Aus der Chirurgischen Universitäts-Klinik der Albert
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Aus der Chirurgischen Universitäts-Klinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Abteilung für Plastische und Handchirurgie Valley TEC Ärztlicher Direktor: Univ.-Prof. Dr. G. B. Stark SCHAFFUNG DREIDIMENSIONALER KAPILLARNETZE IN EXTRAZELLULÄREN KOLLAGENMATRICES AUS GENMODIFIZIERTEN HUMANEN ENDOTHELZELLEN INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Vorgelegt am 01.02.2000 von Artiom W. Riabikhin geboren in Moskau -2- Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. H. E. Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. G. B. Stark 2. Gutachter: PD Dr. J. Norgauer Jahr der Promotion: 2000 -3- INHALTSVERZEICHNIS Glossar verwendeter Abkürzungen 6 1. EINLEITUNG 8 1.1 Historischer Überblick 8 1.2 Definition Angiogenese 8 1.3 Angiogene Wachstumsfaktoren 9 1.4 Morphologie der Endothelzellen im Lichtmikroskop 9 1.5 Funktion der Endothelzellen 12 1.6 Angiogenese als Prozeß der Proliferation 12 1.7 Tissue Engineering 13 1.8 Ziele 15 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. Zellkultur 18 2.1.1 Zusammensetzung des Kulturmediums 18 2.1.2 Beschichtung der Kulturflaschen 18 2.1.3 Herkunft der Nabelschnüre 19 2.1.4 Isolierung einer HUVEC-Endothelzellkultur 19 2.1.5 Kultivierung von HUVEC 21 2.1.6 Austestung von Matrix-Materialien auf Stabilität 21 2.1.7 Hämatoxilin–Eosin Färbung 22 2.1.8 Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31 Antikörper 2.1.9 16 23 Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittel CD 105 (Endoglin)-Antikörper 2.1.10 Etablierung von 3D tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices 24 25 2.1.11 Proliferationsmessungen von HUVEC mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF 26 2.1.12 Auszählen von HUVEC 26 2.1.13 HUVEC Proliferationsmessungen mit Thymidineinbau/ DNA-Synthese 27 -4- 2.1.14 Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Escort Transfektionsreagenz 27 2.1.15 Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Fugene 6 Transfektionsreagenz 28 2.1.16 ELISA-hVEGF-Immunoassay 29 2.1.17 Trennkammersystem 30 2.2. Gentechnische Methoden 31 2.2.1 Puffer 31 2.2.2 Plasmide 31 2.2.3 Herstellung kompetenter E. coli Zellen 32 2.2.4 Transformation von Plasmid DNA in E. coli 33 2.2.5 Isolierung von DNA aus E. coli 33 2.2.6 Phenol-Chloroform Extraktion, DNA-Mengenbestimmung 33 2.2.7 DNA-Verdauung mit Restriktionsendonukleasen 34 2.2.8 Agarosegelelektrophorese 34 2.2.9 Ligation von DNA-Fragmenten 34 3. ERGEBNISSE 35 3.1 Präparationen 35 3.2 HUVEC Zellkultur 35 3.3 Färbung mit Hämalaun und Eosin 37 3.4 Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31-Antikörper 3.5 37 Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittels CD 105 Antikörper 37 3.6 Austestung von Matrix-Materialien auf Stabilität 39 3.7 Etablierung von dreidimensionalen tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices 3.8 Proliferationsuntersuchung von HUVEC mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF in Monolayer-Kultur 3.9 39 41 Proliferationsuntersuchung von HUVEC mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF in 3D Zellkutur in Kollagenmatrices 43 -53.10 Liposomale Transfektion von HUVEC mit zwei hVEGF-165-Vektoren und Escort- und Fugene 6-Transfektionsreagenzien 3.11 Untersuchung des proliferativen Effektes der transfizierten HUVEC auf die nicht-transfizierte HUVEC im Trennkammersystem 3.12 46 Implantation von transfizierten HUVEC in eine Kollagenmatrix und Untersuchung des proliferativen Effektes in 3D Zellkultur 3.13 44 47 Implantation von transfizierten HUVEC ins Matrigel und Analyse der Bildung von kapillarähnlichen Strukturen in einer 3D HUVEC-Kulturin vitro 49 4. DISKUSSION 51 4.1 In vitro Model 51 4.2 Präparation 52 4.3 Kulturmedium 53 4.4 Art des Serums 54 4.5 Serum-Anteil 55 4.6 Beschichtung der Kulturflaschen 56 4.7 3D-Endothelzellkultur 56 4.8 Wachstumsfaktoren 57 4.9 Transfektion von humanen Endothelzellen 60 4.10 3D-Kapillarkonstrukt 62 4.11 Zusammenfassung 64 5. DANKSAGUNG 65 6. LITERATURVERZEICHNIS 66 -6- Glossar verwendeter Abkürzungen aqua deion. aqua deionisata; deionisiertes Wasser aqua dest. aqua destillata; destilliertes Wasser bFGF basic Fibroblast Growth Factor BSA Bovine Serum Albumin; Rinder-Serum-Albumin Da Dalton DMEM Dulbecco‘s Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure ECBM Endothelial Cell Basal Medium (ECBM) ECGM Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) EGF Epidermal Growth Factor ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. et alteri, und andere (Mitarbeiter) EtOH Äthanol FBC Fetal Bovine Serum, fötales Rinderserum FCS Fetal Calf Serum, fötales Kälberserum HE Hämatoxilin-Eosin HSA Humanes Serumalbumin HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells; menschliche Nabelschnur-Venen-Endothelzellen kDa Kilo Dalton M molar; Mol pro Liter mM millimolar MVEC Microvascular Endothelial Cells; mikrovaskuläre Endothelzellen PBS Phosphate Buffered Saline PDGF Platelet Derived Growth Factor pH pH-Wert, pondus hydrogenii; negativer dekadischer Logarithmus Alkali-Gehalt einer Lösung Pi Propidium Iodid PCR Polymerase Chain Reaction; Polymerase-Kettenreaktion RT-PCR Reversed Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RNA Ribonuclein Acid; Ribonuklein-Säure -7- TAE Puffer (0,04 m Tris-Acetat, 0,001 m EDTA) TGF-β Transforming Growth Factor β Upm Umdrehungen pro Minute VEGF Vascular Endothelial Growth Factor -8- 1. EINLEITUNG 1.1 Historischer Überblick Mit dem Fortschritt in der Mikroskopie Mitte des 19. Jahrhunderts wurde eine Analyse der Gefäße und Kapillare ermöglicht. So ist neben der Prägung des Begriffes „Endothel“ durch His (1805) die Beschreibung der Perizyten durch Rouget (1878) zu erwähnen. Der Begriff der Neovaskularisation oder Angiogenese wurde erstmals 1935 von Arthur Tremain Hertig erwähnt, der die Formation neuer Blutgefäße in der Plazenta beschrieb (Hertig et al., 1935). Das Phänomen der Angiogenese war Ärzten und Wissenschaftlern bereits aus Vorgängen wie Entzündung, Trauma und Tumor bekannt, doch fehlten Erkenntnisse über die Bedeutung dieses Vorganges. Allerdings ermutigte schon im 19. Jahrhundert Johannes Müller (1801-1898), einer der Begründer der modernen Physiologie, seine Schüler, sich mit diesem Phänomen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu beschäftigen. Es dauerte aber bis zu den 70er Jahren unseres Jahrhunderts, bis man begann, die Frage nach dem „warum“ von Angiogenese zu untersuchen. Wesentliche Untersuchungen dazu sind mit dem Namen Judah Folkman verbunden, der einen Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Angiogenese herstellte und versuchte therapeutische Ansätze daraus zu ziehen (Folkman et al., 1971). Ein möglicher Einfluß von Wachstumsfaktoren, die vom Tumor gebildet werden, auf die Angiogenese, wurde 1939 von A.G. Ide diskutiert (Ide et al., 1939). 1.2 Definition Angiogenese Für das Verständnis der Bildung von Blutgefäßen sind zwei Begriffe von Bedeutung: Vaskulogenese und Angiogenese. Die de novo Organisation von Endothelzellen in Gefäßen in Abwesenheit eines bereits präexistenten Gefäßsystems wird als „Vaskulogenese“ bezeichnet. Dieser Vorgang findet nur im Embryo statt. Dabei entwickelt sich ein primitiver Gefäßplexus aus dem Mesoderm mittels Differenzierung von Angioblasten (Cines et al., 1998; Risau, 1997). -9- Im Gegensatz dazu beschreibt der Begriff „Angiogenese“ die kontinuierliche Entwicklung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Gefäßen (Folkman et al.,1980). Dieser Vorgang ist im Embryo in noch avaskulären Regionen zu beobachten, findet sich aber vor allem im erwachsenen Organismus in physiologischen Situationen (Cines et al., 1998). Nach Bildung eines primitiven Gefäßplexus stehen mehr Endothelzellen zur Verfügung, die neue Kapillaren formen können. Zunächst erfolgt eine proteolytische Degradierung der Extrazellulärmatrix, gefolgt von einer chemotaktischen Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Formation eines Lumens und der funktionellen Reifung des Endothels (Risau, 1997). 1.3 Angiogene Wachstumsfaktoren Angiogenese wird durch ein Vielzahl von Faktoren gesteuert. Wesentlichen Einfluß nehmen angiogene Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle 1.1), die gezielt die Endothelzell-Proliferation, -Migration und -Differenzierung beeinflussen. Fast alle bekannten angiogenen Faktoren beeinflussen einen oder mehrere Schritte der Angiogenese in vitro. Es bleibt allerdings unklar, welcher dieser Faktoren welchen Vorgang in vivo beeinflußt. Tabelle 1.1 listet die wichtigsten und stärksten angiogenen Wachstumsfaktoren auf, die bis heute bekannt sind. Außerdem kann eine Reihe anderer Wachstumsfaktoren und Zytokine die Funktion der Endothelzellen beeinflussen. Diese spielen aber eine untergeordnete Rolle in der Angiogenese. 1.4 Morphologie der Endothelzellen im Lichtmikroskop Humane Endothelzellen werden seit fast 30 Jahren erfolgreich in vitro kultiviert. Die ersten Isolationsversuche und auch die erste Publikation über Kultivierung von HUVEC wurden von E.A. Jaffe im Jahre 1972 präsentiert (Jaffe et al., 1972). Jaffe beobachtete nicht nur das Verhalten von Endothelzellen in vitro, sondern beschrieb auch ausführlich deren Morphologie (Jaffe et al., 1973). Endothelzellen sind mesodermale polare Zellen, die einen engen Zell-Zell-Kontakt suchen. -10- Faktor bFGF (II) Ursprung glatte Muskelzellen Ziel Endothelzellen Funktion Proliferation, KollagenaseSynthese Endothelzellen aFGF Endothelzellen Fibroblasten Proliferation Glatte Muskelzellen Proliferation Perizyten Aktivierung, Chemotaxis Endothelzellen Proliferation, KollagenaseSynthese glatte Muskelzellen VEGF Endothelzellen Fibroblasten Proliferation glatte Muskelzellen Proliferation Endothelzellen Proliferation, GefäßHyperpermeabilität glatte Muskelzellen Makrophagen TGF-β β Makrophagen Endothelzellen Synthese von Extrazellulärmatrix Ruhephase Thrombozyten PDGF glatte Muskelzellen VEGF und bFGF-Produktion Fibroblasten Chemotaxis Makrophagen Chemotaxis Monozyten Chemotaxis Endothelzellen Endothelzellen Proliferation glatte Muskelzellen glatte Muskelzellen Migration, Proliferation Thrombozyten Perizyten Chemotaxis, Aktivierung Angiopoietin 1 unbekannt Endothelzellen Gefäßreifung Angiopoietin 2 unbekannt Endothelzellen Gefäß-Hyperpermeabilität Tabelle 1.1: Angiogene Wachstumsfaktoren -11- Sie kleiden als einschichtige Zellage (Monolayer) die Gefäßwände der Arterien, Venen und Kapillaren aus, sorgen für einen möglichst reibungsarmen Blutfluß und vermitteln einen Stoffaustausch zwischen dem Gefäßlumen und dem umgebenden Gewebe. Es gibt unterschiedliche Populationen von Endothelzellen, die sich vor allem histochemisch durch eine unterschiedliche Enzymausstattung (v.a. Phosphatasen) Abbildung 1.2: Fotografische Abbildung der Endothelzellen 4 Tage nach Aussaat. Endothelzellen proliferieren und suchen Kontakt um eine Monolayer-Kultur zu bilden Abbildung 1.3: Fotografische Abbildung der Endothelzellen 7 Tage nach Aussaat. Die Zellen bilden einen dichten Monolayer mit pflastersteinartigem Aussehen. -12- unterscheiden. Die Dicke der Zellschicht beträgt 0,1-1 µm. In vitro bilden sie auf beschichteten Gewebekulturplatten nach wenigen Tagen dichte Monolayer von pflastersteinartigem Aussehen (siehe Abbildung 1.2 und Abbildung 1.3). 1.5 Funktion der Endothelzellen Die Endothelzellen sind maßgeblich an der Hämostase (Blutgerinnung) sowie der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Sie besitzen ebenfalls eine große Bedeutung bei Entzündungsprozessen, die durch das Zusammenwirken von im Blutstrom zirkulierenden Zellen mit Rezeptoren auf der Zelloberfläche der luminalen Seite der polaren Endothelzellen beeinflußt werden (Vickart et al., 1993). In erster Linie erfüllen sie aber eine Barrierenfunktion, indem sie als semipermeable Schranke zwischen dem Gefäßlumen und dem Gewebe liegen. Zum Bereich ihrer Syntheseleistung sind die Glykoproteine wie Kollagen, Laminin, Fibronectin und vonWillebrand-Faktor zu erwähnen. Die Funktion der Rezeptoren ist erst seit kurzem beschrieben worden. Sie deutet darauf hin, daß entweder die Art der Wirkung humoraler Mediatoren beeinflußt werden kann, oder aber das Endothel generell für das Wirksamwerden vasoaktiver Substanzen erforderlich ist. Die Fähigkeit dieser Zellen zur Migration spielt eine große Rolle bei der Endothelialisierung von Gefäßprothesen sowie der Vaskularisation von Transplantaten und Tumoren. Beeindruckend ist aber auch die Berechnung, daß das Endothel eines Erwachsenen die Oberfläche von ca. 720 m2 besitzt und insgesamt zwischen 1,5 und 2 kg wiegen dürfte (Hammersen et al., 1985). 