Wertigkeit einer SMAD4-Expressionsreduktion als prognostischer
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Aus der Medizinischen Klinik im Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Wolff-H. Schmiegel Wertigkeit einer SMAD4-Expressionsreduktion als prognostischer Marker bei einer Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Dominik Meier aus Schwerte 2011 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Anke Reinacher-Schick Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Hans-Joachim Trampisch Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2012 Abstract Dominik Meier Wertigkeit einer SMAD4-Expressionsreduktion als prognostischer Marker bei einer Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Problem SMAD4 ist ein Tumorsuppressorgen, welches eine wichtige Rolle in der kolorektalen Karzinogenese spielt. Erste Studien deuten auf eine Wertigkeit von SMAD4 als prognostischer Biomarker bei kolorektalen Karzinomen (KRK) in den UICC-Stadien II und III hin. Für metastasierte KRK des Stadiums IV sind vergleichbare Daten bislang nicht verfügbar. In dieser Arbeit haben wir Gewebeproben von Patienten mit metastasierten KRK, welche eine Kombinationschemotherapie bestehend aus Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin erhalten haben, analysiert, um eine mögliche Assoziation zwischen dem SMAD4Expressionsstatus und dem Gesamt- bzw. progressionsfreien Überleben der Patienten nachzuweisen. Methode Es wurden Tumor-Gewebeproben aus einem Teilkollektiv einer großen klinischen Phase III Studie der Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie (AIO) untersucht (Porschen et al., 2007). In dieser Studie wurde der Einsatz des oralen Fluoropyrimidins Capecitabin mit einer infusionalen Applikation von 5-FU/FS – jeweils in Kombination mit Oxaliplatin – im Rahmen der Erstlinien-Chemotherapie von Patienten mit metastasiertem KRK verglichen. Die immunhistochemischer Auswertung Methoden. Für des die SMAD4-Expressionsstatus statistischen Analysen erfolgte bezüglich mittels des etablierter Gesamt- und progressionsfreien Überlebens wurden der log-rank-Test sowie Kaplan-Meier-Plots verwendet. Ergebnis Es stand Tumor-Material von 121 Patienten zur Verfügung. Eine reduzierte nukleäre SMAD4-Expression war in 19,7% der Präparate nachweisbar, eine gleichzeitige Expressionsreduktion sowohl in den Nuklei als auch im Zytoplasma in 4,3% der Fälle. Eine alleinige nukleäre Expressionsreduktion zeigte keinen signifikanten Unterschied bezüglich des Gesamtüberlebens (OS) im Vergleich zu Patienten mit erhaltener SMAD4Expression (p = 0.533). Die vollständige, d.h. sowohl nukleär als auch zytoplasmatisch nachweisbare Expressionsreduktion war hingegen signifikant mit einem reduzierten OS assoziiert (6,733 vs. 14,960 Monate, p = 0.002). Eine signifikante Assoziation mit dem progressionsfreien Überleben (PFS) war weder bei alleiniger Reduktion der nukleären Expression (p = 0.334) noch bei gleichzeitiger Reduktion in Nuklei und Zytoplasma (p = 0.458) nachweisbar. Diskussion Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine reduzierte SMAD4-Expression ein negativer prognostischer Marker bei Patienten mit metastasiertem KRK unter Behandlung mit Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin ist. Die vorliegende Arbeit war Grundlage für eine größere retrospektive Studie, die eine erste Bestätigung der Resultate dieser Arbeit zeigen konnte (Baraniskin et al., 2011). Eine weitere prospektive Validierung dieser Daten in größeren Kollektiven erscheint daher sinnvoll. Meiner Mutter und Nina Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ………………………………………………………………………… 1.1 6 Das kolorektale Karzinom – Epidemiologie, Pathologie und Prognose ……………..………………………………………………….. 6 1.2 Medikamentöse Therapie des kolorektalen Karzinoms …………. 11 1.3 Molekulare Prognose- und Prädiktionsfaktoren beim kolorektalen Karzinom …………………….….……………………………….. 14 1.3.1 k-ras …………………………………………………………………… 17 1.3.2 Mikrosatelliteninstabilität ………..………………………………….. 18 1.3.3 SMAD4 …………………………….…………………………………. 18 2 Fragestellung und Ziel ………………………………………………………… 21 3 Material und Methoden …………………..……………………………………. 22 4 3.1 Material ……………………………………………………………….. 22 3.1.1 Studiendesign ……………………………….………………………. 22 3.1.2 Materialien und Geräte …………………….……………………….. 23 3.2 Methoden …………………………………..………………………… 26 3.2.1 Ethikvotum …………………………………………………………… 26 3.2.2 Herkunft des Studienmaterials …………..………………………… 26 3.2.3 Aufbereitung der Gewebeproben …………………..……………… 26 3.2.4 Immunhistochemie ………………………………………………….. 27 3.2.4.1 Allgemeines Prinzip der Immunhistochemie ………..……………. 27 3.2.4.2 Immunhistochemische Färbung ……………………...……………. 29 3.2.5 Konventionell-histologische Färbung ……………….…………….. 30 3.2.6 Kontrollen …………………………………………………………….. 31 3.2.7 Auswertung der gefärbten Gewebeproben ………………………. 32 3.2.8 Statistische Auswertung ……………………………….…………… 33 Ergebnisse ………………………………………………………….…………… 34 4.1 Basis-Charakteristika des untersuchten Teilkollektivs ………….. 34 4.2 SMAD4-Expressionsstatus …………………………………………. 36 4.3 Korrelationsanalysen ……………………………………………….. 39 4.3.1 SMAD4-Expressionsstatus und Basis-Charakteristika ………….. 39 4.3.2 SMAD4-Expressionsstatus und Gesamt- bzw. progressionsfreies Überleben …………………………………………………….. 40 -1- 5 Diskussion ………………………………………………………………….……. 45 5.1 Erläuterung und Diskussion der Ergebnisse ……………….…….. 45 5.1.1 Basis-Charakteristika und Expressionsstatus ……………………. 45 5.1.2 Gesamt- und progressionsfreies Überleben ………………..…….. 46 5.1.3 Immunhistochemie …………………………………………..……… 48 5.1.4 Studiendesign ……………………………………………….………. 49 5.2 Einordnung der Ergebnisse in die Literatur …………….………… 49 5.3 Ausblick ……………………………………………………………… 53 6 Zusammenfassung …………………………………………………….……….. 55 7 Literaturverzeichnis ……………………………………………………………. 57 -2- Verzeichnis der Abkürzungen 5-FU 5-Fluorouracil AIO Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie CAPOX- Schema Chemotherapie-Protokoll bestehend aus Capecitabin und Oxaliplatin CIM CpG-Insel-Methylierung CIN chromosomale Instabilität CR complete response EGFR Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor FAP familiäre adenomatöse Polyposis FOBT fecal occult blood test FOLFOX-Schema Chemotherapie-Protokoll bestehend aus 5-Fluorouracil, Folinsäure und Oxaliplatin FS Folinsäure FUFOX-Schema Chemotherapie-Protokoll bestehend aus 5-Fluorouracil, Folinsäure und Oxaliplatin HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung HIER-Methode heat induced epitop retrieval Methode HNPCC hereditäres nicht-polypöses Kolonkarzinom KRK kolorektales Karzinom LOH loss of heterozygosity LSAB-Methode Labelled-Streptavidin-Biotin-Methode MAPK Mitogen-aktivierte Protein-Kinase mRNA Messenger-Ribonukleinsäure MSI Mikrosatelliteninstabilität, mikrosatelliteninstabil ORR overall response rate OS overall survival PD progressive disease PFS progression free survival PR partial response RECIST response evaluation criteria in solid tumors SD stable disease TGF-β transforming growth factor beta UICC Union internationale contre le cancer VEGF vascular endothelial growth factor -3- Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Stadieneinteilung des KRK nach UICC (TNM-Klassifikation in der 6. Auflage) und 5-Jahres-Überlebensrate nach O’Connell et al. .…………………………….………..……………………………. 10 Tabelle 2: Definition des Remissionsverhaltens gemäß der RECIST-Kriterien. ……….……………………….………….….……………..……… 23 Tabelle 3: Geräte und Computerprogramme. ……………...………….………. 24 Tabelle 4: Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. ……...…………..………. 25 Tabelle 5: Basis-Charakteristika des untersuchten Teil- und des Gesamtkollektivs im Vergleich. …………………..……...…………..………. 34 Tabelle 6: Basis-Charakteristika des untersuchten Teilkollektivs. ….….……. 35 Tabelle 7: SMAD4-Expressionsstatus in Nuklei und Zytoplasma. ….…….…. 36 Tabelle 8: p-Werte der Korrelationsanalyse zwischen SMAD4-Expressionsstatus und Basis-Charakteristika des Teilkollektivs. …….….……. 40 Tabelle 9: Uni- und multivariate Korrelationsanalysen des SMAD4-Expressionsstatus und der Basischarakteristika mit Gesamt- und progressionsfreiem Überleben. ……………………………..………. 44 -4- Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1: Genetische Veränderungen im Verlauf der klassischen Adenom-Karzinom-Sequenz. …….……...……...…………………. 8 Abbildung 2: Unterschiede zwischen prognostischen und prädiktiven Markern. ………………………….…..…………...…………………. 15 Abbildung 3: Prinzip der LSAB-Methode bei der immunhistochemischen Färbung. ……………………………..…………...………………….. 29 Abbildung 4: Deutlich positive Anfärbung von Tumorgewebe und Stroma, erhaltene SMAD4-Expression in Nuklei und Zytoplasma. ..…….. 37 Abbildung 5: Expressionsverlust in Nuklei und Zytoplasma des Tumorgewebes, deutlich positive Anfärbung des Stromas und angrenzenden Normalgewebes. ……………………….…………….. 38 Abbildung 6: Verlust der Expression in den Nuklei bei erhaltener zytoplasmatischer Expression, positiv angefärbtes Stroma. ……….…….. 39 Abbildung 7: Kaplan-Meier-Plots des Gesamtüberlebens (Expressionsreduktion vs. -erhalt getrennt nach Lokalisation). ……..….….….. 41 Abbildung 8: Kaplan-Meier-Plots des progressionsfreien Überlebens (Expressionsreduktion vs. -erhalt getrennt nach Lokalisation). …..... 43 -5- 1 Einleitung 1.1 Das kolorektale Karzinom – Epidemiologie, Pathologie und Prognose Das kolorektale Karzinom (KRK) stellt innerhalb Deutschlands die zweithäufigste Manifestation maligner Tumorerkrankungen dar. Jährlich sind beinahe 70.000 Neuerkrankungen sowie nahezu 30.000 Todesfälle aufgrund eines KRK in Deutschland zu verzeichnen. Damit nimmt das KRK auch in der Todesursachenstatistik der Krebserkrankungen den zweiten Platz ein. Diese Daten verteilen sich zu nahezu gleichen Teilen auf Männer und Frauen (Husmann et al., 2010). Das mittlere Erkrankungsalter beträgt bei Männern 69, bei Frauen 75 Jahre. Das KRK ist damit im Wesentlichen – lässt man genetisch bedingte Erkrankungen wie z.B. die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) oder das hereditäre nichtpolypöse Kolonkarzinom (HNPCC) einmal beiseite – eine Erkrankung des alten Menschen. Dies zeigt sich auch bei der Betrachtung der Altersverteilung. Die Inzidenz nimmt bei beiden Geschlechtern mit steigendem Alter stetig zu und erreicht bei den Männern ein Maximum im Alter zwischen 80 und 85 Jahren bzw. bei den Frauen im Alter von mehr als 85 Jahren (Husmann et al., 2010). Auch bei Betrachtung des vorwiegenden Diagnosealters ergibt sich das gleiche Bild: 90% der KRK werden im Alter über 50 Jahren diagnostiziert. Ab diesem Zeitpunkt verdoppeln sich sowohl Inzidenz als auch Mortalität pro weiterer Lebensdekade (Nelson et al., 1999). Insgesamt betrachtet ergibt sich für Deutschland ein individuelles Lebenszeitrisiko von 4-6%. Damit erkrankt in etwa jeder 20. Bundesbürger im Laufe seines Lebens an einem KRK. Betrachtet man Inzidenz und Mortalität über einen Erfassungszeitraum von 1980 bis 2006 hinweg, so lassen sich folgende Trends erkennen: Die Inzidenzen haben sich seit etwa Mitte der 90er Jahre zunächst auf einem – für Männer und Frauen etwas unterschiedlichen – Niveau stabilisiert, um nun seit ca. 2002 eine langsam abfallende Tendenz zu zeigen. Demgegenüber zeigt die Betrachtung der Mortalitätsraten einen schwachen, aber stetigen Rückgang bei beiden Geschlechtern bereits seit ca. 1992 (Husmann et al., 2010). Es ist anzunehmen, dass dieser Rückgang der Mortalitätsraten sowohl durch die Entwicklung von -6- effektiven Methoden zur Krebs-Früherkennung als auch durch die Verbesserung der verfügbaren Therapieoptionen mit bedingt ist (Stewart et al., 2004; Brenner et al., 2010). So können mittlerweile Screening-Methoden wie z.B. der FOBT (fecal occult blood test) und die Kolonoskopie der Allgemeinbevölkerung (weitestgehend) flächendeckend angeboten werden. Auch das zur Verfügung stehende Spektrum an Therapieoptionen ist in den letzten Jahren stetig gewachsen, insbesondere durch die Einführung neuer wirksamer Substanzen (siehe Kap. 1.2). Betrachtet man alle auftretenden KRK in der Gesamtschau, so findet sich in 6575% der Fälle eine leere Familienanamnese. Die sporadischen KRK