Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion (RGS)

Aus dem Institut für Physiologische Chemie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für
Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion (RGS) als
Zielgruppe für neue Medikamente – Entwicklung eines Testsystems zur
Suche nach RGS3-Inhibitoren
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Eva-Christina Schliewert
aus Münster
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Hassan Naim
Prof. Dr.Manfred Jung
1. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Naim
2. Gutachter: PD Dr. Wolfgang Bäumer
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Mai 2007
Inhaltsverzeichnis
1
2
Einleitung.................................................................................................................. 1
1.1
G-Proteine und G-Protein gekoppelte Rezeptoren ........................................... 2
1.2
RGS-Proteine .................................................................................................... 5
1.3
Möglichkeiten der Modulation des Signaltransduktionsweges ...................... 11
1.4
Zielsetzung der Arbeit .................................................................................... 13
Materialien und Methoden...................................................................................... 14
2.1
Materialien ...................................................................................................... 14
2.1.1
Western Blot–Antikörper........................................................................ 14
2.1.2
Größenmarker für Gele........................................................................... 14
2.1.3
Chemikalien und Pufferlösungen............................................................ 14
2.1.4
Enzyme ................................................................................................... 16
2.1.5
Primer...................................................................................................... 16
2.1.6
Vektoren.................................................................................................. 16
2.1.7
Bakterienstämme .................................................................................... 16
2.1.8
Protein..................................................................................................... 16
2.1.9
Testsubtanzen.......................................................................................... 17
2.1.10
Reaktionssysteme („Kits“)...................................................................... 17
2.1.11
Reaktionslösungen .................................................................................. 17
2.1.12
Affinitätschromatographie ...................................................................... 18
2.1.13
Geräte und sonstige Materialien ............................................................. 18
2.2
Methoden ........................................................................................................ 20
2.2.1
Klonierung .............................................................................................. 20
2.2.1.1
Primer-Design..................................................................................... 20
2.2.1.2
Polymerasenkettenreaktion (PCR)...................................................... 21
2.2.1.3
Agarose-Gelelektrophorese ................................................................ 23
2.2.1.4
Topoisomerase-Reaktion .................................................................... 23
2.2.1.5
Plasmidaufreinigung ........................................................................... 24
2.2.1.6
LR-Reaktion zwischen Entryvektor und Destinationsvektor ............. 26
2.2.2
Proteinaufbereitung................................................................................. 29
2.2.2.1
Proteinexpression................................................................................ 30
2.2.2.2
SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot) ................... 30
2.2.2.3
Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode ...................... 32
2.2.2.4
Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford.............................. 32
Inhaltsverzeichnis
2.2.2.5
Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit
Quantity One (Firma Bio-Rad) ........................................................... 33
2.2.2.6
Proteinfärbung mit Coomassie-Blau................................................... 33
2.2.2.7
Proteinfärbung mit Silberfärbung ....................................................... 34
2.2.2.8
Lösung und Rückfaltung der Proteine ................................................ 34
2.2.2.9
Aufreinigung der Proteine .................................................................. 35
2.2.3
2.2.3.1
Aufreinigung des Gαq......................................................................... 36
2.2.3.2
Aufreinigung des RGS3...................................................................... 37
2.2.4
3
AlphaScreen-Assay................................................................................. 38
Ergebnisse............................................................................................................... 42
3.1
4
Affinitätschromatographie ...................................................................... 35
Klonierung der DNA ...................................................................................... 43
3.1.1
PCR aus cDNA ....................................................................................... 43
3.1.2
Insertion in einen „Entryvektor“............................................................. 43
3.1.3
Umklonierung in Destinationsvektoren .................................................. 44
3.2
Proteinexpression............................................................................................ 45
3.3
AlphaScreen-Assay......................................................................................... 50
3.3.1
Etablierung.............................................................................................. 51
3.3.2
Test potentieller RGS3-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay .................. 57
Diskussion............................................................................................................... 60
4.1
Proteinexpression und –detektion................................................................... 61
4.2
Erhaltung der Proteinaktivität......................................................................... 62
4.3
Proteinaufreinigung ........................................................................................ 63
4.4
Etablierung des RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays.......................................... 64
4.5
Screening von RGS-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay................................ 66
5
Zusammenfassung .................................................................................................. 70
6
Summary................................................................................................................. 71
7
Literatur .................................................................................................................. 72
8.
Danksagung ............................................................................................................ 77
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
RGS3 als 'Drug-Target'................................................................................. 2
Abb. 2:
GTPase – Zyklus eines heterotrimeren G-Proteins....................................... 5
Abb. 3:
Struktur und Einteilung der humanen RGS –Proteine.................................. 7
Abb. 4:
Isoformen von RGS3 .................................................................................... 8
Abb. 5:
Domänenstruktur von RGS3 (Isoform 6). .................................................... 8
Abb. 6:
DNA-Sequenz der klonierten Proteine ....................................................... 22
Abb. 7:
Gateway-Klonierungssystem ...................................................................... 26
Abb. 8:
Sequenz der klonierten Proteine ................................................................. 29
Abb. 9:
Prinzip des AlphaScreen Assays................................................................. 39
Abb. 10:
Strukturformeln der potentiellen Inhibitoren, „Hits“ des virtuellen
Screenings................................................................................................... 41
Abb. 11:
PCR-Amplifikation der RGS3- und Gαq-Sequenz..................................... 43
Abb. 12:
Kontrollverdau der RGS3- und Gαq-Klonierungsvektoren........................ 44
Abb. 13:
Kontrollverdau der rekombinanten Destinationsvektoren.......................... 45
Abb. 14:
Kontrolle der Proteinexpression und Verifizierung des Proteintags .......... 46
Abb. 15:
Zeitverlauf der Proteinexpression............................................................... 46
Abb. 16:
RGS3-Koloniewahl..................................................................................... 47
Abb. 17:
Überprüfung der Löslichkeit von Gαq und RGS3 ...................................... 47
Abb. 18:
Gαq und RGS3-Detektion nach Rückfaltungsprotokoll ............................. 48
Abb. 19:
RGS3-GST-Aufreinigung........................................................................... 49
Abb. 20:
Aufreinigung von Gαq-Biotin-Fusionsprotein ........................................... 50
Abb. 21:
Kompetitive Verdrängung des biotinylierten GST durch die rekombinanten
Proteine ....................................................................................................... 52
Abb. 22:
Unspezifische Interferenz des E.coli-Lysats mit dem AlphaScreen-Assay 53
Abb. 23:
Experimentelle Bestimmung des optimalen Verhältnisses zwischen RGS3
und Gαq ...................................................................................................... 54
Abb. 24:
Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay........................ 54
Abb. 25:
Kompetition durch Gαq/Gαi ....................................................................... 55
Abb. 26:
Einfluß des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO auf das Bindungssignal des
RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays................................................................ 56
Abb. 27:
Test verschiedener Konzentrationen des Neubig-RGS4-Inhibitors im
RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay ................................................................. 57
Abb. 28:
Einfluß der Substanz HTS 07963 im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay ...... 58
Abbildungsverzeichnis
Abb. 29:
Einfluß der Substanzen 2, 3 und 4 aus „virtuellem Screening“ im
AlphaScreen................................................................................................ 59
Abb. 30:
Vergleich der Sequenzen von Gαq und Gαi1 (A) und RGS3 und RGS4 (B
und C) ......................................................................................................... 68
Abkürzungsverzeichnis
BSA
:
Bovines Serum Albumin
cDNA :
complementary DNA
cps
:
counts per second
DMSO :
Dimethylsulfoxid
DTT
Dithiothreitol
:
EDTA :
Ethylendinitrilotetraessigsäure – Dinatriumsalz
GAP
:
GTPase accelerating protein (GTPase-beschleunigendes Protein)
GDP
:
Guanosindiphosphat
GPCR :
G-Protein coupled receptor (G-Protein-gekoppelter Rezeptor)
GST
:
Glutathion-S-Transferase
GTP
:
Guanosintriphosphat
IP3
:
Inositoltriphoshat
IPTG
:
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
NA
:
Noradrenalin
PBS
:
Phosphate Buffered Saline
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
RGS
:
Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion
SDS
:
Sodiumdodecylsulfat
1 Einleitung
1
1
Einleitung
Es gibt viele Krankheiten, deren Ätiologie noch nicht vollständig geklärt ist. Dazu
zählen auch Erkrankungen wie Epilepsie, Parkinson, Alzheimer, Herzversagen,
Schmerz, Spastiken oder psychiatrische Störungen wie die Schizophrenie oder
depressive Erkrankungen.
In aktuellen Untersuchungen wird diskutiert, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren und
ihre Regulatoren einen Einfluss auf diese Krankheitsbilder haben (HOLLINGER et al.
2002; ZHONG et al. 2001). Besonders der Überexpression der Kontrollproteine wird
eine entscheidende Rolle zugewiesen.
Am Beispiel der Depression lässt sich die Bedeutung der G-Protein–vermittelten
Signaltransduktion und deren Funktion als Drug-Target gut aufzeigen: Es gibt eine
Reihe von Hypothesen, die auf der neurobiologischen Ebene Erklärungsversuche für die
Ätiologie der depressiven Erkrankung darstellen. Schon 1965 postulierte Schildkraut in
der „Katecholamin-Hypothese“ ein Ungleichgewicht der Neurotransmitter Noradrenalin
(NA) und Adrenalin bei affektiven Störungen. Einige Jahre später vermuteten Janowsky
et al., dass ein Ungleichgewicht der cholinergen und adrenergen Transmitter das
Krankheitsbild hervorruft (JANOWSKY et al. 1972). Spätere Forschungsarbeiten
verlagerten den Fokus auf die zelluläre Ebene und vermuteten z.B. eine veränderte
Signaltransduktion von G-Protein gekoppelten Neurotransmitter-Rezeptoren (DEAN et
al. 2004). Die Bedeutung der noradrenergen Signaltransduktion im Rahmen der
depressiven Erkrankung zeigt der therapeutische Erfolg der Noradrenalin –
Wiederaufnahmehemmer (Wirkstoff: Reboxetin). Durch die Unterdrückung der NAWiederaufnahme bleibt der Neurotransmitter länger im synaptischen Spalt und verstärkt
so das noradrenerge Signal. Bezeichnet man diesen Weg aus zellulärer Sicht als eine
„exogene“ Amplifikation des Neurotransmitter-Signals, so stellt die Inhibition der RGSMoleküle, die im Inneren der Zelle den Neurotransmitterrezeptor „ausschalten“, eine
„endogene“ Amplifikation des Neurotransmittersignals dar.
1 Einleitung
2
Abb. 1: RGS3 als 'Drug-Target'
Neurotransmitter-vermittelte Rezeptoraktivierung wird über G-Proteine auf ein Effektorenzym vermittelt.
RGS-Proteine schalten das G-Protein in den „OFF-Zustand“ zurück. Wird das RGS-Protein selber
inhibiert, so bleibt das G-Protein länger im „ON-Zustand“, das heißt, der Transmittereffekt wird verstärkt
(Modifiziert nach Nature Reviews. Drug Discovery 1(3):187, 2002).
So könnten Inhibitoren dieser Regulationsproteine beispielsweise auch in der
Schmerztherapie Einsatz finden, indem sie die Wirkung endogener Opioide steigern und
die Sensibilität für synthetische Opioide erhöhen (NEUBIG et al. 2002).
In Folge dieser Erkenntnisse eröffnen sich Optionen zu einer pharmakotherapeutischen
Modulation dieses Systems und die Notwendigkeit zur Suche nach potentiellen
Wirkstoffen.
1.1
G-Proteine und G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Die Fähigkeit, auf externe Signale mit einer intrazellulären Antwort zu reagieren, ist für
die einzelne Zelle, aber auch für den Gesamtorganismus von entscheidender Rolle. Eine
wichtige Rolle in dieser Signaltransduktion wird von transmembranären Rezeptoren und
den
zugehörigen
Signalkaskaden
übernommen.
Das
Standardmodell
der
guanidinnukleotidbindenden Signaltransduktion besteht aus drei Komponenten:
Rezeptor, G-Protein und Effektor. Der Rezeptor ist ein helikales Zellprotein, das die
Zellmembran sieben Mal durchspannt und an ein G-Protein gekoppelt ist. G-Proteine
sind eine heterogene Gruppe von Proteinen, die in der Lage sind, Guanin-Nucleotide,
also GTP und GDP, zu binden.
Als Effektoren können verschiedene Proteine wirken. Es werden einige Na- und KIonenkanäle,
verschiedene
Kinasen
(Tyrosin
und
Serin/Threonin-Kinasen),
Phospholipase C und Adenylylcyclasen durch die G-Proteine beeinflusst.
1 Einleitung
3
G-Proteine kommen in zwei Zuständen, „on“ und „off“, bzw. aktiv und inaktiv, vor.
Diese Grundzustände werden durch die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beeinflusst.
Durch die Bindung eines Liganden erfährt der Rezeptor eine Konformationsänderung,
die schließlich zu einer Aktivierung des G-Proteins führt (PFEUFFER et al. 1988).
Das G-Protein ist heterotrimer, besteht also aus drei Untereinheiten, Gα, Gβ, Gγ.
Zurzeit sind 16 Gene, die Gα, 5 Gene, die Gβ, und 12 Gene, die Gγ kodieren, bekannt
(DOWNES et al. 1999). Gemeinhin werden die G-Proteine gemäß ihrer GαUntereinheit in 4 Gruppen eingeteilt: Gαi, Gαs, Gαq und Gα12/13.
Gα-Untereinheiten bestehen aus zwei Domänen; einer GTPase-Domäne mit den
sogennanten „Switch Regions“, die an der Bindung und Spaltung von GTP beteiligt
sind, und einer helikalen Domäne, die das GTP in das Zentrum des Proteins
transportiert. Diese helikale Domäne weist zwischen den verschiedenen GαUntergruppen große Unterschiede auf und könnte die Ursache für unterschiedliche
Spezifität der verschiedenen G-Proteinfamilien sein.
Die Gβ-Untereinheit hat β-Faltblattstruktur und interagiert mit der Gγ-Untereinheit. Der
Gβγ-Komplex bindet an eine hydrophobe Tasche in Gα-GDP. Diese Tasche wird durch
die Bindung von GTP an Gα entfernt und somit wird die Affinität von Gβγ zu Gα
gesenkt. Dadurch dissoziiert der trimere Gαβγ-Komplex.
Die aktivierten Untereinheiten interagieren nun mit unterschiedlichen Komponenten,
die in der Signalkaskade nachgeschaltet sind, und ihrerseits weitere Effektoren, so
genannte „second messengers“ und Ionen freisetzen, die die Zellfunktion steuern.
1 Einleitung
4
GProtein
Gs
Gl
α-UntereinheitUnterfamile
Gsα, Golf
Glα1-3, Goα, Gzα, Gαt
Gq
G12
Gqα, G11α, G14α, G16α
G12α, G13α
Aktivierung
Stimulation der Adenylylcyclase
Inhibition der Adenylylcyclase
Aktivierung der cGMP Phosphodiesterase
(retinale Phototransduktion)
Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ)
Aktivierung des RhoA-Signals, Aktivierung
der PLC4
Tab. 1: Gα – Untereinheit Unterfamilien heterotrimerer G – Proteine und ihre Effekte (NEUBIG et
al. 2002)
Die aktivierte Gα-Untereinheit beeinflusst zum Beispiel die Adenylylcyclase oder die
Phosphodiesterase. Die Effektoren der βγ-Untereinheiten sind sehr unterschiedlich, es
werden Na-und K-Ionenkanäle, unterschiedliche Kinasen (Tyrosin und Serin, ThreoninKinasen), Phospholipase C und Adenylylcyclasen durch den βγ-Komplex gesteuert.
Der limitierende Faktor bei der Aktivierung des G-Proteins ist die Freisetzung von
GDP. GDP wird auch spontan freigesetzt, die Rate ist dabei abhängig von der Art der
Gα-Untereinheit.
Die Freisetzungsrate von GDP durch die Stimulation von Rezeptoren hängt davon ab, in
welchem Maße der Rezeptor eine Konformationsänderung in der Gα-Untereinheit
bewirkt.
Die Beendigung des Signals findet durch die Hydrolyse von GTP zu GDP statt. Die
Geschwindigkeit dieser Spaltung ist abhängig von der GTPase-Aktivität der αUntereinheit. Diese spaltet GTP zu GDP und führt so den Rezeptor vom „on“- in den
„off“-Zustand zurück. Durch die Hydrolyse von GTP zu GDP löst die Gα-Untereinheit
sich vom Effektor und reassoziiert mit der βγ-Untereinheit und dem Rezeptor. So ist der
Komplex bereit für ein neues Signal von außen.
Die intrinsische GTPase–Aktivität der G-Protein-Untereinheit kann durch die
Assoziation mit dem Effektor verstärkt werden: Durch diese erhöhte GTPase-Aktivität
wird das Signal schneller beendet.
Diese verkürzte Zellantwort kann allerdings auch durch RGS-Proteine (Regulators of
G-Protein Signaling) bewirkt werden (ISHII et al. 2003).
1 Einleitung
5
III.
I.
II.
Abb. 2: GTPase – Zyklus eines heterotrimeren G-Proteins
Durch die Bindung eines Liganden an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor kommt es zu einer
Aktivierung des G – Proteins mit Austausch von GDP gegen GTP(I.). GαGTP dissoziert in der Folge
vom Rezeptor und den Untereinheiten Gβγ. Die Untereinheiten können nun weitere Signalkaskaden
modulieren (II.).
Das Signal wird durch die Hydrolyse von GTP zu GDP durch die intrinsische GTPase–Aktivität der Gα–
Untereinheit beendet, die Untereinheiten reassoziieren und der Zyklus ist vollendet (III.).
RGS – Proteine beschleunigen die intrinsische GTPase–Aktivität der Gα–Untereinheit und verkürzen so
die Dauer des Signals. (CABRERA-VERA et al. 2003).
1.2
RGS-Proteine
RGS-Proteine sind Proteine, die an die Gα-Untereinheit binden und die Hydrolyse von
GαGTP zu GαGDP beschleunigen, sogenannte „GTPase accelerating Proteins“ (GAPs),
wodurch sie die die Inaktivierung des G-Proteins um ein Tausendfaches beschleunigen.
RGS-Proteine wurden erst in den 90er Jahren von drei unterschiedlichen
Arbeitsgruppen entdeckt (SIDEROVSKI et al. 1994; DE VRIES et al. 1995; KOELLE
et al. 1996; DRUEY et al. 1996).
In Auswertungen der Atomstruktur wurde gezeigt, dass die RGS-Proteine an den GαEffektorregionen angreifen und so auch mit dem Effektor um Gα-Proteine konkurrieren
(HEPLER et al. 1997).
1 Einleitung
6
Im menschlichen Genom sind mehr als 30 verschiedene Proteine, die eine RGS- oder
RGS-like-Domäne besitzen, identifiziert.
RGS-Proteine werden ubiquitär, also in vielen verschiedenen Geweben, exprimiert,
häufig jedoch in einem zeitlich und räumlich eingeschränkten Muster. Ein wesentlicher
Anteil der RGS-Genexpression findet allerdings im Gehirn statt, denn hier liegt eine
große Diversität neuronaler und glialer G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vor und
somit spielt die Signalmodulation dort eine große Rolle (HOLLINGER et al. 2002).
