Samuel Koller Diss 20333 - ETH E

DISS. ETH NO. 20333
KINASE-DEPENDENT AND KINASE-INDEPENDENT FUNCTIONS OF
G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR KINASE 2 (GRK2)
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
SAMUEL DAVID KOLLER
Dipl. Natw. ETH
born on December 15th,1979
citizen of Appenzell AI
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ursula Quitterer, examiner
Prof. Dr. Jonathan Hall, co-examiner
2012
2 Summary
Knowledge of the regulation of G-protein-coupled receptor (GPCR) signalling is crucial in
view of understanding diseases and to develop drugs against them. In the year 2000, about
50% of all modern drugs and around 25% of the top 200 best-selling drugs targeted GPCR
signalling. G-protein coupled receptor kinases (GRKs) are one of the key regulators of GPCR
signalling: GRKs recognize and phosphorylate specifically activated GPCRs. This leads to a
desensitization of the GPCR. GRKs are divided into three families. The visual GRKs (GRK1
and GRK7), the β-adrenergic receptor kinases (GRK2 and GRK3), and the GRK4 subfamily
(GRK4, GRK5 and GRK6).
GRK2 is ubiquitously expressed and one of the most intensively studied GRKs. It was shown
that dysregulation of GRK2 promotes disorders such as heart failure or hypertension.
Furthermore, mice lacking the gene are not viable, indicating its role in cell proliferation and
growth. The underlying mechanisms however are less clear. In recent years, several
publications indicated a more diverse role of GRK2 besides phosphorylation of activated
GPCR.
In the presented study, by using a dominant negative mutant of GRK2 (GRK2-K220R)
kinase-dependent and kinase-independent functions of GRK2 were deciphered.
The impact of GRK2 on GPCR-induced Gα-mediated signalling was investigated in HEK
cells. It was shown that calcium signalling of activated Gq-coupled GPCRs such as
bradykinin B2 receptor (B2R), lysophatidic acid type 1 receptor (LPA1R), and angiotensin II
receptor type 1 (AT1R) was reduced by both GRK2 and GRK2-K220R. This indicates a
kinase-independent signal inhibition by GRK2. In addition, inhibition of signalling was
dependent on GRK expression levels. Knock-down of GRK2 or GRK2-K220R in cells stably
expressing those genes partially reversed the calcium-signal inhibition.
In addition to Gαq-stimulated calcium signalling, Gβγ-mediated calcium signalling that is
induced by stimulation of Gi-coupled GPCR such as dopamine D2 receptor (D2R), was also
kinase-independently reduced by GRK2.
A GRK2 mutant, GRK2-D110A, unable to bind Gαq, was shown to reduce receptor-induced
calcium signalling of Gq-coupled AT1R, B2R, and LPA1R but was less efficient than GRK2
or GRK2-K220R. In contrast, Gβγ-mediated calcium signalling of D2R was equally reduced
5
by GRK2-D110A, GRK2, and GRK2-K220R. Taken together, this indicates that the observed
kinase-independent dampening of Gαq-mediated calcium signalling was only partially
dependent on GRK2-Gαq sequestration.
GRK3 and GRK2 have 84% protein sequence identity. Taken conservative substitutions into
account their sequences are 93% identical. In fact, GRK3 showed similar kinase-independent
reduction of B2R-mediated calcium signalling as GRK2. In addition, this reduction was also
dependent on GRK3 expression level.
To analyze kinase-dependent effects of GRK2, the binding of β-arrestin to the activated B2R
was investigated. The B2R-β-arrestin interaction is dependent on the kinase activity of GRK2
because phosphorylation of the activated GPCR by GRK is a prerequisite for GPCRβ-arrestin interaction. Only 10 min after stimulation, binding of β-arrestin to activated B2R
could be detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) in cells expressing either
endogenous or exogenous GRK2. In contrast, no binding of β-arrestin was detected in cells
co-expressing exogenous GRK2-K220R, indicating that GRK2-K220R is a dominant negative
mutant as previously suggested with isolated proteins.
