Die Bildung von extrazellulären DNA - TiHo Bibliothek elib

Aus dem Institut für Physiologische Chemie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Bildung von extrazellulären DNANetzen in der Immunabwehr gegen
bakterielle Infektionen
Habilitationsschrift
zur Erlangung der VENIA LEGENDI
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. rer. nat. Maren von Köckritz-Blickwede
Hannover 2014
Tag der nichtöffentlichen
wissenschaftlichen Aussprache: 07.07.2014
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG KO-3552/4-1), durch Stipendien der Deutschen Akademie der
Naturforscher Leopoldina (BMBF-LPD 9901/8-187), des Deutschen Akademischen
Austauschdienst (DAAD) und der Akademie für Tiergesundheit gefördert.
Für meine ganze Familie
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Liste der verwendeten Publikationen
7
2.
Abkürzungsverzeichnis
11
3.
Einleitung
13
3.1.
3.2.
3.3
Entdeckung der extrazellulären DNA-Netze im Kampf gegen
Infektionskrankheiten
Grundlegende Mechanismen der Bildung von DNA-Netzen
Assoziation der DNA-Netz-Bildung
mit spezifischen Krankheiten
14
15
19
4.
Ziele der Arbeit
21
5.
Ergebnisse
23
5.1.
5.2.
23
5.3.
5.4.
6.
Visualisierung und funktionelle Evaluierung von DNA-Netzen
Untersuchungen der Mechanismen,
die zur DNA-Netz-Bildung führen
Charakterisierung von bakteriellen Anti-DNA-Netz-Faktoren
Charakterisierung von pharmakologischen Substanzen auf ihre
Fähigkeit, DNA-Netz-Bildung zu verstärken oder DNA-Netze zu
stabilisieren
Übergreifende Diskussion
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
Charakterisierung der DNA-Netze bei verschiedenen Zelltypen
und in verschiedenen Tierarten
Mechanismen der DNA-Netz-Bildung:
Zelltod versus lebende Zellen
Die Rolle von DNA-Netzen gegen Infektionserreger
Extrazelluläre DNA-Netze und ihre negative Assoziation mit
spezifischen Krankheitsbedingungen
Abschließende Diskussion und wissenschaftlicher Ausblick
24
26
29
31
31
36
37
39
42
7.
Zusammenfassung
45
8.
Summary
49
9.
Literaturverzeichnis
53
10.
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
65
11.
Danksagung
73
12.
Anhang (16 verwendete Publikationen)
77
5
Liste der verwendeten Publikationen
1.
Liste der verwendeten Publikationen
Die Auflistung der 16 verwendeten Publikationen erfolgte entsprechend der
inhaltlichen Aufteilung. Der eigene Anteil an den Publikationen ist in Kapitel 10
dargestellt.
Publikation 1:
von Köckritz-Blickwede M, Nizet V. Innate immunity turned
inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular
traps. J Mol Med. 2009; 87(8): 775-83.
Publikation 2:
von Köckritz-Blickwede M, Chow OA, Nizet V. Fetal calf serum
contains
heat-stable
nucleases
that
degrade
neutrophil
extracellular traps. Blood. 2009; 114(25): 5245-6.
Publikation 3:
von Köckritz-Blickwede M, Chow O, Ghochani M, Nizet V.
Visualization and functional evaluation of phagocyte extracellular
traps. In: Methods in Microbiology (Volume 37) Immunology of
Infection Immunology, 3rd edition (Kaufmann SH and Kabelitz D,
eds). Academic Press, London, p. 139-160 (2010).
Publikation 4:
Kisseleva T, von Köckritz-Blickwede M, Reichart D, McGillvray
SM, Wingender G, Kronenberg M, Glass CK, Nizet V, Brenner
DA. Fibrocyte-like cells recruited to the spleen support innate and
adaptive immune responses to acute injury or infection. J Mol
Med. 2011; 89(10): 997-1013.
Publikation 5:
Akong-Moore K, Chow OA, von Köckritz-Blickwede M, Nizet V.
Influences of chloride and hypochlorite on neutrophil extracellular
trap formation. PLoS One. 2012; 7(8): e42984.
Publikation 6:
Branitzki-Heinemann K, Okumura CY, Völlger L, Kawakami Y,
Kawakami T, Naim HY, Nizet V, von Köckritz-Blickwede M. A
novel role for the transcription factor HIF-1α in the formation of
mast cell extracellular traps. Biochem J. 2012; 446(1): 159-63.
7
Liste der verwendeten Publikationen
Publikation 7:
Okumura CY, Hollands A, Tran DN, Olson J, Dahesh S, von
Köckritz-Blickwede M, Thienphrapa W, Corle C, Jeung SN,
Kotsakis A, Shalwitz RA, Johnson RS, Nizet V. A new
pharmacological agent (AKB-4924) stabilizes hypoxia inducible
factor-1 (HIF-1) and increases skin innate defenses against
bacterial infection. J Mol Med. 2012; 90(9): 1079-89.
Publikation 8:
Short KR, von Köckritz-Blickwede M, Langereis JD, Chew KY,
Job ER, Armitage CW, Hatcher B, Fujihashi K, Reading PC,
Hermans PW, Wijburg OL, Diavatopoulos DA. Antibodies
mediate formation of neutrophil extracellular traps in the middle
ear and facilitate secondary pneumococcal otitis media. Infect
Immun. 2014; 82(1): 364-70.
Publikation 9:
Berends ET, Horswill AR, Haste NM, Monestier M, Nizet V, von
Köckritz-Blickwede M. Nuclease expression by Staphylococcus
aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. J
Innate Immun. 2010; 2(6): 576-86.
Publikation 10:
de Buhr N, Neumann A, Jerjomiceva N, von KöckritzBlickwede M*, Baums CG*. Streptococcus suis DNase SsnA
contributes to degradation of neutrophil extracellular traps
(NETs) and evasion of NET-mediated antimicrobial activity.
Microbiology. 2014; 160(Pt2): 385-95. [*contributed equally to the
manuscript]
Publikation 11:
van Sorge NM, Beasley FC, Gusarov I, Gonzalez DJ, von
Köckritz-Blickwede M, Anik S, Borkowski AW, Dorrestein PC,
Nudler E, Nizet V. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
bacterial nitric-oxide synthase affects antibiotic sensitivity and
skin abscess development. J Biol Chem. 2013; 288(9): 6417-26.
8
Liste der verwendeten Publikationen
Publikation 12:
Cole JN, Pence MA, von Köckritz-Blickwede M, Hollands A,
Gallo RL, Walker MJ, Nizet V. M protein and hyaluronic acid
capsule are essential for in vivo selection of covRS mutations
characteristic of invasive serotype M1T1 group A Streptococcus.
MBio. 2010; 1(4).
Publikation 13:
Chow OA*, von Köckritz-Blickwede M*, Bright AT, Hensler ME,
Zinkernagel AS, Cogen AL, Gallo RL, Monestier M, Wang Y,
Glass CK, Nizet V. Statins enhance formation of phagocyte
extracellular traps. Cell Host Microbe. 2010; 8(5): 445-54.
[*contributed equally to the manuscript]
Publikation 14:
Brogden G*, von Köckritz-Blickwede M*, Adamek M, Reuner F,
Jung-Schroers V, Naim HY, Steinhagen D. β-Glucan protects
neutrophil extracellular traps against degradation by Aeromonas
hydrophila in carp (Cyprinus carpio). Fish Shellfish Immunol.
2012; 33(4): 1060-4. [*contributed equally to the manuscript]
Publikation 15:
Brogden G, Krimmling T, Adamek M, Naim HY, Steinhagen D,
von Köckritz-Blickwede M. The effect of β-glucan on formation
and functionality of neutrophil extracellular traps in carp
(Cyprinus carpio L.). Dev Comp Immunol. 2014; 44(2): 280-285.
Publikation 16:
Jerjomiceva N, Seri H, Völlger L, Wang Y, Zeitouni N, Naim HY,
von
Köckritz-Blickwede
M.
Enrofloxacin
enhances
the
formation of neutrophil extracellular traps in bovine granulocytes.
J. Innate Immun. 2014; Mar 14. [Epub ahead of print]
9
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A. hydrophila
ATP
bNOS
CD45
ClCRAMP
Dapi
DNA
DPI
ETs
FCS
FeLV
h
H2O2
HIF-1α
HMC-1
HOCl
IgA
IL
L. monocytogenes
LPS
MCETs
min
MRSA
NETs
nm
NO
P. aeruginosa
PAD-4
PMA
ROS
S. aureus
S. pneumoniae
S. pyogenes
S. suis
TLR
z.B.
µm
Aeromonas hydrophila
Adenosintriphosphat
Stickstoffmonoxid-Synthase
Clusters of differentiation 45
Chlorit
Cathelicidin-related antimicrobial peptide
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
Diphenyleniodonium
Extracellular Traps (Extrazelluläre DNA-Netze)
Fetal calf serum (Fetales Kälberserum)
Felines Leukämie-Virus
Stunde (hour)
Wasserstoffperoxid
Hypoxia inducible factor 1α (Hypoxie induzierender Faktor 1α)
Humane Mastzellen
Hypochlorit
Immunglobulin A
Interleukin
Listeria monocytogenes
Lipopolysaccharide
Mast cell extracellular traps (Mastzell extrazelluläre DNANetze)
Minute
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
Neutrophil extracellular traps (Neutrophile extrazelluläre DNANetze)
Nanometer
Stickstoffmonoxid
Pseudomonas aeruginosa
Peptidyl-arginin-deiminase-4
Phorbol-12-myristat-13-acetat
Reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies)
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus suis
Toll-like receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor)
Zum Beispiel
Mikrometer
11
Einleitung
3.
Einleitung
Das Immunsystem des Menschen hat verschiedene Strategien entwickelt, um die
Ausbreitung von Pathogenen – Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten – im Körper zu
kontrollieren und ihre pathogenen Wirkungen zu verhindern. Immunzellen wie
Neutrophile,
Makrophagen
und
Mastzellen
stellen
in
der
Abwehr
von
Krankheitserregern die erste Verteidigungslinie dar. Sie nehmen in den Körper
eingedrungene Bakterien auf und zerstören diese mittels so genannter Phagozytose.
Im Jahr 2004 ist jedoch ein neuer Mechanismus entdeckt geworden (Brinkmann et
al., 2004): Die Zellen werfen gewissermaßen extrazellulär ein Netz aus DNA aus, in
dem die Bakterien gefangen und teilweise auch abgetötet werden. Die neu
entdeckten Strukturen wurden von den Wissenschaftlern extrazelluläre DNA-Netze
oder im englischen ETs (extracellular traps) getauft. Ein wesentlicher Bestandteil der
DNA-Netze ist Chromatin (DNA und Histone) sowie bestimmte Zelltyp-spezifische
Proteine aus dem Zytoplasma, welche Mikroorganismen einfangen und ihre
Ausbreitung verhindern können.
Abbildung 1: Pseudomonas (P.) aeruginosa gefangen in extrazellulären DNA-Netzen (von
Köckritz-Blickwede et al., 2008).
In den folgenden Kapiteln der Einleitung werden die wesentlichen Mechanismen, die
zu der Bildung von DNA-Netzen führen, sowie die Rolle der DNA-Netze bei der
Abwehr von Infektionskrankheiten zusammengefasst. Eine detaillierte Übersicht
bietet zusätzlich die Publikation Nr. 1 (Anhang 12.1). Die zusammengefassten
Erkenntnisse aus diesem Übersichtsartikel dienten als Ausgangspunkt für die
weiterführenden Studien, die im Rahmen dieser Habilitationsschrift durchgeführt
wurden.
13
Einleitung
3.1.
Entdeckung
der
extrazellulären
DNA-Netze
im
Kampf
gegen
Infektionskrankheiten
Die hauptsächliche Aufgabe von Phagozyten wie Neutrophilen in der angeborenen
Immunabwehr
gegen Infektionserreger wird klassischerweise als intrazelluläre
Abtötungsmethode verstanden. Nach dem Kontakt mit den Eindringlingen nehmen
die Phagozyten die Mikroorganismen in ihre Vakuolen (Phagosomen) auf. Die
effiziente
Aufnahme
wird
über
Opsonisierung
mittels
zirkulierender
Komplementfaktoren erleichtert oder aber im Falle des nicht-naiven Wirtes über
spezifische Antikörper gegen das Pathogen vermittelt. Die Phagosomen fusionieren
mit den intrazellulären Lysosomen zu den Phagolysosomen, in denen die Erreger
über eine Kombination von oxidativen und nicht-oxidativen Abtötungsmechanismen
zerstört werden (Nathan, 2006; Serbina et al., 2008). Potente nicht-oxidative
Tötungsmechanismen beinhalten die Produktion von antimikrobiellen Peptiden wie
zum Beispiel (z.B.) der Cathelicidine, Defensine, Cathepsine oder degradierender
Proteasen. Sauerstoff-abhängig werden antimikrobielle reaktive Sauerstoffspezies
(reactive oxygen species, ROS)
mittels eines Membran-gebundenen NADPH-
Oxidase-Enzym-Komplexes gebildet (Rada und Leto, 2008).
Vor einigen Jahren ist ein Mechanismus in Neutrophilen entdeckt worden (Brinkmann
et al., 2004), der das oben beschriebene klassische Konzept der Phagozytenfunktion
in einer faszinierenden aber auch provokativen Art und Weise verändert hat: Die
Ausbildung von sogenannten neutrophil extracellular traps (NETs) wurde mittels
hochauflösender Mikroskopietechniken beschrieben. Diese NETs wurden als
extrazelluläre DNA-Stränge mit einem Durchmesser von circa 15 bis 17 nm gezeigt,
an denen sich punktuell auch globuläre Proteine befinden, die Aggregate von circa
50 nm formen. In den NETs befinden sich vor allem kationische Proteine und Peptide
wie Histone und Cathelicidine, die in der Lage sind, Bakterien wie z.B. Listeria (L.)
monocytogenes oder Staphylococcus (S.) aureus einzufangen und zu töten
(Brinkmann et al., 2004). Da dieser antimikrobielle Mechanismus auch stattfinden
kann, wenn die Phagozytose pharmakologisch über den Aktin-Mikrofilament-Inhibitor
Cytochalasin D gehemmt wird, ist davon auszugehen, dass die NET-Bildung
Phagozytose-unabhängig abläuft (Fuchs et al., 2007). Allerdings konnte gezeigt
werden, dass die antimikrobielle Aktivität der NETs unterbunden werden kann, wenn
die Zellen mit Nukleasen behandelt werden, die die NET-Strukturen zerstören. DNA
14
Einleitung
ist also das Grundgerüst der NETs (Brinkmann et al., 2004). Einer der besten
Beweise dafür, dass das DNA-Gerüst schließlich eine protektive Rolle im
Infektionsverlauf darstellt, konnte schließlich mittels bakterieller Mutagenese gezeigt
werden, wodurch letztendlich das Gleichgewicht zwischen der Erreger-WirtInteraktion gestört wird. Bereits kurz nach der Entdeckung der NETs, konnten zwei
unterschiedliche
Arbeitsgruppen
zeigen,
dass
die
pathogenen
Bakterien
Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) in der Lage sind, der antimikrobiellen
Aktivität der NETs durch die Produktion von Nukleasen zu entkommen (Buchanan et
al., 2006; Sumby et al. 2005). Diese Nukleasen sind in der Lage, die NETs zu
degradieren und somit die Virulenz von S. pyogenes in vitro und in vivo zu steigern.
Eine bakterielle Mutante, die defizient in der Produktion der Nuklease Sda1 ist, zeigt
sich
empfindlicher
gegenüber
der
antimikrobiellen
Aktivität
von
humanen
Neutrophilen und weist eine geschwächte Virulenz in einem murinen Modell der
nekrotisierenden Fasziitis auf (Buchanan et al., 2006). Gleicher Phänotyp konnte für
eine Nuklease-Mutante für S. pnyeumoniae gezeigt werden, die geschwächte
Virulenz in einem murinen Pneumoniemodell aufweist (Beiter et al., 2006). Anhand
dieser Experimente ließ sich belegen, dass eine effiziente NETs-Degradation durch
Pathogene den Infektionsverlauf aus Sicht des Wirtes negativ beeinflussen kann.
3.2.
Grundlegende Mechanismen der Bildung von DNA-Netzen
Einige experimentelle Studien konnten schließlich auch auf der Wirtsseite wichtige
Faktoren für die Bildung von DNA-Netzen identifizieren (Fuchs et al., 2007). Es hat
sich gezeigt, dass die DNA-Netz-Bildung mit einer erhöhten Produktion an ROS
mittels der membranständigen NADPH-Oxidase einhergeht, die z.B. mit Phorbol-12myristat-13-acetat (PMA) ausgelöst werden kann. Wenn die Bildung von ROS
chemisch mittels Diphenyleniodonium (DPI), einem Inhibitor der NADPH-Oxidase,
blockiert wird, wird die DNA-Netz-Bildung reduziert. In Korrelation dazu zeigen
Neutrophile
mit
chronischer
granulomatöser
Erkrankung,
einer
genetischen
Fehlfunktion der NADPH-Oxidase (Heyworth et al., 2003), eine Defizienz in der
Ausbildung von DNA-Netzen (Fuchs et al., 2007). Dieses Phänomen ist vermutlich
ein weiterer Faktor neben der verringerten Phagozytoseaktivität der Zellen, der zu
15
Einleitung
einer hohen Empfindlichkeit dieser Patienten gegenüber Infektionskrankheiten
beiträgt.
Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die DNA-Netz-Bildung mit einer
besonderen Art von Zelltod, der sogenannten NETose (englisch NETosis),
einhergeht (Fuchs et al., 2007). Im Gegensatz zu nekrotischen oder apoptotischen
Zellen, zeigen die NETose-Zellen eine prälytische Dekondensierung des Chromatins
und die Auflösung der Kernmembran. Das Auflösen der Kernmembran sorgt
schließlich dafür, dass das Kernmaterial (DNA und Histone) aus dem Kern austreten
kann und sich mit dem Zytoplasma und den Inhalten der zytoplasmatischen Granula
der Zelle vermischt. In der Tabelle 1 werden einige Faktoren beschrieben, die bei der
NETose eine wesentliche Rolle spielen und sich von den klassischen anderen
Zelltodmechanismen der Nekrose oder Apoptose unterscheiden. Neben den
typischen morphologischen Merkmalen, ist die antimikrobielle Wirkung der NEToseZellen nach ihrem Tod schließlich für die Immunabwehr von besonderer Bedeutung.
Somit sind die Zellen, vor allem kurzlebige Zellen wie Neutrophile, auch nach ihrem
Tod zum Schutz anderer gesunder Zellen noch in der Lage eine antimikrobielle
Wirkung zu entfalten.
Tabelle 1: Charakteristische Merkmale und Unterschiede der drei Zelltodmechanismen
Apoptose, Nekrose und NETose.
Apoptose
Nekrose
ATP-abhängig
ATP-unabhängig
Aktivierung von spezifischen Aktivierung von spezifischen
Enzymen wie z.B. Kaspase 9 Enzymen wie z.B. NADPHOxidase
Kondensierung des
Postlytische Fragmentierung
Kernmaterials und
des Kerns
prälytische Fragmentierung
des Chromatins
Schrumpfen der Zellen und
Anschwellen der Zellen und
Organellen
Organellen
Bildung von apoptotischen
Aufplatzen der Zellmembran
Körperchen (Membranumschlossenen Vesikel)
Auslösen geringer
Auslösen starker
Inflammation
Inflammation
16
NETose
ATP-abhängig
Keine spezifische
Aktivierung von Enzymen
Dekondensierung des
Kernmaterials
Anschwellen des Zellkerns
Auflösen der Kernmembran
und anschließend Platzen
der der Zellmembran
Auslösen lokaler
Inflammation
Einleitung
Die Bildung von extrazellulären DNA-Netzen wurde zunächst als eine besondere
Form des Abwehrmechanismus bzw. Zelltods von ausschließlich Neutrophilen
beschrieben, da die Stimulierung von peripheren Blut-Mononukleären Zellen mit
ROS-produzierenden Chemikalien kein ähnliches Phänomen auslösen konnte. Im
Jahr 2008 konnte jedoch bereits als Vorarbeit für diese Habilitation gezeigt werden,
dass neben Neutrophilen auch Mastzellen in der Lage sind, DNA-Netze auszubilden
und in der Immunabwehr gegen bakterielle Erreger zu nutzen (von KöckritzBlickwede et al., 2008).
Mastzellen sind wichtige Bestandteile des angeborenen Immunsystems. Sie sind vor
allem für ihre Rolle bei der Entstehung von allergischen Reaktionen aufgrund der
Histaminausschüttung bekannt (Puxeddu et al., 2003). In den letzten Jahren ist
jedoch zunehmend erkannt worden, dass sie auch bedeutend bei der Abwehr von
Infektionen sind (Bischoff und Kramer 2007; Galli und Wershil, 1996). Sie können
eine Vielzahl von antimikrobiellen Substanzen generieren und diese im Kampf gegen
parasitäre, virale und auch bakterielle Erreger einsetzen. Schließlich hat sich auch
gezeigt, dass sie DNA-Netze, im englischen mast cell extracellular traps (MCETs),
ausbilden können (von Köckritz-Blickwede et al., 2008).
Abbildung 2: Interaktion von Mastzellen mit S. pyogenes (von Köckritz-Blickwede et al.
2008). Elektronenmikroskopische Aufnahme von murinen Mastzellen: (A) nicht infiziert
(Größenbalken 2 µm); (B) assoziiert mit S. pyogenes (Größenbalken 1 µm); (C) ein Klumpen
von S. pyogenes gefangen durch extrazelluläre DNA-Netze (Größenbalken 10 µm und 2 µm
in der Nahaufnahme); (D) Mastzelle, die ein extrazelluläres Netz ausbildet und S. pyogenes
einfängt (Größenbalken 5 µm). Die Bakterien sind jeweils mit weißen Pfeilen markiert.
17
Einleitung
Ähnlich wie bei den Neutrophilen bestehen diese Mast-Zell-DNA-Netze aus DNA als
Hauptbestandteil, sowie darin eingebetteten zelltypspezifischen Proteinen (Tryptase)
und Peptiden (Cathelicidine wie LL-37), die schließlich antimikrobielle Wirkung wie
bei den Neutrophilen entfalten (von Köckritz-Blickwede et al., 2008). Die Mastzellen,
die diese DNA-Netze ausbilden, zeigen genauso wie die Neutrophilen eine Auflösung
der Kernmembran mit assoziiertem Zelltod. Daher wurde der beschriebene
Zelltodmechanismus „NETose“ (englisch NETosis) in den Begriff „ETose“ (englisch
ETosis) umgewandelt (Wartha und Henriques-Normark, 2008).
Abbildung 3: Modell der Bildung von extrazellulären DNA-Netzen. Neutrophile oder
Mastzellen werden über Kontakt mit Mikroorganismen aktiviert. Die Stimulierung resultiert in
der Aktivierung von NADPH-Oxidasen und der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies.
Dann kommt es zur Spaltung der Kernmembran und der Mischung von Kernmaterial mit
Bestandteilen der zytoplasmatischen Granula der Zelle. Die Freisetzung der extrazellulären
DNA-Netze geht mit einem typischen Zelltod der ETose einher. Die extrazellulären Netze
sind in der Lage Mikroorganismen einzufangen und zu immobilisieren (angepasst von
Goldmann und Medina, 2013; von Köckritz-Blickwede und Nizet 2009, Publikation 1,
Anhang 12.1).
18
Einleitung
3.3.
Assoziation der DNA-Netz-Bildung mit spezifischen Krankheiten
Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass die extrazellulären DNA-Netze eine
bedeutende Rolle in zahlreichen Infektionen spielen. Es wurden bereits zahlreiche
Mikroorganismen beschrieben, die eine DNA-Netz-Bildung initiieren (siehe Abbildung
3). Für die meisten dieser Organismen wurde auch gezeigt, dass sie mittels der
DNA-Netze eingefangen und immobilisiert werden können. Die molekularen
Mechanismen, die der Immobilisierung zugrunde liegen, sind jedoch unzureichend
bekannt. Es wird spekuliert, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen
kationischen Komponenten der DNA-Netze und der anionischen Oberfläche einiger
Mikroorganismen eine Rolle in dem Prozess spielen (Brinkmann und Zychlinsky,
2007). Für einige Mikroorganismen wurden auch spezifische Oberflächenfaktoren
identifiziert, die bei der Interaktion mit den DNA-Netzen eine Rolle spielen, wie z.B.
das M1-Protein von S. pyogenes (Lauth et al., 2009; Oehmcke et al., 2009). Einige
Studien haben schließlich auch eine in vivo Demonstration der DNA-Netz-Bildung
nach Infektion belegen können, wie z.B. bei Kindern mit Plasmodium falciparuminduzierter Malaria (Baker et al., 2008), Patienten mit Leishmanien-Infektionen in der
Haut (Guimaraes-Costa et al., 2009), einem murinen Modell der pneumokokkalen
Lungenentzündung (Beiter et al., 2006) oder der streptokokkalen Hautinfektion
(Buchanan et al., 2006). Interessanterweise hat sich aber gezeigt, dass DNA-Netze
nicht nur eine protektive Wirkung ausüben, sondern manchen Mikroorganismen auch
als eine Art Kolonisierungsplattform dienen können. Das gilt vor allem für Erreger, die
eine Resistenz gegenüber der antimikrobiellen Aktivität der DNA-Netze aufweisen
wie z.B. Haemophilus influenzae sowie S. pneumoniae. Beide Erreger können DNANetze nutzen, um in dem Mittelohr von Chinchillas einen Biofilm zu generieren, der
schließlich im Wirt eine Persistenz ermöglicht und die Ursache für eine chronische
Mittelohrentzündung darstellt (Hong et al., 2009; Reid et al., 2009).
Ob letztendlich die DNA-Netze eine protektive oder möglicherweise auch schädliche
Wirkung für den Infektionsverlauf aus Sicht des Wirtes darstellen, scheint jedoch von
dem Erreger und auch dem Infektionsort abzuhängen. Im Falle einer vorrangig
protektiven Wirkung würden die DNA-Netze einen attraktiven Angriffspunkt für
therapeutische Ansätze liefern, indem man die DNA-Netze gegen Degradation durch
die Bakterien stabilisiert oder die DNA-Netz-Bildung pharmakologisch verstärkt wird.
19
Einleitung
20
Ziele der Arbeit
4.
Ziele der Arbeit
Das Ziel der Forschungsarbeiten im Rahmen dieser Habilitationsschrift war es, die
Rolle der DNA-Netze in der Wirtimmunantwort gegen Infektionskrankheiten
tiefgehender zu charakterisieren. Dabei sollten sowohl auf der Wirtsseite die
molekularen Mechanismen der Netz-Ausbildung und auf Seite der Erreger
Mechanismen möglicher Anti-DNA-Netz-Faktoren analysiert werden. Die Rolle der
DNA-Netze im Infektionsverlauf verschiedener Erreger sollte unter Einsatz von
Tiermodellen evaluiert werden. Schließlich sollten basierend auf den gewonnen
Erkenntnissen neue therapeutische Ansätze zur Stärkung der DNA-Netz-Aktivität
ausgetestet werden. Folgende Kern-Ziele standen im Fokus der Arbeit und wurden
auf biochemischer und zellulärer Ebene untersucht:
(1) Visualisierung und funktionelle Evaluierung von DNA-Netzen;
(2) Untersuchung der Mechanismen, die zur DNA-Netz-Bildung führen;
(3) Charakterisierung von bakteriellen Anti-DNA-Netz-Faktoren;
(4) Charakterisierung von pharmakologischen Substanzen auf ihre Fähigkeit,
DNA-Netz-Bildung zu verstärken oder DNA-Netze zu stabilisieren.
Abbildung 4: Ziele der Arbeit.
21
Einleitung
22
Ergebnisse
5.
Ergebnisse
5.1.
Visualisierung und funktionelle Evaluierung von DNA-Netzen
Bereits in einer der ersten Veröffentlichungen, die die Bildung von DNA-Netzen
detaillierter betrachtet hat (Fuchs et al., 2007), wurde gezeigt, dass die Anwesenheit
von fetalem Kälberserum (fetal calf serum, FCS) die Bildung von DNA-Netzen
inhibiert. Da die DNA-Netz-Bildung von ROS abhängig ist (Fuchs et al., 2007), wurde
spekuliert, dass FCS aufgrund seiner antioxidativen Wirkung die DNA-Netz-Bildung
beeinflusst. In der Publikation 2 (Anhang 12.2) konnte gezeigt werden, dass FCS
außerdem auch hitze-stabile Nukleasen enthält, die in der Lage sind, DNA-Netze zu
degradieren. FCS, welches in der Zellkultur zur Stabilisierung der Zellen eingesetzt
wird, wird normalerweise zur Komplementinaktivierung bei 56°C für 30 Minuten
behandelt. In der oben genannten Publikation konnte gezeigt werden, dass bei 56°C
behandeltes FCS weiterhin aktive Nukleasen enthält, die sowohl Kälberthymus-DNA
als auch DNA-Netze von Neutrophilen degradieren können. Gleiche Ergebnisse
wurden auch für Mausserum, humanes Serum und humanes Plasma erhalten. Sogar
DNA-Netze, die zuvor mit Paraformaldehyd fixiert wurden, waren von der FCSverursachten Degradation betroffen. Interessanterweise wurde eine Inhibierung der
Nukleaseaktivität erst durch die Erhitzung des Serums auf 70°C für 30 Minuten
erreicht. Die Anwesenheit von Nukleasen in dem FCS kann also die Visualisierung
von DNA-Netzen in Zellkultur erschweren. Es ist somit denkbar, dass Protokolle, die
auf die Anwesenheit von 56°C hitze-inaktiviertem FCS zurückgreifen, die
Visualisierung
von
DNA-Netzen
unmöglich
machen.
Basierend
auf
diesen
Ergebnissen sollten folglich der Einsatz der Medien, die für die Studien mit DNANetzen genutzt werden, nachhaltig durchdacht werden.
In der Publikation 3 (Anhang 12.3) werden schließlich Techniken zur Visualisierung
und
funktionellen
Evaluierung
der
extrazellulären
DNA-Netze
unter
der
Berücksichtigung der oben genannten Problematik detailliert beschrieben und
erläutert. Genannte Techniken finden schließlich in den folgenden Publikationen
Anwendung, die Bestandteil dieser Habilitationsschrift sind.
Basierend auf den optimierten Techniken zur Visualisierung und funktionellen
Evaluierung von DNA-Netzen konnte schließlich auch in einer weiterführenden
Arbeit, in Publikation 4 (Anhang 12.4), ein weiterer Zelltyp beschrieben werden, der
23
Ergebnisse
in der Lage ist, DNA-Netze auszubilden und als Abwehrmechanismus gegen
bakterielle Infektionen einzusetzen: Fibrozyten.
Fibrozyten sind eine Population aus CD45-positiven Knochenmark-abstammenden
Zellen, die in der Lage sind, Kollagen Typ I zu produzieren. Sie spielen eine Rolle in
der Pathogenese von fibrotischen Erkrankungen verschiedener Organe wie Leber,
Lunge, Haut und Niere (Kisseleva und Brenner, 2008; Quan et al., 2004). Diese
Zellpopulation ist in der Lage, sich entsprechend der vorhandenen Mikro-Umgebung
zu differenzieren, so dass die gebildeten unterschiedlichen Subtypen flexibel in der
Lage sind, auf Gewebsschädigungen zu reagieren (Curnow et al., 2010; Chesney et
al., 1997). In Publikation 4 (Anhang 12.4) konnte gezeigt werden, dass Fibrozyten
nach intravenöser Infektion von Mäusen mit L. monocytogenes in die Milz
einwandern können und wichtige Immunabwehrfunktionen übernehmen. Sie weisen
ein Genexpressionsmuster auf, welches Ähnlichkeiten zu dem von Neutrophilen hat,
wie beispielsweise die Expression von Myeloperoxidase, Cathelicidinen und
Defensinen. Außerdem sind sie in der Lage extrazelluläre DNA-Netze auszubilden
und
damit
L.
monocytogenes
zu
immobilisieren
und
deren
Vermehrung
einzuschränken.
5.2.
Untersuchung der Mechanismen, die zur DNA-Netz-Bildung führen
Einige essentielle Enzym-abhängige Schritte der DNA-Netz-Bildung sind bereits
beschrieben worden, wie z.B. die Produktion von ROS mittels der NADPH-Oxidase
(Fuchs et al., 2007) oder auch der Myeloperoxidase (Metzler et al., 2010).
Myeloperoxidase katalysiert die Produktion von Hypochlorit (HOCl) aus den
Substraten Wasserstoffperoxid (H2O2) und Chlorit (Cl-). Neutrophile, die von
Patienten mit einer Myeloperoxidasedefizienz isoliert
verminderte
DNA-Netz-Bildung
im
Vergleich
zu
wurden, zeigten eine
entsprechenden
Kontroll-
Neutrophilen (Metzler et al., 2010). In der Publikation 5 (Anhang 12.5) wurde die
Rolle von Myeloperoxidase und ihrer Substrate Cl- und H2O2 sowie des Produktes
HOCl auf die DNA-Netz-Bildung untersucht. In guter Übereinstimmung zu der
Publikation von Metzler et al. (2010), zeigten humane Neutrophile, die mit einem
pharmakologischen Myeloperoxidasehemmer behandelt wurden, eine verminderte
DNA-Netz-Bildung
24
nach
Infektion
mit
Pseudomonas
(P.)
aeruginosa.
Die
Ergebnisse
Abwesenheit von extrazellulärem Cl- als Substrat für die Myeloperoxidase ergab den
gleichen Phänotyp. Diese verminderte DNA-Netz-Bildung nach Blockierung der
Myeloperoxidase konnte nur mittels Supplementierung mit HOCl, nicht aber mit H2O2
aufgehoben werden. Somit konnte HOCl als eine wichtige reaktive Sauerstoffspezies
identifiziert werden, welches die DNA-Netz-Bildung in humanen Neutrophilen
auslösen kann. Dieser Aspekt hat besondere Bedeutung für Krankheitszustände, in
denen die Chlorit-Homöostase gestört ist, wie z.B. bei der zystischen Fibrose, in
denen Infektionserreger wie P. aeruginosa eine maßgebliche Rolle spielen können
(Painter et al., 2008).