stellen anteilsmäßig also den Großteil aller Neuerkrankungen. In 25-35% der Fälle findet sich im Gegensatz dazu jedoch eine familiäre Häufung (Lichtenstein et al., 2000). Diese Häufung ist zu einem kleinen Teil (2-6% aller KRK (Kemp et al., 2004)) einem der heute bekannten, monogen erblichen Syndrome zuzuordnen. Dazu gehören v.a. das hereditäre nicht-polypöse Kolonkarzinom (HNPCC bzw. LynchSyndrom) und die FAP. Weitere, seltenere Ursachen sind das Peutz-JeghersSyndrom sowie die juvenile Polyposis coli. Der restliche Anteil der familiär gehäuft auftretenden Fälle wird anderen, noch nicht identifizierten (poly-) genetischen Faktoren zugeschrieben (Xu and Pasche, 2007). Karzinome des Kolons und des Rektums entstehen fast nie in bzw. aus gesunder Schleimhaut. In der Regel finden sich zunächst Adenome, welche primär benigner Dignität sind. Die Entstehung eines KRK aus einem Adenom dauert im Mittel etwa 10 Jahre. Die zugrundeliegenden molekularbiologischen Veränderungen sind heute gut untersucht (Vogelstein et al., 1988). Man bezeichnet diese genetischen Alterationen im Verlauf der Entwicklung von gesunder Schleimhaut zum Adenom und später zum Karzinom auch als klassische Adenom-Karzinom-Sequenz. Das Progressions-Modell dieser klassischen Adenom-Karzinom-Sequenz beruht auf der Annahme, dass die Akkumulation verschiedener Mutationen bzw. genetischer Veränderungen im Verlauf dazu führt, dass zunächst aberrant kryptische Foci, kleine Adenome, größere Adenome und dann Karzinome entstehen. Diese Veränderungen betreffen verschiedene Onkogene und Tumorsuppressorgene (Kinzler and Vogelstein, 1998). Einen Überblick über die genetischen Alterationen im Verlauf dieser Progressionskaskade gibt Abbildung 1: -7- Abbildung 1: Genetische Veränderungen im Verlauf der klassischen AdenomKarzinom-Sequenz (modifiziert nach (Vogelstein et al., 1988; Kinzler and Vogelstein, 1998), Erläuterungen im Text). Bei KRK kann man nun je nach Art der zugrundeliegenden Veränderungen bzw. je nach Zeitpunkt ihres Auftretens drei verschiedene Phänotypen unterscheiden: die Phänotypen der chromosomalen Instabilität (CIN), der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) sowie der CpG-Insel-Methylierungen (CIM) (Issa, 2008). Der sog. Phänotyp der chromosomalen Instabilität ist der häufigste der drei genannten Phänotypen. Er zeichnet sich aus durch eine Kaskade von Alterationen verschiedener chromosomaler Abschnitte und entspricht dem o.g., von Vogelstein et al. postulierten, klassischen Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz (Vogelstein et al., 1988). Am Anfang dieser Kaskade steht die Inaktivierung des APC-Gens, bei dem es sich um ein Tumorsuppressorgen handelt. Es verliert aufgrund von inaktivierenden Mutationen seine Funktion, wodurch ein Wachstums- bzw. Überlebensvorteil der Zelle resultiert (Goss and Groden, 2000) und es zur Akkumulation weiterer genetischer Alterationen im Rahmen der klonalen Expansion kommt. Im weiteren Verlauf des Progressions-Modells kommt es dann sowohl zu aktivierenden Mutationen des k-ras Onkogens als auch zu inaktivierenden Veränderungen von Tumorsuppressorgenen auf dem Chromosom 18q. Dort sind insbesondere die Gene DCC, SMAD2 und SMAD4 (siehe Kap. 1.3.3) von Bedeutung, welche v.a. durch Verlust chromosomalen Materials inaktiviert werden. -8- Schließlich ist auch das Tumorsuppressorgen p53 im Rahmen des ProgressionsModells von Alterationen betroffen. Sind Mutationen im Bereich dieses Gen-Locus aufgetreten, so findet man als morphologisches Korrelat high-grade intraepitheliale Neoplasien oder sogar bereits invasive Karzinome. Ein kleinerer Anteil der KRK weist den sog. Phänotyp der Mikrosatelliteninstabilität auf. Diese Form ist insbesondere typisch für Tumoren im Rahmen eines LynchSyndroms (HNPCC), kommt aber auch beim sporadischen KRK vor. Zugrunde liegt eine angeborene (HNPCC) oder erworbene Mutation im Bereich der DNAMismatch-Reparatur-Gene. Bei Mutationen im Bereich dieser Loci kommt es zunehmend zu verbleibenden Fehlern bei der Replikation, die insbesondere repetitive Sequenzen, die sog. Mikrosatelliten, betreffen. Bei Längenveränderungen dieser repetitiven Bereiche kann es gehäuft zu „frame-shifts“, d.h. zu Verschiebungen des Leserasters und damit in der Konsequenz zur Synthese funktionsuntüchtiger Proteine kommen. Dies resultiert in einem beschleunigten Durchlauf des Tumor-Progressions-Modells (Issa, 2008). Der dritte und letzte Phänotyp trägt die Bezeichnung CpG-Insel-MethylierungsPhänotyp. Hier spielen epigenetische Vorgänge wie Histon-Acetylierungen oder die sog. CpG-Insel-Methylierung eine Rolle. Durch das Stattfinden dieser Vorgänge in genregulatorischen Abschnitten (insbesondere im Promoter-Bereich) kommt es zur Abschaltung der Transkription der jeweils betroffenen Gene, was einer funktionellen Inaktivierung entspricht. Sind von dieser Inaktivierung nun Tumorsuppressorgene oder Loci der DNA-Mismatch-Reparatur-Gene betroffen, so kann nun auch hier eine (beschleunigte) Karzinogenese stattfinden. Bezüglich der DNA-Mismatch-Reparatur-Gene ist gehäuft der Locus des MLH-1Gens von einer Hypermethylierung betroffen. Dies führt dazu, dass häufig gleichzeitig eine Mikrosatelliteninstabilität vorliegt (Issa, 2008). Die Einteilung des KRK erfolgt nach dem TNM-System. Die verschiedenen TNMParameter werden den UICC-Stadien 0-IV (Union internationale contre le cancer) zugeordnet. Diese Einteilung erlaubt die Zusammenfassung von Stadien mit ähnlichem prognostischem Verlauf. Für die bislang in der 6. Auflage verwendete TNM-Klassifikation der UICC (UICC, -9- 2002) zeigt beispielsweise eine Untersuchung von O’Connell et al. (O'Connell et al., 2004) wie die 5-JahresÜberlebensrate mit fortschreitendem Stadium stetig sinkt (siehe Tabelle 1): Tabelle 1: Stadieneinteilung des KRK nach UICC (TNM-Klassifikation in der 6. Auflage (UICC, 2002)) und 5-Jahres-Überlebensraten nach O’Connell et al. (O'Connell et al., 2004). T-Stadium N-Stadium M-Stadium Anteil 5-JahresÜberlebensrate UICC 0 Tis N0 M0 - - UICC I T1-2 N0 M0 ~ 15% 93,2% UICC IIA T3 N0 M0 UICC IIB T4 N0 M0 UICC IIIA T1-2 N1 M0 UICC IIIB T3-4 N1 M0 UICC IIIC jedes T N2 M0 UICC IV jedes T jedes N M1 ~ 20-30% 84,7% 72,2% 83,4% ~ 30-40% 64,1% 44,3% ~ 20-25% 8,1% Seit kurzem ist diese TNM-Klassifikation nun in der aktualisierten 7. Auflage verfügbar (UICC, 2010). Hierbei wird das UICC-Stadium II nun in die Subgruppen A, B und C und das Stadium IV in die Subgruppen A und B unterteilt. In den Stadien II, III und IV wurden darüber hinaus geringfügige Änderungen an der jeweiligen Zuordnung der N- und M-Parameter vorgenommen. Bislang sind für diese neue Fassung jedoch noch keine Überlebensdaten verfügbar, so dass eine prospektive Evaluation dieser Klassifikation noch aussteht. Die UICC-Stadieneinteilung ist nun nicht nur relevant für die Abschätzung der Prognose bzw. der 5-Jahres-Überlebensrate einzelner Patienten, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle für die Wahl der entsprechenden Therapie. Die Stadieneinteilung bei Erstdiagnose stellt die Entscheidungsgrundlage für das sich anschließende therapeutische Vorgehen dar. Generell sollte die chirurgische R0-Resektion – wann immer möglich – die Therapie der Wahl darstellen, da nur so das KRK potentiell kurativ zu behandeln ist. Neben dem chirurgischen Vorgehen stellt die systemische medikamentöse (Chemo-) Therapie einen weiteren Bestandteil - 10 - der KRK-Behandlung dar. Hierbei unterscheidet man je nach Therapieziel verschiedene Ansätze. Die adjuvante Therapie wird an eine chirurgische R0Resektion angeschlossen, um das Auftreten von Rezidiven zu verhindern. Im Gegensatz dazu geht die neoadjuvante Therapie der Operation voraus. Ihr Ziel besteht darin, Tumormanifestationen (wie beispielsweise hepatische Metastasen) zu verkleinern, um sie so sekundär resektabel zu machen. Die palliative Therapie verfolgt schließlich keinen kurativen Therapieansatz mehr. Ihr Ziel ist es das Gesamt- bzw. progressionsfreie Überleben der Patienten bei größtmöglicher Lebensqualität zu verlängern. Zusätzlich zur medikamentösen Behandlung stellt auch die Strahlentherapie eine weitere etablierte Therapieform dar. Sie ist Teil von adjuvanten und neoadjuvanten Therapieansätzen, beschränkt sich in ihrem Einsatz allerdings im Wesentlichen auf Karzinome mit Lokalisation im Rektum. 1.2 Medikamentöse Therapie des kolorektalen Karzinoms Die systemische medikamentöse Therapie des (fortgeschrittenen) KRK ist ein wesentlicher Bestandteil der Behandlung im Rahmen von adjuvanten, neoadjuvanten und palliativen Therapieansätzen. Zu diesem Zweck stand bis vor etwa 10 Jahren lediglich eine etablierte Substanz zur Verfügung: das 5-Fluorouracil (5-FU). Dieses ist nach wie vor – insbesondere zusammen mit dem synergistisch wirksamen Modulator Folinsäure (FS) – ein entscheidender Bestandteil der zum Einsatz kommenden Therapieregime. Allerdings hat sich darüber hinaus in den letzten Jahren das Therapie-Spektrum durch die Einführung neuer Substanzen ganz entscheidend erweitert. Die Entdeckung und Zulassung neuer Chemotherapeutika und auch sog. zielgerichteter Substanzen führte zu entscheidenden Fortschritten in der Behandlung des KRK. Im Rahmen der zuerst genannten Gruppe sind vor allem zu nennen das Platinderivat Oxaliplatin, der Topoisomerase-I-Inhibitor Irinotecan sowie orale Vorstufen des bereits bekannten und etablierten 5-FU (v.a. Capecitabin). Die Gruppe der neu eingeführten zielgerichteten Substanzen (auch als Biologicals bezeichnet) umfasst im Wesentlichen zwei Antikörper-Gruppen: den Anti-VEGF-Antikörper (vascular endothelial growth factor) Bevacizumab sowie die Anti-EGFR-Antikörper (Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor) Cetuximab und Panitumumab. - 11 - Eine adjuvante Therapie wird durchgeführt mit dem Ziel, das Risiko für Rezidive nach einer chirurgischen R0-Resektion des Primärtumors (bei fehlenden Fernmetastasen) zu verringern. Für Patienten mit einem kurativ resezierten KRK im Stadium I ist eine adjuvante Therapie nicht indiziert (Schmiegel et al., 2008). Die Empfehlungen bezüglich einer adjuvanten Behandlung im Stadium II differieren international erheblich. In Deutschland wird laut aktueller Leitlinie (Schmiegel et al., 2008) derzeit empfohlen, eine adjuvante Therapie unter Absprache mit dem Patienten ggf. in Erwägung zu ziehen. Im Gegensatz dazu stellt die adjuvante Behandlung im Stadium III schon seit vielen Jahren einen gesicherten Standard dar. Alle Patienten im Stadium III sollten heute (bei ausreichend gutem Allgemeinzustand) eine 6-monatige Chemotherapie nach einem FOLFOX-Protokoll (bestehend aus Oxaliplatin und 5-FU/FS) erhalten, da dieses in großen Studien eine signifikante Verbesserung des Überlebens zeigen konnte (Andre et al., 2009). Neben den genannten Chemotherapeutika besitzt auch Capecitabin in bestimmten Situationen einen Stellenwert in adjuvanten Therapieansätzen. Die zielgerichteten Substanzen Bevacizumab, Cetuximab und Panitumumab hingegen spielen ebenso wie Irinotecan in adjuvanten Behandlungskonzepten gegenwärtig keine Rolle. Neben der adjuvanten Therapie konnte auch in der palliativen Situation in den letzten Jahren eine Verbesserung der Therapieerfolge erzielt werden. Hierzu haben neben Oxaliplatin und Capecitabin auch Irinotecan sowie die o.g. Biologicals beigetragen. Standard der palliativen Chemotherapie war in der jüngeren Vergangenheit bislang die alleinige kontinuierliche infusionale Applikation einer 5-FU/FS Monotherapie. Im Vergleich hierzu konnten diverse Studien jedoch zeigen, dass sowohl Oxaliplatin als auch Irinotecan bei Kombination mit dem genannten 5FU/FS Schema die Ansprechraten sowie das PFS (progression free survival, progressionsfreies Überleben) und OS (overall survival, Gesamtüberleben) deutlich steigern können. Diese Oxaliplatin- und Irinotecan-Protokolle sind sowohl für die Erst- als auch für die Zweitlinien-Therapie zugelassen. Außerdem sind beide Therapie-Schemata einander gleichwertig bezüglich der Erfolgsraten, so - 12 - dass die Auswahl der optimalen Erstlinien-Therapie unter Berücksichtigung der individuellen Situation des Patienten erfolgen sollte. Neben Oxaliplatin und Irinotecan besitzt auch Capecitabin in der palliativen Therapie seinen Stellenwert. Es konnte gezeigt werden, dass es nicht nur bei 5FU Monotherapie sondern auch bei einer Kombinationschemotherapie bestehend aus 5-FU und Oxaliplatin dem 5-FU jeweils äquipotent ist. Darüber hinaus besitzt die Substanz Vorteile bezüglich der Patientenfreundlichkeit (orale Darreichungsform) und der Therapiekosten. Bei Kombinationsprotokollen von 5FU und Irinotecan bleibt derzeit noch abzuwarten, ob Capecitabin auch hier dem infusionalen 5-FU gleichwertig ist. In Anbetracht der drei bisher genannten zur Verfügung stehenden Substanzen (Fluoropyrimidine, Oxaliplatin, Irinotecan) stellt sich die Frage, ob bestimmte – und falls ja welche – Präparate dem Patienten einen maximalen Überlebensvorteil bringen. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, dass es nicht auf die Auswahl einer bestimmten Substanz im Rahmen der Erst- oder Zweitlinientherapie ankommt. Prognose-bestimmend ist vielmehr die Anzahl der eingesetzten Substanzen im Verlauf der Therapie, d.h. entscheidend ist, dass der Patient während seines Krankheitsverlaufs Zugang zu allen drei Substanzen erhält (Grothey et al., 2004). Zusätzlich zu den bereits genannten Präparaten sind im Rahmen palliativer Therapieansätze mittlerweile auch die zielgerichteten Substanzen Bevacizumab, Cetuximab und Panitumumab sinnvoll einsetzbar. Der Antikörper Bevacizumab ist gegen das Signalmolekül VEGF gerichtet und wirkt auf diesem Wege v.a. der tumorösen Neoangiogenese entgegen. Bevacizumab ist sowohl für die Erst- als auch für die Zweitlinientherapie zugelassen. Die Wirkung des Anti-EGFR-Antikörpers Cetuximab resultiert im Wesentlichen aus der Inhibition des MAPK-Signalweges (Mitogen-aktivierte Protein-Kinase) und somit aus der Hemmung von Zellproliferation, Metastasierung und Neoangiogenese. Auch Cetuximab ist sowohl für die Erst- als auch für die Zweitlinientherapie zugelassen. Neben Cetuximab ist das Präparat Panitumumab als weiterer Anti-EGFRAntikörper zugelassen. Dieser ist vollhumanen Ursprungs und birgt so geringere Gefahren anaphylaktischer Reaktionen. Für beide Antikörper gilt, dass ihre Wirksamkeit ausschließlich auf Tumoren des k-ras Wildtyps beschränkt ist. Patienten mit metastasiertem KRK müssen somit vor Therapie-Start mit einem - 13 - Anti-EGFR-Antikörper eine k-ras Mutationsanalyse aus Primärtumorgewebe erhalten. Bei Vorliegen einer k-ras Mutation sind diese Antikörper kontraindiziert. Dies stellt die erste Integrierung des Konzeptes einer individualisierten Therapie in den klinischen Alltag beim KRK dar (siehe Kap. 1.3.1). Unter einer neoadjuvanten Therapie im Rahmen kolorektaler Karzinome wird im Allgemeinen die lokale strahlentherapeutische Behandlung des Rektumkarzinoms im Stadium II und III verstanden. Darüber hinaus kommt ein neoadjuvanter Therapieansatz auch für Patienten in Frage, bei denen bereits eine z.B. hepatische Fernmetastasierung vorliegt (siehe Kap. 1.1). In diesem Rahmen wird eine medikamentös-systemische Behandlung mit dem Ziel eingesetzt, eine Verkleinerung primär nicht-resektabler Metastasen zu induzieren, um so schließlich eine sekundäre Operabilität zu erreichen. Im Rahmen einer solchen Behandlung kommen im Wesentlichen die Chemotherapeutika 5-FU, Oxaliplatin und Irinotecan sowie der Antikörper Cetuximab zum Einsatz. 1.3 Molekulare Prognose- und Prädiktionsfaktoren beim kolorektalen Karzinom In Anbetracht der im vorangegangenen Kapitel dargestellten Therapieoptionen und Behandlungsschemata wird deutlich, dass die Zahl der zur Verfügung stehenden wirksamen Medikamente in den letzten 10-15 Jahren deutlich gewachsen ist. Dies bedeutet zwar Fortschritt und Verbesserung der Therapieergebnisse auf der einen Seite, jedoch auch eine zunehmende Differenzierung der Behandlung auf der anderen. Insbesondere wird es zunehmend schwieriger, das für die individuelle Situation des jeweiligen Patienten optimale therapeutische Vorgehen herauszuarbeiten. Bei der Auswahl einer solchen individuell optimalen Therapie ist es erforderlich, einen Kompromiss zwischen verschiedenen Anforderungen an das therapeutische Vorgehen zu finden. Das primäre Ziel besteht dabei darin, das für den Patienten bestmögliche Therapieresultat durch maximalen Therapieeinsatz zu erreichen. Gleichzeitig ist aber eine Übertherapie des Patienten zu vermeiden, da gerade Chemotherapeutika bekanntermaßen erhebliche Nebenwirkungen haben. Desweiteren ist zu beachten, dass moderne Chemotherapeutika, wie z.B. die o.g. Biologicals, sehr kostenintensiv sein können. In der Konsequenz sollten also diese - 14 - Substanzen möglichst selektiv nur bei jenen Patienten eingesetzt werden, bei denen mit einer entsprechend hohen Wahrscheinlichkeit ein Benefit zu erwarten ist. Diese Umstände begründen also schon für sich allein genommen die dringliche Forderung nach einer Identifizierung von molekularen Markern, welche eine Aussage darüber erlauben, ob und wenn ja für welche Therapie ein Patient am ehesten qualifiziert. Darüber hinaus gibt es aber noch weitere Faktoren, die die Identifizierung dieser Marker notwendig erscheinen lassen. Zu nennen ist hier insbesondere die Tatsache, dass KRK in ihrer Gesamtheit ein sehr heterogenes Tumorkollektiv bilden. Aufgrund der verschiedenen Phänotypen der Karzinomentstehung handelt es sich (trotz einem möglicherweise ähnlichen (histo-) morphologischen Erscheinungsbild) nicht um molekularbiologisch identische Entitäten (siehe Kap. 1.1), sondern es bestehen z.T. erhebliche interindividuelle Unterschiede im jeweiligen genetischen Makeup sowie bezüglich Prognose und Therapieansprechen (Zlobec and Lugli, 2008). Beschäftigt man sich nun mit der Untersuchung von solcherlei molekularen Markern, so ist definitionsgemäß zwischen prognostischen und prädiktiven Markern zu unterscheiden (Zlobec and Lugli, 2008). In Abbildung 2 sind die Unterschiede zwischen diesen Markern schematisch dargestellt: Abbildung 2: Unterschiede zwischen prognostischen und prädiktiven Markern (modifiziert nach (Barratt et al., 2002), Erläuterungen im Text). - 15 - Ein prognostischer Marker wird definiert als ein Kriterium zur Vorhersage des individuellen Risikos für ein bestimmtes Outcome. Dies bedeutet, dass rein prognostische Marker (links in Abbildung 2) eine Aussage über die Wahrscheinlichkeit erlauben, mit der bei einem Patienten ein bestimmtes Ereignis eintritt, wie z.B. eine Tumorprogression oder der Tod. Rein prognostische Marker sind allerdings nicht dazu bestimmt, eine spezifische Therapieauswahl zu begründen. Prädiktive Marker hingegen sind dazu da, die Effektivität oder den Benefit einer spezifischen Behandlung bei einem bestimmten Patienten aufgrund des Markerstatus vorherzusagen. Rein prädiktive Faktoren (rechts in Abbildung 2) zeigen also unabhängig vom Ausgangsrisiko an, welcher Benefit von der Durchführung einer spezifischen Therapie zu erwarten ist. Folglich sind sie als Hilfsmittel bei der Therapieauswahl durchaus geeignet. Zu den potentiellen, für diesen Zweck geeigneten molekularen Markern zählen nun vor allem jene Gene bzw. Genprodukte, die im Rahmen der oben beschriebenen Karzinogenese (siehe Kap. 1.1) von Alterationen betroffen sind. Da diese Strukturen (mit-) verantwortlich sind für die Tumorentstehung und -progression, stellen sie mögliche Zielstrukturen für eine Therapie dar. Darüber hinaus können sie unter Umständen auch Ursache einer Therapieresistenz gegenüber bestimmten Behandlungsansätzen sein (z.B. Mikrosatelliteninstabilität, siehe Kap. 1.3.2). Aufgrund dieser Tatsachen erscheinen die entsprechenden Strukturen also als potentiell geeignet eine prädiktive Aussage im oben beschriebenen Sinne zu ermöglichen. Gleichzeitig beeinflussen diese Gene bzw. Genprodukte jedoch auch die Prognose, da sie die Tumorprogression, -metastasierung und -invasion beschleunigen (können). Somit können sie also auch als prognostische Marker von Relevanz sein. Gleichwohl gibt es bisher, mit Ausnahme des k-ras (siehe Kap. 1.3.1), jedoch noch keine klinisch sicher etablierten molekularen Marker zur Prognosevorhersage oder Therapieprädiktion. Ziel soll es also nach Möglichkeit sein, Biomarker zu finden, die eine verlässliche Vorhersage über (beispielsweise) die zu erwartende Entwicklung von klinischem Verlauf, Therapieansprechen und Toxizität der jeweiligen Therapie erlauben. So können im optimalen Fall Therapieerfolge maximiert und gleichzeitig Nebenwirkungen sowie Kosten minimiert werden. - 16 - Um solche Vorhersagen treffen zu können, muss ein optimaler Biomarker jedoch gewisse Voraussetzungen erfüllen. Zunächst einmal muss er im Patientenmaterial (z.B. Blut oder Gewebe) stabil, reproduzierbar und einfach bestimmbar sein. Es sollte ein ausreichend großes Patientenkollektiv im Rahmen einer randomisierten Therapiestudie untersucht werden, um den Effekt eines solchen optimalen Markers zu belegen. Dieser dabei festgestellte Effekt muss weiterhin ausreichend groß sein, um eine entsprechende klinische Relevanz zu haben. Schließlich muss auch eine Validierung stattfinden, welche nach Möglichkeit unter prospektiven Bedingungen durchgeführt werden sollte (Sargent et al., 2005). Unter diesen Voraussetzungen sollen nun im Folgenden drei Marker näher beschrieben werden, welche in Bezug auf das KRK von besonderer Bedeutung sind. 1.3.1 k-ras Das Onkogen k-ras kodiert für ein in die Signalkaskade des EGF-Rezeptors integriertes Protein, welches in etwa 35% aller kolorektalen Karzinome mutiert ist (Bamford et al., 2004). Seine Wertigkeit als prognostischer Marker ist in der Vergangenheit umfassend untersucht worden. Jedoch sind die Aussagen diesbezüglich noch immer widersprüchlich, da einige Studien eine prognostische Relevanz nachweisen konnten (Andreyev et al., 2001; Bazan et al., 2002), wohingegen andere Untersuchungen keine Assoziation zwischen dem k-ras Mutationsstatus und klinischem Outcome finden konnten (Bleeker et al., 2001; Westra et al., 2005). Demgegenüber konnte dem k-ras Mutationsstatus kürzlich jedoch eine zuverlässige Aussage als prädiktiver Marker zugeschrieben werden. Es wurde gezeigt, dass nur Patienten mit einem k-ras Wildtyp von einer Behandlung mit einem Anti-EGFR-Antikörper profitieren – im Gegensatz zu Patienten, deren k-ras Gen mutiert ist (Amado et al., 2008). Damit ist k-ras der bislang einzige prädiktive Biomarker, der beim KRK klinisch etabliert und in Kombination mit einer AntiEGFR-Therapie zugelassen ist (siehe Kap. 1.2). - 17 - 1.3.2 Mikrosatelliteninstabilität Die Mikrosatelliteninstabilität (MSI) tritt bei KRK auf, bei denen es zu einer Schädigung des zellulären DNA-Mismatch-Reparatur-Systems gekommen ist. Dies ist bei etwa 8-18% aller KRK der Fall. Dabei handelt es sich sowohl um hereditäre KRK im Rahmen eines HNPCC als auch in ca. 15% der Fälle um sporadische KRK (Locker et al., 2006). Eine prognostische Relevanz des Mikrosatelliten-Status konnte bereits in verschiedenen Studien demonstriert werden. Demnach ergibt sich für Patienten mit mikrosatelliteninstabilen KRK eine bessere Prognose als für Patienten mit mikrosatellitenstabilen Tumoren (Popat et al., 2005). Dennoch wird die routinemäßige Analyse dieses Markers zwecks einer prognostischen Aussage bislang noch nicht empfohlen. Im Gegensatz zur prognostischen Aussagekraft ist die prädiktive Relevanz des Mikrosatelliten-Status bislang weitestgehend unklar. Verschiedene Studien zeigten ein vermindertes Ansprechen von MSI-KRK auf eine Chemotherapie mit 5-FU. Als Ursache vermutet man aufgrund von in-vitro Untersuchungen eine gewisse Resistenz von MSI-Zellen gegenüber diesem Chemotherapeutikum (Carethers, 2008). Die genaue klinische Relevanz diesbezüglich bleibt derzeit jedoch noch unklar. 