Da RGS-Proteine Gα-spezifisch und rezeptorspezifisch sind und durch die
verschiedenen Spleißvarianten einzigartige Expressionsmuster möglich sind, könnte ein
RGS-Inhibitor die Zellantwort über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektiv in
bestimmten Geweben steigern.
RGS-Proteine werden, ausgehend von der Homologie der 120 Aminosäuren großen
RGS-Domäne und dem Vorhandensein anderer Domänen, in verschiedene Familien
eingeteilt (ROSS et al. 2000) (Abb. 3). Die konservierte RGS-Domäne ist für die
Aktivierung des G-Proteins (GAP-Aktivität) verantwortlich (ISHII et al. 2003;
NEUBIG et al. 2002).
1 Einleitung
7
Abb. 3: Struktur und Einteilung der humanen RGS –Proteine
Die Proteine werden gemäß ihrer Domänen in verschiedene Unterfamilien eingeteilt. Jede Unterfamilie
ist durch das Vorhandensein bestimmter Domänen charakterisiert, die RGS–Domäne ist Merkmal der
gesamten RGS – Familie. Quelle: (HOLLINGER et al. 2002)
In dieser Abbildung sind die Proteine so dargestellt, dass der N–Terminus links liegt.
In dieser Arbeit wird die Interaktion eines ubiquitär exprimierten Familienmitgliedes,
RGS3 Isoform 4, mit Gαq untersucht (Abb. 4).
RGS3 wurde 1996 erstmals von K.M. Druey am National Institute of Health (NIH) in
Maryland/USA kloniert. Die zuerst beschriebene Isoform besteht aus 519 Aminosäuren
und
hat,
basierend
auf
der
Aminosäurenabfolge
ohne
posttranslatorische
Modifikationen, ein Molekulargewicht von 57 kD (DRUEY et al. 1996). RGS3 ist auf
1 Einleitung
8
Chromosom 9 codiert. Weitere Isoformen (Spleißvarianten) sind in Abbildung 4
dargestellt.
Abb. 4: Isoformen von RGS3
Diese Abbildung zeigt die verschiedenen bekannten Isoformen von RGS3 im Vergleich. Die
Spleißvarianten weisen Unterschiede in ihrer Struktur und Funktion auf. In dieser Arbeit wird Isoform 4
näher untersucht. Quelle: NCBI Entrez Gene
Das RGS3-Protein ist aus mehreren funktionellen Domänen zusammengesetzt (Abb. 5).
Die für die Proteinfamilie charakteristische RGS-Domäne befindet sich am Carboxyterminalen Ende. Dieser Teil des Proteins bindet an die Gα-Untereinheit und
beschleunigt die Hydrolyse von GTP. Darüber hinaus kann RGS allerdings auch mit
dem Effektor um Gα konkurrieren und so die Zellantwort modulieren (EffektorAntagonismus) (ANGER et al. 2004).
Abb. 5: Domänenstruktur von RGS3 (Isoform 6).
Der Balken mit Zahlen symbolisiert die Aminosäuresequenz mit der entsprechenden Position. Die
„Proteinkinase C konservierte Region 2“ (2C) besteht aus einem Ca2+-bindenden Motiv, wie es in
Phospholipasen und PKCs vorkommt. Spezielle 2Cs binden Phospholipide, Inositolphosphate und
1
intrazelluläre Proteine . Die KOG-Domäne (KOG) steht im Zusammenhang mit dem intrazellulären
2
Proteinverkehr, der Sekretion und dem vesikulären Transport .
In der konservierten RGS-Domäne existiert eine Phosphorylierungsstelle, an die sich
abhängig vom Phosphorylierungszustand das RGS-inaktivierende-Protein „14-3-3“
bindet (BENZING et al. 2000). So wird die RGS-Aktivität kontrolliert. Fehlte eine
solche Kontrolle, würden in Folge die RGS-Proteine ständig die G-Proteine zu einer
erhöhten GTP-Hydrolyserate anregen und so die Signalkaskade auf Höhe des GProteins stoppen. Diese Phosphorylierung wird über G-Protein regulierte Kinasen
1
2
NCBI Conserved Domain Database (CDD)
NCBI CDD
1 Einleitung
9
gesteuert, wie z.B. Phosphokinase A, Phosphokinase C und „Extracellular Signal
Related Kinase“ (HOLLINGER et al. 2004). Durch die RGS-vermittelte negative
Rückkopplungsschleife kann die Rezeptoraktivierung gezielt und sehr genau reguliert
werden.
Im nicht aktivierten Zustand sind die RGS-Proteine gleichmäßig im Zytoplasma verteilt.
Nach der Aktivierung des G-Proteins durch einen Liganden wird RGS3 teilweise aus
dem Zytoplasma in die Plasmamembran transloziert (DULIN et al. 1999). Zusätzlich
wurde festgestellt, dass RGS3 palmitoyliert wird (CASTRO-FERNANDEZ et al. 2002).
Dabei wird eine 16 Kohlenstoffatom lange Fettsäure an das Protein gekoppelt
(BERNSTEIN et al. 2004). Vermutlich dient diese Palmoylierung der Verankerung des
RGS3 in der Phospholipiddoppelschicht der Zellmembran.
Grundsätzlich kann aber davon ausgegangen werden, dass Abschnitte im Protein
vorhanden sind, die eine Information zur Lokalisation beinhalten. Bei der Untersuchung
von RGS3-Deletionsmutanten (DULIN et al. 1999) konnte gezeigt werden, dass diese
Information über die Translokation in die Zellmembran auf den ersten 380
Aminosäuren kodiert wird, nicht in der RGS-Domäne. Dieser Effekt wurde weiter
untersucht (DRUEY et al. 1996). Hierzu wurde eine klonierte RGS3-Isoform RGS3T
(RGS3 truncated) verwendet. Diese Isoform weicht von der 519 Aminosäuren langen
Isoform 3 ab, ihr fehlt ein großer Teil des aminoterminalen Endes. RGS3T besteht aus
den Aminosäuren 314-519 und so fehlt die Information über die zytoplasmatische
Lokalisation und das Protein wird in den Zellkern verbracht.
In weiteren Versuchen mit Deletionsmutanten konnte der für die Translokation in den
Zellkern verantwortliche Proteinsequenzbereich weiter eingeschränkt werden. Es
handelt sich hierbei um die nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) (DULIN et al. 2000)
(ROBBINS et al. 1991).
Eine Überexpression von RGS3T erhöht die Apoptoseanfälligkeit der Zellen (DULIN et
al. 2000), eine Funktion von RGS3 im Zellkern kann somit vermutet werden.
Auch andere RGS-Proteine besitzen Proteinabschnitte, die die Information für eine
Translokation in den Zellkern kodieren, und so kann eine neuropathologische Relevanz
vermutet werden (CHATTERJEE et al. 2000).
Obwohl noch viele Fragen zum genauen Mechanismus der Protein-ProteinInteraktionen der RGS–Proteine und ihre physiologischen Konsequenzen ungeklärt
1 Einleitung
10
sind, ist die Tatsache, dass RGS–Proteine einen direkten Einfluss auf G-Proteine und
die daran nachgeschalteten Signalkaskaden haben, ein Hinweis auf die resultierenden
Modulationsmöglichkeiten im Rahmen der Pharmakotherapie.
1 Einleitung
1.3
11
Möglichkeiten der Modulation des Signaltransduktionsweges
Insgesamt sind fünf verschiedene Möglichkeiten zu einer Beeinflussung des
Signaltransduktionsweges vorstellbar: 1. direkte RGS/Gα-Bindung, 2. allosterische
Modulation der RGS/Gα-Bindung, 3. selektive Interaktion zwischen RGS und Gα , 4.
Veränderung
der
RGS-Membranbindung,
5.
RGS-Interaktion
mit
G-Protein-
regulierenden Rezeptoren, Regulationsproteinen oder nachfolgenden Effektoren
(HOLLINGER et al. 2002):
1.
direkte Veränderung der RGS/Gα-Bindung
Zwischen den Aminosäuren der RGS/Gα-Kontaktstellen handelt es sich wohl um
die offensichtlichste Angriffsstelle für einen möglichen Einsatz von Therapeutika.
Wirkstoffe, die die Interaktion zwischen RGS und Gα hemmen, könnten die
inhibitorischen
Effekte
auf
die
Signaltransduktion
aufheben,
wohingegen
Wirkstoffe, die RGS simulieren, das Signal des G-Proteins limitieren könnten.
Bisher wurde berichtet, dass die Oberflächenschleifen der Guanidinnukleotid„Switch“-Regionen im aktiven Gα mit der RGS-Domäne in Kontakt treten. Für die
Stärke dieser Bindung sind verschiedene Aminosäurenreste relevant. Diese könnten
auch als mögliche Angriffsziele für Wirkstoffe fungieren. So bewirkt beispielsweise
bei RGS3 eine Phosphorylierung der Aminosäure 164 (Serin) eine verstärkte
Interaktion mit dem zytosolischen Gerüstprotein 14:3:3 und verhindert eine
Interaktion zwischen RGS und Gα (BENZING et al. 2000). Im Gegensatz dazu
aktiviert eine Phosphorylierung von RGS2 durch Phosphokinase C die GAPAktivität gegenüber Gαq (CUNNINGHAM et al. 2001).
2
Allosterische Veränderung der RGS/Gα-Bindung
Auch Regionen, die nur indirekt an der Bindung von Gαq und RGS3 beteiligt sind,
könnten als Zielstruktur für Therapeutika in Frage kommen. So verhindert die
kovalente Bindung einer Palmitinsäure an ein Cystein in der Helix α4 der RGSDomäne, die nicht direkt an der Bindung zu Gα beteiligt ist, eine Interaktion
zwischen RGS und Gα (TU et al. 1999).
1 Einleitung
3.
12
Selektivität der Interaktion zwischen Gα und RGS
Idealerweise sollte eine Substanz zwischen verschiedenen RGS-Gα Interaktionen
unterscheiden können. Aus diesem Grund sind Gruppen, die die Spezifität von RGS
bestimmen,
besonders
interessant.
So
haben
verschiedene
RGS-Proteine
unterschiedliche Gα-Selektivität. RGS4 ist zum Beispiel ein sehr starkes GAP für
Gαi und Gαq, während RGS2 sehr selektiv Gαq inhibiert (INGI et al. 1998;
HEXIMER et al. 1999). Aus solchen Untersuchungen erwächst die Möglichkeit,
hochspezifische Gα-Inhibitoren zu entdecken.
4. Veränderung der Membranlokalisation von RGS3
Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität von RGS3 zu inhibieren, ist, die
Membranbindung des Proteins zu stören. So verhindern Statine die Isoprenylierung
vieler Signalproteine und stören so deren Membranbindung und Signalaktivität
(BELLOSTA et al. 2000).
Da RGS-Proteine mit der Plasmamembran assoziieren müssen, um Gα-Signale zu
modulieren, könnte eine Veränderung der Membranlokalisation ein interessantes
Ziel für therapeutisch wirksame Substanzen sein.
5. Veränderung der RGS-Bindung an GPCR, Effektor- und Regulationsproteine
Weil RGS nicht nur direkt mit Gα interagiert, sondern auch direkt an Proteine, die
bei der nachgeschalteten Signaltransduktion von Bedeutung sind, bindet, ist eine
Hemmung der Interaktion mit diesen Molekülen von Interesse. Dadurch könnten
spezifische Zellprozesse wie Ionenleitfähigkeit, Zellwachstum und –differenzierung
beeinflusst werden. So ist ein Effektorantagonismus bei RGS2 und RGS3 bekannt
(LADDS et al. 007).
Insgesamt ist das Wissen über die spezifischen Proteinbindungen und ihre
physiologischen Folgen noch sehr gering, weshalb besonders diese Funktion noch einer
Vielzahl von Untersuchungen bedarf.
1 Einleitung
1.4
13
Zielsetzung der Arbeit
In Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern wird eine Überproduktion von
RGS diskutiert. So stellen RGS-Proteine ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung neuer
Pharmakotherapeutika dar.
Aus diesem Grunde ist es Ziel dieser Arbeit, auf der Basis des AlphaScreen-Assays von
PerkinElmer ein Testsystem zu entwickeln, das es ermöglicht, Substanzen zu finden, die
die Interaktion zwischen RGS3 und Gαq inhibieren.
Dieser Assay soll auf Grundlage der Proteininteraktion zwischen RGS3 und Gαq
funktionieren. So werden die notwendigen Gensequenzen von RGS3 und Gαq aus
cDNA kloniert und die kodierten Proteine exprimiert. Nachfolgend werden die Proteine
im Testsystem verwendet, der Assay soll etabliert, optimiert und für einige ausgewählte
Substanzen angewendet werden.
2 Materialien und Methoden
14
2
Materialien und Methoden
2.1
Materialien
2.1.1
Western Blot–Antikörper
Primäre Antikörper:
Anti - Gαq Rabbit IgG
Gramsch, Schwabhausen
Anti GST-tag (Mouse)
Santa Cruz, USA
Anti RGS3 Rabbit IgG
Santa Cruz, USA
Strep-AP Konjugat
Invitrogen, Karlsruhe
Sekundäre Antikörper:
Anti Mouse IgG
Amersham, München
Anti Rabbit IgG
Amersham, München
2.1.2
Größenmarker für Gele
100 Base-Pair Leiter (DNA)
Amersham, München
High Range Rainbow Molecular Weight Marker
Amersham, München
peqGOLD High Range DNA-Leiter
peqLAB, Erlangen
2.1.3
Chemikalien und Pufferlösungen
Agarose
Biozym, Hess. Oldendorf
Arginin
Applichem, Darmstadt
Bacto Agar
Difco Laboratories, USA
Bacto Trypton
Difco Laboratories, USA
Carbacillin
Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Riedel-de-Haën, Seelze
Dithiothreitol
Roth, Karlsruhe
(DTT)
Essigsäure
Riedel-de-Haën, Seelze
Ethanol
Roth, Karlsruhe
2 Materialien und Methoden
15
Ethidiumbromid
Schülke, Norderstedt
Ethylendinitrilotetraessigsäure – Dinatriumsalz (EDTA)
Serva, Heidelberg
Formaldehyd
Riedel-de-Haën, Seelze
GDP
Sigma, Taufkirchen
Glutathion oxidiert
Applichem, Darmstadt
Gluthation reduziert
Applichem, Darmstadt
Glycerin
Roth, Karlsruhe
GTP-γ-S
Sigma, Taufkirchen
Guanidinhydrochlorid
Applichem, Darmstadt
Imidazol
Riedel-de-Haën, Seelze
Isopropanol
Merck, Darmstadt
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)
Sigma, Taufkirchen
Kanamycin
Gibco BRL, Eggenstein
Lysozym
Merck, Darmstadt
Methanol
Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid
Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat
Gibco BRL, Eggenstein
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Gibco BRL, Eggenstein
Salzsäure (37%)
Merck, Darmstadt
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
USB, USA
Yeast Extract
Difco Laboratories, USA
Weitere im Text erwähnte Chemikalien wurden von den Firmen Roth, Sigma, Merck
oder Applichem in der Qualitätstufe p.a. bezogen.
2 Materialien und Methoden
2.1.4
16
Enzyme
Taq Proofreading Polymerase AccuPrime PFX
Invitrogen, Karlsruhe
Restriktionsenzyme:
Cel II
Roche, Mannheim
Eco RV
Roche, Mannheim
Not I
Roche, Mannheim
Sfu I
Roche, Mannheim
Sph I
Roche, Mannheim
2.1.5
Primer
MWG Biotech AG,
München
2.1.6
Vektoren
pENTR/D-TOPO
Invitrogen, Karlsruhe
pDest 15
Invitrogen, Karlsruhe
pET104 BioEase
Invitrogen, Karlsruhe
2.1.7
Bakterienstämme
BL21Star - Zellen E.coli
Invitrogen, Karlsruhe
OneShot Top10 E.coli
Invitrogen, Karlsruhe
2.1.8
Protein
Gαq/Gαi-Chimäre-His-Tag
Dr. Joachim Orth, AG
Aktories, Pharmakologie,
Albert-LudwigUniversität Freiburg
2 Materialien und Methoden
2.1.9
17
Testsubtanzen
RGS4-Inhibitor
Peptide Specialty
Laboratories GmbH,
Heidelberg
HTS 07963
Maybridge, Cornwall, UK
SCR 01461
Maybridge, Cornwall, UK
HTS 05503
Maybridge, Cornwall, UK
ChemBridge 6372993
ChemBridge Corporation,
USA
2.1.10 Reaktionssysteme („Kits“)
BCA Protein Assay
Pierce, USA
GST Detection Kit AlphaScreen
PerkinElmer,
Rodgau-Jügesheim
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
Qiagen Plasmid Mini Kit
Qiagen, Hilden
Qiagen Plasmid Maxi Kit
Qiagen, Hilden
Roti-Black P Kit
Roth, Karlsruhe
2.1.11 Reaktionslösungen
Bradford Reagenz
Promega, Mannheim
ECL Plus Western Blotting Detection Reagents
Amersham, München
Roti-Block
Roth, Karlsruhe
Rotiphorese-Gel
Roth, Karlsruhe
TMP Stabilized Substrate for HRP
Promega, Mannheim
Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphate
Promega, Mannheim
2 Materialien und Methoden
18
2.1.12 Affinitätschromatographie
Glutathion Sepharose 4B
Amersham, München
Soft Link Soft Release Avidin Resin
Promega, Mannheim
2.1.13 Geräte und sonstige Materialien
BioDoc Analyze (UV-Gel)
Biometra, Göttingen
CCTV Kamera
Panasonic, Hamburg
Dialysiermembran cut-off 10,000
Roth, Karlsruhe
Dialysierkassette Slide-A-Lyzer
Pierce, USA
Elektrophoresekammer SE 600
Hoefer, USA
Electrophoresis Power Supply EPS 601
Pharmacia, Freiburg
EnVision 2102 Multilabel Reader
PerkinElmer,
Rodgau-Jügesheim
Gelkammer GNA 200
Pharmacia, Freiburg
Hyperfilm ECL
Amersham, München
Immobilon-Membran
Millipore , Schwalbach
Kühlzentrifuge 5430
Eppendorf, WesselingBerzdorf
Laborzentrifuge 5415D
Eppendorf, WesselingBerzdorf
Laborzentrifuge J2-21
Beckman, Krefeld
Laborzentrifuge Biofuge 13
Heräus, Hanau
LKB Multiphor II (Blot)
Pharmacia, Freiburg
OptiPlate-384
PerkinElmer,
Rodgau-Jügesheim
Photometer GeneQuant
Pharmacia, Freiburg
Pipetten „eppendorf research“
Eppendorf, WesselingBerzdorf
Schüttelinkubator GFL 3031
GFL, Burgwedel
Schüttelinkubator Certotech MO
Sartorius AG, Göttingen
Thermomixer Comfort
Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf
2 Materialien und Methoden
19
Techne Genius (Thermocycler)
Techne, Burkhardtsdorf
Ultraturrax Homogenisator
Schütt, Göttingen
2 Materialien und Methoden
2.2
Methoden
2.2.1
Klonierung
20
2.2.1.1 Primer-Design
Die verwendeten Primer wurden mit dem Programm „Primer Express 1.5“ von Applied
Biosystems entworfen. Bei der Erstellung der verwendeten Primer waren verschiedene
Punkte zu beachten:
Zuerst müssen die relevanten Abschnitte der Aminosäurensequenz des zu klonierenden
Proteins durch den 5’- und den 3’-Primer abgedeckt werden (Tabelle 2).