In der Publikation 6 (Anhang 12.6) wurde ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der
sogenannte hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) als Regulator in der zellulären
Signalgebung
der
DNA-Netz-Bildung
bei
Mastzellen
charakterisiert.
Der
Transkriptionsfaktor HIF-1α ist ein Hauptregulator der Homöostase und zellulären
Anpassung an Sauerstoffstress. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass HIF-1α
durch bakterielle Pathogene aktiviert werden kann und die bakterizide Aktivität von
Phagozyten verstärkt (Peyssonnaux et al., 2005; Cramer et al., 2003). Allerdings
waren die detaillierten Mechanismen, wie HIF-1α die Immunzellen beeinflusst, noch
unzureichend geklärt. In Publikation 6 (Anhang 12.6) wurde die Rolle des
Transkriptionsfaktors HIF-1α bei der Bildung von DNA-Netzen durch Mastzellen
untersucht. Dafür wurde ein neuer HIF-1α-Agonist eingesetzt, AKB-4924, der die
Prolylhydroxylasen, die in der Degradation von HIF-1α involviert sind, inhibiert. AKB4924 stabilisiert HIF-1α-und erhöht HIF-1α-Protein-Level in der Zelle. Wenn murine
Knochenmarks-abstammende Mastzellen oder humane Mastzellen (HMC-1-Zellen)
mit AKB-4924 behandelt wurden, konnte eine gesteigerte antimikrobielle Aktivität
gegen S. aureus detektiert werden. Diese Wirkung stand im Zusammenhang mit
einer verstärkten Bildung von DNA-Netzen. Um zu überprüfen, ob der Effekt HIF-1αspezifisch ist, wurden Knochenmarks-abstammende Mastzellen von HIF-1αdefizienten Mäusen isoliert und im Vergleich zu entsprechenden Wildtypzellen auf
ihre antimikrobielle Aktivität untersucht. Diese HIF-1α-defizienten Zellen zeigten
generell eine verringerte Wirkung gegen S. aureus. Darüber hinaus konnte bei
diesen Zellen keine verstärkte DNA-Netz-Bildung als Antwort auf die Behandlung mit
AKB-4924 festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich also aus dieser Studie
schließen, dass HIF-1α die Bildung von DNA-Netzen in Mastzellen reguliert.
25
Ergebnisse
Die Publikation 7 (Anhang 12.7) bestätigt schließlich nochmal, dass AKB-4924 die
HIF-1α Level auch in Monozyten und Keratinozyten erhöht. Außerdem wurde nach
Behandlung mit AKB-4924 eine verstärkte antimikrobielle Aktivität gegen MRSA, P.
aeruginosa und Acinetobacter baumanii detektiert. In einem in vivo Mausmodell nach
subkutaner Infektion mit S. aureus konnte sogar gezeigt werden, dass die lokale
Applikation von AKB-4924 sowohl die Vermehrung von S. aureus als auch die
Abszessbildung limitiert. Es lässt vermuten, dass HIF-1α-Agonisten neben Antibiotika
zur unterstützenden Immuntherapie insbesondere gegen Antibiotika-resistente Keime
wie MRSA zukünftig Anwendung finden könnten.
Unter Verwendung eines Modelles der sekundären Infektion mit Pneumokokken nach
vorausgehender Influenza-A-Infektion im Mittelohr wurde in Publikation 8 (Anhang
12.8) herausgefunden, dass unspezifische Antikörper der Gruppe IgA die DNA-NetzBildung verstärken. Interessanterweise zeigte sich in dieser Arbeit auch, dass die
Ausbildung der DNA-Netze nicht nur eine protektive Wirkung für den Wirt haben
kann. Es stellte sich heraus, dass die Pneumokokken die DNA-Netze nutzen, um
sich
zu
vermehren,
im
Mittelohr
zu
persistieren
und
eine
chronische
Mittelohrentzündung auszulösen. Die detaillierten biochemischen Mechanismen, die
der Antikörper-abhängigen DNA-Netz-Bildung zugrunde liegen, müssen jedoch noch
geklärt werden.
5.3.
Charakterisierung von bakteriellen Anti-DNA-Netz-Faktoren
Im dritten Teil wurden bakterielle Faktoren charakterisiert, die in der Lage sind, den
Bakterien einen Schutz gegenüber der antimikrobiellen Aktivität der DNA-Netze zu
ermöglichen. Für MRSA (Publikation 9, Anhang 12.9) und Streptococcus (S.) suis
(Publikation 10, Anhang 12.10) wurden bakterielle Nukleasen analysiert, die in der
Lage sind, DNA-Netze zu degradieren und dadurch die Bakterien vor der
Immobilisierung und der antimikrobiellen Aktivität von DNA-Netzen zu schützen. Bei
S. suis wurde die DNA-Netz-Degradation durch die Nuklease SsnA sowohl im
porcinen als auch humanen Modell bestätigt. Ob die Nuklease in vivo eine Rolle
spielt, bleibt jedoch offen und soll in zukünftigen Experimenten analysiert werden.
Der Einfluss der MRSA Nuklease Nuc auf die DNA-Netz-Evasion wurde in vitro mit
humanen Neutrophilen gezeigt. Es konnte zusätzlich aber auch bestätigt werden,
26
Ergebnisse
dass die Nuklease einen wesentlichen Einfluss auf den Infektionsverlauf in einem
murinen Lungeninfektionsmodell hat: Mäuse, die mit einer nukleasedefizienten
Mutante des MRSA USA 300 LAC-Stammes intranasal infiziert wurden, zeigten
einen abgeschwächten Krankheitsverlauf (geringere Bakterienzahlen in der Lunge)
und eine verringerte Mortalitätsrate im Vergleich zu den Tieren, die mit dem
Nuklease-positiven Wildtyp infiziert wurden. Besonders betont sei an dieser Stelle,
dass in diesem Infektionsmodell (Publikation 9, Anhang 12.9) auch Netze in den in
vivo infizierten Lungenschnitten mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Techniken
nachgewiesen werden konnten (Abbildung 5).
Abbildung 5: Bildung von DNA-Netzen in S. aureus-infizierten Mauslungen in vivo.
Representative Immunfluoreszenzbilder, die die Anwesenheit von DNA-Netzen in dem
Alveolarraum von murinen Lungenschnitten 24 Stunden nach einer intranasalen Infektion mit
MRSA zeigen. DNA-Netze wurden anhand einer Dreifachfärbung sichtbar gemacht: blau =
Dapi/DNA, grün = monoklonaler anti-H2A-H2B-DNA-Komplex-Antikörper und rot =
polyklonaler anti-CRAMP (Maus-Cathelicidin)-Antikörper (Titelbild der Zeitschrift Journal of
Innate Immunity, Ausgabe 2(6), 2010).
In Publikation 11 (Anhang 12.11) konnte als weiterer DNA-Netz-Evasionsfaktor die
Stickstoffmonoxid Synthase von MRSA identifiziert werden. S. aureus repräsentiert
eine
der
wenigen
Bakterienarten,
die
Stickstoffmonoxid-Synthase
(bNOS)
exprimieren und damit die NO-Produktion aus L-Arginin katalysieren können.
27
Ergebnisse
Bakterielle NO-Produktion ist bei Bacillus anthracis als Virulenzfaktor bereits
charakterisiert und vermittelt Resistenz gegenüber oxidativem Stress (Shatalin et al.,
2008). In der Publikation 11 (Anhang 12.11) wurde eine isogene bNOS-Mutante
generiert und damit der Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit und die Virulenz
des Bakteriums geprüft. Der Verlust von bNOS erhöhte die Empfindlichkeit von
MRSA
gegenüber
Empfindlichkeit
ROS
und
korrelierte
mit
antimikrobiellen
einer
Peptiden
erhöhten
des Wirtes.
Sensitivität
gegenüber
Diese
der
antimikrobiellen Aktivität von Neutrophilen und gegenüber DNA-Netzen. Es zeigte
sich auch, dass bNOS eine Resistenz gegenüber Antibiotika, die an der Zellwand
agieren, vermittelt, wie z.B. Vancomycin und Daptomycin. Im Vergleich zu
entsprechenden Wildtyp-Bakterien war für die bNOS-Mutanten nach subkutaner
Infektion eine reduzierte Virulenz mit kleineren Abszessen charakteristisch. Die
zukünftige Entwicklung von bNOS-Inhibitoren könnte einen attraktiven Ansatzpunkt
darstellen, um die MRSA-Pathologie zu minimieren und die Bakterien empfindlicher
gegenüber Antibiotikabehandlung zu machen.
Im Falle des Erregers S. pyogenes konnte im Rahmen der Publikation 12 (Anhang
12.12) die Kapselbildung als DNA-Netz-Evasionsfaktor charakterisiert werden. Eine
Kapselmutante des S. pyogenes M1T1 Stamm 5448 zeigte erhöhte Empfindlichkeit
gegenüber
antimikrobieller
Aktivität
von
DNA-Netzen
sowie
gegenüber
antimikrobieller Peptide des Wirtes, wie z.B. dem Cathelicidin LL-37. Ähnliche Daten
konnten bereits in einer vorherigen Studie für das Oberflächenprotein M1 gezeigt
werden (Lauth et al., 2009).
Basierend auf all diesen Studien (Publikationen 9 bis 12, Anhang 12.9 bis 12.12)
konnte
somit
mittels
bakterieller
Mutagenese
nachgewiesen
werden,
dass
verschiedene Gram-positive bakterielle Pathogene unterschiedliche Strategien
entwickelt haben, um der antimikrobiellen Aktivität von DNA-Netzen zu entkommen.
Mutanten, denen die entsprechenden DNA-Netz-Evasionsfaktoren fehlen, zeigen
sich als empfindlich gegenüber der antimikrobiellen Aktivität der DNA-Netze. Indirekt
konnte
damit
eine
protektive
Infektionserreger belegt werden.
28
Wirkung
der
DNA-Netze
gegen
bakterielle
Ergebnisse
5.4.
Charakterisierung
Fähigkeit,
von
pharmakologischen
DNA-Netz-Bildung
zu
Substanzen
verstärken
oder
auf
DNA-Netze
ihre
zu
stabilisieren
Schließlich
wurden
in
dem
letzten
Teil
dieser
Arbeit
drei
verschiedene
pharmakologische Substanzgruppen biochemisch und zellbiologisch auf ihre
Fähigkeit hin getestet, die DNA-Netz-Bildung beeinflussen zu können. Die erste
wichtige Entdeckung in diesem Teil ist in Publikation 13 (Anhang 12.13)
beschrieben. Diese Veröffentlichung beruht auf der spannenden Beobachtung, dass
Statine, die zur Behandlung von Hypercholesterinämie pharmakologisch eingesetzt
werden, DNA-Netz-Bildung induzieren können und somit protektiv für den
behandelnden Patienten gegen bakterielle Erkrankungen wirken können. Diese
Studien belegen erstmals, dass die pharmakologische Stimulation der DNA-NetzBildung therapeutischen Nutzen gegen bakterielle Infektionen haben kann.
Zunächst zeigte sich, dass verschiedene Statine wie Simvastatin, Mevastatin und
andere Inhibitoren der 3-Hydroxy 3-Methylglutaryl Coenzym A-Reduktase, dem
entscheidenden Enzym der Cholesterol-Biosynthese, die Bildung von DNA-Netzen
mittels ETose bei Makrophagen, Monozyten und Neutrophilen verstärken. Anhand
biochemischer Untersuchungen konnte der Effekt der Statine einer Hemmung des
Sterol-Stoffwechsels zugeordnet werden. In einem in vivo Mausmodell ließ sich
darüber hinaus demonstrieren, dass die orale Verabreichung von Statinen den
Infektionsverlauf nach intranasaler Infektion mit S. aureus protektiv beeinflusst: die
infizierten Mäuse, die Statine über ihre Nahrung aufgenommen hatten, zeigten im
Vergleich zu den Kontrolltieren eine verminderte Entzündungsreaktion sowie
geringere Bakterienzahlen in der Lunge.
Publikation 14 und 15 (Anhang 12.14 und Anhang 12.15): Neben den Statinen hat
auch das Futterzusatzmittel β-Glucan, welches vor allem in der Fischzucht für eine
Verbesserung von Wachstum und Gesundheitsstatus der Fische eingesetzt wird,
einen Effekt auf Fisch-DNA-Netze: Es zeigte sich, daß β-Glucan die Ausbildung von
DNA-Netzen bzw. ETose in Neutrophilen, die aus der Niere oder Kopfniere von
Karpfen gewonnen wurden, induziert. Als Folge erhöht β-Glucan auch die
Immobilisierung des Fisch-pathogenen Gram-negativen Bakteriums Aeromonas (A.)
29
Ergebnisse
hydrophila. Darüber hinaus ist β-Glucan auch in der Lage, die DNA-Netze gegen
eine Degradation durch Nukleasen von A. hydrophila zu stabilisieren.
Publikation 16 (Anhang 12.16): Als dritte pharmakologische Substanz konnte das
Fluoroquinolon
Enrofloxacin
die
Ausbildung
von
DNA-Netzen
in
bovinen
Granulozyten verstärken. Enrofloxacin hat sich als Antibiotikum zur Bekämpfung von
Mastitiserregern
bei
Rindern
bewährt.
Es
ist
ein
ausschließlich
für
die
Veterinärmedizin zugelassenes Quinolon der 2. Generation, welches seine
bakterizide Wirkung mittels Hemmung der bakteriellen DNA-Gyrase verursacht. In
vorherigen Studien hat sich gezeigt, dass Enrofloxacin neben seiner bakteriziden
Wirkung auch die Fähigkeit besitzt, die Aktivität von Neutrophilen zu stimulieren
(Hoeben et al., 1997). Nach Behandlung von bovinen Neutrophilen mit Enrofloxacin
steigt die Freisetzung von ROS an, die eine wichtige Rolle in der Abwehr von
Infektionserregern spielen. Der zugrunde liegende Mechanismus oder auch die
weiteren Auswirkungen auf die Erreger-Wirt-Interaktion sind jedoch nicht bekannt.
Wir konnten zeigen, dass Enrofloxacin die Bildung von DNA-Netzen in bovinen
Granulocyten stimuliert. Biochemische Untersuchungen identifizierten zwei Enzyme,
die Peptidyl-arginin-deiminase-4 (PAD-4) und die NADPH-Oxidase, sowie das
Zytoskelett als maßgebliche Komponenten in diesem Prozess. Wenn die NADPHOxidase-abhängige
ROS-Bildung
oder
auch
die
PAD-4-abhängige
Histon-
Citrullinierung pharmakologisch blockiert wurden, konnten signifikant weniger DNANetze bestimmt werden. Gleiches zeigte sich, wenn die Zellen mit Cytochalasin D
oder
Nocodazole
behandelt
wurden,
welche
die
Ausbildung
eines
voll
funktionsfähigen Zytoskelettes unterbinden. Dies ist die erste Studie, die zeigt, dass
ein Antibiotikum in der Lage ist, DNA-Netz-Bildung in bovinen Zellen zu stimulieren.
Dieses Phänomen könnte wesentlich das Management einer Infektion beeinflussen.
Zusammenfassend führen die Studien dieses dritten Teils der Habilitationsschrift zu
der Hypothese, dass bei bestimmten Erregern wie S. aureus und A. hydrophila eine
pharmakologische Verstärkung der DNA-Netz-Bildung oder auch eine Stabilisierung
der DNA-Netze für den infizierten Wirt vorteilhaft sein kann.
30
Übergreifende Diskussion
6.
Übergreifende Diskussion
6.1.
Charakterisierung der DNA-Netze bei verschiedenen Zelltypen und in
verschiedenen Tierarten
Die Bildung von DNA-Netzen als neuer Immunabwehrmechanismus ist erstmals im
Jahr 2004 beschrieben worden (Brinkmann et al., 2004). Im Laufe der vergangenen
Jahre hat sich die Bedeutung dieser DNA-Netze in Hinsicht auf die Abwehr von
Infektionen anhand zahlreicher Publikationen bestätigen lassen. Es stellte sich
natürlich die Frage, warum dieses Phänomen erst so spät erkannt worden ist, obwohl
hochauflösende Fluoreszenzmikroskopietechniken ja bereits seit geraumer Zeit zur
Verfügung stehen. Die Publikation 2 (Anhang 12.2) zeigt, dass möglicherweise die
genutzten Zellkulturbedingungen unter Verwendung von FCS als Zusatz in den
Zellkulturmedien die Visualisierung der DNA-Netze behindert haben könnten. FCS
kann Nukleasen enthalten, die in der Lage sind, DNA-Netze zu degradieren. Nach
Optimierung der Zellkulturbedingungen konnten schließlich auch im Rahmen dieser
Habilitationsschrift
und
in
Kooperation
mit
zahlreichen
internationalen
Wissenschaftlern verschiedene Zelltypen beschrieben werden, die in der Lage sind
Netze zu bilden: In der Publikation 4 (Anhang 12.4) wurde gezeigt, dass
Knochenmarks-abstammende Fibrozyten
in der Lage sind, DNA-Netze als
Immunantwort auf eine Infektion mit L. monocytogenes zu bilden. Auch Monozyten
und Makrophagen besitzen die Fähigkeit zur DNA-Netz-Bildung, wenn sie mit
Statinen behandelt wurden (Publikation 13, Anhang 12.13). Inzwischen konnte mit
zahlreichen Publikationen belegt werden, dass verschiedene Zelltypen des
angeborenen Immunsystems zur Bildung von DNA-Netzen fähig sind. Zu diesen
gehören Neutrophile, Mastzellen, Eosinophile, Basophile, Monozyten, Makrophagen
und Fibrozyten (Tabelle 2).