1.6 Angiogenese als Prozeß der Proliferation Die Gefäßneubildung (Angiogenese) stellt ein Beispiel koordinierter Zellvermehrung dar (siehe Abbildung 1.4). Sie spielt eine bedeutende Rolle bei biologisch wichtigen Prozessen wie Wundheilung, Tumorwachstum, und Embryonalentwicklung. Sie tritt physiologisch während der Follikelreifung und der nachfolgenden Bildung des corpus luteum auf (Frederick et al., 1985). Im gesamten Endothelsystem, auch in dem des Erwachsenen behalten die Endothelzellen die Fähigkeit zu proliferieren und zu migrieren. So können sie nicht -13- nur ausgefallene Zellen ersetzen, sondern auch das Innere von Gefäßprothesen auskleiden. In vivo ist der physiologische Umsatz der Endothelzellen langsam: nur eine von hundert Zellen wird pro Tag ersetzt (Voet, 1992). Bei der Ausbildung von neuen Blutgefäßen sind die Endothelzellen maßgeblich beteiligt. Neue Gefäße entstehen als Kapillaren, die von bereits bestehenden kleinen Gefäßen seitlich aussprießen, indem sie Pseudopodien ausstrecken. Die Zellen bilden als erstes einen massiven Sproß, der sich dann zu einer Röhre aushöhlt. Dieser Prozeß setzt sich fort, bis der Sproß auf eine andere Kapillare trifft, mit der er sich verbindet, um Blutzirkulation zu ermöglichen. In vitro ist das erste Anzeichen für eine Röhrenbildung das Auftreten einer Zelle mit verlängerter Vakuole, die anfangs noch völlig von Zytoplasma umschlossen wird. Benachbarte Zellen bilden ähnliche Vakuolen. Schließlich reihen die Zellen ihre Vakuolen distal aneinander und verschmelzen diese, so daß sie von Zelle zu Zelle durchgehen und einen Kapillarkanal bilden (Voet, 1992). Die Kapillare wächst durch Migration, Teilung und Lumenbildung der Endothelzellen. Abbildung 1.4: Schema Vaskulogenese und Angiogenese. 1.7 Tissue Engineering Durch vereinfachte in vitro Kulturtechniken für Zellen verschiedenster Gewebe und die Anwendung molekularbiologischer Techniken, ist es möglich geworden, in vitro -14- hergestellte Zellkonstrukte zum Ersatz fehlender Gewebe oder zur Unterstützung von deren Funktion zu verwenden. Dieses Verfahren wird als Tissue Engineering bezeichnet und ist in der plastischen Chirurgie von zunehmender Bedeutung. Tissue Engineering vereinigt Prinzipien aus technischen und Ingenieursdisziplinen mit medizinischen, chemischen und molekularbiologischen Erkenntnissen mit dem Ziel biologische Ersatzmaterialien zu entwickeln, die zu einer Wiederherstellung, dem Erhalt oder der Verbesserung von Gewebefunktion führen (Langer et al., 1993). Der Ausfall oder der Verlust von Gewebe- und Organfunktionen betrifft eine große Anzahl von Patienten. Die Behandlung umfaßt Transplantationen, rekonstruktive Verfahren und die Nutzung apparativer Techniken, wie zum Beispiel Dialyse. Die Kosten dieser Verfahren sind enorm und Ergebnisse oft suboptimal. Obwohl mit diesen Verfahren viele Patienten erfolgreich therapiert werden konnten, sind sie dennoch in der Anwendung und dem Erfolg begrenzt. Grundsätzlich könnten Zellen, die eine fehlende oder defekte Organfunktion ersetzen, substituiert werden. Desweiteren konnte mittels spezifischer Proteine, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren, der Körper angeregt werden, defekte oder insuffiziente Organfunktion zu regenerieren. Durch Gentechnologie können auch gezielt für Wachstumsfaktoren kodierende Gene in kultivierten Zellen angewandt werden (Tanczos et al., 1999; Kopp et al., 1998; Andree et al., 1994) Die Dritte Säule ist die in vitro Fertigung oder Präfabrikation von Konstrukten, in denen die benötigten Zelltypen in einer Matrix ein dreidimensionales Gebilde formen. Diese Entwicklung hat in der letzten Dekade große Fortschritten gemacht, sodaß heute an nahezu allen Gewebearten Versuche zum Ersatz mittels Tissue Engineering durchgeführt werden. Gerade in der Plastischen Chirurgie gibt es viele Anwendungsmöglichkeiten des Gewebeersatzes, des Ausgleiches von Konturdeformitäten und der Wiederherstellung von Organfunktion durch Tissue Engineering. Bei der Behandlung chronischer Wunden ist die Anwendung von composite grafts, bestehend aus verschiedenen Zelltypen in einer gemeinsamen Trägermatrix zur Verbesserung der Wundheilung von Interesse. Ein funktionierendes Kapillarnetz ist für ein solches Konstrukt die wichtigste Voraussetzung. Zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten finden sich im Bereich der Lappenchirurgie, wo bei grenzwertig vaskularisierten transponierten Gewebelappen ein Kapillarkonstrukt zur Verbesserung der Angiogenese implantiert werden könnte (Stark et al., 1987; Walgenbach et al., 1995 und 1998; Jaeger et al., 1983). -15- Im Bereich des Tissue Engineering ist bei einer Vielzahl dreidimensionaler Zellkonstrukte die Vaskularisation bislang ungeklärt. Ein allgemeines experimentelles in vitro Modell für die Angiogeneseforschung im Rahmen des Tissue Engineering existiert noch nicht. Auch hierbei ergeben sich Einsatzmöglichkeiten eines solchen Konstruktes. Verschiedene Ansätze werden zur Zeit untersucht, um ein dreidimensionales Endothelzellwachstum zu ermöglichen. Mehrere Voraussetzungen sind dazu notwendig. Das Konstrukt wird sich aus Zellen und einer Extrazellulärmatrix zusammensetzen. Zell-Proliferation und -Migration, Zell-Zell- und Zell- Extrazellulärmatrix-Interaktionen werden über Zytokine gesteuert (Noishiki et al., 1995). Das dreidimensionale Gerüst, die artifizielle Extrazellulärmatrix, besteht dabei aus Kollagen in Gel- oder Netzform oder Polyglykolsäure-Netzen (Mooney et al., 1996). Diese Konstrukte werden dann teils in Monokultur, teils in Ko-Kultur mit verschiedenen Zelltypen besiedelt (Zund et al., 1998; Shinoka et al., 1998). Gelingt es die Trägersubstanzen in eine tubuläre Form zu bringen, kann das Lumen mit Endothelzellen besiedelt werden - die Vorstufe zu einem in vitro geschaffenen Gefäß. Solche Konstrukte wurden bereits nach nur 7 Tagen Inkubation als ca. 2 cm langes Segment in die Pulmonalarterie eines Schafes implantiert (Shinoka et al.,1998). Vor allem im Rahmen der Tumorangiogeneseforschung wurden Studien zur Untersuchung des Verhaltens von Endothelzellen in Kollagengelen oder -netzen durchgeführt. Kultiviert man ein Aortenstückchen in einem Kollagen Typ I - Gel, so kommt es zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen, die ähnlich der Kapillaren in vivo aufgebaut sind und deren Endothelzellen einen hohen Grad an Differenzierung aufweisen (Akita et al., 1997). Allerdings konnte auch gezeigt werden, daß bei Endothelzellkultivierung in einem Kollagengitter zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen eine Stimulation mit angiogenen Wachstumsfaktoren notwendig ist, um eine andernfalls erhöhte Apoptosisrate zu vermeiden (Satake et al., 1998). Verschiedene Kollagengele sind in der Literatur beschrieben und etabliert. Dazu zählen Kollagen Typ I und Typ I/IV - Gele sowie mit angiogenen und Extrazellulärmatrix - Substanzen versetzte Gele (Matrigel). Im Bereich der dreidimensionalen Kapillarkonstrukte sind allerdings bislang kaum Ansätze zu einer therapeutischen Nutzung beschrieben. -16- 1.8 Ziele Im Rahmen des Tissue Engineering wird an der in vitro Konstruktion von Gewebesubstituten (composite grafts) gearbeitet. Zentraler Bestandteil vitaler Organe ist ein gut entwickeltes und durchblutetes Gefäßnetz. Von der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration des arteriell-venösen Gefäßnetzes hängt die Funktion eines jeden Organs und des Organismus insgesamt ab. Es ist kein Zufall, daß die beiden bisher erfolgreich klinisch eingesetzten Tissue Engineering Produkte (Epidermis und Knorpel) per diffusionem ernährt werden und somit nutritiv privilegiert sind. Daher spielt die Angiogenese eine wichtige Rolle in der Wundheilung und Geweberegeneration. Ziel dieser Arbeit war die Schaffung eines stabilen Kapillarnetzes aus kultivierten Endothelzellen zur Vaskularisation dreidimensionaler, in vitro kultivierter Konstrukte. Als Matrices wurden ein Kollagenschwamm (TissuVlies) und im Vergleich dazu Kollagengel (Matrigel) verwendet. Folgende Punkte standen dabei im Mittelpunkt des Interesses: • Etablierung einer zwei- und dreidimensionalen Endothelzellkultur im eigenen Labor • Austestung und Vergleich von zwei extrazellulären Kollagenmatices: TissuVliesKollagenschwamm und Matrigel-Kollagengel auf mechanische Stabilität und Eignung als Endothelzell-Gerüst • In vitro Kultivierung Endothelzellen (Human und Implantation Umbilical Vein von humanen Endothelial Umbilikalvenen- Cells, HUVEC) in dreidimensionalen Kollagenmatrices • Proliferationassays von HUVEC in Monolayer- und dreidimensionaler Kultur stimuliert mit rekombinantem bFGF, VEGF und EGF. Untersuchung und Analyse des Endothelzell-Wachstums und der Ausbildung von „tube-like structures“ im TissuVlies und Matrigel -17- • Zwei- und dreidimensionale liposomale transiente Transfektion von HUVEC mit zwei konstruierten hVEGF-165-Plasmiden und Untersuchung des proliferativen Effektes der transfizierten Zellen auf die nicht-transfizierte Trennkammersystem und in einer dreidimensionalen Zellkultur Zellen im -18- 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. ZELLKULTUR Die Isolation und Kultivierung von humanen Endothelzellen wurde im Tissue Engineering Labor der Abteilung für Plastische und Handchirurgie vorgenommen. Alle Arbeiten, die Keimfreiheit verlangten, wurden in einer Laminar-LuftstromWerkbank durchgeführt. Sämtliche Inkubationen wurden, soweit nicht ausdrücklich davon abweichend beschrieben, im Brutschrank bei 37° C und 5% CO2 durchgeführt. Statt aqua dest fand Wasser Verwendung, das vor seiner Verwendung mittels einer Millipore-Anlage deionisiert worden war (aqua deion). 2.1.1 Zusammensetzung des Kulturmediums Endothelial Cell Growth Medium (Promocell, Heidelberg, Deutschland) Endothelial Cell Basal Medium (Promocell, Heidelberg, Deutschland) 1% Fungizone (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) 5% Fetal Bovine Serum (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) 1% Penicillin/ Streptomycin Oben beschriebene kommerzielle Endothelzell-Medien wurden modifiziert und für jedes Versuchsvorhaben speziell angesetzt. Das zuzusetzende FCS war für 30 min auf 55°C erhitzt worden, um das Komplementsystem zu inaktivieren. Im Anschluß daran wurde es zu je 40 ml aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. 2.1.2 Beschichtung der Kulturflaschen Gelatine (DIFCO, USA) Phosphat Buffered Saline (PBS, Biochrom, Berlin, Deutschland) Zur Beschichtung wurde eine sterile 1,5%-Gelatine-Lösung (bovine Gelatine in aqua dest) zubereitet und in Kulturflaschen oder Kulturplatten abgefüllt. Es wurden ca. 6 ml -19- Lösung für eine 75 cm2 Kulturflasche und 1 ml Lösung pro Well für eine 6-Well-Platte benötigt. Danach erfolgte eine 20 min. Inkubation in einem Brutschrank bei 37° C. Anschließend wurde die so hergestellte Gelatine-Beschichtung der Kulturflaschen oder Platten mit PBS-Waschpuffer (w/w Ca2+ / Mg2+) gewaschen. Die Gelatine-Beschichtung ist für optimale Zelladhäsion und stabile Haftung der HUVEC auf den Kulturflaschenböden notwendig. Gelatine stellt im Vergleich zu Fibronektin und humanem Kollagen eine leicht anwendbare und preiswerte extrazelluläre Kollagenmatrix dar, die für Endothelzellwachstum essentiell ist. 2.1.3 Herkunft der Nabelschnüre Die verwendeten Nabelschnüre wurden von der gynäkologischen Abteilung des St. Josef Krankenhauses Freiburg (Chefarzt: PD Dr. Schmitt) zur Verfügung gestellt. Sie wurden in sterilen 100 ml-Kunstoff-Gefäße (Mehrzweckbecher) aufbewahrt und bis zur Präparation bei +4° C gelagert. Eine Präparation der Nabelschnur und Isolation der HUVEC fand nicht statt, wenn der Geburtstermin länger als 24 Stunden zurücklag. 2.1.4 Isolierung einer HUVEC Endothelzellkultur 75 cm² Kulturflaschen (COSTAR, Bodenheim, Deutschland) Phosphat Buffered Saline (Biochrom, Berlin, Deutschland) Dispase II (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Die Präparationsvorschrift geht in ihrer 1972 beschriebenen Form auf Jaffe et al. zurück. Im Verlauf wurden aber zusätzliche Modifikationen vorgenommen (siehe auch Jaffe et al., 1973). Sämtliche verwendeten Instrumente und Flüssigkeiten lagen steril vor. Während der Präparation in der Sicherheitswerkbank wurden mit Äthanol desinfizierte Latex-Handschuhe getragen. Die Nabelschnüre wurden mit Kompressen gereinigt. In beide Enden der Nabelschnurvene wurden Dreiwegehähne mit Schläuchen (Discofix-3 mit LuerLock) eingeführt und mit Kabelbändern befestigt. Mit einer 20 ml Infusionsspritze wurden die Nabelvenen mit PBS solange gespült, bis das Blut komplett entfernt war. Danach wurden die Nabelvenen mit Dispase II aufgefüllt, die Hähne der Schläuche -20- verschlossen, die Nabelschnüre in Alufolie verpackt und im Brutschrank 40 min inkubiert. A B C D Abbildung 2.1: Fotografische Darstellung zwei humaner Nabelschnüre zur HUVEC Isolation (A) und zwei Schläuche, die an beiden Enden der vena umblicalis befestigt sind (B). Auf der Abbildung (C) ist ein Dispase-Injektionssystem für die schonende Isolation von Endothelzellen dargestellt. Nach der 40minutigen Inkubation im Brutschrank wird die Dispase II mit abgelösten HUVEC aus der Nabelschnurvene evakuirt (D). Danach wurde Dispase in 50 ml Falcon-Röhrchen abgefüllt und Nabelvenen mit PBS gründlich durchgespült. Die gewonnene Suspension wurde zentrifugiert (10 min bei 1200 Upm, +4° C). Das so gewonnene Sediment wurde entnommen und im ECGM resuspendiert. Die zubereitete Zellsuspension wurde in die vorbereiteten 75 cm² Kulturflaschen in 12 ml ECGM verteilt und im Brutschrank bei 37° C und 5% CO2 inkubiert. Mediumwechsel erfolgten jeden 2 Tag. -21- 2.1.5 Kultivierung von HUVEC Trypsin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Trypan Blue (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Bei 70-90% Konfluenz der Zellen wurde die Passage durchgeführt. Das Medium wurde aus den Kulturflaschen angesaugt und die Kultur einmal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden der Zellkultur 2 ml auf 37° C aufgewärmtes Trypsin zugesetzt. Nachdem sich die Zellen abzurunden begannen, wurde das Trypsin abgesaugt. Intermittierendes Abklopfen, sogenannter "shake-off", sorgte für das Ablösen der Zellen vom beschichteten Flaschenboden, mit ECGM wurden die Zellen abgespült und zentrifugiert (10 min bei 1200 Upm). Das Sediment wurde in 2 ml ECGM resuspendiert und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Dazu wurden 50 µl der Zellsuspension mit 50 µl 0,4% Trypanblau gut gemischt. Die Zellzahl pro ml wurde nach der Formel: Anzahl der Zellen in 4 Quadraten der Neubauer-Zählkammer x 2,5 x 2 x 1000 berechnet. Anschließend wurden die Zellen (3.000-5.000 Zellen pro cm² ausrechnen) in Kulturflaschen ausgesät und im Brutschrank gelagert. 