Insights into novel caveolar proteins: The - ETH E

Diss. ETH No 20796
Insights into novel caveolar proteins:
The ATPase EHD2 confines caveolae
to the plasma membrane
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
MIRIAM CAROLIN STÖBER
Dipl. Biotech. Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg (ESBS)
born April 22nd, 1984
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ari Helenius, examiner
Prof. Dr. Ulrike Kutay, co-examiner
Prof. Dr. Gisou van der Goot, co-examiner
2012
Summary
Caveolae are small membrane invaginations at the surface of most mammalian cell types. They function in various cellular processes including
membrane and lipid regulation, signaling, and endocytosis. On a molecular level, caveolae consist of a membrane bilayer enriched in cholesterol and
sphingolipids and two known protein components at their cytosolic face, the
caveolins and the cavins. Caveolins are integral membrane proteins that stably associate with each other and cholesterol. These assemblies represent
protein-lipid scaffolds that form the organizing principle of caveolae. Cavins
peripherally bind the caveolar scaffolds and provide an additional protein
layer that stabilizes caveolae and maintains their curved morphology.
Under steady-state conditions, most caveolae are static structures in the
plasma membrane, likely confined by components of the actin cytoskeleton.
Through external or internal stimuli caveolae can be activated to undergo
internalization and carry cargo from the plasma membrane to early endosomes. The caveolar coat is a stable, long-lived structure that does not undergo rounds of assembly and disassembly during vesicular transport. The
cellular functions of caveolae have been assigned to both, stationary caveolar
domains and motile caveolar carriers.
The aim of this thesis was to gain molecular and mechanistic insights into
novel regulatory proteins present at caveolae.
In the first results part of this thesis, Chapter 2, we biochemically characterize a large oligomeric complex composed of cavin proteins. We show that
this protein complex forms independently of caveolae, has a well defined size,
and contains several cavin familiy members. Using a live-cell microscopy approach, we temporally dissect that the association of cavins with caveolae
occurs shortly after plasma membrane insertion of newly formed caveolin-1
(CAV1) domains.
Investigations on the degradation of caveolae in the endo/lysosomal system are presented in Chapter 3. Our findings show that turn-over of CAV1
depends on its ubiquitination and that sorting of CAV1 into the lumen of
maturing endosomes requires the ESCRT machinery. Fluorescently tagged
iii
iv
cavin proteins are found together with CAV1 domains at early endosomes
but are absent from late endosomes, indicating that they detach from the
degrading caveolar scaffold at this late step of the caveolar life-cycle.
In Chapter 4, we identify the ATPase EHD2 as a novel caveolar protein
that critically controls caveolar dynamics. We show that EHD2 is a major
component of static caveolae in various cell lines. Analyses of the cellular
localization and biochemical properties of several EHD2 mutants uncover a
progressive series of events that lead to the formation of EHD2 complexes,
and the subsequent association of these complexes with caveolae. We find
that EHD2, in contrast to the cavin proteins, undergoes dynamic exchange
at caveolae, a process that depends on a functional ATPase cycle. Depletion
of EHD2 by siRNA, or expression of a dominant-negative mutant of EHD2,
dramatically increases the fraction of motile caveolar vesicles trafficking from
the plasma membrane. Overexpression of EHD2, in turn, causes retention
of caveolar cargo in static caveolae. Our results indicate that EHD2 confines
caveolae to the plasma membrane, likely by mediating an immobilizing link
to actin filaments.
Finally we present several approaches and methods to study the structure
of isolated caveolar complexes and caveolae in their cellular environment
(Chapter 5).
Zusammenfassung
Caveolae sind 50 bis 80 Nanometer grosse Membraneinstülpungen in der
Oberfläche der meisten Säugetier-Zellen. Diese Strukturen spielen in vielen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle, unter anderem in Lipid- und
Membranregulierung, Signaltransduktion und Endozytose. Auf molekularer
Ebene bestehen Caveolae aus einer Lipid-Doppelschicht, die einen hohen Gehalt an Cholesterin und Sphinglipiden aufweist, und aus Proteinen zweier
Proteinfamilien, den Caveolin und Cavin Proteinen. Caveoline sind integrale
Membranproteine auf der zytosolischen Seite der Caveolae, die sich zu einer
Proteinhülle assemblieren und mit Cholesterin interagieren. Diese ProteinLipid Einheit stellt das Grundgerüst der Caveolae dar. Cavin Proteine binden an dieses stabile Gerüst und bilden eine zusätzliche Proteinschicht, die
Caveolae in ihrer eingestülpten Form stabilisiert.
