Negative regulation of T cell responses in central - ETH E
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DISS. ETH Nr. 20389 Dissecting the function of lymphoid organ stromal cells in vivo Abhandlung zur Erlangung des Titels DOKTOR DER WISSENSCHAFTEN der ETH ZURICH vorgelegt von Lucas Onder Mag. Biol., Leopold-Franzens-Universität Innsbruck geboren am 25. Februar 1983 von Österreich Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. Annette Oxenius Prof. Dr. Burkhard Ludewig PD Dr. Volker Thiel 2012 Summary 1 Summary The initiation and maintenance of immune responses is highly dependent on the specialized organization of secondary lymphoid organs (SLOs). In principle, SLOs have three major functions: (i) trapping pathogens and other antigens in an antigen sampling zone in order to avoid systemic spread, (ii) optimization of immune cell traffic and initiation of systemic alert signals and (iii) caring for a controlled performance of the immune response. To fulfill these major tasks, structural integrity of SLOs is indispensable. Structural plasticity of SLOs, antigen retrieval, lymphocyte guidance and maintenance are supported by the scaffold of nonhematopoietic stromal cells. Research in the recent years described molecular signals derived by stromal cells during development and in adult SLOs during steady state and during infection. Moreover, the importance of the lymphoid stroma for the organization of SLO architecture was recently recognized and raised the attention in non-hematopoietic stromal cells. Nevertheless, exact determination of stromal cell kinetics, phenotypes and function in particular during the course of immune responses are still lacking. Likewise, stromal cell diversification during development and during the regulation of immune responses is poorly understood. The aim of this study was therefore to create and analyze stromal cell-specific mouse models. Targeting transgene expression specifically to stromal cell subsets enabled the identification, tracking and manipulation of these cells in vivo. Furthermore, manipulating stromal cells by conditional silencing of genes or specific stromal cell ablation, showed the impact of certain stromal cell subsets on immunological and developmental processes. Stromal cell specific reporter gene expression allowed tracking of stromal cell subsets by using various techniques, such as flow cytometry or advanced microscopy techniques. 4 Summary We have generated a bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic mouse model that utilizes the podoplanin (pdpn) promoter to express Cre-recombinase exclusively in SLO stromal cells. The characterization of Pdpn-Cre transgene expression revealed targeting of subsets of fibroblastic reticular cells and lymphatic endothelial cells in LNs. Furthermore, the transgene facilitated the identification of a novel splenic perivascular stromal cell subpopulation that forms web-like structures around central arterioles. Assessment of in vivo antigen expression in the genetically tagged stromal cells of Pdpn-Cre mice resulted in activation of both MHC I and II-restricted TCR transgenic T cells. To gain further knowledge on the biology of FRCs and possibly other stromal cell subsets, we have generated a bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic mouse model that utilizes the CCL19 promoter to direct Cre-recombinase to FRCs. Crossing of CCL19-Cre mice to R26-EYFP reporter mice revealed that transgene expression in LNs was almost exclusively confined to podoplanin+CD31- FRCs. Furthermore, we conditionally silenced LTR signaling in all CCL19-Cre expressing FRCs and found that terminally differentiated FRCs are important for LN development and identified a yet unknown differentiation-pathway of FRCs. A further part of this thesis shows that lymphatic endothelial cells (LECs) are a prominent source of Interleukin-7 (IL-7) both in human and murine lymph nodes. Using BAC transgenic IL-7-Cre mice, we found that FRCs and LECs strongly upregulated IL-7 expression during LN remodeling induced by viral infection and avascular transplantation. Importantly, selective depletion of IL-7-producing stromal cells completely abolished LN reconstruction. Our data change the view on the functions of this pleiotropic cytokine, which was believed to selectively act on T cells in the T cell zone. IL-7 might be required in LNs and peripheral tissues, in particular to support the survival of various migratory cells crossing the lymphatic endothelium and residing in interfollicular regions. 5 Summary Lymphotoxin--receptor (LTR) signaling in mesenchymal stromal cells of the embryo is crucial for the development of SLOs. Since endothelial cells are present during early development of the lymphoid system and were shown to express chemokines and cytokines which require LTR engagement, we were interested in the role of endothelial restricted LTR signaling for LN development. Our conditional deletion of LTR in endothelial cells delineated a crucial role of embryonic endothelial progenitors for LN development and adult endothelial cell differentiation. Taken together, this study condensates the characterization of first stromal cell specific mouse models, selectively targeting LN FRCs and endothelial cells. Besides the description of transgene expressing stromal cells in these models, first experiments show the versatility of these models to study stromal cell biology in vivo. 6 Zusammenfassung 2 Zusammenfassung Sekundäre lymphatische Organe (SLO) besitzen eine hoch spezialisierte Gewebestruktur, die es ermöglicht den Ablauf einer Immunantwort zu organisieren. Die Aufrechterhaltung dieser Struktur ist dabei unerlässlich um die Funktion und Qualität der Immunantwort zu sichern. Die Aufgaben funktioneller SLO umfassen einerseits die Ausbreitung von Pathogenen im Organismus zu vermeiden und andererseits den kontrollierten Ablauf der Immunantwort zu garantieren. Der Ablauf einer Immunantwort umfasst neben einer hohen Migrations-Aktivität von verschiedenen Immunzellen auch eine graduelle Veränderung der Gewebestruktur von SLO. Die Migration von Immunzellen, aber auch die Plastizität der Struktur wird von nichthämatopoietischen Stromazellen organisiert. Einige Studien der letzten Jahre beschrieben wichtige molekulare Mechanismen in Stromazellen, die für die Entwicklung von SLO und die Organisation der Struktur von SLO während Immunaktivität unerlässlich sind. Die Gesamtheit nicht-hämatopoietischer Stromazellen wird als sehr heterogen betrachtet, sodass eine Charakterisierung von Stromazell-Subpopulationen oder die Zuweisung von spezifischen Funktionen an diverse Subpopulationen noch nicht erfolgen konnte. Nicht zuletzt ein Mangel an Wissen über die Variabilität der Stromazellen, sondern auch das Fehlen von stromazellspezifischen Modellen sind der Grund dafür. Die vorliegende Arbeit hatte es sich zum Ziel gesetzt, stromazell-spezifische, transgene MausModelle zu erstellen und zu charakterisieren. Gezielte Transgen expression in Stromazellen ermöglicht es, Stromazellen in vivo zu markieren und unter verschiedensten Bedingungen zu analysieren und manipulieren. Unter Anwendung von Analyseverfahren, wie Durchflusszytometrie oder verschiedener Mikroskopie-Techniken, beschreibt die vorliegende Arbeit die Beschaffenheit zwei neuer Mausmodelle für die Analyse von Stromazellen in SLO. 7 Zusammenfassung Im ersten Teil dieser Arbeit befindet sich die Beschreibung des transgenen Podoplanin-Cre (Pdpn-Cre) Mausmodells, das im Rahmen dieses Projektes erstellt wurde. Hier wurde das Enzym Cre-Rekombinase unter die Kontrolle des Promotors des stromazell-spezifischen Gens Pdpn gestellt. In den Lymphknoten von Pdpn-Cre Mäusen wurde die Aktivität des Transgens in fibroblastischen, retikulären Stromazellen (FRCs) der T-Zell-Zone und in Zellen des lymphatischen Endothels (LECs) lokalisiert. Ausserdem identifizierte die Pdpn-Cre-Aktivität eine neue perivaskuläre Stromazell-Subpopulation in der Milz. In ersten Experimenten zum Einfluss von stromazell-spezifischer Modellantigen-Expression auf die T-Zell-Entwicklung konnte gezeigt werden, dass selbstreaktive T Zellen aktiviert werden können, wenn Stromazellen das Selbstantigen produzieren. Um die Expression der Cre-Rekombinase spezifisch in Stromazellen der T-Zell-Zone, den FRCs, zu erreichen, wurde ein CCL19-Cre Mausmodell erstellt. Die initiale Charakterisierung dieses Modells erbrachte eine hoch-spezifische Aktivität des Transgens in FRCs der Lymphknoten von CCL19-Cre Mäusen. In ersten Experimenten mit dem neuen CCL19-Cre Mausmodell wurde ein stromazell-relevantes Gen in transgen-aktiven FRCs deaktiviert. Die Expression von Lymhotoxin--Rezeptor (LTR) in Stromazellen ist wichtig für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von SLO. Der relative Beitrag der LTR Signalkaskade in FRCs ist daher von Interesse. Im Verlauf dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Blockade der LTR -Expression in FRCs einen Einfluss auf die Organisation von Lymphknoten hatte. Zusätzlich konnte ein Teil der LTR-abhängigen Differenzierung von FRCs im Detail beschrieben werden. Frühere Studien zeigten dass der Botenstoff Interleukin-7 (IL-7) von Stromazellen in SLO produziert wird. Die detaillierte Charakterisierung der transgenen Aktivität in IL-7-Cre Mäusen identifizierte Stromazell-Subpopulationen 8 in peripheren Lymphknoten als Zusammenfassung Produktionsstätte von IL-7. Dieser Teil der vorliegenden Arbeit zeigt, dass Subpopulationen von LECs und FRCs IL-7 produzieren und, dass diese Zellen infolge von struktureller Veränderung der Lymphknoten-Architektur expandieren. Als Ergebnis von selektiver Depletion IL-7 produzierender Stromazellen während der Rekonstruktion von Lymphknoten, zeigt sich die Notwendigkeit dieser Zellen zum erfolgreichen Wiederaufbau zerstörter Lymphknoten. Die Expression von LTR in mesenchymalen Stromazellen ist wichtig für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von SLO. Im Embryo befinden sich nicht nur mesenchymale Stromazellen, aber auch Endothelzellen, die LTR abhängige Genexpression durchführen. Der Einfluss der LTR Signaltransduktion in Endothelzellen für die Entwicklung von beispielsweise Lymphknoten ist allerdings unbekannt. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit eine konditionelle Deaktivierung dieses Signalweges spezifisch in Endothelzellen generiert. Im Anbetracht der Lymphknoten Entwicklung konnte in diesem Teil der Arbeit gezeigt werden, dass LTR abhängige Signale in embryonalen Endothelzellen einerseits unerlässlich zur normalen Entwicklung von Lymphknoten sind und andererseits die Differenzierung von Endothelzellen reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden stromazell-spezifische Mausmodelle generiert und analysiert. Diese Modelle zeigen eine selektive Transgen-Aktivität in verschiedenen Stromazell-Subpopulationen von SLO. Erste Experimente beschreiben die Vielseitigkeit dieser Modelle in der Verwendung zum detaillierten Studium der Biologie von Stromazellen. 9