2.1.6 Austestung von Matrix-Materialen auf Stabilität Zwei verschiedene Kollagenmatrices wurden zur Etablierung einer dreidimensionalen Endothelzellkultur verwendet. Als erstes wurden beide Matrices auf die Stabilität getestet. TissuVlies (Baxter-Immuno, Heidelberg, Deutschland) besteht aus nativem bovinem Kollagen I. TissuVlies enthält pro cm³ 5,6 mg Kollagen. Es wird zur Blutstillung in der Chirurgie angewendet. Außerdem ist TissuVlies als Träger-Matrix von verschiedenen Zelltypen verwendet worden. Matrigel besteht aus einem Basalmembranen-Extrakt der Engelbreth-Holm-SwarmTumorzellen (EHS) und verwandelt sich in ein Gel bei Raumtemperatur. Die wichtigsten Bestandteile des Matrigels sind Laminin, Kollagen Typ IV, Entaktin und Heparan-Sulfat-Proteoglykan. Matrigel wird als spezielles Kulturmaterial für Endothelzellkulturen kommerziell angeboten und enthält außerdem vom Hersteller nicht publizierte Komponenten. -22- Es wurde ein wachstumsfaktorenreduziertes Matrigel benutzt, damit die Auswirkungen von bFGF und VEGF auf die HUVEC in einer dreidimensionalen Matrix untersucht werden können (Gehalt von bFGF im wachstumsfaktorenreduziertem Matrigel: 0-0,1 pg/ml; VEGF ist nicht vorhanden). TissuVlies wurde in gleiche Stücke geschnitten, sodaß der Well-Boden komplett bedeckt war und auf dem Boden der Wells einer 24-Well-Platte mit Gelatine-Gel fixiert. Nicht verdünntes Matrigel (ca. 500 µl) wurde in jedes Well der 24-Well-Platte gegeben. Nach 10 min Inkubation bei 37° C verwandelte sich die Lösung in ein Gel. Anschließend wurden die Wells mit den Proben mit ECGM aufgefüllt und im Brutschrank für 21 Tage inkubiert. Im Laufe des Versuches wurden die getesteten Matrizen jeden zweiten Tag aus den Wells entnommen und visuell mit Hilfe eines Lichtmikroskopes auf strukturelle Veränderungen untersucht. Nach der Inkubation wurden die Proben aus den Wells endgültig entnommen und histologisch aufgearbeitet. 2.1.7 Hämatoxilin-Eosin Färbung Die Hämatoxilin-Eosin-Färbemethode läßt die den blauen Farbstoff Hämatoxilin (oder Hämalaun, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) aufnehmenden Zellkerne deutlich gegen das mit Eosin rötlich gegengefärbte Zytoplasma hervortreten. Die Färbung wurde in Glasküvetten nach folgendem Protokoll vorgenommen: - Aqua deion.; 3-maliges Spülen - Hämalaun Mayer 1%-Lösung; Färben für 7 min - Leitungswasser, fließend; Spülen für 15 min - Eosin; Gegenfärben für 1 min - C2H5OH70%; Fixieren für 30 sec - C2H5OH80%; Fixieren für 30 sec - C2H5OH95%; Fixieren für zweimal 2 min - C2H5OHabs.; Fixieren für zweimal 2 min - Xylol; Fixieren für zweimal 5-10 min -23- Danach folgte das Eindecken mit Glycergel (DAKO, Dänemark) und SuperFrostDeckgläsern. 2.1.8 Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31-Antikörper Peroxidase Blocking Reagent (DAKO, Hamburg, Deutschland) Ziegen-Serum (DAKO, Hamburg, Deutschland, Goat Serum,Normal) CD 31-Antikörper (DAKO, Hamburg, Deutschland) EnVision+ (DAKO, Hamburg, Deutschland, Goat-Anti-Mouse) DAB (DAKO, Hamburg, Deutschland, Liquid DAB+ Chromogen System) AEC (DAKO, Hamburg, Deutschland, AEC+ Chromogen System) Glycergel (DAKO, Hamburg, Deutschland) Die CD 31-Antikörper werden durch eine starke Reaktion mit formalin-resistenten Epitopen auf der Endothelzell-Oberfläche in normalen und malignen Gewebetypen charakterisiert. Dieses Antikörper wurde offiziell als ein spezifischer humaner Endothelzellmarker auf dem Fifth International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens in Boston (1993) anerkannt. Die Färbungen wurden an Paraffin- und Kryoschnitten vorgenommen. Um die Paraffinschnitte zu fixieren, wurden diese mit einer 4% Formalin-Lösung über 24 Stunden bei +4° C behandelt. Danach wurden diese automatisiert (HistoKinnete, Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) über 14 Stunden bearbeitet und anschließend im Paraffin eingebettet und geschnitten. Danach wurden die Schnitte mit einer Methanol-Äthanol-Reihe entparaffiniert. Bei Verwendung von kryopräservierten Präparaten wurden 3-5 µm dicke Schnitte von einem schockgefrorenen Gewebeblock mit dem Kryotom (Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) angefertigt. Um das Gefriermedium zu lösen, wurden die Objektträger für 10 min in Azeton eingelegt. Der weitere Färbungsvorgang wurde für beide Fixierungsarten gleich durchgeführt. Die Histologien wurden einmal mit PBS gewaschen und mit Peroxidase Blocking Reagent 10 min inkubiert. Nach jedem Vorgang wurden die Objektträger sorgfältig abgetupft, um die Vermischung verschiedener Färbungskomponente zu vermeiden. Anschließend wurden die Schnitte mit PBS zwei mal gewaschen und mit 10% Ziegen-Serum-Lösung (in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach -24- diesem Vorgang wurden die Proben nicht mit PBS gewaschen sondern gleich mit Erst-Antikörper-Lösung (CD 31) für 30 min inkubiert. Zubereitung der CD 31-ErstAntikörper-Lösung: 900 µl (1% BSA-Lösung in PBS) + 100 µl (CD 31-Antikörper) = 1000µl (CD 31-Erst-Antikörper-Lösung, pro Schnitt ungefähr 100 µl). Alternativ kann das Präparat mit der Erst-Antikörper–Lösung über die Nacht bei +4° C im Kühlschrank inkubiert werden. Es wurde eine "Negativ"- und "Positiv"-Kontrolle angelegt. Als "Positiv"-Kontrolle wurde ein Schnitt normaler humanen Haut verwendet und als "Negativ"-Kontrolle diente ein beliebiger Schnitt aus der Reihe, die zur Färbung vorbereitet wurde. Die beiden Kontrollen wurden einem normalen Färbungsvorgang unterworfen, nur die "Negativ"-Kontrolle wurde anstatt CD31-Lösung mit der BSA-Lösung bearbeitet. Die beiden Kontrollen dienten zur Bestätigung der Färbungsergebnissen und deren Effizienz. Nach der Inkubation mit CD 31-Antikörper wurden die Proben dreimal mit PBS gewaschen und gründlich abgetupft. Danach wurden die Schnitte mit einer Zweitantikörper-Lösung (+EnVision®, DAKO) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3 mal mit PBS gewaschen. Zur Färbung der markierten Zellen wurde eine DAB- oder AEC-Chromogen-Lösung vorbereitet. Die Chromogene sind sehr lichtempfindlich und sollten deshalb in einer Dunkelkammer auf die Schnitte aufgegeben und durchschnittlich für 5 min inkubiert werden. Anschließend wurden die Histologien einmal mit aqua destillata gewaschen und mit Hämalaun (Hintergrundfärbung, ca. 3 min Inkubation) gefärbt. Die Schnitte sollten nicht austrocknen, bevor sie mit Glycergel eingedeckelt wurden. 2.1.9 Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittels CD 105 (Endoglin) Antikörper CD 105-Antikörper, Endoglin (DAKO, Hamburg, Deutschland) Die Färbung erfolgte nach einem identischen Färbeprotokoll wie im Kapitel 2.1.8. . CD 105-Antikörper beziehungsweise Endoglin markieren spezifisch nur die proliferierenden humane Endothelzellen im Gewebe (Cheitetz et al., 1992; Bellon et al., 1993). -25- Endoglin ist ein transmembranes Type I Protein, das sehr stark von humanen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird. Steigerung der Endoglinexpression wurde in Tumorgefäßnetzen und proliferierenden Zellen nachgewiesen (Burrows et al., 1995; Matsuzaki et al., 1987). 2.1.10 Etablierung von 3D tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices TissuVlies (Baxter-Immuno, Heidelberg, Deutschland) Matrigel (Becton- Dickinson, Heidelberg, Deutschland) 0,4 µm Membraneneinsätze für 24-Well-Platten (Falcon, Heidelberg, Deutschland) 24-Well-Platten (Falcon, Heidelberg, Deutschland) Für die Implantation der HUVEC in TissuVlies wurden 24-Well-Platten verwendet. TissuVlies wurde in gleiche Stücke steril so geschnitten, daß der Boden von 0,4 µm Membraneneinsätzen (siehe Abbildung 2.3) komplett bedeckt war. Die Oberfläche von TissuVlies wurde mit einer Kanüle mehrmals perforiert, damit sich die Zellen gleichmäßig im Schwamminneren verteilen konnten. Die HUVEC-Zellen wurden abtrypsiniert und abgezählt. Es wurden 100.000, 300.000, 500.000, 700.000, 1.000.000 Zellen (in Triplex-System: 3 Proben/ Ansatz) auf die perforierte Oberfläche der TissuVlies-Stücke in 200 µl ECGM ausplattiert und für 15 min im Brutschrank bei 37° C inkubiert damit die Zellen von dem Kollagen-Schwamm aufgesaugt werden können. In ein Well wurden zur Kontrolle keine Zellen gegeben. Nach dieser Inkubation wurden in jedes Well 600 µl von ECGM gegeben. Die Proben dieses Konstruktes wurden am Tag 1, 2, 5, 7 und 14 entnommen, geschnitten und gefärbt. Zur Implantation von HUVEC in Matrigel wurden 24-Well-Platten verwendet. Zunächst wurden in jeden Membraneneinsatz 200 µl von nicht verdünntem Matrigel gegeben und im Brutschrank bei 37° C 10 min inkubiert. Die Zellen wurden vorbereitet und nachdem das Gel verfestigt war auf die Oberfläche Matrigel in 200 µl ECGM ausplattiert. Danach wurden die Platten 1 Stunde im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurden in jeden Einsatz noch 200 µl Matrigel gegeben (sogenanntes "Sandwich"-Modell). Die Bildung von tubulären Strukturen wurde mit der Hilfe der Lichtmikroskopie verfolgt. Die Proben wurden am Tag 1, 2, 5, 7 und 14 entnommen, fixiert, geschnitten und gefärbt. -26- Für die histologische Untersuchung wurde Matrigel erst 24 Stunden nach Explantation aus dem Well im 4 % Formalin-Lösung bei +4° C fixiert und dann mit Flüssig-Stickstoff tiefgefroren. Paraffin-Schnitte gelangen nur bei TissuVlies, Matrigel dagegen löste sich in der HistoKinette (Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) auf und war daher nicht schneidbar. 2.1.11 Proliferationsmessungen von HUVEC mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF rhFGF (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) rhVEGF (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) rhEGF (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Es wurden 6-Well-Platten verwendet und mit 1,5% Gelatin-Lösung beschichtet. Die HUVEC wurden durch Inkubation mit Trypsin abgelöst, ausgezählt und 50.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten ausplattiert. Über 24 Stunden wurden die Zellen in ECBM (wachstumsfaktorenfrei) „verarmt“, damit diese besser auf die WachstumsfaktorenStimulation reagieren. Zur Ausbildung von VEGF-Rezeptoren wurde ein Teil der HUVEC über 4 Passagen mit rekombinantem bFGF (1,0 ng/ml) vorstimuliert. Die Wachstumsfaktoren-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen (0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20 ng/ml) wurden in ECBM vorbereitet und nach 24 Stunden auf die Zellen in Triplex-System gegeben. Konzentrationsgruppen Parallel angelegt, wurde wobei die eine HUVEC Kontrolle mit für jede ECBM ohne Wachstumsfaktoren inkubiert wurden. Das ECBM mit Wachstumsfaktoren mußte jeden zweiten Tag gewechselt werden, bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichten. Danach wurden die Zellen aus den 6Well-Platten abtrypsiniert, ausgezählt und mit der Kontrolle verglichen. 2.1.12 Auszählen der HUVEC Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch Trypsin abgelöst. Die gewonnene Zellsuspension wurde gut in ECBM resuspendiert und 100 µl wurden auspipettiert. Für jedes Well wurde ein spezielles Becher mit 10 ml isotonischen Lösung vorbereitet und 100 µl von der Zellsuspension wurde dazu gegeben. Ausgezählt -27- wurde mit dem CultureCounter. Alternativ wurde eine Neubauer-Zell-Zählkammer verwendet (siehe Kapitel 2.1.5). 2.1.13 HUVEC Proliferationsmessungen mit 3H-Thymidineinbau/DNA-Synthese 48-Well-Platten (COSTAR, Bodenheim, Deutschland) Thymidinstammlösung (14,4 mg/20 ml (3mM), Lösung steril filtrieren und Aliquote. einfrieren) 3 H-Thymidin (1mCi/ml, verdünnt mit sterilem PBS auf 0,025 mCi/ml) ß-Counter (Beckman, Deutschland) In 48-Well-Platten wurden 10.000 Zellen pro Well in ECGM ausplattiert, diese adhärierten über Nacht und begannen zu proliferieren. Am nächsten Tag wurde das ECGM gegen ECBM ausgetauscht um die Zellen zu verarmen (im ECBM ohne Wachstumsfaktoren und nur mit 2% FCS-Zusatz kultiviert), die Zellen wurden 24 Stunden im Brutschrank bei 37° C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und die Wachstumsfaktoren-Lösungen auf die Zellen gegeben und 18 Stunden inkubiert. Danach wurden 10 µl 3H-Thymidinlösung (0,025 mCi/ml) in jedes Well gegeben und 6 Stunden im Brutschrank inkubiert. Waschschritte mit je 0,25 ml: PBS (möglichst schnell), MeOH zweimal je 5 min, TCA zweimal je 10 min, H2O einmal. Nach dem Waschvorgang wurden 0,25 ml 0,3 M NaOH in jedes Well geben und 5 min inkubiert. Dann wurden 2,5 ml ECO Plus in jedes Szintillationsgefäß gegeben und mit Überständen aus den Wells gut vermischt. Die Gefäße wurden gut geschüttelt und 5 min inkubiert, danach im ß-Zähler gemessen. 