Außerdem ist es für die direktionale Klonierung in den verwendeten Vektor notwendig,
am 5’-Ende CAAC einzufügen. Die Schmelztemperatur sollte bei 50-60°C liegen und
bei 3’- und 5’-Primer möglichst gleich sein, in der Regel werden Primer mit einer Länge
von 18-30 bp verwendet, durch Variation der Länge kann allerdings die
Schmelztemperatur verändert werden.
Am 3’-Ende des Primers sollten nicht drei aufeinander folgende gleiche Pyrimidinbasen
(Guanin oder Cytosin) liegen, ferner sollte dort nicht Thymidin codiert sein.
Im Fall der vorliegenden Primer ist eine ausgeprägte Haarnadelstruktur der Primer zu
beobachten. Das kann zu einer verminderten Amplifizierung der Targetsegmente in der
PCR führen, da die Primer statt an die Ziel-DNA zu binden, eine Sekundärstruktur
ausbilden. Da nicht alle Anforderungen gleichzeitig erfüllt werden können, wird ein
Kompromiss in der Sekundärstruktur des Primers gemacht.
Primer
Gαq - forward
Gαq - reverse
RGS3 - forward
RGS3 - reverse
Sequenz
5’- CAC CAT GAC TCT GGA GTC CA -3’
5’- TTA GAC ATT GTA CTC CTT CAG G -3’
5’- CAC CAT GAA GAA CAA GCT GG -3’
5’- CTA AAG CGG GGG ACT CAT C -3’
Tab. 2 : Primer für die Genamplifikation mittels PCR aus ss cDNA
2 Materialien und Methoden
21
2.2.1.2 Polymerasenkettenreaktion (PCR)
In der PCR werden die Gαq und RGS3 (Isoform 4) Genabschnitte aus single stranded
cDNA amplifiziert. Die für die Amplifizierung des Gαq verwendete cDNA stammt aus
der Tumorzelllinie U373, die mit Noradrenalin stimuliert wurde. Die für die
Amplifizierung des RGS3 verwendete cDNA wurde aus humanen Astrozyten isoliert.
Die semiquantitative PCR wird mit dem Techne Genius durchgeführt.
Material:
AccuPrimePFX Proofreading DNA Polymerase (Invitrogen, 2,5 U/µl)
10x Reaktionspuffer (Boehringer)
RGS3: ss cDNA aus humanen Astrozyten
Gαq:
ss cDNA aus Noradrenalin-stimulierten U373-Zellen
Primer: 1,5 µl (10µM in dH2O) (MWG Biotech AG, München)
Für den Reaktionsansatz werden 5 µl 10x Puffer mit 1,5 µl Forward-Primer (Sequenz)
und 1,5 µl Reverse-Primer, 0,4 µl Taq Polymerase (1U) und 15,6 µl dH2O in ein 0,5 ml
Eppendorf-Gefäß pipettiert, das Gemisch wird kurz zentrifugiert und dann in die
Techne PCR-Maschine überführt und amplifiziert. Zuerst wird bei 95°C in 60 sec die ss
cDNA denaturiert. Im Anschluss wird in 40 Zyklen die DNA zuerst bei 97°C für 15 sec
denaturiert, dann folgt für 30 sec bei 55°C die Anlagerung der Primer an das Template
und in den folgenden 40 sec wird bei 72°C der Basenstrang verlängert. Zum Schluss
folgt eine zehnminütige Phase bei 72°C, in der die Kettenextension beendet wird.
Die Sequenz der amplifizierten Fragmente ist in Abb. 6 dargestellt.
2 Materialien und Methoden
A.
B.
22
1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
tggcgtgctg
ggcagctccg
caggagagag
actctgatga
tgcaggccat
aggctcatgc
catatgtaga
gacgacgaga
tagctgaccc
cagggatcat
ggggccaaag
tgtttctagt
gaatggagga
cctcggttat
atctagtcga
aattcattct
acttcacgtg
ccatcctcca
gccctgccct
aacaatttgc
gtttgtagta
agtacagtcc
gtattttaaa
ctctttttct
ttcatacctc
cctgagcgag
cagggacaag
tggcaagagt
agataaaagg
gatcagagcc
acaattagtt
tgcaataaag
atatcaatta
tgcctacctg
cgaatacccc
gtcagagaga
agcgcttagt
aagcaaggct
tctgttctta
ctacttccca
gaagatgttc
cgccacagac
gttgaacctg
tccctggtgg
ataatactaa
aatattatga
cagcacattt
ttctcagtca
tttctatgga
cctcctgatg
gaggccaagg
cgggacgccc
acgtttatca
ggcttcacca
atggacacac
cgagaagttg
agtttatgga
tctgactcta
cctacgcaac
tttgacttac
agaaaatgga
gaatatgatc
ctctttagaa
aacaagaaag
gaatatgatg
gtggacctga
accgagaata
aaggagtaca
gctattgaag
tttattgccg
ttttatttaa
cctctctatc
tgcactcaca
gcaaaacaaa
tttttcccag
aagcccggcg
gccgggagct
agcagatgag
agctggtgta
tcaagatccc
atgtggagaa
atgatcctgg
ccaaatacta
aagatgtgct
aaagtgtcat
tacactgctt
aagttctcgt
caattatcac
atcttctaga
gaccccagag
acccagacag
tccgctttgt
atctggtcta
atacacaaga
tcctggactc
actattcaga
ttttttttag
aagataagac
gctgatttcc
gttacaatgg
gatcaacgac
caagctgctg
aatcatccat
tcagaacatc
atacaagtat
ggtgtctgct
aatccaggaa
tcttaatgac
tagagttcga
tttcagaatg
tgaaaatgtc
ggagtcagac
atacccctgg
ggagaaaatc
agatgcccag
tgacaaaatt
ctttgctgcc
attgtgcctc
gggactgtat
tgtgtgagcg
ggaaaaacag
gcaaaacctt
ttgtttcttt
cttttttctt
cctttatcct
gagatcgagc
ctgctcggga
gggtcaggat
ttcacggcca
gagcacaata
tttgagaatc
tgctatgata
ttggaccgcg
gtccccacca
gtcgatgtag
acctctatca
aatgagaacc
ttccagaact
atgtattccc
gcagcccgag
atctactccc
gtcaaggaca
ctagacaccc
ttctgtggaa
tgtccacaga
aggatgctga
gtgactcagt
ctgtctctct
cccccgctaa
agttccattc
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
ggatggacgc
cacaggggac
gcggggtggg
catctcggat
tccagcctct
agctggggat
acaaaatgat
tggagaagct
agttcagtga
cacagtccaa
catgcaagga
gcgtcacgcg
actcgtaccc
tgagtccccc
gtcccctgcc
gctgtgtctc
aggctactgg
ggcccaagac
tgctgcggag
gcaggaggtc
agacccccac
gtaataggaa
tgccttggga
tcgtcccggg
ctgcagtctg
ttgggaaagc
ctgtgttatt
ctctcccccg
ccacagccta
cagaaggacg
gaaagtgctt
ctccagagtg
cttcagacgg
gaagtcattc
gctggttcac
ggagaatctg
gatggcatcc
ggtcaacctg
gggctgcttc
tcgctttctc
gctttagggg
cacctgcctc
tggacagacg
aggagtagaa
cctggcaggt
accgcggagg
caggcctggg
tttgagtttt
acccttgcct
gaagctgcca
caccggtggc
gctacacaca
atggcaccct
tcttgttctt
gagcagcact
tgcgtgtgag
ggctggccca
tgagaaacca
gcggtggccg
cggaatgagt
aagcccacct
aaatacgggt
gagttctggt
aaggccaaga
gactcctaca
gacctggcac
cgttctgacc
ccactggagt
cctgccccct
gatagacata
ggatgggccc
caggggccct
cttcgcgttg
ctctcgggcc
atttatttaa
catcagtttt
tgcaaaggtg
aggcagctgg
gagatctggc
cagaccacac
ga
ttggggccag
catgtaaccc
ggaccctctt
cagagttttc
gctagacagg
cccctggagc
cagaggaagc
tagcagtgtt
tggcttgtga
agatctttgc
cgcgggagca
agaagcgcat
tctacctgga
cgagctcagc
gtgacggagg
cggaagcgag
cgtggggtcc
ggccaagcca
accaagttcc
ctcctagagg
atagtagttg
cctgatttac
gacaccattc
ccttctggac
accccctggg
agtagccaag
cttgggccct
gggagccagc
ctttgagaca
tgtttaatgg
agccaaggac
ccctcccgcg
cctcaagtgg
ccaagccttc
ggacttcaag
tgaatacatc
caccaaggac
cttcgggctc
ccttattaac
gttcacacca
gggcaagcaa
gcctggacca
ccactgcccc
gatctggagc
ttaaagaact
gccattggag
gatgcttggc
aagtgcaata
tccagcttca
taaggcagcc
tggagtgtcc
ttctggagca
ggggatgagc
tgggcccctc
tcccggactc
aagaaagaaa
atgaagaaca
ggcaaggcag
ggcgagtcct
cttcgcactg
aaggtcaagt
gcgatccagg
aacctgcaga
atggaaaagg
cagaagaaga
ggcgggctgg
gcccccagag
agagaggccc
ggtacgaggg
tgctgctccc
ggctgatggg
cttgcagctc
acgtcgtcct
ttttagccaa
ggggatatgc
tggggggaca
ctcgggggct
aataaaaggc
Abb. 6: DNA-Sequenz der klonierten Proteine
A. Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide (GNAQ), mRNA
Gi: 40254461
B. Homo sapiens regulator of G-protein signalling 3 (RGS3), transcript variant 4, mRNA
Gi: 19913391
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
Markiert sind die Proteinsequenzen, die Primerangriffsstellen sind fettgedruckt.
2 Materialien und Methoden
23
2.2.1.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die amplifizierten Gensequenzen werden in einer Agarose-Gelelektrophorese getrennt,
identifiziert und anschließend aufgereinigt.
10 µl der PCR-Produkte werden auf ein 1%-iges horizontales Agarosegel, das mit
Ethidiumbromid gefärbt wird, aufgetragen. Als Gel- und Laufpuffer wird 1x TBE
verwendet. Als Größenstandard wird die 100 Base-Pair Leiter aufgetragen.
Die Gele werden im UV-Licht mit dem BioDoc Analyze bei 254 nm betrachtet,
fotografiert und digital gespeichert.
Die nun auf dem Gel aufgetragenen Proben werden nach Beendigung der
Elektrophorese mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) wieder extrahiert.
2.2.1.4 Topoisomerase-Reaktion
Um eine besonders effektive Klonierung zu erreichen, wird das „Gateway-System“ von
Invitrogen
verwendet,
welches
statt
einer
Ligase
zur
Rekombination
eine
Topoisomerase einsetzt.
DNA-Topoisomerasen sind in allen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zu
finden.
Sie sind bei Reaktionen beteiligt, in denen die räumliche Struktur der DNA verändert
wird. Eine Topoisomerase-Reaktion hat mehrere Schritte:
Zuerst bindet das Enzym an die DNA, so wird eine Phosphatbrücke zwischen einer
Tyrosin-Seitenkette des Enzyms und der hierbei gespalteten Phosphordiesterkette der
DNA gebildet. Durch diese Bindung bildet sich eine Lücke in der DNA, hier kann nun
der DNA-Strang gedreht oder ein intakter DNA-Strang eingebracht werden.
Zum Schluss löst sich die Enzym-DNA-Bindung und die Phosphordiesterkette der DNA
bildet sich zurück.
Für diese Reaktion wird keine externe Energie benötigt, weil die Energie auch in der
Tyrosin-Phosphat-Brücke erhalten bleibt.
Man
unterscheidet
zwei
Gruppen
von
DNA-Topoisomerasen:
Typ-I-DNA-
Topoisomerasen spalten nur einen der beiden DNA-Stränge, durch Typ-II-DNA-
2 Materialien und Methoden
24
Topoisomerasen werden beide Stränge gespalten und ein intakter Doppelstrang in die
Lücke eingeführt.
Bei den durchgeführten Vektorreaktionen handelt es sich demzufolge um Typ-II-DNATopoisomerasen, denn es werden die klonierten Gene in den Vektor eingebracht.
Dabei ist zu beachten, dass die PCR-Produkte „blunt end“ repliziert werden müssen,
dazu muß in der PCR eine Proofreading Taq-Polymerase verwendet werden, hier die
Taq Proofreading Polymerase AccuPrime PFX der Firma Invitrogen.
In der Topoisomerasereaktion werden Vektor und PCR-Produkt in einem Verhältnis
von 1:1 gemischt. 1 µl TOPO-Vektor (2580 bp) hat ein Gewicht von etwa 17,5 ng, dazu
werden die in 4 µl dH2O gelösten PCR-Produkte pipettiert.
Das PCR-Produkt von RGS3 hat eine Länge von 506 bp, also müssen entsprechend 3,4
ng in 4 µl dH2O gelöst sein, bei Gαq mit einer Länge von 1079 bp 7,3 ng in 4 µl dH2O.
Reaktionsansatz: 4 µl dH20, darin gelöst PCR-Produkt
1 µl Salt Solution
1 µl TOPO – Vektor
Zur Transformation der kompetenten E. coli werden 2 µl des Reaktionsproduktes zu den
Zellen gegeben und nach Herstelleranleitung fortgefahren.
Im Anschluss werden die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten, die mit 50 µg
Kanamycin/ml versetzt werden, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die gewachsenen Kolonien werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin/ml)
überführt und 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
2.2.1.5 Plasmidaufreinigung
Je 1,5 ml der Kulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach
Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit
überprüft.
Um die Größe der eluierten cDNA zu überprüfen, müssen die Plasmide geschnitten
werden. Dazu verwendet man Restriktionsenzyme, die den Vektor 5’ und 3’ des Inserts
schneiden.
2 Materialien und Methoden
25
Dabei ist zu beachten, dass das verwendete Restriktionsenzym den Vektor nur einmal
schneiden sollte und außerdem nicht in das Insert schneidet. Das kann mit dem „NEB
Cutter“ unter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php geprüft werden.
Hier wurden Eco RV, das bei 818 bp, und Not I, das bei der Vektorposition 673 bp
schneidet, gewählt.
So ist das ausgeschnittene Insert schließlich um 144 bp der Vektor-DNA länger als die
eigentlich eingefügte Sequenz, also 1223 bp bei Gαq und 653 bp bei RGS3.
Die Plasmide werden für eine Stunde bei 37°C mit den Restriktionsenzymen inkubiert.
Um sicherzustellen, dass ein großer Teil der Plasmide geschnitten wird, wird das
Enzym in hoher Konzentration eingesetzt.
Reaktionsansatz: 50 µl DNA (~10ng/µl)
6 µl 10x Puffer (Roche)
2 µl Not I in Verdünnung
2 µl Eco RV in Verdünnung
1 µl Not I bzw. 1 µl Eco RV enthält 10 U, 1 µl reagiert also mit 10 µg DNA pro Stunde.
Anschließend werden die Eluate komplett auf ein Agarosegel aufgetragen und
elektrophoretisch getrennt.
Die E. coli - Kolonien mit den erwarteten Resultaten werden in 50 ml LB-Medium (50
µg Kanamycin/ml) überimpft und für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm bebrütet.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung
aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit überprüft und auf ein
Agarosegel aufgetragen, um zu verifizieren, dass es sich um die erwarteten Produkte
handelt.
Zur Absicherung des Ergebnisses wird die rekombinante DNA zusätzlich durch Herrn
Dr. Igloi, Institut für Biologie III der Albert-Ludwig-Universtät Freiburg, sequenziert.
2 Materialien und Methoden
26
2.2.1.6 LR-Reaktion zwischen Entryvektor und Destinationsvektor
In der LR-Reaktion werden die zu klonierenden Sequenzen aus dem Entryvektor in den
Destinationsvektor geschleust. LR ist die firmeneigene Abkürzung für „Left-Right“, es
werden nur die einander entsprechenden „Attachment Sites“ der Entry- bzw.
Destinationsvektoren miteinander verknüpft.
Durch die Verwendung zweier Vektoren im Rahmen des „Gateway-Systems“ ist es
möglich, auszuwählen, in welchem Zellsystem man das Zielprotein exprimieren
möchte. So gibt es beispielsweise Vektoren für E. coli, Hefe, humane Zellen oder auch
für Insektenzellen. Weiterhin ermöglicht der Destinationsvektor den Einbau einer
zusätzlichen Sequenz, eines so genannten „Tags“, an das Protein. Dadurch wird
nachfolgend die Aufreinigung des Proteins erleichtert und weitere Verwendungszwecke
ermöglicht (Abb. 7).
Abb. 7: Gateway-Klonierungssystem
Quelle: Invitrogen
2 Materialien und Methoden
27
Das RGS3-Molekül wird in den pDEST 15 – Vektor (Invitrogen) eingefügt, hier wird
dem Molekül ein N-terminaler GST-Tag angehängt, der später für die Konzeptionierung
des Alpha-Screen-Assays notwendig ist, aber auch für die Aufreinigung von Vorteil ist.
Gαq wird in den pET104 BioEase (Invitrogen) eingebracht und erhält so einen
N-terminalen Biotin-Tag, der für die spätere Verwendung im Alpha-Screen-Assay
benötigt wird, aber auch zur Aufreinigung dient.
Für die Reaktion werden 1 µl des Destinationsvektors mit 100 ng des Entryvektors
versetzt und mit TE Puffer, pH 8, auf 8 µl aufgefüllt.
Dazu werden 2 µl LR ClonaseII Enzyme Mix pipettiert und die Lösung für eine Stunde
bei 25°C inkubiert. Im Anschluß wird 1 µl Proteinase K hinzugefügt und das Gemisch
für 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Für
die
Transformation
der
kompetenten
E.coli-Zellen
wird
1
µl
des
Reaktionsgemisches in 1 Tube OneShot-E.coli (Invitrogen) überführt. Die Tubes
werden für 30 Minuten auf Eis gelagert und dann für 30 Sekunden bei 42°C einem
Hitzeschock ausgesetzt. Nun werden 250 µl SOC-Medium (2 % (w/v) Trypton, 0,5 %
(w/v) Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose) zu
den Bakterienzellen gegeben und die Kulturen für eine Stunde bei 37°C und 300 rpm
inkubiert.
Im Anschluss wird das Nährmedium in Volumina von 10 µl, 100 µl und 130 µl auf LBAgarplatten (50 µg Carbacillin/ml) ausgestrichen und bei 37°C für 18 Stunden
inkubiert.
Die einzeln gewachsenen Kulturen werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg
Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm für 14 Stunden inkubiert.
LB-Medium:
0,1 % (w/v) NaCl
0,1 % (w/v) Bactotrypton
0,05 % (w/v) Yeast Extract
LB-Agar:
0,1 % (w/v) NaCl
0,1 % (w/v) Bactotrypton
0,05 % (w/v) Yeast Extract
1,5 % (w/v) Bacto Agar
Nach dem Autoklavieren wird dem Medium ein Antibiotikum zugesetzt.