31
Übergreifende Diskussion
Tabelle 2: Übersicht über bekannte Zelltypen des angeborenen Immunsystems, die neben
Neutrophilen auch in der Lage sind DNA-Netze auszubilden.
Zelltyp
Auslöser
Rolle
Referenz
Mastzellen
Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes,
Pseudomonas
aeruginosa
S. pyogenes M1 Protein
Immobilisierung und
Wachstumshemmung
von Bakterien
von KöckritzBlickwede et al.,
2008
Immobilisierung und
Wachstumshemmung
von Bakterien
Auslöser für
Schuppenflechte
(Psoriasis)
Einfangen und Töten von
Bakterien
unklar
Lauth et al., 2009
unklar
Schorn et al., 2012
Protektive Rolle gegen
MRSA
Eliminierung von
Nanopartikeln
unklar
Chow et al., 2010
(Publikation 13)
Bartneck et al.,
2010
Webster et al., 2010
Protektive Rolle gegen
MRSA
unklar
Chow et al., 2010
(Publikation 13)
Wong und Jacobs,
2013
Aulik et al., 2012
IL-23 und IL-1β
Eosinophile
LPS, Gram-negative
Bakterien
Mononatrium-UratKristalle
Mononatrium-UratKristalle
Statine
Basophile
Monozyten
Nanopartikel
Makrophagen
Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae
Statine
Mycobacterium
tuberculosis
Mannheimia haemolytica
Nanopartikel
Fibrocyten
Listeria monocytogenes
Einfangen und Töten von
Bakterien
Eliminierung von
Nanopartikeln
Immobilisierung und
Wachstumshemmung
von Bakterien
Lin et al., 2011
Yousefi et al., 2008
Schorn et al., 2012
Bartneck et al.,
2010
Kisseleva et al.,
2011
(Publikation 4)
Interessanterweise sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass bisher keine
funktionelle DNA-Netz-Bildung in B-Zellen, Epithel- oder Endothelzellen beschrieben
wurde. Es ist zu vermuten, dass Zelltyp-spezifische Faktoren wie Proteasen die
Bildung
der
DNA-Netze
beeinflussen.
In
einer
Veröffentlichung
von
Papayannopoulos et al. (2010) wurde beschrieben, dass möglicherweise Elastase
und Myeloperoxidase die zellspezifische DNA-Netz-Bildung von Neutrophilen
32
Übergreifende Diskussion
modulieren. Es bleibt jedoch zu klären, welche Faktoren in anderen Immunzellen in
den Netz-Bildungs-Prozess involviert sind. Bei Mastzellen lässt sich vermuten, dass
Tryptase eine Rolle spielt, da dieses Enzym auch wesentlicher Bestandteil von
MCETs darstellt (von Köckritz-Blickwede et al., 2008).
Im Rahmen der Studien dieser Habilitationsschrift wurde mit verschiedenen Zelltypen
(Mastzellen, Fibrozyten, Monozyten und Makrophagen) gearbeitet. Es ist wichtig und
spannend zu erwähnen, dass während dieser Studien aufgefallen ist, dass
Neutrophile im Vergleich zu anderen Zelltypen Meister in der Ausbildung von DNANetzen sind. Durch geeignete Stimulantien wie PMA oder Statine (Publikation 13,
Anhang 12.13) können 100% der eingesetzten Neutrophile zur DNA-Netz-Bildung
angeregt werden. Dieser Wert lässt sich in keinem anderen Zelltyp erreichen. Da
Neutrophile im Vergleich zu Mastzellen oder Makrophagen sehr kurzlebige Zellen mit
einer zirkulierenden Halbwertzeit von circa 6 bis 8 Stunden sind (Cowburn et al.,
2012), erscheint es durchaus sinnvoll, dass sie den Zelltod der NETose nutzen, um
eine höchstmögliche Effizienz hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Aktivität zu erreichen.
Die initialen Arbeiten zu der Bildung von DNA-Netzen hatten sich zunächst vorrangig
auf Untersuchungen mit humanem Blut fokussiert. Im Laufe der Jahre stellte sich
jedoch heraus, dass es sich ganz offensichtlich um einen sehr konservierten
Mechanismus handelt und viele verschiedene Tierarten den Prozess der DNA-NetzBildung als effizienten Immunabwehrmechanismus nutzen (Tabelle 3). Neben dem
humanen Modell werden in zahlreichen Studien Mäuse aufgrund der Verfügbarkeit
von transgenen Varianten eingesetzt, die es erlauben, die molekularen und
zellulären Mechanismen der DNA-Netz-Bildung detaillierter zu charakterisieren. Auch
für zahlreiche in vivo-Modelle hat sich das Maussystem als höchst aussagekräftig
erwiesen. Es ist jedoch anzumerken, dass die gewonnenen Erkenntnisse aus dem
System Maus nicht 100%ig auf den Menschen übertragbar sind und stets kritisch
diskutiert werden müssen. In Publikation 5 (Anhang 12.5) wird gezeigt, dass es
signifikante Spezies-spezifische Unterschiede in den Mechanismen, die zur DNANetz-Bildung
führen,
gibt.
Während
die
pharmakologische
Hemmung
der
Myeloperoxidase die DNA-Netz-Bildung in humanen Neutrophilen blockiert, spielt
dieses Enzym in der Maus nur eine untergeordnete Rolle. Das kann natürlich
grundsätzlich an der Spezies Maus liegen. Allerdings wurde in einer Studie von
Ermert et al. (2009) gezeigt, dass selbst verschiedene transgene Mausstämme
33
Übergreifende Diskussion
stammspezifische Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur DNA-Netz-Bildung aufweisen.
Das deutet darauf hin, dass es durchaus eine genetische Prädisposition für die
Fähigkeit zur Ausbildung von DNA-Netzen geben kann.
Auch im Vergleich von Mensch und Schwein sind im Rahmen dieser Arbeit
Unterschiede aufgefallen: In der Studie zu der Streptococcus suis-abhängigen DNANetz-Bildung (Publikation 10, Anhang 12.10) ließ sich zeigen, dass porcine DNANetze erheblich weniger effektiv ausgebildet werden als humane DNA-Netze. Bisher
vollkommen unklar ist allerdings, worin die Ursache für dieses Phänomen besteht. Es
lässt sich jedoch vermuten, dass die DNA-Netz-induzierenden Substanzen
möglicherweise weniger effektiv mit porcinen Neutrophilen interagieren können und
somit weniger effektiv die DNA-Netz-auslösenden Signalkaskaden in Gang bringen
können. Andererseits ist es auch möglich, dass die porcinen Zellen eine geringeres
Expressionslevel
der
Faktoren
aufweisen,
die
für
die
DNA-Netz-Bildung
verantwortlich sind, wie z.B. PAD-4, Elastase, Myeloperoxidase oder NADPHOxidase.
Extrazelluläre DNA-Strukturen sind inzwischen tatsächlich auch in Pflanzen
beschrieben worden, in deren Wurzelspitzen sie eine Abwehr gegen Infektionen
darstellen (Driouich et al., 2013; Hawes et al., 2011). Die Ausbildung von DNANetzen als Immunreaktion scheint von Pflanzen über Insekten und verschiedene
Vertebraten bis hin zum Menschen konserviert zu sein. Diese Beobachtung bestärkt
die Hypothese, dass DNA neben seiner lebenswichtigen Funktion als genetisches
Material auch eine Schlüsselrolle in der angeborenen Immunabwehr spielen kann.
34
Übergreifende Diskussion
Tabelle 3: Übersicht über Tierarten, dessen Granulozyten in der Lage sind, DNA-Netze
auszubilden.
Zelltyp
Auslöser
Rolle
Referenz
Verschiedene
Mausstämme
Produktion von ROS
Ermert et al., 2009
Ratte
PMA/Propylthiouracil
Abwehr gegen
Mikroorganismen (z.B.
Candida albicans)
Ursache für Vaskulitis
Chinchilla
Pferd
Haemophilus
influenzae
Streptococcus
pneumoniae
Seminalplasma
Persistenz in Biofilmen im
Mittelohr
Persistenz in Biofilmen im
Mittelohr
Behinderung des
Spermientransportes
Schwein
Streptococcus suis
PMA/Ionomycin
Feline Leukämie-Virus
(FeLV)
Staphylococcus aureus
Einfangen und
Wachstumshemmung
unklar
Marker für den
Krankheitsverlauf
Mastitis
Eimeria bovis
Immobilisierung
Seminalplasma
Behinderung des
Spermientransportes
Abtöten der Bakterien
Katzen
Rind
Escherichia coli
PMA/Ionomycin,
verschiedene Bakterien
Enrofloxacin
unklar
Reid et al., 2009
Alghamdi und
Foster, 2005
De Buhr et al., 2014
(Publikation 10)
Loving et al., 2013
Wardini et al., 2010
Reinhardt et al.,
2013
Behrendt et al.,
2009
Alghamdi et al.,
2009
Grinberg et al.,
2008
Lippolis et al., 2006
Huhn
PMA, H2O2
Pimephales
promelas
unklar
unklar
Palic et al., 2007
Karpfen
PMA, Calciumionophore, βGlucan/LPS
Calcium-Ionophor,
PMA, β-Glucan
β-Glucan
Jerjomiceva et al.,
2014 (Publikation
16)
Chuammitri et al.,
2009
Palic et al., 2007
Einfangen von Aeromonas
hydrophila
Wachsmotte
Escherichia coli
Immunabwehr
Brogden et al.,
2014 (Publikation
14 und 15)
Altincicek et al.,
2008
Zebrafisch
Einfangen und
Wachstumshemmung von
Staphylococcus aureus
unklar
Nakazawa et al.,
2012
Hong et al., 2009
35
Übergreifende Diskussion
6.2.
Mechanismen der DNA-Netz-Bildung : Zelltod versus lebende Zellen
Wie bereits in der Einleitung erläutert, hat sich in den meisten Fällen herausgestellt,
dass diejenigen Zellen, die DNA-Netze ausbilden, den Zelltod der NETose eingehen,
der sich morphologisch und mechanistisch deutlich von Apoptose und Nekrose
abgrenzen lässt. Kurze Zeit nach der Entdeckung der Netze ließ sich jedoch auch
zeigen, dass Eosinophile und auch Neutrophile in der Lage sind, auch im vitalen
Zustand
extrazellulär
DNA
auszuschleusen
und
diese
im
Kampf
gegen
Infektionskrankheiten zu nutzen (Yousefi et al., 2009; Yousefi et al., 2008). Dieses
Phänomen konnte mittlerweile sogar in vivo in der Haut von S. aureus infizierten
Mäusen bestätigt werden (Yipp et al., 2012). Die DNA-Netz-Bildung wurde in der
Studie als ein dynamischer Prozess beschrieben, der während der Wanderung von
Neutrophilen durch das Gewebe ablaufen kann und die Möglichkeiten der
Immunabwehr neben der Phagozytose von einwandernden Erregern um einen
weiteren effektiven Mechanismus erweitert.
Basierend auf den bisherigen Erkenntnissen ist daher davon auszugehen, dass es
zwei verschiedene Wege der DNA-Netz-Bildung gibt. In der Tabelle 4 sind die
wesentlichen Unterschiede der Zelltod-assozierten NETose und der DNA-NetzBildung durch lebende Zellen zusammengefasst. In den vorgestellten Publikationen
13 bis 15 (Anhang 12.13 bis 12.15) wurde beschrieben, dass die über Statine sowie
β-Glucan induzierte DNA-Netz-Bildung mit dem Zelltod der ETose einhergeht. Für
die Enrofloxacin-induzierte DNA-Netz-Bildung in bovinen Granulozyten (Publikation
16, Anhang 12.16) ist bislang unklar, ob es sich um vitale oder tote Zellen handelt.
Laufende Untersuchungen beschäftigen sich mit dieser Thematik.
Bezüglich der DNA-Netz-Bildung bei lebenden Zellen gibt es natürlich noch viele
offene Fragen. Es ist zum Beipiel vollkommen unklar, wie es zu dem Budding und
dem Ausschleusen des Kernmaterials bei den vitalen Zellen kommt. Allerdings
handelt es sich um ein überaus spannendes Phänomen mit großem therapeutischen
Potential: es wäre für die Zukunft wünschenswert, auf Neutrophile pharmakologisch
Einfluss nehmen zu können, indem explizit diejenige antimikrobielle Aktivität der
Zellen verstärkt wird, die für die Abwehr eines Erregers von Nutzen ist: bei
intrazellulären Erregern gegebenenfalls die Phagozytose und bei extrazellulären
Erregern die Bildung von DNA-Netzen.
36
Übergreifende Diskussion
Tabelle 4: Unterschiede zwischen der Zelltod-assozierten NETose und der DNA-NetzBildung durch lebende Zellen (zusammengefasst aus Yipp und Kubes, 2013)
Zelltyp
Zeitspanne
Morphologie
Stimulantien
Involvierte Mechanismen
6.3.
Zelltod-assoziierte NETose
DNA-Netz-Bildung
lebende Zellen
durch
Neutrophile, Mastzellen,
Monozyten, Makrophagen
10 min bis 4 h
Aufbrechen der
Kernmembran und der
Zytoplasmamembran
Verschiedene Stimulantien,
die die ROS-Bildung
verstärken (z.B. PMA);
verschiedene
Mikrorganismen, Toxine,
Statine
PAD-4, Myeloperoxidase,
Elastase, NADPH-Oxidase
Neutrophile und Eosinophile
wenige Minuten
Kein Aufbrechen der
Membranen, nukleäres
Budding
LPS, Staphylococus aureus,
TLR4-aktivierte
Blutplättchen, Candida
albicans
TLR2, TLR4, Komplement
Die Rolle von DNA-Netzen gegen Infektionserreger
Unabhängig von dem Zelltyp oder der Tierspezies, in denen die DNA-Netz-Bildung
bisher beschrieben wurde, konnte gezeigt werden, dass die DNA-Netze in der Lage
sind, Mikroorganismen einzufangen. In vielen Studien, wie auch im Rahmen dieser
Arbeit gezeigt (Publikationen 9-12, Anhang 12.9 bis 12.12), hat sich die protektive
Rolle der Netze gegen Infektionen mittels Mutagenese spezifischer Evasionfaktoren
belegen lassen. Es wird inzwischen davon ausgegangen, dass Netze auf zwei sich
ergänzende Arten Immunabwehrfunktionen übernehmen können: (1) Immobilisieren
und (2) Töten der Mikroorganismen.
Die Funktion der Erregerabtötung wird jedoch in der Literatur stark diskutiert
(Menegazzi et al., 2012). Basierend auf der Färbung von gefangenen Bakterien mit
DNA-interkalierenden Farbstoffen, konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit gezeigt
werden, dass die Membran von S. aureus (Publikation 9, Anhang 12.9) und S.
pyogenes (Publikation 12, Anhang 12.12) in den DNA-Netzen zerstört und dadurch
ein Abtöten der Bakterien erreicht wird. Auch in mikrobiologischen Experimenten hat
sich zeigen lassen, dass das Überleben der Bakterien in Anwesenheit von DNA37
Übergreifende Diskussion
Netzen signifikant minimiert werden kann. Hierfür wurde die antimikrobielle Aktivität
von Neutrophilen mittels Auszählen von überlebenden Bakterien in der Anwesenheit
von DNA-Netzen analysiert. Per Definition kann man zwar nicht von einer
bakteriziden Wirkung sprechen, die als ein Abtöten der Bakterien im Vergleich zum
initialen Inokulum von mehr als 99,9% definiert ist. Allerdings lässt sich aus den
bisherigen
Daten
darauf
schließen,
dass
die
DNA-Netze
zumindest
eine
bakteriostatische, also eine wachstumshemmende Wirkung auf die Mikroorganismen
haben und somit funktionell auf jeden Fall zwei essentielle Ziele in der Immunabwehr
verfolgen:
(1)
Immobilisierung
von
Mikroorgansimen
und
(2)
deren
Wachstumshemmung.
Hoch interessant und ein weiterer Hinweis auf die grundsätzliche Komplexität der
Wirt-Erreger-Interaktion war die Erkenntnis, dass die Ausbildung der DNA-Netze
nicht nur eine protektive Wirkung für den Wirt haben kann. Bei einer sekundären
Pneumokokken-Infektion nach vorausgehender Influenza-A-Infektion des Mittelohrs
stellte sich heraus, dass die Pneumokokken die DNA-Netze nutzen, um sich zu
vermehren (Publikation 8, Anhang 12.8). Darüber hinaus zeigte sich in weiteren
Studien, dass H. influenzae und S. pneumoniae die DNA-Netze nutzen, um einen
Biofilm zu produzieren und diesen als Basis für Persistenz zu nutzen (Hong et al.,
2009; Reid et al., 2009).
