Immunologie: 2 - Universitätsklinikum Heidelberg

Signale der T-Zellaktivierung als Angriffspunkte für die therapeutische Induktion bzw. Durchbrechung von Toleranz
Kostimulatorische Signale der T-Zellaktivierung als Angriffspunkte für die therapeutische
Induktion bzw. Durchbrechung von Toleranz
Die Aktivierung von T-Lymphozyten spielt bei Entzündungsreaktionen und bei Transplantatabstoßungen eine
zentrale Rolle. Sie erfordert, dass neben dem Antigen-Erkennungssignal über den T-Zellrezeptor (TZR)
kostimulatorische Signale über akzessorische Rezeptoren wie CD2 oder CD28 ausgelöst werden (13).
Antigenerkennung ohne kostimulatorische Signale ist kein neutrales Ereignis für T-Zellen, sondern führt zu
einer antigenspezifischen Unreaktivität (Anergie). Dies ist einer der Mechanismen, die dazu führen, dass
T-Lymphozyten sich nicht gegen körpereigene Strukturen richten. Kostimulatorische Signale stellen somit
interessante Zielstrukturen für neue Strategien zur Immunmodulation dar.
Kostimulatorische Signale werden in vivo durch Bindung akzessorischer Rezeptoren an ihre Liganden (CD80,
CD86 und CD58) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) ausgelöst. Während der Aktivierung von
T-Zellen durch APZ wird an der Kontaktzone eine komplexe Struktur ausgebildet. Analog zu neuronalen
Synapsen wurde diese Struktur als reife ?Immunologische Synapse? (IS) bezeichnet (Abb.1). Sie besteht aus
einem inneren Aktivierungsbereich, cSMAC (engl. central supramolecular activation cluster), in dem sich der
TZR, der akzessorische Rezeptor CD28, sowie die Protein Kinase C ? (PKC?) anreichern und einem
umliegenden Adhäsionsring, pSMAC (engl. peripheral SMAC), in dem LFA-1, CD2 sowie der
Membrananker Talin lokalisiert sind. Rezeptoren mit einem großen extrazellulären Bereich, wie die
Tyrosin-Phosphatase CD45, befinden sich in einem Bereich außerhalb des pSMACs. Dieser Bereich wird als
dSMAC (engl. distal SMAC) bezeichnet. Unklar ist bisher noch, wie die hoch-organisierte Ring-Struktur in
der Synapse entsteht. Sicher ist, dass sowohl Kostimulation als auch ein dynamisch funktionierendes
Aktin-Zytoskelett dafür notwendig sind. Das Aktin-Zytoskelett wird bei einem APZ-Kontakt an die
Kontaktzone zwischen den Zellen verlagert. Wenn die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts durch
Cytochalasin, eine Substanz, welche die Aktin-Polymerisierung inhibiert, gestört wird, kann sich keine reife
IS ausbilden. Es gibt erste Hinweise darauf, dass die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts durch
T-Zell-Kostimulation gesteuert wird.
Abb. 1
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Abb. 1
Abb. 1: Die immunologische Synapse
Als Immunologische Synapse (IS) wird die Kontaktzone zwischen der T-Zelle und der Antigenpräsentierenden Zelle (APZ: Dendritische Zelle oder
B-Zelle) bezeichnet. In einem Querschnitt durch die Kontaktzone sind in der reifen IS drei in konzentrischen Kreisen aufgebaute Zonen zu
unterscheiden. Der innere Kreis (central supramolecular activation cluster (cSMAC)) besteht aus einem zentralen Aktivierungskluster, in dem
TZR/CD3, CD28 und PKC theta lokalisiert sind. Der periphere Adhäsionsring (peripheral SMAC oder pSMAC) enthält die Adhäsionsmolekule CD2
und LFA-1. Im äußersten Ring (distal SMAC oder dSMAC) befinden sich große Moleküle, wie CD45 und CD43. Für die Ausbildung dieser
Proteinkluster sind sowohl ein intaktes Zytoskelett, als auch T-Zell Kostimulation unabdingbar.