2.1.14 Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Escort Transfektionsreagenz Escort Transfection Reagent (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Es wurden 50.000 Zellen pro Well im ECGM ausplattiert und über 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Eine Escort-DNA-Mischung (für eine drei Proben pro Ansatz HUVEC-Transfektion) wurde angesetzt: 1 vol DNA zu 2 vol Escort + DMEM (ohne Zusätze) = 250 µl/Well. Die Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurden 2 ml ECGM dazugeben und mit der Pipette gemischt. Während -28- der Inkubationszeit wurden die HUVEC für die Transfektion vorbereitet. Das Medium wurde aus den Wells entfernt und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Die Escort-DNA-Mischung wurde auf die Zellen gegeben (0,7 ml/Well bei 6-WellPlatten) und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 (niedriger Gehalt von CO2 < 2% verbessert die Transfektionseffiziens) 5-6 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Transfektionsmischung abgesaugt und die Platten wurden mit ECGM einmal gewaschen. Anschließend wurden 2 ml ECBM pro Well (6-Well-Platten) gegeben und im Brutschrank inkubiert. Jeden Tag wurden die Überstände abgenommen (komplett 2 ml) und mit frischem ECBM (ohne Wachstumfaktoren und < 2% Serumgehalt) ersetzt. Zur Implantation von transfizierten Endothelzellen in die dreidimensionalen Matrizen wurde eine spezielle Methode der „Transfektion in der Suspension“ entwickelt. Die Zusammensetzung der Transfektionsmischung ist die gleiche wie bei dem StandardTransfektionsverfahren, die Zellen wurden aber vorher nicht in die Well-Platten ausplattiert, sondern zur Transfektions-Mischung hinzugegeben. Die gewonnene Suspension wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend in die ausgewählte Matrix injiziert. 2.1.15 Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Fugene 6 Transfektionsreagenz Fugene 6 (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Es wurden 50.000 Zellen pro Well (6-Well-Platten) im ECGM ausplattiert und über 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Es mußten zwei Typen von Lösungen vorbereitet werden (L1 und L2). Lösung 1: Proportion DNA zu Fugene 6 war mindestens 1:2, das heißt 1 vol DNA mit 2 vol Fungene 6 wurden tropfenweise, ohne den Rand des Tubes zu berühren gut vermischt und 5 min bei Raumtemperatur mit ECBM (ohne Serum- und Wachstumsfaktoren-Zusatz) inkubiert. Zur gleichen Zeit wurde auch Lösung 2 vorbereitet, die nur aus DNA bestand. Danach wurden die beiden Lösungen gut vermischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Vor dem Transfektionsvorgang wurde das ECGM abgesaugt und frisches ECBM 2 ml pro Well gegeben. Nach der Inkubation wurde die Transfektionslösung -29- (L1+L2) auf die Zellen (100 µl pro 35 mm Well) gegeben. Die Überstände (komplett 2 ml) wurden jeden Tag abgenommen und mit frischem ECBM ersetzt. 2.1.16 ELISA - hVEGF- Immunoassay Quantikine-Kit human VEGF (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Assay Diluent RD1J (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Assay Diluent RD1W (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Wash Buffer (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) VEGF Conjugate (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Stop Solution (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) ELISA-Reader Das VEGF-Immunnoassay wurde mit Hilfe des Quantikine-Kit durchgeführt. Alle KitBestandteile mußten bei +4° C gelagert werden. Vor dem Beginn der Arbeit wurden alle Reagezien auf Raumtemperatur aufgewärmt . Alle Proben und Standards wurden doppelt angelegt werden. Die Folie wurde von der Reagenzplatte entfernt. Es wurden 50 µl von Assay Diluent RD1J zu jeder Probe und Standard gegeben. Assay Diluent RD1J verfügt über starke Präzipitationseigenschaften. Deshalb wurde das Reagenz in den Wells gut gemischt. Dann wurden in jedes Well 200 µl von der Standart-Lösung oder der Proben gegeben. Die Reagenzplatte wurde mit Folie zugeklebt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Wells aspiriert und dreimal mit Wasch-Puffer (400 µl) gewaschen. Für bequemeren Wachsvorgang wurden multi-channel-Pipetten benutzt. Komplette Absaugung von den Reagenzien aus jedem Well garantiert die Präzision der Ergebnisse. Nach dem letzten Waschvorgang wurde der Wasch-Puffer sorgfältig aus den Wells aspiriert und die Platte auf einem sauberen Tuch abgeklopft, damit die Reste der Flüßigkeit aus den Wells entfernt werden könnten. Danach wurden jedem Well 200 µl VEGF-Konjugat zugesetzt. Die Platte wurde mit einer neuen Folie zugeklebt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Waschschritte (wie oben beschrieben) wurden wiederholt. Nach der Inkubationszeit wurden in jedes Well 200 µl von der Substrat-Lösung gegeben und 20 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden pro Well 50 µl der Stop Solution gegeben und gut vermischt. Die Ergebnisse wurden in einem ELISE-Reader innerhalb von 30 min. (450 µm-Filter) abgelesen. -30- 2.1.17 Trennkammersystem Das Trennkammersystem-Model dient zur Untersuchung der Wirkung transfizierter Zellen, auf nicht-transfizierte Zellen. Dabei werden die transfizierten Zellen auf einem semipermeablen Membraneinsatz (0,1 µm) kultiviert. Nicht-transfizierte Zellen sind auf dem Well-Boden ausplattiert. (siehe Abbildung 2.3). Das exprimierte Protein kann somit durch die semipermeable Membran treten. Ein möglicher stimulierender Effekt auf die nicht-transfizierten Zellen kann dann quantifiziert werden. Als die nicht-transfizierten Zellen eine 80-90%ige Konfluenz erreicht hatten, wurden sie abtrypsiniert und ausgezählt. A B C D E F Abbildung 2.3: Schematische Darstellung des Trennkammersystems: A) Membranseinsatz; B) Endothelial Cell Basal Medium (ohne Wachstumsfaktorenn); C) hVEGF-165-transfizierte HUVEC; D) 0,1 µm Membrane; E) Nicht-transfizierte HUVEC; F) Well. -31- 2.2. GENTECHNISCHE METHODEN Falls nicht anders angegeben, wurden die molekularbiologischen Methoden aus dem Laborhandbuch „Molecular cloning“ (Sambrook et al., 1989) entnommen und entsprechend modifiziert. Auch die gängigen Puffer wurden nach diesem Buch hergestellt. Veränderungen sind an entsprechender Stelle aufgeführt. 2.2.1 Puffer PBS: 137mM NaCL, 2,7 mM KCL, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH 7,4 TBS: 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCL TTBS: TBS + 0,05% Tween-20 (Fluka) TBE: 89 mM Tris, 89 mM Borat, 1 µM EDTA, pH 8,2 SDS-Gelelektrophoresepuffer: 250 mM Glycin, 0,1% SDS, 25 mM Tris/ HCL TAE-Laufpuffer zur Agarosegelelektrophorese: 40 mM Tris, 2 mM EDTA, auf pH 8,0, mit Essigsäure eingestellt 10x DNA-Auftragungspuffer: 10 mM Tris pF 7,8, 1 mM EDTA, 80% Glyzerin, 0,2% Bromphenolblau Proteinauftragspuffer für SDS-PAGE: 125 mM Tris, pH 6,8, 2,5% SDS, 10% Glyzerin, 0,1% Bromphenolblau Kathodenpuffer für Western Blots: 25 mM Tris pH 10,4, 40 mM ε-Aminokapronsäure, 20% Methanol 2.2.2 Plasmide pcDNA/NEO III - VEGF 165 CMV-Promotor-Plasmid für stabile Transfektion mit hVEGF165. Selektion von Klonen ist möglich mit G418 Neomycin (GibcoBRL,Cat.Nr.10131-027) -32- pCMX - VEGF 165 CMV-Promotor-Plasmid für transiente Transfektion mit hVEGF165 1 APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRS Ic ic YCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGCCNDEGL ECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQ DPQTCKCSCKNTDSRCKA RQLELNERTCRCDKPRP165 Abbildung 2.4: hVEGF-165 Sequenz aus Keck et al. Arch Biochem Biophys 344 (1): 103-113, 1997 2.2.3 Herstellung kompetenter E. coli Zellen Lösung I 150 mM RbCl2, 50 mM MnCl2, 30 mM CoAc, 10 mM CaCl2, 13% Glyzerol, pH 5.8, steril filtriert Lösung II 10mM MOPS, 10 mM RbCl2, 75 mM CaCl2, 13% Glyzerol, pH 7.0, steril filtriert 500 ml Bakterienkultur wurden in LB-Medium bis zu einer OD550nm von 0,48-0,5 vermehrt und anschließend bei +4° C für 10 min bei 2200 Upm in einem JA 10 Rotor abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 170 ml eiskalter Lösung I resuspendiert und 1-2 h auf Eis gekühlt. Anschließend wurde die Suspension wie oben beschrieben zentrifugiert und das Zellsediment in 12,5 ml eiskalter Lösung II resuspendiert. Die Zellen wurden in Aliquots zu 250 µl schockgefroren und bei –80° C gelagert. -33- 2.2.4 Transformation von Plasmid DNA in E. coli Kompetente E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 100 µl Bakteriensuspension wurden mit 1 µl Plasmid-DNA bzw. der Hälfte eines Ligationsansatzes vermischt und für 20 min. auf Eis inkubiert. Es folgte ein Hitzeschritt von 90 Sekunden bei 42° C, 2 min. Inkubation auf Eis und 45 min, danach Mischen der Suspension bei 37° C in 1 ml LB Medium. Danach wurden die Bakterien auf ampicillinhaltigen Agarplatten (100 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37° C inkubiert. 2.2.5 Isolierung von DNA aus E. coli Lösung I 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1% Glukose Lösung II 0,2 M NaOH, 1% SDS 1,5 ml Bakteriensuspension einer Übernachtkultur wurden abzentrifugiert und in 100 µl kalter Lösung I resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe von 200 µl Lösung II für 5 min. Danach erfolgte die Inkubation auf Eis. Durch Zugabe von 150 µl 3 M Na-Acetat pH 5,2 und erneuter Inkubation auf Eis wurden chromosomale DNA und ein Teil der Proteine gefällt. Der Ansatz wurde 10 min. bei 13000 Upm zentrifugiert und der plasmidhaltige Überstand mit 500 µl Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die Plasmid-DNA wurde danach aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 1ml Äthanol und 10 min. Zentrifugation bei 13000 Upm gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 500 µl 70% Äthanol gewaschen, vakuumgetrocknet und in 50 µl aqua deion. mit 1µg RNAse resuspendiert. Für eine Plasmidisolierung in präparativem Maßstab wurden „Maxiprep“ und „Gigaprep“ Plasmidextraktionskits von Fa. QUIAGEN nach den Vorschriften des Herstellers verwendet. 2.2.6 Phenol-Chloroform Extraktion, DNA-Mengenbestimmung Um Proteine aus DNA-Lösungen zu entfernen, wurden diese mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) gemischt und die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die obere, wäßrige Phase wurde abgenommen und erneut mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Danach wurde die DNA mit Äthanol gefällt, mit 70% Äthanol gewaschen und vakuumgetrocknet. -34- Zur Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA-Lösungen wurden diese photometrisch bei 260 nm und 280 nm vermessen. OD260 von 1 entspricht dabei 50 µg/ml Doppelstrang-DNA, 40 µg/ml Einzelstrang-DNA oder 20 µg/ml Oligonukleotid. Der Quotient aus OD260 und OD280 gibt Aufschluß über Verunreinigungen durch Protein oder Phenol, die bei 280 nm stärker als DNA absorbieren. Bei reiner DNA ist der Quotient größer als 1,8. 2.2.7 DNA-Verdauung mit Restriktionsendonukleasen Zum Verdau von Plasmid-DNA wurden 2 bis 10 U/µg DNA in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer eingesetzt. Die Reaktion wurde je nach Enzym 2-12 h bei Raumtemperatur oder 37° C durchgeführt und durch Auftrennung der Fragmente mittel Agarosegelelektrophorese gestoppt. 2.2.8 Agarosegelelektrophorese DNA-Restriktionsfragmente und PCR-Produkte wurden elektrophoretisch je nach DNA Größe in 0,7-1,5% -igen Agarosegelen aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte bei 10 Volt/cm Gellänge in TAE-Puffer, das Gel wurde mit Ethidiumbromid versetzt und zur Visualisierung von DNA auf einem Transilluminator mit UV-Licht (366 nm) bestrahlt. Gewünschte DNA-Fragmente wurden mit dem Gel-Extraktion-Kit (Fa. QUIAGEN) eluirt. Die Banden wurden unter UV-Licht ausgeschnitten und entsprechend den Angaben des Herstellers behandelt. 2.2.9 Ligation von DNA-Fragmenten Zur Ligierung wurde Vektor-DNA und DNA-Insert in einem molaren Verhältnis von ca. 1:4 eingesetzt. Die Ligation erfolgte bei 15° C über Nacht in einem möglichst kleinen Volumen (15-30 µl) mit dem vom Hersteller gelieferten Ligasepuffer und 1 Weiss-Einheit an T4-Ligase (Boehringer Mannheim, Deutschland). Die Ligationsansätze wurden bei –20° C gelagert oder direkt zur Transformation von E. coli verwendet. -35- 3. ERGEBNISSE 3.1 Präparationen Im Rahmen dieser Dissertation wurden 116 Nabelschnüre präpariert. Davon stammten 72 Nabelschnüre von weiblichen und 44 von männlichen Neugeborenen. Dabei gelang die Präparation bis zur Ausplattierung bei 114 Nabelschnüren, was einem prozentualen Anteil von über 98% entspricht. Die durchschnittliche Länge aller präparierter Schnurstücke betrug 24,7 cm. Um genügend vergleichbare Zellen für die Kultur zu erhalten, wurden im Verlauf der Dissertation zunehmend die Zellen mehrerer Präparationen zu einer Kultur zusammengefaßt und gemischt ausplattiert. So konnte ausreichend vergleichbares Zellmaterial für Kontroll- und Stimulationsexperimente gewonnen werden. Einzelne Kulturen, die durch eine eventuelle Unverträglichkeit der vereinigten Zellen ein geschwächtes Anheftungspotential bzw. eine verminderte Vitalität besaßen, konnten im Rahmen der Kulturbedingungen unter dem Lichtmikroskop an der gestörten Monolayer-Bildung erkannt und von den Stimulations-Experimenten ausgeschlossen werden. 