Unter Standardbedingungen sind die meisten Caveolae statische Strukturen in der Plasmamembran. Sie werden wahrscheinlich von Komponenten des
Aktin-Zytoskeletts immobilisiert. Durch äussere und innere Stimuli können
Caveolae aktiviert werden und sich daraufhin ins Innere der Zelle abschnüren.
Über diesen Weg kann Transportgut von der Plasmamembran zu Endosomen
gelangen. Die Proteinhülle der Caveolae ist sehr stabil und hat eine lange Lebensdauer. Während vesikulärem Transport durchläuft sie keinen zyklischen
Auf- und Abbau. Caveolae übernehmen zelluläre Funktionen sowohl als statische Strukturen, als auch als bewegliche Vesikel.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war es neu identifizierte Proteine, die an
Caveolae binden und Caveolae regulieren, auf molekularer und mechanischer
Ebene zu untersuchen.
Im ersten Ergebnisteil (Kapitel 2) untersuchen wir mit biochemischen Methoden einen grossen Proteinkomplex, der aus Cavin Proteinen zusammengesetzt ist. Wir zeigen, dass sich dieses Oligomer unabhängig von Caveolae
bildet, eine charakteristische Grösse besitzt und verschiedene Cavine beinhaltet. Durch Mikroskopiestudien an lebenden Zellen können wir aufzeigen,
dass Cavin Proteine erst an Caveolae binden, kurz nachdem neue Caveolin-1
(CAV1)-Domänen an die Plasmamembrane transportiert worden sind.
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vi
Unsere Forschungsergebnisse über den Abbau von Caveolae im endosomalen und lysosomalen System werden in Kapitel 3 dargestellt. Die Resultate
zeigen, dass CAV1 für effizienten Abbau ubiquitiniert werden muss und dass
der Eintritt von CAV1 in das angesäuerte Lumen von endosomalen Organellen die ESCRT Maschinerie benötigt. Da wir fluoreszierende Fusionsproteine
von Cavinen an frühen, nicht aber an reiferen, späten Endosomen beobachten können, folgern wir, dass sich Cavine an diesem Punkt des Lebenszyklus
von Caveolae loslösen.
Im Kapitel 4 identifizieren wir die ATPase EHD2 als ein neuartiges Protein, dass sich an Caveolae befindet, und die Beweglichkeit von Caveolae
massgeblich kontrolliert. Wir zeigen, dass EHD2 in verschiedenen Zelllinen
einen Hauptbestandteil der statischen Caveolae darstellt. Durch Analysen
der zellulären Lokalisierung und der biochemischen Eigenschafen einer Reihe
von EHD2 Mutanten können wir einen molekularen Ablauf aufdecken, der
zur Bildung von EHD2 Komplexen und anschliessend zur Bindung an Caveolae führt. Zusätzlich haben wir herausgefunden, dass EHD2 Moleküle an
Caveolae einen ständigen, dynamischen Austausch durchlaufen, der von ihrer ATPase Funktion abhängt und einen Gegensatz zu den fest gebundenen
Cavin Proteinen darstellt. Knock-down von zellulärem EHD2 mittels RNA
Interferenz, oder Expression einer dominant-negativen EHD2 Mutante, führt
zu einem drastischen Anstieg von Caveolae, die sich als Vesikel durch die Zelle
bewegen. Überexpression von wild-typ EHD2 hingegen verursacht die Immobilisierung von Transportgut in statischen Caveolae in der Plasmamembran.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass EHD2 Caveolae an der Zelloberfläche festhält,
was wahrscheinlich durch eine Verbindung zu Aktinfilamenten gewährleistet
wird.
Im letzten Ergebnisteil (Kapitel 5) stellen wir mehrere Methoden vor, um
die Struktur von aufgereinigten Caveolae oder Caveolae in ihrem zellulären
Kontext zu untersuchen.