1.3.3 SMAD4 Wie bereits zuvor beschrieben (siehe Kap. 1.1), handelt es sich bei SMAD4 um ein wichtiges Tumorsuppressorgen, dessen Genlocus auf dem Chromosom 18 an der Stelle 18q21.1 zu finden ist. Entdeckt wurde die Lokalisation dieses Gens bzw. seine Bedeutung als möglicher Tumorsuppressor Mitte der 90er-Jahre zunächst im Rahmen der Analyse von Pankreas-Karzinomen (Hahn et al., 1996). In den folgenden Jahren zeigte sich, dass dieser Genlocus auch in der Karzinogenese von Malignomen anderer Organe eine wichtige Rolle spielt – zu nennen ist hier vor allen anderen das KRK (Miyaki et al., 1999; Maitra et al., 2000). Die Bedeutung des Tumorsuppressorgens SMAD4 bei der Karzinogenese erschließt sich aus der Betrachtung seiner physiologischen zellulären Funktion (Leivonen and Kahari, 2007; Xu and Pasche, 2007). In Säugern sind insgesamt acht SMAD-Gene bekannt, deren Genprodukte allesamt an der intrazellulären Signaltransduktion der TGF-β-Zytokin-Superfamilie (transforming growth factor - 18 - beta) beteiligt sind. Diese acht SMAD-Gene wirken in komplexer Art und Weise zusammen, wobei SMAD4 die Rolle des zentralen Mediators übernimmt. Darüber hinaus interagiert SMAD4 auch mit anderen Signalkaskaden (z.B. dem MAPKSignalweg). Nach Translokation in den Zellkern im Rahmen der Signaltransduktion beeinflussen SMAD4 bzw. seine Komplexe dann die entsprechenden Zielgene. Die auf diese Weise beeinflussten Zielgene sind an der Regulation vielseitiger Prozesse beteiligt – dazu zählen unter anderem: Zell-Differenzierung, -Proliferation und -Migration, Zellzyklus-Kontrolle, Apoptose, Angiogenese und Immunmodulation. Weiterhin beeinflusst werden auch Eigenschaften wie die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und die Zell-Zell-Adhäsion. SMAD4 ist somit also an der Steuerung von genau jenen elementaren Zellfunktionen beteiligt, deren Regulation bei neoplastischen Läsionen typischerweise pathologisch verändert ist (Schwarte-Waldhoff, 2003; Reinacher-Schick et al., 2004). Die Bedeutung von SMAD4 bei der kolorektalen Karzinogenese liegt nun darin, dass es seine Funktion als Tumorsuppressor durch Inaktivierung im Verlauf des Adenom-Karzinom-Progressionsmodells verliert. Dies ist meist bedingt durch einen Verlust genetischen Materials, kann aber auch durch eine Mutation innerhalb des Genlocus verursacht sein. Der beschriebene Verlust genetischen Materials betrifft den das SMAD4-Gen tragenden langen Arm des Chromosoms 18 (siehe Kap. 1.1). In den meisten Fällen kommt es zunächst nur zur Deletion eines der beiden Allele, während das andere intakt bleibt. Man bezeichnet dies als sog. loss of heterozygosity (LOH). Es konnte gezeigt werden, dass eine Deletion der chromosomalen Region 18q in etwa 70% der KRK nachweisbar ist und es sich hierbei um die am häufigsten nachweisbare Deletion überhaupt handelt (Vogelstein et al., 1988). Desweiteren zeigte sich, dass ein 18q LOH im Rahmen des zeitlichen Ablaufs der AdenomKarzinom-Sequenz ein spät auftretendes Ereignis ist. Die besondere Bedeutung des 18q LOH bzw. der SMAD4-Inaktivierung liegt dabei vor allem am (klinisch bedeutsamen) Übergang zu invasiven und metastasierenden Stadien des KRK. So konnten z.B. Tanaka et al. zeigen, dass metastasierte KRK signifikant häufiger einen 18q LOH und eine SMAD4-Inaktivierung aufweisen als frühe KarzinomStadien (Tanaka et al., 2006; Tanaka et al., 2008). Neben einem 18q LOH können auch Mutationen die Funktion des SMAD4-Gens verändern bzw. beeinträchtigen. Insgesamt sind diese jedoch deutlich seltener zu - 19 - beobachten als der beschriebene LOH. Ihre Bedeutung liegt v.a. in der Pathogenese der angeborenen juvenilen Polyposis coli, weniger in der Karzinogenese der sporadischen KRK. Allerdings sind Mutationen des SMAD4Gens auch beim Übergang in invasive und metastasierende KRK-Stadien von Bedeutung. So konnten Miyaki et al. zeigen, dass metastasierte KRK signifikant häufiger eine inaktivierende SMAD4-Mutation aufweisen als frühe KRK-Stadien mit noch nicht eingetretener Metastasierung (Miyaki et al., 1999). Die prognostische und prädiktive Aussagekraft einer SMAD4-Inaktivierung bzw. eines 18q LOH wurde in der Vergangenheit bereits in verschiedenen Studien untersucht (siehe Kap. 5.2). In diesen Untersuchungen sind im Wesentlichen KRK in den UICC-Stadien II und III berücksichtigt worden. So konnte für Patienten im Stadium II (Font et al., 2001; Diep et al., 2003) wie auch im Stadium III (Watanabe et al., 2001) gezeigt werden, dass ein 18q LOH eine negative prognostische Bedeutung besitzt bzw. mit einem schlechteren Gesamtüberleben assoziiert ist. Ebenso konnte für Patienten im Stadium III in zwei Studien demonstriert werden, dass eine reduzierte SMAD4-Expression mit einem signifikant schlechteren Gesamt- und progressionsfreien Überleben einhergeht (Alazzouzi et al., 2005; Alhopuro et al., 2005). Studien zur Analyse der prädiktiven Relevanz ergaben für KRK im Stadium II wie auch im Stadium III Hinweise, dass Patienten mit intakten 18q Loci bzw. mit normalem diploiden SMAD4-Status einen größeren Benefit aus einer adjuvanten 5-FU-basierten Chemotherapie ziehen können als Patienten mit einem 18q LOH bzw. einer SMAD4-Inaktivierung (Barratt et al., 2002; Boulay et al., 2002). Vergleichbare Daten für KRK des UICC-Stadiums IV sind bisher jedoch nur unzureichend verfügbar. Insbesondere ist bislang noch keine diesbezügliche Evaluation unter Applikation eines aktuellen Chemotherapie-Protokolls mit Einbeziehung von Oxaliplatin erfolgt. Aufgrund der Assoziation einer SMAD4-Inaktivierung mit dem Übergang zu invasivem und metastasierendem Wachstum kolorektaler Karzinome im Verlauf der mehrstufigen Karzinogenese und die dadurch erfassbare Markierung einer klinisch relevanten Stufe, erscheint das Potenzial dieses Markers bezüglich einer prognostischen Relevanz bei Patienten im Stadium IV als hoch. Die Frage nach einer etwaigen prädiktiven Relevanz des Markers SMAD4 innerhalb dieses Kontexts kann im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf der Basis der zugrunde liegenden Daten jedoch nicht beantwortet werden. - 20 - 2 Fragestellung und Ziel Die zuvor dargestellten Sachverhalte lassen eine Reduktion der SMAD4Expression als einen potentiell geeigneten prognostischen Marker für Patienten mit kolorektalen Karzinomen erscheinen. Diesbezügliche Daten bei metastasierten KRK im Stadium IV liegen bislang nicht vor. Um Hinweise auf eine prognostische Relevanz des SMAD4-Expressionsstatus zu finden, sollen in dieser Arbeit Gewebeproben von Patienten mit metastasierten KRK analysiert werden. Ziel der Auswertung soll es sein, eine mögliche Assoziation zwischen dem SMAD4Expressionsstatus und dem Gesamt- bzw. progressionsfreien Überleben der Patienten nachzuweisen. Um diese Ziele zu erreichen, wurden Gewebeproben von Patienten untersucht, die mit einem aktuellen Chemotherapie-Protokoll unter Verwendung einer Kombination von Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin therapiert wurden. Die Evaluation des SMAD4-Expressionsstatus erfolgte durch lichtmikroskopische Analyse nach immunhistochemischer Färbung, einem etablierten und zuverlässigen Verfahren. Abschließend wurde unter Verwendung statistischer Tests eine Korrelationsanalyse bezüglich des PFS und OS durchgeführt. Die vorliegende Arbeit soll also folglich einen Beitrag zu folgender Fragestellung liefern: Welche Wertigkeit besitzt eine Expressionsreduktion des Proteins SMAD4 als prognostischer Marker bei einer Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen? - 21 - 3 Material und Methoden 3.1 Material Bei den für diese Arbeit untersuchten 121 Tumor-Gewebeproben handelt es sich um ein Teilkollektiv Arbeitsgemeinschaft einer großen Internistische klinischen Onkologie Phase (AIO), III welche Studie aus der einem Gesamtkollektiv von 470 Patienten bestand (intention-to-treat-Population). In dieser bereits abgeschlossenen und publizierten Studie (Porschen et al., 2007) wurde der Einsatz des oralen Fluoropyrimidins Capecitabin mit einer infusionalen Applikation von 5-FU/FS (jeweils in Kombination mit Oxaliplatin) im Rahmen der Erstlinien-Chemotherapie von Patienten mit metastasiertem KRK verglichen. Die 121 in dieser Arbeit analysierten Gewebeproben sind auch Teil einer im Anschluss von uns durchgeführten weitergehenden Untersuchung, in der dieses Kollektiv auf 230 Patienten erweitert wurde (Baraniskin et al., 2011). 3.1.1 Studiendesign Das von der AIO geplante Studiendesign (Porschen et al., 2007) sah eine multizentrisch und prospektiv-randomisiert durchzuführende Studie vor. Alle in die Studie aufgenommenen Patienten wurden einem der zwei im Studienprotokoll definierten Therapiearme zugeordnet und entsprechend dem jeweiligen TherapieProtokoll behandelt. Patienten des Therapiearms A erhielten eine Kombination bestehend aus den Chemotherapeutika 5-FU/FS und Oxaliplatin (sog. FUFOXSchema) während die Behandlung im Therapiearm B aus den zwei Präparaten Capecitabin und Oxaliplatin (sog. CAPOX-Schema) bestand. Die Studie wurde als sog. „non-inferiority clinical trial“ konzipiert. Das Ziel der Untersuchung war somit der Nachweis, dass das definierte CAPOX-Protokoll dem entsprechenden FUFOX-Regime bezüglich der Behandlungs-Effektivität mindestens gleichwertig ist. Die Zielkriterien der Studie waren das progressionsfreie Überleben als primärer Endpunkt sowie das Gesamtüberleben und die Gesamtansprechraten auf die Therapie (ORR, overall response rate). Um die Gesamtansprechraten beurteilen zu können, wurde das Remissionsverhalten der Patienten gemäß den RECIST- - 22 - Kriterien (response evaluation criteria in solid tumors) (Therasse et al., 2000) in die üblichen Kategorien eingeteilt (siehe Tabelle 2): Tabelle 2: Definition des Remissionsverhaltens gemäß der RECIST-Kriterien (Therasse et al., 2000). Kategorie Definition complete response (CR) vollständiges Verschwinden aller Läsionen partial response (PR) Verkleinerung der Läsionen um min. 30% progressive disease (PD) Vergrößerung der Läsionen um min. 20% stable disease (SD) Einordnung weder unter PR noch PD möglich Der Parameter der Gesamtansprechraten auf die Therapie (ORR) ist schließlich definiert durch die zusammenfassende Betrachtung der Kategorien CR und PR. 3.1.2 Materialien und Geräte Im Folgenden sind sämtliche Materialien und Geräte aufgelistet, die für die Aufbereitung und Auswertung der in dieser Arbeit untersuchten Gewebeproben verwendet wurden (siehe Tabellen 3 und 4): - 23 - Tabelle 3: Geräte und Computerprogramme. Artikel Kühlplatte CP 60 Hersteller Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland Schlittenmikrotom HM 400 Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland Mikrotom-Klingen R35 pfm AG, Köln, Deutschland Paraffin-Streckbad HIR-3 Kunz Instruments AB, Nynäshamn, Schweden Objektträger M7620, 76x26 mm Süsse GmbH Labortechnik, Gudensberg, mit Mattrand 20 mm Deutschland Adhäsions-Objektträger Fa. Menzel, Braunschweig, Deutschland ® SuperFrost Plus, 75x25 mm Wasserbad 1002 GFL Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Deutschland Immunfärbeautomat Dako Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Autostainer plus S3800 Deutschland Deckgläser, 24x50 mm Diagonal GmbH & Co KG, Münster, Deutschland Eindeckgerät CTM6 Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland Mikroskop Carl Zeiss Axioplan Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Deutschland Statistikprogramm SPSS 16.0 SPSS GmbH Software, München Textverarbeitungsprogramm Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, ® Microsoft Word 2007 Deutschland Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Microsoft® Excel 2007 Deutschland - 24 - Tabelle 4: Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Artikel Xylol Hersteller Quadflieg GmbH, Gelsenkirchen, Deutschland Alkohol 70%, 96%, 100% Quadflieg GmbH, Gelsenkirchen, Deutschland Aqua destillata aus eigener Destillationsanlage Tris-/EDTA-Pufferlösung Dako Target Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Retrieval Solution pH 9 Deutschland Färbekit Dako REAL™ Detection System Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Kit Deutschland Inhalt: - Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) - Streptavidin Peroxidase (HRP) - DAB+ Chromogen - HRP Substrate Buffer Primär-Antikörper SMAD4, Typ B-8, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, monoklonal, Maus IgG1 USA Antikörper-Verdünnungsmedium Dako Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Antibody Diluent Deutschland Waschpuffer für Dako Autostainer Plus Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland Mayers Hämalaun Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Eindeckmedium CytosealTM XYL Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland Eosin Y, wässrig 2% Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland - 25 - 3.2 Methoden 3.2.1 Ethikvotum Mit Datum vom 8. Juli 2002 wurde bei der Ethik-Kommission der Ruhr-Universität Bochum der entsprechende Antrag mit dem Thema „5-Fluorouracil/Folinsäure plus Oxaliplatin (FUFOX) versus Oxaliplatin/Capecitabin (CAPOX) beim fortgeschrittenen kolorektalen Karzinom“ eingereicht. Diesem Antrag wurde per 12. Juli 2002 unter der Registrier-Nr. 1923 durch ein positives Votum der EthikKommission stattgegeben. Es bestanden keine Bedenken hinsichtlich des beantragten Untersuchungsvorhabens. Das translationale Begleitforschungsprogramm (u.a. die Analyse von SMAD4 in diesem Kollektiv) wurde sowohl im Studienprotokoll beschrieben als auch in der Patientenaufklärung genannt. Die Teilnahme am translationalen Forschungsprogamm der Studie war freiwillig. Die in dieser Arbeit analysierten Gewebeproben stammen sämtlich von Patienten, die für diesen Studienteil ihre Einwilligung erteilt haben. 