3.2 HUVEC Zellkultur In Experimenten mit ECBM (serumreduziertes Medium) gelang unter den oben beschriebenen Bedingungen keine kontinuierliche Zellkultur (Zell-Linie). Die Zellen wurden daher für die Proliferationsassays und Implantationsversuche mit ECGM (Serumanteil 5%) bis Passage 4 kultiviert. Das ECGM enthält rekombinante Wachstumsfaktoren wie bFGF und EGF, die das Wachstum der Zellen und die Ausbildung der Rezeptoren fördern. Zur Ausbildung von VEGF-Rezeptoren mußten die Endothelzellen zum Beispiel über mindestens 4 Passagen mit bFGF (> 0,1 ng/ml) vorstimuliert sein. Während der Aussaat lagen die Endothelzellen meist als Cluster mehrerer zusammenhängender Zellen bzw. Endothelzell-Monolayer-Fragmente, vor. Daneben fanden sich (je nach Präparation unterschiedlich viele) Erythrozyten. Bei adäquater Präparation ließ sich bereits innerhalb von 24 Stunden nach Aussaat eine -36- Monolayerbildung beobachten. Nun konnte die Monolayer-Kultur mit frischem ECGM zweimal gewaschen, von den nicht-adhärenten Erythrozyten befreit, und ein Mediumwechsel durchgeführt werden. Dies war in knapp 90% der Kulturen der Fall, 10% der Kulturen mußten verworfen werden. Die Stabilität der Anheftung an der Gelatinebeschichtung konnte durch Langzeitkulturen nachgewiesen werden. Wurden die Endothelzellen jedoch auf unbeschichtetem Kunststoff oder Glas ausgesät, so lösten sie sich bereits nach 3-4 Tagen vom Boden ab und wurden mit dem ausgewechseltem Medium entfernt. Die vorerst noch verbleibenden Zellen waren nicht in der Lage, die entstandenen Lücken durch Proliferation und Wachstum zu schließen. Bereits nach einem weiteren Tag in ECGM (Alter der Zellen in Kultur 2 Tage) hatten sie das charakteristische Aussehen des Monolayers weitgehend angenommen. Am dritten Tag zeigte sich das typische pflastersteinartige, durch engen Zell-Zell-Kontakt ausgezeichnete Erscheinungsbild der Endothelzellen (siehe Abbildung 3.1). Sie stellen sich als 30 bis 40 µm breite und 60 bis 95 µm lange polygonale Zellen dar mit einer maximalen Wachstumsdichte von 105 Zellen pro cm2 (Gimbrone et al., 1974). Abbildung 3.1: Lichtmikroskopische Phasenkontrastaufnahme des Endothelzell-Monolayers mit charakteristischem pflastersteinartigem Aussehen. Dieses Aussehen verändert sich in den folgenden Tagen nicht nennenswert. Erst nach mindestens 6 bis 8 Tagen in Kultur traten in wenigen Fällen durch -37- Differenzierung von Endothelzellen andersartige Zellen auf. In der Hauptsache handelt es sich dabei vermutlich um glatte Muskelzellen oder Fibroblasten. Nach 13-15 Tagen in Kultur ohne Passagieren zeigten sich die Zellen der Langzeitkulturen in ECGM meist am Ende ihrer Lebensfähigkeit, sie lösten sich in großer Zahl von der Unterlage ab und die verbleibenden veränderten ihr Aussehen rasch. 3.3 Färbung mit Hämalaun und Eosin Als Basisfärbung sowie zur Hintergrundfärbung der Immunhistochemien wurden Hämalaun-Eosin-Färbungen (HE-Färbungen) durchgeführt. Deutlich treten die durch das Hämalaun blau gefärbten Zellkerne gegen das durch das Eosin rötlich gefärbten Zytoplasma hervor. 3.4 Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31-Antikörper Das zum Nachweis der humanen Endothelzellen als Chromogen verwendete DAB zeichnet sich durch Bildung eines braunen Farbstoffes aus. Als Gegenfärbung wurde ein schwaches Blau durch Hämalaun verwendet. Abbildung 3.2 zeigt EndothelzellMonolayer nach Fixierung und immunhistologischer CD 31-Färbung (gelungener Färbereaktion). Wie deutlich zu erkennen ist, färben sich die Zellen im Zytoplasma durch den dort vom spezifisch gebundenen Enzym gebildeten Farbstoff bräunlich. Es kann also nicht um Zellen der glatten Muskulatur oder Fibroblasten gehandelt haben. 3.5 Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittels CD 105-Antikörper Das beim Nachweis der proliferierenden humanen Endothelzellen mit CD 105Antikörper verwendete Chromogen AEC+ zeichnet sich durch Bildung eines roten Farbstoffes auf der Zelloberfläche aus. Als Gegenfärbung wurde ein schwaches Blau durch Hämalaun verwendet. Abbildung 3.3 zeigt die auf Kammer-Objektträgern -38- A Abbildung B 3.2: Lichtmikroskopische Abbildung der spezifischen CD 31 immunhistochemischen Färbung der Endothelzellen (Vergrößerung: Bild (A) x100, Bild (B) x200). C D B Abbildung 3.3: Lichtmikroskopische Abbildung der spezifischen Immunhistochemie mit humanen CD 105-Antikörpern und AEC+ Chromogens. Die proliferierenden humane Endothelzellen, die Endoglin exprimieren wurden rötlich gefärbt, Hintergrundfärbung wurde mit Hämalaun durchgeführt. (Vergrößerung: Bild (C) x100, Bild (D) x200). -39- proliferierenden Endothelzellen nach Fixierung und immunhistochemischer CD 105Färbung (gelungene Färbereaktion). Wie deutlich zu erkennen ist, färben sich die Zellen im Zytoplasma durch den dort vom spezifisch gebundenen Enzym gebildeten Farbstoff rötlich. Die Endothelzellen haften auf der Gelatine-Beschichtung und proliferieren, was durch die rötliche Färbung der Endothelzellen auf der Abbildung 3.3 bestätigt wird. 3.6 Austestung von Matrix-Materialien auf Stabilität Die histologische Untersuchungen zeigten, daß die Struktur von TissuVlies über 21 Tage im ECGM in vitro nur geringe makroskopische Veränderungen aufweist. Auch nach längerer Inkubation bleibt der Kollagenschwamm stabil und kann leicht mit Hilfe einer Pinzette transponiert werden. Dagegen hat sich die Gel-Konsistenz von nicht verdünntem Matrigel nach 21 Tagen Inkubation in ECGM erheblich aufgeweicht und 50% seines Volumens verloren. Das heißt, daß TissuVlies im Vergleich zu Matrigel in der feuchten Umgebung über längere Zeit stabil bleibt und daher eine geeignete Matrix für eine in vivo Implantation von Endothelzellen darstellt. 3.7 Etablierung von dreidimensionalen tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices Bereits 24 Stunden nach der Implantation von HUVEC in TissuVlies ließen sich die Zellen auf den Kollagenfasern nieder und begannen zu proliferieren. Es bildeten sich auch „tubuläre“ Strukturen, die den ersten Schritt zur Bildung eines Kapillarnetzes in vivo darstellen (siehe Abbildung 3.4). Die Endothelzellen legten sich dabei an die Kollagenfasern an und bildeten teils eine lumenartige Struktur aus. Aufgrund der Gelstruktur und der zur Endothelzellkultur optimale Zusammensetzung B nach der Implantation von HUVEC von Matrigel bildeten sich bereits 6 Stunden tubuläre Strukturen, sogenannte „tube-like“-Formationen aus (siehe Abbildung 3.5). Mit Hilfe des Lichtmikroskops konnte eine gezielte Migration der HUVEC und deren dreidimensionale Organisation im Matrigel beobachtet werden. -40- A B Abbildung 3.4: A) Lichtmikroskopische Abbildung der TissuVlies-Histologie ohne implantierte HUVEC. Die Kollagenfasern sind mit Hämalaun blau gefärbt (x200). B) Lichtmikroskopische Abbildung der TissuVlies-Histologie mit implantierten HUVEC nach 7 Tagen (x300). Die Endothelzellen sind mittels CD 31-Immunhistochemie und DAB-Chromogen braun gefärbt, die Hintergrundfärbung wurde mit Hämalaun durchgeführt. Die Endothelzellen haben sich an die Kollagenfasern angelegt und bilden ein Lumen aus (Kreis-Markierungen auf der Abbildung B). C D Abbildung 3.5: C) Lichtmikroskopische Abbildung der ins Matrigel implantierten Endothelzellen (unmittelbar nach der Implantation, x100). D) Lichtmikroskopische Abbildung der ins Matrigel implantierten HUVEC. Endgültige Organisation der Endothelzellen in die „tube-like structures“ (24 Stunden nach der Implantation, x200). -41- 3.8 Proliferationsuntersuchungen von HUVEC mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF in Monolayer-Kultur Die Proliferationsassays konnten mit allen drei genannten Wachstumsfaktoren erfolgreich durchgeführt werden. Mit allen Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren konnte ein proliferierender Effekt auf die Endothelzellen erreicht werden. Der insgesamt stärkste proliferierende Effekt wurde durch bFGF (Abbildung 3.6 und Tabelle 3.7) erzielt, gefolgt von VEGF und EGF (t -Test, n = 24 pro Gruppe, p ≤ 0,05). EGF wurde dabei erstmals im Vergleich mit zwei sehr potenten angiogenen Wachstumsfaktoren untersucht. Dabei fällt im Vergleich zu den anderen Faktoren auf, daß mit allen Konzentrationen ein ähnliche Stimulation erreicht werden kann. Anzahl der HUVEC (in Tausend) 400 350 Kontrolle 300 0,2 ng /ml 250 0,5 ng /ml 1 ng /ml 200 2 ng /ml 150 5 ng /ml 100 10 ng /ml 20 ng /ml 50 0 bFGF VEGF EGF Abbildung 3.6: Graphische Darstellung der Ergebnisse der Proliferationsassays mit HUVEC und rekombinanten bFGF, VEGF und EGF in Konzentrationen 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 und 20 ng/ml. Auszählen der Zellen wurde mit Hilfe des CoulterCounter und der Neubauer-Zählkammer durchgeführt (siehe Tabelle 3.7 unten) -42- Kontrolle 87.300 ± 2.98 83.700 ± 2.720 86.400 ± 2.870 Konzentration rhbFGF rhVEGF rhEGF (ng/ml) (n=24) (n=24) (n=24) 0,2 232.218 ± 8.348 102.114 ± 3.830 158.976 ± 5.441 0,5 244.440 ± 9.523 122.202 ± 4.387 161.568 ± 5.497 1 279.360 ± 10.830 179.118 ± 6.964 176.256 ± 5.815 2 303.800 ± 11.890 239.382 ± 8.835 166.752 ± 5.609 5 338.720 ± 12.680 249.426 ± 8.913 163.296 ± 5.534 10 326.500 ± 12.070 244.404 ± 8.774 162.432 ± 5.516 20 323.010 ± 11.930 232.686 ± 8.449 159.840 ± 5.450 Tabelle 3.7: Tabelle der Absolutzahlen der Auszählung der HUVEC nach der Stimulation mit rekombinanten bFGF, VEGF und EGF im Vergleich zur Kontrolle. -43- Zur Kontrolle der oben aufgeführten Ergebnissen wurde parallel ein 3H-ThymidinEinbau bei HUVEC durchgeführt. Die mit rekombinanten Wachstumsfaktoren bFGF, VEGF und EGF stimulierten Endothelzellen proliferierten im Laufe von 24 Stunden. Nach 24 Stunden wurde die Stärke der radioktiven Intensivität des eingebauten 3HThymidins in HUVEC mit einem β-Zähler gemessen. 450 3 H-Thymidineinbau ( in %) 400 350 300 bFGF 250 VEGF EGF 200 150 100 50 0 0 0,2 0,5 1 2 5 10 20 ng/ml 3 Abbildung 3.8: Graphische Darstellung des H-Thymidineinbau-Proliferationsassays mit HUVEC und rekombinanten Wachstumsfaktoren bFGF, VEGF und EGF. Kontrolle wurde als 100% definiert und mit anderen Werten verglichen (t-Test, n=24 pro Gruppe, p ≤ 0,05). Auch hier zeigt sich der stärkste proliferative Effekt nach Stimulation mit bFGF, gefolgt von VEGF und EGF. Diese Untersuchung bestätigt die zuvor dargestellten Ergebnisse. 3.9 Proliferationsuntersuchung von HUVEC mit rekombinantem bFGF, VEGF und EGF in 3D Zellkultur in Kollagenmatrices Die stärkste Proliferationsaktivität von Endothelzellen nach der Stimulation mit rekombinantem bFGF, VEGF und EGF wurde in Monolayer-Kultur nachgewiesen, gefolgt von TissuVlies und Matrigel. In allen drei Gruppen war die Proliferation im Vergleich zu den Kontrollen erhöht (siehe Abbildung 3.9). Es besteht ein signifikanter -44- Unterschied in der Proliferationsaktivität zwischen der TissuVlies- und der MatrigelGruppe zur Monolayer-Kultur (t -Test, n = 15 pro Gruppe, p ≤ 0,05). In Matrigel begannen die HUVEC schon nach 12 Stunden zu migrieren und bildeten rasch die sogenannten „tube-like“-Formationen. Nach 72 Stunden stoppte die Migration und Organisation von HUVEC im Kollagengel und die „tube-like“Formationen begannen sich zu lösen. Anzahl der HUVEC (in Tausend) 140000 120000 100000 Anzahl der ausplattierten HUVEC Kontrolle 80000 rhEGF rhVEGF 60000 rhbFGF 40000 20000 0 Monolayer Matrigel TissuVlies Abbildung 3.9: Graphische Darstellung der Ergebnisse von Stimulation der HUVEC durch rekombinante bFGF, VEGF und EGF. Man sieht eine signifikante Proliferationsteigerung der HUVEC ® ® im TissuVlies im Vergleich zu Matrigel (t-Test, n=15 pro Gruppe, p≤0,05). Die Endothelzellen im Kollagenschwamm dagegen wiesen eine langsamere dreidimensionale Organisation, dafür aber eine wesentlich stärkere, im Vergleich zu Matrigel signifikant erhöhte, Proliferation auf. Zudem blieben die Endothelzellen in TissuVlies länger vital als in Matrigel. 3.10. Liposomale Transfektion von HUVEC mit hVEGF-165-Vektoren und Escort- und Fugene 6-Transfektionreagenzien Die Transfektion von Endothelzellen wurde erfolgreich mit beiden Vektoren und beiden Transfektionsreagenzien durchgeführt (siehe Abbildung 3.10 und Abbildung 3.11). Die Expression des hVEGF-165-Proteins konnte über 7 Tage mit Hilfe der -45- VEGF-ELISA nachgewiesen werden. Die höchste Expression des Proteins wurde mit dem Vektor pcDNA/Neo-I-hVEGF-165 mit beiden Transfektionsreagenzien und 7 µg DNA/50.000 Zellen am Tag 1 (Escort: 783 ± 41 pg/ml; Fugene 6: 648 ± 32 pg/ml) und Tag 2 (Escort: 723 ± 36 pg/ml; Fugene 6: 584 ± 29 pg/ml) registriert (t-Test, n = 18 pro Gruppe, p ≤ 0,05). 900 800 700 pg/ml 600 500 Kontrolle (0 pg/ml) pcDNA/ Neo I-hVEGF-165 400 pCMX-hVEGF-165 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 3.10: Graphische Darstellung der besten ELISA-Transfektionsergebnisse mit pcDNA/ Neo I-VEGF-165, pCMX-hVEGF-165 (7 µg pro Well/ 50.000 Zellen) und Escort-Transfektionsreagenz (Proportion 1 vol DNA zu 3 vol Escort) 800 700 pg/ml 600 500 Kontrolle (0 pg/ml) pcDNA/ Neo I-hVEGF-165 400 pCMX-hVEGF-165 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 3.11: Graphische Darstellung der besten ELISA-Transfektionsergebnisse mit pcDNA/ Neo I-hVEGF-165, pCMX-hVEGF-165 (7 µg pro Well/ 50.000 Zellen) und Fugene 6-Transfektionsreagenz (Proportion 1 vol DNA zu 2 vol Fugene 6) -46- Die Expression von VEGF-165 befand sich im Stimulationsbereich von 0,1–1 ng/ml für Endothelzellen. Deswegen wurden Trennkammerversuche, bei denen der Einfluß von hVEGF-165-transfizierten Endothelzellen auf die nicht-transfizierten Endothelzellen untersucht werden kann, durchgeführt. 3.11 Untersuchung des proliferativen Effektes der transfizierten HUVEC auf die nicht-transfizierte HUVEC im Trennkammersystem. Das nach Transfektion der Endothelzellen exprimierte VEGF führte im Trennkammersystem zu einer gesteigerten Proliferation von nicht-transfizierten Endothelzellen (siehe Abbildung 3.12). Die Anzahl der abtrypsinierten HUVEC aus dem Trennkammersystem war signifikant 2,46 mal höher als bei der Kontrolle (t-Test, n=6 pro Gruppe, p ≤ 0,05). Allerdings wurde die stärkste Proliferationsinduktion bei den mit rhVEGF-165 stimulierten HUVEC registriert. 