To further investigate the kinase function of GRK2, an in vivo cell expansion model was used,
and HEK or A431 cells expressing either GRK2 or GRK2-K220R were expanded in
immunodeficient NOD/SCID mice. Interestingly, both HEK and A431 tumours expressing
GRK2-K220R showed an enhanced proliferation compared to control or GRK2-expressing
tumours whereas no change in proliferation of GRK2 or GRK2-K220R expressing HEK cells
was detected under in vitro cell cultivation. This indicates that the kinase function of GRK2 is
involved in cell proliferation signalling or growth control in vivo. In fact, whole genome
microarray gene expression analysis of in vitro cultured and in vivo expanded HEK cells
revealed an up-regulation of MAPK pathway related genes in in vivo expanded HEK tumours
expressing dominant negative GRK2-K220R. Within the MAPK pathway, FOS was found to
be up-regulated. In agreement with MAPK activation, nuclear p-ERK1/2 levels were
increased in GRK2-K220R expressing HEK tumours. Similarly, in A431 tumours expressing
GRK2-K220R an increased expression of FOS was detected by qRT-PCR.
For comparison, expression of fibronectin was reduced in in vitro cultivated and in vivo
expanded HEK cells expressing GRK2.
6
Taken together it was shown in the presented study that Gq- and Gi-mediated calcium
signalling of GPCR seems to be kinase-independently influenced by GRK2 whereas
β-arrestin binding and cell proliferation in vivo seems to be kinase-dependent. A novel model
has been established that reveals GRK2-mediated cell proliferation control.
Knowledge of kinase function involvement in cell proliferation is of enormous relevance as
several GRK2-kinase specific inhibitors are in preclinical test for treatment of human heart
failure.
7
3 Zusammenfassung
Erkenntnisse über die Regulierung der Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
(GPCR) sind von enormer Bedeutung im Hinblick auf das Verständnis von Krankheiten und
die Entwicklung von Medikamenten. Ungefähr 50% aller modernen Medikamente und etwa
25% der 200 bestverkauften Arzneimittel modulieren die GPCR-Aktivität (Stand 2000).
G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK) sind wichtige Regulatoren im GPCR
vermittelten Signalweg: GRK erkennen und phosphorylieren aktivierte GPCR, was zu einer
Desensibilisierung der Rezeptoren führt. GRK können in drei Familien unterteilt werden: Die
visuellen GRK (GRK1 und GRK7), die β-Adrenergen Rezeptorkinasen (GRK2 und GRK3)
und die GRK4-Unterfamilie (GRK4, GRK5 und GRK6).
GRK2 wird ubiquitär exprimiert und ist eine der am intensivsten untersuchten GRK. Es
konnte gezeigt werden, das eine Dysregulation von GRK2 zu Krankheiten wie
Herzinsuffizienz und Hypertonie führen kann. Des Weiteren sind Mäuse, denen das GRK2
Gen fehlt, nicht lebensfähig, was auf eine wichtige Rolle von GRK2 in der Zellteilung und
dem Zellwachstum hindeutet. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind aber noch nicht
vollständig aufgeklärt. In den letzten Jahren zeigten mehrere Publikationen, dass GRK2 eine
vielfältigere Rolle hat, als nur die Phosphorylierung von aktivierten GPCR.
In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe einer dominant-negativen Mutante von GRK2
(GRK2-K220R) Kinase-abhängige und Kinase-unabhängige Funktionen von GRK2
untersucht.
Die Bedeutung von GRK2 in der GPCR-induzierten, Gα-vermittelten Signaltransduktion
wurde in HEK Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Kalziumsignale von
Gq-gekoppelten aktivierten GPCR wie Bradykinin B2 Rezeptor (B2R), Lysophophatidsäure
Typ 1 Rezeptor (LPA1R) und Angiotensin II Typ 1 Rezeptor (AT1R) durch GRK2 und
GRK2-K220R reduziert wurden. Das zeigt eine Kinase-unabhängige Signalinhibition durch
GRK2. Zudem war die Signalinhibition abhängig vom Expressionsniveau der GRK2. Die
Reduktion der Expression von GRK2 oder GRK2-K220R in Zellen, die diese Gene stabil
exprimieren, führte zu einer teilweisen Aufhebung der Inhibition.
Zusätzlich zu dem Gαq stimulierten Kalziumsignalen wurde ein Gβγ-vermitteltes
Kalziumsignal untersucht. Es wird durch die Stimulierung von Gi-gekoppelten GPCR, wie
8
dem Dopamin D2 Rezeptor (D2R), induziert und scheint auch Kinase-unabhängig von GRK2
reduziert zu werden.
