Zur Relevanz der immunhistochemischen Marker D2

Ruhr-Universität Bochum
PD Dr. med. Annette M. Müller
Dienstort: Universitätsklinikum Bonn
Abteilung für Kinderpathologie
Zur Relevanz der immunhistochemischen Marker D2-40 und Podoplanin in
der Diagnostik dermaler angiosarkomatöser Gefäßtumore
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Yvonne Hunder
aus Koblenz
2008
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
PD Dr. A. M. Müller
Koreferent:
Prof. Dr. med. J. Guzman y Rotaeche
Tag der Mündlichen Prüfung: 02.12.2008
Meinen lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
6 1 Einleitung
7 1.1 Angiosarkome
7 1.2 M2A / D2-40
8 1.3 Podoplanin
9 1.4 CD34 (human hematopoietic progenitor cell antigen)
10 2 Ziel der Untersuchung
12 3 Material
13 3.1 Untersuchungsgut
13 3.2 Geräte
15 3.3 Reagenzien
15 4 Methode
17 4.1 Immunhistochemische Aufarbeitung der Präparate
17 4.1.1 Anfertigung der Schnittpräparate
17 4.1.2 Demaskierung
17 4.1.3 Blockierung
18 4.1.4 Immunhistochemische Färbung von CD34 und Podoplanin
18 4.1.5 Immunhistochemische Färbung von D2-40
19 4.2 Negativ- und Positivkontrollen
21 4.3 Computergestützte Auswertung der immunhistochemischen
Färbung
4.4 4.5 22 Manuelle Mikroskopie: Ermittlung des Immunreaktivitätsscore
(IRS)
29 Statistik
30 5 Ergebnisse
32 5.1 ACIS-Analyse der immunhistochemischen Färbungen
32 5.1.1 D2-40
32 5.1.1.1 Deskriptive Auswertung
32 5.1.1.2 Anteil mischdifferenzierter Angiosarkome (Haupthypothese)
34 4
5.1.1.2.1 Relative Häufigkeit Tumoren mit Mischdifferenzierungsanteil >20%
34 5.1.1.2.2 Relative Häufigkeiten der verschiedenen MischdifferenzierungsUntergruppen
35 5.1.2 Podoplanin
39 5.1.3 Podoplanin und D2-40: Vergleich der ACIS-Ergebnisse
41 5.1.4 Patientengruppen mit zwei und mehr Rezidiven
44 5.1.5 CD34-Messung
54 5.2 Manuelle Mikroskopie der immunhistochemischen Färbungen:
D2-40 und Podoplanin
59 5.3 Vergleich der ACIS-Analyse mit der manuellen Mikroskopie
64 5.3.1 D2-40
64 5.3.2 Podoplanin
72 6 Diskussion
81 7 Zusammenfassung
96 8 Literaturverzeichnis
98 9 Anhang
110 Danksagung
Lebenslauf
5
Abkürzungsverzeichnis
ABC:
Avidin-Biotin-Enzym-Komplex
ACIS:
Automated Cellular Imaging System
APAAP:
Alkalische Phosphatase anti-Alkalische Phosphatase
AQUA:
Automated Quantitative Analysis
BN:
Normalized Blue
BSA:
Bovine Serum Albumin
CCD:
Charged-Coupled Device
CIA:
Chemiluminescence Immunoassay
CMYK:
Cyan / Magenta / Yellow / Key
CS-CAIA: Color Substractive-Computer-assisted Image Analysis
DAB:
3,3’ Diaminobenziden
DCC:
Dextran Coated Charcol
EGFR:
Epidermal Growth Factor Receptor
EIA:
Enzyme Immuno Assay
ELISA:
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ER:
Estrogen Receptor
FISH:
Fluoreszenz In-Situ Hybridisation
HE:
Hematoxylin-Eosin
IDRA:
Immunhistochemical Densitometrical Receptor Analysis
IHC:
Immunhistochemistry
IRS:
Immunreaktivitätsscore
PBS:
Phosphate-buffered saline
PR:
Progesterone Receptor
RGB:
Red / Green / Blue
RGB/HSL: Red / Green / Blue / Hue / Saturation / Luminosity
TMA:
Tissue Microarray
TBS:
Tris-buffered saline
TRIS:
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
6
1
Einleitung
1.1
Angiosarkome
Angiosarkome sind vergleichsweise seltene maligne endotheliale, differenzierte
Gefäßstrukturen nachahmende Neoplasien. (Murphy and Elder, 1991). Prädilektionsstellen sind vor allem Kopf- und Nackenhaut älterer Menschen (Morales
et al., 1981; Holden et al., 1987; Murphy and Elder, 1991; Fata et al., 1999;
Weiss and Goldblum, 2001; Fletcher, 2002; Abraham et al., 2007). Im MundKiefer-Gesichtsbereich kommen Angiosarkome sowohl im Bereich der Haut
oder Schleimhaut vor allem älterer Menschen als auch in tiefer liegenden
Geweben vor (Ehrenfeld und Prein, 2002).
