Wirkung von Oberflächenladungen auf Zellen – Beobachtungen in

Wissenschaftliche Zeitschrift der Technischen Universität Dresden • 56 (2007) Heft 1 – 2 • Nanowelt
Richard H. W. Funk und Thomas K. Monsees
Wirkung von Oberflächenladungen auf
Zellen – Beobachtungen in der
Nanodimension
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Einleitung
Mit der Entstehung von Leben auf der Erde
– von den Urbakterien hin bis zu den pflanzlichen und tierischen Zellen – begann eine
intensive Strukturierung auf Nanoebene,
sowohl im Innenaufbau dieser Lebewesen
als auch in der Strukturierung ihrer Umgebung. So wird zum Beispiel bei Korallen,
durch die ganze Riffe entstehen, deutlich,
welch große Bedeutung nicht nur die Zelle
selbst, sondern auch die durch sie produzierte Umgebung hat.
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Größendimensionen innerhalb und
außerhalb von Zellen
Eine Zelle eines menschlichen bzw. tierischen Organismus hat normalerweise einen
Durchmesser zwischen 5 und 30 µm. Einzelne Zellfortsätze können jedoch bis zu
einem Meter lang werden, beispielsweise
wenn eine Nervenzelle das Rückenmark mit
Rezeptoren an der Fußsohle verbinden soll.
Nahezu alle Moleküle, mit denen eine Zelle
arbeitet, liegen allerdings im Nanometermaßstab. So zeigt Bild 1 ein Kollagenmolekül, ein Protein, das von der Zelle in ihre
Umgebung produziert wird. Beispiele für
die Vielzahl intrazellulärer Proteine sind
Transportproteine wie Myosin oder Dynein
(Bild 2). Auch die kleineren Nukleinsäuren
wie ribosomale RNA gehören in die Nanodimension. Die Kern-DNA erreicht dagegen
im gestreckten Zustand eine Länge von bis
zu zwei Metern.
Die außerhalb der Zellen liegende Matrix
(extrazelluläre Matrix), die aktiv von der
Zelle selbst gebildet wird, enthält auch
Strukturen in größerem Maßstab. So werden
aus nanometergroßen Untereinheiten, wie
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dem Protein Laminin (Bild 3), größere
Strukturen gebildet, die wiederum mikrometergroße Gebilde aufbauen, zum Beispiel die
Basalmembran (Bild 4). Von diesen Anordnungen auf mittlerer Größenebene geht es
dann hinauf bis in Millimeter- und Zentimetermaßstäbe, beispielsweise bei menschlichen und tierischen Sehnen oder dem konzentrisch angelegten Kollagen-Hydroxylapatit, das zum Aufbau der Lamellenknochen dient. Es können aber auch Riesenzellgebilde strukturiert werden, wie es
zum Beispiel bei den Muskelzellen der Fall
ist. Hier können aus vielen Vorläuferzellen
durch Verschmelzung zentimetergroße Zellgebilde entstehen.
Eingebettet in diese Größendimensionen
arbeiten die Zellen im Inneren und nach
außen aktiv mit Molekülen im Nanometermaßstab. Sie müssen sich auch in der selbst
geschaffenen Umwelt, d. h. der extrazellulären Matrix, zurechtfinden.
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Zellen reagieren auf Umgebungsreize
– das Beispiel nanostrukturierter Implantatoberflächen
Ausgelöst durch Außenreize (Signalmoleküle, Wachstumsfaktoren etc.) haben Zellen
die Möglichkeit, bestimmte Programme aus
ihrem genetischen Material an- und abzuschalten und ihr Verhalten entsprechend zu
ändern. Sie können beispielsweise mit der
Ausbildung spezifischer Merkmale, z. B.
Differenzierung, reagieren.