3.2.2 Herkunft des Studienmaterials Die für diese Arbeit untersuchten 121 Tumor-Gewebeproben wurden von den jeweiligen primären Pathologien zur Verfügung gestellt. Das Patientenmaterial lag Formalin-fixiert und in Paraffin eingebettet vor. Die Gewebeproben wurden von der Studienzentrale pseudo-anonymisiert und dann an das Institut für Pathologie am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil Bochum weitergeleitet. Dort fand die weitere Prozessierung statt, im Rahmen derer von jedem Tumorpräparat ein konventionell-histologisch sowie ein immunhistochemisch gefärbter Schnitt erstellt wurde. 3.2.3 Aufbereitung der Gewebeproben Nach Kühlung auf der Kühlplatte wurden von den zur Verfügung gestellten Paraffinblöcken mittels des Schlittenmikrotoms jeweils zwei konsekutive, je 2-µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden aus dem Paraffin-Streckbad auf die entsprechenden Objektträger aufgezogen. Für die alleinige Hämatoxylin-Eosin- - 26 - Färbung (HE-Färbung) wurden die Objektträger M7620 (Süsse GmbH Labortechnik, Gudensberg, Deutschland) verwendet, für die immunhistochemisch zu färbenden Schnitte die Adhäsions-Objektträger SuperFrost® Plus (Fa. Menzel, Braunschweig, Deutschland). Diese sind mit einer permanenten positiven Ladung versehen, wodurch eine elektrostatische Anziehung zwischen negativen Gewebeladungen und der positiv geladenen Beschichtung auf der Glasoberfläche erzeugt wird. Auf diese Weise wird die Widerstandsfähigkeit des Präparates erhöht, so dass die recht raue Behandlung der Präparate vor allem im Rahmen der Antigendemaskierung erst ermöglicht wird. Nach Trocknung bei 37°C über Nacht wurden alle Schnitte mittels Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Dazu wurde folgendes Schema angewandt: Entparaffinierung und Rehydrierung 1. Xylol 3x 5 min. 2. Alkohol 100% 2-3 min. 3. Alkohol 100% 2-3 min. 4. Alkohol 96% 2-3 min. 5. Alkohol 70% 2-3 min. 6. Aqua destillata 2-3 min. Die so vorbereiteten Schnitte wurden dann direkt der konventionell-histologischen Färbung (als HE-Färbung) zugeführt (siehe Kap. 3.2.5) bzw. für die immunhistochemische Färbung zunächst weiter prozessiert. 3.2.4 Immunhistochemie 3.2.4.1 Allgemeines Prinzip der Immunhistochemie Die Immunhistochemie ist eine spezifische Färbemethode, bei der sich selektiv bestimmte Gewebebestandteile eines histologischen Schnittes anfärben lassen. Das zugrundeliegende Prinzip ist eine spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion. Die zu detektierende antigene Determinante muss dabei eine für das zu untersuchende Merkmal typische Gewebeeigenschaft sein. Ein solches Epitop kann beispielsweise eine Aminosäuresequenz oder eine Oligosaccharidkette sein. Um das darzustellende Epitop für die entsprechenden Reaktionspartner - 27 - zugänglich zu machen, muss dieses zunächst demaskiert werden. Dazu wurde in dieser Arbeit die sog. HIER-Methode (heat induced epitop retrieval) angewandt. Dabei wird durch das Einwirken von feuchter Hitze die Permeabilität des fixierten Gewebes erhöht. Die Sichtbarmachung des Epitops kann dann unter Anwendung verschiedener Methoden erfolgen. In dieser Arbeit wurde die derzeit am meisten verbreitete Methode, die sog. Labelled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSABMethode) angewandt. Dabei wird zunächst ein Primär-Antikörper verwendet, welcher mit seinem variablen Fab-Anteil spezifisch gegen das zu detektierende Epitop gerichtet ist (sog. Schlüssel-Schloss-Prinzip). Durch diese Spezifität besteht im optimalen Fall eine besonders hohe Affinität zwischen Antigen und Antikörper, so dass es zu einer starken Bindung kommt. In einem zweiten Schritt wird ein Sekundär- oder auch Brücken-Antikörper hinzugegeben. Dieser stellt das Bindeglied zwischen dem Primär-Antikörper und dem eigentlichen Detektionssystem dar. Der Sekundär-Antikörper erkennt seinerseits spezifisch das Fc-Fragment des Primär-Antikörpers und ist gleichzeitig mehrfach mit dem Vitamin Biotin konjugiert. Im letzten Schritt wird Streptavidin hinzugegeben, welches mit hoher Affinität an den biotinylierten Sekundär-Antikörper bindet. Gleichzeitig ist es mit dem Enzym Meerrettichperoxidase konjugiert, welches für die eigentliche Umsetzung des Chromogens verantwortlich ist. Als Substratchromogen wird Diaminobenzidin verwendet, welches von der Peroxidase in ein stabiles, sichtbares, braunes Farbprodukt umgewandelt wird. Auf diese Weise wird eine eindeutige Identifizierung der gesuchten Gewebeeigenschaft durch indirekte färberische Markierung erreicht. Gleichzeitig wird eine Signalamplifikation dadurch erreicht, dass jedes Biotin-Molekül der mehrfach biotinylierten SekundärAntikörper als Bindungspartner für das Enzym-konjugierte Streptavidin zur Verfügung steht. Das Prinzip ist noch einmal in Abbildung 3 verdeutlicht: - 28 - Abbildung 3: Prinzip der LSAB-Methode bei der immunhistochemischen Färbung. Abschließend wird eine Gegenfärbung mit Hämalaun durchgeführt, um eine bessere Kontrastierung der Zellkerne und somit eine bessere Beurteilbarkeit des Schnittes zu erreichen (Lang, 2006). 3.2.4.2 Die Immunhistochemische Färbung zuvor vorbereiteten Gewebeproben (siehe Kap. 3.2.3) wurden zur Antigendemaskierung nach folgendem Schema prozessiert: Antigendemaskierung (HIER-Methode) 1. Inkubation in Tris-/EDTA-Pufferlösung im Wasserbad für 10 min. bei 98,8°C 2. Abkühlung in Tris-/EDTA-Pufferlösung für 20 min. bei Raumtemperatur 3. Spülung mit Tris-/EDTA-Pufferlösung 4. Spülung mit Aqua destillata Danach erfolgte die immunhistochemische Färbung im Immunfärbeautomat unter Verwendung des Färbekits und des monoklonalen SMAD4 Primär-Antikörpers, welcher die gesamte Länge des humanen SMAD4-Proteins (Aminosäuren 1-552) - 29 - detektiert. Der Primär-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 (hergestellt mittels Verdünnungsmedium) verwendet. Die Färbung erfolgte nach folgendem Protokoll: Färbung im Immunfärbeautomat 1. Primär-Antikörper SMAD4 30 min. 2. Waschpuffer 5 min. 3. Biotinylierter Sekundär-Antikörper 4. Waschpuffer 15 min. 5 min. 5. Peroxidase-konjugiertes Streptavidin 6. Waschpuffer 15 min. 5 min. 7. Diaminobenzidin-Chromogen 8. Waschpuffer 10 min. 5 min. Die Gegenfärbung zur besseren Kontrastierung der Präparate erfolgte nach folgendem Schema: Gegenfärbung 1. Mayers Hämalaun 2 min. 2. Aqua destillata 2-3 min. 3. Alkohol 70% 2-3 min. 4. Alkohol 96% 2-3 min. 5. Alkohol 100% 2-3 min. 6. Alkohol 100% 2-3 min. 7. Xylol 2-3 min. Die so gefärbten Präparate wurden dann unter Verwendung der entsprechenden Materialien (Eindeckmittel, Deckgläser, Eindeckgerät) eingedeckt. 3.2.5 Konventionell-histologische Färbung Neben den immunhistochemisch gefärbten Präparaten wurde zusätzlich von jeder Gewebeprobe ein konventionell-histologisch gefärbter Schnitt angefertigt. Dazu wurde eine HE-Färbung der zuvor vorbereiteten Gewebeschnitte (siehe Kap. 3.2.3) nach folgendem Schema durchgeführt: - 30 - HE-Färbung 1. Mayers Hämalaun (Kernfärbung) 12 min. 2. Spülung mit Leitungswasser 3. Bläuen in lauwarmem Leitungswasser 3 min. 4. Eosin Y, wässrig 2% (Zytoplasmafärbung) 2 min. 5. Spülung mit Leitungswasser 6. Alkohol 70% 2-3 min. 7. Alkohol 96% 2-3 min. 8. Alkohol 100% 2-3 min. 9. Alkohol 100% 2-3 min. 10. Xylol 2-3 min. Anschließend wurden auch diese Schnitte unter Verwendung der entsprechenden Materialien (Eindeckmittel, Deckgläser, Eindeckgerät) eingedeckt. 3.2.6 Kontrollen Um die Aussagekraft der Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung zu bestätigen, wurden bei jeder Färbung sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen mitgeführt. Als Positivkontrolle wurde das Gewebe eines Kolonkarzinoms verwendet, welches das SMAD4-Antigen exprimiert und somit eine positive Reaktion sicher erwartet werden kann. Das Kontrollgewebe wurde der gleichen Behandlung wie die Patientenproben unterzogen. Wäre bei diesem Gewebe nun eine Anfärbung ausgeblieben, so hätten die Patientenproben nicht beurteilt werden können. Als Negativkontrolle Positivkontrolle wurde eingesetzt, das gleiche jedoch Karzinomgewebe wurde der wie bei der Primär-Antikörper im entsprechenden Schritt des Färbeprotokolls durch Waschpuffer ersetzt. Davon abgesehen wurden auch die Negativkontrollen auf identische Weise wie die Patientenproben behandelt. Die Aussagekraft der Negativkontrolle liegt in der Aufdeckung von unspezifischen Färbereaktionen bei fehlendem Primär-Antikörper in Abgrenzung zu einer echten positiven Reaktion. - 31 - 3.2.7 Auswertung der gefärbten Gewebeproben Die Auswertung der gefärbten Gewebeproben erfolgte am o.g. Mikroskop. Dazu wurden die Gewebeschnitte von drei Untersuchern (AB, ARS und DM) unabhängig voneinander ausgewertet. Bei fehlender Übereinstimmung wurde ein weiterer Untersucher (JM) Berufsgenossenschaftlichen aus dem Institut Universitätsklinikum für Pathologie Bergmannsheil am Bochum hinzugezogen, dessen Meinung dann ausschlaggebend für die endgültige Beurteilung war. Die HE-Schnitte dienten als Referenz-Medium des jeweils korrespondierenden kontrollierende Zellverbände immunhistochemischen Beurteilung zu von ermöglichen. Schnittes, Zellmorphologie Die um und mikroskopische so Dignität ggf. eine einzelner Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Schnitte erfolgte in einem semiquantitativen Verfahren, bei dem die Intensität sowie die intrazelluläre Lokalisation der Anfärbung beurteilt wurden. Bezüglich der Lokalisation wurde unterschieden zwischen Anfärbung im Zytoplasma und/oder im Nukleus. Die Intensität der Färbung der Karzinomzellen wurde im Vergleich zu daran angrenzender normaler Mukosa (sofern vorhanden) sowie zum umgebenden Stroma beurteilt, wodurch eine zusätzliche interne Positivkontrolle bezüglich der Färbung möglich war. Bei dieser Beurteilung erfolgte die Zuordnung von Tumoranteilen zu insgesamt drei Gruppen: Zellen, deren Färbeintensität dem Normalgewebe entsprach, Zellen, die schwächer als das Normalgewebe gefärbt waren sowie Zellen, die einen vollständigen Verlust der Anfärbung zeigten. Eine solche Einteilung in drei Gruppen ist auch in vorangegangenen Arbeiten bereits verwendet worden (Wilentz, Iacobuzio-Donahue et al., 2000; Wilentz, Su et al., 2000; ReinacherSchick et al., 2004). Der Anteil der entsprechenden Gruppen am jeweiligen Tumor wurde dann prozentual abgeschätzt. Für die statistische Auswertung wurde definiert, dass Tumoren, die einen vollständigen Verlust der Anfärbung in einem Anteil von ≥30% zeigten, der Kategorie „reduzierte SMAD4-Expression“ („SMAD4negativ“) zugeordnet werden sollten. Der Verlust der Anfärbung konnte dabei im Zytoplasma und/oder im Kern lokalisiert sein. Demgegenüber wurden alle anderen Tumoren der Gruppe „erhaltene SMAD4-Expression“ („SMAD4-positiv“) zugeordnet. Dieser Cut-Off wurde in Anlehnung an eine große translationale Studie von Bosman et al. (Bosman et al., 2009) mit mehr als 1500 Patienten definiert (siehe Kap. 5.2). - 32 - 3.2.8 Statistische Auswertung Die für diese Arbeit notwendigen