180000 Anzahl der HUVEC (in Tausend) 160000 140000 120000 Anzahl der ausplatierten HUVEC 100000 80000 Anzahl der abtrypsinierten HUVEC 60000 40000 20000 0 Kontrolle Trennkammer rhVEGF-165 Abbildung 3.12: Graphische Darstellung des proliferativen Effektes der mit hVEGF-165 transfizierten HUVEC auf die nicht-transfizierte Endothelzellen. Zur Vergleich des proliferativen Effektes wurden in einer weiteren Gruppe nicht-transfizierte HUVEC mit rekombinantem VEGF-165 stimuliert. Auszählung der Endothelzellen erfolgte bei Erreichen der 80-90% Konfluenz. -47- 3.12 Implantation von transfizierten HUVEC in eine Kollagenmatrix und Untersuchung des proliferativen Effektes in 3D Zellkultur Da die TissuVlies-Matrix (Kollagenschwamm) aufgrund seiner Stabilität im Vergleich zu Matrigel (Kollagengel) besser für eine in vivo Transplantation geeignet ist, wurden die in der Suspension mit hVEGF-165-transfizierten 100.000 Endothelzellen in diesen Kollagenschwamm injiziert und bei 37° C und 5% CO2 im Brutschrank für 7 Tage inkubiert. Die Überstände wurden jeden Tag im Laufe einer Woche gesammelt und bei -20° C eingefroren. Danach wurde ein VEGF-ELISA durchgeführt, um die Expression des hVEGF-165 in der dreidimensionalen Endothelzellkultur zu bestätigen. 300 250 pg/ml 200 Kontrolle (0 pg/ml) Escort 150 Fugene 6 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 3.13: Graphische Darstellung der VEGF-165-Expression in dreidimensionaler Zellkultur im TissuVlies. Die Transfektion wurde in der Suspension mit 7 µg/ Well pcDNA/Neo I-hVEGF-165 und Escort (1:3) und Fugene 6 (1:2) Transfektionsreagenzien durchgeführt. Nach erfolgreicher Transfektion der Endothelzellen in Suspension konnten diese in den Kollagenschwamm implantiert werden. Auch in dreidimensionaler Kultur exprimierten die Zellen das hVEGF-165-Protein (siehe Abbildung 3.13) Obwohl die Transfektion in der Suspension weniger effizient als die Transfektion in der Monolayer-Kultur (Transfektionseffizienz 3-10%) war, befand sich die Menge des exprimierten hVEGF-165 dennoch im Stimulationsbereich (0,1-1 ng/ml) der -48- Endothelzellen. Die alleinige Besiedlung nur mit transfizierten Zellen war nicht sinnvoll, da ein Teil dieser Zellen (ca. 20%) nach wenigen Tagen abstarb. Daher konnte nur eine Mischkultur (transfizierte Endothelzellen zu nicht-transfizierten Endothelzellen 1:1) verwendet werden. Daher wurde der proliferative Effekt der mit hVEGF-165-transfizierten Endothelzellen auf die nicht-transfizierte HUVEC in dreidimensionaler Kultur im TissuVlies untersucht. 50.000 nicht-transfizierter Endothelzellen wurden ins TissuVlies implantiert und 24 Stunden im Brutschrank bei 37° C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurden noch zusätzlich 50.000 Endothelzellen mit pcDNA/Neo I-hVEGF165 und Escort und Fugene 6 in der Suspension transfiziert und in bereits mit HUVEC besiedelten TissuVlies implantiert. Nach 7 Tagen Inkubation wurde TissuVlies mit Dispase II gelöst und die gewonnenen HUVEC ausgezählt und mit Kontrolle verglichen. Anzahl der HUVEC (in Tausend) 250000 200000 150000 Anzahl der ausplatierten HUVEC Anzahl der abtrypsinierten HUVEC 100000 50000 0 Transfizierte HUVEC Nichttransfizierte HUVEC Nichttransfizierte HUVEC + hVEGF-165transfizierte HUVEC rhVEGF Abbildung 3.14: Graphische Darstellung des proliferativen Effektes der mit VEGF-165-transfizierten Endothelzellen auf die nicht-transfizierte HUVEC in dreidimensionaler Kultur im TissuVlies. hVEGF165-transfizierte HUVEC induzieren die dreidimensionaler Kollagenmatrix TissuVlies . Proliferation der nicht-transfizierter HUVEC in -49- Die Menge des exprimierten hVEGF-165-Protein reicht aus um die Proliferation der dreidimensionaler Endothelzellkultur im oben beschriebenen Mischungsverhältnis 1:1 zu fördern. Die Proliferationsaktivität der HUVEC unter Einfluß des exprimierten hVEGF-165 stieg um 19% im Vergleich zu Kontrolle signifikant an (t -Test, n = 6 pro Gruppe, p ≤ 0,05). Im Vergleich wurde die stärkste Proliferationsaktivität von HUVEC allerdings mit Hilfe des rekombinanten rh VEGF(Konzentration: 5 ng/ml) erreicht. 3.13 Implantation von transfizierten HUVEC ins Matrigel und Analyse der Bildung von kapillarähnlichen Strukturen in einer 3D HUVEC-Zellkultur in vitro. Mit hVEGF-165-transfizierte HUVEC wurden nach einem „Sandwich-Model“ in Matrigel in Falcon-Membraneinsätze implantiert und 4 Tage in ECBM bei 37° C im Brutschrank inkubiert. Die Bildung von „tube-like structures“ wurde mit Hilfe eines Lichtmikroskops verfolgt. Am 4. Tag erreicht die Ausbildung von „tube-like structures“ erfahrungsgemäß ihren Höhepunkt, dann beginnen sich diese Strukturen zu lösen und sind am 7. Tag kaum noch lichtmikroskopisch zu registrieren. Zur Kontrolle wurden nicht-transfizierte HUVEC in einen Membraneinsatz in Matrigel implantiert. Nach der Auszählung der „tube-like structures“ pro Einheit (Einheit - Leuchtrahmen im Lichtmikroskop, bei x100 ungefähr 1 mm2) wurden die Daten statistisch bearbeitet (t -Test, n = 3 pro Gruppe, p ≤ 0,05). Durch immunhistochemische Färbungen für CD 31 konnte die 3D Ausbildung von „tube-like structures“ in beiden Versuchsgruppen bestätigt werden. Die starke Positivität für CD 105 zeigt, daß es sich dabei um proliferierende Endothelzellen handelt. Die transfizierten HUVEC proliferierten und migrierten unter dem Einfluss von hVEGF-165 schneller. Die hVEGF-165-transfizierten HUVEC bildeten signifikant mehr „tube-like structures“ in Matrigel (11 ± 0,53 „tube-like structures“ pro Einheit) im Vergleich zu nicht-transfizierten Endothelzellen (8 ± 0,37 „tube-like structures“ pro Einheit) aus (siehe Abbildung 3.15 und Abbildung 3.16). -50- Anzahl von "capillary-like structures" pro Einheit 14 12 10 8 Anzahl von "capillary-like structures" pro Einheit nach 4 Tagen Inkubation 6 4 2 0 Matrigel + nichttransfizierte HUVEC Matrigel + hVEGF-165transfizierte HUVEC Abbildung 3.15: Graphische Darstellung des Vergleichs der Bildung von „tube-like structures“ aus hVEGF-165-transfizierten HUVEC und nicht-transfizierten Endothelzellen im Matrigel nach 4 Tagen Inkubation im Brutschrank bei 37° C und 5% CO2, A B A Abbildung 3.16: Photografische Darstellung einer CD 105 Immunhistochemie von ins Matrigel implantierten und mit hVEGF-165-transfizierten HUVEC. A) Nicht-transfizierte HUVEC + Matrigel (Kontrolle): 48 Stunden nach der Implantation. B) 50% hVEGF-165-transfizierte HUVEC + 50% nichttransfizierte HUVEC + Matrigel: 48 Stunden nach der Implantation. Die Anzahl der tubulären Strukturen ist deutlich höher als bei der Kontrolle. -51- 4. DISKUSSION Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines kapillarähnlichen Konstruktes in vitro im Rahmen des sogenannten Tissue Engineerings. Die Entwicklung eines solchen Konstruktes ist aus zweierlei Hinsicht von Bedeutung: Zum einen könnte das Konstrukt in der Behandlung chronischer hypovaskularisierter Wunden zur Induktion einer therapeutischen Angiogenese eingesetzt werden, zum anderen ist die Vaskularisation in vitro produzierter Gewebe-Konstrukte von entscheidender Bedeutung für die Schaffung funktionfähiger Gewebekonstrukte und damit die Weiterentwicklung des gesamten Tissue Engineering. 4.1 In vitro Model Seit mehr als 20 Jahren sind die Grundzüge der Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen beschrieben und bekannt (Jaffe et al., 1973). Im Laufe der Jahre wurden die Methoden jedoch vielfach überarbeitet. HUVEC sind leicht zugänglich und die Kultur ist einfach durchzuführen. Daher finden sie zur Forschung an humanen Endothelzellen häufig Anwendung. In der Literatur finden sich allerdings zahlreiche Modifikationen der Methoden der Gewinnung und Kultur dieser Zellen. So transportierte man anfangs die Nabelschnüre in einem speziellen „Nabelschnur-Puffer“, der NaCL, KCL, PhosphatPuffer und Glucose enthielt, aus dem Kreißsaal ins Labor. Trotz Kühlung auf 4° C gelang die Präparation nicht mehr, wenn der Zeitraum zwischen Geburt des Kindes und der Präparation mehr als 3 Stunden vergangen waren (Jaffe et al., 1973). Später ersetzten andere Autoren den Nabelschnur-Puffer durch einfaches PBS oder Basalmedium mit oder ohne Antibiotika (Franke et al., 1979; Czapla et al., 1986). Aber letzlich erwies sich der Transport in sterilen Gefäßen unter Kühlung ohne jegliche Zusätze als der einfachste und sicherste Weg. So konnten erfolgreiche Zellpräparationen auch noch 24 Stunden nach der Geburt durchgeführt werden. Bedingt durch das Fehlen eines „Transport-Mediums“ können eventuelle äußerliche Kontaminationen der Nabelschnüre gar nicht erst ins Innere der Venen gelangen, sondern werden bei der Reinigung vor der Präparation entfernt. Die Kühlung bremst das Wachstum der eventuell kontaminierenden Organismen und die natürlichen -52- Verwesungsprozesse. So kann, entgegen der Angaben von Gospodarowicz et al. (1978), auf eine Sterilisation der Nabelschnur mit Äthanol verzichtet werden. 4.2 Präparation Bei der Präparation der Nabelschnüre selbst liegt die Ursache für Erfolg oder Mißerfolg der Isolierung der Endothelzellen in der vorliegenden Arbeit meist beim verwendeten Endothelzell-Isolierungsenzym. Einige wenige Autoren benutzen Trypsin zur Herauslösung der Zellen z.B. Franke et al. (1979). Jedoch erfordert die Trypsinierung eine vorhergehende gründliche Entfernung der zweiwertigen Kationen (meistens Ca2+ und Mg2+), da diese das Enzym in seiner Wirksamkeit einschränken. Die Handhabung dieser Methode ist kompliziert. Andere Autoren geben verschiedenen Kollagenasen den Vorzug (z.B. Gimbrone et al., 1974; Gospodarowicz et al., 1978). Bei deren Einsatz war keine Vorbehandlung mit speziellen Ca2+/Mg2+-freien Lösungen erforderlich. Die Inkubationszeiten mit diesen Enzymen sind sehr unterschiedlich. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Herkunft des jeweils verwendeten Enzyms meist nicht angegeben wird und somit unterschiedliche Aktivitäten vermutet werden können, die durch eine Veränderung der Inkubationszeiten ausgeglichen werden. Jedoch wird in allen Fällen bei einer Temperatur von 37° C und in einem Begasungsbrutschrank bei 5% CO2 inkubiert. Das für diese Arbeit verwendete Enzym Dispase II zählt zu den neutralen Proteasen. Es zeichnet sich durch einige Vorteile gegenüber den oben erwähnten Enzymen aus. Es hat einen bakteriellen Ursprung (Bacillus polymyxa) und ist frei von tierischen Viren und Mykoplasmen. Während der Inkubation bleibt Dispase II stabil in einem weiten Temperatur (15 - 40°C) und pH-Bereich (Optimum bei pH 6,0 - 8,5). Das Enzym wird durch viele zwei- und dreiwertige Kationen aktiviert und durch Serum in keiner Weise inhibiert. Es treten aber Probleme in der Zellkultur durch dieses Enzym auf. Wird die gelieferte Stammlösung 1:10 nach Herstellervorschrift mit PBS auf Gebrauchslösungskonzentration verdünnt, bildet sich nach bereits einem Einfrierund Auftau-Vorgang ein Niederschlag, der zu einer Trübung der Lösung und zum Verlust der Enzymaktivität führt. -53- Es handelt sich dabei, wie eine Nachfrage beim Hersteller ergab, um präzipitiertes Enzym. Dieses unlösliche Enzym gelangte durch die Zentrifugation der gewonnenen Zellen mit in das Sediment und damit in die Zellkultur. Dort setzte es seine Wirkung fort, verhinderte die Anheftung des größten Teiles der gewonnenen Endothelzellen und brachte die restlichen Zellen innerhalb von 24 Stunden zur Ablösung von den beschichteten Kulturflaschenböden. Erst durch die sterile Filtrierung der Dispase-Stammlösung unmittelbar vor deren Verwendung konnte dieser Effekt beseitigt werden. Durch die Präzipitation des Enzyms und dessen Entfernung wurde die Konzentration in der Lösung herabgesetzt, was aber erfolgreich durch eine Verlängerung der Inkubationszeit um 10 min auf 40 min ausgeglichen werden konnte. Mit dieser Modifikation gelang eine erfolgreiche schonende Isolierung der Endothelzellen. 4.3 Kulturmedium Als Basal Medium wurde das Endothelial Cell Basal Medium (ECBM) von Firma Promocell angewendet. Zur Prävention der Kontamination wurden dem ECBM zusätzlich 1% Fungizone und 1% Penicillin/Streptomicin hinzugefügt. ECBM gehört zu den serumfreien- oder Low-Serum-Medium (Serumanteil: <2%), außerdem ist ECBM wachstumsfaktorenfrei. Daher ist dieses Medium für die Proliferationsassays mit Endothelzellen und Zusatz verschiedenen rekombinanten Wachstumsfaktoren optimal geeignet. ECGM enthält im Vergleich zum ECBM Wachstumsfaktoren (EGF 0,1 ng/ml; bFGF 1 ng/ml) und 5% Serum (inkl. 1% Fungizone und 1% Penicillin/ Streptomicin). So werden die idealen Bedingungen für die beschleunigte Proliferation der HUVEC nach der Isolation aus den Nabelschnurvenen geschaffen. In anderen Arbeitsgruppen wurde als Basalmedium unter anderem auch M199 eingesetzt (Gimbrone et al., 1974; Haudenschild et al., 1976; Maciag et al., 1982; Knauer et al., 1983). Es enthält neben EARLE’s-Salzen hauptsächlich die L- und auch einige D-Aminosäuren, Nukleinsäurevorläufer, ATP, diverse Vitamine und Zucker sowie einen Carbonat-Puffer. Die instabile Aminosäure L-Glutamin wird im Falle der Verwendung als Kultur-Medium in einer Konzentration von 2 mM jeweils frisch zugesetzt. Das Medium mußte aber unbedingt durch den Zusatz von mindestens 1% FCS supplementiert werden, da sonst eine erfolgreiche Zellkultur der -54- Endothelzellen unterblieb. Unter diesen Bedingungen zeigten sich keine sichtbaren Unterschiede im Zellwachstum und der Proliferation über eine Woche. Das beigefügte Serum enthielt außerdem eine ausreichende Menge der Aminosäure. Es wurde dennoch zugesetzt, um das Komponentenangebot zu komplettieren. Andere Autoren verwendeten andere Basalmedien, so gelang Franke et al. (1979) mit „Dulbecco’s minimal essential medium“ unter Zusatz von 20-30% FCS oder Human-Serum eine kontinuierliche Kultur. Ebenfalls DMEM setzte Folkman et al. (1980) im selben Jahr bei Langzeit-Kulturen kapillarer Endothelzellen ein. Eine Mixtur aus Icove’s MDM und Ham’s F12 kam bei Friedl et al. (1988) zum Einsatz. Natürlich muß auch diese mit Serum und diversen Wachstumsfaktoren komplettiert werden. „Dulbecco’s modified Eagle’s medium“ (DMEM) wurde von Gospodarowicz et al. (1983) verwendet. In der Arbeit von de Groot et al. (1983) ist neben M199 das Medium RPMI-1640 beschrieben. Alle diese Medien unterscheiden sich nur unwesentlich in ihrer Zusammensetzung. 