Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen
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Universität Bremen Fachbereich 2: Biologie Projektbericht angefertigt in der Abteilung Marine Mikrobiologie Leitung: Prof. Dr. Ulrich Fischer Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen heterotrophen Bakterien unter besonderer Berücksichtigung der Amylasen vorgelegt von Tatjana Votteler Bremen, Mai 2007 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUBGSVERZEICHNIS ........................................................................................ IV 1. EINLEITUNG ........................................................................................................... ......... 1 1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen ...........................................................................................1 1.2. Enzyme in der Industrie .................................................................................................................1 1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz ..........................................................2 1.3. Amylasen .......................................................................................................................................3 1.4. Peptidasen ..................................................................................................................................... 3 1.5. Lipasen ...........................................................................................................................................4 1.6. DNasen ...........................................................................................................................................5 1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit .......................................................................5 2. MATERIAL UND METHODEN....................................................................................... 6 2.1. Material .........................................................................................................................................6 2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien ......................................................................6 2.1.2. Bacillus subtilis ………...........................................................................................................6 2.2. Medien, Lösungen und Puffer ......................................................................................................7 2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992) .......................................7 2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979, modifiziert nach Rethmeier, 1995) ........................................................................................9 2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989) ...........................................................10 2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme ......................................................10 2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhard et al., 1994) .......................................................................................................................11 2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach Schreier, 1969) ..................................................................................................................11 2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach Gerhard et al., 1994) ........................................................................................................11 2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................11 2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis ......................................................................11 2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis ......................................................11 Inhaltsverzeichnis II 2.2.7. Lugolsche Lösung ..................................................................................................................12 2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976) ......................................................................................12 2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) ...............................................................................12 2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5) ..................................................................12 2.2.11. Stärke-Puffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung ................................................................12 2.2.12. 2x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970) ...................................................12 2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung ...................................................................................13 2.2.13.1. Fixierer A .......................................................................................................................13 2.2.13.2. Fixierer B .......................................................................................................................13 2.2.13.3. Fixierer C .......................................................................................................................13 2.2.13.4. Entwickler ......................................................................................................................13 2.3. Methoden .....................................................................................................................................13 2.3.1. Hälterung der Organismen .....................................................................................................13 2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen ........................................................14 2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhard et al.,1994) .......................................................................................................................14 2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach Schreier, 1969) .................................................................................................................14 2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach Gerhard et al., 1994) .......................................................................................................14 2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin B-Agar (modifiziert nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................15 2.3.3. Methoden zur Anreichreung und Bestimmung von Proteinen ..............................................15 2.3.3.1. Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium .......................................................................15 2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis- Kultur ..............................................................................15 2.3.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände ...........................................................................15 2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung ..................................................................................................16 2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976) ..............................................................................16 2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen .....................................................17 2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach Laemmli, 1970) ......................................................................................................17 2.3.4.2. Amylase-Aktiviätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert nach Kim et al., 1995, Lacks & Springhorn, 1980) .........................................................17 2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine .......................................................................................18 2.4. Chemikalien .................................................................................................................................19 Inhaltsverzeichnis III 3. ERGEBNISSE ....................................................................................................................20 3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien ................................................................20 3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar ..............................................................21 3.