Die (pharmakologische) Ausschaltung kostimulatorischer Signale eröffnet Perspektiven, um einerseits die
Akzeptanz von Organtransplantaten zu erhöhen und andererseits chronisch entzündliche / autoreaktive
Prozesse zu unterdrücken. Ein gezielter Einsatz solcher Strategien für die klinische Immunmodulation würde
vom Verständnis der molekularen Grundlagen kostimulatorischer Signale erheblich profitieren. Unser Ziel
besteht darin, intrazelluläre Moleküle, die kostimulatorische Signale vermitteln, zu identifizieren und ihre
regulatorischen Enzyme zu charakterisieren. Anschließend sollen Ansätze entwickelt werden, um die
Funktion dieser Moleküle in T-Lymphozyten zu blockieren.
Bedeutung des Aktin-bindenden Proteins Cofilin für die Aktivierung menschlicher
T-Lymphozyten
Wir haben kostimulatorische Signalübertragungswege identifiziert, die für die Ausbildung der
immunologischen Synapse zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen, sowie die
T-Zell-Aktivierung essentiell sind. Einer dieser Signalwege führt zur Dephosphorylierung und Aktivierung
des Aktin-Zytoskelett-Regulators Cofilin (7, 11, 16). Über konfokale Laserscanning-Mikroskopie konnten wir
zeigen, dass sich Cofilin im pSMAC der immunologischen Synapse anreichert (Abb. 2). Durch Zerschneiden
(Severing) und Depolymerisieren von Aktinfilamenten ermöglicht Cofilin einen dynamischen Umbau des
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Bedeutung des Aktin-bindenden Proteins Cofilin für die Aktivierung menschlicherT-Lymphozyten
Aktinzytoskeletts (13). Wenn die Aktin-Bindefähigkeit dieses Proteins durch Einschleusen zellpermeabler
Peptid-Homologe in vivo blockiert wird, bildet sich keine reife IS aus und die Aktivierung der
T-Lymphozyten sowie die Produktion von Zytokinen sind signifikant gestört (11).
Abb. 2
Abb. 2: Cofilin reichert sich im pSMAC der Immunologischen Synapse an
Humane T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBT) wurden mit Superantigen-beladenen Raji B-Zellen stimuliert (SEB/SEF) oder mit
unbeladenen Raji B-Zellen inkubiert (no Ag). Nach Fixierung wurde Cofilin in grün (Cy2) und CD3 in rot (Cy3) mit entsprechenden Antikörpern
angefärbt. Der Overlay zeigt die Überlagerung beider Färbungen. Bei Antigenstimulation (SEB/SEF) reichert sich der antigenspezifische
TZR/CD3-Komplex im c-SMAC, Cofilin im p-SMAC an.
Ziel dieses Projektes ist es nun, die Regulation der für die Cofilin-Dephosphorylierung und Aktivierung
verantwortlichen Phosphatasen (z.B. PP1 und PP2A (9, 10, 12, 14)) zu charakterisieren. Desweiteren soll die
Beeinflussung von Cofilin durch Veränderungen des Redox-Milieus und deren Auswirkung auf die
Kostimulation, Adhäsion und Migration von T-Lymphozyten untersucht werden. Hierdurch hoffen wir, neue
Angriffspunkte für die therapeutische Immunmodulation zu identifizieren.
Bedeutung des Aktin-bündelnden Proteins L-Plastin für die Aktivierung menschlicher
T-Lymphozyten
Auf der Suche nach Funktionsmolekülen, die selektiv über akzessorische Rezeptoren reguliert werden (s.o.),
haben wir ein weiteres interessantes Molekül identifiziert: das Aktin-bündelnde Protein, L-Plastin. Über
konfokale Laserscanning-Mikroskopie (Abb. 3) und Time-Lapse-Video-Mikroskopie (Abb. 4) konnten wir
zeigen, dass L-Plastin innerhalb von Sekunden nach Kontakt mit einer Antigenpräsentierenden Zelle an die
Immunologische Synapse verlagert wird (1). L-Plastin wird nach Kostimulation am Serin-5 phosphoryliert.