4.4 Art des Serums Von den vielen auf dem Markt befindlichen Seren (oft tierischen Ursprungs) sind in der Literatur die verschiedenen bovinen Seren beschrieben. So setzte Fotsis et al. (1994) den Kulturen Serum vom neugeborenen Kalb (NCS) in 10%-igem Anteil zu. Bei Friedl et al. (1989) waren es 20% neben diversen Wachstumsfaktoren. Serum von Kalb (FCS) verwendete Gospodarowicz et al. (1983) zusammen mit FCS, fötales Rinderserum (FBS) (Maciag et al., 1981; 1982 und Knauer et al., 1983). Die Verwendung von FCS beschrieben Gimbrone et al. (1974), Franke et al. (1979) und Gospodarowicz et al. (1983). Neben dem letztlich eingesetzten FCS wurde auch humanes Serumalbumin (HSA) auf seine Fähigkeit zur Stabilisierung der Endothelzell-Kultur überprüft. Es zeigten sich keine Unterschiede bezüglich der Überlebensfähigkeit und der Proliferationsaktivität der untersuchten Zellkulturen bei Einsatz von 1% FCS oder HSA im ECBM unter den etablierten Kulturbedingungen. Diese Befunde beruhen auf täglicher Kontrolle der Monolayer unter dem Phasenkontrast-Mikroskop und anderseits durch Auszählen der Endothelzellen mit dem CultureCounter. -55- Zwar wäre die Verwendung des HSA einen Schritt näher zum Ideal der serumfreien Kultivierung der Endothelzellen gewesen, anderseits besteht (bewiesen durch diese Befunde) keine Notwendigkeit, das teuere humane Präparat einzusetzen, obwohl de Groot et al. (1983) gute Ergebnisse in der Endothelzell-Kultur mit ihm beschrieben hatte. Komplexes Humanserum wurde in diesem Zusammenhang nicht getestet. In der Literatur dagegen findet es große Beachtung der Angiogenese-Forscher. So fügte Folkman et al. (1980) seinen Kulturen verschiedener Kapillar-Endothelzellen 15% bei. Franke et al. (1979) verabreichte den HUVEC 20-30% Serum-Anteil und erreichte damit eine leicht erhöhte Proliferationsaktivität der Endothelzellen. Übereinstimmend mit der aktuellen Literatur hat sich der Zusatz von FCS als einfachste und sicherste Methode bewährt. 4.5 Serum-Anteil Ursprünglich wurde von einem Serum-Anteil von 20% im Kultur-Medium ausgegangen (Maciag et al., 1981 und 1982). Jedoch zeigte sich unter diesen Bedingungen keine signifikante Induktion der Proliferationsaktivität der HUVEC. Sogar die Verwendung von Wachstumsfaktoren (bFGF, EGF, VEGF) mit der Konzentration bis zu 100 ng/ml zeigte sich keine signifikante Veränderung im Vergleich zu Kontrolle. Wie die umfangreichen Vorversuche mit Serum-Anteil von 20% und 10% im Medium zeigten, begünstigt ein hoher Serum-Anteil im Kultur-Medium die Vitalität der Endothelzellen in Kultur und fördert die mikroskopisch sichtbare Serum-Anteil nahezu bessere Anheftungsbereitschaft. Es ist einsichtig, wachstumsfördernde daß ein Faktoren so im hoher Überfluß bereitstellt und sämtliche „saubere“ Proliferationsassays mit rekombinanten Wachstumsfaktoren wie rhbFGF, rhEGF und rhVEGF undurchführbar macht. Der von vielen Autoren beschriebene Einsatz von 10% Serum im Medium (Jaffe et al., 1973; Knauer et al., 1983; Fotsis et al., 1994) erschien für die Untersuchung der Effekte der verwendeten Wachstumsfaktoren immer noch zu hoch. Erst nach Senkung des FCS-Anteils auf < 2% (low serum medium) im Medium konnten Effekte im Rahmen der Stimulationsversuche mit den Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. -56- Serumfreie Kultivierung der humanen Endothelzellen wurde z.B. von Hayashi et al. (1975) und von Hoshi et al. (1984) beschrieben. Jedoch kann auch hierbei nicht auf Zusatz von Wachstumsfaktoren und Supplement, sowie auf ein durch HepatomZellen konditioniertes Medium verzichtet werden. 4.6 Beschichtung der Kulturflaschen Entscheidenden Einfluß auf die Stabilität einer Endothelzell-Kultur und auf das dreidimensionale Wachstum der HUVEC hat die extrazelluläre Matrix: Beschichtung der Kulturflaschen und Kollagen-Matrices, TissuVlies und Matrigel. So konnte gezeigt werden, daß die Endothelzellen unter sonst gleichartigen Bedingungen nur dann eine dauerhafte Anheftung am Boden der verwendeten Kunststoff-Kulturgefäße (z.B. 6-Well-Platten, Chamber-Slides und Zellkulturflaschen) oder Glas-Objektträger erlangten, wenn diese zuvor mit Gelatine, Kollagen oder Fibronektin beschichtet worden waren. Es wurde in dieser Arbeit die Gelatine-Beschichtung (Folkman et al., 1980; Vicart et al., 1993) ausgewählt. Andere Autoren geben dem Fibronektin (Maciag et al., 1981; de Groot et al., 1983; Holzinger et al., 1993) oder Kollagen (Hoshi et al., 1984; Fotsis et al., 1994) den Vorzug. Während der Arbeit mit HUVEC-Zellkulturen hat sich herausgestellt, daß es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den obengenannten Beschichtungen gibt. In allen drei Fällen hafteten die Endothelzellen auf dem Kulturflaschenboden und proliferierten. 4.7 3D-Endothelzellkultur Im Gegensatz zu der schon lange etablierten 2D-Kultur gibt es bislang nur wenige in der Literatur beschriebenen Ansätze einer dreidimensionalen Endothelzellkultur (Williams et al., 1993). Schwierigkeiten bereitet dabei die Identifizierung einer optimalen dreidimensionalen Matrix zur Implantation der Endothelzellen. Hier sind die Anforderungen je nach Fragestellung sehr unterschiedlich. Bei Untersuchungen zur Physiologie und Pathophysiologie von Endothelzellwachstum und Kapillarbildung kommen häufig Kollagengele zum Einsatz. Ein sehr bekanntes in vitro Model für die 3D-Zellwachstumsforschung ist Matrigel, wobei die Erkenntnisse hierzu vor allem aus Arbeiten zur Tumorangiogenese kommen (Baatout, 1997). Die Anforderungen -57- an eine dreidimensionale Endothelzellkultur im Rahmen des Tissue Engineerings sind aber weiter gesteckt. Neben der Extrazellulärmatrix- und Gerüstfunktion muß die verwendete Matrix eine höhere Stabilität nachweisen, um nach erfolgreicher Konstruktion transplantiert werden zu können. Daher fand in diesen Untersuchungen ein Kollagen-I-Schwamm Verwendung. Die verwendete Kollagenmatrix hat ihre Brauchbarkeit im Tissue Engineering bereits für Knorpel und Epithelzellen gezeigt (Stark et al., 1998; Horch et al., 1998). Für die praktische Verwendbarkeit von endothelbesiedelten Konstrukten ist unter anderem die mechanische Langzeitstabilität (bei gleichzeitiger Resorbierbarkeit und Biokompatibilität) von Bedeutung. Im Vergleich zum untersuchten Kollagengel (Matrigel) war dieser Schwamm aus Kollagen I über drei Wochen im Kulturmedium stabiler. Auch nach dieser Zeit konnte der Schwamm leicht transponiert werden und war daher dem Kollagengel überlegen. Nach Implantation der Endothelzellen konnte sowohl Wachstum als auch Proliferation der Zellen in beiden Matrices nachgewiesen werden. Aufgrund der für das Endothelzellwachstum optimalen Zusammensetzung war Matrigel dem Kollagenschwamm anfänglich überlegen, sogenannte "tube-like structures" bildeten sich schneller aus. Allerdings konnten auch im Schwamm solche tubulären Strukturen nachgewiesen werden. Es war aber nötig, den Schwamm vor Besiedelung mit Endothelzellen zu perforieren, um ein Vordringen der Zellen in tiefer gelegene Schichten zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Kollagengel, in der Regel nach Wachstumsfaktorenstimulation, eine Migration der Endothelzellen von der Oberfläche aus, die im Schwamm nur sehr verzögert eintrat. Zusammenfassend erscheint bei der Etablierung eines dreidimensionalen Endothelzellkonstruktes die Verwendung des Kollagenschwammes dem Kollagengel überlegen. Die erhöhte Festigkeit, die überlegene Proliferation der Endothelzellen und eine ausreichende Bildung tubulärer Strukturen machen den Kollagenschwamm zu einer für das Tissue Engineering vielversprechenden Matrix. 4.8 Wachstumsfaktoren Um Endothelzell-Proliferation und -Migration sowie Ausbildung eines Lumens und kapillärer Strukturen zu unterstützen, können angiogene Wachstumsfaktoren eingesetzt werden. -58- In zweidimensionaler wie auch in dreidimensionaler Endothelzellkultur wurden drei verschiedene Wachstumsfaktoren getestet: bFGF (basic fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) und EGF (epidermal growth factor). bFGF ist der zuerst beschriebene und am besten charakterisierte angiogene Wachstumsfaktor. Die bFGF Familie besteht aus neun strukturell verwandten Proteinen. Ursprünglich benannt wegen des proliferativen Effektes auf Fibroblasten, zeigte sich, daß bFGF auf fast alle Zellen einen Effekt zeigt. Vier der FibroblastenWachstumsfaktoren beeinflussen Zellen des Gefäßsystems: FGF-1 (acidic oder aFGF), FGF-2 (basic oder bFGF), FGF-4 und FGF-5 (Asahara et al., 1995). Bei all diesen Faktoren konnte ein mitogener Effekt nachgewiesen werden. Der angiogene Effekt ist am besten bei aFGF und bFGF charakterisiert. Interessanterweise fehlt FGF die Signalpeptidsequenz zur Sekretion, so daß diese Faktoren nicht aktiv aus der Zelle sezerniert werden können. Da der Freisetzungsmechanismus aus der Zelle nicht bekannt ist, wurde auf eine Transfektion mit bFGF verzichtet. Zudem ist anzunehmen, daß die Transfektion einer wesentlich größeren Anzahl von Zellen notwendig ist, um einen ausreichenden therapeutischen Effekt zu erzielen. Dies ist bei Faktoren, die aktiv sezerniert werden anders, da hier ein ausreichender parakriner Effekt bereits erzielt werden kann, wenn nur eine verhältnismäßig geringe Anzahl an Zellen, zum Beispiel nach Gentransfer mittels nackter Plasmid-DNA, transfiziert ist. Ein weiterer Aspekt sind die bereits bekannten Nebenwirkungen einer bFGF Therapie. Auf das Problem möglicher Nebenwirkungen des Einsatzes angiogener Wachstumsfaktoren soll später eingegangen werden. VEGF hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, da dieser Faktor selektiv auf Endothelzellen wirkt und neben der Proliferation auch die Regeneration von Gefäßen beeinflußt (Bauters et al., 1995; Leung et al., 1989). Dieser spezifische Endothelzell-Wachstumsfaktor wurde erstmals aus der Aszitesflüssigkeit von Patienten mit schnell wachsenden intraperitonealen Tumoren isoliert. Das humane VEGF Gen ist auf dem Chromosom 6p12-p21 lokalisiert und besteht aus 8 Exons und 6 Introns. Es bestehen mindesten 4 Isoformen mit 121, 165, 189 und 206 Amoinosäuren, wobei VEGF-165 im Serum dominiert. Es handelt sich dabei um ein homodimeres Glykoprotein mit einer molekularen Masse zwischen 39 und 45 kD. VEGF besitzt im Gegensatz zu bFGF eine Signalsequenz zur aktiven Sekretion. Die mRNA für VEGF konnte in Fibroblasten, Monozyten, Makrophagen, Mastzellen, TLymphozyten, Hepatozyten sowie in allen Tumorzellen nachgewiesen werden. VEGF -59- wirkt demnach parakrin auf Endothelzellen. Korrespondierende Rezeptoren wurden vor allem auf Endothelzellen, aber auch auf primitiven hämatopoetischen Stammzellen und Monozyten gefunden. Drei VEGF-Rezeptoren sind bisher bekannt, Flt-1 (VEGF-R1), Flk-1 (VEGF-R2) und Flt-4 (VEGF-R3). Eine mitogene Wirkung von VEGF ließ sich allerdings nur bei Endothelzellen nachweisen. Desweiteren wirkt VEGF chemotaktisch auf Makrophagen und Mastzellen sowie Endothelzellen (Gruber, 1995; Folkman, 1995). Zudem führt es zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität und fördert den Austritt von Blutplasma. Zusätzlich wurden noch zwei weitere Isoformen gefunden, VEGF-B und VEGF-C. VEGF-B wirkt in vitro mitogen auf Endothelzellen und soll eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gefäßsystems spielen, VEGF-C scheint eine Rolle bei der Regulierung des lymphatischen Systems zu spielen. Der angiogene Effekt von EGF ist zwar bekannt, aber nur wenig charakterisiert. EGF besteht aus 53 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 6 kDa. EGF gehört zur gleichen Familie wie TGF-β und bindet an den selben Rezeptor (King et al., 1990). Als Produktionsorte identifiziert wurden die Glandula submandibularis und die Nierentubuli. Der Faktor scheint in Thrombozyten gespeichert zu werden (Bennett et al., 1993) und wird von dort bei Bedarf durch Degranulation freigesetzt (Shenaq et al., 1996). Erläßt sich in nahezu allen Körperflüssigkeiten nachweisen und in geringer Konzentration in experimentellen Wunden (Vogt et al., 1995). EGF wirkt in vitro proliferativ auf epitheliale Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen (Shenaq et al., 1996). Ein Vergleich zu den beiden potentesten angiogenen Wachstumsfaktoren fehlte bislang. EGF ist aber von zusätzlicher Bedeutung, da diesem Faktor eine bedeutende Rolle in der Wundheilung zukommt (Brown et al., 1989; Vogt et al., 1995; Andree et al., 1994), was für spätere Ko-Kulturen von Endothelzellen mit Keratinozyten von Bedeutung sein kann. Der hier dokumentierte angiogene Effekt kann dabei ausgenutzt werden. Ein weiterer, hier nicht untersuchter, vielversprechender angiogener Wachstumsfaktor ist Angiopoietin (Suri et al., 1998; Maisonpierre et al., 1997). Es sind zwei Angiopoietine bekannt, Angiopoietin 1 (Ang 1) und 2 (Ang 2). Beide binden an den gleichen Rezeptor Tie 2, eine endothelzell-spezifische Rezeptor Thyrosin Kinase. Angiopoietin 1 und 2 wirken antagonistisch, wobei Ang-2 die proangiogene Wirkung von Ang-1 inhibiert. Es wird angenommen, daß die Angiopoietine, gemeinsam mit VEGF die Formation neuer Kapillaren koordinieren. Ang-1 stabilisiert -60- dabei die neu formierten Kapillaren und ist für deren Regeneration verantwortlich, während Ang-2 eine Auflockerung der zellulären Kontakte zwischen den Endothelzellen bewirkt und dadurch eine Wirkung von VEGF erleichtert und ein Aussprossen neuer Kapillaren erst ermöglicht. Beiden Angiopoietinen könnte daher im Tissue Engineering eine bedeutende Rolle zukommen. In rekombinanter Form zeigt bFGF sowohl in zweidimensionaler wie auch in dreidimensionaler Kultur den größten proliferativen Effekt, was zunächst eine bevorzugte Nutzung dieses Faktors nahelegt. Allerdings ergeben sich dabei einige Probleme, auf die weiter unten eingegangen werden soll. Nach Austestung einer optimalen Wachstumsfaktorenkonzentration in 2D-Kultur konnten die Proliferationsassays auch in dreidimensionaler Endothelzellkultur durchgeführt werden. Auffallend dabei war, daß in zweidimensionaler Kultur ab einer bestimmten Konzentration ein Plateau erreicht ist, bei EGF findet sich sogar eine annähernd gleiche Proliferation bei allen Konzentrationen. Dabei erweist sich, wie bereits in zweidimensionaler Kultur, bFGF als der bezüglich der Proliferation potenteste angiogene Wachstumsfaktor, gefolgt von VEGF und EGF. Allerdings war der Proliferationseffekt aller untersuchter Wachstumsfaktoren in 3D-Kultur im Vergleich zur Überraschend Monolayerkultur signifikant war, Endothelzellproliferation daß die geringer (siehe nach Abbildung 3.10). Stimulation im Kollagenschwamm gegenüber dem Gel signifikant erhöht war, obwohl sich im Gel tubuläre Strukturen früher ausbildeten. Offensichtlich scheint die netzartige Struktur des Schwammes die Proliferation und letzlich damit auch die Bildung kapillarähnlicher Strukturen zu begünstigen. 