Doch wie nehmen Zellen ihre Außenwelt,
wie zum Beispiel Oberflächen, wahr? Wie
kommt es zu entsprechenden Rückkopplungen in das genetische Programm? Verläuft dies über einen mechanischen Weg,
über den chemischen Weg oder vielleicht
Lebende Organismen und insbesondere die einzelnen Zellen
selbst sind Meister in der aktiven Strukturierung auf Nanoebene. So bilden die Zellen
nicht nur ihr reichhaltiges „Innenleben“ in dieser Dimension,
sondern strukturieren auch ihre
direkte Umgebung, den extrazellulären Bereich. Bei der Haftung und gerichteten Bewegung der Zellen scheinen nach
neueren Befunden auch elektrische Potenziale und Oberflächenladungen mit Mustern bis
„hinab“ auf die Nanoebene
eine Rolle zu spielen. Nanostrukturierte Muster von Ladungen können so auch die Wechselwirkung von Zellen und Geweben mit Implantaten beeinflussen. Diese Beobachtungen
führen wieder zurück zu den
Zellen selbst, die zum Beispiel
im Falle von Ionenkanälen mit
hundertstel Nanometer Genauigkeit Topographie und Potenziale kontrollieren. Solche
Strukturen könnten zukünftig
auch über Chiptechnologie
modelliert werden – eine Chance, von der Natur zu lernen und
dies technisch umzusetzen.
Living organisms and in particular cells actively structure their
inner world in the nano-dimension. Not only organelles are
formed by the cells, but also
their direct environment, the
extracellular matrix. Recent studies show that electrical potentials are similarly important in
the process of adhesion and
directed migration.
Nanostructured charge patterns
may also influence the interactions between cells, tissues and
implants used in therapy.
Even small differences in the
structure of charged molecules
can already change the behaviour of cells drastically. Inside
the cell, furthermore, very small
topographic features are decisive: In ion channels, dimensions
of 1/100 nm are essential for
their function.
Such precise structures are
nowadays still a technical challenge. When modelling such
cellular “electronics” using chip
technology, we can learn a lot
from nature’s tricks in cell
physiology.
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Bild 1. Aufbau eines Kollagenmoleküls (Tripelhelixstruktur)
Bild 3. Das Molekül Laminin als Grundbestandteil der Basalmembran,
einer „teppichartigen“ Grundlage, auf der Zellen sich zu einem Verband
verankern
über andere Kräfte? Es ist bekannt, dass Blutzellen und
ganze Kaskaden von Eiweißmolekülen die Blutgerinnung
ablaufen lassen können, wenn die Gefäßinnenwand verletzt
Bild 2. Das Motorprotein Dynein in der Interaktion mit dem
Zellskelettprotein Aktin
wird und das Blut mit negativ geladenen Oberflächen in
Berührung kommt. Auf alle Fälle sind bestimmte Zelltypen
in der Lage, auf fremde Oberflächen zu reagieren. Dies
können Oberflächen sein, die nicht zum Körper gehören,
zum Beispiel die von Antigenen, oder Oberflächen, mit
denen der Körper täglich Kontakt hat, wie Mikroben- oder
Pollenoberflächen. Da die – auf Nanoebene strukturierte –
Oberflächenlandschaft dieser Partikel nicht zum Körper
gehört, werden Antworten unseres Immunsystems ausgelöst. Ein typisches Molekül, das zur Immunabwehr gebraucht wird, ist der Antikörper (schematische Darstellung
in Bild 5).
Was kann man vor diesem Hintergrund erwarten, wenn
neuartige Oberflächen in Form von Implantaten in den
Körper eingebracht werden, wie zum Beispiel künstliche
Hüften oder anderer Gelenkersatz, Sensoren oder Hilfsgeräte (z. B. Herzschrittmacher)? Hierbei ist es wichtig, dass
das fremde Material biokompatibel, d. h. gut körperverträglich ist. Die Oberflächen sollten aber auch so gestaltet sein,
dass sie sich funktionell gut in den Körper integrieren.
Bild 4. Aufbau der Basalmembran, unter
anderem mit dem Molekül Laminin
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Bild 5. Schematische Darstellung eines Antikörpers, der Antigene (z. B.
auf Pollenoberflächen) bindet und sie der „Weiterverarbeitung“ im
Immunsystem zuführt
Außerdem sollten sie die Zellen dazu veranlassen, das
Implantat entweder gut zu verankern oder abbaubare (resorbierbare) Implantate so zu ersetzen, dass die funktionelle
Integrität des Gewebes wieder hergestellt wird.
