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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
High performance- Durchflusszytometrie
Innovative Hochleistungsgeräte mit neuen
Anwendungsmöglichkeiten
ROLAND GÖHDE 1 , VOLKER OST 2 , MATTHIAS STEINBERG 2 , WOLFGANG GÖHDE 3
1 PARTEC GMBH, GÖRLITZ
2 PARTEC GMBH, MÜNSTER
3 MEDIZINISCHE FAKULTÄT, WESTFÄLISCHE WILHELMS-UNIVERSITÄT MÜNSTER
Die Durchflusszytometrie hat die zytologische Grundlagenforschung
entscheidend verändert und zu neuen Einsichten in die komplexen molekularen Hintergründe der Zelldifferenzierung sowie zur Realisierung neuer
Konzepte für eine effektive Diagnostik und Therapie bei zahlreichen
Erkrankungen beigetragen.
Flow cytometry fundamentally has changed cytological research and
contributed to new insights into the complex molecular backgrounds of
cell differentiation. Innovative high performance flow cytometers lead to
new interesting applications.
ó Anwendungen in der Medizin dominieren
die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie seit ihrer Entstehung im Jahr 1968 [1, 2].
Die technische Entwicklung dieser Technologie war für viele Jahre von dem Wunsch getragen, Anwendungen zu erschließen, die Patienten unmittelbar Nutzen bringen. Zusätzlich
hat die Durchflusszytometrie viele neue
Ansätze für die wissenschaftlich-technische
Forschung gefunden, die allesamt auf der präzisen Erfassung physikalischer und chemischer Eigenschaften einer großen Anzahl von
Einzelzellen und anderer mikroskopisch kleiner Partikel beruhen.
Die high performance-Durchflusszytometrie mit Partec CyFlow®-Durchflusszytome-
tern ist durch einen hohen Probendurchsatz
von mehr als 10.000 Einzelmessungen pro
Sekunde und einer hohen Empfindlichkeit
(Messung der DNA bis unter 10–15 bis 10–16 g
pro Zelle, Bakterium oder Virus) bei einer
Messgenauigkeit pro Einzelmessung mit
einem Varianzkoeffizienten (CV) ≤ 1 % gekennzeichnet (Abb. 1A, D).
Immunologie
Eines der wichtigsten Anwendungsgebiete
ist die Immunstatusbestimmung für
HIV/AIDS-Patienten. Ohne diese Laboruntersuchung, die nur mithilfe der Durchflusszytometrie möglich ist, gelingt eine
langfristige Stabilisierung der Patienten
nicht. Generell eignen sich Partec-Multilasersysteme für die Routineimmunologie
(Abb. 2) und für polychromatische Analysen
mit über acht Farben bzw. Fluoreszenzkanälen in der immunologischen Forschung
[3]. Die Immunphänotypisierung einer Patientenprobe erlaubt z. B. die Differenzierung und
Konzentrationsbestimmung von LeukozytenSubpopulationen. Bei unserem Versuch mit
dem Partec CyFlow-Durchflusszytometer wurde eine Vollblutprobe (100 μl) mit je 10 μl
monoklonalen Antikörpern CD45-PE-Dy647
für alle Leukozyten, CD8-PE für CD8-positive
Lymphozyten und CD3-FITC inkubiert und
anschließend fixiert und schonend lysiert
(Abb. 2).
¯ Abb. 1: Hochauflösende DNA-Messungen
mit Durchflusszytometern. A, menschliche Lymphozyten, Anregung mit dem UV-Spektrum
einer HBO-Lampe. Dem Hauptpeak der diploiden Zelle (*) wird per Definition ein DNA-Index
von 1,0 zugeordnet. B, Menschliche Lymphozyten (aus A) wurden mit Zellen einer Mundhöhlen-Tumorbiopsie gemischt. Die neu auftretenden Peaks (Pfeile) symbolisieren Zellen mit
abweichenden DNA-Gehalten (Tumorzellen). C,
Blattgewebe von Arabidopsis thaliana. Anregung bei 532 nm. Die relativen Positionen der
DNA-Peaks ermöglichen die exakte Bestimmung
des DNA-Gehalts einer Zelle. (*): diploider DNAPeak. D, Hochauflösende DNA-Messung
menschlicher Lymphozyten. Anregung mittels
UV-LED bei 365 nm. CV: Varianzkoeffizient
(durchgeführt mit Partec CyFlow).