Eine weitere GRK2-Mutante, GRK2-D110A, die Gαq nicht binden kann, reduzierte ebenfalls
das Rezeptor-induzierte Kalziumsignal von Gq-gekoppelten AT1R, B2R und LPA1R, aber
weniger effizient als GRK2 oder GRK2-K220R. Im Gegensatz dazu wurde das
Gβγ-vermittelte Kalziumsignal des D2R in der gleichen Grössenordnung durch GRK2D110A, GRK2 und GRK2-K220R reduziert. Zusammengefasst zeigt dies, dass die
beobachten Kinase-unabhängige Reduktion von Gαq-vermittelten Kalziumsignalen nur
teilweise von der Sequestrierung von Gαq durch GRK2 abhängig ist.
GRK3 und GRK2 haben eine zu 84% identische Proteinsequenz. Werden konservative
Substitutionen in Betracht gezogen sind sie zu 93% identisch. Tatsächlich zeigt GRK3 eine
ähnliche Kinase-unabhänige Reduktion des B2R-vermittelten Kalziumsignals wie GRK2. Des
Weiteren war die Reduktion, wie im Fall der GRK2, abhängig vom Expressionsniveau von
GRK3.
Um Kinase-abhängige Effekte von GRK2 zu analysieren, wurde die Bindung von β-Arrestin
an den aktivierten Rezeptor untersucht. Die B2R-β-Arrestin Interaktion ist von der
Kinaseaktivität der GRK2 abhängig, weil die Phosphorylierung des GPCR durch GRK eine
Grundvoraussetzung für eine GPCR-β-Arrestin Interaktion ist. In Zellen die entweder
endogen oder exogen GRK2 exprimieren, konnte 10 Minuten nach Stimulation die Bindung
von β-Arrestin an den aktivierten B2R mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
(FRET) nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte in Zellen die exogen
GRK2-K220R ko-exprimieren keine Bindung von β-Arrestin nachgewiesen werden. Dies
zeigt, dass GRK2-K220R eine dominant-negative Mutante ist, was bereits zuvor mit isolierten
Proteinen gezeigt werden konnte.
Die Kinase-Funktion von GRK2 wurde zusätzlich mittels einem in vivo ZellexpansionsModell untersucht. Dazu wurden HEK beziehungsweise A431 Zellen, die entweder GRK2
oder GRK2-K220R stabil exprimieren in immunodefiziente NOD/SCID Mäusen implantiert.
Interessanterweise zeigten Tumore von HEK und A431 Zellen, die GRK2-K220R
exprimieren, eine höhere Proliferation im Vergleich zu Kontroll- oder GRK2-exprimierenden
Tumoren. Hingegen konnte kein Unterschied in der Proliferation von GRK2 oder
GRK2-K220R exprimierenden HEK Zellen in vitro festgestellt werden. Dies deutet darauf
9
hin, dass die Kinase-Funktion der GRK2 in die Signaltransduktion der Zellproliferation oder
in die Mechanismen der Wachstumskontrolle involviert ist. Bestätig wurde die Annahme
durch Gesamt-Genom Microarray Gen Expressionsanalysen von in vitro kultivierten und in
vivo expandierten HEK Zellen. Diese zeigten in Tumoren, die GRK2-K220R exprimieren,
eine erhöhte Expression von Genen, die in den MAPK Signalweg involviert sind. Zu diesen
gehörte auch Gen FOS. In Übereinstimmung mit der MAPK Aktivierung konnte im Kern von
GRK2-K220R exprimierenden Tumorzellen, eine erhöhte Konzentration von p-ERK1/2
festgestellt werden. Ebenso konnten in A431 Tumoren, die GRK2-K220R exprimieren, eine
erhöhte Expression von FOS mittels qRT-PCR nachgewiesen werden.
Weiter konnte gezeigt werden, dass die Expression von Fibronektin in in vitro kultivierten
und in vivo expandierten HEK Zellen, die GRK2 exprimieren, im Vergleich zu GRK2-K220R
exprimierenden Zellen reduziert war.
Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass das Gq- und
Gi-vermittelte Kalziumsignal von GPCR scheinbar auch Kinase-unabhängig von GRK2
beeinflusst wird, wobei die β-Arrestin-Bindung an den aktivierten Rezeptor und die
Zellproliferation im Gegensatz dazu Kinase-abhängig sind. Zudem wurde ein neuartiges
Modell etabliert, das die GRK2-vermittelte Kontrolle der Zellproliferations zeigt.
Erkenntnisse über den Einfluss der Kinase-Funktion in der Zellproliferation sind von enormer
Bedeutung, da diverse GRK2-Kinase spezifische Inhibitoren in vorklinischen Tests zur
Behandlung von Herzinsuffizienz sind.
10