaltet das
Hyaluronsäure-Rückgrat der ECM und zerstört so ihre dichte, netzwerkartige Struktur. Die
Behandlung reifer, neuronaler Zellkulturen mit Hya erhöhte die Oberflächenexpression von
GluN2B-NMDA-Rezeptoren, was zu erhöhten synaptischen Strömen durch diese Rezeptoren
führte. Dieser Effekt wurde verhindert, indem
-Integrine in ihrer Funktion inhibiert
wurden. Die Gesamtmenge an GluN2B Proteinen war jedoch nicht verändert durch den ECM
Verdau, was auf eine veränderte Endo- oder Exozytose hinweist. Durch den ECM Verdau
wurde GluN2B vermehrt phosphoryliert, woraus eine verringerte Endozytose resultierte.
Außerdem zeigte sich, dass GluN2B-NMDA-Rezeptoren nach der Hya Behandlung eine
geringere laterale Mobilität in der Membran aufwiesen. Die erhöhte synaptische
Oberflächenexpression von GluN2B-NMDA-Rezeptoren nach der Hya-Behandlung, was
einer juvenilen Rezeptorzusammensetzung entspricht, könnte ein molekularer Baustein
sein, der eine erhöhte Plastizität nach EZM-Verdau begründet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die zelluläre Funktion und die zu Grunde liegenden
Signalwege von Calsyntenin (Cst), einem transmembranalen Protein der Cadherin
Superfamilie, untersucht. Das Protein wird von Proteasen geschnitten und dabei wird ein
Proteinfragment, die Ectodomäne, in das extrazelluläre Milieu freigegeben. Es ist bekannt,
dass das Cst-Gen in Menschen Einfluss auf das episodische Gedächtnis hat. In C. elegans
Mutanten, denen das Cst- -Gen fehlt, wurde ein verändertes assoziatives Lernen
nachgewiesen, dass durch Zugabe der Ectodomäne wieder normalisiert wurde. Es gibt
Hinweise, dass auch die Regulation von AMPA-Rezeptoren in diesen Tieren beeinflusst ist,
jedoch ist der genaue Signalweg unbekannt. Unveröffentlichte Daten aus dem Labor von
Prof. Sonderegger zeigen, dass Cst- secreted frizzled related protein
sFRP- bindet
sFRP- ist ein extrazelluläres Protein das den Wnt-Signalweg inhibiert. Auf Grund dessen
wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Cst- einen Einfluss auf den „canonical“ WntSignalweg hat. Dieser verändert die Genexpression und wird mit einem Reportersystem
erforscht, in dem Luciferase exprimiert wird, wenn der Wnt spezifische Promotor aktiviert
ist. Cst- zeigte keinen Einfluss auf die Expression der Luciferase. Auf Grund struktureller
Homologien von sFRP- und dem Frizzled-Rezeptor wurde postuliert, dass Cst- auch an
Frizzled bindet; dies konnte aber nicht nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass der Wnt
Signalweg präsynaptische Aktivität regulieren kann, weshalb die Wirkung von Cst- auf die
Präsynapse untersucht wurde. Anhand der Aufnahme eines Synaptotagmin-Antikörpers
konnte gezeigt werden, dass die Ectodomäne von Cst- die präsynaptische Aktivität erhöht.
Dieser Effekt konnte verhindert werden, indem entweder der Wnt Signalweg oder die 7nACh Rezeptoren inhibiert wurden, von denen bekannt ist, dass sie in Wnt abhängige
Prozesse in der Präsynapse involviert sind. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass die
Ectodomäne von Cst- als transsynaptisches Signalmolekül fungiert, dessen genauer
Einfluss weiter zu erforschen ist.