Es ist bekannt, dass Zellen, die auf Implantatoberflächen
aufgebracht wurden, häufig mit millimetergroßen Rillenstrukturen längs des Oberflächenmusters laufen. Diese Erscheinung ist als Kontaktführung bekannt. Inzwischen weiß
man, dass auch sehr feine nanometergroße Reliefmuster in
der Lage sind, Zellorientierung und -funktion zu beeinflussen [1, 2]. Diese Oberflächen bewirken zum Beispiel eine
Hochregulation von Genen, die alle für eine vitale Zelle charakteristisch sind: erhöhte extrazelluläre Matrixproduktion,
Zellteilung, Stoffwechsel und Beweglichkeit. Auf glatten
Oberflächen sind Zellen dagegen eher unbeweglich und bilden vermehrt Stressfasern aus. Strukturierte Oberflächen
aber sind den inneren Oberflächen des Körpers ähnlicher
und ermöglichen „natürlichere“ Zellreaktionen und Zellbeweglichkeit. So konnten eigene Studien zeigen, dass Osteoblasten (Knochenzellen) bereits auf 12 nm hohe Streifenmuster reagieren (Bild 6) [3]. Fibroblasten (Bindegewebszellen) können ebenfalls Nanostrukturen bis hinab auf
10 nm über Filopodien (fingerförmige Zellfortsätze) „erfühlen“ [4]. Es bleibt allerdings die Frage, über welche Kräfte
diese feinsten fingerförmigen Zellausläufer und letztendlich
die Zelle selbst die Oberflächenmuster erkennen und wie
diese Information bis zum Innersten der Zelle weitergeleitet
wird.
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Spezifizierung der Reize zur Zellorientierung
Außer den topographisch-mechanischen sind auch andere
Reize für die Wahrnehmung der Migrationsrichtungen und
die Ausbildung von Anheftungsstellen verantwortlich. So
scheinen neben chemischen Reizen (Chemotaxis, z. B. nach
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Bild 6. Kontaktführung bei Saos-2-Osteosarkomazellen auf einer nanostrukturierten Titanoberfläche. Der Abstand der Titanoxidlinien beträgt
5 µm, Breite = 0,7 µm. Die Filopodien der Zelle erkennen die nur 12 nm
hohen Linienstrukturen und bilden dort fokale Kontakte. Die Zellen wurden fluoreszenzgefärbt (Actin-Zytoskelett). Größenbalken = 20 µm.
dem Konzentrationsgradienten von Wachstumshormonen
oder Komponenten der extrazellulären Matrix) insbesondere auch Oberflächenladungen oder elektrische Gradienten
als Leitstrukturen zu fungieren. Bei Implantaten können solche Gradienten an der Grenze unterschiedlicher Materialien
auftreten. Eigene Studien zeigten, dass solche Übergangsstellen für Osteoblasten einen positiven Reiz darstellen, da
die Zellen von solchen Übergangsstellen signifikant stärker
angezogen wurden als von den reinen Materialoberflächen.
Erste Messungen mit der Kelvinrastersonde wiesen signifikante Änderungen im elektrischen Potenzial an Übergängen
von Titan und Gold auf [3].
Der erste Kontakt einer Zelle mit einer Implantatoberfläche
könnte also auf elektrostatischen Wechselwirkungen beruhen. Viele Bestandteile der Zellmembran sind bei physiologischem pH-Wert negativ geladen, sodass ohnehin eine starke elektrostatische Anziehung zwischen der Zelle und den
positiv geladenen Substraten besteht.
Allerdings „sieht“ die Zelle nur sehr wenig von der eigentlichen Implantatoberfläche. Sobald ein Implantat in Kontakt
mit einer biologischen Flüssigkeit (Blut, Zellkulturmedium)
kommt, wird ein großer Teil der Oberfläche mit in Wasser
gelösten Ionen bedeckt. Danach werden Aminosäuren und
Proteine der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin und
Vitronektin, adsorbiert. Sie enthalten bestimmte
Peptidsequenzen, die dann die spezifische Bindung von
Zellen über Integrinrezeptoren auf der Zellmembran
beschleunigen. Interessanterweise fördern negativ geladene
Oberflächen Zelladhäsion und Zellfunktionen oft wesentlich stärker als positive [5 bis 7]. An diese Oberflächen binden zunächst anorganische Kationen (Na+, Ca2+, Mg2+)
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Bild 7. Die zunächst unspezifische
Annäherung einer Zelle an eine
Implantatoberfläche beruht auf
elektrostatischen Wechselwirkungen (A). Bei negativ geladenen
Oberflächen wirken Kationen wie
Kalzium vermittelnd und fördernd
auf die Adhäsion (B). Auf der
Oberfläche adsorbierte Proteine
der extrazellulären Matrix binden
spezifisch über ihre RGD-Peptidsequenzen an Integrinrezeptoren
auf der Zelloberfläche (C – E).
