Functional Characterization of Native and recombinant Transient

Conclusion
TRPM8 C terminus mediated. In contrast to the loss of the ability to activate Gαq, the
effect of inhibition of TRPM8 by Gαq was conserved in both receptor chimeras.
In summary, the findings of this doctoral thesis provide insight into the activation- and
modulation-behavior of TRPM8, especially cTRPM8. The findings shed more light on
gating mechanisms in dependence on varying primary protein structures between
different species which may be of relevance for medical research due to the
involvement of TRPM8 in different diseases, such as prostate cancer.
7.2 Zusammenfassung
Der TRPM8 Ionenkanal ist maßgeblich an der Wahrnehmung von moderat kühlen bis
schmerzhaft kalten Temperaturen beteiligt. Er wird in sensorischen Neuronen des
trigeminalen Ganglions und der dorsalen Hinterwurzelganglien exprimiert. Neben
thermischen Reizen kann er auch durch eine große Anzahl an natürlichen und
synthetischen Liganden, wie Menthol, Icilin oder PIP2 aktiviert werden. Sowohl die
Aktivierung durch Temperatur, wie auch die Aktivierung durch Menthol werden über
spannungsabhängige Öffnungsmechanismen des Kanals vermittelt. Außerdem wird
die Funktionalität des TRPM8 durch eine Vielzahl an intrazellulären Proteinen
moduliert, wie z.B. der PKC, der PKA oder Pirt. Des Weiteren haben aktuelle Studien
gezeigt, dass eine Interaktion des TRPM8 mit dem Gαq Protein möglich ist, welche
zu einer Inhibierung der Aktivität des TRPM8 führt.
Der Fokus dieser Doktorarbeit lag auf einer funktionellen Charakterisierung des
Aktivierungsverhaltens des TRPM8 Ionenkanals des Huhns (cTRPM8) im Vergleich
zu dem der Maus (mTRPM8). Die Körperkerntemperatur von Vögeln ist mit 39°C um
zwei Grad höher als die von Säugetieren (37°C). Während die Funktionalität, die
Aktivierung und die Modulation des TRPM8 Ionenkanals der Säugetiere sehr gut
charakterisiert sind, ist nur wenig über den orthologen TRPM8 Ionenkanal anderer
Spezies bekannt. Deswegen sollte in dieser Studie erforscht werden, in wie weit ein
Unterschied in der Körperkerntemperatur Einfluss auf die Aktivierung und Modulation
des thermosensitiven TRPM8 Kanals hat. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die
Aktivierungstemperatur des TRPM8 des Huhns annähernd 4°C höher war als die der
Maus. Zudem haben Versuche im Kalzium-imaging einen signifikant geringeren
Kalziumeinstrom in cTRPM8- im Vergleich zu mTRPM8-exprimierenden Zellen
110
Conclusion
ergeben. Außerdem wurden in cTRPM8-exprimierenden Zellen zwei Antwortmuster
auf die Stimulation durch Kälte (18°C) entdeckt. Eine Zellpopulation reagierte mit
einem Ca2+-Anstieg, die andere Zellpopulation mit einer Ca2+-Abnahme im Zytosol.
Diese Unterschiede des temperaturvermittelten Aktivierungsverhaltens zwischen
cTRPM8 und mTRPM8 könnten in Zusammenhang mit einer Punktmutation der
Aminosäure Glutamin an der Stelle 856 der Aminosäuresequenz des mTRPM8 zu
Lysin 847 der Aminosäuresequenz des cTRPM8 stehen. Es ist bekannt, dass diese
Aminosäure an der temperaturvermittelten Aktivierung des TRPM8 in Säugetieren
beteiligt ist.