2 Materialien und Methoden
28
Je 1,5 ml der Bakterienkulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach
Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit
überprüft. Um die Größe der klonierten Sequenz zu kontrollieren, werden die Plasmide
mit Restriktionsenzymen (Roche) versetzt.
Für den Verdau des pDEST15 (5309 bp nach LR-Reaktion) werden Sfu I und Cel II
verwendet. Das Insert hat eine Länge von 546 bp und wird zwischen bp 792 und bp
2496 eingefügt. Sfu I schneidet den Vektor bei bp 503, Cel II bei bp 2546, der
geschnittene Vektor hat also Teilstücke von 885 bp und 4424 bp Länge.
Der Vektor pET104 (6911 bp nach LR-Reaktion) wird mit den Restriktionsenzymen
Sph I, das bei bp 1 schneidet, und Cel II, das bei 2352 bp schneidet, versetzt. Das Insert
selbst hat eine Länge von 1119 bp und liegt zwischen den bp 597 und 2280. Die
Fragmente haben also eine Länge von 1788 bp und 5123 bp.
Für den Verdau werden je 10 U des Restriktionsenzyms mit 10xPuffer und 500 ng DNA
versetzt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach werden die Proben auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch
getrennt. Als Marker wird die peqGOLD High Range DNA-Leiter verwendet.
Von den positiv geprüften Proben werden Kulturen mit 50 ml LB-Medium (50 µg
Carbacillin/ml) angesetzt, diese werden für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung
aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit geprüft. Auch diese
Proben werden zur Überprüfung mit den Restriktionsenzymen versetzt und
anschließend elektrophoretisch getrennt.
2 Materialien und Methoden
2.2.2
29
Proteinaufbereitung
In weiteren Schritten werden nun die exprimierten Proteine (Abb. 8) auf ihre Identität
getestet und quantifiziert. In Folge werden die Proteine aufgereinigt.
A.
1
61
121
181
241
301
B.
1 mknklgifrr rnespgappa gkadkmmksf kptseealkw geslekllvh kyglavfqaf
61 lrtefseenl efwlacedfk kvksqskmas kakkifaeyi aiqackevnl dsytrehtkd
121 nlqsvtrgcf dlaqkrifgl mekdsyprfl rsdlyldlin qkkmsppl
mtlesimacc
iihgsgysde
vsafenpyvd
rvrvpttgii
esdnenrmee
daqaarefil
lseeakearr
dkrgftklvy
aikslwndpg
eypfdlqsvi
skalfrtiit
kmfvdlnpds
indeierqlr
qniftamqam
iqecydrrre
frmvdvggqr
ypwfqnssvi
dkiiyshftc
rdkrdarrel
iramdtlkip
yqlsdstkyy
serrkwihcf
lflnkkdlle
atdtenirfv
kllllgtges
ykyehnkaha
lndldrvadp
envtsimflv
ekimyshlvd
faavkdtilq
gkstfikqmr
qlvrevdvek
aylptqqdvl
alseydqvlv
yfpeydgpqr
lnlkeynlv
Abb. 8: Sequenz der klonierten Proteine
A. guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide [Homo sapiens]
Gi: 40254462
B. regulator of G-protein signalling 3 isoform 4 [Homo sapiens]
Gi: 19913392
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2 Materialien und Methoden
30
2.2.2.1 Proteinexpression
Für die Proteinexpression (Proteinsequenzen siehe Abb. 8, allerdings ohne Tags)
werden BL21Star-Zellen, einem speziellen Stamm zur Proteinexpression (Invitrogen),
auf Eis aufgetaut und mit der in Wasser gelösten DNA gemischt. 4 ng der Gαq-DNA
werden in 2 µl dH2O gelöst, ebenso 4,5 ng der RGS3-DNA. Die Zellen werden für 30
Minuten auf Eis gelagert, dann folgt für 30 Sekunden ein Hitzeschock bei 42°C mit
anschließender Lagerung auf Eis. Nun werden 250 µl SOC-Medium hinzugefügt und
für eine Stunde bei 37°C und 225 rpm inkubiert. Schließlich werden 10 ml LB-Medium
(50 µg Carbacillin/ml) hinzugefügt und bei 37°C und 225 rpm für 12 Stunden inkubiert.
500 µl der Kulturlösung werden in 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt
und bei 37°C und 225 rpm inkubiert, bis die photometrisch gemessene OD600 0,5-0,8
beträgt.
Nun wird die 10 ml Kultur in zwei Kulturen à 5 ml geteilt, eine dieser Kulturen wird
mit 25 µl 200 mM IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM IPTG gebracht. Das ist
notwendig, weil das zur Rekombination gewünschte Gen sich auf einem Plasmid
befindet, womit die Bakterien transformiert werden. Zur Aktivierung und Translation
dieses Gens in ein Protein muß ein Operon aktiv sein. IPTG wird verwendet, um das
Lactose-Operon zu aktivieren. Da Gαq biotinyliert wird, wird den E.coli–Bakterien
zusätzlich Biotin in einer 2 µM Endkonzentration zur Verfügung gestellt. Zum
Startzeitpunkt und danach stündlich für 6 Stunden wird von jeder Kultur eine 500 µl
Probe genommen, das Medium abzentrifugiert und das Bakterienpellet in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -20°C gelagert.
2.2.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot)
Bei dieser Methode werden Proteine elektrophoretisch getrennt und dauerhaft auf einer
Membran fixiert. Die nach Gewicht getrennten Proteine können so durch spezifische
Antikörperreaktionen nachgewiesen und zudem die Größe und relative Menge der
Proteine bestimmt werden.
Die Bakterienpellets werden in 96 µl dH2O und 24 µl 5x Loading Buffer gelöst, 5
Minuten bei 95°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren, und dann auf ein 12%-iges
2 Materialien und Methoden
31
SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Page-Gel) aufgetragen. SDS (Sodiumdodecylsulfat) löst
die Proteine und gibt ihnen eine negative Ladung, sodass die elektrophoretische
Auftrennung nur aufgrund der Proteingröße erfolgt. Als Größenreferenz wird der High
Range Rainbow Molecular Weight Marker verwendet.
Zuerst wandern die Proteine bei einer Spannung von 40 Volt 10 Minuten im Sammelgel
in Richtung Anode, danach erfolgt die Auftrennung im Trenngel bei 80 Volt für 50
Minuten.
Im Anschluss erfolgt der elektrophoretische Transfer der Proteine auf eine
proteinbindende Membran. Durch Anlegen eines Stroms von 65 mA werden die
Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylfluoridmembran (Immobilon-Membran,
Millipore) übertragen und dort hydrophob gebunden.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden nun durch eine einstündige
Inkubation mit Roti-Block (Roth) abgesättigt.
Die überschüssige Roti-Block-Lösung wird für 15 Minuten mit TBST (20 mM Tris-Cl,
pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% Tween-20) abgewaschen, danach wird die Membran für
zwei Stunden mit dem primären Antikörper inkubiert.
In drei weiteren fünfzehnminütigen Waschschritten mit TBST wird Antikörper, der
nicht an Antigen gebunden hat, entfernt. Nun wird die Membran für eine Stunde mit
dem sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG, HRP-konjugiert, Qiagen) inkubiert.
Dieser Antikörper bindet an den Fc-Teil des primären Antikörpers und ist zur Detektion
an das Enzym Horseradishperoxydase gekoppelt.
Anschließend erfolgen wieder drei fünfzehnminütige Waschschritte mit TBST, um den
überschüssigen Sekundärantikörper zu entfernen.
Für die Detektion erfolgt eine einminütige Inkubation der Membran mit der
Visualisierungslösung, um eine Chemilumineszenzreaktion, die auf Röntgenfilm
sichtbar ist, hervorzurufen. Der Röntgenfilm wird in einer Dunkelkammer entwickelt
und anschließend ausgewertet.
Bei der Auswahl der spezifischen (primären) Antikörper werden zwei Aspekte
berücksichtigt:
Zum einen wird das Protein mit einem spezifischen Antikörper detektiert, zum anderen
wird ein Antikörper eingesetzt, der gegen den Tag gerichtet ist.
Für die Detektion von Gαq werden somit zwei unterschiedliche Systeme verwendet.
Ein Antikörper (Anti-Gαq, Kaninchen, Gramsch) ist gegen das Protein selber gerichtet,
2 Materialien und Methoden
32
im anderen System bindet der Antikörper (Strep-AP-Konjugat, Invitrogen) an den
Biotin-Tag des klonierten Proteins. Dieser Biotinantikörper kann statt mit einer
Chemilumineszenzreaktion auch mit einer Farbreaktion (Western Blue Stabilized
Substrate for Alkaline Phosphate) detektiert werden.
RGS3 wird ebenfalls mit einem proteinspezifischen Antikörper (RGS3 AS 1-300, Santa
Cruz) und auch mit einem GST-Tag-spezifischen Antikörper (Anti-GST-Tag, Mouse,
Santa Cruz) detektiert. Dieser kann mit einer Farbreaktion (TMP Stabilized Substrate
for HRP, Promega) oder durch Chemilumineszenz auf einem Film (Hyperfilm ECL,
Amersham) sichtbar gemacht werden.
2.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode
Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem BCA Protein Assay (Pierce) wird
die
Proteinkonzentration
einer
Lösung
durch
Vergleich
mit
bekannten
Standardverdünnungen von BSA (Bovine Serum Albumin) bestimmt. Die Proben
werden mit einer Mischung aus Reagenz A und B (Pierce) vermischt und bei 37°C für
30 Minuten inkubiert. Eine Farbreaktion findet statt, wenn das Cu2+-Reagenz mit der
Peptidbindung und Cu+ mit Bicinchoninat reagiert. Die Lösungen werden bei 630 nm
auf ihre optische Dichte getestet und so die Proteinkonzentration ermittelt.
Dieser Test hat eine Sensitivität von 20-2000 µg/ml.
2.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Da das Glutathion aus dem Elutionspuffer mit der Proteinmessung im BCA-Assay
interferieren kann, ist es notwendig, auf ein anderes Quantifizierungssystem
auszuweichen. Hier eignet sich die Proteinbestimmung nach Bradford.
Bei dieser kolorimetrischen Methode wird der Farbstoff Coomassie-Brilliantblau G250
verwendet, der an aromatische und basische Aminosäurereste bindet. Die Standardkurve
wird mit linear ansteigenden Konzentrationen von BSA erstellt.
2 Materialien und Methoden
33
5 Minuten nach Zugabe des Farbstoffes wird die Absorption bei einer Wellenlänge von
595 nm gemessen und die Proteinkonzentration der Probe berechnet. Die
Detektionsgrenze dieses Tests liegt bei 1µg Protein /ml.
2.2.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit
Quantity One (Firma Bio-Rad)
Nach der Dialyse lag die Proteinkonzentration der aufgereinigten Proteinprobe
unterhalb
des
Detektionsbereichs
der
o.g.
Bestimmungsmethoden.
Um
die
Konzentration des Proteins abschätzen zu können, wurde ein SDS-Page Gel der
Proteinprobe angefertigt, mit Coomassie-Blau angefärbt und im Anschluss entfärbt.
Parallel wurden Proben mit definierter BSA-Konzentration aufgetragen. In dem
verwendeten Computerprogramm wird die Bandenstärke der gesuchten Probe mit der
Bandenstärke der bekannten Proteinkonzentration an BSA verglichen und anschließend
kann so rechnerisch die Konzentration des aufgereinigten Proteins ermittelt werden.
2.2.2.6 Proteinfärbung mit Coomassie-Blau
Mit dieser Färbetechnik werden Proteine quantitativ nachgewiesen. Der Farbstoff
Coomassie Brilliant Blau bindet unspezifisch an die meisten Proteine. Dadurch bleiben
nach Anfärbung und anschließender Entfärbung der Gelmatrix die Proteine im Gel als
blaue Banden sichtbar. Die Detektionsgrenze der Coomassie-Blau-Färbung liegt bei 50100 ng Protein pro Bande.
Die Anfärbung erfolgt in 60 Minuten mit einer Lösung, die aus 40% Ethanol, 10%
Essigsäure, 50% Wasser und 0,05% Coomassie Brilliant Blau besteht. Anschließend
wird für 60 Minuten mit einer Lösung aus 40% Ethanol, 10% Essigsäure und 50%
Wasser entfärbt.
Das Gel wird zwischen Zellophanpapier getrocknet.
2 Materialien und Methoden
34
2.2.2.7 Proteinfärbung mit Silberfärbung
Die Silberfärbung ist eine weitere sehr sensitive Möglichkeit, Proteine nachzuweisen.
Hier bindet sich Silbernitrat unspezifisch an die Proteine und lässt so die Banden
sichtbar werden.
Die Detektionsgrenze liegt bei dieser Methodik bei 1-10 ng Protein pro Bande.
Zur Färbung wird das Roti-Black P Kit (Roth) verwendet und nach Herstelleranleitung
vorgegangen.
2.2.2.8 Lösung und Rückfaltung der Proteine
Für die nachfolgenden Experimente ist es unabdingbar, dass die Proteine aktiv sind.
Allerdings liegen überexprimierte Proteine in vielen Fällen in Form unlöslicher
Aggregate, sogenannter „Inclusion Bodies“, vor, weil sich das Bakterium vor dem
Protein durch dessen Abkapselung schützt. So müssen die Proteine mit denaturierenden
Reagenzien extrahiert werden. Deshalb muss nach der Extraktion eine Rückfaltung des
Proteins
in
seine
native
Form
durchgeführt
werden.
Ein
etabliertes
Rückfaltungsverfahren ist die „Pulsrenaturierung“ nach Rudolph (RUDOLPH et al.
1996). Hier wird das Bakterienpellet erst in PBS, 10µg/ml Lysozym, gelöst. Diese
Lösung wird dreimal für 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt und in einem
anschließenden Zentrifugationsschritt werden bei 40000g für 40 Minuten die löslichen
Bestandteile von den unlöslichen getrennt. Die unlöslichen Anteile befinden sich im
Pellet, der Überstand wird verworfen.
Das Pellet wird in 6 M Guanidinhydrochlorid (GdmCl), 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH
8,0 (4ml/g Pellet) mit Hilfe eines Ultraturrax Homogenisators für 1 min bei Stufe 8
resuspendiert. Die Lösung wird anschließend bei Raumtemperatur für mindestens zwei
Stunden gerührt und dann bei 40000g für 40 Minuten zentrifugiert. Die Proteine
befinden sich nun im Überstand.
Dieser wird gegen ein hundertfaches Volumen von 6 M GdmCl, 50 mM Tris, 2 mM
EDTA, pH 3,0 bei 4°C dialysiert. Das ist notwendig, um das bei der Renaturierung
unerwünschte DTT des Solubilisierungspuffers zu entfernen. Der niedrige pH-Wert
2 Materialien und Methoden
35
bewirkt die Protonierung der Sulfhydrylgruppen, so wird eine Oxidation der
Cysteinseitenketten und die Bildung von Disulfidbrücken verhindert.
Nachfolgend wird die Proteinkonzentration der Einschlusskörper bestimmt.
Die
eigentliche
Proteinrenaturierung
wird
bei
4°C
mit
der
Methode
der
„Pulsrenaturierung“ durchgeführt. Dazu wird zu einem Rückfaltungspuffer (1 M
Arginin, 50 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, 1 mM oxidiertes Glutathion, 10 mM
reduziertes
Glutathion)
in
Abständen
von
einer
Stunde
jeweils
eine
Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml Puffer hinzugefügt. Das ermöglicht die Einstellung
eines Gleichgewichts und verringert eine Aggregation noch nicht vollständig
zurückgefalteter Proteine.
Nach Zufügen des letzten Pulses wird die Lösung für weitere 12-14 Stunden bei 4°C
gehalten und im Anschluss zweimal gegen 50 Volumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300mM
NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol dialysiert.
Die Proteinkonzentration wird mit der BCA-Proteinbestimmung gemessen und mittels
eines Western Blots die Anwesenheit einer bekannten Menge Kontrollprotein
quantifiziert.
2.2.2.9 Aufreinigung der Proteine
Die gelösten Proteine werden chromatographisch bei 4°C aufgereinigt. Zur
Aufreinigung des Gαq wird die ÄKTA design Pumpe von Amersham Pharmacia Biotech
verwendet und nach Anleitung des Herstellers vorgegangen.
2.2.3
Affinitätschromatographie
Das Prinzip der Affinitätschromatographie beruht auf der reversiblen Bindung von
Proteinen an einen spezifischen Liganden, der an eine Matrix gekoppelt ist. Durch diese
selektive Bindung kann das Zielprotein aus einer Lösung, die verschiedene Proteine
enthält, isoliert und konzentriert werden.
Die Interaktion zwischen Ligand und Zielmolekül resultiert aus elektrostatischen oder
hydrophoben Wechselwirkungen, van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken. Zur
2 Materialien und Methoden
36
Elution des Zielproteins können diese Bindungen durch einen kompetetiven Liganden,
die Änderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen oder der Polarität gebrochen
werden.
So genannte Tags ermöglichen die schnelle Aufreinigung der Proteine in einem Schritt
mittels Affinitätschromatographie. Hierzu werden mit der Hilfe von speziellen
Destinationsvektoren gezielt Aminosäureketten an das exprimierte Protein angehängt.
RGS3 wird an einen GST-Tag gekoppelt. So wird das kleine RGS-Protein (~19 kDa)
mit einem großen Tag (~28 kDa) kombiniert. GST (Glutathion S-Transferase) ist der
am zweithäufigsten verwendete Tag. Es ist zudem bekannt, dass ein GST-Tag die
Ausbeute und Löslichkeit des Proteins erhöhen kann. Die Aufreinigung erfolgt über
Glutathion Sepharose.
Ursprünglich war geplant, Gαq an einen His-Tag zu koppeln, da jedoch die
Nickelbrücke eventuell mit einigen der zu testenden Wirkstoffen in Wechselwirkung
treten könnte, fiel die Entscheidung für Gαq auf einen Biotin-Tag.
2.2.3.1 Aufreinigung des Gαq
Biotinylierte Proteine binden an Streptavidin, allerdings ist die Bindung zwischen
diesen Substanzen sehr stark. Die Dissoziationskonstante (Kd) des Avidin-BiotinKomplexes beträgt pro Untereinheit 0,6x10-15 M, die des Streptavidin-BiotinKomplexes 4x10-14 M. Diese Komplexe sind sehr stabil gegenüber denaturierenden
Reagenzien, Detergentien, Proteolyse und einem breiten pH-Wert. Somit können die
gebundenen biotinylierten Proteine nur unter äußerst stringenten Bedingungen, die das
Zielprotein im Allgemeinen inaktivieren, eluiert werden. Um diese Problematik zu
umgehen, verwendet man monomeres Avidin statt der tetrameren Form des
Streptavidins. Durch die Dissoziation des Avidintetramers zum Avidinmonomer kommt
es zu einer Konformationsänderung in der Untereinheit und die Kd für Biotin steigt auf
10-7M, die hohe Bindungspezifität für Biotin bleibt dabei erhalten. So wird eine Elution
des gebundenen biotinylierten Proteins unter milden Konditionen ermöglicht.
Allerdings weisen auch diese Formen Nachteile auf, denn monomeres Avidin tendiert
dazu, sich zu hochaffinen Tetrameren zusammenzuschließen (GREEN et al. 1973).