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................22 3.2.1. Anreicherung der Amylase ....................................................................................................22 3.2.2. Ammoniumsulfatfällung ........................................................................................................23 3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel ........................................................................23 3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine .............................................................................................25 4. DISKUSSION .....................................................................................................................26 4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien .....................................................26 4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................26 5. LITERATURVERZEICHNIS ..........................................................................................29 Abkürzungsverzeichnis IV Abkürzungsverzeichnis A Ampere Aqua dest. destilliertes Wasser ASN Artificial Seawater Nutrients d Tage (days) Da Dalton et al. und andere (et alii) G Gramm k Kilo M1 Medium m Milli µ Mikro n.u. noch unbekannt p.a. zur Analyse (pro analysi) PAGE Polyacryamid-Gelelektrophorese RT Raumtemperatur rpm Rotationen pro Minute (rounds per minute) SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) s Sekunde V Volt v/v Volumen pro Volumen (volume per volume) W Watt w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume) Einleitung 1 1. Einleitung 1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen Jeder Organismus produziert eine große Vielfalt von Enzymen (Madigan et al., 2003), welche für die Katalyse der zahlreichen biochemischen Reaktionen verantwortlich sind (Voet et al., 2002). Die meisten Enzyme werden von den Organismen in kleinen Mengen synthetisiert und sind an zellulären Prozessen beteiligt. Jedoch sind einige Mikroorganismen befähigt, gewisse Enzyme in viel größeren Mengen zu produzieren und diese nach außen zu sekretieren (Madigan et al., 2003). Extrazelluläre Enzyme spalten Makromoleküle, welche nicht in die Zelle aufgenommen werden können, zu transportablen Mono-, Di- oder Oligomeren (Fritsche, 2002). Diese können nach der Aufnahme in die Zelle als Nährstoffe für das Wachstum verwendet oder in Form von Makromolekülen gespeichert werden (Madigan et al., 2003). 1.2. Enzyme in der Industrie Mikroorganismen und Enzyme werden schon seit langer Zeit zur Verarbeitung von pflanzlichen und tierischen Rohstoffen verwendet. Früher standen die Verfahren mit lebenden Mikroorganismen im Vordergrund. Dazu gehört die Herstellung von alkoholischen Getränken, Hefe-Fermentation von Teig bei der Brotherstellung, Konservierung von Gemüse durch Fermentation mit Lactobazillen (z.B. Sauerkraut) oder die Herstellung von Käse (Uhlig, 1991). Gegen Ende des 19. Jahrhunderts wurde erkannt, dass Enzyme unabhängig von lebenden Zellen wirken (Buchholz & Kasche, 1997). Heutzutage werden sowohl lebende Zellen als auch isolierte Enzyme in der Industrie verwendet (Schmid et al., 2001). Enzyme unterscheiden sich von den üblichen chemischen Katalysatoren in einigen wichtigen Punkten: Sie weisen höhere Reaktionsgeschwindigkeiten auf, funktionieren unter milderen Reaktionsbedingungen, sie haben größere Reaktionsspezifität und sind regulationsfähig (Voet et al., 2002). Aufgrund ihrer Reaktionsspezifität entstehen bei enzymatischen Reaktionen relativ reine Produkte, was die Abfallmenge reduziert (Marrs et al., 1999). Die milden Reaktionsbedingungen, bei denen Enzyme arbeiten, senken den Energieverbrauch, was die Produktionskosten und die Treibhausgasemissionen vermindert (Rozzel, 1999). Enzyme werden in zahlreichen Industriezweigen in biokatalytischen Prozessen angewandt (siehe Tab. 1.1.). Sie werden in der Lebensmitteltechnologie, bei der Papier-, Textil- und Lederbehandlung, sowie für analytische und diagnostische Zwecke eingesetzt. Auch in der pharmazeutischen und chemischen Industrie werden Enzyme verwendet Dabei ist die Stereo-, Regio- und Substratspezifität der enzymatischen Katalyse in diesen Industriezweigen von Einleitung 2 besonderer Bedeutung, weil dadurch Verbindungen synthetisiert werden, die mit konventionellen chemischen Methoden schwer herzustellen sind (Schmid, 2006; Marrs et al., 1999; Rozzel, 1999; Koeller & Wong, 2001) Tab. 1.1.: Anwendungsgebiete und einige Beispiele für Herkunftsorganismen von biotechnisch genutzten Enzymen (Schmid, 2006; Uhlig, 1991) Enzymtyp Anwendung Organismen Proteasen Waschmittelzusatz Mehl- und Backwaren Käsereifung und Aroma Lederbehandlung Bacillus licheniformis Aspergillus oryzae Amylasen Stärke-Abbau Papierherstellung Textilbehandlung Teig- und Backwarenverarbeitung Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis Aspergillus oryzae Lipasen Waschmittelzusatz Käsereifung und Aroma Aspergillus nidulans Cellulasen Waschmittelzusatz Früchteverwertung und Wein Futtermittelherstellung Trichoderma reesei Aspergillus niger 1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz Ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt, wird durch das Verhältnis des anwendungstechnischen Nutzens und dem Preis des Enzyms bestimmt (Schmid, 2006). Die Kosten der Enzymproduktion und Aufarbeitung sinken mit steigendem Enzymgehalt in den Enzymquellen. Bei der Suche nach neuen Enzymquellen können Mikroorganismen mithilfe von Enzym-Assays auf die Produktion von gesuchten Enzymen getestet werden. Inwieweit sich diese Mikroorganismen auch als Enzymproduzenten für enzymtechnische Verfahren eignen, kann durch Untersuchungen der Enzymproduktion und der Enzymeigenschaften herausgefunden werden (Buchholz & Kasche, 1997). Viele Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit, diejenigen Enzyme verstärkt zu synthetisieren, deren Substrate im Medium vorhanden sind. Bestimmte Bakterien produzieren nur dann Amylasen, wenn Stärke als Kohlenstoffquelle in der Umgebung vorliegt. Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, können hingegen die Synthese der Amylasen reprimieren. Solche Enzyme werden als induzierbare Enzyme bezeichnet. Enzyme, deren Synthese Einleitung 3 unabhängig von den äußeren Faktoren ist und kontinuierlich stattfindet, werden als konstitutive Enzyme bezeichnet (Ruttloff et al., 1978). Um hohe Ausbeuten bei der Enzymsynthese zu erreichen, muss die Induktion und Repression der Synthese berücksichtigt werden (Buchholz & Kasche, 1997). Eine maximale Synthese induzierbarer Enzyme wird erst durch den Einsatz bestimmter Nährsubstrate, welche als Induktoren wirken, erreicht. Als typische Induktoren sind Stärke (Amylase), Casein, Albumin (Protease), Pektin (Pektinase), u.a. bekannt (Ruttloff et al., 1978). 