Da Angiosarkome morphologische und funktionelle Eigenschaften des normalen Endotheliums rekapitulieren, weisen sie ein großes morphologisches Spektrum auf (Weiss and Goldblum, 2001; Meis-Kindblom and Kindblom, 1998).
Diese Varianz reicht von hochdifferenzierten Tumoren, die Hämangiomen
ähneln, bis zu solchen, bei denen es Anaplasien schwer machen, sie zum Beispiel von Karzinomen oder Melanomen zu unterscheiden. Der Begriff Angiosarkom wird für alle Sarkome mit endothelialer Differenzierung verwendet, egal ob
die Läsion im Bezug zu vaskulärem oder lymphangischem Endothel steht
(Weiss and Goldblum, 2001).
Das kutane Angiosarkom entsteht in den meisten Fällen de novo, wobei Männer häufiger betroffen sind als Frauen (Holden et al., 1987; Meis-Kindblom and
Kindblom, 1998; Weiss and Goldblum, 2001; Pawlik et al., 2003).
Bei der histologischen Aufarbeitung findet sich oft eine tiefe Infiltration des
Weichgewebes (Girard and Johnson, 1970; Hodgkinson et al., 1979; Jones,
1976).
Kutane Angiosarkome zeigen eine bessere Prognose als zum Beispiel Angiosarkome tiefer Weichgewebe oder Organe. Die Therapie besteht aus aggressiver chirurgischer Resektion und Bestrahlung (Morrison et al., 1995; Verleysen
et al., 2000; Chan et al., 2001; Abraham et al., 2007). Auch der kombinierte Einsatz von Interferon-α2b und Paclitaxel scheint eine gute Wirkung zu zeigen
(Fata et al., 1999; Schneider et al., 2006). Die Fünfjahres-Überlebensrate
kutaner Angiosarkome ist sehr gering (Morrison et al., 1995; Pawlik et al. 2003).
Die meisten Patienten versterben schon nach wenigen Monaten. Wichtigste Pa7
rameter für die Prognose sind Tumorgröße und Infiltrationstiefe (Holden et al.,
1987; Kutzner, 2005). Auch das Alter spielt eine Rolle. So ist nach Pawlik et al.,
2003 die Prognose für Patienten jüngeren Alters besser.