Diese Phosphorylierung ist wichtig für die Aktivierung der T-Lymphozyten. Expression einer
nicht-phosphorylierbaren Mutante von L-Plastin in untransformierten menschlichen T-Lymphozyten aus dem
Blut hat interessanterweise einen dominant negativen (d.h. immunsuppressiven) Effekt auf die
T-Zellaktivierung (1). Daher könnten L-Plastin und/oder die Kinasen, die für die L-Plastin Phosphorylierung
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Bedeutung des Aktin-bündelnden Proteins L-Plastin für die Aktivierung menschlicherT-Lymphozyten
verantwortlich sind, ebenfalls interessante Targets für neue Immunsuppressiva darstellen.
Abb. 3
Abb. 3: L-Plastin reichert sich Superantigen-abhängig in den äußeren Bereichen der Kontaktzone zwischen T-Zellen und APZ an
Humane T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBT) wurden mit Superantigen-beladenen Raji B-Zellen stimuliert. Nach Fixierung wurde
L-Plastin in grün (Cy2) und CD3 in rot (Cy3) mit entsprechenden Antikörpern angefärbt. Die Überlagerung zeigt beide Färbungen. Bei
Antigenstimulation (SEB/SEF) reichert sich der antigenspezifische TZR/CD3-Komplex im c-SMAC und L-Plastin im p-SMAC und d-SMAC der
Immunologischen Synapse an.
Abb. 4 (VIDEO.avi)
Abb. 4 (Film): L-Plastin Dynamik in Zell-Kontakten zwischen PBT und Raji B-Zellen
Über Transfektion von cDNA wurde grün fluoreszierendes L-Plastin-EGFP in humanen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBT) exprimiert.
Anschließend wurden die PBT mit Superantigen-beladenen Raji B-Zellen (APZ) auf Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern inkubiert. Die
Ausbildung der Immunologischen Synapse wurde über Time-Lapse-Videomikroskopie dokumentiert. Für diesen Film wurden im Abstand von 18
Sekunden je ein Digitaler Interferenz Kontrast (DIC, oben) und ein Fluoreszenzbild (unten) aufgenommen. L-Plastin (in Falschfarben dargestellt)
verlagert sich innerhalb von Sekunden an die Kontaktstelle mit der APZ.
Eine dynamische Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts ist für eine Vielzahl von T-Zellfunktionen wichtig
(13). Wie oben beschrieben, übernimmt das Aktin-Zytoskelett eine wichtige Funktion bei der Stabilisierung
der immunologischen Synapse, d.h. bei der initialen Antigenerkennung. Außerdem ist die Reorganisation des
Aktin-Zytoskeletts ein essentieller Bestandteil von Prozessen, die das Zellwachstum (klonale Expansion
antigenspezifischer T-Lymphozyten) und die Zellmigration (Homing) steuern. Ziel dieses Projektes ist es, die
Bedeutung von L-Plastin für die Funktion der Immunologischen Synapse und die T-Zell-Migration zu klären.
Dazu soll die Expression von L-Plastin in menschlichen T-Lymphozyten durch siRNA-Ansätze gezielt
blockiert werden. Außerdem werden wir die Signalübertragungsvorgänge, die die Funktion von L-Plastin
steuern, charakterisieren. Wir erhoffen uns, durch Eingriffe in diesen kostimulatorischen Signalweg
antigenspezifische Unreaktivität induzieren zu können und das Wachstums- und Migrationsverhalten von
T-Lymphozyten zu beeinflussen.
Kooperationspartner:
University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa City, USA (Prof. Strack)
University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, USA (Prof. Brautigan)
Abteilung Medizinische Biochemie, Med. Universität Wien, Österreich (Dr. Ogris)
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Kooperationspartner:
Dep. Molecular Cell Biology, Faculty of Medicine, KULeuven, Belgien (Prof. Bollen)
Firma Novartis, Basel, Schweiz (Dr. Patel, Dr. Scharrer)
Universität Düsseldorf, Deutschland (Dr. Gohla)
Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, Deutschland (Prof. Arnold)
Finanzierung:
SFB 405 (Immuntoleranz und ihre Störungen), Projekt A4
DFG-Einzelantrag (SA 393/ 3-3)
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