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¯ Abb. 2: Durchflusszytometrische DreifachImmunmarkierung. Der Dot-Plot zeigt links die
positive Auswahl der stark fluoreszierenden Lymphozyten (R1) und rechts die daraus abgeleitete
Darstellung der Lymphozytenuntergruppen in
Quadranten: CD8-positiv (Q2: CD8+), CD8-negativ (Q3 und Q4: CD8–), CD3-positiv (Q2 und Q4:
CD3+) und CD3-negativ (Q1 und Q3: CD3–), die
in ihrer Gesamtheit aus R1 stammen. Rot: CD45PE-Dy647; orange: CD8-PE; grün: CD3-FITC
(durchgeführt mit Partec CyFlow).
¯ Abb. 3: Durchflusszytometrische Anwendungen aus den Bereichen Mikrobiologie, Partikelund Virendetektion. A, Färbung von Hefezellen
mittels eines Lebendfarbstoffs und Fluoreszenzmarkierung von toten Zellen zur Bestimmung
der Zellvitalität. Die Hefezellen wurden direkt
einem Fermenter entnommen und mit Yeast
Control-Viability (Partec) angefärbt. Laseranregung bei 488 nm. B, Identifizierung von Mikroorganismen durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten, sequenzspezifischen DNA-Sonden.
Ein Organismus kann in einem Gemisch zahlreicher verschiedener Zellen markiert und somit
erkannt werden. Oben: alle Zellen einer Probe
im Streulichtbild (Region R1). Unten: fluoreszenzmarkierte Escherichia coli-Zellen nach
Hybridisierung mit einer spezifischen DNA-Sonde (Q2), Zellen ohne Markierung (Q4). C, Darstellung einer Probe von Mikropartikeln im
Streulichtbild. Größe: 200 nm. D, Probe von
kleinsten Goldpartikeln im Streulichtbild. Größe: 88 nm. E, T4-Bakteriophagen nach Anfärbung der viralen Nukleinsäuren. Messung mit
blauer Laseranregung bei 488 nm (durchgeführt
mit Partec CyFlow).
Mikroorganismen
DNA-Analytik
Eine der ersten medizinischen Anwendungen
der Durchflusszytometrie hatte zum Ziel, den
DNA-Gehalt von Zellen und Tumorzellen sehr
genau an großen Zellpopulationen zu bestimmen. Der zytodiagnostische Wert dieser Untersuchungen ergibt sich daraus, dass Tumorzellen in der Regel eine höhere Chromosomenzahl und damit einen höheren DNA-Gehalt
haben als normale Zellen [4]. Bei einer Messgenauigkeit von ≤ ± 1 % lassen sich Zellen charakterisieren, deren Chromosomenzahl um
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mindestens ein Chromosom vom Normalwert
abweicht [5]. Ergebnisse von DNA-Messungen
sind in Abbildung 1A und B gezeigt. Hochpräzise DNA-Analysen spielen heute auch in der
Pflanzen- und Tierzüchtung eine wichtige Rolle [6]. Abbildung 1C zeigt die DNA-Verteilung
der für genetische Untersuchungen wichtigen,
aber für die genaue DNA-Bestimmung „schwierigen“ Pflanze Arabidopsis thaliana. Der DNAGehalt, der hier lediglich 0,5 · 10–12 Gramm pro
Zelle beträgt [7], lässt sich immerhin mit einer
Genauigkeit von ± 1,5 % bestimmen.
Für viele Untersuchungen an Mikroorganismen lässt sich die Durchflusszytometrie effektiv einsetzen, häufig hat diese Technologie
die zeitraubende Kultivierung auf Agarplatten
ersetzt. Für die Überwachung von Zellkulturen z. B. in Fermentern liefert die Durchflusszytometrie neue und aufschlussreiche
Informationen (Abb. 3A). In Ergänzung zum
Nachweis von Mikroorganismen besteht häufig der Wunsch, deren Zugehörigkeit zu einer
bestimmten Art zu ermitteln. Mittels fluoreszenzmarkierter DNA- und RNA-Proben
gelingt diese taxonomische Einordnung mithilfe der Durchflusszytometrie (Abb. 3B).
Mikrobeads/Nanopartikel/Viren
Die besondere Leistungsfähigkeit der high performance-Durchflusszytometrie wird durch
die Analyse extrem kleiner Partikel deutlich.
Ohne auf die interessanten Anwendungsmöglichkeiten derart hochsensitiver Messungen im Detail einzugehen, sei darauf hingewiesen, dass diese Partikel oft benutzt werden, um die Leistung unterschiedlicher tech-
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nischer Lösungen oder kompletter Durchflusszytometer miteinander zu vergleichen. Insoweit dienen
diese Messungen auch als Entscheidungshilfe für die
Auswahl der jeweils am besten geeigneten Technologie (Abb. 3C, D). Von hier ist der Schritt zum direkten Nachweis von Viren nicht mehr weit (Abb. 3E).