statistischen Analysen wurden unter Einsatz des Statistikprogramms SPSS 16.0 (SPSS GmbH Software, München) gemacht. Die Korrelationsanalysen der zu vergleichenden Gruppen bzw. Kollektive wurden unter Verwendung des t-Tests durchgeführt. Die multivariate Auswertung erfolgte mittels der Cox-Regressions-Analyse. Für die Überprüfung des Gesamt- und progressionsfreien Überlebens auf Signifikanz wurde der log-rank-Test verwendet. Die grafische Darstellung erfolgte mittels Kaplan-Meier-Plots. Als Signifikanzniveau wurde durchgehend p = 0.05 definiert. - 33 - 4 Ergebnisse 4.1 Basis-Charakteristika des untersuchten Teilkollektivs Für die Erstellung dieser Arbeit war Tumor-Material von insgesamt 121 Patienten verfügbar. Aufgrund von nicht ausreichendem Tumorgewebe, nicht ausreichender Qualität der eingesandten Gewebeproben oder fehlender essentieller Daten waren nur bei 117 der 121 Proben (97%) die Voraussetzungen für eine erfolgreiche Auswertung des SMAD4-Expressionsstatus gegeben. Diese 117 Gewebeproben wurden immunhistochemisch gefärbt. Die immunhistochemische Färbung war in allen Fällen (100%) erfolgreich und aussagekräftig – bestätigt durch die oben beschriebenen Kontrollmechanismen (siehe Kap. 3.2.6 und 3.2.7). Dies entspricht einem Anteil von 25% bezogen auf das Gesamtkollektiv der ursprünglichen AIOStudie (Porschen et al., 2007). Dieses Teilkollektiv kann in Bezug auf Alter, Geschlecht, Lokalisation des Primärtumors, ORR, PFS und OS als repräsentativ für das gesamte Studienkollektiv betrachtet werden (siehe Tabelle 5): Tabelle 5: Basis-Charakteristika des untersuchten Teil- und des Gesamtkollektivs im Vergleich. Charakteristika Teilkollektiv Gesamtkollektiv p-Wert (n=117) (n=470) (Teil- vs. Gesamtkollektiv) Alter (in Jahren) 63,99 64,41 0,648 Geschlecht (m/w) 76/41 292/178 0,572 Lokalisation Primärtumor 69/42/6 262/193/15 0,825 overall response rate (CR & PR) 57,0% 54,3% 0,609 PFS (in Monaten) 7,750 8,074 0,578 OS (in Monaten) 14,608 15,523 0,309 (Kolon/Rektum/unbekannt) In der untersuchten Subkohorte fanden sich 76 Männer und 41 Frauen (Verhältnis m:w = 1,85:1), deren Alter zwischen 35-82 Jahren lag (Median: 65,00 ± 8,752 Jahre). Bei 69 Patienten (59,0%) war der Primärtumor im Kolon, bei 42 Patienten (35,9%) im Rektum lokalisiert – in 6 Fällen (5,1%) war die Lokalisation nicht - 34 - bekannt. Die Behandlung erfolgte bei 56,4% der Patienten mittels des FUFOXSchemas, wohingegen 43,6% mit einem CAPOX-Schema therapiert wurden. Die Basis-Charakteristika des untersuchten Teilkollektivs sind in Tabelle 6 dargestellt: Tabelle 6: Basis-Charakteristika des untersuchten Teilkollektivs. Charakteristika Teilkollektiv (n=117) Alter (in Jahren) • Mittelwert 63,99 • ≤60 39 (33,3%) • >60 78 (66,7%) Geschlecht • männlich 76 (65,0%) • weiblich 41 (35,0%) Lokalisation • Kolon 69 (59,0%) • Rektum 42 (35,9%) • unbekannt 6 (5,1%) Grading • G1 2 (1,7%) • G2 58 (49,6%) • G3 17 (14,5%) • G4 1 (0,9%) • unbekannt 39 (33,3%) T-Stadium • T1 0 (0,0%) • T2 8 (6,8%) • T3 77 (65,8%) • T4 28 (23,9%) • unbekannt 4 (3,4%) N-Stadium • N0 30 (25,6%) • N1 31 (26,5%) • N2 51 (43,6%) • unbekannt 5 (4,3%) - 35 - Wie aus der Tabelle ersichtlich waren für die Variablen Lokalisation, Grading, TStadium und N-Stadium nicht für alle Patienten des Teilkollektivs Daten vorhanden. Dies wurde in den folgenden statistischen Berechnungen berücksichtigt. 4.2 SMAD4-Expressionsstatus Die 117 erfolgreich auswertbaren Gewebeproben wiesen allesamt eine deutlich positive Anfärbung von Stroma und normaler Kolonmukosa (sofern vorhanden) auf – diese Gewebsanteile dienten als zusätzliche interne Positivkontrolle der Färbung. Bei der unabhängigen Auswertung durch drei Untersucher ergab sich eine hohe interindividuelle Reliabilität von 93,2%. In den übrigen Fällen war die Meinung eines hinzugezogenen weiteren Untersuchers ausschlaggebend (siehe Kap. 3.2.7). Von den 117 Gewebeproben wiesen 23 Präparate (19,7%) eine reduzierte SMAD4-Expression mit Verlust der Anfärbung im Nukleus und 5 Präparate (4,3%) eine reduzierte SMAD4-Expression mit Verlust der Anfärbung im Zytoplasma auf (siehe Tabelle 7). Ein Expressionsverlust im Zytoplasma war dabei in allen Fällen mit einem gleichzeitigen Verlust der Expression im Kern verbunden, so dass es sich in diesen Fällen um einen vollständigen Expressionsverlust der jeweiligen Tumoren handelte. Ein isolierter Expressionsverlust im Zytoplasma bei erhaltener nukleärer Expression war bei keinem der Präparate nachweisbar. Tabelle 7: SMAD4-Expressionsstatus in Nuklei und Zytoplasma. Expressionsstatus Nukleus Nukleus & Zytoplasma reduzierte SMAD4-Expression (SMAD4- 23 (19,7%) 5 (4,3%) SMAD4-Expression (SMAD4- 94 (80,3%) 112 (95,7%) 117 (100,0%) 117 (100%) negativ) erhaltene positiv) Gesamt - 36 - Die folgenden Abbildungen zeigen exemplarisch einige charakteristische Aufnahmen von einer Auswahl der gefärbten Präparate (siehe Abbildungen 4-6): Abbildung 4: Deutlich positive Anfärbung von Tumorgewebe und Stroma, erhaltene SMAD4-Expression in Nuklei und Zytoplasma. - 37 - Abbildung 5: Expressionsverlust in Nuklei und Zytoplasma des Tumorgewebes, deutlich positive Anfärbung des Stromas und angrenzenden Normalgewebes. - 38 - Abbildung 6: Verlust der Expression in den Nuklei bei erhaltener zytoplasmatischer Expression, positiv angefärbtes Stroma. 4.3 Korrelationsanalysen 4.3.1 SMAD4-Expressionsstatus und Basis-Charakteristika Bei der Korrelationsanalyse zwischen den beobachteten Expressionsmustern und den Basis-Charakteristika des Teilkollektivs ergaben sich – mit einer Ausnahme – keine signifikanten Abhängigkeiten (siehe Tabelle 8). Die Präparate mit reduzierter SMAD4-Expression verteilen sich somit gleichmäßig auf die entsprechenden Subgruppen des jeweiligen Basischarakteristikums. Als Ausnahme war eine reduzierte SMAD4-Expression mit vollständigem Verlust der Anfärbung sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma knapp signifikant häufiger bei Tumoren des Rektums im Vergleich zu Neubildungen des Kolons zu beobachten. - 39 - Tabelle 8: p-Werte der Korrelationsanalyse zwischen SMAD4-Expressionsstatus und Basis-Charakteristika des Teilkollektivs. reduzierte SMAD4-Expression Korrelation mit Nukleus Nukleus & Zytoplasma Alter 0,869 0,747 Geschlecht 0,605 0,471 Lokalisation 0,267 0,047 Grading 0,092 0,304 T-Stadium 0,904 0,294 N-Stadium 0,061 0,814 Wie bereits unter Tabelle 6 erläutert, waren für die Variablen Lokalisation, Grading, T-Stadium und N-Stadium nicht für alle Patienten des Teilkollektivs Daten vorhanden. 4.3.2 SMAD4-Expressionsstatus und Gesamt- bzw. progressionsfreies Überleben Das mittlere Gesamtüberleben der Patienten mit Reduktion der SMAD4Expression nur im Nukleus lag bei 12,964 (95% CI: 9,150 – 16,777), das der Patienten mit erhaltener Expression bei 15,010 (95% CI: 13,276 – 16,744) Monaten (p = 0.533). Demgegenüber war das mittlere OS der Patienten mit gleichzeitiger Reduktion der Expression sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma mit 6,733 Monaten (95% CI: 2,314 – 11,152) signifikant kürzer (p = 0.002) als das mittlere OS der Patienten mit erhaltener Expression, welches bei 14,960 (95% CI: 13,348 – 16,572) Monaten lag. Die Kaplan-Meier-Plots des Gesamtüberlebens sind in Abbildung 7 dargestellt. Die Korrelation zwischen OS und Alter, Geschlecht, Lokalisation, Grading, T- und N-Stadium ergab in der univariaten Analyse keine signifikanten Abhängigkeiten (siehe Tabelle 9). In der multivariaten Analyse zeigten sich weder zwischen SMAD4- Expressionsstatus und OS noch zwischen den Basischarakteristika und dem OS signifikante Abhängigkeiten (siehe Tabelle 9). - 40 - Abbildung 7: Kaplan-Meier-Plots des Gesamtüberlebens (Expressionsreduktion vs. -erhalt getrennt nach Lokalisation). - 41 - Das mittlere progressionsfreie Überleben der Patienten mit Reduktion der SMAD4Expression nur im Nukleus lag bei 6,812 (95% CI: 4,978 – 8,645), das der Patienten mit erhaltener Expression bei 7,980 (95% CI: 6,847 – 9,113) Monaten (p = 0.334). Demgegenüber lag das mittlere PFS der Patienten mit gleichzeitiger Reduktion der Expression sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma bei 6,287 (95% CI: 2,120 – 10,453) Monaten, das der Patienten mit erhaltener Expression lag bei 7,816 (95% CI: 6,808 – 8,824) Monaten (p = 0.458). Die Kaplan-MeierPlots des progressionsfreien Überlebens sind in Abbildung 8 dargestellt. Die Korrelation zwischen PFS und Alter, Geschlecht, Lokalisation, Grading, T- und NStadium ergab in der univariaten Analyse keine signifikanten Abhängigkeiten (siehe Tabelle 9). Auch in der multivariaten Analyse zeigten sich keine signifikanten Abhängigkeiten zwischen SMAD4-Expressionsstatus bzw. den Basischarakteristika und dem PFS (siehe Tabelle 9). - 42 - Abbildung 8: Kaplan-Meier-Plots des progressionsfreien Überlebens (Expressionsreduktion vs. -erhalt getrennt nach Lokalisation). - 43 - Tabelle 9: Uni- und multivariate Korrelationsanalysen des SMAD4-Expressionsstatus und der Basischarakteristika mit Gesamt- und progressionsfreiem Überleben. Charakteristika Gesamt n OS 117 14,608 SMAD4-Expression p-Wert PFS p-Wert univariate multivariate univariate multivariate Analyse Analyse Analyse Analyse - - - - 0,533 0,366 0,334 0,524 0,458 0,476 0,912 0,528 0,764 0,370 0,956 0,370 0,167 0,172 0,078 0,639 0,315 0,916 7,750 nukleär • erhalten 94 15,010 7,980 • reduziert 23 12,964 6,812 0,002 SMAD4-Expression nukleär & zytoplasmatisch • erhalten • reduziert 112 5 14,960 6,733 39 78 12,906 15,459 Alter (in Jahren) • ≤60 • >60 • männlich • weiblich 76 41 14,475 14,854 69 42 14,278 15,120 • Rektum • unbekannt 0,655 7,826 7,713 0,653 Lokalisation • Kolon 7,816 6,287 0,243 Geschlecht 0,931 0,617 7,598 8,033 0,749 0,310 7,820 8,044 6 Grading 0,167 0,993 • G1 2 11,683 5,200 • G2 58 17 15,551 14,388 8,180 6,692 1 39 4,633 2,900 • G3 • G4 • unbekannt T-Stadium 0,414 0,204 • T2 0 8 17,650 9,842 • T3 77 15,234 8,233 • T4 28 4 12,264 5,932 • T1 • unbekannt N-Stadium • N0 • N1 • N2 • unbekannt 0,218 0,568 30 31 15,886 16,074 8,654 7,766 51 5 13,083 7,370 - 44 - 5 Diskussion 5.1 Erläuterung und Diskussion der Ergebnisse In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebeproben von Patienten mit metastasiertem KRK retrospektiv auf einen Expressionsverlust des Proteins SMAD4 hin untersucht. Das untersuchte Material stammt aus einer großen randomisierten Phase III Therapiestudie, welche aus einem Gesamtkollektiv von 470 Patienten bestand. Die Behandlung im Rahmen der Studie erfolgte in zwei Armen unter Anwendung eines CAPOX- respektive eines FUFOX- Therapieregimes. Aufgrund der randomisierten Studiendurchführung kann das rekrutierte Patienten-Kollektiv in den beiden Studien-Armen als homogen betrachtet werden. 5.1.1 Basis-Charakteristika und Expressionsstatus Für diese Arbeit wurde Tumor-Material von insgesamt 121 Patienten des AIOStudienkollektivs untersucht. Die Voraussetzungen für eine erfolgreiche Auswertung waren in 117 Fällen (97%) gegeben. Das aus diesen 117 auswertbaren Präparaten gebildete Teilkollektiv stellt einen Anteil von 25% des ursprünglichen Studienkollektivs dar und kann als repräsentativ für dieses betrachtet werden. So zeigten sich in Bezug auf Alter, Geschlecht, Lokalisation des Primärtumors, Ansprechraten, PFS und OS keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die mikroskopische Auswertung des SMAD4-Expressionsstatus ergab eine reduzierte nukleäre Expression in 19,7% und eine reduzierte Expression sowohl im Zytoplasma als auch in den Nuklei in 4,3% der Fälle. Ein isolierter Expressionsverlust im Zytoplasma bei erhaltener nukleärer Expression war bei keinem der Präparate nachweisbar. Dieser Umstand passt in das gegenwärtige biologische Modell der SMAD4-Funktionalität, da dieses im physiologischen Fall aus dem Zytoplasma in den Kern transloziert und dann dort transkriptionell aktiv ist. - 45 - Die Korrelation dieser Resultate mit den Basischarakteristika des untersuchten Kollektivs ergab keine signifikanten Abhängigkeiten und damit eine homogene Verteilung innerhalb des Teilkollektivs. Als Ausnahme war eine gleichzeitige Expressionsreduktion in Zytoplasma und Nuklei bei Tumoren des Rektums etwas häufiger (p = 0.047) als bei Neoplasien des Kolons zu beobachten. Bei der Beurteilung dieser grenzwertigen Signifikanz ist jedoch sowohl die geringe Anzahl an Präparaten, welche eine vollständige (d.h. nukleäre und zytoplasmatische) Expressionsreduktion aufwiesen (n = 5), als auch der Umstand zu beachten, dass nicht für alle Patienten Daten zu den Variablen Lokalisation, Grading, T- und NStadium vorhanden waren. 