Neben der Charakterisierung der temperaturvermittelten Kanalaktivierung war die
Untersuchung des Menthol-vermittelten Aktivierungsverhaltens des cTRPM8 ein
weiteres Ziel der vorliegenden Doktorarbeit. Kalzium-imaging Experimente zeigten
eine signifikant kleinere Zunahme der zytosolischen Kalziumkonzentration nach
Stimulation durch Menthol in cTRPM8- im Vergleich zu mTRPM8-exprimierenden
Zellen. Des Weiteren hat eine Ermittlung des Menthol-vermittelten KonzentrationsWirkungs-Verhältnisses kleinere EC50-Werte für cTRPM8 im Vergleich zu mTRPM8
ergeben. Zusätzlich konnte durch Stimulation mit Menthol bei unterschiedlich
vorliegenden
Temperaturen
(18°C
und
31°C)
eine
Potenzierung
des
Antwortverhaltens, ähnlich wie für den mTRPM8 beschrieben, auch für den cTRPM8
nachgewiesen werden. Eine Analyse des Strom-Spannungsverhältnisses zeigte
einen engen Zusammenhang zwischen temperatur- bzw. Menthol-vermittelter
Aktivierung zu spannungsabhängigen Öffnungsmechanismen von cTRPM8 und
mTRPM8. Verschiebungen in der spannungsabhängigen Aktivierbarkeit und
Unterschiede in der tertiären Proteinstruktur, die auf den entdeckten Variationen
innerhalb der primären Proteinstruktur basieren, dienen als Erklärung für das
modifizierte Aktivierungsverhalten des cTRPM8 im Vergleich zu mTRPM8.
Neben der Aktivierung durch verschiedene chemische und physikalische Stimuli wird
das Aktivierungsverhalten des TRPM8 auch durch verschiedene Proteine moduliert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Studie war die Analyse der Interaktion von TRPM8
und Gαq. Aktuellste Studien beschreiben eine mTRPM8-vermittelte Aktivierung des
Gαq Proteins die zu einer Aktivierung eines PLC-abhängigen metabotropen
Signaltransduktionswegs
extrazellulär
führen.
kalziumfreien
In
Kalzium-imaging
Bedingungen
führt
eine
Experimenten
Aktivierung
unter
dieses
111
Conclusion
Signaltransduktionswegs durch Ausschütten von Kalzium aus intrazellulären
Speichern zu einem Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration. Es ist
allerdings ungeklärt, ob es sich bei der Interaktion zwischen TRPM8 und Gαq um
eine direkte Verbindung handelt oder ob weitere interaktionsvermittelnde Proteine
beteiligt sind. Deswegen war ein weiteres Ziel dieser Doktorarbeit die Interaktion
zwischen
TRPM8
und
Gαq
näher
zu
charakterisieren.
Mit
Hilfe
von
proteinbiochemischen Methoden, wie Co-IP und Western Blot konnte Hinweise
gefunden werden die auf eine direkte Interaktion zwischen beiden Proteinen ohne
das Auftreten weiterer interaktionsvermittelnder Proteine hinweisen.
Im Vergleich zu mTRPM8 zeigte weitere Untersuchungen keine cTRPM8-vermittelte
Aktivierung des Gαq. Zusätzlich zur Aktivierung des PLC-abhängigen metabotropen
Signaltransduktionswegs verursacht die Interaktion von TRPM8 und Gαq eine
Inhibition des TRPM8. Dieser TRPM8-modulierende Effekt von Gαq wurde anhand
der Analyse des spannungsvermittelten Aktivierungsverhaltens sowohl für mTRPM8
als auch für cTRPM8 nachgewiesen. Es wird vermutet, dass die Interaktion von
TRPM8 und Gαq durch den TRPM8 C Terminus vermittelt wird. Um eine mögliche
interaktionsvermittelnde Domäne weiter einzuengen wurden Rezeptorchimären
durch den Austausch der C Termini von mTRPM8 und cTRPM8 hergestellt. Eine
funktionelle Charakterisierung dieser Rezeptorchimären zeigte einen Verlust der
Aktivierbarkeit von Gαq. Dies weist darauf hin, dass die funktionelle Interaktion
beider Proteine möglicherweise nicht nur mTRPM8 C Terminus-abhängig ist. Im
Gegenteil zum Verlust der Fähigkeit Gαq zu aktivieren, bleibt der Effekt der
Inhibierung des TRPM8 durch Gαq in beiden Rezeptorchimären erhalten.
Zusammenfassend ermöglichen die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit einen
Einblick in das Aktivierungs- und Modulationsverhalten von TRPM8, im Besonderen
von
cTRPM8.
Die
Ergebnisse
verdeutlichen
die
Abhängigkeit
des
Öffnungsverhaltens des Kanals zu Variationen in der primären Proteinstruktur
verschiedener
Spezies.
Diese
Erkenntnisse
über
unterschiedliches
Aktivierungsverhalten könnten unter anderem für die klinische Forschung von
Bedeutung sein, da der TRPM8 Ionenkanal bei Krankheiten wie z.B. Prostatakrebs
eine Rolle spielt.
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