RNA-abhängige RNA-Polymerasen

Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend
Ihrer Genomorganisation
einzelsträngig
(+)-Polarität
(-)-Polarität
ambisense
Arenavirus
Poliovirus
segmentiert
Influenza A Virus
nicht segmentiert
vesicular stomatitis virua (VSV)
doppelsträngig
circulär
Hepatitis G-Virus
Reovirus
Prinzipien der Replikation und mRNA-Synthese
nicht-retroviraler RNA-Viren
RNA Genom
(+),(-), ds
Synthese von mRNA
(+)
„Transkription“
mRNA-Sysnthese
Kopie des RNA Genoms
(+),(-), ds
Replikation
Translation in virale Proteine
(Strukturproteine,
regulatorische Proteine)
Verpackung in neue Virionen
(Verpackungssequenzen, Strukturproteine)
RNA-abhängige RNA Synthese
RNA
RNA
Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs) !!
Ausnahme: Retroviren (RdDP)
RNA-abhängige RNA-Polymerasen
Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die
„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert
Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D
Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden
Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden
Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig
(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen)
Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig
Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen auf
einen gemeinsamen „Vorfahren“ hin
Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viraler
und zellulärer Polymerasen
Poliovirus 3Dpol
HIV-I RT
Pol I Klenow
RNA Pol T7
Metallbindung
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Tertiärstruktur der Poliovirus 3Dpol-Polymerase und
generelle Strukturhomologien von Polymerasen
YGDD
Nur in RdXPs
Klenow
T7 RNAP
HIV-I RT
3Dpol
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Einige repräsentative Viren mit RNA-Genomen
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Funktionen akzessorischer Proteine bei der
RNA-abhängigen RNA Synthese
1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment
RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an
definierten zellulären Strukturen statt:
(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteins
in den Kern dirigiert.
(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD an
ein vesikuläres Kompartiment dirigiert.
2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize
Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen der
Polymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die an
spezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.
Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion.
3. Stimulation der Polymeraseaktivität
4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen
Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.
Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)
Strategien der Replikation und mRNA Synthese von RNA Virusgenomen
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Zelluläre Orte viraler RNA Synthese
Cytoplasma:
Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mRNAs im Cytoplasma
Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen,
Cytoskelett)
Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöht
die Effizienz der Replikation
Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar.
Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinen
bereitgestellt werden (z.B. capping von mRNAs).
Nukleus:
Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus
Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären „splicing“-Apparates
Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält
Kernlokalisationssequenz.
Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren
RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös
- (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen
(+) Strang RNA Viren bedürfen keine aktive RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat
Polivirus hat ein 5´VpG statt CAP
Struktur und Genomorganisation des (+) Strang
Picornavirus: Poliovirus
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Replikationszyklus des (+) Strang
Picornavirus: Poliovirus
Zellkern
Bindung an PVR
(Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung)
Membranvesikel
Polyproteinsynthese
(VPg-Entfernung, Ribosomenbindung
an IRES Element)
VPg (-) Strangsynthese
Polyproteinprozessierung
(P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und
RdRP)
VPg (+) Strangsynthese
Proteintransport in Vesikel
(vesikuläre RNA-Synthese)
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Struktur des 5´-Endes des Poliovirus (+) Strang RNA Genoms
Hydrolyse durch zelluläre Esterase
(Generierung eines 5´-Up-Endes)
Phosphosäureester mit Tyr 3 von VPg
5´-Uridylrest
22 Aminosäuren
VPg Peptid
Kleeblattstruktur des 5´-Endes des
Poliovirus RNA-Genoms
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RNA Sekundärstrukturen
„stem-loops“ und „Pseudoknoten“
„stem-loop“ Strukturen
Basenpaarungen im Stamm (stem),
Keine Basenpaarungen innerhalb
der Schleife (loop)
Pseudoknoten
Basenpaarungen im Stamm,
Basenpaarungen der Schleife mit
Nukleotiden außerhalb der Schleife
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Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionen
viraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet
Bindung von viralem 3CD und dem zellulären
Poly (rC) Bindeprotein an „stem-loop“ D und B
Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexes
an Membrangebundenes 3AB Protein
„Priming“ und proteolytische Abspaltung von
VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von
3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des
3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität
Elongation und (-) Strang Synthese
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„Priming“ Reaktion am 3´-Ende der Poliovirus RNA
Proteolytische Abspaltung von
VpG durch virale 3C Protease
Bindung von 3AB an Membranen
(membranous web)
Uridylylierung von Tyr 3 des VPgTeils in 3AB durch 3Dpol
Rekrutierung des polyadenylierten
3´-Endes der Poliovirus RNA
Ausbildung eines „geprimten“
Ribonukleoproteinkomplexes
mit 2 Uriditylresten (VPgpUpU)
Elongation des (-) Stranges
Synthese eines vollständigen
VPg gebundenen (-) Stranges
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Translation viraler RNA in Proteine und
RNA-Synthese sind koordinierte Prozesse
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Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren
RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös
- (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden.