1.3. Amylasen Amylasen spalten Stärke und Glykogen durch Hydrolyse der α-1,4-glycosidischen Bindung zu Dextrinen und Zuckern (Uhlig, 1991). Stärke ist ein wichtiges Reservepolysaccharid der höheren Pflanzen (Ruttloff et al., 1978) und ist Hauptbestandteil der meisten Nahrungsmittel und der wichtigste Energielieferant unserer Ernährung (Uhlig, 1991). Stärke setzt sich aus den Bestandteilen Amylose und Amylopektin zusammen, die aus Glucoseuntereinheiten bestehen. Amylose ist ein lineares Polymer, das aus 6.000 oder mehr α-1,4-glycosidisch verbundenen Glucoseresten besteht. Amylopektin ist hingegen ein verzweigtes Molekül. Es setzt sich aus etwa 2 Mio. α-1,4- und α-1,6-glycosidisch verbundenen Glucoseresten zusammen, wobei die α-1,6-glycosidischen Bindungen etwa 5 % der Gesamtbindungen ausmachen (van den Maarel et al., 2002). Viele Bakterien können Stärke als Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum nutzen. Dafür werden die Stärkemoleküle extrazellulär von den Bakterien zu transportablen Molekülen gespalten, bevor sie in die Zelle aufgenommen und weiterverwertet werden. Eine ganze Reihe Stärke-abbauender Enzyme, die eine große Vielfalt von Produkten liefern, werden von diesen Mikroorganismen gebildet. Viele dieser Enzyme finden bei den stärkeverarbeitenden, industriellen Prozessen Anwendung (van der Veen et al., 2000). Man unterscheidet α-, β- und Glycoamylasen. α-Amylasen (1,4-α-D-glucan glucanohydrolase; EC 3.2.1.1) hydrolysieren α-1,4-glycosidische Bindungen innerhalb des Makromoleküls, wobei Glucose, Maltose und Grenzdextrine freigesetzt werden. β-Amylasen (1,4-α-D-glucan maltohydrolase; EC 3.2.1.2) spalten Maltose vom nicht reduzierenden Ende des Polysaccharids ab und Glycoamylasen (1,4-α-D-glucan glucohydrolase; 3.2.1.3) spalten Glucose ebenfalls vom nicht reduzierenden http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/). Ende ab (Ruttloff et al., 1978; Einleitung 4 1.4. Peptidasen Proteolytische Enzyme (EC 3.4) katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen und Peptiden. Sie werden in zwei Hauptgruppen, die Exo- und Endopeptidasen unterteilt. Exopeptidasen spalten Peptidbindungen, die nahe dem C- oder N-Terminus liegen und werden aufgrund ihres Reaktionsortes entweder als Amino- oder als Carboxypeptidasen bezeichnet. Endopeptidasen spalten ketteninterne Peptidbindungen. Sie werden nach ihrem katalytischen Mechanismus in Serin-, Aspartat-, Cystein- und Metalloproteasen unterteilt (Rao et al., 1998). Peptidasen kommen sowohl in Tieren als auch in Pflanzen und Mikroorganismen vor. Jedoch haben die mikrobiologisch erzeugten Peptidasen technisch die größte Bedeutung (Uhlig, 1991). Die große Vielfalt der Peptidasen erregte weltweite Beachtung und es wurde versucht diese Vielfalt physiologisch und biotechnologisch auszunutzen (Rao et al., 1998). Serinproteasen (Subtilisine) werden als Waschmittelzusatz zur Entfernung von eiweißhaltigen Verschmutzungen eingesetzt (Schmid, 2006). In der Lederindustrie werden Peptidasen zur Entfernung von Haaren von den Tierhäuten verwendet und ersetzen somit den Einsatz von giftigen Chemikalien (Rao et al., 1998). Auch in der Lebensmittelindustrie werden Peptidasen eingesetzt. Bei der Verarbeitung von Teig bewirken Peptidasen den partiellen Abbau des Getreide-Klebereiweißes (Gluten). Die Dehnbarkeit des Teiges wird erhöht, wodurch verbessertes Gasrückhaltevermögen für das CO2 (Gärung) erreicht wird. Außerdem werden Peptidasen zum Zartmachen von Fleisch (partieller Verdau des Muskelgewebes) (Schmid, 2006), zur Herstellung von Soja-Produkten und zur Synthese von Aspartam (kalorienfreier Süßstoff) eingesetzt (Rao et al., 1998). Auch in der Grundlagenforschung spielen Peptidasen eine wichtige Rolle. Ihre Fähigkeit, selektiv bestimmte Peptidbindungen zu spalten, wird bei der Peptidsynthese und bei der Sequenzierung von Proteinen ausgenutzt (Rao et al., 1998). 1.5. Lipasen Lipasen (Triacylglycerol acylhydrolase; EC 3.1.1.3) katalysieren sowohl die Hydrolyse als auch die Synthese von Estern aus Glycerin und langkettigen Fettsäuren. Lipasen durchführen diese Reaktionen mit hoher Regio- und Enantioselektivität, was sie zu wichtigen Biokytalysatoren in der organischen Chemie macht. Viele Lipasen werden großtechnisch produziert, wobei der Großteil von ihnen aus Pilzen und Bakterien stammt. Das kommerziell wichtigste Anwendungsgebiet von Lipasen ist ihr Zusatz zu Detergenzien (Jaeger & Reetz, 1998). Einleitung 5 Ein weiteres Anwendungsgebiet von Lipasen ist die Papierindustrie. Dabei werden Lipasen zur Entfernung von Triglyceriden und Wachs aus Zellstoff bei der Papierherstellung eingesetzt (Jaeger & Reetz, 1998). Außerdem kann beim Recycling-Prozess von Altpapier die Drückerschwärze nach Vorbehandlung mit Lipasen, Cellulasen und Xylanasen leichter entfernt werden (Schmid, 2006). Lipasen werden auch für die Synthese von Biopolymeren, wie Polyester sowie Feinchemikalien, wie Medikamenten oder Duftstoffen, eingesetzt (Jaeger & Eggert, 2002). 1.6. DNasen DNasen gehören zu den Nukleasen. Sie katalysieren die Spaltung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) entweder durch die Hydrolyse von PhosphodiesterBindungen oder durch das Entfernen von Phosphat (Zenkova, 2004). Extrazelluläre Nukleasen sind bei Bakterien selten. Ihre Produktion begrenzt sich auf eine kleine Anzahl von Bakterien-Arten, die weit über das Reich der Eubakterien verteilt sind (Benedik & Strych, 1998). DNasen werden in der Analytik eingesetzt. Bei der Isolierung von RNA werden DNasen zugesetzt, um mögliche DNA-Kontaminationen zu entfernen (Lottspeich & Zobras, 1998). Restriktionsendonukleasen, die bestimmte Sequenzen erkennen und schneiden, werden z.B. bei der Erstellung von genetischen Fingerabdrücken (Fingerprinting) oder beim Klonieren bestimmter DNA-Fragmente in Vektoren verwendet (Voet et al., 2002). Bestimmte DNasen werden bei der Behandlung von Symptomen der Cystischen Fibrose eingesetzt. Bei dieser Erbkrankheit kommt es durch Schleimbildung in den Atemwegen zur dramatischen Behinderung der Atmung. Dabei wird die Viskoelastizität des Schleims durch extrazelluläre DNA aus den Leukocyten drastisch erhöht. Durch Inhalationssprays, welche DNasen enthalten, werden die Symptome gelindert (Schmid, 2006). 1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden zwölf heterotrophe Bakterienstämme aus der Ostsee, welche von Cyanobakterien aus der Stammsammlung der Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie isoliert wurden, zunächst hinsichtlich der Produktion verschiedener extrazellulärer Enzyme getestet. Im zweiten Teil wurde dann bei dem Stamm, der die höchste Amylaseaktivität aufwies, die Expression der Amylase codierender Gene untersucht. Außerdem sollte anhand der erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob dieser Stamm als Enzymquelle für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist. Material und Methoden 6 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden freundlicherweise von Dipl.-Biologin Annina Hube (Universität Bremen, Abteilung Marine Mikrobiologie) zur Verfügung gestellt. Die Organismen (siehe Tab. 2.1.) stammen aus der Ostsee bei Boiensdorf und wurden von den Cyanobakterien Nodularia harveyana (Stammbezeichnung der Heterotrophen Bo 53) und Oscillatoria brevis (Stammbezeichnung der Heterotrophen Bo 10) isoliert. Die Stämme wurden von Annina Hube mithilfe der Sequenzierung und Charakterisierung von Merkmalen einer Gruppe oder einige von ihnen sogar einer Art zugeordnet (siehe Tab. 2.1). Tab. 2.1.: Verwendete Bakterienstämme und deren Art bzw. Gruppenzugehörigkeit Stamm Art Gruppe Bo 10-09 Muricauda aquimarina Bacteroidetes Bo 10-10 n.u. Bacteroidetes Bo 10-13 n.u. Bacteroidetes Bo 10-15 n.u. Bacteroidetes Bo 10-19 Rhodobaca sp. Alpha-Proteobacteria Bo 10-20 Roseobacter sp. Alpha-Proteobacteria Bo 53-20 Bo 53-33 n.u. Porphyrobacter sp. Gamma-Proteobacteria Alpha-Proteobacteria Bo 53-34 n.u. Bacteroidetes Bo 53-37 n.u. Bacteroidetes Bo 53-39 n.u. Bacteroidetes Bo 53-45 n.u. Bacteroidetes n.u.= noch unbekannt 2.1.2. Bacillus subtilis Ein Bacillus subtilis-Stamm wurde von Dipl.-Biologe Helge Mühl (Universität Bremen, Abteilung Marine Mikrobiologie) zur Verfügung gestellt. Aufgrund seiner Fähigkeit zur Produktion großer Mengen extrazellulärer Amylasen (Helge Mühl, persönliche Mitteilung), Material und Methoden 7 wurde dieser Stamm als Positivkontrolle im Amylaseaktivitätstest nach der SDS-PAGE eingesetzt. 2.2. Medien, Lösungen und Puffer 2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992) Die Komponenten des M1-Mediums sind in den Tabellen 2.2.