Seit einigen Jahren mehren sich Studien, denen zufolge die Tumorzellen der
Angiosarkome nicht nur Oberflächenrezeptoren aufweisen, die denen des Hämangioendothels entsprechen, sondern auch eine lymphangioendotheliale Differenzierung aufzeigen (Breitender-Geleff et al., 1999 a, 1999 b; Kahn et al.,
2002; Kaiserling, 2004). So exprimieren viele Angiosarkome das CD34-Antigen,
das von Lymphangioendothel mehrheitlich nicht exprimiert wird (Ramani et al.,
1990; Traweek et al., 1991; Meis-Kindblom and Kindblom, 1998) und reagieren
gleichzeitig positiv mit Markern lymphangischen Endothels
(Breitenender-
Geleff et al., 1999 a; Kahn et al., 2002; Kaiserling, 2004; Ordonez, 2005). Eine
Erklärung ist der mögliche gemeinsame Ursprung aus unreifen endothelialen
Vorläuferzellen (Breiteneder-Geleff et al., 1999 a).
Wichtig ist daher eine auf immunhistologischer Untersuchung basierende Diagnostik, da es sich bei Tumoren, die in der konventionellen HE-Färbung als Angiosarkome diagnostiziert werden, auch um Lymphangiosarkome handeln kann.
Nach einem Fallbericht von Danz et al. (2005) sprechen lymphödem-assoziierte
Angiosarkome beziehungsweise immunhistologisch gesicherte Lymphangiosarkome gut auf eine Bestrahlungstherapie an.
Spezifische lymphangioendotheliale Marker sind seit einiger Zeit kommerziell
erhältlich. Dabei handelt es sich um den Antikörper D2-40 (gegen das Antigen
M2A) und den Antikörper gegen Podoplanin.
1.2
M2A / D2-40
Das oncofetale Antigen M2A ist ein monomeres Oberflächensialoglykoprotein
mit einem Molekulargewicht von 40-kD (Bailey et al., 1986; Marks et al., 1999).
Der monoklonale M2A-Antikörper wurde ursprünglich gegen die humane ovariale epitheliale Adenocarcinoma-Zelllinie HEY entwickelt. Hierbei entdeckte
man, dass dieser Antikörper auch mit Zelllinien von testikulären und ovarialen
Stammzellen, Keimzellen im fetalen Hoden, Seminomen und Dysgerminomen
8
(ovarial und testikulär) reagierte. Auch Kapillarendothel wies eine schwache
Färbung auf (Bailey et al., 1986).
Marks et al. (1999) entwickelten 1999 ein Panel monoklonaler Antikörper aus
M2A (IgG2a), D1-26 (Ig2b) und D2-40 (IgG1) mit dem Ziel, das M2A-Antigen
weiter zu charakterisieren und dessen Verteilung in Keimzelltumoren zu studieren. Dabei stellten sie fest, dass der Antikörper D2-40 als einziger keine Sialidacid-Reste brauchte, um an das Antigen zu binden.
Im Jahr 2002 postulierte Kahn et al. (2002), mit dem monoklonalen D2-40-Antikörper einen Marker gefunden zu haben, der in Paraffinschnitten selektiv
lymphangisches Endothel detektiert und der in einer Vielzahl von KaposiSarkomen und einigen Angiosarkomen positiv reagiert. Reaktionen mit
Blutgefäßendothel wurden auch in weiteren Studien nicht beobachtet (Kahn et
al., 2002; Kahn and Marks, 2002; Franke et al., 2004; Kaiserling, 2004;
Fukanaga, 2005; Sonne et al., 2006, Yaita et al., 2007). Hansen et al. (2007)
berichten nach ihren Studien an Lymphangioleiomyomen / Lymphangioleiomyomatosen mit D2-40 einen guten Marker für vaskuläre Weichgewebstumoren
zur Verfügung zu haben, mit dem lymphangioendotheliale Gefäßtumoren diagnostiziert werden können.
1.3
Podoplanin
In kultivierten humanen lymphangischen Endothelzellen ist Podoplanin eines
der am stärksten exprimierten spezifischen Antigene des lymphangischen Endothel (Hirawaka et al., 2003).