5.1.2 Gesamt- und progressionsfreies Überleben Bei der Korrelation des SMAD4-Expressionsstatus mit dem Gesamtüberleben ergab sich ein divergentes Bild. Eine Expressionsreduktion nur in den Nuklei zeigte keinen signifikanten Unterschied bezüglich des Gesamtüberlebens im Vergleich zu Patienten mit erhaltener nukleärer SMAD4-Expression (p = 0.533). Demgegenüber war jedoch die gleichzeitige Expressionsreduktion sowohl im Zytoplasma als auch in den Nuklei mit einem reduzierten OS bei deutlicher Signifikanz (p = 0.002) assoziiert. Dies bedeutet, dass eine vollständige, d.h. sowohl zytoplasmatisch als auch nukleär nachweisbare Reduktion der SMAD4Expression ein negativer prognostischer Marker bei Patienten mit metastasiertem KRK unter Behandlung mit einem Chemotherapie-Protokoll bestehend aus Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin ist. Die multivariaten Analysen in der Gruppe des Gesamtüberlebens waren jedoch allesamt ohne Signifikanz. Eine unabhängige prognostische Bedeutung des SMAD4-Expressionsstatus kann demnach an dem Patienten-Kollektiv dieser Arbeit zunächst nicht nachgewiesen werden. Der Umstand, dass eine signifikante Assoziation des Gesamtüberlebens mit einer alleinigen Reduktion der Expression im Kern nicht nachzuweisen war, lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass erst bei einem vollständigen Verlust der Expression in der Zelle (d.h. Zytoplasma und Nukleus betreffend) ein messbarer Effekt zu belegen ist. Auch die eher geringe Größe des untersuchten Kollektivs spielt in diesem Zusammenhang gegebenenfalls eine Rolle. - 46 - Bei der Beurteilung der signifikanten Assoziation zwischen der gleichzeitigen Expressionsreduktion in Nukleus und Zytoplasma und dem OS in der univariaten Analyse ist auch hier die geringe absolute Anzahl an Präparaten in dieser Gruppe zu berücksichtigen (n = 5, siehe oben). Diese geringe Fallzahl ist möglicherweise auch einer der wesentlichen Gründe für die in der multivariaten Analyse fehlende Signifikanz. Dieser Umstand war u.a. Anlass dazu, in einer weitergehenden Untersuchung das für diese Arbeit untersuchte Kollektiv von 121 auf 230 Patienten auszudehnen. In dieser nachfolgenden, von Baraniskin et al. publizierten Arbeit konnte an dem erweiterten Kollektiv eine Reduktion der SMAD4-Expression als unabhängiger prognostischer Faktor sowohl in der uni- als auch in der multivariaten Analyse für das OS (wie auch für das PFS, siehe unten) identifiziert werden (Baraniskin et al., 2011). Bei den Analysen bezüglich des Gesamtüberlebens ist zu beachten, dass das OS wesentlich auch durch Folgetherapien, d.h. durch Zweit- und Drittlinientherapien, (mit-) bestimmt wird. Daher könnte die prognostische Aussagekraft des SMAD4Expressionsstatus in Relation zum OS insbesondere bei Patienten von Nutzen sein, die aufgrund ihrer progredienten Erkrankung sich an die Erstbehandlung anschließende Folgetherapien erhalten. Eine diesbezügliche Evaluation muss jedoch zunächst in der Zukunft an geeigneten Kollektiven durchgeführt werden. Die Korrelationsanalysen des SMAD4-Expressionsstatus mit dem progressionsfreien Überleben ergaben im Gegensatz zu den zuvor genannten Analysen ein homogenes Resultat. Es waren weder bei der alleinigen Expressionsreduktion in den Nuklei (p = 0.334) noch bei der vollständigen, zytoplasmatisch und nukleär nachweisbaren Expressionsreduktion (p = 0.458) signifikante Abhängigkeiten nachweisbar. Ebenso waren auch die multivariaten Analysen in der Gruppe des PFS allesamt ohne Signifikanz. Eine prognostische Aussagekraft des SMAD4Expressionsstatus bezüglich des PFS kann also bei dem für diese Arbeit untersuchten Kollektiv nicht abgeleitet werden. In dem erweiterten Kollektiv der Arbeit von Baraniskin et al. (siehe oben, (Baraniskin et al., 2011)) konnte jedoch sowohl in der uni- als auch in der multivariaten Analyse eine Reduktion der SMAD4-Expression in den Nuklei als negativer prognostischer Faktor auch für das PFS identifiziert werden. - 47 - 5.1.3 Immunhistochemie Die zur Auswertung der 117 Präparate durchgeführte immunhistochemische Färbung verlief in allen Fällen erfolgreich (100%). Bestätigt durch die oben beschriebenen Kontrollmechanismen (siehe Kap. 3.2.6 und 3.2.7) war demnach in allen Fällen (100%) eine aussagekräftige Auswertung möglich. Die mikroskopische Auswertung erfolgte unter Verwendung in der Literatur etablierter Methoden (Wilentz, Iacobuzio-Donahue et al., 2000; Wilentz, Su et al., 2000; Reinacher-Schick et al., 2004) und in Anlehnung an eine große aktuelle Studie ((Bosman et al., 2009), siehe Kap. 5.2). Der ganz überwiegende Anteil der Präparate war mikroskopisch eindeutig zu beurteilen bzw. auszuwerten, was sich auch in der hohen interindividuellen Reliabilität von 93,2% bei der Auswertung zeigte. In dieser Arbeit wurde die Immunhistochemie verwendet, um den Expressionsstatus von SMAD4 beurteilen zu können, da diese Methode diverse Vorteile bietet. Es handelt es sich um ein etabliertes, standardisiertes und reproduzierbares Verfahren, welches darüber hinaus relativ kostengünstig durchzuführen ist. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie beispielsweise der Untersuchung des Mutations- oder des 18q LOH Status, ist die immunhistochemische Analyse außerdem ein sensitiverer Parameter, um eine prognostische Vorhersage treffen zu können (Alazzouzi et al., 2005). Die Färbung mittels kommerziell erhältlicher Kits und Färbeautomaten erlaubt heutzutage eine sichere und reproduzierbare histologische Aufarbeitung. Das Verfahren zeigt eine hohe Erfolgsquote bzw. Zuverlässigkeit in seiner Anwendung (Bosman et al., 2009). Selbst große Mengen an Präparaten lassen sich verhältnismäßig schnell und routinemäßig aufarbeiten und untersuchen. Als weiteren wichtigen Aspekt bietet die Immunhistochemie über die mikroskopisch erfassbare Intensität der Färbung ein direktes Maß für die verminderte Expression des Proteins – unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache. Gleichzeitig lässt sich außerdem sowohl die Morphologie des untersuchten Gewebes als auch die subzelluläre Lokalisation der Färbung evaluieren. Der wahrscheinlich größte Nachteil dieses Verfahrens liegt in seiner großen Abhängigkeit vom Untersucher bzw. dessen Erfahrung. In diesem Zusammenhang ist auch die bereits zuvor erwähnte interindividuelle Reliabilität bei der Auswertung (siehe oben) zu bewerten. Darüber hinaus stellt die Immunhistochemie als - 48 - semiquantitatives Auswertungsverfahren kein exaktes empirisches Maß, sondern nur eine Annäherung an dieses dar. Auch erlaubt eine reine immunhistochemische Analyse keine Rückschlüsse auf die tatsächliche Funktion des Proteins im jeweiligen Gewebe. Darüber hinaus sind auch die komplexen Methoden der Antigen-Aufbereitung im Färbeprozess mögliche Fehlerquellen. So garantiert zwar der in dieser Arbeit verwendete monoklonale SMAD4-Antikörper eine hohe Antigenaffinität, jedoch können bereits geringe Abweichungen bei der Gewebebehandlung bzw. bei der Einstellung der Reaktionsbedingungen im Rahmen der Epitop-Aufbereitung dazu führen, dass das Epitop zerstört wird oder für den Antikörper nicht erreichbar ist. Daraus können in der Folge falsch-negative Ergebnisse resultieren (Lang, 2006). 5.1.4 Studiendesign Die AIO-Studie, im Rahmen derer das Patientenkollektiv für diese Arbeit generiert wurde, war eine gut geplante, multizentrische und prospektiv-randomisiert durchgeführte Studie. Die Behandlung innerhalb der Studie erfolgte mittels moderner Chemotherapie-Protokolle unter Verwendung von Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen. Da jedoch alle Patienten mit diesen Chemotherapeutika behandelt wurden (Oxaliplatin und 5-FU entweder intravenös oder als orales Prodrug Capecitabin), gab es innerhalb der Studie keinen zweiten, alternativen Therapiearm, insbesondere keinen Nullarm. Die Analyse des SMAD4-Expressionsstatus im Hinblick auf eine etwaige prädiktive Aussagekraft war demnach nicht möglich. 5.2 Einordnung der Ergebnisse in die Literatur In diversen vorangegangenen Studien wurden die Bedeutung der genomischen Inaktivierung von SMAD4 im Rahmen der kolorektalen Karzinogenese und die Korrelation mit der Tumorprogression bereits aufgezeigt. So demonstrierten Takaku et al., dass eine homozygote Inaktivierung des SMAD4-Gens bei Maus-Mutanten eine Progression von polypösen Adenomen zu invasiven und malignen Karzinomen zur Folge hat (Takaku et al., 1998). Miyaki et al. fanden keine Mutationen von SMAD4 in Adenomen und in auf die Mukosa - 49 - begrenzten Karzinomen. Demgegenüber konnte die Arbeitsgruppe jedoch eine deutlich erhöhte Mutationsfrequenz beim Übergang in fortgeschrittene, invasive und insbesondere metastasierende Tumorstadien (siehe Kap. 1.3.3) feststellen (Miyaki et al., 1999). Dass die Inaktivierung von SMAD4 mit zunehmender Progression des Tumorstadiums gehäuft auftritt, konnten Maitra et al. bei der Untersuchung von 83 Präparaten kolorektaler Adenome und Adenokarzinome demonstrieren. Sie fanden eine Inaktivierung des SMAD4-Gens in 0% der Patienten im Stadium I, in 8% im Stadium II, in 6% im Stadium III und bei 22% der Patienten im Stadium IV (Maitra et al., 2000). Die Bedeutung des Eintretens der Metastasierung in diesem Zusammenhang konnten auch Tanaka et al. darlegen (siehe Kap. 1.3.3). Sie zeigten, dass in Lymphknoten oder Leber metastasierte KRK signifikant häufiger eine SMAD4-Inaktivierung aufweisen als frühe KarzinomStadien (Tanaka et al., 2006; Tanaka et al., 2008). Übereinstimmend mit diesen Resultaten konnten Alhopuro et al. zeigen, dass die SMAD4 Protein- und mRNALevels (Messenger-Ribonukleinsäure) in Lymphknotenmetastasen signifikant niedriger sind als im Primärtumorgewebe (Alhopuro et al., 2005). Zusammenfassend ergibt sich, dass die Inaktivierung von SMAD4 ein spät auftretender Vorgang im Rahmen der kolorektalen Karzinogenese ist, der insbesondere am klinisch relevanten Übergang zu invasiven und metastasierenden Stadien des KRK auftritt. Die Häufigkeit einer solchen immunhistochemisch nachweisbaren Inaktivierung der SMAD4-Expression variiert jedoch je nach betrachteter Studie. So fanden Reinacher-Schick et al. (Reinacher-Schick et al., 2004) in einer Untersuchung von 51 Gewebeproben kolorektaler Karzinome einen Anteil von SMAD4-negativen Gewebeproben in 26% der Fälle im Stadium III und in 29% der Fälle im Stadium IV. Salovaara et al. (Salovaara et al., 2002) untersuchten ein etwa gleich großes Kollektiv bestehend aus 53 Patienten und fanden einen SMAD4-negativen Anteil von insgesamt 38%. Die SMAD4-negativen Fälle verteilten sich hier auf die Dukes-Stadien A, B, C und D zu 0%, 9%, 21% und 8%. Im Vergleich zu diesen Resultaten fand die Arbeitsgruppe um Maitra et al. in den Stadien I und II eine annähernd gleiche Häufigkeitsverteilung, in den Stadien III und IV zeigte sich jedoch eine in etwa spiegelverkehrte Verteilung der Prozentsätze (siehe oben). In der Zusammenschau dieser Daten ergibt sich bezüglich der konkreten Häufigkeit des Auftretens einer SMAD4-Inaktivierung im Stadium IV also eine nicht - 50 - ganz homogene Datenlage mit zwischen 8% und 29% schwankenden Zahlen. In Deckung mit diesen Angaben ergab sich bei den in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen ein Anteil von insgesamt 19,7% an SMAD4-negativen Gewebeproben. Dieses Ergebnis erscheint also in Kongruenz mit den bisher in der Literatur zu findenden Angaben. In Anbetracht der Ergebnisse von Reinacher-Schick et al. sowie Maitra et al. ist jedoch davon auszugehen, dass tendenziell eher noch höhere Prozentsätze an SMAD4-negativen KRK im Stadium IV zu erwarten sind. Dies bestätigte sich beispielsweise in unserer Untersuchung von Baraniskin et al., in der das für diese Arbeit herangezogene Kollektiv