(-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat
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Struktur und Genomorganisation des nicht segmentierten (-) Strang
Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)
leader
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Replikationszyklus des nicht segmentierten (-) Strang
Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)
Bindung und Fusion
(Freisetzung des helicalen
viralen Nukleokapsids)
Synthese von 5 mRNAs
(ausgehend von leader-Sequenz)
(+) Strang Synthese
(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)
Translation viraler mRNAs
(an freien und ER-gebundenen Ribosomen)
(-) Strang Synthese
(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)
Verpackung
(unter Beteiligung von M-Protein)
Prozessierung und Lokalisierung des G-Proteins
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Genomorganisation und mRNAs des vesicular stomatitis virus VSV
Genlokalisation korrespondiert zur mRNA Menge
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Stop-Start Modell der VSV mRNA Synthese
Initiation der RNA Synthese am 3´-Ende des (-) Strang
Genoms von VSV (Primerunabhängig)
Synthese einer 47 nt langen „leader“-Sequenz;
Termination durch Ablösen der RNA von Polymerase
Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 1. Gens
(N) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)
Synthese der N mRNA und Termination in der
folgenden intergenischen Region.
Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 2. Gens (P)
(nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)
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Funktion der VSV RNA-Polymerase an der Intergenregion
Komplementärer Einbau von 7A-Resten an der U7 Sequenz der IR
Verrutschen des neusynthetisierten Stranges am Template
„Stottern“ der viralen Polymerase
Termination nach Einbau von ca. 200 A Resten: Polyadenylierung
durch „stotternde“ Transkription einer U7 Sequenz
Reinitiation und „capping“ der nachfolgenden mRNA
(„capping“ erfolgt im Zytoplasma durch virale Polymerase
und ähnelt der cap Struktur zellulärer mRNAs)
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Die Umschaltung von mRNA-Synthese zur Genomreplikation
Bei VSV wird durch das virale N-Protein reguliert
Niedrige N-Proteinkonzentration favorisiert mRNA Synthese
Hohe N-Proteinkonzentration favorisiert (+) Strang Synthese
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Struktur und Genomorganisation des segmentierten (-) Strang
Orthomyxovirus: Influenza A
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Replikationszyklus des segmentierten (-) Strang
Orthomyxovirus: Influenza A
Bindung über HA an Sialinsäure
pH-induzierte Fusion
(Endozytose)
(Freisetzung der 8 Nukleokapsidsegmente)
Kerntransport des Nukleokapsids
(NP/P/RNA-Komplex über NLS)
mRNA-Synthese/Export
(cap-snatching)
Synthese von PA, PB1, PB2
(Kernimport)
mRNA-splicing
(NS2/M2)
Synthese von HA, NA
(am rER, Transport)
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Nukleäre RNA-Synthese bei dem Orthomyxovirus Influenza A
8 Segmente mit (-) Strang Polarität
als Nukleoproteinkomplex im Virion
Synthese gecappter und polyadenylierter
mRNA aus (-) Strang Segmenten Inhibierbar
durch Į-Amanitin und Actinomycin D !?
Genomisches RNA-Segment mit
5´und 3´konservierten Regionen
(vRNA)
?
„Gecappte“ mRNA mit 10-13 zellulären
Nukteotiden und 3´-Poly A (mRNA)
Vollständige Kopie des (-) Segmentes
(cRNA)
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Capping eukaryontischer mRNAs
Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs
Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen
Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5´Ende
Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert
Cap-Struktur stabilisiert mRNA
Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation der
Translation. Cap bindet an den eukariontischen InitiationsFaktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.
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mRNA-Synthese bei Influenza A Virus: „cap snatching“
„Cap“-Raub im Nucleus der Wirtszelle
Hydrolyse einer beliebige zellulären mRNA
(„capping“ erfolgte durch zelluläre
Transferase) durch virales Protein
CpG
Initiation der (+) Strang Synthese durch
Einbau eines komplementären GTP an
vorletztem C im (-) Strang Segment:
Cap-primer-abhängige Initiation
G
Elongation durch sukkzessivem Einbau
komplementärer Nukleotide
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Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes
3
5
1
2
4
1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2
2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)
3. Bindung des 3´-Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mRNA-Fragmentes zum 3´Ende
4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.
Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).
5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.
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Umschaltung von mRNA-Syntese auf Genomreplikation bei
Influenza A Virus durch Polymerasemodifikation
PB1 Polymerase wird durch die Bindung
von (-) Strang Bindung aktiviert.
Daraufhin bindet PB2 mRNA
PA hat hier keine Funktion.
In Gegenwart des viralen NP Proteins erfolgt Bindung an PA. Die
Polymerase PB1 wird primer-unabhängig und katalysiert eine
komplette cRNA-Synthese
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Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen
Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden
RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).
Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.
Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlust
des Proteins zur Folge.
Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10
Mutationen in seinem Genom aufweist.
Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“
Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine NeuverTeilung der viralen Gensegmente.
Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.
RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch Sprung
Der Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).
Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen
(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).