-2.7. aufgeführt. Die KH2PO4-, Spurenelement-, Se-W- und NH4Cl-Lösungen wurden als Stammlösungen angesetzt und getrennt autoklaviert. Die 7-Vitamin-, Vitamin B12-, Riboflavin- und Thiamin-Lösungen wurden ebenfalls als Stammlösungen angesetzt und sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem Medium nach dem Autoklavieren steril zugesetzt. Als Kohlenstoffquellen dienten Stärke oder Maltose. Stärke wurde vor dem Autoklavieren dem Medium zugesetzt. Maltose wurde in Aqua dest. gelöst, sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius) und dem Medium nach dem Autoklavieren hinzugefügt. Tab. 2.2.: Zusammensetzung des M1-Mediums Komponenten g/l oder ml/l NaCl MgCl2 x 6 H2O KCl MgSO4 x 7 H2O CaCl2 x 2 H2O NaHCO3 Aqua dest. KH2PO4-Lösung (50 g/l) NH4Cl-Lösung (50 g/l) Spurenelementlösung Se-W-Lösung 7-Vitamin-Lösung Vitamin B12-Lösung (50 mg/l) Vitamin B2-Lösung Vitamin B1-Lösung 13,19 2,84 g 0,36 g 3,4 g 0,74 g 0,095 g ad 1000 ml 10 ml 10 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml l Material und Methoden 8 Tab. 2.3.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das M1-Medium Komponenten mg/l oder ml/l FeSO4 x 7 H2O Na2-EDTA H3BO3 MnCl2 x 4 H2O CoCl2 x 6 H2O NiCl2 x 6 H2O CuCl2 x 2 H2O ZnSO4 x 7 H2O Na2MoO4 x 2 H2O 2100 mg 5200 mg 30 mg 100 mg 190 mg 24 mg 10 mg 144 mg 36 mg Die Spurenelemente wurden in 800 ml demineralisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 5 M NaOH-Lösung vor dem Autoklavieren auf 6,0 eingestellt. Tab. 2.4.: Zusammensetzung der Se-W-Lösung für das M1-Medium Komponenten mg/l oder ml/l NaOH Na2SeO3 x 5 H2O Na2WO4 x 2 H2O Aqua dest. 200 mg 18 mg 18 mg ad 1000 ml Tab. 2.5.: Zusammensetzung der 7-Vitamin-Lösung für das M1-Medium Komponenten mg/l oder ml/l NaH2PO4 x H2O (3 mM) Na2HPO4 x 2 H2O (7 mM) Vitamin H1 D-(+)-Biotin Niacin Ca-D-(+)-Pantothenat Vitamin B6 Folsäure Liponsäure Aqua dest. 414 mg 1246 mg 40 mg 20 mg 100 mg 50 mg 150 mg 40 mg 20 mg ad 1000 ml Tab. 2.6.: Zusammensetzung der Vitamin B2-Lösung für das M1-Medium Komponenten mg/l oder ml/l NaH2PO4 x H2O (25 mM) Vitamin B2 Aqua dest. 3450 mg 50 mg ad 1000 ml Material und Methoden 9 Tab. 2.7.: Zusammensetzung der Vitamin B1-Lösung für das M1-Medium Komponenten mg/l oder ml/l NaH2PO4 x H2O (25 mM) Vitamin B1 Aqua dest. 3450 mg 50 mg ad 1000 ml 2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979, modifiziert nach Rethmeier, 1995) Die Komponenten des ASN-Mediums sind in den Tabellen 2.8 und 2.9 aufgeführt. Na2CO3 wurde in demineralisiertem Wasser gelöst und getrennt autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde es dem Medium zugegeben. Die K2HPO4-, Spurenelement- und Eisen-Ammonium-Citrat-Lösungen wurden als Stammlösungen angesetzt und getrennt autoklaviert. Die Vitamin B12-Lösung wurde hingegen sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem Medium nach dem Autoklavieren steril zugesetzt. Tab. 2.8.: Zusammensetzung des ASNIII/2-Mediums Komponenten NaCl MgCl2 x 6 H2O KCl MgSO4 x 7 H2O CaCl2 x 2 H2O NaNO3 Agar (nur für feste Medien) Aqua dest. Na2CO3 (in 100 ml demineralisiertem Wasser lösen) K2HPO4 x 3 H2O-Lösung (4 g/l) Spurenelementlösung Fe-NH4-Citrat-Lösung (6 g/l) Vitamin B12-Lösung (10 mg/l) g/l oder ml/l 12,5 g 1g 0,25 g 1,75 g 0,25 g 0,75 g 15 g ad 900 ml 0,12 g 2,5 ml 0,5 ml 0,25 ml 0,5 ml Material und Methoden 10 Tab. 2.9.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das ASNIII/2-Medium Komponenten g/l pder ml/l Na3-Citrat x 2 H2O Na3-EDTA x 2 H2O H3BO3 MnCl2 x 4 H2O ZnSO4 Na2MoO4 x 2 H2O CuSO4 x 5 H2O Co(NO3)2 x 6 H2O 3g 5,5 g 2,86 g 1,81 g 0,222 g 0,318 g 0,079 g 0,0494 g Aqua dest. 1000 ml 2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989) Die Zusammensetzung des LB-Mediums ist in Tab. 2.10 aufgeführt. Nach dem Auflösen der einzelnen Komponenten in Aqua dest. wurde das Medium autoklaviert. Tab. 2.10.: Zusammensetzung des LB-Mediums Komponenten g/l oder ml/l Trypton Hefeextrakt NaCl Aqua dest. 10 g 5g 10 g ad 1000 ml 2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme Für den Nachweis der extrazellulären Enzyme wurde das ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.2.) verwendet. Dafür wurden den Medien 15 g/l Agar vor dem Autoklavieren zugegeben. Nach dem Autoklavieren wurden die Medien auf ca. 50 °C abgekühlt und die Na2CO3-, K2HPO4-, Spurenelement-, Eisen-Ammonium-Citrat- und Vitamin B12-Lösungen hinzugefügt. Der pHWert der fertigen Medien wurde mit 1 M NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Anschließend wurden die Medien in Aliquots von 20-30 ml in Petrischalen gegossen. Die Platten wurden bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln und gegen Austrocknung geschützt gelagert. Die weiteren Zusätze zu den Medien bzw. die Abweichungen in der Herstellung sind jeweils unten aufgeführt. Kohlenstoffquellen, Pepton, um Fleisch- gutes oder Wachstum Hefeextrakt der dienten verschiedenen als Energie- Bakterienstämme gewährleisten und erfüllten in dem eigentlichen Enzymtest keine Funktion. und zu Material und Methoden 11 2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994) Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 2 g/l lösliche Stärke und 10 g/l Pepton zugegeben. Das Medium wurde bei 115 °C für 10 min autoklaviert. 2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach Schreier, 1969) Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 100 mg/l Toluidinblau (AppliChem) und 10 g/l Fleischextrakt zugegeben. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden 0,5 g/l DNA aus der DNA-Stammlösung (siehe Kap. 2.2.5.) hinzugegeben. 2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994) Dem ASNIII/2-Medium wurden 10 g/l Hefeextrakt zugegeben und anschließend bei 115°C autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 20 g/l Magermilchpulver aus der Magermilchpulver-Lösung (siehe Kap. 2.2.6.) hinzugegeben. 2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert nach Kouker & Jaeger, 1987) Dem ASNIII/2-Medium wurde vor dem Autoklavieren 10 g/l Fleischextrakt hinzugefügt. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 25 g/l (2,5 % (w/v)) steriles Olivenöl (Lidl) und 0,01 g/l Rhodamin B aus einer sterilen wässrigen Lösung mit 1 mg/ml Rhodamin B zugegeben. Das Medium wurde auf einer Rührplatte gut gemischt und in Petrischalen gegossen. 2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis Es wurden 0,5 g DNA aus Fischsperma in 10 ml sterilem 10 mM Tris-HCl, pH 8 über Nacht bei 4°C und mäßigem Rühren gelöst. Für die Sterilisation wurde vor dem Lösen der DNA ein Tropfen Chloroform hinzugegeben. 2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis Es wurden 20 g (handelsübliches) Magermilchpulver in 200 ml Aqua dest. gelöst und bei 110 °C für 10 min autoklaviert. Material und Methoden 12 2.2.7. Lugolsche Lösung Bei der Lugolschen Lösung handelt es sich um eine 1 %ige Iod-Kaliumjodid-Lösung. Dazu wurden Iod und Kaliumjodid im Verhältnis 1:2 in Aqua dest. gelöst. 2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976) Für die Herstellung des Bradford-Reagenz wurden 40 mg des Farbstoffes Serva Blau G-250 in 50 ml Ethanol (absolut) und 100 ml 85 % iger Orthophosphorsäure gelöst und anschließend mit Aqua dest. auf 1 l aufgefüllt. Das Bradford-Reagenz wurde dreimal durch Papierfilter (Schleicher & Schuell 595 1/2 Faltenfilter) filtriert und in einer dunklen Flasche bei 4 °C gelagert. 2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) Lösung A : Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat [0,2 mol/l]: 27,6 g/l Lösung B: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l Für die Herstellung von 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) wurden 8 ml Lösung A, 42 ml Lösung B und 50 ml Aqua dest. miteinander vermischt. 2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5) Lösung A: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l Lösung B: Zitronensäure-Monohydrat [0,1 mol/l]: 21 g/l Für den gewünschten pH-Wert von 7,5 wurden 88,7 ml Lösung A und 11,3 ml Lösung B miteinander vermischt. 2.2.11. Stärkepuffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung Für die Herstellung des Stärkepuffers wurde der Zitronensäurephosphat-Puffer (siehe Kap. 2.2.10.) mit 10 g/l löslicher Stärke versetzt und anschließend aufgekocht, um die Stärke zu lösen. 