auf insgesamt 230 Patienten erweitert wurde. Bei der Untersuchung dieses Kollektivs ergab sich dann eine Reduktion der SMAD4Expression mit einer Häufigkeit von 34% im Stadium IV (Baraniskin et al., 2011). Die bisher größte Untersuchung zur stadienabhängigen Häufigkeit und prognostischen Relevanz eines SMAD4-Expressionsverlustes bei KRK wurde von Bosman et al. durchgeführt (Bosman et al., 2009). Diese Studiengruppe untersuchte ein Kollektiv von mehr als 1500 Patienten mit KRK im Stadium II und III. Als Resultat fanden die Autoren einen SMAD4-Verlust in 9% bzw. 13% der Fälle im Stadium II bzw. III. Aufgrund der großen Anzahl eingeschlossener Patienten erscheint ein Vergleich mit dieser Studie als relevant und richtungsweisend. Das methodische Vorgehen bei der vorliegenden Arbeit wurde daher in weitgehend analoger Weise durchgeführt. So wurden die Gewebeproben hier ebenso wie bei Bosman et al. mittels immunhistochemischer Färbung und semiquantitativer mikroskopischer Auswertung analysiert. Es ergaben sich vergleichbare Prozentsätze an erfolgreich auswertbaren Präparaten (98% bei Bosman et al. vs. 100%). In beiden Arbeiten erfolgte die Auswertung durch Analyse des Prozentsatzes an SMAD4-defizitären Zellen im Tumorgewebe unter Verwendung in etwa identischer Cut-Offs (35% bei Bosman et al. vs. 30%). Für diese Arbeit wurde aus Praktikabilitäts-Gründen ein Cut-Off von 30% gewählt, da im Rahmen der semiquantitativen mikroskopischen Auswertung ein Unterschied im Bereich von 5% kaum sicher zu erfassen ist. Bei der Untersuchung von Bosman und Kollegen wurde jedoch ausschließlich der Nukleus als subzelluläres Kompartiment für die Beurteilung herangezogen, während bei dieser Arbeit zwischen Nukleus und Zytoplasma unterschieden wurde. - 51 - In Anbetracht der vorangegangenen Ausführungen und unter Berücksichtigung der Resultate von Bosman et al. für die Stadien II und III erscheint das in dieser Arbeit gefundene Ergebnis einer SMAD4-Expressionsreduktion von 19,7% im Stadium IV als plausibel. Dies gilt insbesondere, da der SMAD4-Verlust als ein spät auftretendes Ereignis im Rahmen der kolorektalen Karzinogenese angesehen wird (siehe oben). Die prognostische und prädiktive Aussagekraft einer SMAD4-Inaktivierung bzw. auch eines 18q LOH wurde ebenfalls in der Vergangenheit bereits in verschiedenen Studien untersucht. In diesen Untersuchungen sind im Wesentlichen KRK in den UICC-Stadien II und III berücksichtigt worden. So konnte beispielsweise für KRK im UICC-Stadium II bzw. im Dukes-Stadium B in zwei Studien gezeigt werden, dass ein 18q-Allelverlust eine unabhängige prognostische Bedeutung besitzt: Sowohl Font et al. (Font et al., 2001) als auch Diep et al. (Diep et al., 2003) demonstrierten eine signifikant schlechtere Prognose bei Vorhandensein eines 18q LOH. Watanabe et al. zeigten, dass KRK im Stadium III oder in einer Hochrisiko-Situation des Stadiums II nach adjuvanter Chemotherapie mit einem 5-FU-Protokoll ein signifikant schlechteres Gesamtüberleben haben, wenn ein 18q LOH nachgewiesen werden kann (Watanabe et al., 2001). Auch Alazzouzi et al. und Alhopuro et al. konnten mittels immunhistochemischer Analyse von KRK im Dukes-Stadium C demonstrieren, dass eine verminderte Expression von SMAD4 mit einem signifikant schlechteren Gesamt- und progressionsfreien Überleben assoziiert ist. Diese Ergebnisse wurden in den beiden Studien für ein jeweils unterschiedliches Kollektiv belegt: Auf der einen Seite für Patienten, welche ausschließlich eine (potentiell kurative) operative Behandlung erhalten hatten (Alazzouzi et al., 2005), und zum Anderen für ein Kollektiv, welches zusätzlich zur Operation noch mit einer adjuvanten 5-FU Chemotherapie behandelt wurde (Alhopuro et al., 2005). Barratt et al. zeigten in einer Untersuchung, dass Patienten im Dukes-Stadium B und C mit intakten 18q Loci einen größeren Benefit aus einer adjuvanten Therapie mit 5-FU ziehen als Patienten mit einem 18q LOH (Barratt et al., 2002). Auch eine Arbeitsgruppe aus der Schweiz fand Hinweise darauf, dass Patienten mit einem normalen diploiden SMAD4-Status einen höheren Benefit aus einer adjuvanten 5FU-basierten Chemotherapie ziehen als Patienten mit einem SMAD4-Verlust (Boulay et al., 2002). - 52 - Patienten mit KRK im Stadium IV sind demgegenüber jedoch bisher kaum Gegenstand von derartigen Studien. Insbesondere gibt es bislang keine Untersuchungen mit einer isolierten Betrachtung des metastasierten Stadiums unter Fokussierung auf eine mögliche prognostische Relevanz eines SMAD4Verlustes oder eines 18q LOH. In dieser Arbeit wurde eine derartige Untersuchung erstmalig durchgeführt und demonstrierte eine prognostische Relevanz einer SMAD4-Expressionsreduktion in Bezug auf das Gesamtüberleben bei Patienten im Stadium IV unter Chemotherapie mit Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin. Eine Bestätigung dieser Ergebnisse erfolgte schließlich durch die weitergehenden Untersuchungen von Baraniskin et al. (siehe oben, (Baraniskin et al., 2011)). 5.3 Ausblick Die Ergebnisse der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen deuten auf eine prognostische Bedeutung eines SMAD4-Verlustes im Rahmen metastasierter KRK hin. Eine erste Bestätigung dieser Resultate erfolgte in der nachfolgenden Arbeit publiziert von Baraniskin et al. (Baraniskin et al., 2011) an einer größeren Serie von Patienten. Dort konnte eine unabhängige prognostische Bedeutung sowohl im Rahmen des OS als auch des PFS demonstriert werden. Gewiss müssen diese Daten jedoch in großen prospektiven klinischen Studien weiter evaluiert und verifiziert werden. Erst bei Untersuchung weiterer, großer Kollektive von Patienten im Stadium IV unter randomisierten Bedingungen können zuverlässige Aussagen über die tatsächliche Aussagekraft dieses Markers getroffen werden. Um neben der prognostischen Bedeutung auch eine mögliche prädiktive Relevanz näher zu untersuchen, ist es weiterhin notwendig Studien durchzuführen, welche verschiedene Therapiearme beinhalten. So sollten zum Einen verschiedene Chemotherapie-Protokolle miteinander verglichen werden, zum Anderen sollte man in ausgewählten Situationen unter Umständen auch einen reinen Beobachtungsarm als Vergleichskriterium in Erwägung ziehen. Die bereits vorhandenen Daten zu KRK in den Stadien II und III deuten bereits auf eine mögliche, praxisrelevante Therapieprädiktion hin (siehe Kap. 5.2), jedoch sind auch hier weitere Untersuchungen notwendig. Kann die weitere Validierung des Markers SMAD4 in der Zukunft die in dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse bestätigen oder noch weiter spezifizieren, so kann - 53 - dieser Marker möglicherweise als zusätzliches diagnostisches Werkzeug auf dem Weg zu einer Individualisierung der medikamentösen Therapie des KRK herangezogen werden. - 54 - 6 Zusammenfassung Das kolorektale Karzinom liegt in Deutschland sowohl bei den Krebsneuerkrankungen als auch in der Todesursachenstatistik der Krebserkrankungen auf Platz zwei. Männer und Frauen sind gleichermaßen betroffen. Im Rahmen der kolorektalen Karzinogenese spielt das Tumorsuppressorgen SMAD4 eine wichtige Rolle, da es im Verlauf der Adenom-Karzinom-Sequenz seine Funktion verliert. Dieser Prozess findet insbesondere am Übergang zu invasiven und metastasierenden Stadien statt. Die Bedeutung von SMAD4 als möglicher prognostischer Biomarker ist in der Vergangenheit bereits für KRK in den UICC-Stadien II und III evaluiert worden. Hierbei ergaben sich Hinweise insbesondere für eine prognostische Relevanz des SMAD4-Verlustes im Rahmen eines 18q LOH. Entsprechende Untersuchungen für metastasierte KRK im Stadium IV sind bislang jedoch nicht erfolgt. In dieser Arbeit wurden Tumor-Gewebeproben aus einem Teilkollektiv einer großen klinischen Phase III Studie der Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie untersucht. In dieser Studie wurde der Einsatz des oralen Fluoropyrimidins Capecitabin mit einer infusionalen Applikation von 5-FU/FS – jeweils in Kombination mit Oxaliplatin – im Rahmen der Erstlinien-Chemotherapie von Patienten mit metastasiertem KRK verglichen. Die Beurteilung und Auswertung des SMAD4-Expressionsstatus erfolgte unter Verwendung etablierter immunhistochemischer Methoden. Bei der Untersuchung der 121 Gewebeproben fanden wir, dass eine vollständige (d.h. sowohl zytoplasmatisch als auch nukleär nachweisbare) Reduktion der SMAD4-Expression in der univariaten Analyse mit einem signifikant kürzeren OS assoziiert ist und demnach einen negativen prognostischen Marker bei Patienten mit metastasiertem KRK unter Behandlung mit einem Chemotherapie-Protokoll bestehend aus Oxaliplatin und einem Fluoropyrimidin darstellt. Eine unabhängige prognostische Bedeutung konnte bei fehlender Signifikanz in der multivariaten Analyse zunächst nicht nachgewiesen werden. Auch eine signifikante Assoziation des Expressionsstatus mit dem PFS war in dieser Arbeit nicht nachweisbar. Bei unserer weitergehenden Untersuchung von Baraniskin et al. konnte an einem größeren Kollektiv der Einfluss auf das OS bestätigt und auch die unabhängige prognostische Bedeutung der Expressionsreduktion von SMAD4 demonstriert werden. Gleichzeitig konnte auch eine negative prognostische Assoziation mit - 55 - dem PFS nachgewiesen werden. Eine erste Validierung der Ergebnisse dieser Arbeit ist also positiv verlaufen. Für die Zukunft ist es jedoch notwendig, weitere Untersuchungen zur Validierung des potentiellen Biomarkers SMAD4 durchzuführen, welche insbesondere unter prospektiven klinischen Bedingungen an geeigneten, großen Kollektiven erfolgen sollten. Erst dann wird sich zeigen, ob langfristig eine Integration des SMAD4Expressionsstatus als Biomarker zur Individualisierung der Therapie des kolorektalen Karzinoms im klinischen Alltag erfolgen kann. - 56 - 7 Literaturverzeichnis Alazzouzi, H., Alhopuro, P., Salovaara, R., Sammalkorpi, H., Jarvinen, H., Mecklin, J. P., Hemminki, A., Schwartz, S., Jr., Aaltonen, L. A. and Arango, D. (2005). SMAD4 as a prognostic marker in colorectal cancer. 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Schulmann sowie Herrn Dr. A. Baraniskin für die kompetente Unterstützung bei der Erstellung der Statistik sowie für die Hilfe bei generellen Fragen und Problemen. Auch Frau Dr. J. Munding und Frau Dr. W. Ziebarth im Institut für Pathologie am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil möchte ich ganz herzlich für die Hilfe bei der Erstellung des „Material und Methoden“-Teils danken. Frau Dr. J. Munding danke ich darüber hinaus auch für die hilfreiche Mitbegutachtung einiger Präparate. Ebenso danke ich Frau Prof. Dr. A. Tannapfel für die Möglichkeit uneingeschränkt in Ihrem Institut arbeiten zu dürfen. Ein ganz besonderer Dank gilt Nina und meiner Mutter dafür, dass sie mich immer wieder ermutigt haben diese Arbeit fortzusetzen und schließlich zu beenden. Danke für die vorbehaltlose Unterstützung und stete Motivation! Abschließend bedanke ich mich auch bei Ingo für seine kompetente und hilfreiche Unterstützung in praktischen Dingen. Und auch meinen Freunden danke ich für ihr fortwährendes Verständnis für meine gelegentlich knapp bemesse Zeit während der Erstellung dieser Arbeit. Curriculum Vitae Persönliche Daten Name Dominik Meier Geburtsdatum/ -ort 27. April 1984 in Schwerte Staatsangehörigkeit deutsch Familienstand ledig Beruf seit 04/2011 Assistenzarzt in der Medizinischen Klinik, Augusta-KrankenAnstalt, Bochum Studium 12/2010 Approbation als Arzt 11/2010 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 09/2006 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 10/2004 – 11/2010 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Zivildienst 08/2003 – 05/2004 Zivildienst beim Caritasverband Hattingen-Schwelm e. V., Hattingen Schulbildung 6/2003 Abitur 6/2001 High School Diploma USA 08/2000 – 06/2001 Laconia High School, Rosendale, Wisconsin, USA 08/1994 – 06/2003 Gymnasium im Schulzentrum Hattingen-Holthausen 08/1993 – 06/1994 Gemeinschafts-Grundschule Niedersprockhövel 12/1991 – 07/1993 Gemeinschafts-Grundschule Gevelsberg-Silschede 08/1989 – 11/1991 German Swiss International School Hongkong