Ob letztendlich die DNA-Netze eine protektive oder aber schädliche Wirkung für den
Infektionsverlauf aus Sicht des Wirtes darstellen, scheint von dem Erreger und auch
dem Infektionsort abzuhängen (siehe Abbildung 6). Im Falle einer protektiven
Wirkung, wie für MRSA gezeigt, könnten die Netze einen attraktiven Angriffspunkt für
therapeutische Ansätze liefern, indem man sie gegen Degradation durch Bakterien
stabilisiert oder auch die Netzbildung an sich pharmakologisch verstärkt.
38
Übergreifende Diskussion
Abbildung 6: Zusammenfassung der protektiven und schädlichen Rolle von DNA-Netzen
bei Infektionen (Baker et al., 2008; Behrendt et al., 2009; Berends et al., 2010, Publikation
9, Anhang 12.9; Brinkmann et al., 2004; Brogden et al., 2014, Publikation 15, Anhang
12.15; Carlin et al., 2009; Cole et al., 2010, Publikation 12, Anhang 12.12; de Buhr et al.,
2014, Publikation 10, Anhang 12.10; Gabriel et al., 2010; Grinberg et al., 2008; GuimaraesCosta et al., 2009; Hong et al., 2009; Jenne et al., 2013; Menten-Dedoyart et al., 2014;
Narasaraju et al., 2011; Ramos-Kichik et al., 2008; Reid et al., 2009; Röhm et al., 2014;
Saitoh et al., 2012; Seper et al., 2013; Short et a., 2014, Publikation 8, Anhang 12.8; Urban
et al., 2009; Wardini et al., 2010; Wong und Jacobs, 2013).
6.4.
Extrazelluläre DNA-Netze und ihre negative Assoziation mit spezifischen
Krankheitsbedingungen
Neben der protektiven Wirkung bei Infektionen, werden auch zunehmend negative
Assoziationen mit spezifischen Krankheitsbedingungen bei der Ausbildung von DNANetzen bekannt. So wurde bereits herausgefunden, dass die überschüssige Bildung
von DNA-Netzen im Körper oder auch ein reduzierter DNA-Netz-Abbau mit
Gewebsschädigungen
und
verminderten
Zellfunktionen
einhergehen
kann
(Villanueva et al., 2011; Saffarzadeh et al., 2012). Schließlich kann es dadurch zu
pathologischen Erscheinungen wie Unfruchtbarkeit, Thrombose oder zystischer
39
Übergreifende Diskussion
Fibrose kommen. In der Tabelle 5 ist eine Übersicht über die negative Assoziation
von DNA-Netze mit spezifischen Krankheiten zusammengestellt.
Tabelle 5: Extrazelluläre DNA-Netze und ihre negative Assoziation mit spezifischen
Krankheitsbedingungen, aufgelistet nach Jahr der Entdeckung.
Pathologische
Erscheinung
Kurze Erklärung
Referenz
Unfruchtbarkeit
Immobilisierung von
Spermien
Schwangerschaftintoxikation
Überschießende
Immunreaktion bei
Infektionen
Autoimmunerkrankung mit
Anti-Neutrophilantikörpern
Autoimmunerkrankung der
Niere mit Autoantikörpern
gegen DNA und Histone
Aktivierung der
Einwanderung von roten
Blutkörperchen und
Aktivierung der
Thrombenbildung
Verstopfung und Schädigung
der Lungengefäße durch
DNA-Netze
Autoimmunerkrankung der
haut, Knochen, Nieren und
auch anderer Organe, mit
Autoantikörpern gegen DNA
und Histone
Schuppenflechte, Nekrose
des Hautepithels
Hyperkoagulation bei Krebs
Alghamdi und Foster, 2005
Endothelzerstörung in der
Lunge
Caudrillier et al., 2012
Förderung der
Metastasenausbreitung
Cools-Lartigue et al., 2013
Präeklampsia
Sepsis
Vaskulitis
Lupus nephritis
Thrombose
Zystische Fibrose
Lupus erythematodes
Psoriasis
Thrombose bei
Krebspatienten
Transfusionsassoziierte
akute Lungeninsuffizienz
(TRALI)
Krebs
40
Gupta et al., 2006
Margraf et al., 2008
Kessenbrock et al., 2009
Hakkim et al., 2010
Fuchs et al., 2010
Marcos et al., 2010
Lande et al., 2011
Lin et al., 2011
Demers et al., 2012
Übergreifende Diskussion
Unter oben aufgeführten Bedingungen wäre es in der Tat sogar empfehlenswert, die
DNA-Netz-Bildung zu unterdrücken, um pathologische Schäden zu minimieren.
Allerdings wäre eine Inhibition von Enzymen oder Signalwegen, die bei der DNANetz-Bildung involviert sind, nicht sinnvoll, da die meisten Prozesse nicht spezifisch
für die Netzbildung sind, sondern auch in andere immunologische Prozesse involviert
sind, wie z.B. PAD-4, der auch eine Rolle bei der Apoptose bzw. Krebsentstehung
zukommt (Li et al., 2008; Chang und Han, 2006). Es wäre daher sinnvoller, die DNANetz-Struktur umzugestalten oder den DNA-Netz-Abbau im Wirt (lokal) zu
beschleunigen. So haben sich z.B. eine DNAse-Behandlungen bei Patienten mit
cystischer Fibrose (Fuchs et al., 1994) oder auch die Anwendung von Anti-HistonAntikörpern bei der Vorbeugung von Thrombose als durchaus zweckdienlich
erwiesen (Semeraro et al., 2011). Eine Kontrolle der ungewünschten Konsequenzen
von DNA-Netzen setzt jedoch eine detaillierte Betrachtung der Komplexität der DNANetze voraus, die mit vielen zahlreichen verschiedenen Proteinen modifiziert sein
können (Urban et al., 2009). In Abhängigkeit der Krankheit erscheint es angebracht
zu sein, unterschiedliche therapeutische Strategien anzuwenden, um die negativen
Auswirkungen der DNA-Netze zu beheben (Saffarzadeh und Preissner, 2012). Da
eine gehemmte DNA-Netz-Bildung mit vielschichtigen Nebeneffekten, allen voran
dem zunehmenden Risiko einer Infektion, einhergehen kann, ist eine derartige
therapeutische Anwendung möglicherweise nur in (lebensbedrohlichen) Situationen
wie beispielsweise einer Autoimmunerkrankung oder einer schweren Sepsis
empfehlenswert, in denen die schädlichen Folgen gegenüber der protektiven
Immunabwehrwirkung von DNA-Netzen überwiegen (Saffarzadeh und Preissner,
2012).
41
Übergreifende Diskussion
6.5.
Abschließende Diskussion und wissenschaftlicher Ausblick
Insgesamt zielte das Projekt darauf ab, die molekularen und zellulären Grundlagen
der mikrobiellen Pathogenese und der Immunologie des Wirtsabwehrsystems
zellbiologisch und biochemisch zu analysieren, um Grundlagen für die Entwicklung
neuartiger therapeutischer Ansätze zu schaffen. Dabei stand der neu entdeckte
Immunabwehrmechanismus der DNA-Netze im Vordergrund der Untersuchungen.
Zusammenfassend konnten mit diesen Arbeiten wesentliche Erkenntnisse in Bezug
auf die Rolle der DNA-Netze gegen bakterielle Infektionen gewonnen werden.
Mit der drastisch ansteigenden Anzahl von Publikationen auf diesem Gebiet hat sich
herausgestellt, welche weitreichenden protektiven Effekte aber auch welche
negativen Konsequenzen die Bildung von extrazellulären DNA-Netzen durch
Immunzellen sich für den Wirt ergeben. Die Komplexität lässt sich wohl am Ehesten
mit der Wirkung von Cytokinen vergleichen: während die Ausschüttung von
Cytokinen für die Immunantwort auf eine Vielzahl von (pathogenen) Mikroorganismen
essentiell ist, kann eine überschüssige Reaktion für den Organismus tödlich sein.
Letztendlich entscheidet das Gleichgewicht zwischen Produktion und Abbau sowohl
von Cytokinen als auch von DNA-Netzen über ihre positiven oder negativen
Auswirkungen auf die Gesundheit des Organismus.
Für eine optimale therapeutische Anwendung der DNA-Netz-Bildung müssten die
Netz-Strukturen gegen Degradation durch bakterielle Faktoren wie Nukleasen
stabilisiert werden, wohingegen die Aktivität der wirtseigenen endogenen Nukleasen
nicht beeinflusst werden dürfte. Somit könnte die natürliche Regulation der DNANetz-basierten Immunreaktion des Wirtsorganismus uneingeschränkt ablaufen und
wäre weder durch den Erreger noch durch die Therapiemaßnahme maßgeblich
modifiziert.
Letztendlich haben die bisherigen Studien gezeigt, dass die protektive Wirkung auch
abhängig vom Infektionserreger ist. Während einige Erreger wie Pneumokokken
DNA-Netze zur Kolonisierung und Persistenz nutzen können, werden andere (S.
aureus und S. pyogenes) an ihrer Ausbreitung gehindert. Ob DNA-Netze also
grundsätzlich eine protektive Rolle gegen sämtliche Infektionserreger haben, lässt
sich folglich nicht verallgemeinern und sollte stets gewissenhaft unter Einbeziehung
42
Übergreifende Diskussion
aller Aspekte wie Erreger, Infektionsort, DNA-Netz-bildender Zelltyp und eventuell
der genetischen Prädisposition diskutiert werden.
Da
eine
überschüssige
DNA-Netz-Bildung
auch
in
Zusammenhang
mit
Autoimmunerkrankungen oder auch Gewebsschädigungen steht, scheint das
Gleichgewicht zwischen DNA-Netz-Bildung und anschließender Eliminierung durch
den Wirt ausschlaggebend für den Nutzen oder Schaden von DNA-Netzen für den
Organismus zu sein. Um das Gleichgewicht zwischen Netz-Bildung und Eliminierung
besser verstehen und zukünftig für therapeutische Zwecke nutzen zu können, ist es
unabdingbar, die zugrunde liegenden Mechanismen und die spezifische Rolle bei
verschiedenen Infektionen genau zu verstehen.
Folgende Fragen bleiben zum jetzigen Zeitpunkt unbeantwortet und sollen im
Rahmen zukünftiger Forschungsarbeiten analysiert werden:
o Die NETose unterscheidet sich im Vergleich zu der Apoptose und der Nekrose
durch das prälytische Aufbrechen der Kernmembran. Welche zellulären
Faktoren sind dafür verantwortlich? Können möglicherweise wirtsendogene
antimikrobielle Peptide die nukleäre Membran zerstören?
o Welche Rolle spielt die Zusammensetzung der Zytoplasmamembran und auch
der Kernmembran in der Bildung von DNA-Netzen? Gibt es Speziesspezifische
Unterschiede
in
der
Lipidzusammensetzung
oder
dem
Cholesterolgehalt, was Unterscheide in der Fähigkeit der DNA-Netz-Bildung
bei verschiedenen Tierspezies erklären lässt?
o Bei der DNA-Netz-Bildung im Falle von lebenden Zellen hat sich gezeigt, dass
ein vesikulärer Transport des Kernmaterials ins extrazelluläre Milieu involviert
ist. Welche biochemischen Mechanismen spielen in diesem Prozess eine
Rolle?
o Wodurch wird die Stabilität der DNA-Netze im Wirt beeinflusst? Gibt es
Wirtsfaktoren, die die Stabilität in Abhängigkeit vom Ort der Infektion
modulieren?
o Lässt sich die Stabilität der DNA-Netze pharmakologisch beeinflussen?
o Lassen sich neue pharmakologische oder auch pflanzliche Substanzen finden,
die die DNA-Netz-Bildung durch lebende Zellen im Menschen und im Tier
43
Übergreifende Diskussion
verstärken
und
im
Kampf
gegen
Infektionskrankheiten
therapeutisch
eingesetzt werden könnten?
o Spielen Spezies-spezifische Unterschiede der DNA-Netz-Bildung eine Rolle
bei
der
Wirtsspezifität
verschiedener
Pathogene,
insbesondere
bei
zoonotischen Infektionen? Welche Mechanismen liegen der Wirtsspezifität
zugrunde?
o Zellen
und
Gewebe
werden
normalerweise
unter
atmosphärischen
(normoxischen) Sauerstoffkonzentrationen (20-21%) kultiviert, obwohl diese in
den
meisten
Geweben
gewebsspezifische
in
vivo
Unterschiede
deutlich
niedriger
auftreten
sind
können.
und
auch
Hat
die
Sauerstoffkonzentration einen Einfluss auf die Bildung und funktionelle
Aktivität von DNA-Netzen?
o Am
häufigsten
wurde
die
protektive
Wirkung
der
DNA-Netze
an
Infektionsorten wie der Lunge und der Haut analysiert. Spielen DNA-Netze
auch bei der Immunabwehr im Gehirn (z.B. bei der Abwehr gegen S. suis)
oder im gastrointestinalen Trakt (zur Abwehr gegen Yersinia enterocolitica)
eine Rolle?
44
Zusammenfassung
7.
Zusammenfassung
Die Bildung von extrazellulären DNA-Netzen wurde im Jahr 2004 als ein neuer
Immunabwehrmechanismus gegen Infektionen bekannt und hat das klassische
Konzept der Immunabwehr durch Phagozyten erweitert. Wohingegen bisher
angenommen wurde, dass Zellen der angeborenen Immunabwehr wie Neutrophile,
Makrophagen, oder Mastzellen infektiöse Erreger durch intrazelluläre Aufnahme und
Abtöten, der sogenannten Phagozytose, eliminieren, wurde mit der Bildung der DNANetze ein weiterer Phagozytose-unabhängiger Mechanismus beschrieben. Die Zellen
werfen ein Netz an Kernmaterial bestehend aus DNA und Histonen aus, und nutzen
dieses DNA-Netz als Fangarme, um Mikroorganismen einzufangen und in einzelnen
Fällen auch zu töten. Das Ziel dieser Forschungsarbeiten war es, die Rolle der DNANetze gegen bakterielle Infektionen genauer zu charakterisieren. Die folgenden Ziele
standen im Fokus der Arbeit und wurden auf biochemischer und zellulärer Ebene
untersucht:
(1) Visualisierung und funktionelle Evaluierung von DNA-Netzen;
(2) Untersuchung der Mechanismen, die zur DNA-Netz-Bildung führen;
(3) Charakterisierung von bakteriellen Anti-DNA-Netz-Faktoren;
(4) Charakterisierung von pharmakologischen Substanzen auf ihre Fähigkeit,
DNA-Netz-Bildung zu verstärken oder DNA-Netze zu stabilisieren.
Als erster Schritt zur Verbesserung der Visualisierung der DNA-Netze konnte im
Rahmen
dieser
Untersuchungen
gezeigt
werden,
dass
Serum,
welches
normalerweise als Bestandteil der Zellkultur genutzt wird, Nukleasen enthält, und
DNA-Netze degradiert. Somit kann eine optimale Visualisierung und Analyse der
DNA-Netz-Bildung gestört werden. Eine Hitzeinaktivierung des Serums bei 70°C ist
nötig, um diese Nukleasen zu inhibieren und optimale Zellkulturbedingungen für die
experimentelle Arbeit zu schaffen. Basierend auf einer verbesserten Technik zum
Nachweis von DNA-Netzen konnten schließlich weitere Zelltypen identifiziert werden,
die in der Lage sind, DNA-Netze auszubilden, wie z.B. Fibrozyten.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige wesentliche Mechanismen der DNA-NetzBildung charakterisiert: Zunächst wurde Hypochlorit (HOCl) als eine wichtige reaktive
Sauerstoffspezies
identifiziert,
welches
die
DNA-Netz-Bildung
in
humanen
Neutrophilen auslösen kann. Außerdem wurde ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der
45
Zusammenfassung
sogenannte Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF-1α) als Regulator in der zellulären
Signalgebung
der
DNA-Netz-Bildung
bei
Mastzellen
charakterisiert.
Eine
pharmakologische Verstärkung der Aktivität von HIF-1α sorgt schließlich auch für
eine verbesserte antimikrobielle Aktivität verschiedener Wirtszellen gegen bakterielle
Erreger. In einem Modell der sekundären Infektion mit Pneumokokken nach
vorausgehender Influenza-A-Infektion im Mittelohr konnte zusätzlich gezeigt werden,
dass unspezifische Antikörper der Gruppe IgA die DNA-Netz-Bildung verstärken.
Im dritten Teil wurden bakterielle Faktoren charakterisiert, die in der Lage sind, den
Bakterien einen Schutz gegenüber der antimikrobiellen Aktivität der DNA-Netze zu
bieten. Für die Gram-positiven Bakterien Methicillin-resistente Staphylococcus.
aureus (MRSA) und Streptococcus suis wurden bakterielle Nukleasen analysiert, die
in der Lage sind, DNA-Netze zu degradieren und dadurch die Bakterien vor dem
Einfangen und der Wachstumshemmung durch DNA-Netze schützt. Für MRSA
konnte sogar gezeigt werden, dass die Nuklease einen wesentlichen Einfluss auf den
Infektionsverlauf in einem murinen Lungeninfektionsmodell hat: Mäuse, die mit einer
nukleasedefizienten Mutante des MRSA USA 300 LAC-Stamms intranasal infiziert
wurden, zeigten einen abgeschwächten Krankheitsverlauf im Vergleich zu Mäusen,
die mit dem Nuklease-positiven Wildtyp infiziert wurden. Zusätzlich wurden die
Stickstoffmonoxid-Synthase bei MRSA, sowie die Kapselbildung als DNA-NetzEvasionsfaktoren bei S. pyogenes identifiziert. Basierend auf diesen Studien konnte
somit
auch
eine
protektive
Wirkung
der
DNA-Netze
gegen
bakterielle
Infektionserreger belegt werden.