Die Expression von Podoplanin wurde als Antigen E11 zum ersten Mal 1996
von Wetterwald et al. beschrieben. Ein monoklonaler Antikörper gegen E11
färbte nicht nur Osteozyten und Osteoblasten im Knochengewebe, sondern
auch alveoläre Zellen vom Typ I und Endothelzellen von Lymphgefäßen. Der
Name Podoplanin für das 43-kD Mukoprotein entstand aufgrund zahlreicher Untersuchungen an Podozyten der Niere (Breiteneder-Geleff et al., 1997; Matsui
et al., 1998). Umfangreiche Untersuchungen an verschiedenen menschlichen
Geweben zeigten, dass das reichlich O-glykolysierte Glykoprotein vom Mucintyp sowohl in gesunden, als auch in tumorösen lymphangischen Endothelien,
9
nicht aber in Blutgefäßendothelzellen exprimiert wird (Kriehuber et al., 2001;
Matsui et al., 2003; Evangelou et al., 2005; Sonne et al., 2006). Analog zu Wetterwalds Ergebnissen fand man Podoplanin auch in nicht-endothelialen Zellen
(Schacht et al., 2005).
Die Funktion von Podoplanin ist noch nicht vollständig bekannt. Aufgrund seiner
chemischen Struktur und seines Vorkommens in Gallengangsepithelien, Podozyten und Alveolarzellen vom Typ I wird ihm eine protektive Wirkung in externen und internen Flüssigkeitskompartimenten nachgesagt. Studien an Podoplanin-defizienten Mäusen zeigten Defekte in der Formation lymphangischer
Gefäße mit anschließender Entwicklung eines kongenitalen Lymphödems. Es
wurde keine Wirkung auf die Entwicklung von Blutgefäßen beobachtet.
Man vermutet, dass Podoplanin in der Progression epithelialer Tumoren eine
Rolle spielt (Schacht et al., 2003, 2005).
1.4
CD34 (human hematopoietic progenitor cell antigen)
In ihrem Review beschreiben Krause et al. (1996) CD34 (human hematopoietic
progenitor cell antigen) als ein oberflächliches Glykophosphoprotein, welches
von sich entwickelnden frühen lympho-hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen, Endothelzellen kleiner Gefäße und embryonischen Fibroblasten exprimiert wird. Der monoklonale CD34-Antikörper wurde bei der Suche nach einem
Marker entdeckt, der spezifisch nur unreife humane Knochenmarkzellen erkennt, nicht aber reife Blut- oder lymphatische Zellen (Civin et al., 1984; Katz et
al., 1985; Andrews et al., 1986).
Der in der hier vorgelegten Studie verwendete Klon QBEND/10 wurde ursprünglich gegen humane plazentare Endothelzellen eingesetzt und bindet an
ein monomeres 110-kD Glykoprotein (Fina et al., 1990). Er ist ein Marker für
Zellen endothelialer Differenzierung, der demzufolge auch mit Angiosarkomzellen positiv reagiert (Ramani et al., 1990). In der Leukämieforschung wird er zur
Detektion CD34-positiver hämatopoietischer Stammzellen eingesetzt, wobei die
in Biopsien positiv reagierenden vaskulären Endothelzellen hier lediglich als
interne Positivkontrollen gewertet werden (Horny et al., 1995).
10
Das Vorkommen des CD34-Antigens sowohl in hämatopoietischen als auch in
lymphangischen Endothelzellen lässt einen gemeinsamen Ursprung dieser Zellen vermuten (Schlingemann et al., 1990). Angiosarkome zeigen zum Teil eine
uneinheitliche Expression von CD34 (Kuzu et al., 1992; Chan et al., 2001). So
fand man positive Reaktionen in Endothelien von Kapillaren, Venen und
Arterien und uneinheitlich positive Reaktionen im lymphangischen Endothel
(Miettinen et al., 1994). Entgegen der Beobachtungen von Regezi et al. (1992),
die eine CD34-Färbung nur in kleinen Blutgefäßen von gesunden und
tumorösen Gewebe und keine Färbung von lymphangischen Endothel in
Lymphangiomen beschreiben, berichten Sauter et al. (1998) von luminalen und
abluminalen CD34-Expressionen von Zellmembranen der Endothelien lymphangischer Kapillaren in gesunder Haut und Lymphangiomen. In dermalen
mikrovaskulären lymphangischen Endothelzellen konnten Kriehuber et al.