sowie kationische Aminosäuren und Proteine, die dann
elektrostatisch anziehend auf die negativ geladene Zellmembran wirken. Insbesondere Kalziumionen wirken als
„Kit“ zwischen den negativ geladenen Oberflächen (Bild 7).
Zellen lassen sich also in ihrem Verhalten (Richtung der
Zellbewegung, Adhäsion, Differenzierung und Teilung)
durchaus auch durch verschiedene Ladungsmuster bis „hinunter“ auf die Nanoebene beeinflussen, wobei die Zelle im
Ladungsmuster eine Information zu erkennen scheint.
Man steht hier jedoch erst am Anfang eines neuen Forschungsbereiches, der später aber zur bewussten Herstellung neuer Oberflächen, deren Ladungsmuster entspre-
chend biokompatibel sind und die darüber hinaus ganz
gezielt bestimmte Reaktionen auslösen können, führen
kann.
5
Interaktion von Ladungsmustern und Zellstrukturen
auf Nanoebene
Zellen gehen allgemein
membran äußerst genau
erkennt man auch, wenn
Ionenkanälen die exakte
im Inneren und an ihrer Zellmit Ladungsmustern um. Dies
man zum Beispiel im Falle von
Ausrichtung der Ladungsträger
Bild 8. Struktur eines KaliumKanals in nm-Maßstab (Blick in
Porenrichtung), der nur Kaliumionen (über vier Bindungen zentriert) durchlässt
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betrachtet (Bild 8). Hier werden selektiv nur ganz bestimmte Ionen mit einem – auf einhundertstel Nanometer genau –
definierten Durchmesser durch die Zellmembran geschleust.
Nicht nur bei Ionen, z. B. Eisenionen, in Enzymen, sondern
auch bei Proteinen, bei denen keine elektrischen Funktionen
im Vordergrund stehen, ist inzwischen die Wertigkeit von
Ladungsmustern auf Nanoebene bekannt geworden.
Erst seit kurzem kann man diese feinen Ladungsmuster
mit entsprechenden Atomkraftmikroskopen zeigen [8],
sodass man allmählich eine Vorstellung bekommt, wie exakt
die Zellen mit Ladungen und Ladungsträgern umgehen. Dabei wird klar, dass Biomoleküle eben nicht nur „molekulare
Maschinen“ auf rein mechanischer Basis sind, sondern auch
elektronische Bausteine! Ohnehin wird meist nicht in Betracht gezogen, dass in µm- und nm-Dimension die physikalischen Grundkräfte (Schwerkraft, starke bzw. schwache
Wechselwirkung und Elektromagnetismus) in ihrer Dominanz ganz anders ausgeprägt sind als in unseren menschlichzentrierten cm-und m-Maßstäben. So stehen auf Nanoebene
zum Beispiel elektrostatische, Adhäsions- und Bindungskräfte viel stärker im Vordergrund als die Schwerkraft, die
ohnehin im wässrigen Milieu zum Beispiel für Proteine
nahezu unbedeutend ist. Darüber hinaus treten in der
Nanometerdimension die quantenphysikalischen Erscheinungen (Elektron- und Wasserstoff-Tunnelling) [9] in den
Vordergrund. So wurde bereits vor Jahren in der Fachzeitschrift „Nature“ ein Artikel über Membrankanäle unter
der Überschrift „Life’s transistors“ veröffentlicht [10].
Um diesen Phänomenen näher zu kommen, haben wir
gerade auch in Dresden hervorragende Möglichkeiten, solche von der lebenden Zelle auf Nanoebene gebrauchte
Strukturen auch „in silico“, d. h. als elektronische Bausteine
aus Festkörpern, zu modellieren und entsprechend elektronisch „durchzumessen“. Auf diese Weise können Analogieschlüsse auf die elektronische Funktion von Molekülen in
der Zelle vorgenommen werden. Aus diesen Erkenntnissen
wird deutlich, dass wir vor einem weiten Feld neuer Forschungsaufgaben stehen.