Interessanterweise zeigte sich jedoch auch, dass die Ausbildung der DNA-Netze
nicht nur eine protektive Wirkung für den Wirt haben kann. Bei einer sekundären
Pneumokokken-Infektion nach vorausgehender Influenza-A-Infektion des Mittelohrs
stellte sich heraus, dass die Pneumokokken die DNA-Netze nutzen, um sich zu
vermehren. Ob letztendlich die DNA-Netze eine protektive oder möglicherweise auch
schädliche Wirkung für den Infektionsverlauf aus Sicht des Wirtes darstellen, scheint
von dem Erreger und auch dem Infektionsort abzuhängen. Im Falle einer protektiven
Wirkung, wie für MRSA gezeigt, könnten die Netze einen attraktiven Angriffspunkt für
therapeutische Ansätze liefern, indem man sie gegen Degradation durch Bakterien
stabilisiert oder auch die Netzbildung an sich pharmakologisch verstärkt.
Schließlich
wurden
in
dem
letzten
Teil
dieser
Arbeit
drei
verschiedene
pharmakologische Substanzgruppen biochemisch und zellbiologisch auf ihre
46
Zusammenfassung
Fähigkeit getestet, ob sie die DNA-Netz-Bildung beeinflussen können. Zunächst
zeigte sich, dass Statine, Inhibitoren der 3-Hydroxy 3-Methylglutaryl Coenzym AReduktase, das entscheidende Enzym der Cholesterol-Biosynthese, die Bildung von
DNA-Netzen verstärken. Anhand biochemischer Untersuchungen konnte der Effekt
der Statine einer Hemmung des Sterol-Stoffwechsels zugeordnet werden. In einem in
vivo Mausmodell konnte sogar gezeigt werden, dass die orale Verabreichung von
Statinen den Infektionsverlauf nach intranasaler Infektion mit Staphylococcus aureus
protektiv beeinflusst: Die infizierten Mäuse, die mit Statinen gefüttert wurden, zeigten
im Vergleich zu den Kontrolltieren eine verminderte Entzündung sowie geringere
Bakterienzahlen
in
der
Lunge.
Neben
den
Statinen
zeigte
auch
das
Futterzusatzmittel β-Glucan, welches vor allem in der Fischzucht für ein verbessertes
Wachstum und auch Immunstärke der Fische eingesetzt wird, eine Wirkung auf
Fisch-DNA-Netze: Zunächst stimuliert β-Glucan die Ausbildung von DNA-Netzen und
folglich auch das Einfangen von Fisch-pathogenen Bakterien wie Aeromonas
hydrophila. Zusätzlich ist β-Glucan auch in der Lage, die DNA-Netze gegen eine
Degradation durch Nukleasen von A. hydrophila zu stabilisieren. Als dritte
pharmakologische Substanz konnte das Fluoroquinolon Enrofloxacin die Ausbildung
von
DNA-Netzen
in
bovinen
Granulozyten
verstärken.
Biochemische
Untersuchungen identifizierten die Rolle von zwei wesentlichen Enzymen, der
Peptidyl-arginin-deiminase-4 und der NADPH-Oxidase, sowie des Zytoskeletts bei
der Ausbildung dieser DNA-Netze. Diese Studien führen somit zu der Hypothese,
dass
bei
bestimmten
Erregern
wie
S.
aureus
und
A.
hydrophila
eine
pharmakologische Verstärkung der DNA-Netzbildung oder auch eine Stabilisierung
der DNA-Netze für den infizierten Wirt vorteilhaft sein kann.
Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit wesentliche Erkenntnisse in Bezug auf
die Rolle der DNA-Netze gegen bakterielle Infektionen gewonnen werden. Da sowohl
protektive als auch negative Auswirkungen für den Wirt in Abhängigkeit des
Infektionserregers beschrieben wurden, bleibt dennoch die Frage offen, ob DNANetze als Angriffspunkt für therapeutische Anwendungen dienen könnten. Dieses
Thema wird in der übergreifenden Diskussion unter der Berücksichtigung aktueller
Literatur diskutiert. Da eine überschüssige DNA-Netzbildung auch in Zusammenhang
mit Autoimmunerkrankungen steht, scheint das Gleichgewicht zwischen DNA-NetzBildung und anschließender Eliminierung durch den Wirt ausschlaggebend für den
Nutzen von DNA-Netzen oder einer Schädigung des Wirtes durch dieselben zu sein.
47
Zusammenfassung
48
Summary
8.
Summary
In 2004, the formation of extracellular DNA-traps (so-called neutrophil extracellular
traps or NETs) was discovered as a novel host innate immune defense mechanism
against infections. This discovery altered the fundamental conception of the innate
immune defense mechanism of phagocytes against pathogenic microbes in a most
fascinating way. Whereas it was believed that cells of the innate immunity as
neutrophils, macrophages and mast cells kill the invading pathogens by intracellular
uptake and subsequent killing, so-called phagocytosis, the discovery of formation of
NETs revealed an additional phagocytosis-independent mechanism. The cells
release an extracellular trap consisting of nuclear material as histones and DNA,
which can be used to immobilize and occasionally also kill several bacteria, viruses
or parasites. The aim of this study was to characterize the role of NETs against
bacterial infections. The specific aims were:
(1) Visualization and functional evaluation of NETs;
(2) Investigation of the mechanisms leading to NET-formation;
(3) Characterization of bacterial NET-evasion-factors;
(4) Characterization of pharmacological agents, which have the ability to boost
NET-formation or stabilize NETs against degradation.
As a first step to optimize the visualization of NETs, it was shown, that serum, which
is normally used as supplemental factor in tissue culture, contains NET-degrading
nucleases. Thus, the visualization and analysis of NETs could be hampered. Heatinactivation of the serum at 70°C is necessary to inhibit the nucleases and to
generate optimal tissue culture conditions for the NET-experiments. Based on an
improved method for the detection of NETs, additional cell types, e.g. bone-marrowderived fibrocytes, were identified to be able to release NETs.
In the second part of this work, some important mechanisms involved in the formation
of NETs have been characterized: Firstly, hypochlorite (HOCl) was identified as the
key reactive oxygen species involved in NET-formation of human neutrophils.
Secondly, an important transcription factor, namely the hypoxia inducible factor 1α
(HIF-1α) was characterized as a regulator in cellular signaling events mediating NETformation in mast cells. A pharmacological boosting of HIF-1α-activity was able to
improve the antimicrobial activity of different host cells against bacterial pathogens.
49
Summary
Thirdly, a model of secondary pneumococcal infections after prior influenza A
infection demonstrated that non-specific IgA antibodies enhance the formation of
NETs in the middle ear.
In the third chapter, bacterial factors that mediate resistance against antimicrobial
effects of NETs were characterized. The Gram-positive bacteria methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) and Streptococcus (S.) suis showed production of
bacterial nucleases, which are able to efficiently degrade NETs and to protect against
NET-mediated inhibition of bacterial growth. In case of MRSA, it was demonstrated
that the nuclease has a significant impact on the course of infection in a murine lung
infection model: Mice that were intranasally infected with a nuclease-deficient mutant
of the MRSA USA 300 LAC-strain exhibited an attenuated disease phenotype
compared to mice infected with the nuclease-positive wild-type strain. Additionally,
the bacterial nitric-oxide synthase of MRSA as well as the capsule of S. pyogenes
were identified as NET-evasion factors. Based on these studies, the protective
activity of NETs against several bacterial pathogens could be proven.
Interestingly, the formation of NETs does not only exhibit protective activity for the
host. In case of a secondary pneumococcal infection after prior influenza A infection,
it was found that the NETs facilitate survival and replication of pneumococci in the
middle ear. Thus, it seems to depend on the pathogen and the place of infection if
NETs have a protective or detrimental role for the host. In case of a protective role of
NETs, as shown for MRSA, NETs could be used as a therapeutic target e.g. by
pharmacologically boosting of NET-formation or stabilizing NETs against bacterial
NET degradation.
In the last part of this study, three different pharmacological substance classes were
biochemically and cell-biologically tested for their impact on NET-formation. First,
statins, inhibitors of the 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A-reductase, the ratelimiting enzyme in cholesterol-biosynthesis, were shown to enhance NET-formation.
Based on biochemical testing, the effect of statins was linked to the sterol pathway
inhibition. Using an in vivo mouse model, it was also shown that the oral application
of statins has a protective effect against intranasal infection with Staphylococcus
aureus: The infected mice that were fed a diet containing statins showed a lower
inflammation and lower bacterial load in the lung compared to respective control
mice. Besides the statins, the feed-additive β-glucan, which is widely used in fish
agriculture to improve growth and health status of fish, had an impact on NET50
Summary
formation: On one hand, β-glucan was able to trigger NET formation and
subsequently the entrapment of the fish pathogen Aeromonas hydrophila. On the
other hand, β-glucan stabilized NETs against degradation by A. hydrophila nuclease.
As a third pharmacological agent, the fluoroquinolone enrofloxacin enhanced
formation of NETs in bovine granulocytes. Biochemical investigations identified two
enzymes, the peptidyl-arginin-deiminase-4 and the NADPH-oxidase, as key enzymes
involved in this process besides the cytoskeletal rearrangement. All these data may
lead to the hypothesis that a pharmacological boosting of NET-formation or
stabilization of NETs might improve the outcome of certain bacterial infections in the
host.
In conclusion, this work provides important knowledge on the role of NETs against
bacterial infections. Since protective as well as negative effects on the host were
identified, the question still remains to be answered, whether NETs could be used as
a novel target for therapeutic interventions. This topic is discussed within this thesis
under consideration of the actual literature. Since an excessive release of NETs has
been associated with detrimental consequences for the host e.g. autoimmune
diseases, a fine balance between NET-formation and NET-degradation by the host
itself seems to be essential for a final protective outcome of an infectious disease.
51
Summary
52
Literaturverzeichnis
9.
Literaturverzeichnis
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Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
10.
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Publikation 1
von Köckritz-Blickwede M, Nizet V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial
defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 2009; 87(8): 775-83.
Konzept der Übersichtsarbeit:
von Köckritz-Blickwede, Nizet
Auswertung der Literatur:
von Köckritz-Blickwede
Erstellung des Manuskriptes:
von Köckritz-Blickwede, Nizet
Publikation 2
von Köckritz-Blickwede M, Chow OA, Nizet V. Fetal calf serum contains heat-stable
nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 2009; 114(25): 5245-6.
Konzept und Versuchsplanung:
von Köckritz-Blickwede, Nizet
Durchführung der Experimente:
von Köckritz-Blickwede, Chow
Auswertung der Ergebnisse:
von Köckritz-Blickwede
Diskussion, Beratung:
von Köckritz-Blickwede, Nizet, Chow
Erstellung des Manuskriptes:
von Köckritz-Blickwede, Chow, Nizet
Publikation 3
Von Köckritz-Blickwede M, Chow O, Ghochani M, Nizet V. Visualization and
functional evaluation of phagocyte extracellular traps. In: Methods in Microbiology
(Volume 37) Immunology of Infection Immunology, 3rd edition (Kaufmann SH and
Kabelitz D, eds). Academic Press, London, p. 139-160 (2010).
Konzept und Versuchsplanung:
von Köckritz-Blickwede, Nizet
Durchführung der Experimente:
von Köckritz-Blickwede, Chow, Ghochani
Auswertung der Ergebnisse:
von Köckritz-Blickwede, Chow, Ghochani
Diskussion, Beratung:
von Köckritz-Blickwede, Nizet, Chow,
Ghochani
Erstellung des Manuskriptes:
von Köckritz-Blickwede, Chow, Ghochani,
Nizet
65
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Publikation 4
Kisseleva T, von Köckritz-Blickwede M, Reichart D, McGillvray SM, Wingender G,
Kronenberg M, Glass CK, Nizet V, Brenner DA. Fibrocyte-like cells recruited to the
spleen support innate and adaptive immune responses to acute injury or infection. J
Mol Med. 2011; 89(10): 997-1013.
Konzept und Versuchsplanung:
Kisseleva, Brenner, Nizet, Glas
Durchführung der Experimente:
von Köckritz-Blickwede, Kisseleva, Reichart,
McGillvray, Wingender, Kronenberg
Auswertung der Ergebnisse:
von Köckritz-Blickwede, Kisseleva, Reichart,
McGillvray, Wingender, Kronenberg
Diskussion, Beratung:
Kisseleva, Brenner, Nizet, Glas, von
Köckritz-Blickwede, Reichart, McGillvray,
Wingender, Kronenberg
Erstellung des Manuskriptes:
Kisseleva, Brenner, Nizet, Glas
Publikation 5
Akong-Moore K, Chow OA, von Köckritz-Blickwede M, Nizet V. Influences of chloride
and hypochlorite on neutrophil extracellular trap formation. PLoS One. 2012; 7(8):
e42984.
Konzept und Versuchsplanung:
Akong-Moore, Nizet, Chow, von KöckritzBlickwede
Durchführung der Experimente:
Akong-Moore, Chow, von Köckritz-Blickwede
Auswertung der Ergebnisse:
Akong-Moore, Nizet, Chow, von KöckritzBlickwede
Diskussion, Beratung:
Akong-Moore, Nizet, Chow, von KöckritzBlickwede
Erstellung des Manuskriptes:
Akong-Moore, Nizet
66
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Publikation 6
Branitzki-Heinemann K, Okumura CY, Völlger L, Kawakami Y, Kawakami T, Naim
HY, Nizet V, von Köckritz-Blickwede M. A novel role for the transcription factor HIF1α in the formation of mast cell extracellular traps. Biochem J. 2012; 446(1): 159-63.
Konzept und Versuchsplanung:
Branitzki-Heinemann, Okumura, von
Köckritz-Blickwede, Naim, Nizet
Durchführung der Experimente:
Branitzki-Heinemann, Okumura, Völlger,
Kawakami, von Köckritz-Blickwede
Auswertung der Ergebnisse:
Branitzki-Heinemann, Okumura, von
Köckritz-Blickwede, Völlger
Diskussion, Beratung:
Branitzki-Heinemann, Okumura, von
Köckritz-Blickwede, Naim, Nizet, Kawakami
Erstellung des Manuskriptes:
Branitzki-Heinemann, Okumura, von
Köckritz-Blickwede, Nizet
Publikation 7
Okumura CY, Hollands A, Tran DN, Olson J, Dahesh S, von Köckritz-Blickwede M,
Thienphrapa W, Corle C, Jeung SN, Kotsakis A, Shalwitz RA, Johnson RS, Nizet V.
A new pharmacological agent (AKB-4924) stabilizes hypoxia inducible factor-1 (HIF1) and increases skin innate defenses against bacterial infection. J Mol Med. 2012;
90(9): 1079-89.
Konzept und Versuchsplanung:
Okumura, Hollands, Shalwitz, Kotsakis,
Johnson, Nizet
Durchführung der Experimente:
Okumura, Hollands, Tran, Olson, Dahesh,
von Köckritz-Blickwede, Thienphrapa, Corle,
Jeung
Auswertung der Ergebnisse:
Okumura, Hollands, Tran, Olson, Dahesh,
von Köckritz-Blickwede, Thienphrapa, Corle,
Jeung
Diskussion, Beratung:
Okumura, Shalwitz, Kotsakis, Johnson,
Nizet, von Köckritz-Blickwede
Erstellung des Manuskriptes:
Okumura, Shalwitz, Kotsakis, Johnson, Nizet
67
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Publikation 8
Short KR, von Köckritz-Blickwede M, Langereis JD, Chew KY, Job ER, Armitage CW,
Hatcher B, Fujihashi K, Reading PC, Hermans PW, Wijburg OL, Diavatopoulos DA.
Antibodies mediate formation of neutrophil extracellular traps in the middle ear and
facilitate secondary pneumococcal otitis media. Infect Immun. 2014; 82(1): 364-70.
Konzept und Versuchsplanung:
Short, von Köckritz-Blickwede, Langereis,
Chew, Job, Armitage, Hatcher, Fujihashi,
Reading, Hermans, Wijburg, Diavatopoulos
Durchführung der Experimente:
Short, von Köckritz-Blickwede, Langereis,
Chew, Job, Armitage, Hatcher, Fujihashi,
Reading, Hermans, Wijburg, Diavatopoulos
Auswertung der Ergebnisse:
Short, von Köckritz-Blickwede, Langereis,
Chew, Job, Armitage, Hatcher, Fujihashi,
Reading, Hermans, Wijburg, Diavatopoulos
Diskussion, Beratung:
Short, von Köckritz-Blickwede, Langereis,
Chew, Job, Armitage, Hatcher, Fujihashi,
Reading, Hermans, Wijburg, Diavatopoulos
Erstellung des Manuskriptes:
Short, Diavatopoulos
Publikation 9
Berends ET, Horswill AR, Haste NM, Monestier M, Nizet V, von Köckritz-Blickwede
M. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil
extracellular traps. J Innate Immun. 2010; 2(6): 576-86.