2.2.12. 2 x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970) Die Zusammensetzung des 2x SDS-Probenpuffers, sowie die Endkonzentrationen der verschiedenen Substanzen im Puffer sind in Tab. 2.11. dargestellt. Material und Methoden 13 Tab. 2.11.: Zusammensetzung des 2 x SDS-Probenpuffers Substanz Zugabe [µ µl] 10 % (w/v) SDS 1 % (w/v) Bromphenolblau 87 % (w/v) Glycerin 1 M Tris-HCl (pH 6,8) Endkonzentration im Puffer 400 200 230 170 4% 0,2 % 20 % 170 mM 2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung 2.2.13.1. Fixierer A Zur Herstellung dieser Lösung wurden 50 ml Methanol mit 10 ml Eisessig vermischt und auf 100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt. 2.2.13.2. Fixierer B Für die Herstellung von Fixierer B wurden 5 ml Methanol mit 7 ml Eisessig vermischt und auf 100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt. 2.2.13.3. Fixierer C Fixierer C ist eine 10 %ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung. 2.2.13.4. Entwickler Entwickler ist eine wässrige Lösung, die zu 3 % aus Na2CO3 und zu 0,0185 % aus Formaldehyd besteht. 2.3. Methoden 2.3.1. Hälterung der Organismen Die Reinkulturen der verschiedenen Stämme wurden in Petrischalen auf festem ASN-Medium (siehe Kap. 2.2.2.) von Dipl.-Biologin Annina Hube für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Zur Erhaltung von Stammkulturen wurde zunächst von den einzelnen Reinkulturen etwas Zellmaterial mit einer Impföse von den Platten entnommen und in jeweils 30 ml flüssiges ASNIII/2-Medium mit 10 g/l Fleischextrakt in 50 ml Erlenmeyerkolben überführt. Nach zwei Tagen Inkubation auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 120 rpm und 21 °C wurden die Stämme durch Begutachten des mikroskopischen Bildes (Zeiss Jürgens Mikroskop) auf Reinheit überprüft. Anschließend Material und Methoden 14 wurde von den Reinkulturen jeweils 200 µl in Eppendorfcups überführt und mit sterilem 87 %igen (w/v) Glycerin auf 1 ml aufgefüllt. Die auf diese Weise präparierten Stammkulturen wurden bei -80 °C gelagert. Zur Reaktivierung wurde aus den Eppendorfcups das aufgetaute Zellmaterial mit einer Impföse entnommen und auf feste Nährböden (ASNIII/2 mit 10 g/l Fleischextrakt) ausgestrichen. Die Platten wurden mit Parafilm gegen Austrocknen geschützt und bis zum Anwachsen der Kulturen bei 21 °C inkubiert. Danach wurden diese Platten bei 4 °C gelagert und dienten als Stammplatten zum Animpfen von flüssigen und festen Medien. 2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen Im ersten Teil dieser Arbeit sollten zunächst die in Tab. 2.1 aufgeführten Stämme hinsichtlich der Produktion von extrazellulären Enzymen untersucht werden. 2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994) Bei diesem Test wurden die Stärke-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.1.) mit den zu untersuchenden Stämmen von den Stammplatten (siehe Kap. 2.3.1.) punktförmig beimpft und 2-9 Tage bei 21 °C inkubiert. Danach wurden die Bakterien vorsichtig von den Agarplatten entfernt und die Platten für 2 min mit Lugolscher Lösung (siehe Kap. 2.2.7.) überschichtet. Das in dieser Lösung enthaltene Iod-Kaliumjodid färbt hochmolekulare Stärke dunkelblau an. Amylase-positive Stämme spalten die Stärkepolymere in ihrer Umgebung. Dies führte dazu, dass nach dem Abgießen der Lugolschen Lösung an den Stellen, wo sich diese Stämme befanden, farblose Zonen auftraten. 2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach Schreier, 1969) DNase-Toluidinblau-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.2.) wurden punktförmig beimpft und bei 21 °C inkubiert. DNase-positive Kolonien konnten durch die Bildung eines rosafarbenen Hofs auf dem ansonsten blau gefärbten Agar identifiziert werden. Die Platten wurden alle 2-4 Tage nach Farbveränderungen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert. 2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994) Magermilchpulverhaltige Agaplatten (siehe Kap. 2.2.4.3.) wurden punktförmig mit den zu untersuchenden Stämmen beimpft und bei 21 °C inkubiert. Peptidase produzierende Kolonien ließen sich durch die Entstehung eines klaren Hofes in dem trüben Agar identifizieren. Die Material und Methoden 15 Entstehung der klaren Höfe ist auf die Hydrolyse des im Magermilchpulver enthaltenen Caseins zurückzuführen. Die Platten wurden alle 2-4 Tage auf das Vorhandensein von klaren Höfen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert. 2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin-B-Agar (modifiziert nach Kouker & Jaeger, 1987) Bei diesem Test wurden die olivenölhaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.4.) punkförmig beimpft. Lipase-Aktivität konnte mittels Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 360 nm anhand der Fluoreszenz des feiwerdenden und sich im Wasser lösenden Rhodamin B nachgewiesen werden. Die Platten wurden bis zu vier Wochen lang inkubiert und alle 5-7 Tage mittels UV-Bestrahlung auf das Vorhandensein der Lipase-Aktivität untersucht. 2.3.3. Methoden zur Anreicherung und Bestimmung von Proteinen 2.3.3.1 Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium Für die Produktion der extrazellulären Amylasen wurden sechs 100 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 50 ml M1-Medium mit 10 g/l Maltose und sechs weitere 100 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 50 ml M1-Medium mit 5 g/l löslicher Stärke befüllt. Diese Medien wurden mit Stamm Bo 10-09 (siehe Tab. 2.1.) von einer Stammplatte (siehe Kap. 2.3.1) beimpft und bei 21°C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 120 rpm 3 Wochen lang inkubiert. Die Aufteilung der 300 ml der jeweiligen Medien in 50 ml Fraktionen wurde vorgenommen, weil aus Vorversuchen bekannt war, dass Stamm Bo 10-09 in dem M1-Medium mit Stärke in großem Mediumvolumen nicht anwächst. 2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis-Kultur Ein 50 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 20 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.3.) gefüllt. Anschließend wurden dem Medium 2 g/l unsterile lösliche Stärke hinzugegeben und das Medium beimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker) bei 100 rpm herangezogen. 2.2.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände Die Flüssigkulturen (siehe Kap. 2.3.3.1) wurden in Zentrifugenbecher überführt und für 30 min bei 4 °C und 10.000 x g in einer Zentrifuge (Beckman AvantiTM J-25) zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Zentrifugenbecher überführt und erneut unter gleichen Material und Methoden 16 Bedingungen für 30 min zentrifugiert. Zur Entfernung der restlichen Mikroorganismen aus den Überständen wurden diese mit Hilfe einer Pumpe (Jürgens) über einen Cellulose-AcetatFilter (Sartorius) mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Die sterilen Überstände wurden bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Zur Herstellung eines zellfreien Überstandes der Bacillus subtilis-Übernachtkultur wurden von dieser jeweils 1 ml in zwei 1,5 ml Eppendorfcups überführt und in einer Zentrifuge (Heraeus Instruments) bei 12.000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden die Aliquots vereinigt und sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius). 