Literatur
[1] Funk, R. H.; Monsees, T. K.: Effects of electromagnetic fields on cells: physiological and therapeutical approaches and molecular mechanisms of interaction. A
review. In: Cells Tissues Organs. 182 (2006) 2, S. 59 – 78
[2] Monsees, T. K.; Funk, R. H.: Wirkung von Oberflächenladungen und elektromagnetischen Feldern auf Zellen. Sonderdruck Biomaterialien 6 (2). VNM
Verlag, 2005
[3] Monsees, T. K.; Barth, K.; Tippelt, S.; Heidel, K.; Gorbunov, A.; Pompe, W.;
Funk, R. H.: Effects of different titanium alloys and nanosize surface patterning
on adhesion, differentiation, and orientation of osteoblast-like cells. In: Cells
Tissues Organs 180 (2005) 2, S. 81 – 95
[4] Dalby, M. J.; Riehle, M. O.; Johnston, H.; Affrossman, S.; Curtis, A. S. G.:
Investigating the limits of filopodial sensing: a brief report using SEM to image
the interaction between 10 nm high nano-topography and fibroblast filopodia. In:
Cell Biol International 28 (2004), S. 229 – 236
[5] Erskine, L.; McCaig, C. D.: Integrated interactions between chondroitin sulphate proteoglycans and weak dc electric fields regulate nerve growth cone guidance in vitro. In: J Cell Science 110 (1997), S. 1957 – 1965
[6] Bierbaum, S.; Douglas, T.; Hanke, T.; Scharnweber, D.; Tippelt, S.; Monsees, T.
K.; Funk, R. H.; Worch, H.: Collageneous matrix coatings on titanium implants
modified with decorin and chondroitin sulfate: characterization and influence on
osteoblastic cells. In: J Biomed Mater Res A. 77 (2006) 3, S. 551 – 562
[7] Ohgaki, M.; Kizuki, T.; Katsura, M.; Yamashita, K.: Manipulation of selective
cell adhesion and growth by surface charges of electrically polarized hydroxyapatite. In: J Biomed Mater Res 57 (2001), S. 366 – 373
[8] Ferguson, C.; McCammon, J. A.; Baker, N.: Supercomputer paints electric landscape of cellular structures. 20. August 2006. ucsdnews.ucsd.edu
[9] Kohen, A.; Cannio, R.; Bartolucci, S.; Klinman, J. P.: Enzyme dynamics and
hydrogen tunnelling in a thermophilic alcohol dehydrogenase. In: Nature 399
(1999) 6735, S. 496 – 499
[10] Sigworth, Fred J.: Structural biology: Life’s transistors. In: Nature 423 (2003),
S. 21 – 22
Manuskripteingang: 5.9.2006
Angenommen am: 12.12.2006
Funk, Richard H. W.
Prof. Dr. med. habil.
Monsees, Thomas
Dr. rer. nat. habil.
Studium Medizin von 1973 bis 1979 an der
Universität Erlangen-Nürnberg ♦ 1979 Promotion zum Dr. med. ♦ 1986 Habilitation zum Dr.
med. habil. ♦ von 1988 bis 1994 Professor für
Anatomie an der Universität Erlangen-Nürnberg
♦ seit 1994 Professor für Anatomie und Direktor
des gleichnamigen Instituts, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus der TU Dresden
1988 Studienabschluss als Diplomchemiker ♦
1991 Promotion zum Dr. rer. nat. ♦ 2005 Habilitation zum Dr. rer. nat. habil. ♦ von 1992 bis
1997 wissenschaftlicher Angestellter am Zentrum
für Dermatologie und Andrologie der JustusLiebig-Universität Gießen (JLU) ♦ von 1997 bis
2003 wissenschaftlicher Assistent am Zentrum für
Dermatologie und Andrologie der JLU Gießen ♦
seit 2004 wissenschaftlicher Angestellter/Gruppenleiter Biomaterialien am Institut für Anatomie,
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus der TU
Dresden ♦ seit 2005 Privatdozent an der JLU
Gießen
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