2 Materialien und Methoden
37
Vor Verwendung der monomeren Avidinsäule (Soft Link Soft Release Avidin Resin,
Promega) wird diese mit 0,1 M NaPO4 equilibriert und nichtreversible Bindungsstellen
mit
2
Säulenvolumen
5
mM
Biotin
in
NaPO4-Lösung
mit
einer
Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde abgesättigt. Nach einer Wartezeit von 15
Minuten wird die Säule regeneriert, indem sie zuerst mit 8 Säulenvolumen 10%iger
Essigsäure und dann mit 8 Säulenvolumen 100mM NaPO4 (pH 7,0) gewaschen wird.
Der Durchlauf soll einen pH von mindestens 6,8 haben. Nun folgt eine Wartezeit von
30 Minuten, in der sich das Avidin rückfalten kann. Abschließend wird die Säule mit 5
Säulenvolumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol
equilibriert.
Nun kann die Probe mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde auf die Säule
gegeben werden. Hierbei bindet das biotinylierte Protein an die Matrix.
Schließlich kann das biotinylierte Protein mit 5 mM Biotin-Lösung von der Säule
verdrängt werden. Das Eluat wird mittels BCA-Proteinbestimmung auf seinen
Proteingehalt getestet und im Western Blot die Anwesenheit von Gαq geprüft.
2.2.3.2 Aufreinigung des RGS3
Die Aufreinigung des an einen GST-Tag gekoppelten RGS3 erfolgt mit Glutathion
Sepharose 4B (Amersham). Die Beads (200 µl pro Liter E. coli – Kultur) werden
zweimal mit jeweils 1 ml PBS gewaschen und bei 14000 rpm bei 4°C abzentrifugiert.
Dann werden sie zu der mittels Pulsrenaturierung rückgefaltetem Proteinlösung gegeben
und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. In dieser Zeit bindet das GST-RGS3
an die Sepharosebeads. Im Anschluss werden die Beads bei 400 rpm bei 4°C
sedimentiert und wiederum zweimal mit je 1 ml PBS und zweimal mit je 1 ml
Salzpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Elution des
gebundenen Proteins erfolgt durch zehnminütige Inkubation mit dem Elutionspuffer (10
mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Die Elution wird insgesamt
dreimal durchgeführt und im Anschluss die Eluatsfraktionen im Bradford-Proteinassay
auf ihren Proteingehalt überprüft.
Zusätzlich wird mittels eines Western Blots auch noch die Identität der aufgereinigten
Proteine kontrolliert.
2 Materialien und Methoden
2.2.4
38
AlphaScreen-Assay
Der AlphaScreen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) ist ein
nichtradioaktiver Bioassay, der auf der Basis so genannter Beads funktioniert und mit
dem sich biomolekulare Interaktionen im Mikroplattenformat untersuchen lassen (Abb.
9).
Ursprünglich wurde der AlphaScreen unter dem Namen LOCI (Luminescent Oxygen
Channeling Immunoassay) von Dade Behring, Inc. in Deutschland entwickelt,
PerkinElmer Life and Analytical Sciences hat den Assay 1999 für den
pharmazeutischen Markt etabliert.
Die AlphaScreen Beads sind Kügelchen von neutraler Dichte und einem Durchmesser
von etwa 200 nm. Sie sind mit einem Dextranhydrogel überzogen, das unspezifische
Bindungen und Aggregation minimiert. In jedem Testsystem sind zwei verschiedene
Beads enthalten. Diese Beads sind mit reaktiven Aldehydgruppen ausgestattet, so
können sie Proteine, Peptide oder Aminosäuren binden. Donor Beads sind gewöhnlich
mit Streptavidin überzogen, Akzeptorbeads sind an Antikörper, Protein A oder
Metallchelate gebunden. Die Donorbeads enthalten einen Photosensibilisator,
Phthalocyanin, der, wenn er mit Licht der Wellenlänge 680 nm angeregt wird,
umgebenden Sauerstoff in eine angeregte Form eines O2, ein Singlet-Sauerstoff,
wandelt (Abb. 9). Die Acceptorbeads enthalten Thioxenderivate, die mit SingletSauerstoff reagieren und Licht der Wellenlängen 520-620 nm emittieren. In den für
gewöhnlich verwendeten Puffern hat Singlet- Sauerstoff eine Halbwertszeit von 4 µsec
und kann sich in freier Lösung etwa 200 µm vom Donorbead entfernen. Ist nun ein
Akzeptorbead in Reichweite, wird die Energie des Singlet- Sauerstoff durch eine
chemische Reaktion auf das Akzeptorbead übertragen und durch nachfolgenden Zerfall
Licht (Chemilumineszenz) emittiert. Sollte kein Acceptorbead erreicht werden, zerfällt
das Singlet- Sauerstoff ohne Lichtsignal (Abb. 9B).
Dieser auf Distanz der Reaktionspartner basierende Energietransfer ist die Grundlage
für die Messung der Interaktion zweier Biomoleküle.
Zwei Reaktionspartner werden an Donor- und Akzeptorbead gekoppelt. Das
Bindungsverhalten dieser zwei Moleküle kann nun anhand der Größe des Lichtsignals
interpretiert werden (Abb. 9C).
2 Materialien und Methoden
39
In der AlphaScreen Technologie ist zusätzlich ein Amplifizierungsschritt vorhanden, da
jedes Donorbead nach Anregung bis zu 60000 Singlet- Sauerstoffmoleküle pro Sekunde
erzeugt. So wird die Sensitivität erhöht und die benötigten Reaktionsvolumina können
niedrig gehalten werden (VON LEOPRECHTING et al. 2006).
B.
A.
C.
GST-tagged
RGS3
biotinyliertes
G-alpha-q
Abb. 9: Prinzip des AlphaScreen Assays
Bei Anregung der Donorbeads mit einem Laser der Wellenlänge 680 nm wird ein Singlet-Oxygen
freigesetzt. Dieses Molekül hat eine Halbwertzeit von 4 µsec und kann sich etwa 200 µm vom Donorbead
entfernen. Trifft es auf ein Akzeptorbead, wird Licht der Wellenlänge 520-620 nm emittiert (A). Ist kein
Akzeptorbead in Reichweite, zerfällt das Singlet-Oxygen, ohne ein Signal zu emittieren (B). Im hier
entwickelten Assay (C) bindet Gαq über Biotin an das Streptavidin-überzogene Akzeptorbead, RGS3
über den GST-Tag an den mit einem Anti-GST versehenen Donorbead. Durch die Bindung zwischen
RGS3 und Gαq ist die Distanz zwischen Donor- und Acceptorbead geringer als die maximale Reichweite
des Singlet-Oxygen, somit wird nach Anregung ein Signal erzeugt, das mit dem EnVision Reader
gemessen werden kann.
Quelle: modifiziert nach PerkinElmer - A practical guide to working with AlphaScreen
Es wurde mit Anti-GST-Akzeptorbeads und mit Streptavidin-Donorbeads gearbeitet.
Die Anti-GST-Akzeptorbeads binden das mit einem GST-Tag ausgestattete RGS3,
während die Streptavidin-Donorbeads das an Biotin gekoppelte Gαq binden (Abb. 9C).
Die Versuche wurden mit einem Gesamtvolumen von 60 µl pro Reaktion in einer 394Well-Platte (OptiPlate-384, PerkinElmer) durchgeführt und mit dem PerkinElmer
EnVision Reader mit dem Emissionsfilter 570 und dem Mirror D640as abgelesen.
2 Materialien und Methoden
40
Alle Versuche mit dem AlphaScreen Assay wurden mit Triplikaten zweifach
durchgeführt.
In den ersten Versuchen wurde das optimale Verhältnis zwischen der verwendeten
Menge an RGS3 und Gαq ermittelt.
Die verwendeten 60 µl setzten sich in Folge aus 15 µl Pufferlösung mit je 750 ng
Beads, 40 µl Proteinlösung mit 320 µg RGS3 und 170 µg Gαq und 10 µl DMSO, das
auch zur Lösung der zu testenden Inhibitoren eingesetzt wurde, zusammen. Zusätzlich
wurden 40 µM GTP-γ-S hinzugefügt, um die RGS3-Gαq-Proteinbindung zu
stabilisieren. In weiteren Versuchen wurde ausgeschlossen, dass reines DMSO einen
Einfluss auf die Bindungsqualität und das Signal-Rausch-Verhältnis hat.
RGS3-Protein und der in DMSO gelöste Inhibitor wurden vermischt und bei
Raumtemperatur für 20 Minuten vorinkubiert. Nun wurden Gαq, GTP-γ-S und die
Donor- und Akzeptorbeads hinzugefügt und bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden
auf einem Schüttler inkubiert. Als Negativkontrolle wurden Donor- und Akzeptorbeads
mit PBS und DMSO auf das Assaygesamtvolumen von 60 µl aufgefüllt. Für die
Positivkontrolle wurde nur DMSO ohne Inhibitor verwendet; die Bindung zwischen den
beiden Proteinen wird dadurch nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde die testeigene
Assaykontrolle verwendet. Hierbei wurden die Donor- und Akzeptorbeads mit PBS und
DMSO und zusätzlich 41,6 nM biotinyliertem GST auf das Gesamtvolumen von 60 µl
gebracht. Biotinyliertes GST bindet sowohl an Anti-GST-Akzeptorbeads als auch an
Streptavidin-Donorbeads und erzeugt ein starkes Signal.
Der von Jin, Neubig et. al publizierte RGS4-Inhibitor (JIN et al. 2004) wurde in DMSO
in Konzentrationen von 10 µM bis 1 pM gelöst und mit RGS3 20 Minuten vorinkubiert.
Dann wurden die weiteren Assaykomponenten hinzugegeben, die Mikroplatte für 2
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit dem PerkinElmer
EnVision Reader abgelesen.
Die Substanzen, die als mögliche Inhibitoren getestet werden, sind aus einem virtuellen
Screening hervorgegangen. Mittels des GOLD docking program (Version 2.2) Computerprogramms (Cambridge Christallographic Data Center) wurde geprüft, ob die
verschiedenen Molekularstrukturen der in Datenbanken verfügbaren Substanzen
möglicherweise einen Kontakt zu der Bindungsstelle des RGS3 herstellen könnten. Es
2 Materialien und Methoden
41
ist nur die Kristallstruktur von RGS4 bekannt, deshalb wurde diese als Grundlage für
das Screening verwendet. Das virtuelle Screening wurde durch Herrn Prof. W. Sippl,
Institut für Pharmazeutische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg,
durchgeführt.
N
CH3
O
S
N
O
N
O
N N
H3C
H3C
O
N
H
O
CH3
O
H
N
O
F
O
CH3
O
S
O
SCR0146
HTS0796
H
N
N
H
S
H3C
HN
O
N
H
O
O
S O
NH2
O
Cl
N
H
N
O
NO2
F F
HTS0550
N
H
637299
Abb. 10: Strukturformeln der potentiellen Inhibitoren, „Hits“ des virtuellen Screenings
Diese Abbildung zeigt die Strukturformeln der Substanzen, die beim virtuellen Screening als mögliche
Inhibitoren angezeigt wurden. Es ist keine gemeinsame chemische Leitstruktur zu erkennen.
Die in diesem Verfahren als potentielle Hemmstoffe erkannten Stoffe wurden in Folge
in DMSO gelöst und in Konzentrationen von 10 µM-1 pM im Assay eingesetzt.
3 Ergebnisse
3
42
Ergebnisse
In der Pathogenese verschiedener Krankheitsbilder wie Parkinson, Epilepsie oder
Depression wird eine Fehlregulation in der Signaltransduktionskaskade diskutiert. So
soll die Überexpression bestimmter Kontrollproteine des G-Protein-gekoppelten
Rezeptors, z.B. Mitglieder der RGS-Familie, ursächlich in der Genese dieser
Erkrankungen beteiligt sein. Eine pharmakologische Inhibition von RGS-Molekülen
sollte eine Verstärkung des Target-G-Protein-Rezeptorsignals bedeuten.
Um zu untersuchen, ob die Bindung von RGS3 an Gαq spezifisch gestört werden kann,
wurde ein Testsystem zum Screening potentieller Inhibitoren entwickelt.
Dazu wurden die Gensequenzen der beteiligten Proteine aus cDNA amplifiziert, in
Vektoren mit einem zusätzlichen Tag exprimiert, aufgereinigt und in den AlphaScreen
Assay integriert.
3 Ergebnisse
43
3.1
Klonierung der DNA
3.1.1
PCR aus cDNA
In der PCR wurden die Genabschnitte von RGS3 und Gαq amplifiziert. Zur Kontrolle
wurden die PCR-Produkte in einem Agarosegel nach Größe getrennt.
1
2
M
Gαq 1079 bp
1000 bp
RGS3 506 bp
500 bp
Abb. 11: PCR-Amplifikation der RGS3- und Gαq-Sequenz
Die Genabschnitte mit Ursprung in unterschiedlicher cDNA wurden nach der PCR auf ein 3%-iges
Agarosegel aufgetragen. Die Abbildung zeigt ein Agarosegel in dem die klonierten PCR-Produkte von
Gαq (Spur 1, 1079 Basenpaare) und RGS3 (Spur 2, 506 Basenpaare) zu erkennen sind. Am Gelrand
wurde zum Größenvergleich eine Highrange 1000 bp-Leiter (Spur M) aufgetragen.
3.1.2
Insertion in einen „Entryvektor“
Die PCR-Produkte wurden in einer Topoisomerasereaktion in einen „Insertionsvektor“
ligiert. Im Anschluss wurde mittels Kontrollverdaus und Gelelektrophorese geprüft, ob
die Fragmente in den Vektor korrekt eingefügt wurden (Abb. 12).
3 Ergebnisse
44
M
1
2
Vektorfragment
1000 bp
500 bp
Gαq-Insert
RGS3-Insert
Abb. 12: Kontrollverdau der RGS3- und Gαq-Klonierungsvektoren
Auf diesem Agarosegel sind die Fragmente nach der Plasmidaufreinigung und dem Kontrollverdau mit
NOT I und ECO RV zu sehen. Zum Größenvergleich wurde ein High Range Marker (Spur M)
aufgetragen. Der geschnittene Vektor pENTR/D-TOPO hat eine Größe von 2435 Basenpaaren, die
Fragmente eine Gesamtgröße von 1223 bp bei Gαq (Spur 2) und 653 bp bei RGS3 (Spur 1). Die
Abweichung von der ursprünglichen Größe der PCR-Produkte ist in den Schnittstellen der
Restriktionsenzyme begründet.
3.1.3
Umklonierung in Destinationsvektoren
Die exprimierten Proteine RGS3 und Gαq sollten jeweils mit einem GST- bzw. BiotinTag versehen werden. Zu diesem Zweck wurden die Insertionsfragmente von RGS3 und
Gαq in der LR-Reaktion (siehe Methoden 2.2.1.6) in den entsprechenden
Destinationsvektor, pDest 15 bzw. pET 104, ligiert. Auch hier wurden die
aufgereinigten Plasmide wieder zur Kontrolle mit Restriktionsenzymen geschnitten und
die Fragmente in einem Agarosegel nach Größe getrennt (Abb. 13).
3 Ergebnisse
45
M
1
2
3
4
M
Vektorfragment pDEST 15
4424 bp
Vektorfragment pET 104
5123 bp
2000 bp
1500 bp
Gαq
1788 bp
RGS3
885 bp
Abb. 13: Kontrollverdau der rekombinanten Destinationsvektoren
Der Vektor pDEST15-RGS3 wurde mit den Restriktionsenzymen Sfu I und Cel II (Spur 1 und 2,
unabhängige Klone) und der Vektor pET104-Gαq mit Sph I und Cel II (Spur 3 und 4, unabhängige
Klone) geschnitten. Zu sehen sind die erwarteten Fragmentlängen von 4424 und 885 bp (Spur 1 und 2)
sowie 5123 und 1788 bp (Spur 3 und 4). Seitlich wurde die 1000 bp-Leiter als Marker aufgetragen.
3.2
Proteinexpression
Die transfizierten E. coli–Bakterien wurden, wie unter 2.2.2.1 beschrieben,
herangezüchtet und lysiert. Im folgenden Schritt wurde nun mittels Western Blots
verifiziert, dass die gewünschten Proteine von den Bakterienzellen exprimiert werden
und den entsprechenden Tag besitzen. Auf Basis der Sequenz der Proteine konnte das
Molekulargewicht
abgeschätzt
werden.
Allerdings
konnten
posttranslationale
Modifikationen, wie beispielsweise Phosphorylierung und Glykosylierung, die in E. coli
nicht stattfinden, nicht berücksichtigt werden. So hat die klonierte RGS3 Isoform 4 ein
Molekulargewicht von 19,35 kDa und der fusionierte GST-Tag ein Molekulargewicht
von 27.7 kDa, das Produkt also ein Gesamtgewicht von 47 kDa (Abb. 14, 2A und 2B).
Der Biotin-Tag hat ein Molekulargewicht von 11 kDa, Gαq ein Molekulargewicht von
42,1 kDa, das Gesamtprotein hat demzufolge ein Gewicht von 53 kDa (Abb. 14, 1A und
1B).
3 Ergebnisse
46
1A
2A
RGS3 47 kDa
Gαq 53 kDA
1B
2B
RGS3 47 kDa
Gαq 53 kDA
Abb. 14: Kontrolle der Proteinexpression und Verifizierung des Proteintags
In diesem Western Blot liegt die Bande des biotinylierten Gαq bei 53 kDa. Das Protein wurde mit einem
Anti-Gαq-Antikörper detektiert (Abb. 1B) und zur Kontrolle der Biotinylierung außerdem mit einem
Antikörper gegen Biotin (Abb.1A) detektiert.
RGS3-GST wurde ebenfalls in einem Western Blot detektiert. Die Bande liegt bei 47 kDa, auch hier
wurde das Protein mit Anti-RGS3 (Abb. 2A) und zusätzlich mit Anti-GST (Abb. 2B) geprüft.
Um die Proteinausbeute zu optimieren, wurde in einem Zeitverlauf stündlich eine Probe
der mit IPTG induzierten und nicht induzierten Kulturen genommen, lysiert und in
einem Western Blot die Proteinausbeute quantifiziert (Abb. 15).
A.
0
1
1i
2
2i
3
3i
4
4i
5
5i
Zeit in h
i=
induzierte Probe
RGS3 (~47kDa)
B.
0
1
1i
2
2i
3
3i
4
4i
5
5i
6
6i
Zeit in h
i
= induzierte Probe
Gαq (~53 kDa)
Abb. 15: Zeitverlauf der Proteinexpression
Diese Western Blots von Lysaten mit Destinationsvektoren transfizierter E. coli mit RGS3 (A.) und Gαq
(B.) zeigen eine Zunahme der Expression bei längerer Inkubationszeit der Bakterienkulturen. Die Proben
wurden im Abstand von einer Stunde genommen (1, 2, 3, 4, 5, 6 Stunden). Der Unterschied zwischen mit
IPTG induzierten (i) und nicht induzierten Kulturen ist sehr gering.
Nach fünf Stunden wurde eine hohe Konzentration an exprimiertem Protein erreicht.