(2001) durch simultane Färbung positive Reaktionen mit CD34 und dem Marker
für Lymphangioendothel, dem Podoplanin, beobachten. Fiedler et al. (2006)
berichteten, dass CD34 neben tumorösen Hämangioendothelzellen auch
intratumoral von LYVE-1-positiven und peritumoral von Podoplanin-positiven
lymphangischen Endothelzellen exprimiert wird.
11
2
Ziel der Untersuchung
In der Literatur wird seit einiger Zeit eine Mischdifferenzierung aus lymphangischem und hämangischen Endothel in einer Vielzahl von Angiosarkomen verschiedenster Lokalisationen beschrieben (Breitenender-Geleff et al.,1999 a,
1999 b; Kahn et al., 2002; Kaiserling, 2004).
Im ersten Teil dieser Studie soll die Ausprägung einer etwaigen lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung für Angiosarkome der Haut untersucht
werden. Dazu wurde folgende Haupthypothese aufgestellt: Der Anteil der
lymphangioendothelial mischdifferenzierten Angiosarkome am untersuchten
Kollektiv liegt über 55%.
Weiterhin soll überprüft werden, ob der bereits seit einiger Zeit etablierte lymphangioendothelial-spezifische Antikörper D2-40 und der erst seit vergleichsweise
kurzer Zeit kommerziell erwerbbare lymphangioendothelial-spezifische Antikörper gegen Podoplanin die Tumorzellen in gleicher Weise markieren und daher
gleichwertig in der immunhistochemischen Diagnostik eingesetzt werden
können (Nebenhypothese: Podoplanin ist ein ähnlich guter Marker wie D2-40).
Sowohl die Haupt- als auch die Nebenhypothese wurden mittels computergestützter Analyse (Automated Cellular Image System, ACIS) und mittels
manueller Mikroskopie überprüft.
Des Weiteren sollte eine mögliche Veränderung der häm- beziehungsweise
lymphangioendothelialen Tumordifferenzierung bei Angiosarkomrezidiven untersucht werden. Hierfür wurden Patienten mit zwei und mehr Tumorrezidiven
zu einer Gruppe zusammengefasst und die Ausprägung der Podoplanin- und
D2-40-Expression im zeitlichen Verlauf - betrachtet von der ersten Probenentnahme an - begutachtet.
Anschließend soll die manuelle Mikroskopie mit der computergestützten Analyse (ACIS) der Präparate unter dem Aspekt einer weiteren Verbreitung von ACIS
in der täglichen pathomorphologischen Diagnostik verglichen werden.
12
3
Material
3.1
Untersuchungsgut
Bei dem Untersuchungsgut handelte es sich um insgesamt 58 formalinfixierte
und in Paraffin eingebettete Proben mit malignen dermalen Angiosarkomen von
32 Patienten. Die Diagnose basierte auf der HE-(Hematoxylin-Eosin)- Färbung
und wurde mehrheitlich ergänzt durch immunhistochemische Färbungen mit
den Antikörpern gegen vWF (von Willlebrand Faktor) und CD31, teils auch
CD34. Es handelte sich dabei um insgesamt 58 diagnostizierte Angiosarkome,
wobei sich darin 50 nicht weiter spezifizierte Angiosarkome, 4 epitheloide Angiosarkome, 1 benignes juveniles Angiosarkom, 1 spindelzelliges
Angiosar-
kom, 1 kaposiformes Angiosarkom und 1 Hautmetastase eines Angiosarkoms
fanden (Abb. 1).