2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung Das Aussalzen der Proteine durch die Zugabe von Ammoniumsulfat ist die älteste und die am häufigsten angewendete Methode zur Proteinfällung. Ammoniumsulfat vergrößert hydrophobe Effekte in der Lösung und fördert Proteinaggregationen über hydrophobe Wechselwirkungen (Lottspeich & Zobras, 1998). Zur Fällung der Proteine wurde den Kulturüberständen (siehe Kap. 2.2.3.3.) unter Rühren in einem Eisbad Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 80 % zugegeben. Als Kontrollen wurden 250 ml unbeimpftes M1Medium mit 0,5 % Stärke und 250 ml unbeimpftes M1-Medium mit 1 % Maltose eingesetzt und der gleichen Behandlung unterzogen. Mit diesen Kontrollen wurden zuvor auch die in den Kap. 2.3.3.1 und 2.3.3.2 beschriebenen Arbeitsschritte durchgeführt. Nach der vollständigen Zugabe des Ammoniumsulfates zu den Ansätzen wurden diese für weitere 30 min in einem Eisbad gerührt und anschließend bei 10.000 x g für 40 min und bei 4 °C zentrifugiert (Beckman AvantiTM J-25). Die Überstände wurden entfernt und die Pellets in jeweils 3 ml 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert. Zur Entsalzung wurden die Proben in Dialyseschläuche mit einer Porengröße von 12-14 kDa überführt und über Nacht unter Rühren bei 4 °C gegen 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert. 2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976) Bei der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) wird der Farbstoff Serva Blau G-250 (Coomassie Brillantblau G-250) eingesetzt. Dieser Farbstoff bindet recht unspezifisch an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Komplexbildung zwischen Farbstoff und Protein bewirkt die Stabilisierung des Farbstoffes in seiner unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form, wodurch sich das Absorptionsmaximum von Coomassie Brillantblau G-250 von 465 zu 595 nm verschiebt (Lottspeich & Zobras, 1998). Somit kann der Farbstoff-Proteinkomplex photometrisch bei 595 nm bestimmt werden. Material und Methoden 17 Für die Proteinbestimmung wurden 50 µl Probe, 50 µl 2 M NaOH und 1 ml BradfordReagenz (siehe Kap. 2.2.8.) in ein Eppendorfcup gegeben und sofort auf einem Whirl-Mixer gemischt. Nach 90 s wurde die Absorption bei 595 nm in einem Photometer (Novaspec II Farmacia) in Kunststoff-Einmalküvetten gegen den Leerwert (entsprechendes Medium oder 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer) gemessen. Eine Eichkurve wurde mit Rinderserumalbumin (Stammlösung 0,1 mg/ml in 1 M NaOH) im Bereich von 0 bis 10 µg erstellt. 2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen 2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach Laemmli, 1970) Zur Analyse der extrazellulären Amylase wurden die mit Ammoniumsulfat-gefällten Proteine mittels der SDS-PAGE aufgetrennt. Bei dieser Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird das anionische Detergenz SDS (sodium dodecyl sulfate) benutzt. SDS überdeckt die Eigenladungen der Proteine, so dass Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen. Dadurch werden bei dieser Methode die Proteine im Wesentlichen nach ihrer Größe aufgetrennt (Lottspeich & Zobras, 1998). Die Ammoniumsulfat-gefällten Proben (siehe Kap. 2.3.3.4.) wurden im Verhältnis 1:2 mit dem Probenpuffer (siehe Kap. 2.2.12.) versetzt. Auf die Zugabe von Disulfidbrückenreduzierenden Substanzen und auf die Hitzedenaturierung der Proben wurde verzichtet, da dies zum Verlust der Enzymaktivität führen würde. Die Auftrennung erfolgte in einer vertikalen XCell SureLockTM Novex Mini-Cell Elektrophoresekammer (Invitrogen). Als Laufpuffer diente der 1:20 verdünnte NuPAGE MOPS-SDS-Laufpuffer (Invitrogen). Als Proteinmarker wurde ein vorgefärbter PageRuler Marker (Fermentas) mit Molekulargewichten von 10 bis 170 kDa eingesetzt. Die Geltaschen des fertigen NuPAGE 12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen) wurden mit 12 µl Probe bzw. 5µl Proteinmarker beladen. Die Auftrennung wurde bei 4 °C mit 150 V, 70 mA und 10 W für ca. 90 min durchgeführt. 2.3.4.2. Amylase-Aktivitätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert nach Kim et al., 1995; Lacks & Springhorn, 1980) Mit der Amylase-Aktivitätsfärbung kann die Amylaseaktivität der Proteinbanden im Gel nach der SDS-PAGE nachgewiesen werden. Material und Methoden 18 Nach der Auftrennung der Proteine durch die Elektrophorese wurde das Gel mit Aqua dest. gespült und anschließend 3 x 15 min bei 21 °C und 70 rpm auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) mit Zitronensäure-Phosphatpuffer (siehe Kap. 2.2.10.) gewaschen. Danach wurde dieser durch den Stärkepuffer (siehe Kap. 2.2.11.) ersetzt und das Gel bei gleichen Bedingungen für 1 h inkubiert. Anschließend wurde der Puffer abgegossen und das Gel gut mit Aqua dest. gespült, bis die anhaftende Stärke von der Oberfläche des Gels entfernt war. Die Färbung erfolgte in Lugolscher Lösung (siehe Kap. 2.2.7.) für 2 min. Die Amylaseaktivitäts-Zonen sollten als helle Bereiche im dunkelblau angefärbten Gel erscheinen. 2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine Die durch die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine sollten nach der Amylase-Aktivitätsfärbung mit 0,1 %igem Silbernitrat nach Wiechmann (1993) angefärbt und detektiert werden. Alle Einzelschritte der Färbung erfolgten unter Schwenken des Gels auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 80 rpm und RT. Zur Fixierung der Proteine wurde das Gel nacheinander für 30 min in Fixierer A (siehe Kap. 2.2.13.1.), für 20 min in Fixierer B (siehe Kap. 2.2.13.2.) sowie für 20 min in Fixierer C (siehe Kap. 2.2.13.3.) inkubiert. Zum Waschen wurde das Gel mit 100 ml Aqua dest. mittels eines Folienschweißgerätes (Petra Electrinic vacufix electron FS500A) in eine Folie eingeschweißt und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde eine Ecke der Folie aufgeschnitten, und es wurden 0,5 mg Dithiothreitol (DTT) in 1 ml Aqua dest. (Endkonzentration 5µg DTT/ml) zugegeben. Die Folie wurde verschweißt und das Gel für 20 min mit DTT zur Reduktion der Proteine inkubiert. Erneut wurde eine Ecke der Folie aufgeschnitten und die DTT-Lösung durch 100 ml 0,1 %ige Silbernitat-Lösung ausgetauscht. Zur Anbindung der Silber-Ionen an die Proteine wurde das Gel für 20 min in der SilbernitratLösung inkubiert. Danach wurde das Gel aus der Folie entnommen, mit Aqua dest. gespült und zweimal mit Entwickler (siehe Kap. 2.2.13.4.) überschichtet. Sobald eine gute Anfärbung der Proteinbanden zu erkennen war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,3 M Zitronensäure-Lösung gestoppt. Anschließend wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen und in einer 0,03 %igen Na2CO3-Lösung für 10 min konserviert. Material und Methoden 19 2.4. Chemikalien Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle Chemikalien in p.a.-Qualität von den Firmen Merck, Sigma-Adrich, Serva, Fluka, Riedel de Häen sowie Acros Organics bezogen. Ergebnisse 20 3. Ergebnisse 3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien Es wurden 12 Stämme mariner heterotropher Bakterien hinsichtlich der Produktion extrazellulärer Amylasen, DNasen, Peptidasen und Lipasen untersucht (siehe Kap. 2.3.2.). In Tab. 3.1. sind die Ergebnisse der Plattentests dargestellt. Tab. 3.1.: Produktion von Amylase, DNase, Peptidase und Lipase durch verschiedene marine heterotrophe Stämme Stamm Amylase DNase Peptidase Lipase + + + + + + + + + + + - + + - Bo 10-09 Bo 10-10 Bo 10-13 Bo 10-15 Bo 10-19 Bo 10-20 Bo 53-20 Bo 53-33 Bo 53-34 Bo 53-37 Bo 53-39 Bo 53-45 + = positives Testergebnis - = negatives Testergebnis Wie aus Tab. 3.1. ersichtlich, ist Amylase von den vier getesteten Enzymen das am häufigsten vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Bakterienstämmen. Dabei konnte bei sieben von insgesamt 12 Stämmen die Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Amylase festgestellt werden. Bei diesen Stämmen handelt es sich um Vertreter der α-Proteobakterien und der Bacteroidetes-Gruppe (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Als DNase-positiv erwiesen sich drei Stämme, die alle der Bacteroidetes-Gruppe angehören (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Peptidase könnte nur bei Stamm Bo 53-37 nachgewiesen werden. Bei zwei Stämmen konnte die Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Lipase festgestellt werden. Dabei ist einer dieser Stämme ein Vertreter der γ-Proteobakterien und der andere Stamm gehört der BacteroidetesGruppe an. In Abb. 3.1. sind Beispielplatten für den Nachweis extrazellulärer DNasen, Amylasen und Proteasen dargestellt. Ergebnisse 21 A B C Abb. 3.1.: Beispielplatten für den Nachweis der Produktion von extrazellulären Enzymen. A: DNaseNachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar; positive Kolonien konnten anhand der Bildung eines rosafarbenen Hofes um die Kolonien identifiziert werden. B: Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar; positive Kolonien waren nach dem Überschichten mit Lugolscher Lösung anhand farbloser Zonen zu erkennen. C: Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar; positive Kolonien konnten anhand klarer Hydrolyse-Höfe identifiziert werden. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (hp photosmart 715) und bei A und B zusätzlich mit Hilfe einer Durchlicht-Einrichtung (Schütt Labortechnik KolonienZähler). Stämme mit Enzymaktivitäten wurden mit einem Pfeil markiert. Stämme mit der höchsten Amylaseaktivität sind bei B mit einem grünen Pfeil markiert. Mit den Plattentests konnte gezeigt werden, dass Amylase von den getesteten Enzymen das am häufigst vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Stämmen ist. Daher wurden die Stämme mit Amylaseaktivität für weitere Arbeit ausgewählt und näher untersucht. 3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar Es sollte untersucht werden, welcher von den sieben ausgewählten Amylase-produzierenden Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufweist. Dieser Test wurde, wie im Kap. 2.3.2.1. beschrieben, durchgeführt. Die Amylaseaktivität wurde anhand der Größe der Klarzone auf Stärke-Agar im Vergleich mit dem Kolonie-Durchmesser nach 2, 3, 5 und 9 Tagen Inkubation bestimmt. Tab. 3.2.: Amylaseaktivität bei Amylase-positiven Stämmen auf festen Medien nach 2, 3, 5 und 9 Tagen Inkubation Zeit [d] Stamm Bo 10-09 Bo 10-10 Bo 10-13 Bo 10-20 Bo 53-33 Bo 53-34 Bo 53-45 2 3 5 9 +++ + + ++ + +++ +++ ++ + + ++ ++ +++ +++ ++ ++ + ++ ++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ - = keine Amylaseaktivität: keine Klarzone; + = geringe Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie < Kolonie-Durchmesser; ++ = mittlere Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie entspricht dem Kolonie-Durchmesser; +++ = starke Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie > KolonieDurchmesser Ergebnisse 22 Die Ergebnisse in Tab. 3.2. zeigen, dass die Stämme Bo 10-09 und Bo 53-45 nach 2, 3 und 5 Tagen Inkubation die höchste Amylaseaktivität aufweisen (siehe Abb. 3.1. B). Vermutlich handelt es sich bei den beiden Isolaten um ein Duplikat und somit um die gleiche Art (Annina Hube, persönliche Mitteilung). Daher wurde der Stamm Bo 10-09 für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. 3.2. Untersuchungen zur Expression der Amylase codierender Gene Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde bei Stamm Bo 10-09, welcher die höchste Amylaseaktivität aufwies (siehe Kap. 3.1.1.), die Expression der Amylase codierenden Gene untersucht. Dabei sollte festgestellt werden, ob es sich bei der Amylase um ein konstitutives oder induzierbares Enzym handelt. Dazu wurden Medien, welche Stärke oder Maltose als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthalten, mit diesem Stamm beimpft. Nach ausreichender Inkubation sollten zellfreie Überstände von den Kulturen gewonnen und die darin enthaltenen Proteine gefällt werden. Anschließend sollten die Proteine der verschiedenen Ansätze mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf das Vorhandensein von Amylaseaktivität getestet werden. 3.2.1. Anreicherung der Amylase In Abb. 3.2. sind die Kulturen des Stammes Bo 10-09 sowie Negativkontrollen (unbeimpfte Medien) nach dreiwöchiger Inkubation dargestellt. S SNEG MNEG M Abb.3.2.: Kulturen des Stammes Bo 10-09 nach dreiwöchiger Inkubation in M1-Medium mit 0,5 % Stärke oder 1 % Maltose und die entsprechenden Negativkontrollen. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (hp photosmart 715). S = Kulturen, die in M1-Medium mit Stärke herangezogen wurden SNEG = unbeimpftes M1- Medium mit Stärke MNEG = unbeimpftes M1-Medium mit Maltose M = Kulturen, die in M1-Medium mit Maltose herangezogen wurden Die Kulturen, welche auf Stärke gewachsen sind, weisen eine rötliche Färbung auf. Die Färbung der Kulturen, die auf Maltose gewachsen sind, ist gelblich. Das unbeimpfte Medium Ergebnisse 23 mit Stärke ist aufgrund der ungelösten Stärkepolymere sehr trüb, wohingegen das Medium mit Maltose klar ist. Die Anreicherung der Amylase aus den Kulturüberstanden des Stammes Bo 10-09 (siehe Kap. 2.3.3.3.) erfolgte mittels der Ammoniumsulfatfällung. Die Proteinkonzentrationen in den zellfreien Kulturüberstanden waren unter der Detektionsgrenze der Methode nach Bradford (siehe Kap. 2.3.3.5.). 3.2.2. Ammoniumsulfatfällung Die Proteine in den Kulturüberständen, welche 1 % Maltose oder 0,5 % Stärke enthielten, wurden bei einer 80 % igen Sättigung mit Ammoniusulfat gefällt. Die Fällung der Proteine in dem Ansatz, welches Stärke beinhaltete, erwies sich als problematisch. Es hat sich herausgestellt, dass Stärke bei Zugabe von Ammoniumsulfat ausfällt. Dadurch wurde nach der Zentrifugation ein großes Stärke-Protein-Pellet erhalten. Nach der Dialyse betrug die Proteinkonzentation in dem Ansatz mit Stärke 1,74 µg/ml und in dem Ansatz mit Maltose 0,6 µg/ml. 3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel Mit Hilfe der Amylase-Aktivitätsfärbung sollten die Proben auf Anwesenheit von Amylase getestet werden. Auf diese Weise sollte überprüft werden, ob der Stamm Bo-10-09 die Fähigkeit besitzt, sowohl bei Anwesenheit von Stärke als auch bei Anwesenheit von Maltose, extrazelluläre Amylasen zu produzieren. In Tab. 3.3. ist das Auftragsschema der Proben im Gel für die SDS-PAGE dargestellt. Ergebnisse 24 Tab. 3.3.: Auftragsschema der Proben im Gel zum Nachweis von Amylase Tasche 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Probe PageRuler Proteinstandard Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) unbeimpftes Medium mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) unbeimpftes Medium mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) zellfreier Übertand der Bacillus subtilis-Übernachtkultur (siehe Kap. 2.3.3.3.) - = Tasche wurde nicht beladen In Abb. 3.3. ist das SDS-Gel nach der Überschichtung mit Lugolscher Lösung dargestellt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abb. 3.3.: SDS-Gel nach Amylase-Aktivitätsfärbung mit Lugolscher Lösung. Auftragsschema der Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt. Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines Scanners (Canon CanoScan 3200 F). Ergebnisse 25 Wie man in Abb. 3.3. sieht, konnten in dem dunkel angefärbten SDS-Gel keine hellen Hydrolyse-Zonen festgestellt werden. Somit konnte bei keiner der Proben Amylaseaktivität nachgewiesen werden. Das gilt auch für den Überstand der Bacillus subtilis-Kultur (Spur 15), der als Positivkontrolle dienen sollte. 3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine Nach der Amylase-Aktivitätsfärbung wurden die Proteine im Gel mittels der Silbernitratfärbung visualisiert. Das Gel ist in Abb. 3.4. dargestellt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 kDa 170 130 100 72 55 40 33 24 17 11 Abb.3.4.: SDS-Gel nach Silbernitratfärbung der Proteine. Die Molekulargewichte der Markerproteine befinden sich links in der Abbildung. Auftragsschema der Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt. Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines Scanners (Canon CanoScan 3200 F). Wie aus Abb. 3.4. ersichtlich, sind in den Spuren 4 und 10 zahlreiche Proteinbanden zu erkennen. Das bedeutet, dass die Bakterien des Stamms Bo 10-09 in Anwesenheit von Maltose (Spur 4) oder Stärke (Spur 10) Proteine ins Medium abgegeben haben. Aufgrund der fehlenden Hydrolyse-Zonen bei der Amylase-Aktivitätsfärbung (siehe Kap. 3.2.3.) ist es jedoch nicht möglich festzustellen, bei welchen Banden es sich um Amylasen handelt. Es ist jedoch deutlich zu erkennen, dass in Spur 10 mehr Proteinbanden sind als in Spur 4. Im Überstand der Bacillus subtilis-Kultur konnten keine Proteinbanden nachgewiesen werden (Spur 15), was die nicht vorhandene Amylaseaktivität (siehe Kap. 3.2.3.) erklärt. Diskussion 26 4. Diskussion 4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten 12 Stämme sind heterotrophe Begleitbakterien mariner filamentöser Cyanobakterien. Diese heterotrophen Bakterien beziehen ihre Nährstoffe wahrscheinlich aus der Biomasse der Cyanobakterien. Daher wurde angenommen, dass diese Bakterien viele extrazelluläre Enzyme produzieren müssen, um Substrate wie Glykogen, Membranlipide, Proteine, DNA u.a. spalten zu können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die meisten der 12 getesteten marinen heterotrophen Bakterienstämme zur Produktion von extrazellulären Enzymen fähig sind. Dabei konnte nur bei einem Stamm extrazelluläre Peptidase nachgewiesen werden. Lipaseaktivität konnte bei zwei Stämmen auf den Olivenöl-Rhodamin-B-Agarplatten festgestellt werden. Beim Lipase-Nachweis erwies sich die Detektion mit UV-Licht als problematisch, weil nur geringe Fluoreszenz am Kolonienrand zu sehen war. Zudem konnte die Fluoreszenz nur in einem begrenzten Zeitraum der Inkubation detektiert werden. Nach Benedik & Strych (1998) kommen extrazelluläre Nukleasen selten bei Bakterien vor. In dieser Arbeit wurden bei drei von zwölf getesteten Stämmen extrazelluläre DNasen nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass extrazelluläre Amylasen weit verbreitet bei den cyanobakteriellen Begleitbakterien sind. Cyanobakterien können Glykogen speichern. Vermutlich nutzen viele Begleitbakterien Glykogen aus der partiell zersetzten cyanobakteriellen Biomasse als Energieund Kohlenstoffquelle, was die vermehrte Produktion von Amylasen erklären würde. 4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene In dieser Arbeit ist es nicht gelungen, die Amylaseaktivität im Gel nach der SDS-PAGE nachzuweisen. Somit konnte nicht festgestellt werden, ob es sich bei den extrazellulären Amylasen des Stamms Bo 10-09 (Muricauda aquimarina) um konstitutive oder induzierbare Enzyme handelt. Vermutlich wurde keine ausreichende Menge an Amylasen ins Medium abgegeben, denn die Proteinkonzentrationen in den zellfreien Kulturüberständen waren unter der Detektionsgrenze. Auch nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat waren die Proteinkonzentrationen mit 1,74 µg/ml im Ansatz mit Stärke und 0,6 µg/ml im Ansatz mit Maltose sehr niedrig. Dies könnte auf Verdünnungseffekte im Flüssigmedium zurück zu führen sein, weil auf festen Medien dieser Stamm im Vergleich zu anderen in dieser Arbeit untersuchten Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufwies. Good und Hartman (1970) Diskussion 27 haben nämlich beobachtet, dass von festen Medien mit Halobacterium halobium größere Mengen an Amylasen erhalten werden als aus Flüssigkulturen. Bei der Anreicherung der Amylasen mit Ammoniumsulfat wurde zusätzlich unerwünscht Stärke mitgefällt, wodurch mengenmäßig betrachtet ein sehr viel größerer Pellet im Vergleich zum Ansatz mit Maltose erhalten wurde. Dementsprechend musste das Pellet in einem größeren Volumen Puffer resuspendiert werden, was wiederum zur Verdünnung der Proteine in der Probe führte. Vorversuche haben bereits gezeigt, dass Stärke mit Ammoniumsulfat gefällt wird, daher wurde bei der Herstellung der Medien die Konzentration von Stärke niedriger gewählt als die von Maltose. Zudem sollte die relativ lange Inkubationsdauer (drei Wochen) der Kulturen gewährleisten, dass möglichst viel Stärke hydrolisiert und von den Bakterien verwertet wird und daher weniger bei der Fällung ausfällt. Jedoch konnte das Ausfallen der Stärke trotz dieser Maßnahmen nicht verhindert werden. Wahrscheinlich müsste man die Konzentration der Stärke im Medium noch viel niedriger wählen. Außerdem kann eine zu lange Inkubation der Kultur zur Abnahme der Amylaseaktivität führen. Nach Kim und Mitarbeitern (1995) tritt dies bei der Amylase von Bacilluc sp. Stamm GM8901 ein. In einer Arbeit von Kim und Mitarbeitern (1995) wurde eine Amylase von Bacilluc sp. Stamm GM8901 aufgereinigt. Dazu wurde dieser Stamm im Medium mit 1 % löslicher Stärke kultiviert. Nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat (80 %) und einer anschließenden Dialyse der Enzymlösung wurde diese bei 15.000 x g für 30 min zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. In der vorliegenden Arbeit wurde keine Zentrifugation nach der Dialyse vorgenommen. Dieser zusätzliche Zentrifugationsschritt könnte möglicherweise eine Trennung der Stärke von den Proteinen bewirken. Weitere Optimierungen der Methoden konnten jedoch aus Zeitgründen nicht mehr vorgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit sollten die heterotrophen Begleitbakterien der Cyanobakterien hinsichtlich der Produktion extrazellulärer Enzyme gestestet werden. Außerdem sollte anhand der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob der Stamm mit der höchsten Amylaseaktivität für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist. Nach Buchholz und Kasche (1997) sinken die Kosten der Enzymproduktion und Aufarbeitung mit steigendem Enzymgehalt in den Enzymquellen. Dabei ist das Verhältnis zwischen dem Preis eines Enzyms und seinen anwendungstechnischen Nutzen entscheidend Diskussion 28 dafür, ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt (Schmid, 2006) (siehe auch Kap. 1.2.1.). Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass Muricauda aquimarina die extrazellulären Amylasen in sehr geringen Mengen produziert. Daher ist dieser Stamm wahrscheinlich als Amylasequelle für den technischen Einsatz ungeeignet. Nach Whitehead und Mitarbeiter (2001) kann die Produktion von extrazellulären Enzymen bei bestimmten Gram-negativen Bakterien durch Quorum sensing reguliert werden. Bei diesem Regulationsmechanismus werden von den einzelnen Bakterien bestimmte N-AcylHomoserin-Laktone (AHLs) produziert und durch Diffusion in die Umgebung abgegeben. Bei hoher Zelldichte steigt die Konzentration von AHLs in der Umgebung. Dadurch können die AHLs in die Nachbarzellen diffundieren und die Expression bestimmter Gene induzieren (Madigan et al., (2003). In der vorliegenden Arbeit konnte nicht bestimmt werden, ob die Produktion der Amylasen bei Muricauda aquimarina durch die Anwesenheit bestimmter Kohlenstoffquellen induziert oder reprimiert wird. Es gibt jedoch Indizien dafür, dass die Produktion von Amylasen bei diesem Stamm durch AHLs reguliert wird. Es wurde beobachtet, dass Muricauda aquimarina in 500 ml Medium mit Stärke als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle nicht anwächst. Jedoch wachsen diese Bakterien in demselben Volumen des gleichen Mediums, welches Maltose als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthält. In kleinen Medienvolumen wächst diese Bakterienart sowohl auf Stärke als auch auf Maltose. Dies kann dadurch erklärt werden, dass in großen Volumina die AHLs stark verdünnt werden und daher keine Induktion der Expression Amylase codierender Gene stattfindet. Ohne extrazelluläre Amylasen kann die Stärke nicht in kleinere Moleküle gespalten werden, was zum „Verhungern“ der Mikroorganismen führt. Ein weiterer Grund für diese Beobachtung könnte auch nicht die Verdünnung der AHLs, sondern die Verdünnung der extrazellulären Amylasen sein. Um festzustellen, ob die Produktion der Amylasen von den AHLs abhängt, müsste dieser Stamm auf AHL-Produktion getestet werden. Anschließend müsste überprüft werden, ob durch die Zugabe bestimmter AHLs zum Medium dieser Stamm eine größere Menge an Amylasen produziert. Literaturverzeichnis 29 5. Literaturverzeichnis BENEDIK MJ, STRYCH U (1998) Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol Lett 165: 1-13 BRADFORD MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254 BUCHHOLZ K, KASCHE V (1997) Biokatalysatoren und Enzymtechnologie. VCH Verlag, Weinheim FRITSCHE W (2002) Mikrobiologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin GERHARDT P, MURRAY RGE, WOOD WA, KRIEG NR (1994) Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington DC, USA GOOD WA, HARTMAN PA (1970) Properties of the amylase from Halobacterium halobium. J Bacteriol 104: 601-603 JAEGER KE, REETZ MT (1998) Microbial lipases from versatile tools for biotechnology. 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