3 Ergebnisse
47
Nach Schwierigkeiten mit der Proteinausbeute von RGS3 wurden auf einer LBAgarplatte verschiedene Kolonien herangezüchtet und die unterschiedlichen Klone in
Folge amplifiziert, lysiert und auf ihren RGS3-Proteingehalt geprüft (Abb. 16). Es war
ersichtlich, dass Kolonie Nr. 5 für die weiteren Versuche geeignet ist und als
Stammkolonie verwendet werden kann.
1
1i
2
2i
3i
4
4i
5
5i
6
6i
7i
8
8i
RGS3 (47 kDa)
Abb. 16: RGS3-Koloniewahl
In diesen Western Blots wurden Lysate verschiedener, mit pDest 15-RGS3 tranzifizierter E. coli Kolonien (Nummern 1-8, i = induzierte Proben) aufgetragen. Unter Berücksichtigung des Proteingehalts
(4 µg/Spur) konnte so gefolgert werden, dass Kolonie Nr. 5 als Stammkolonie für die weiteren
Experimente zur RGS3-Expression geeignet ist, während z.B. Kolonie Nr. 1 kaum RGS3 exprimiert und
deshalb nicht verwendet werden sollte.
Die exprimierten Proteine waren nach der Lyse zu unterschiedlichen Anteilen in Pellet
und Überstand enthalten. Auch hier wurden zur Überprüfung der Löslichkeit Western
Blots durchgeführt.
A.
1
2
RGS3 47 kDA
B.
1
2
Gαq 53 kDA
Abb. 17: Überprüfung der Löslichkeit von Gαq und RGS3
Der Western Blot des mit Tris-Puffer (pH 8,0) gelösten und mit Ultraschall behandelten E. coli-Pellets
zeigt, dass RGS3 (Abb. A) und Gαq (Abb. B) unter den gewählten Bedingungen nicht in Lösung geht..
Die Proteine verblieben im sedimentierten Pellet (Spur 1), das in SDS-Puffer gelöst und auf das Gel
aufgetragen wurde, nur ein kleiner Teil konnte gelöst werden und war im Überstand (Spur 2). In diesen
Abbildungen ist die RGS3-Bande bei 47 kDa und die Gαq-Bande bei 53 kDa zu sehen.
Sowohl RGS3 (Abb. 17A) als auch Gαq (Abb. 17B) erwiesen sich als lipophil und so
verblieb der Großteil der exprimierten Proteine nach der Lyse im Pellet. Um sie zu
lösen und gleichzeitig die Aktivität zu erhalten, wurden sie im Verfahren der
„Pulsrenaturierung“ zuerst gelöst und anschließend zurückgefaltet.
3 Ergebnisse
48
Nach dieser Prozedur konnten die gelösten Proteine im Dialysat detektiert werden
(Abb.18).
A.
B.
[kDa]
66
45
RGS3 47 kDa
Gαq 53 kDa
30
Abb. 18: Gαq und RGS3-Detektion nach Rückfaltungsprotokoll
Nach der Rückfaltung werden die Proteine erneut in einem Western Blot detektiert. So findet sich auch
hier RGS3 bei 47 kDa (A) und Gαq bei 53 kDa (B).
3 Ergebnisse
49
Um die Spezifität im AlphaScreen-Assay zu erhöhen, wurde RGS3 anschließend über
den GST-Tag mit Glutathion-Sepharose aufgereinigt (Abb. 19).
A
M
1
2
3
4
5
220
97
66
45
RGS3 47 kDa
30
20
B
1
2
3
4
5
RGS3-GST 47 kDa
C
1
2
3
4
5
RGS3-GST 47 kDa
Abb. 19: RGS3-GST-Aufreinigung
Diese Abbildungen zeigen die Konzentration an RGS3 vor und nach der Aufreinigung. Auf jede Spur
wurden 4 µg Protein aufgetragen. Die mit Anti-RGS3 detektierte Bande befindet sich bei etwa 47 kDa
(Abb. B). Auch die Detektion mit einem GST-Tag spezifischen Antikörper war erfolgreich (Abb. C).
In Spur 1 wurde das Dialysat nach der Rückfaltung aufgetragen, hier sind nur geringe Konzentrationen
des Proteins zu detektieren. Nach der Inkubation mit den Glutathion-Sepharose Beads ist das Protein fast
vollständig an diese gebunden, das Signal im Überstand (Spur 2) also noch geringer. Nach der Elution
war das Protein dann in den Eluatsfraktionen zu finden (Spuren 3 bis 5). Die Coomassie-Blau-Färbung
(Abb A.) zeigt, dass das aufgereinigte Protein etwa eine Reinheit von 80% hat. Hier wurde 1 µg Protein
pro Spur aufgetragen.
3 Ergebnisse
50
Die Aufreinigung von Gαq mittels Streptavidin war nicht möglich (Abb. 20). Zwar
konnte eine erfolgreiche Bindung an die Matrix nachgewiesen werden (Abb. 20B, Spur
1), aber die Elution unter nicht denaturierenden Bedingungen war nicht möglich
(Abb.20A, Spur 1-6).
A
1
2
3
4
5
6
D
K
Gαq 53 kDa
B
[kDa]
1
2
97
66
Gαq 53 kDa
45
30
Abb. 20: Aufreinigung von Gαq-Biotin-Fusionsprotein
Die Elution des gebundenen Proteins war nicht erfolgreich (Abb. A). In keiner der Eluatsfraktionen (Spur
1 bis 6) wurde Gαq detektiert. Auch im Durchlauf (Spur D) war kein Gαq mehr vorhanden. In Spur K
wurde als Positivkontrolle das Gαq enthaltende E. coli-Dialysat aufgetragen, welches nicht über die
Streptavidinsäule gegeben wurde.
Im Western Blot (Abb. B) wurde das mit SDS aufgekochte Säulenmaterial (Spur 1) neben einer GαqPositivkontrolle, die vom Hernn Prof. Benzing, Freiburg, gestellt wurde (Spur 2), aufgetragen. Deutlich
ist zu erkennen, dass das Protein nach der Inkubation mit dem Elutionspuffer auf der Säule verblieb.
3.3
AlphaScreen-Assay
Die isolierten Proteine werden nun im AlphaScreen-Assay eingesetzt. Hierbei handelt
es sich um eine preisgünstige Testplattform, die es ermöglicht, die Inhibitorsuche im
Hochdurchsatzscreenig durchzuführen.
3 Ergebnisse
3.3.1
51
Etablierung
In einem ersten Versuch wurde nur biotinyliertes GST zu den Reaktionsbeads
hinzugegeben und so nur die Bindungskapazität des Assays überprüft (Abb. 21A).
In einem weiteren Schritt wurde jeweils nur eines der Proteine eingesetzt und das, als
Positivkontrolle funktionierende Molekül, biotinyliertes GST, kompetitiv vom
jeweiligen Reaktionspartner des Fusionsproteines verdrängt (Abb. 21 B und 21 C).
A.
AlphaScreen [cps]
AlphaScreen Assay: Positivkontrolle (BiotinGST)
60.000
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0
1,00E-12
1,00E-11
1,00E-10
1,00E-09
Biotin-GST [M]
1,00E-08
1,00E-07
3 Ergebnisse
52
B.
bGST mit RGS3-Kompetition
120
100
[cps%]
80
60
40
20
0
0
50
100
150
RGS3 [ng]
C.
bGST mit Gαq-Kompetition
140
120
100
[cps%]
80
60
40
20
0
-20
30
80
130
180
Gαq [ng]
Abb. 21: Kompetitive Verdrängung des biotinylierten GST durch die rekombinanten Proteine
Die Funktion des Assays wurde mit der firmeneigenen Positivkontrolle überprüft. Biotinyliertes GST
band an Donor- und Acceptorbeads, dadurch wurde ein hohes Signal erzeugt (Abb. A). Durch die Zugabe
eines an ein Reaktionsbead bindendes Protein, wie RGS3-GST (Abb. B) und Gαq-Biotin (Abb. C), wurde
das biotinylierte GST kompetitiv vom entsprechenden Bindungspartner verdrängt. So nimmt das
Bindungssignal der Reaktionsbeads mit steigender Proteinmenge ab.
3 Ergebnisse
53
Aufgrund der nicht erfolgten Aufreinigung des Gαq war es nötig zu überprüfen, in
welchem Maße die noch im Dialysat enthaltenen Restproteine das Ergebnis
beeinflussen. Hierzu wurde zu den Reaktionsbeads biotinyliertes GST gegeben und
zusätzlich E. coli–Lysat titriert.
Es zeigte sich, dass auch große Mengen an Fremdprotein von bis zu 150 µg auf ein
Reaktionsvolumen von 25 µl keine Abnahme des Bindungssignals zur Folge haben
(Abb. 22).
Unspezifische Interferenz von E.coli Protein
120
Fluoreszenz der Kontrolle [%]
100
80
60
40
20
0
1
10
100
1000
10000
100000
E. coli Protein [µg]
Abb. 22: Unspezifische Interferenz des E.coli-Lysats mit dem AlphaScreen-Assay
Durch die Zugabe von Fremdprotein in Form eines E. coli-Lysat wurde die Bindung der Reaktionsbeads
über biotinyliertes GST nur geringfügig gestört. Erst ab einer Menge von mehr als 150 µg Protein in 25 µl
Reaktionsvolumen wurde das Signal gemindert.
Nun wurden verschiedene Mengen an RGS3- und Gαq–Dialysat in den Assay titriert.
Anhand der Signalverstärkung gegenüber der Negativprobe, die nur Reaktionsbeads,
aber keine Proteine enthält, konnte so das optimale Verhältnis von RGS3 zu Gαq eruiert
werden (Abb. 23).
Deutlich wurde dabei, dass ein Verhältnis von 170 ng (53 nmol) Gαq zu 320 ng (113
nmol) RGS3 die meisten counts per second erzeugt. In einem Gesamtreaktionsvolumen
von 60 µl wurden je 7,5 µg Donor- und Akzeptorbeads verwendet. So wurde das Signal
3 Ergebnisse
54
des Grundrauschens, das durch ein zufälliges Aufeinandertreffen der Beads erzeugt
wird und ein immer messbares Signal ist, bis zu 10-fach erhöht.
Signal AlphaScreen [cps]
RGS3/GαqVerhältnis, 170 ng Gαq
14000
12000
160 ng
10000
240 ng
8000
320 ng
6000
400 ng
4000
Rauschen
2000
0
RGS3
Abb. 23: Experimentelle Bestimmung des optimalen Verhältnisses zwischen RGS3 und Gαq
Durch Versuche mit verschiedenen Mengen an Bindungsproteinen wurde das Verhältnis zwischen RGS3
und Gαq ermittelt, bei dem ein möglichst hohes Signal-/Rausch-Verhältnis gemessen wird.
So wurde bei einem Verhältnis von 320 ng RGS3 zu 170 ng Gαq das Signal im Vergleich zum Rauschen,
dem immer meßbaren Grundsignal, das durch ein zufälliges Aufeinandertreffen von Donor- und
Akzeptorbead entsteht, bis zu 10-fach erhöht.
Durch Zugabe von 40 mM GTP-γ-S konnte das Signal-/Rausch-Verhältnis weiter
verbessert werden. Es wurde eine Erhöhung um das 2,5-fache festgestellt (Abb. 24).
Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen Assay
Signal AlphaScreen [cps]
80000
70000
60000
50000
40000
30000
Puffer PBS
GTP (40 µmol)
Rauschen
Assaykontrolle
20000
10000
0
Abb. 24: Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay
Durch die Zugabe von 40 mM GTP-γ-S wurde das Bindungssignal um das 2,5-fache erhöht. Um die
Funktion des Assays zu überprüfen, wurde als Assaykontrolle die Bindungsfähigkeit der Reaktionsbeads
mit biotinyliertem GST, das sowohl an Donor- als auch an Akzeptorbead bindet, überprüft. Rauschen
wurde in Abb. 23 definiert.
Zur Kontrolle der Spezifität des Testsystems wurde eine Verdrängung des mittels
Biotin-Tag an das Akzeptorbead gekoppelten Gαq durch eine nicht an das Bead
3 Ergebnisse
55
bindende Gαq/Gαi-Chimäre (AG Aktories) durchgeführt. Dieses Gαq/i-Molekül besitzt
einen His-Tag und bindet demzufolge weder an Donor- noch an Akzeptorbead (Abb. 9).
Allerdings geht das Protein eine Bindung mit RGS3 ein und kompetetiert das an den
Donor Bead gebundene RGS3 und verringert so die Anzahl der Bindungen. In den
Versuchen wurden ~600 ng der Gαq/Gαi-Chimäre zur Kompetition der 170 ng GαqBiotin eingesetzt und eine Signalverminderung auf bis zu 44% erreicht (Abb. 25).
Test der Spezifität des RGS3/Gαq-AlphaScreen Assays mit Gnaq/GnaiKompetitionsprotein
Signal AlphaScreen [cps]
25000
20000
15000
10000
Positivkontrolle
Gaq/Gai
Rauschen
Assaykontrolle
5000
0
Abb. 25: Kompetition durch Gαq/Gαi
In diesem Diagramm wurden die Signalstärken nach Zugabe von 10 µl reinem PBS und Zugabe von ~600
ng Gαq/Gαi gelöst in 10 µl PBS aufgetragen. Durch die Bindung des Gαq/Gαi an RGS3 wurde die
Anzahl der Bindungen zwischen RGS3 und Gαq-Biotin verringert und somit auch die Stärke des
Bindungssignals abgesenkt. Im ersten Versuch gelang eine Minderung des Signals auf 44% des
Positivkontrollwertes, in der Wiederholung eine Senkung auf 63%. „Positivkontrolle“, „Rauschen“ und
„Assaykontrolle“ wurden in Abb. 23 und 24 definiert.
3 Ergebnisse
56
Die zu testenden Substanzen wurde in DMSO gelöst. Um zu kontrollieren, dass DMSO
die Funktion des Assays nicht beeinträchtigt, wurde 10 µl DMSO zu Negativ (Donorund
Akzeptorbeads
mit
PBS)-,
Positiv
(Donor-
und
Akzeptorbeads
mit
Bindungsproteinen RGS3-GST und Gαq-Biotin) - und Assaykontrolle (Donor- und
Akzeptorbeads mit biotinyliertem GST) auf ein Gesamtvolumen von 60 µl gegeben. Es
zeigte sich, dass die gemessenen Signale höher waren als bei einer Messung ohne das
Lösungsmittel DMSO, jedoch wurde das Signal-/Rausch-Verhältnis nicht beeinflusst.
Einfluß von DMSO auf das Bindungssignal
Signal AlphaScreen [cps]
300000
250000
200000
150000
100000
RGS3 + Gaq
RGS3 + Gaq + DMSO
Rauschen
Rauschen + DMSO
Assaykontrolle + DMSO
Assaykontrolle
50000
0
Abb. 26: Einfluß des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO auf das Bindungssignal des RGS3/GαqAlphaScreen-Assays
Durch die Zugabe von 10 µl DMSO auf ein Gesamtvolumen von 60 µl wurde das Bindungssignal um
etwa 30% erhöht, jedoch hatte diese Erhöhung keine signifikante Veränderung des Signal/RauschVerhältnisses zur Folge. Auch das Signal des Rauschens (Definition siehe Abb. 23) wurde durch Zugabe
von DMSO nicht signifikant erhöht. Die Assaykontrolle wurde in Abb. 24 definiert.
3 Ergebnisse
3.3.2
57
Test potentieller RGS3-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay
In Folge wurde der von der Arbeitgruppe Neubig gefundene, publizierte RGS4-Inhibitor
in Konzentrationen von 168 µM bis 1,68 nM getestet (NEUBIG et al. 2004) (Abb. 27).
Die Messungen wurden nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten, 60 Minuten und
120 Minuten durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde eine Probe mit Donor- und
Akzeptorbeads und den Bindungsproteinen RGS3-GST und Gαq-Biotin verwendet, als
Negativkontrolle Donor- und Akzeptorbeads mit PBS. Die Funktionsfähigkeit des
Assays wurde mit der Assaykontrolle, biotinyliertem PBS, überprüft. Das Signal wurde
weder durch Zugabe des Inhibitors noch durch eine veränderte Inkubationszeit
spezifisch verändert.
Test verschiedener Konzentrationen des Neubig-RGS4-Inihbitors im
RGS3/Gαq-AlphaScreen Assay
[cps]
Pos.kont.
Rauschen
Assaykont.
250.000
200.000
150.000
60 min Inh.
100.000
120 min
Inh.
50.000
0
0,001
Kontrollen
20 min
Kontrollen
60 min
Kontrollen
120 min
20 min Inh.
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000 1000,000 10000,00
0
Inhibitor (µM)
Abb. 27: Test verschiedener Konzentrationen des Neubig-RGS4-Inhibitors im RGS3/GαqAlphaScreen-Assay
Das Liniendiagramm zeigt die Ergebnisse des Tests von Inhibitorkonzentrationen von 168 µM bis 1,68
nM nach einer Inkubationszeit von 20 (blau) bzw. 60 (pink) und 120 (orange) Minuten. Das
Balkendiagramm veranschaulicht die Kontrollwerte (Positivkontrolle, Rauschen und Assaykontrolle)
nach 20 bzw. 60 und 120 Minuten. Das Bindungssignal zwischen RGS3 und Gαq wurde durch die
Substanz innerhalb dieser Zeit nicht spezifisch beeinflusst. „Positivkontrolle“ (Pos.kont.), „Rauschen“
und „Assaykontrolle“ wurden in Abb. 23 und 24 definiert.
Die in der Computerdatenbank ermittelten Substanzen wurden ebenfalls in DMSO
gelöst und in Konzentrationen von 10 µM–1 pM im Assay getestet (Abb. 28 und 29).
3 Ergebnisse
58
Substanz 1 (HTS 07963) wurde in 2 verschiedenen Versuchen getestet. Im ersten
Versuch wurden in einer logarithmischen Verdünnungsreihe Konzentrationen von 10
µM-1 pM getestet. Dabei zeigte sich eine Verminderung des Signals auf bis zu 60% des
Positivkontrollsignals. Die Signalverminderung wurde in allen Konzentrationsstufen
erreicht (Abb 28, Serie 1).
Um zu kontrollieren, ob das Signal mit einer höheren Inhibitorkonzentration weiter
gesenkt wird, wurden in einem weiteren Versuch Konzentrationen von 168, 100, 80, 60,
40, 20, 10 und 1 µM getestet. Hier zeigte sich keine Verminderung, sondern eine
Erhöhung des Signals auf bis zu 130% des Signals der Positivkontrolle (Abb. 28, Serie
2).
% der positiven Kontrolle
HTS07963 aus "virtuellem Screening" im AlphaScreen
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0,00
Serie 1
Serie 2
0,10
10,00
1000,00
100000,00
Substanz HTS 07963 [nM]
Abb. 28: Einfluß der Substanz HTS 07963 im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay
Diese Abbildung zeigt die Veränderung des Bindungssignals durch die Zugabe der Substanz HTS 07963.
In zwei unterschiedlichen Versuchen wurden verschiedene Konzentrationen der Substanz getestet. Im
ersten Versuch wurde die Subtanz in einer logarithmischen Verdünnungsreihe von 10 µM bis 1 pM
eingesetzt und eine Verminderung des Signals auf bis zu 60% erzielt (Serie 1). In einem weiteren Versuch
wurden Konzentrationen von 168, 100, 80, 60, 40, 20, 10 und 1 µM eingesetzt und in Folge eine
Erhöhung des Signals auf bis zu 130% der Positivkontrolle beobachtet (Serie 2).