Von 14 Patienten lagen aufgrund von Rezidiven mehr als eine Probe vor (von 7
Patienten 2, von 3 Patienten 3, von 3 Patienten 4 und von 1 Patienten 5 Proben). Für die Überprüfung der Haupt- und Nebenhypothese wurde bei diesen
Patienten nur die jeweils erste Probe herangezogen (n = 32). Diese Untersuchungsreihe wurde mit dem Begriff “1. Serie“ gekennzeichnet. Die Proben von
Patienten, bei denen 3 Proben und mehr vorlagen, wurden unter der Frage
eventueller Veränderungen der endothelialen (Misch-) Differenzierung im Rezidivverlauf gesondert betrachtet (n = 7).
Alle Proben waren im Rahmen der (diagnostischen) operativen Resektion in der
Fachklinik Hornheide, Münster-Handorf, zwischen 1984 und 2003 entnommen
worden.
Art des Untersuchungsgutes
4
1 1
1
Angiosarkome
epitheloide
Angiosarkome
1
benigne juvenile
Angiosarkome
spindelzellige
Angiosarkome
50
kaposiforme
Angiosarkome
Hautmetastase eines
Angiosarkoms
Abb. 1:
Art des Untersuchungsgutes: den Hauptanteil bilden nicht weiter spezifizierte
Angiosarkome.
13
Nach der Lokalisation der Probenentnahme stammten 39 Proben vom Kopf, 4
vom Rumpf, 8 von einer oberen Extremität, 5 von einer unteren Extremität und
2 von anderen Regionen (Gesäß, Mons pubis) (Abb. 2).
Lokalisation der Probenentnahme
5
2
Kopf
8
Rumpf
obere Extremität
4
Abb. 2:
untere Extremität
39
andere Lokalisation
Lokalisation der Probenentnahmen: der überwiegende Anteil der Proben stammt
von der Kopfregion.
Die Patientengruppe setzte sich zusammen aus 20 Männern im Alter von 15 bis
81 Jahren und 12 Frauen im Alter von 48 bis 87 Jahren (Abb. 3 und Abb. 4).
Verteilung Männer / Frauen
25
20
20
15
12
10
5
0
Männer
Abb. 3:
Frauen
Verhältnis Männer zu Frauen im Patientengut: der Anteil der männlichen
Patienten überwiegt.
14
Alter (Jahre)
Altersverteilung
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Frauen
Abb. 4:
3.2
Männer
Altersverteilung der Patienten: es handelt sich um ein überwiegend älteres
Patientenkollektiv.
Geräte
- ACIS: ChromaVision Medical Systems, San Juan Capistrano, USA
- Feuchte Kammer: Aufbewahrungsbox; Tupperware Deutschland GmbH,
Frankfurt
- Kunststoffküvette für Mikrowelle: DAKO, Glastrup, DK
- Kühlschrank / Gefriertruhe: Liebherr Hausgeräte Ochsenhausen GmbH,
Ochsenhausen
- Lichtmikroskop: Carl Zeiss, Jena
- Mikrowelle: Robert Bosch Hausgeräte GmbH, München
- Schlittenmikrotom SM2000R: Leica, Bensheim
- Superfrost-Objektträger: Menzel, Braunschweig
- TechMate 500: DAKO, Glastrup, DK
- Wärmeschrank: Memmert, Schwabach
3.3
Reagenzien
- ABC-System: VECTASTAIN Elite ABC - Peroxidase Kit Standard, Vector,
Burlingame, USA
15
- Alkohol: 2-Propanol; Carl Roth, Karlsruhe
- Antibody-Diluent: Dako REAL Antibody Diluent, DAKO, Gastrup, DK
- APAAP-System: Dako REAL Detection System APAAP, Mouse,
DAKO,
Gastrup, DK