4.9 Transfektion von Endothelzellen Fasst man die Erkenntnisse über mögliche Nebenwirkungen einer angiogenen Therapie zusammen, macht es Sinn, sich mehr auf einen endothelspezifischen Faktor, wie VEGF zu konzentrieren, um unbeabsichtigte Effekte so gering wie möglich zu halten. Wegen seiner zentralen Bedeutung in der Ausbildung dreidimensionaler Kapillarstrukturen, eines ausreichenden proliferativen Effektes und nur wenigen Nebenwirkungen wurde daher für die Transfektionsversuche VEGF der Vorzug gegeben. Nach Literaturrecherche waren die bisherigen Transfektionen von Endothelzellen mit VEGF ausschließlich mit viralen Vektoren durchgeführt worden. -61- Es handelt sich dementsprechend bei den hier beschriebenen Versuchen um die erste erfolgreiche liposomale Transfektion von Endothelzellen mit dem Gen für humanes VEGF-165. Die Transfektion von Endothelzellen konnte mit beiden Vektoren und beiden Transfektionsreagenzien erfolgreich durchgeführt werden. Die Konzentration des exprimierten Proteins lag dabei im Stimulationsbereich für Endothelzellen und die Proliferationsstimulation konnte in den Trennkammerversuchen nachgewiesen werden. Dabei wird, offensichtlich über eine parakrine Stimulation, die Proliferation nicht-transfizierter Endothelzellen induziert. Dieser Effekt konnte auch in dreidimensionaler Kultur nachgewiesen werden. Nach Vergleich der beiden Kollagenmatrizen wurde die Implantation mit VEGF transfizierten Endothelzellen nur noch im Kollagenschwamm durchgeführt. Nach Transfektion der Endothelzellen außerhalb des Konstruktes wurden diese in die Matrix implantiert. Vorversuche hatten dabei ergeben, daß die Implantation einer nur aus transfizierten Endothelzellen bestehenden Population nicht sinnvoll ist, da unter diesen Bedingungen innerhalb weniger Tage ca. 20% der Zellen absterben (toxische Einwirkung der Transfektionsreagenzien auf die Zellmembran) und es insgesamt zu einer Verminderung der Endothelzellzahl kommt, was gegen das Vorliegen einer autokrinen Stimulation spricht. Daher erfolgte nur die Implantation einer Mischkultur aus transfizierten und nicht-transfizierten Endothelzellen im Verhältnis 1:1. Auch unter diesen Bedingungen reichte die Menge des exprimierten VEGF-Proteins aus, die Endothelzellproliferation zu stimulieren. Hier kann also von einer parakrinen Stimulation der Endothelzellen ausgegangen werden. Obwohl unter gleichen Bedingungen der proliferative Effekt nach Stimulation mit rekombinantem VEGF stärker als nach Transfektion mit VEGF ist, bietet diese Form des kontrollierten „drug delivery“ eine weitere Möglichkeit, dreidimensionales Endothelzellwachstum im Rahmen des Tissue Engineerings zu stimulieren. Der parakrine Effekt auf Endothelzellen kann demnach durch Transfektion eines Teils der Endothelzellen oder Transfektion anderer Zellen in einer Ko-Kultur mit Endothelzellen bewirkt werden (Artiser et al., 1997). -62- 4.10 3D-Kapillarkonstrukt Das Tissue Engineering eröffnet völlig neue Perspektiven der Therapie von Krankheiten und des Ersatzes vitaler Strukturen. So können zum Beispiel körpereigene Zellen durch Gabe von Wachstumsfaktoren zur verstärkten Proliferation und damit zu einer beschleunigten Regeneration und Wundheilung führen. Auf der anderen Seite können dem Patienten autologe oder Donorzellen reimplantiert werden, die, in dreidimensionale abbaubare Konstrukte eingebettet, Form oder Funktion von erkrankten Organen oder Körperteilen ersetzen (Hirai et al., 1996; L’Heureux et al., 1998). Die ersten Erfahrungen wurden bereits mit solchen Konstrukten gesammelt (Stark et al., 1995; Horch et al., 1999). All diese Konstrukte sind nicht auf eine präexistente oder rasch einsetzende Vaskularisierung angewiesen. Bei nicht bradytrophen Geweben oder Geweben, die dicker als wenige Millimeter sind, sind dagegen Blutgefäße notwendig, um diese Gewebe zu ernähren. Wesentliche Erkenntnisse zur Angiogenese kommen aus der Tumorforschung. Hier ist vor allem Judah Folkman zu nennen, der der Erkenntnis eine besondere Bedeutung zumaß, daß sich entwickelnde und wachsende Tumoren ab einer gewissen Größe nicht mehr allein per Diffusion ausreichend ernährt werden können. Vielmehr ist der Tumor in der Lage, dem umgebenden Gewebe Signale zu senden, was dazu führt, daß neue Gefäße aus der Tumorumgebung in diesen einsprossen und zur Vaskularisation des Tumors führen, der entscheidende Schritt für unkontrolliertes Tumorwachstum und Metastasierung. Folkman diskutierte bereits 1971 die Möglichkeit über spezifische Moleküle Tumorangiogenese zu blockieren und damit Tumorwachstum zu stoppen. Es sollte aber mehr als 25 Jahre dauern bis diese Art der Tumortherapie in das Zentrum des Interesses rückte, als wiederum Folkman ein Therapiekonzept mit einem äußerst potenten Angiogeneseinhibitor „Angiostatin” vorstellte. Obwohl genau das Gegenteil, nämlich die Induktion von Angiogenese, beim Tissue Engineering und bei der Wundheilung notwendig ist, können dennoch viele Erkenntnisse aus der Tumorangiogeneseforschung übertragen Entwicklung therapeutischer Angiogenesestrategien genutzt werden. und in der -63- Der entscheidende Schritt hin zur Schaffung funktionsfähiger Neo-Organe im Rahmen des Tissue Engineering wird die Versorgung dieser Konstrukte mit Blut sein. Hierzu ist ein funktionstüchtiges Kapillarnetz notwendig. Dies kann auf zwei verschiedenen Wegen erreicht werden. Zum einen kann nach Implantation eines dreidimensionalen Gewebekonstruktes durch die Freisetzung angiogener Substanzen ein Einsprossen von Kapillaren aus der Umgebung in das Konstrukt gefördert werden. Der zweite, komplexere Ansatz ist die in vitro Schaffung eines dreidimensionalen kapillarähnlichen Netzes in einer künstlichen Matrix in Ko-Kultur mit mesenchymalen Zellen. Implantierte Endothelzellen können bereits eine Art Kapillargrundgerüst formen (Mooney et al., 1999). Dieses konstruierte Kapillargrundgerüst findet dann nach Implantation in vivo Anschluß an bereits existente Gefäße. Dieser Vorgang könnte allerdings gestört sein, wenn im Bereich des Transplantatlagers durch Trauma, Narbe oder Tumor eine gestörte Vakularisation vorliegt. Mögliche Ansätze zur Umgehung dieses Problems könnte die vorangehende heterotope Implantation des Konstruktes ergeben. So gelang es zum Beispiel eine Neomandibula zu konstruieren, indem das Knochenkonstrukt heterotop am Beckenkamm implantiert wurde. Nach stattgefundener Vaskularisation konnte der Knochen mikrochirurgisch zur Unterkieferrekonstruktion nach Tumorresektion mit Radiatio und konsekutiver Zerstörung der Gefäßversorgung implantiert werden. Der eigene Ansatz verknüpft beide Hypothesen, indem das in vitro geschaffene dreidimensionale Kapillarkonstrukt Endothelzellen enthält, die mit einem äußerst potenten angiogenen Wachstumsfaktor, VEGF, transient transfiziert sind. Dadurch kann nach Implantation eines bereits präformierten Kapillarkonstruktes (Vaskulogenese) durch Expression eines angiogenen Wachstumsfaktors ein Stimulus auf die Umgebung (Angiogenese) gegeben werden, was zu einem verstärkten Einsprossen neuer Kapillaren in das Konstrukt führt, die dort in Verbindung zu den bereits präformierten kapillarähnlichen Strukturen treten. Grundsätzlich kann somit das hier im Experiment beschriebene kapillarähnliche Konstrukt in zwei verschiedenen Bereichen eingesetzt werden. Zum einen als alleiniges dreidimensionales Endothelzellkonstrukt direkt als mögliche Therapieform in der Behandlung chronischer hypovaskularisierter Wunden und zum anderen als mögliche Voraussetzung und Grundstruktur in der Schaffung perfundierter NeoOrgane aus verschiedenen Zelltypen. Zusätzlich ist ein solches Konstrukt als Modell zur Untersuchung von Phänomenen der Angiogenese und Vaskulogenese denkbar. -64- 4.11 Zusammenfassung Von der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration des arteriell-venösen Gefäßnetzes hängt die Funktion eines jeden Organs und des Organismus insgesamt ab. Daher spielt die Angiogenese eine wichtige Rolle in der Wundheilung und Geweberegeneration. Ziel dieser Arbeit war die Schaffung eines stabilen Kapillarnetzes aus kultivierten genmodifizierten Endothelzellen zur Vaskularisation dreidimensionaler, im Rahmen des Tissue Engineering hergestellten GewebeKonstrukte (composite graft). Wesentlichen Einfluß auf die Angiogenese üben angiogene Wachstumsfaktoren aus, die gezielt die Endothelzell-Proliferation, Migration und -Differenzierung beeinflussen. Es wurden daher drei verschiedene Wachstumsfaktoren getestet: bFGF (basic fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) und EGF (epidermal growth factor). Zwei extrazelluläre Matrices: TissuVlies (Kollagenschwamm) und Matrigel (Kollagengel) wurden auf Stabilität und Eignung zur Endothelzellimplantation getestet. Humane Endothelzellen, sogenannte HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), wurden aus Nabelschnüren isoliert und in speziellem Nährmedium kultiviert. Proliferationsassays in zweidimensionaler und dreidimensionaler Zellkultur mit verschiedenen Konzentrationen von rekombinanten Wachstumsfaktoren bFGF, VEGF und EGF zeigten eine deutliche Stimulation von Endothelzellen, wobei der stärkste proliferative Effekt durch bFGF (Stimulationsbereich ≥0,3 ng/ml) hervorgerufen wurde. Die transiente liposomale Transfektion von Endothelzellen wurde erfolgreich mit beiden konstruierten hVEGF-165-Vektoren (pcDNA/NeoIhVEGF165 und pCMX-hVEGF-165) und beiden Transfektionsreagenzien (Escort und Fugene 6) durchgeführt. Das nach Transfektion der Endothelzellen exprimierte hVEGF-165 führte im Trennkammersystem zu einer gesteigerten Proliferation von nicht-transfizierten Endothelzellen. Außerdem wurden hVEGF-165-transfizierte HUVEC in den Kollagenschwamm und in das Kollagengel implantiert und zeigten eine signifikant gesteigerte Proliferationsaktivität und Ausbildung von kapillarähnlichen Strukturen in beiden Matrices. Im Rahmen des Tissue Engineering ergibt sich eine Fülle von Möglichkeiten Angiogenese therapeutisch einzusetzen und zu nutzen. Die Ko-Kultur mehrerer Zellen in einer dreidimensionalen Matrix stellt den nächsten Schritt in der Entwicklung eines vaskularisierten Konstruktes dar. -65- 5. DANKSAGUNG Herrn Prof. Dr.med. Stark danke ich für die Überlassung des Themas und die jederzeit großzügige Unterstützung und Hilfestellung. Meinem Projektleiter, Herrn Dr.med. Walgenbach, in dessen Arbeitsgruppe diese Arbeit entstand, danke ich für steten Rat und Hilfsbereitschaft bei der Umsetzung der Idee in das endgültige Projekt und bei der Bewältigung der alltäglichen Probleme. Herrn Prof. Dr.rer.nat. Marmé und seinen Mitarbeitern Dr.rer.nat. Martiny-Baron, Dr.rer.nat. Barleon, Dr.rer.nat. Humar und Frau Herzog, Klinik für Tumorbiologie, Institut für Molekulare Medizin und Tumorforschung (Freiburg) danke ich für die Kooperation und Hilfestellung bei Fragen der Zellkultur und der Gentherapie. Herrn Priv. Doz. Dr.med. Schmitt, Chefarzt der Gynäkologischen Abteilung des St. Josef Krankenhauses in Freiburg, sowie den Hebammen im Kreißsaal danke ich für die Überlassung der Nabelschnüre. Meinen Kollegen im Tissue Engineering Labor der Abteilung für Plastische und Handchirurgie (Freiburg) insbesondere Frau Dr.rer.nat. Bittner, Frau Dr.med. Tanczos, Dr.med. Bannasch, Dr.med. Bach, Frau Flies, Frau Marniga, Frau cand. med. Seifer, Frau cand. med. Huber und Herrn cand. med. Föhn danke ich für Ihre technische und geistige Unterstützung. Die statistische Aufarbeitung erfolgte im Institut für Medizinische Biometrie und Medizinische Informatik unter Mitarbeit von Herr Olchewski. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch: großzügige Förderung im Rahmen des ValleyTEC-Projektes durch das Land Baden-Württemberg und Firma BaxterImmuno, die Moskauer Medizinische und Stomatologische Universität, die Stiftung des Präsidenten der Russischen Föderation (Moskau, Russische Föderation) sowie Gottfried Daimler- und Carl-Benz-Stiftung (Ladenburg, Deutschland). -66- 6. LITERATURVERZEICHNIS Akita M., Murata E., Merker H.J., Kaneko K. 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