Die Substanzen 2, 3 und 4 (SCR 01461, HTS 05503 und ChemBridge 6372993) wurden
in einer logarithmischen Verdünnungsreihe in Konzentrationen von 10 µM bis 1 pM
getestet (Abb. 29).
Hier zeigte sich im Vergleich zum Signal der Positivkontrolle, die Donor- und
Akzeptorbeads und die Bindungsproteinen RGS3-GST und Gαq-Biotin enthält, keine
spezifische Veränderung des Signals.
3 Ergebnisse
59
Substanzen 2, 3 und 4 aus "virtuellem Screening"
im AlphaScreen
Substanz 2
SCR 01461
% der positiven
Kontrolle
200
Substanz 3
HTS05503
150
100
Substanz 4
6372993
50
0
0,00
0,10
10,00
1000,00
100000,00
Substanz [nM]
Abb. 29: Einfluß der Substanzen 2, 3 und 4 aus „virtuellem Screening“ im AlphaScreen
Die im virtuellen Screening als potentielle Inhibitoren erkannten Substanzen wurden in einer
logarithmischen Verdünnungsreihe von 10 µM bis 1 pM eingesetzt. Es zeigte sich keine spezifische
Signalminderung.
4 Diskussion
4
60
Diskussion
Die Fähigkeit von Zellen, auf sich verändernde Umweltbedingungen reagieren zu
können und sich diesen Veränderungen anzupassen, ist essentiell für den
Gesamtorganismus. Dabei muß die Einzelzelle extrazelluläre Reize und Signale
wahrnehmen und in eine intrazelluläre Antwort umwandeln. Eine Schlüsselrolle in
diesem Reaktionsweg haben dabei Rezeptoren, da sie eine Verbindung zwischen dem
extra- und intrazellulären Kompartiment sind.
Es gibt eine große Anzahl an verschiedenen Rezeptorklassen, die Gruppe der G-Proteingekoppelten Rezeptoren ist unter diesen die größte Familie der transmembranären
Rezeptoren im tierischen Zellsystem (GILMAN et al. 1987).
Für die Signaltransduktionskaskade ist die Aktivierung und Desaktivierung des
Rezeptors
von
entscheidender
Bedeutung.
Besonders
der
Mechanismus
der
Desaktivierung war lange Zeit unbekannt. Die für die Desaktivierung essentielle
Hydrolyse von GTP durch die Gα-Untereinheit hielt man für ein nicht reguliertes
System. Der Unterschied zwischen der GTP-Hydrolyse-Rate in vitro und der
Deaktivierungszeit des Systems in vivo resultierte in der Entdeckung der GTPaseAktivierenden-Proteine (GAPs) (BREITWIESER et al. 1988; VUONG et al. 1991).
Durch diese GAPs wird das Gleichgewicht zwischen GTP und GDP+Pi in Richtung der
Hydrolyse verschoben und somit die für viele Sinnessysteme (z.B. visuelles System)
nötige Deaktivierung der G-Proteine beschleunigt.
Die Familie der RGS-Proteine ist eine der Gruppen dieser GAPs (KOELLE et al. 1996;
YU et al. 1996; DOHLMAN et al. 1997). Sie binden an Gαi und Gαq und
beschleunigen die intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheiten (BERMAN et
al. 1996; TESMER et al. 1997). Somit sind RGS-Proteine die molekularen Ausschalter
der G-Proteinabhängigen Signaltransduktion (BENZING et al. 2000). RGS3 ist Teil
dieser Proteinfamilie.
Aufgrund der Erkenntnis, dass RGS-Proteine eine entscheidende Rolle in der
Regulation der Signaltransduktion spielen, stellt sich die Frage, wie dieser
Mechanismus medikamentös reguliert werden könnte. So bezeichnete A.G. Gilman die
RGS-Proteine als „Barbarians at the Gate“ (BERMAN et al. 1998). So stellt sich also
4 Diskussion
61
die Frage, wie diese „Barbaren vor dem Tor“ gebremst werden können, also die
Regulation der Regulatoren funktionieren könnte.
Bei dem entwickelten Testformat handelt es sich um einen Assay, in dem die direkte
Bindung zwischen RGS3 und Gαq untersucht wird. So wurde RGS3 mit seiner RGSDomäne und Gαq mit seiner Effektorregion kloniert, exprimiert und im Assay
eingesetzt.
Für die Klonierung der Proteine wurde cDNA aus humanen Granulozyten verwendet.
4.1
Proteinexpression und –detektion
Bei den Western Blots der exprimierten Proteine zeigten sich in einigen Fällen mehrere
Banden (Abb. 20B). Dafür kann es unterschiedliche Ursachen geben. Zum einen ist eine
Kreuzreaktion des Antikörpers mit anderen im Lysat enthaltenen Proteinen möglich. So
können Epitope mit ähnlicher Sequenz wie die exprimierten, rekombinanten Proteine
mit dem Antikörper in Wechselwirkung treten und ein Signal erzeugen. Solche
Kreuzreaktionen können in allen Größenbereichen des Western Blots auftreten. Weiter
ist zu beachten, dass E. coli Bakterien im Vergleich zu humanen Zellen nicht alle
Codons in gleicher Effektivität zu Proteinen translatieren können. So werden die
Codons AGG, AGA, AUA, CUA, CGA, CGG, CCC und UCG weniger genutzt und es
kann zum Abbruch der Translation kommen (HÉNAUT et al. 1996). Auch diese
Abbruchprodukte werden in einem Western Blot detektiert und somit durch Banden
angezeigt, die niedermolekularer sind als die des rekombinanten Proteins. Darüber
hinaus können auch Dimere des Proteins vorliegen, in diesem Fall haben die Proteine
ein höheres Gewicht, also sind die erzeugten Banden im Gel hochmolekularer als die
des Zielproteins.
Im Laufe der Untersuchungen der Expressionsstärke der Proteine zeigte sich, dass auch
ohne Induktion eine Expression stattfand (Abb. 15 und 16). In mehreren Experimenten
war jedoch ersichtlich, dass die Expressionsrate nach Induktion höher war, deshalb kann
davon ausgegangen werden, dass IPTG die Expressionsrate der Zellen weiter steigert,
d.h.das Operon also aktiviert. Das auch ohne Zusatz von IPTG eine Expression des
4 Diskussion
62
Zielproteins stattfand, könnte daran liegen, dass das Operon auch durch einen andere
Substanz wie beispielsweise Galaktose, das ein Analog zu IPTG ist, aktiviert wurde.
Hinzu kommt, dass in biologischen Systemen stehts ein Gleichgewicht zwischen
aktiven und inaktiven Substanzen herrscht.. So wird zu jedem Zeitpunkt ein Teil der
Operone nicht durch einen Repressor gebunden und somit aktiv.
4.2
Erhaltung der Proteinaktivität
Wesentlich für einen funktionierenden Assay ist die Aktivität beider Bindungspartner.
Denn nur, wenn beide Proteine in nativer Form vorliegen, kann eine Bindung erfolgen.
Leider ist bei der Proteinexpression in E. coli das rekombinante Protein oft nicht aktiv.
Das Bakterium schützt sich vor dem Fremdprotein, indem es dieses in sogenannten
Einschlusskörperchen oder „Inclusion Bodies“ verpackt. Gründe dafür sind unter
anderem die unphysiologisch hohe Konzentration des Proteins in der Wirtszelle, die
unter physiologischen Bedingungen erfolgende Co-Expression von Hilfsenzymen (sog.
Chaperone), die für die Faltung relevant sind und benötigte post-translationale
Modifikationen, die von der Bakterienzelle nicht bereitgestellt werden können (z.B.
Glykosylierung).
Die bei der Überexpression entstehenden Einschlusskörperchen haben dichte, granuläre
Strukturen. Für ihre Entstehung gibt es viele Theorien, von besonderer Bedeutung soll
die Faltung sein. Wenn Proteine neu synthetisiert werden, können sie strukturell
zunächst eine Reihe von unterschiedlichen Faltungsintermediaten bilden, bevor sie in
ihre endgültige native Konformation übergehen. Einige dieser Faltungsintermediate
tragen hydrophobe Bereiche auf ihrer Oberfläche, die dann später im nativen Protein
nach innen gerichtet sind. Bei extrem hoher lokaler Proteinkonzentration können diese
hydrophoben Bereiche miteinander in Kontakt treten, was dann zur Aggregation dieser
Proteine und Deponierung in Einschlusskörpern führt (PROUTY et al. 1972; PROUTY
et al. 1975).
Bei der Isolierung der exprimierten Proteine gab es Probleme (Abb. 17). Das Protein
konnte nicht solubilisiert werden und verblieb im Pellet. Um die in den
Einschlusskörperchen aggregierten Proteine zu isolieren, war eine vollständige
Denaturierung der Proteine notwendig. Deshalb wurden in einem ersten Schritt die
4 Diskussion
63
Zellen mit Ultraschall ruptiert und das unlösliche Material abzentrifugiert. Dabei
sedimentieren auch die Einschlusskörper, die dann mit ionischen Detergenzien wie 1%
SDS und chaotropen Denaturierungsmitteln wie 8 M Harnstoff oder 6 M
Guanidinhydrochlorid
Wasserstoffbrücken
gelöst
werden
zwischen
können.
Wassermolekülen
Letztere
und
stören
beeinflussen
so
die
hydrophobe
Interaktionen. Mittels des Verfahrens der „Pulsrenaturierung“ können die gelösten
Proteine in ihre native Form gebracht werden und sind aktiv (Abb. 21B und C).
4.3
Die
Proteinaufreinigung
gelösten
Proteine
Affinitätschromatographie
sollten
aufgereinigt
in
einem
werden.
weiteren
Das
Prinzip
Schritt
der
mittels
Affinitäts-
chromatographie beruht auf der reversiblen Bindung von Proteinen an einen
spezifischen Liganden, der an eine Matrix gekoppelt ist. Durch diese selektive Bindung
kann das Zielprotein aus einer Lösung, die verschiedene Proteine enthält, isoliert und
konzentriert werden.
Die Interaktion zwischen Ligand und Zielmolekül resultiert aus elektrostatischen oder
hydrophoben Wechselwirkungen, van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken. Zur
Elution des Zielproteins können diese Bindungen durch einen kompetetiven Liganden
oder durch Änderungen des pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen oder der Polarität
gebrochen werden.
So genannte Tags ermöglichen die schnelle Aufreinigung der Proteine in einem Schritt
mittels Affinitätschromatographie. Hierzu werden von speziellen Destinationsvektoren
gezielt Komponenten an das exprimierte Protein angehängt.
Bei der Auswahl des Tags müssen verschiedene Kriterien berücksichtigt werden:
Ein ideales Aufreinigungssystem hat einerseits eine hohe Affinität zum Tag,
andererseits ist eine Elution unter milden Bedingungen möglich, wobei die zur
Aufreinigung benutzte Matrix stabil und mehrfach verwendbar sein sollte. Es sollte
außerdem möglich sein, den Tag vom Protein zu spalten und so nur das reine Protein zu
erhalten.
4 Diskussion
64
Zudem darf der Proteintag nicht mir der Bioaktivität des Proteins interferieren, im Fall
der Arbeit mit dem AlphaScreen-Assay muss außerdem bedacht werden, dass der
Proteintag nicht mit den zu testenden Substanzen interferieren darf.
Da es nicht möglich war, das gebundene Protein zu eluieren, sollte für weitergehende
Versuche oder eine eventuelle kommerzielle Nutzung des Testsystems einen anderen
Proteintag gewählt werden. Dazu muss erneut auf die Insertionsvektoren (TOPO-Vektor
mit Gαq-Insert) zurückgegriffen werden. Dieses Insert kann dann in einer weiteren LRReaktion in einen anderen Destinationsvektor geschleust werden. Hierbei könnten dann
Destinationsvektoren mit verschiedenen Tags ausgewählt und getestet werden. So sollte
es beispielsweise gelingen, das Protein über einen Flag-Tag zu koppeln und dann Ca2+abhängig an Antikörper zu binden. Das gebundene Protein wird dann durch EDTA
verdrängt und kann so eluiert werden.
4.4
Etablierung des RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays
Das Verhältnis zwischen RGS3 und Gαq wurde empirisch ermittelt (Abb. 23). Es ist
jedoch nicht möglich, ein absolutes Verhältnis zwischen den beiden Reaktionspartnern
anzugeben. Im Assay koppeln die Proteine an Donor- und Acceptorbeads, eine genaue
Aussage über die genaue Menge an Protein, die tatsächlich 1. eine Kopplung an das
Reaktionsbead und 2. eine Bindung mit einem ebenfalls an ein Reaktionsbead
gekoppelten Partner eingeht, ist schwierig zu treffen. Es besteht also die Möglichkeit,
dass nicht alle Proteine an ein Reaktionsbead koppeln. So kann es dann vorkommen,
dass ein gekoppeltes Protein, z.B. RGS3, an einen ungekoppelten Bindungspartner,
dann Gαq, bindet. Nach einer Anregung mit 680 nm würde das erzeugte O2-Singulett
also trotz einer bestehenden RGS3/Gαq-Bindung nicht auf ein Akzeptorbead treffen und
so kein Signal emittiert. Auch ist der Anteil der aktiven rekombinanten Proteine nicht
absolut zu bestimmen. So wird vermutlich ein Teil des RGS3 bzw. des Gαq keine
spezifische Bindung miteinander eingehen können.
Die Spezifität des Tests wird durch die Verdrängung des Gαq durch eine Gαq/GαiChimäre mit His-Tag kontrolliert (Abb. 25). Dieses rekombinante Protein bindet nicht
4 Diskussion
65
an eines der Reaktionsbeads, geht aber eine Bindung mit RGS3 ein, verdrängt so das
Gαq-Biotin und senkt das Gesamtbindungssignal (Abb. 25).
Bei der Wiederholung des Versuches konnte das Signal nicht erneut auf 44%, sondern
nur
auf
63%
gemindert
Degenerationserscheinungen
werden.
des
Eine
mögliche
Gαq/Gαi-Proteins
durch
Ursache
den
könnten
wiederholten
Gefriervorgang sein. Hierbei könnte die Aktivität des Proteins beeinträchtigt werden.
Als Folge könnte nur noch ein geringerer Anteil des Gαq-Gαi das biotinylierte Gαq
verdrängen und so das Signal mindern.
Als weiterer Kompetitor kommt nicht bindendes RGS3 in Frage. Allerdings ist eine
Abtrennung des GST-Tags vom Protein nicht möglich, da das dazu benötigte Trypsin
auch das RGS3-Protein schneidet und somit die Aktivität des Proteins nicht mehr
gewährleistet ist.
Eine weitere Option zur Verhinderung der Bindung zwischen Gαq und RGS3 ist der
Einsatz des Proteins 14-3-3. Allerdings ist zu bedenken, dass für eine erfolgreiche
Bindung dieser Substanz an das Protein dessen Phosphorylierung notwendig ist
(BENZING 2000). In E.coli werden die exprimierten Proteine jedoch nicht
phosphoryliert und somit kann diese Substanz nicht zur Kontrolle der Spezifität
verwendet werden.
Da die zu testenden Inhibitoren in DMSO gelöst sind, wurde der Einfluss dieser
Substanz auf das Testsystem überprüft (Abb. 26). Durch die Zugabe von DMSO zum
Reaktionsgemisch wurden die gemessenen Signale erhöht. DMSO ist ein Lösungsmittel
und
erhöht
so
die
Molekularbewegung
eines
Stoffes.
Dadurch
ist
die
Wahrscheinlichkeit, dass Donor- und Akzeptorbead in Reichweite eines O2-Singlets
kommen, erhöht und somit das Signal verstärkt. Somit sind auch die Werte der Negativund Assaykontrolle erhöht.
Um das rekombinante Gαq zu stabilisieren wurde GTP zum Lysat hinzugegeben. Gαq
ist ein nukleotidbindendes Molekül. In seinem „off-Zustand“ bindet es an GDP, im „onZustand“ an GTP. Durch die Zugabe von GTP-γ-S, einem stabilen GTP-Derivat, das
nicht zu GDP hydrolisiert wird, wird das Gleichgewicht in Richtung des aktiven
Zustandes verschoben. Wie erwartet hat die Zugabe von GTP-γ-S eine bessere
Bindungkapazität für RGS3 zur Folge und das Bindungssignal wird so um das
Zweieinhalbfache erhöht (Abb. 24).
4 Diskussion
4.5
66
Screening von RGS-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay
Der bis dato einzig bekannter RGS-Inhibitor (JIN et al. 2004) wurde in dem hier
etablierten System getestet. Da es sich bei der Forschung an RGS-Proteinen um ein
neues Gebiet handelt, gibt es bisher nur relativ wenige Erkenntnisse. So wurde das
Bindungsverhalten von RGS4 und Gαi untersucht und ein Inhibitor dieser Bindung
gefunden. Diese Substanz ist als RGS4-Inhibitor mit einer hohen Spezifität
veröffentlicht worden. Da noch kein Inhibitor der Bindung zwischen RGS3 und Gαq
publiziert wurde, habe ich den einzig bekannten RGS4-Inhibitor getestet.
Bei
der
Untersuchung
des
RGS4-Inhibitors
konnte
keine
spezifische
Signalverminderung festgestellt werden (Abb. 27). Ein Homologievergleich der
Sequenzen von RGS3 und RGS4 bzw. Gαq und Gαi zeigte Unterschiede in der
Molekülstruktur. So ist die Aminosäure 180 der Switch-Region der Gαi-Untereinheit
Prolin, bei Gαq ist dort Lysin. Aminosäure 185 ist bei Gαi ein Valin und bei Gαq ein
Isoleucin. Da diese Aminosäuren ein wichtiger Bestandteil der Gαi/RGS4-Bindung sind
und als Grundlage für das Inhibitordesign dient (JIN et al. 2004), ist dieser Unterschied
essentiell (Abb. 30A).
Analog dazu weist die Proteinsequenz des RGS3 an der Bindungstelle zu Gαq ein
Phenylalanin statt des Tyrosins bei RGS4 auf (Abb. 30B). So ist die Bindung zwischen
RGS3 und Gαq nicht identisch mit der Bindung zwischen RGS4 und Gαi. Durch die
nachgewiesene hohe Spezifität des Inhibitors ist eine Interaktion zwischen Inhibitor und
RGS3 nicht möglich. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Substanz nicht
geeignet ist, die Verminderung des Rezeptorsignals durch RGS3 zu verhindern.
4 Diskussion
67
A.)
GNAI1
1
GNAQ
7
GNAI1
61
GNAQ
67
GNAI1
118
GNAQ
127
GNAI1
178
GNAQ
183
GNAI1
238
GNAQ
243
GNAI1
298
GNAQ
303
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAG
M C LS E K A
+ I+R LR D
A RE+KLLLLG GESGKST +KQM+IIH +G
MACCLSEEAKEARRINDEIERQLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSG
60
YSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFG---DSARADDARQLFVLAGAAEEG
YS+E+ + + +VY N
++ A+IRAM LKI +
+ A A
R++ V
+A E
YSDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVEKVSAFEN
117
FMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRT
IK LW D G+Q C++R REYQL+DS YYLNDLDR+A P Y+PTQQDVLR
----PYVDAIKSLWNDPGIQECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVLRV
177
RVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVAAIIFCVALSDYDLVLAED
RV TTGI+E F + + F+M DVGGQRSER+KWIHCFE V +I+F VALS+YD VL E
RVPTTGIIEYPFDLQSVIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIMFLVALSEYDQVLVES
237
EEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYQEYAGSNTYE
+ NRM ES LF +I
WF ++S+ILFLNKKDL EEKI S L
+ EY G
DNENRMEESKALFRTIITYPWFQNSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDA
EAA-AYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGL
+AA +I
F DLN
D K IY+HFTCATDT+N++FVF AV D I++ NLK+ L
QAAREFILKMFVDLNPDSD-KIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNL
66
126
182
242
297
302
353
358
B.)