Konzept und Versuchsplanung:
Berends, Nizet, von Köckritz-Blickwede
Durchführung der Experimente:
Berends, Horswill, Haste, von KöckritzBlickwede
Auswertung der Ergebnisse:
Berends, Haste, von Köckritz-Blickwede
Diskussion, Beratung:
Berends, Horswill, Haste, Monestier, von
Köckritz-Blickwede, Nizet
Erstellung des Manuskriptes:
Berends, Nizet, von Köckritz-Blickwede
Publikation 10
de Buhr N, Neumann A, Jerjomiceva N, von Köckritz-Blickwede M*, Baums CG*.
Streptococcus suis DNase SsnA contributes to degradation of neutrophil extracellular
traps (NETs) and evasion of NET-mediated antimicrobial activity. Microbiology. 2014;
160(Pt2): 385-95. [*contributed equally to the manuscript]
68
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Konzept und Versuchsplanung:
de Buhr, von Köckritz-Blickwede, Baums
Durchführung der Experimente:
de Buhr, Neumann, Jerjomiceva, von
Köckritz-Blickwede, Baums
Auswertung der Ergebnisse:
de Buhr, Neumann, Jerjomiceva, von
Köckritz-Blickwede, Baums
Diskussion, Beratung:
de Buhr, Neumann, Jerjomiceva, von
Köckritz-Blickwede, Baums
Erstellung des Manuskriptes:
de Buhr, von Köckritz-Blickwede, Baums
Publikation 11
van Sorge NM, Beasley FC, Gusarov I, Gonzalez DJ, von Köckritz-Blickwede M, Anik
S, Borkowski AW, Dorrestein PC, Nudler E, Nizet V. Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus bacterial nitric-oxide synthase affects antibiotic sensitivity and
skin abscess development. J Biol Chem. 2013; 288(9): 6417-26.
Konzept und Versuchsplanung:
van Sorge, Beasley, Gusarov, Gonzalez, von
Köckritz-Blickwede, Anik, Borkowski,
Dorrestein, Nudler, Nizet
Durchführung der Experimente:
van Sorge, Beasley, Gusarov, Gonzalez, von
Köckritz-Blickwede, Anik, Borkowski,
Dorrestein, Nudler
Auswertung der Ergebnisse:
van Sorge, Beasley, Gusarov, Gonzalez, von
Köckritz-Blickwede, Anik, Borkowski,
Dorrestein, Nudler, Nizet
Diskussion, Beratung:
van Sorge, Beasley, Gusarov, Gonzalez, von
Köckritz-Blickwede, Anik, Borkowski,
Dorrestein, Nudler, Nizet
Erstellung des Manuskriptes:
van Sorge, Beasley, Borkowski, Dorrestein,
Nudler, Nizet
Publikation 12
Cole JN, Pence MA, von Köckritz-Blickwede M, Hollands A, Gallo RL, Walker MJ,
Nizet V. M protein and hyaluronic acid capsule are essential for in vivo selection of
covRS mutations characteristic of invasive serotype M1T1 group A Streptococcus.
MBio. 2010; 1(4).
Konzept und Versuchsplanung:
Cole, Walker, Nizet
69
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Durchführung der Experimente:
Cole, Pence, von Köckritz-Blickwede,
Hollands
Auswertung der Ergebnisse:
Cole, Pence, von Köckritz-Blickwede,
Hollands, Gallo, Walker, Nizet
Diskussion, Beratung:
Cole, Pence, von Köckritz-Blickwede,
Hollands, Gallo, Walker, Nizet
Erstellung des Manuskriptes:
Cole, Walker, Nizet
Publikation 13
Chow OA*, von Köckritz-Blickwede M*, Bright AT, Hensler ME, Zinkernagel AS,
Cogen AL, Gallo RL, Monestier M, Wang Y, Glass CK, Nizet V. Statins enhance
formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 2010; 8(5): 445-54.
[*contributed equally to the manuscript]
Konzept und Versuchsplanung:
Chow, von Köckritz-Blickwede, Bright,
Hensler, Zinkernagel, Gallo, Glass, Nizet
Durchführung der Experimente:
Chow, von Köckritz-Blickwede, Bright,
Hensler, Zinkernagel, Cogen
Auswertung der Ergebnisse:
Chow, von Köckritz-Blickwede, Bright,
Hensler, Zinkernagel, Cogen
Diskussion, Beratung:
Chow, von Köckritz-Blickwede, Bright,
Hensler, Zinkernagel, Cogen, Gallo,
Monestier, Wang, Glass, Nizet
Erstellung des Manuskriptes:
Chow, von Köckritz-Blickwede, Glass, Nizet
Publikation 14
Brogden G*, von Köckritz-Blickwede M*, Adamek M, Reuner F, Jung-Schroers V,
Naim HY, Steinhagen D. β-Glucan protects neutrophil extracellular traps against
degradation by Aeromonas hydrophila in carp (Cyprinus carpio). Fish Shellfish
Immunol. 2012; 33(4): 1060-4. [*contributed equally to the manuscript]
Konzept und Versuchsplanung:
Brogden, von Köckritz-Blickwede, Naim,
Steinhagen
Durchführung der Experimente:
Brogden, von Köckritz-Blickwede, Adamek,
Reuner, Jung-Schroers
Auswertung der Ergebnisse:
Brogden, von Köckritz-Blickwede, Adamek,
Reuner, Jung-Schroers
70
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
Diskussion, Beratung:
Brogden, von Köckritz-Blickwede, Adamek,
Reuner, Jung-Schroers, Naim, Steinhagen
Erstellung des Manuskriptes:
Brogden, von Köckritz-Blickwede, Naim,
Steinhagen
Publikation 15
Brogden G, Krimmling T, Adamek M, Naim HY, Steinhagen D, von KöckritzBlickwede M. The effect of β-glucan on formation and functionality of neutrophil
extracellular traps in carp (Cyprinus carpio L.). Dev Comp Immunol. 2014; 44(2): 280285.
Konzept und Versuchsplanung:
Brogden, Krimmling, Naim, Steinhagen, von
Köckritz-Blickwede
Durchführung der Experimente:
Brogden, Krimmling, Adamek
Auswertung der Ergebnisse:
Brogden, Krimmling, Adamek, Steinhagen,
von Köckritz-Blickwede
Diskussion, Beratung:
Brogden, Krimmling, Adamek, Naim,
Steinhagen, von Köckritz-Blickwede
Erstellung des Manuskriptes:
Brogden, Krimmling, Steinhagen, von
Köckritz-Blickwede
Publikation 16
Jerjomiceva N, Seri H, Völlger L, Wang Y, Zeitouni N, Naim HY, von KöckritzBlickwede M. Enrofloxacin enhances the formation of neutrophil extracellular traps in
bovine granulocytes. J. Innate Immun. 2014; Mar 14. [Epub ahead of print]
Konzept und Versuchsplanung:
Jerjomiceva, Seri, Naim, von KöckritzBlickwede
Durchführung der Experimente:
Jerjomiceva, Seri, Völlger, Zeitouni, von
Köckritz-Blickwede
Auswertung der Ergebnisse:
Jerjomiceva, Seri, Völlger, Zeitouni, von
Köckritz-Blickwede
Diskussion, Beratung:
Jerjomiceva, Seri, Völlger, Wang, Zeitouni,
Naim, von Köckritz-Blickwede
Erstellung des Manuskriptes:
Jerjomiceva, von Köckritz-Blickwede
71
Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen
72
Danksagung
11.
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hassan Y. Naim für seine großartige
uneingeschränkte Unterstützung in jeglicher Hinsicht bei meiner Habilitation, sowie
seinem ansteckenden Enthusiasmus und seinen wertvollen Ratschlägen in allen
Bereichen der Lehre und Forschung. Ich schätze ihn sehr dafür, dass er mir so viele
Freiheiten in der Umsetzung meiner Ideen gegeben hat und dass er mich bei der
Vereinbarkeit von Familie und Beruf so sehr unterstützt hat.
Außerdem möchte ich mich bei meinen jetzigen und ehemaligen Doktorandinnen und
Doktoranden, Master- und Bachelorstudierenden, sowie Stipendiaten – Stefanie
Blodkamp, Dr. Katja Branitzki-Heinemann, Dr. Graham Brogden, Nicole de Buhr, Dr.
Natalja Jerjomiceva, Tanja Krimmling, Anne Lorenz, Helene Möllerherm, Ariane
Neumann, Lena Völlger, Ariane Schumski, Moritz Schmitz, Dr. Hisham Seri, Leonie
von Elzner, Ragheda Yaseen, Nathalie Zeitouni - für ihren tollen Einsatz im Labor
und am Schreibtisch ganz herzlich bedanken. Ohne ihr Engagement, ihre Ideen und
exzellente Zusammenarbeit wäre meine Habilitation nicht entstanden.
Mein besonderer Dank gilt auch meinem Mentor Prof. Dr. Victor Nizet und meinem
Doktorvater Prof. Dr. Stefan Schwarz für die stets uneingeschränkte Unterstützung.
Durch ihr enormes Wissen, ihre spannenden Ideen und ihre unvergleichliche
Begeisterung haben sie meine Karriere glücklicherweise wesentlich mitgeprägt.
PD Dr. Eva Medina, Dr. Oliver Goldmann und PD Dr. Manfred Rohde danke ich für
die inspirierende tolle PostDoc-Zeit am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung,
als mir die DNA-Netz zum ersten Mal begegnet sind.
Mein Dank gilt auch meinem Mentor Herrn Prof. Dr. Jürgen Mlynek und Prof. Dr.
Singh Chhatwal für ihre wegweisende Unterstützung in meiner Karriere.
Bei allen Kolleginnen und Kollegen sowie Ehemaligen am Institut für Physiologische
Chemie bedanke ich mich für die wertvolle Hilfe und die gute Arbeitsatmosphäre, die
den tagtäglichen, reibungslosen Arbeitsablauf ermöglichen.
Bei Friederike Reuner und Sandra Pfeifer möchte ich mich für die hervorragende
Zusammenarbeit in den Projekten über die Jahre und vor allem auch bei dem Aufbau
der Arbeitsgruppe Infektionsbiochemie bedanken. Ihr seid die besten Assistenten,
die ich mir je hätte wünschen können!
73
Danksagung
Für die Umsetzung meiner Projekte sind Kooperationen mit anderen Instituten bzw.
Kliniken
der
TiHo
sehr
wichtig.
Ich
möchte
mich
bei
allen
beteiligten
Kooperationspartnern für die konstruktive Zusammenarbeit bedanken, insbesondere
bei Prof. Dr. Dieter Steinhagen und PD Dr. Christoph Baums.
Mein besonderer Dank gilt auch all meinen ehemaligen Kolleginnen und Kollegen Dr. Kathryn Akong-Moore, Evelien Berends, Dr. Katja Branitzki.Heinemann, Dr. Ohn
Chow, Dr. Anna Cogen, Dr. Jason Cole, Dr. Laura Crotty-Alexander, Samira Dahesh,
Prof. Dr. Richard Gallo, Prof. Dr. Christopher Glass, Dr. Mariam Ghochani, Dr. Nina
Haste, Dr. Mary Hensler, Dr. Andrew Hollands, Dr. Peter Hruz, Prof. Dr. Toshiaki
Kawakami, Dr. Yuko Kawakami, Dr. Tatiana Kisseleva, Dr. Shauna McGillvray, Dr.
Timo Meerloo, Dr. Cheryl Okumura, Dr. Morgan Pence, Dr. Suzan Rooijakkers, Dr.
Anjuli Timmer, Tina Tran, Dr. Satoshi Uchiyama, Dr. Nina van Sorge, PD Dr.
Annelies Zinkernagel- für die tolle produktive Zusammenarbeit während der Zeit an
der UCSD in San Diego.
Weiterhin möchte ich Linda Cox, Prof. Dr. Petra Dersch, Dr. Dimitri Diavatopoulos,
Prof. Dr. Joachim Fandrey, Dr. Ana Friães, Prof. Dr. Thomas Gutsmann, Prof. Dr.
Heiko Herwald, Prof. Dr. Alexander Horswill, Prof. Dr. Corinna Kehrenberg, Dr.
Jeroen Langereis, Dr. Petra Lüthje, Dr. Marika Midon, Prof. Dr. Marc Monestier, Dr.
Matthias Mörgelin, Dr. Andreas Nerlich, Prof. Dr. Alfred Pingoud, Prof. Dr. Mário
Ramirez, Katrin Schilcher, Dr. Kirsty Short, Dr. Suzan Rooijakkers, Dr. Simon
Schäfer, Daphne Stapels, Prof. Dr. Dorothee Viemann, Dr. Gertrud Vieten, Prof. Dr.
Yanming Wang und PD Dr. Annelies Zinkernagel für die laufenden fabelhaften
Kooperationen danken.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG KO- 3552/4-1), der Deutschen
Akademie der Naturforscher Leopoldina (BMBF-LPD 9901/8-187), dem Deutschen
Akademischen Austauschdienst (DAAD) und der Akademie für Tiergesundheit.
möchte ich für die finanzielle Unterstützung danken.
Außerdem bedanke ich mich bei all meinen Freunden für viel Verständnis, Motivation
und Vertrauen.
Bei meiner wunderbaren Familie möchte ich mich für die liebevolle Motivation, ihr
Vertrauen und Rückhalt sowie die großartige uneingeschränkte Unterstützung bei der
Vereinbarkeit von Familie und Beruf danken. Ohne Euch hätte ich das nie geschafft!
74
Anhang
75
Anhang
76
Anhang
12.
Anhang (16 verwendete Publikationen)
12.1. Publikation 1
Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte
extracellular traps.
von Köckritz-Blickwede M, Nizet V.
J Mol Med. 2009; 87(8): 775-83.
doi: 10.1007/s00109-009-0481-0.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19444424
Abstract
The formation of extracellular traps (ETs) by phagocytic cells has been recognized as
a novel and important mechanism of the host innate immune response against
infections. ETs are formed by different host immune cells such as neutrophils, mast
cells, and eosinophils after stimulation with mitogens, cytokines, or pathogens
themselves, in a process dependent upon induction of a reactive-oxygen-speciesmediated signaling cascade. ETs consist of nuclear or mitochondrial DNA as a
backbone with embedded antimicrobial peptides, histones, and cell-specific
proteases and thereby provide a matrix to entrap and kill microbes and to induce the
contact system. This review summarizes the latest research on ETs and their role in
innate immunity and host innate defense. Attention is also given to mechanisms by
which certain leading bacterial pathogens have evolved to avoid entrapment and
killing in these specialized structures.
77
Anhang
12.2. Publikation 2
Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil
extracellular traps.
von Köckritz-Blickwede M, Chow OA, Nizet V.
Blood. 2009; 114(25): 5245-6.
doi: 10.1182/blood-2009-08-240713.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20007813
No abstract available.
78
Anhang
12.3. Publikation 3
Visualization and functional evaluation of phagocyte extracellular traps.
von Köckritz-Blickwede M, Chow O, Ghochani M, Nizet V.
In: Methods in Microbiology (Volume 37) Immunology of Infection Immunology, 3rd
edition (Kaufmann SH and Kabelitz D, eds). Academic Press, London, p. 139-160
(2010).
No abstract available.
79
Anhang
12.4. Publikation 4
Fibrocyte-like cells recruited to the spleen support innate and adaptive immune
responses to acute injury or infection.
Kisseleva T, von Köckritz-Blickwede M, Reichart D, McGillvray SM, Wingender G,
Kronenberg M, Glass CK, Nizet V, Brenner DA.
J Mol Med. 2011; 89(10): 997-1013.
doi: 10.1007/s00109-011-0756-0.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21499735
Abstract
Bone marrow (BM)-derived fibrocytes are a population of CD45(+) and collagen Type
I-expressing cells that migrate to the spleen and to target injured organs, such as
skin, lungs, kidneys, and liver. While CD45(+)Col(+) fibrocytes contribute to collagen
deposition at the site of injury, the role of CD45(+)Col(+) cells in spleen has not been
elucidated. Here, we demonstrate that hepatotoxic injury (CCl(4)), TGF-β1,
lipopolysaccharide, or infection with Listeria monocytogenes induce rapid recruitment
of CD45(+)Col(+) fibrocyte-like cells to the spleen. These cells have a gene
expression pattern that includes antimicrobial factors (myleoperoxidase, cathelicidin,
and defensins) and MHC II at higher levels than found on quiescent or activated
macrophages. The immune functions of these splenic CD45(+)Col(+) fibrocyte-like
cells include entrapment of bacteria into extracellular DNA-based structures
containing cathelicidin and presentation of antigens to naïve CD8(+) T cells to induce
their proliferation. Stimulation of these splenic fibrocyte-like cells with granulocyte
macrophage-colony stimulating factor or macrophage-colony stimulating factor
induces downregulation of collagen expression and terminal differentiation into the
dendritic cells or macrophage. Thus, splenic CD45(+)Col(+) cells are a population of
rapidly mobilized BM-derived fibrocyte-like cells that respond to inflammation or
infection to participate in innate and adaptive immune responses.
80
Anhang
12.5. Publikation 5
Influences of chloride and hypochlorite on neutrophil extracellular trap
formation.
Akong-Moore K, Chow OA, von Köckritz-Blickwede M, Nizet V.