High performance-Durchflusszytometrie
Diese Messergebnisse zeigen, dass sich die Einsatzmöglichkeiten der high performance-Durchflusszytometrie in der Zukunft auf ganz neue Anwendungen
ausbreiten werden.
Durchflusszytometrie
Bestimmung der NK-ZellZytotoxizität gegen
Leukämie- und Tumorzellen
Danksagung
Für die wertvolle Kooperation sowie wichtige Beiträge und Anregungen danken wir unseren Kollegen
Dr. Danny Köhler, Dr. Ines Nasdala und Dr. Lionel
Jouvet.
ó
Literatur
[1] Valet G (2003) Past and present concepts in flow cytometry: A
European perspective. J Biol Regul Homeost Agents 17:213–222
[2] Göhde W (1968) Automatisches Meß- und Zählgerät für die Teilchen
einer Dispersion. Patent DE1815352, Anmeldetag: 18.12.1968
[3] Nemes E, Bertoncelli L, Lugli E et al. (2010) Cytotoxic granule release
dominates gag-specific CD4+ T-cell response in different phases of HIV
infection. AIDS 24, im Druck
[4] Barlogie B, Göhde W, Johnston DA et al. (1978) Determination of ploidy and proliferative characteristics of human solid tumors by pulse cytophotometry. Cancer Res 38:3333–3339
[5] Meistrich M, Göhde W, White R (1978) Resolution of X and Y spermatids by pulse cytophotometry. Nature 274:821–823
[6] Pfosser M, Amon A, Lelley T et al. (1995) Evaluation of sensitivity of
flow cytometry in detecting aneuploidy in wheat using disomic and ditelosomic wheat-rye addition lines. Cytometry 21:387–393
[7] Schmuths H, Meister A, Horres R et al. (2004) Genome size variation
among accesions of Arabidopsis thaliana. Ann Bot 93:317–321
Korrespondenzadresse:
1
2
3
4
Roland Göhde1, Matthias Steinberg2,
Volker Ost3, Wolfgang Göhde4
Roland Göhde
Partec GmbH
Am Flugplatz 13
D-02828 Görlitz
Tel.: 03581-8746-0
Fax: 03581-8746-70
[email protected]
www.partec.com
ó Zelluläre Immuntherapien mit immunomagnetisch aufgereinigten, aktivierten natürlichen Killerzellen (NK-Zellen),
deren zytotoxische Aktivität gegen verschiedene Typen von Leukämie- und
Tumorzellen gerichtet ist, stellen vielversprechende Strategien für Hochrisikopatienten mit malignen Erkrankungen
zur Verbesserung ihrer Heilungschancen dar [1, 2]. Die Charakterisierung der
stimulatorischen und inhibitorischen NKZell-Rezeptoren (natural cytotoxicity
receptors, NCRs, und killer immunoglobulin-like receptors, KIRs) hat neue Perspektiven eröffnet für die therapeutische
Entscheidung, NK-Zell-Alloreaktivität zur
Unterstützung des graft-versus-tumorund des graft-versus-leukemia-Effekts
(GvT/GvL) über die Granzym-B- und Perforin-Signalkaskade zu nutzen [3].
Für die Evaluation dieser neuen Therapien und für die initiale in vitroTestung potenzieller GvT-/GvL-Effekte ist eine zuverlässige Methode zur
Charakterisierung der zytologischen
Funktion von NK-Effektorzellen
gegen die Ziel-Leukämie- oder ZielTumorzellen von essenzieller Bedeutung. Dazu haben wir eine Methode
zur Quantifizierung der NK-ZellZytoxizität gegen Leukämiezellen
unter Verwendung einer absoluten Zählmethode (single platform) im no-washModus etabliert [4]. Wir konnten diese
Methode durch Einführung eines neuen
fünffarbigen Zytometrieassays zur Evaluation der lytischen NK-Zellaktivität
gegen adhärente Tumorzellen, im Besonderen gegen Neuroblastomzellen (NBZellen) weiter optimieren [5]. Um die Eignung dieser zytometrischen Methode für
solide Tumoren zu prüfen, haben wir
einen Assay auf einem Beckman Coulter
FC500 Fünf-Farben-Zytometer (Abb. 1,
Argon-Laseranregung: 488 nm; Bandpass-Filter: 525, 575, 620, 675 und 755
nm) etabliert und die Daten nachfolgend
mit der CXP-Analysis-Software ausgewertet. Da die quantitative Auswertung
und zugehörige gating-Strategie dieses
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