RGS3
1
RGS4
19
RGS3
60
RGS4
79
RGS3
120
RGS4
139
MKNKLGIFRRRNESPGAPPA-GKADKMMKSFKPTSEEALKWGESLEKLLVHKYGLAVFQA
MK++LG
++++S
+ K DK++
+ + EE KW ESLE L+ H+ GLA F+A
MKHRLGFLLQKSDSCEHNSSHNKKDKVVICQRVSQEEVKKWAESLENLISHECGLAAFKA
59
FLRTEFSEENLEFWLACEDFXXXXXXXXXXXXXXXIFAEYIAIQACKEVNLDSYTREHTK
FL++E+SEEN++FW++CE++KK+KS SK++ KAKKI+ E+I++QA KEVNLDS TRE T
FLKSEYSEENIDFWISCEEYKKIKSPSKLSPKAKKIYNEFISVQATKEVNLDSCTREETS
119
DNLQSVTRGCFDLAQKRIFGLMEKDSYPRFLRSDLYLDLIN
N+
T CFD AQK+IF LMEKDSY RFL+S YLDL+N
RNMLEPTITCFDEAQKKIFNLMEKDSYRRFLKSRFYLDLVN
160
179
78
138
4 Diskussion
68
Galphaq-Galphai
Unterschiede in grün
Lys-Pro
RGS3-RGS4
Unterschiede in
magenta
rot: backbone vom RGS, blau: backbone vom G-alpha, magenta: AS die im RGS3
anders sind als im RGS4, grün: AS die im G-alpha q anders sind als im G-alpha i1
Abb. 30: Vergleich der Sequenzen von Gαq und Gαi1 (A) und RGS3 und RGS4 (B und C)
A.) Homologievergleich der Proteinsequenzen von Gα i1 (GNA1, Genebank (gi) 20072863) mit Gαq
(GNAQ, gi 40254462) mit dem Programm Blast2. Unterstrichen ist die Switch 1- Region von Gαi1,
welche 3/4 der RGS4 Bindungstasche füllt. Fettdruck markiert zwei Aminosäurereste, die essentiell für
eine feste GNAI1/RGS4 Bindung sind.
B.) Homologievergleich der RGS3 (gi 19913392) und RGS4 (gi-Proteinsequenz. 5032039)
Proteinsequenz. Unterstrichene Aminosäuren bilden die Bindungstasche für das G alpha Protein (JIN et
al. 2004)
C.) Strukturvergleich von RGS3 und RGS4
In dieser Graphik sind die Strukturen von RGS3 und RGS4, bzw. Gαq und Gαi1 abgebildet. Das
Grundgerüst von RGS ist rot markiert, die Aminosäuren, die im RGS3-Protein anders sind als im RGS4Protein magenta. Dementsprechend ist auch das Grundgerüst von Gα in blau dargestellt, die
Aminosäuren, die im Gαq-Protein anders sind als im Gαi1-Protein grün.
Die Substanzen, die im virtuellen Screening ausgewählt wurden, erwiesen sich nicht als
Inhibitoren der RGS3/Gαq-Bindung.
Substanz 1 (HTS 07963) zeigt in einem ersten Versuch zwar eine Erniedrigung des
Signals, die jedoch nicht reproduzierbar ist (Abb.28). Bei einer Erhöhung der
Inhibitorkonzentration im Folgeversuch wird eine Signalverstärkung gemessen, was auf
unspezifische Beeinflussung des Bindungsverhältnisses schließen lässt. Ferner wird bei
einer sehr geringen Konzentration des Inhibitors keine Verminderung des Signals
4 Diskussion
69
gemessen. Das wäre allerdings zu erwarten, denn bei geringen Konzentrationen könnten
nicht alle Bindungen beeinträchtigt werden und somit müsste das Bindungssignal
wieder ansteigen und das Ausgangsniveau erreichen.
Da dies nicht der Fall ist, kann gefolgert werden, dass Substanz 1 (HTS 07963) keine
spezifische Veränderung des Bindungssignals bewirkt.
Der Einsatz der Substanzen 2 (SCR 01461), 3 (HTS 05503) und 4 (ChemBridge
6372993) bewirkt ebenfalls keine spezifische Veränderung des Bindungssignals (Abb.
29).
Da bei ihrer Auswahl die Röntgenstrukturanalysen von Gαi und RGS4 als Grundlage
herangezogen
werden
mussten,
da
keine
Röntgenstrukturanalysen
für
die
Wechselwirkung von RGS3/Gαq vorliegen, überrascht das nicht. Denn, wie
besprochen, weist die Switch-Region der Gα-Untereinheiten Unterschiede auf. So wird
für weitere Untersuchungen die Röntgenstrukturanalyse von Gαq herangezogen und als
Basis für die Suche nach neuen Inhibitoren verwendet.
Darüberhinaus liefert dieser in-vitro-Assay leider keinen Hinweis auf Zellgängigkeit
oder Toxizität der getesteten Substanzen, von daher sollte in einem nächsten Schritt ein
Zellassay zur Verifizierung der Ergebnisse durchgeführt werden. Hier bietet sich ein
funktioneller Assay mit Kontrolle der IP3-Aktivität, die im direkten Zusammenhang mit
dem Rezeptorsignal steht, an. Durch eine Verlängerung des Rezeptorsignals durch die
inhibierte Hydrolysebeschleunigung durch RGS3 sollte zu einem Anstieg der IP3Konzentration führen. Erste Versuche auf diesem Gebiet werden momentan
durchgeführt.
5 Zusammenfassung
5
70
Zusammenfassung
Eva-Christina Schliewert
Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion (RGS) als Zielgruppe für
neue Medikamente – Entwicklung eines Testsystems zur Suche nach RGS3-Inhibitoren
RGS-Proteine verkürzen die Dauer der Rezeptoraktivität von G-Protein gekoppelten
Rezeptoren durch eine Beschleunigung der Hydrolyse von GTP zu GDP. Eine
Überexpression von RGS-Proteinen kann somit zu Krankheitsbildern wie Parkinson,
Herzversagen oder Epilepsie führen. Demzufolge wird nach Wirkstoffen, die die RGSProteine in ihrer Funktion inhibieren, gesucht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Signaltransduktion maßgeblich beteiligte
Proteine, RGS3 und Gαq, kloniert und in eine Testplattform, den AlphaScreen-Assay,
eingefügt. Der Assay wurde etabliert.
Es wurde ein publizierter RGS4-Inhibitor getestet, diese Substanz ist allerdings kein
Inhibitor für RGS3. Anhand der Röntgenstruktur von RGS4 und Gαi ausgewählte
Substanzen, HTS 07963, SCR 01461, HTS 05503 und ChemBridge 6372993 wurden
ebenfalls in dem Assay getestet. Auch hier konnte keine Inhibition von RGS3 gezeigt
werden.
6 Summary
6
71
Summary
Eva-Christina Schliewert
Regulators of G-Protein Signalling as Drug Target - Development of a Screening Assay
for the search for RGS3-Inhibitors
RGS-Proteins shorten the receptor activity of G-protein coupled receptors by
accelerating the hydrolosis of GTP to GDP. An overexpression of RGS-Proteins can
therefore lead to diseases such as Parkinson, chronic heart failure or epilepsy. As a
result substances that inhibit the function of RGS-proteins are searched for.
In this work two proteins that play a major role in the signal transduction cascade,
RGS3 and Gαq, were cloned and inserted into an assay platform, the AlphaScreenAssay. The assay was then established.
A published RGS4-Inhibitor was tested, this substance showed no inhibition of RGS3protein. Other substances, HTS 07963, SCR 01461, HTS 05503 und ChemBridge
6372993, that had been chosen based on the x-ray structure of RGS4 and Gαi were also
tested. They did not show an inhibition of RGS3 either.
7 Literatur
7
72
Literatur
ANGER, T., W. ZHANG u. U. MENDE (2004):
Differential contribution of GTPase activation and effector antagonism to the inhibitory
effect of RGS proteins on Gq-mediated signaling in vivo
J. Biol. Chem. 279: 3906-3915
BELLOSTA, S., N. FERRI, F. BERNINI, R. PAOLETTI u. A. CORSINI (2000):
Non-lipid-related effects of statins.
Ann. Med. 32: 164-176
BENZING, T. E. AL. (2000):
14-3-3 interacts with regulator of G protein signaling proteins and modulates their
activity
J. Biol. Chem. 275: 28167-28172
BERMAN, D. M. u. A. G. GILMAN (1998):
Mammalian RGS proteins: barbarians at the gate
J. Biol. Chem. 273:1269-1272,
BERMAN, D. M., T. M. WILKIE u. A. G. GILMAN (1996):
GAIP and RGS4 are GTPase-activating proteins for the Gi subfamily of G protein alpha
subunits
Cell 86, 445-452,
BERNSTEIN, L. S., M. E. LINDER u. J. R. HEPLER (2004):
Analysis of RGS protein palmitoylation
Methods in Mol. Biol. 237, 195-204
BREITWIESER, G. E. u. G. SZABO (1988):
Mechanism of muscarinic receptor-induced K+ channel activation as revealed by
hydrolysis-resistant GTP analogues
J. Gene. Physiol 91, 469-493,
CABRERA-VERA T.M., J.VANHAUWE., T.O. THOMAS, M. MEDKOVA,
A.PREININGER, M.R.MAZZONI u. H.E. HAMM (2003):
Insights into G Protein Structure, Function, and Regulation
Endocrine Reviews 24, 765-781
CASTRO-FERNANDEZ, C., J. A. JANOVICK, S. P. BROTHERS, R. A. FISHER, T.
H. JI u. P. M. CONN (2002):
Regulation of RGS3 and RGS10 palmitoylation by GnRH
Endocrinology 143, 1310-1317
CHATTERJEE, T. K. u. R. A. FISHER (2000):
Cytoplasmic, nuclear, and golgi localization of RGS proteins. Evidence for N-terminal
and RGS domain sequences as intracellular targeting motifs
J. Biol. Chem. 275, 24013-24021
7 Literatur
73
CUNNINGHAM, M. L., G. L. WALDO, S. HOLLINGER, J. R. HEPLER u. T. K.
HARDEN (2001):
Protein kinase C phosphorylates RGS2 and modulates its capacity for negative
regulation of Galpha 11 signaling
J. Biol. Chem. 276, 5438-5444
DE VRIES, L., M. MOUSLI, A. WURMSER u. M. G. FARQUHAR (1995):
GAIP, a protein that specifically interacts with the trimeric G protein G alpha i3, is a
member of a protein family with a highly conserved core domain
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11916-11920
DEAN, B. (2004):
The neurobiology of bipolar disorder: findings using human postmortem central
nervous system tissue
Aust. N Z J Psychiatry 38, 135-140
DOHLMAN, H. G. u. J. THORNER (1997):
RGS proteins and signaling by heterotrimeric G proteins
J. Biol. Chem. 272, 3871-3874
DOWNES, G. B. u. N. GAUTAM (1999):
The G protein subunit gene families
Genomics 62, 544-552
DRUEY, K. M., K. J. BLUMER, V. H. KANG u. J. H. KEHRL (1996):
Inhibition of G-protein-mediated MAP kinase activation by a new mammalian gene
family
Nature 379: 742-746
DULIN, N. O., P. PRATT, C. TIRUPPATHI, J. NIU, T. VOYNO-YASENETSKAYA
u. M. J. DUNN (2000):
Regulator of G protein signaling RGS3T is localized to the nucleus and induces
apoptosis
J. Biol. Chem. 275, 21317-21323
DULIN, N. O., A. SOROKIN, E. REED, S. ELLIOTT, J. H. KEHRL u. M. J. DUNN
(1999):
RGS3 inhibits G protein-mediated signaling via translocation to the membrane and
binding to Galpha11
Mol. Cel. Biol. 19, 714-723
GILMAN, A. G. (1987):
G proteins: transducers of receptor-generated signals.
Annu. Rev. Biochem. 56, 615-649
GREEN, N. M. u. E. J. TOMS (1973):
The properties of subunits of avidin coupled to sepharose
Biochem. J. 133:, 687-700
7 Literatur
74
HEPLER, J. R., D. M. BERMAN, A. G. GILMAN u. T. KOZASA (1997):
RGS4 and GAIP are GTPase-activating proteins for Gq alpha and block activation of
phospholipase C beta by gamma-thio-GTP-Gq alpha
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 428-432
HEXIMER, S. P., S. P. SRINIVASA, L. S. BERNSTEIN, J. L. BERNARD, M. E.
LINDER, J. R. HEPLER u. K. J. BLUMER (1999):
G protein selectivity is a determinant of RGS2 function
J. Biol. Chem. 274, 34253-34259
HÉNAUT A. u. A.DANCHIN (1996):
Analysis and predictions from Escherichia coli sequences, or E. coli in silico
in NEIDHARDT,F.C. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular
Biology
ASM Press, Washington, DC, Vol. II:, pp. 2047–2066
HOLLINGER, S. u. J. R. HEPLER (2002):
Cellular regulation of RGS proteins: modulators and integrators of G protein signaling.
Pharmacol. Rev. 54, 527-559
HOLLINGER, S. u. J. R. HEPLER (2004):
Methods for measuring RGS protein phosphorylation by G protein-regulated kinases.
Meth. Mol. Biol. 237, 205-219
INGI, T., A. M. KRUMINS, P. CHIDIAC, G. M. BROTHERS, S. CHUNG, B. E.
SNOW, C. A. BARNES, A. A. LANAHAN, D. P. SIDEROVSKI, E. M. ROSS, A. G.
GILMAN u. P. F. WORLEY (1998):
Dynamic regulation of RGS2 suggests a novel mechanism in G-protein signaling and
neuronal plasticity
J. Neurosci. 18, 7178-7188,
ISHII, M. u. Y. KURACHI (2003):
Physiological actions of regulators of G-protein signaling (RGS) proteins.
Life Sci. 74, 163-171
JANOWSKY, D. S., M. K. EL YOUSEF, J. M. DAVIS u. H. J. SEKERKE (1972):
A cholinergic-adrenergic hypothesis of mania and depression
Lancet 2,632-635
JIN, Y., H. ZHONG, J. R. OMNAAS, R. R. NEUBIG u. H. I. MOSBERG (2004):
Structure-based design, synthesis, and pharmacologic evaluation of peptide RGS4
inhibitors
J. Pept. Res. 63, 141-146
KOELLE, M. R. u. H. R. HORVITZ (1996):
EGL-10 regulates G protein signaling in the C. elegans nervous system and shares a
conserved domain with many mammalian proteins
Cell 84, 115-125
LADDS G., GODDARD A., HILL C., THORNTON S. u. DAVEY J. (2007):
Differential effects of Proteins in Galphaq and Galpha1l activity
Cellular Signal. 19, 103-113
7 Literatur
75
NEUBIG, R. R. u. D. P. SIDEROVSKI (2002):
Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.
Nat. Rev. Drug Disc. 1,187-197
PFEUFFER, T. u. E. J. HELMREICH (1988):
Structural and functional relationships of guanosine triphosphate binding proteins.
Curr. Top. Cell. Regul. 29, 129-216
PROUTY, W. F. u. A. L. GOLDBERG (1972):
Fate of abnormal proteins in E. coli accumulation in intracellular granules before
catabolism
Nature New Biol. 240, 147-150
PROUTY, W. F., M. J. KARNOVSKY u. A. L. GOLDBERG (1975):
Degradation of abnormal proteins in Escherichia coli. Formation of protein inclusions in
cells exposed to amino acid analogs
J. Biol. Chem. 250, 1112-1122
ROBBINS, J., S. M. DILWORTH, R. A. LASKEY u. C. DINGWALL (1991):
Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence:
identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence
Cell 64, 615-623
ROSS, E. M. u. T. M. WILKIE (2000):
GTPase-activating proteins for heterotrimeric G proteins: regulators of G protein
signaling (RGS) and RGS-like proteins.
Annu. Rev. Biochem. 69, 795–827
RUDOLPH, R. u. H. LILIE (1996):
In vitro folding of inclusion body proteins.
FASEB J. 10, 49-56
SCHILDKRAUT, J. J. (1965):
The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of supporting evidence
Am. J. Psychiatry 122, 509-522
SIDEROVSKI, D. P., S. P. HEXIMER u. D. R. FORSDYKE (1994):
A human gene encoding a putative basic helix-loop-helix phosphoprotein whose mRNA
increases rapidly in cycloheximide-treated blood mononuclear cells
DNA Cell Biol. 13, 125-147
TESMER, J. J., D. M. BERMAN, A. G. GILMAN u. S. R. SPRANG (1997):
Structure of RGS4 bound to AlF4--activated G(i alpha1): stabilization of the transition
state for GTP hydrolysis
Cell 89, 251-261
TU, Y., S. POPOV, C. SLAUGHTER u. E. M. ROSS (1999):
Palmitoylation of a Conserved Cysteine in the Regulator of G Protein Signaling (RGS)
Domain Modulates the GTPase-activating Activity of RGS4 and RGS10
J. Biol. Chem. 274, 38260-38267
7 Literatur
76
VON LEOPRECHTING A., R. KUMPF, S. MENZEL, D. REULLE, R. GRIEBEL, M.
J. VALLER u. F. H. BÜTTNER (2006):
Miniaturization and validation of a high-throughput serine kinase assay using the
AlphaScreen platform
J. Biomol. Screen. 9, 719-725
VUONG, T. M. u. M. CHABRE (1991):
Deactivation kinetics of the transduction cascade of vision
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9813-9817
YU, J. H., J. WIESER u. T. H. ADAMS (1996):
The Aspergillus FlbA RGS domain protein antagonizes G protein signaling to block
proliferation and allow development
EMBO J. 15, 5184-5190
ZHONG H. u. R.R. NEUBIG (2002):
Regulator of G Protein Signalling: Novel Multifunctional Drug Target
J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 837-845
8 Danksagung
77
8. Danksagung
Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Hassan Naim für die Ermöglichung
dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Dr. Dietrich Otto van Calker danke ich für die Überlassung des Themas
und die bereitwillige Aufnahme in seine Arbeitsgruppe.
Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Frank Willmroth für die umfassende Betreuung und für
konstruktive Diskussionen und Kritik während der Erstellung dieser Arbeit.
Frau Ritva Atmanspacher und Herrn Till Eusemann danke ich für die tatkräftige sowie
mentale Unterstützung während der Laborarbeiten.
Ich danke außerdem Herrn Prof. Dr. Manfred Jung und seiner gesamten Arbeitgruppe
für die Hilfe und Ratschläge. Ich habe mich bei Euch wohl gefühlt!
Und nicht zu vergessen sei meine Familie, die mich immer unterstützt hat.