PLoS One. 2012; 7(8): e42984.
doi: 10.1371/journal.pone.0042984.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22912772
Abstract
BACKGROUND: The release by neutrophils of DNA-based extracellular traps (NETs)
is a recently recognized innate immune phenomenon that contributes significantly to
control of bacterial pathogens at tissue foci of infection. NETs have also been
implicated in the pathogenesis of non-infectious diseases such as small vessel
vasculitis, lupus and cystic fibrosis lung disease. Reactive oxygen species (ROS) are
important mediators of NET generation (NETosis). Neutrophils with reduced ROS
production, such as those from patients with chronic granulomatous disease or
myeloperoxidase (MPO) deficiency, produce fewer NETs in response to inflammatory
stimuli. To better understand the roles of various ROS in NETosis, we explore the
role of MPO, its substrates chloride ion (Cl(-)) and hydrogen peroxide (H(2)O(2)), and
its product hypochlorite (HOCl) in NETosis.
FINDINGS: In human peripheral blood neutrophils, pharmacologic inhibition of MPO
decreased NETosis. Absence of extracellular Cl(-), a substrate for MPO, also
reduced NETosis. While exogenous addition of H(2)O(2) and HOCl stimulated
NETosis, only exogenous HOCl could rescue NETosis in the setting of MPO
inhibition. Neither pharmacological inhibition nor genetic deletion of MPO in murine
neutrophils blocked NETosis, in contrast to findings in human neutrophils.
CONCLUSIONS: Our results pinpoint HOCl as the key ROS involved in human
NETosis. This finding has implications for understanding innate immune function in
81
Anhang
diseases in which Cl(-) homeostasis is disturbed, such as cystic fibrosis. Our results
also reveal an example of significant species-specific differences in NET phenotypes,
and the need for caution in extrapolation to humans from studies of murine NETosis.
82
Anhang
12.6. Publikation 6
A novel role for the transcription factor HIF-1α in the formation of mast cell
extracellular traps.
Branitzki-Heinemann K, Okumura CY, Völlger L, Kawakami Y, Kawakami T, Naim
HY, Nizet V, von Köckritz-Blickwede M.
Biochem J. 2012; 446(1): 159-63.
doi: 10.1042/BJ20120658.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22738198
Abstract
MCs (mast cells) are critical components of the host innate immune defence against
bacterial pathogens, providing a variety of intra- and extra-cellular antimicrobial
functions. In the present study we show, for the first time, that the transcriptional
regulator HIF-1α (hypoxia-inducible factor-1α) mediates the extracellular antimicrobial
activity of human and murine MCs by increasing the formation of MCETs (MC
extracellular traps).
83
Anhang
12.7. Publikation 7
A new pharmacological agent (AKB-4924) stabilizes hypoxia inducible factor-1
(HIF-1) and increases skin innate defenses against bacterial infection.
Okumura CY, Hollands A, Tran DN, Olson J, Dahesh S, von Köckritz-Blickwede M,
Thienphrapa W, Corle C, Jeung SN, Kotsakis A, Shalwitz RA, Johnson RS, Nizet V.
J Mol Med. 2012; 90(9): 1079-89.
doi: 10.1007/s00109-012-0882-3.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22371073
Abstract
Hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) is a transcription factor that is a major regulator of
energy homeostasis and cellular adaptation to low oxygen stress. HIF-1 is also
activated in response to bacterial pathogens and supports the innate immune
response of both phagocytes and keratinocytes. In this work, we show that a new
pharmacological compound AKB-4924 increases HIF-1 levels and enhances the
antibacterial activity of phagocytes and keratinocytes against both methicillinsensitive and methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus in vitro. AKB4924 is also effective in stimulating the killing capacity of keratinocytes against the
important opportunistic skin pathogens Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter
baumanii. The effect of AKB-4924 is mediated through the activity of host cells, as
the compound exerts no direct antimicrobial activity. Administered locally as a single
agent, AKB-4924 limits S. aureus proliferation and lesion formation in a mouse skin
abscess model. This approach to pharmacologically boost the innate immune
response via HIF-1 stabilization may serve as a useful adjunctive treatment for
antibiotic-resistant bacterial infections.
84
Anhang
12.8. Publikation 8
Antibodies mediate formation of neutrophil extracellular traps in the middle ear
and facilitate secondary pneumococcal otitis media.
Short KR, von Köckritz-Blickwede M, Langereis JD, Chew KY, Job ER, Armitage CW,
Hatcher B, Fujihashi K, Reading PC, Hermans PW, Wijburg OL, Diavatopoulos DA.
Infect Immun. 2014; 82(1): 364-70.
doi: 10.1128/IAI.01104-13.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24191297
Abstract
Otitis media (OM) (a middle ear infection) is a common childhood illness that can
leave some children with permanent hearing loss. OM can arise following infection
with a variety of different pathogens, including a coinfection with influenza A virus
(IAV) and Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). We and others have
demonstrated that coinfection with IAV facilitates the replication of pneumococci in
the middle ear. Specifically, we used a mouse model of OM to show that IAV
facilitates the outgrowth of S. pneumoniae in the middle ear by inducing middle ear
inflammation. Here, we seek to understand how the host inflammatory response
facilitates bacterial outgrowth in the middle ear. Using B cell-deficient infant mice, we
show that antibodies play a crucial role in facilitating pneumococcal replication. We
subsequently show that this is due to antibody-dependent neutrophil extracellular
trap (NET) formation in the middle ear, which, instead of clearing the infection, allows
the bacteria to replicate. We further demonstrate the importance of these NETs as a
potential therapeutic target through the transtympanic administration of a DNase,
which effectively reduces the bacterial load in the middle ear. Taken together, these
data provide novel insight into how pneumococci are able to replicate in the middle
ear cavity and induce disease.
85
Anhang
12.9. Publikation 9
Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from
neutrophil extracellular traps.
Berends ET, Horswill AR, Haste NM, Monestier M, Nizet V, von Köckritz-Blickwede
M.
J Innate Immun. 2010; 2(6): 576-86.
doi: 10.1159/000319909.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20829609
Abstract
Neutrophils are key effectors of the host innate immune response against bacterial
infection. Staphylococcus aureus is a preeminent human pathogen, with an ability to
produce systemic infections even in previously healthy individuals, thereby reflecting
a resistance to effective neutrophil clearance. The recent discovery of neutrophil
extracellular traps (NETs) has opened a novel dimension in our understanding of how
these specialized leukocytes kill pathogens. NETs consist of a nuclear DNA
backbone associated with antimicrobial peptides, histones and proteases that
provide a matrix to entrap and kill various microbes. Here, we used targeted
mutagenesis to examine a potential role of S. aureus nuclease in NET degradation
and virulence in a murine respiratory tract infection model. In vitro assays using
fluorescence microscopy showed the isogenic nuclease-deficient (nuc-deficient)
mutant to be significantly impaired in its ability to degrade NETs compared with the
wild-type parent strain USA 300 LAC. Consequently, the nuc-deficient mutant strain
was significantly more susceptible to extracellular killing by activated neutrophils.
Moreover, S. aureus nuclease production was associated with delayed bacterial
clearance in the lung and increased mortality after intranasal infection. In conclusion,
this study shows that S. aureus nuclease promotes resistance against NET-mediated
antimicrobial activity of neutrophils and contributes to disease pathogenesis in vivo.
86
Anhang
12.10. Publikation 10
Streptococcus suis DNase SsnA contributes to degradation of neutrophil
extracellular traps (NETs) and evasion of NET-mediated antimicrobial activity.
de Buhr N, Neumann A, Jerjomiceva N, von Köckritz-Blickwede M, Baums CG.
Microbiology. 2014; 160(Pt2): 385-95.
doi: 10.1099/mic.0.072199-0.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24222615
Abstract
Streptococcus suis is an important cause of different pathologies in pigs and humans,
most importantly fibrinosuppurative meningitis. Tissue infected with this pathogen is
substantially infiltrated with neutrophils, but the function of neutrophil extracellular
traps (NETs) - a more recently discovered antimicrobial strategy of neutrophils - in
host defence against Strep. suis has not been investigated. The objective of this work
was to investigate the interaction of Strep. suis with NETs in vitro. Strep. suis induced
NET formation in porcine neutrophils and was entrapped but not killed by those
NETs. As the amount of NETs decreased over time, we hypothesized that a known
extracellular DNase of Strep. suis degrades NETs. Though this nuclease was
originally designated Strep. suis-secreted nuclease A (SsnA), this work demonstrated
surface association in accordance with an LPXTG cell wall anchor motif and partial
release into the supernatant. Confirming our hypothesis, an isogenic ssnA mutant
was significantly attenuated in NET degradation and in protection against the
antimicrobial activity of NETs as determined in assays with phorbol myristate acetate
(PMA)-stimulated human neutrophils. Though assays with PMA-stimulated porcine
neutrophils suggested that SsnA also degrades porcine NETs, phenotypic
differences between wt and the isogenic ssnA mutant were less distinct. As SsnA
expression was crucial for neither growth in vitro nor for survival in porcine or human
blood, the results indicated that SsnA is the first specific NET evasion factor to be
identified in Strep. suis.
87
Anhang
12.11. Publikation 11
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacterial nitric-oxide synthase
affects antibiotic sensitivity and skin abscess development.
van Sorge NM, Beasley FC, Gusarov I, Gonzalez DJ, von Köckritz-Blickwede M, Anik
S, Borkowski AW, Dorrestein PC, Nudler E, Nizet V.
J Biol Chem. 2013; 288(9): 6417-26.
doi: 10.1074/jbc.M112.448738.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23322784
Abstract
Staphylococcus aureus infections present an enormous global health concern
complicated by an alarming increase in antibiotic resistance. S. aureus is among the
few bacterial species that express nitric-oxide synthase (bNOS) and thus can
catalyze NO production from L-arginine. Here we generate an isogenic bNOSdeficient mutant in the epidemic community-acquired methicillin-resistant S. aureus
(MRSA) USA300 clone to study its contribution to virulence and antibiotic
susceptibility. Loss of bNOS increased MRSA susceptibility to reactive oxygen
species and host cathelicidin antimicrobial peptides, which correlated with increased
MRSA killing by human neutrophils and within neutrophil extracellular traps. bNOS
also promoted resistance to the pharmaceutical antibiotics that act on the cell
envelope such as vancomycin and daptomycin. Surprisingly, bNOS-deficient strains
gained resistance to aminoglycosides, suggesting that the role of bNOS in antibiotic
susceptibility is more complex than previously observed in Bacillus species. Finally,
the MRSA bNOS mutant showed reduced virulence with decreased survival and
smaller abscess generation in a mouse subcutaneous infection model. Together,
these data indicate that bNOS contributes to MRSA innate immune and antibiotic
resistance phenotypes. Future development of specific bNOS inhibitors could be an
attractive option to simultaneously reduce MRSA pathology and enhance its
susceptibility to commonly used antibiotics.
88
Anhang
12.12. Publikation 12
M protein and hyaluronic acid capsule are essential for in vivo selection of
covRS
mutations
characteristic
of
invasive
serotype
M1T1
group
A
Streptococcus.
Cole JN, Pence MA, von Köckritz-Blickwede M, Hollands A, Gallo RL, Walker MJ,
Nizet V.
MBio. 2010; 1(4).
doi: 10.1128/mBio.00191-10.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20827373
Abstract
The initiation of hyperinvasive disease in group A Streptococcus (GAS) serotype
M1T1 occurs by mutation within the covRS two-component regulon (named covRS
for control of virulence regulatory sensor kinase), which promotes resistance to
neutrophil-mediated killing through the upregulation of bacteriophage-encoded Sda1
DNase. To determine whether other virulence factors contribute to this phaseswitching phenomenon, we studied a panel of 10 isogenic GAS serotype M1T1
virulence gene knockout mutants. While loss of several individual virulence factors
did not prevent GAS covRS switching in vivo, we found that M1 protein and
hyaluronic acid capsule are indispensable for the switching phenotype, a
phenomenon previously attributed uniquely to the Sda1 DNase. We demonstrate that
like M1 protein and Sda1, capsule expression enhances survival of GAS serotype
M1T1 within neutrophil extracellular traps. Furthermore, capsule shares with M1
protein a role in GAS resistance to human cathelicidin antimicrobial peptide LL-37.
We conclude that a quorum of GAS serotype M1T1 virulence genes with cooperative
roles in resistance to neutrophil extracellular killing is essential for the switch to a
hyperinvasive phenotype in vivo.
89
Anhang
12.13. Publikation 13
Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.
Chow OA, von Köckritz-Blickwede M, Bright AT, Hensler ME, Zinkernagel AS, Cogen
AL, Gallo RL, Monestier M, Wang Y, Glass CK, Nizet V.
Cell Host Microbe. 2010; 8(5): 445-54.
doi: 10.1016/j.chom.2010.10.005.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21075355
Abstract
Statins are inhibitors of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA)
reductase, the rate-limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. Recent clinicoepidemiologic studies correlate patients receiving statin therapy with having reduced
mortality associated with severe bacterial infection. Investigating the effect of statins
on the innate immune capacity of phagocytic cells against the human pathogen
Staphylococcus aureus, we uncovered a beneficial effect of statins on bacterial
clearance by phagocytes, although, paradoxically, both phagocytosis and oxidative
burst were inhibited. Probing instead for an extracellular mechanism of killing, we
found that statins boosted the production of antibacterial DNA-based extracellular
traps (ETs) by human and murine neutrophils and also monocytes/macrophages.
The effect of statins to induce phagocyte ETs was linked to sterol pathway inhibition.
We conclude that a drug therapy taken chronically by millions alters the functional
behavior of phagocytic cells, which could have ramifications for susceptibility and
response to bacterial infections in these patients.
90
Anhang
12.14. Publikation 14
β-Glucan protects neutrophil extracellular traps against degradation by
Aeromonas hydrophila in carp (Cyprinus carpio).
Brogden G, von Köckritz-Blickwede M, Adamek M, Reuner F, Jung-Schroers V, Naim
HY, Steinhagen D.
Fish Shellfish Immunol. 2012; 33(4): 1060-4.
doi: 10.1016/j.fsi.2012.08.009.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22959188
Abstract
A novel host innate immune defence mechanism against invading pathogens,
namely the formation of neutrophil extracellular traps (NETs), has recently been
discovered. These NETs are described as DNA fibres released by dying neutrophils,
which are able to entrap and kill various microbes. Here we studied the effect of the
feed additive β-glucan, namely MacroGard(®), on the degradation of NETs by the
important fish pathogen Aeromonas hydrophila. Therefore, common carp (Cyprinus
carpio) head kidney cells consisting of approximately 45% neutrophils were isolated
and treated with or without β-glucan. The degradation of NETs after co-incubation
with A. hydrophila was analysed by immunofluorescence microscopy. The data show
that A. hydrophila is able to degrade NETs and that treatment of cells with β-glucan
significantly protects the NETs against bacterial degradation. Control experiments
revealed that β-glucan augments nuclease activity of the bacteria at the same time
while protecting the NETs against its degradation. In conclusion the data indicate that
β-glucan might affect the composition and stabilisation of NETs and thereby
protecting them against degradation by A. hydrophila nuclease.
91
Anhang
12.15. Publikation 15
The effect of β-glucan on formation and functionality of neutrophil extracellular
traps in carp (Cyprinus carpio L.).
Brogden G, Krimmling T, Adamek M, Naim HY, Steinhagen D, von KöckritzBlickwede M.
Dev Comp Immunol. 2014; 44(2): 280-285.
doi: 10.1016/j.dci.2014.01.003.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24434196
Abstract
The formation of neutrophil extracellular traps (NETs) has been characterised as a
novel antimicrobial host defence strategy of neutrophils besides phagocytosis and
degranulation, which may lead to entrapment and subsequent immobilisation and/or
killing of bacterial pathogens. Here we studied the effect of the feed additive βglucan, namely MacroGard(®), on the formation and functionality of NETs in carp.
Therefore, common carp (Cyprinus carpio) head kidney and kidney cells were
isolated and treated with or without β-glucan over time. The formation of NETs was
analysed by immunofluorescence microscopy and revealed a distinct increase of
NET-formation with β-glucan. Furthermore the subsequent entrapment of Aeromonas
hydrophila, an important fish pathogen, was increased after stimulating the cells with
β-glucan. However, β-glucan did not lead to a stimulation of antimicrobial activity of
neutrophils against A. hydrophila. In conclusion, the data underline the fact that the
feed additive β-glucan is able to modulate carp neutrophil functions.
92
Anhang
12.16. Publikation 16
Enrofloxacin enhances the formation of neutrophil extracellular traps in bovine
granulocytes.
Jerjomiceva N, Seri H, Völlger L, Wang Y, Zeitouni N, Naim HY, von KöckritzBlickwede M.
J Innate Immun. 2014 Mar 14. [Epub ahead of print]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24642685
Abstract
Several antibiotics are known for their ability to accumulate in neutrophils and thereby
modulate the antimicrobial functions of those cells. This study demonstrates for the
first time that an antibiotic, namely the fluoroquinolone enrofloxacin, enhances the
formation of bovine neutrophil extracellular traps (NETs). Pharmacologically
inactivated NADPH oxidase or peptidyl-arginine deiminase-4 distinctly reduced
enrofloxacin-induced NET formation. Additionally, when cells were treated with
cytochalasin D or nocodazole, the enrofloxacin-mediated NET induction was
abolished, indicating that besides oxidative burst and histone citrullination also actin
and microtubule polymerization are involved in this process.
93