- Aqua dest.: B. Braun Melsungen AG, Melsungen
- 1%-ige BSA / PBS: BSA, MP Biomedicals, Irvine, USA;
PBS,GIBCO Invitrogen, Carlsbad, USA
- Citratpuffer pH 6,0: Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, Merck, Darmstadt
- DAB (3,3’ Diaminobenziden): DAB Substrate Kit, Vector, Burlingame, USA
- Eukitt: Hico-Mic, Hirtz & Co., Köln
- Hematoxylin: DAKO REAL Hematoxylin, DAKO, Gastrup, DK
- Mayers-Hämalaun: Merck; Darmstadt
- Normalserum (Horse): Vector, Burlingame, USA
- PBS-Puffer pH 7,2: D-PBS, GIBCO Invitrogen,Carlsbad, USA
- Perhydrollösung 0,3%: Perhydrollösung 30%, Merck, Darmstadt
- Roti-Histol: Carl Roth, Karlsruhe
- TBS-Puffer pH 7,4: Tris(-hydromethyl-)aminomethan, NaCl, Merck, Darmstadt
- Tris-HCl-Puffer 50 mM: Tris(-hydromethyl-)aminomethan, 1 N HCl, Merck,
Darmstadt
- Trypsinlösung 0,001%: Trypsin, Sigma-Aldrich, Hamburg;
CaCl2 x 2H2O, Merck, Darmstadt
- Waschpuffer für APAAP Methode: DAKO REAL Buffer Kit, DAKO, Gastrup,
DK
- Xylol: Merck, Darmstadt
Tab. 1:
Verwendeter Antikörper, Klon, Isotyp, Verdünnung und Hersteller.
Antikörper Klon
Isotyp
Verdünnung
Firma
CD34
QBEND 10
IgG1
Mouse
1:200
mit 1% BSA / PBS
Immunotech,
Marseille, F
D2-40
D2-40
IgG1
Mouse
1:50 mit Antibody- DCS/Signet,
Diluent
Hamburg
IgG1
Mouse
1:100
mit 1% BSA / PBS
Podoplanin 18H5
AcrisAntibodies,
Hiddenhausen
16
4
Methode
4.1
Immunhistochemische Aufarbeitung der Präparate
4.1.1 Anfertigung der Schnittpräparate
Nach Formalinfixierung und Einbettung in Paraffin wurden von den Paraffinblöcken Schnitte einer Dicke von 3 - 4µm angefertigt und auf Superfrost-Objektträger der Firma Menzel aufgezogen. Für eine bessere Haftung der Schnitte auf
dem Objektträger wurden die Präparate über Nacht bei 60°C in einem Wärmeschrank getrocknet.
Nach der Entparaffinierung in Xylol (dreimal fünf Minuten) und der Rehydrierung
in einer absteigenden Alkoholreihe (je fünf Minuten) wurden die Schnitte zur
weiteren Hydrierung in destilliertes Wasser gestellt.
4.1.2 Demaskierung
Die Formalinfixierung verursacht eine Proteinvernetzung im Gewebe. Diese
kann dazu führen, dass Epitope maskiert und somit nicht mehr von dem Antikörper erkannt werden können. Damit sich der Antikörper anlagern kann, muss
daher das antigene Epitop demaskiert werden.
Für die so genannte Hitzedemaskierung wurden die Schnitte in mikrowellengeeignete Plastikküvetten mit Citratpuffer (10 mM) gestellt und fünf mal fünf Minuten in einer Mikrowelle bei 600Watt erhitzt. Bei diesem Schritt war darauf zu
achten, dass die Objektträger immer komplett von Flüssigkeit umgeben waren
und somit
nicht austrocknen konnten.
Daher wurde die verdunstete
Puffermenge nach jeweils fünfminütigem Erhitzen mit kaltem Citratpuffer wieder
aufgefüllt.
Im Anschluss kühlten die Schnitte in der Flüssigkeit noch mindestens fünfzehn
Minuten aus, bevor die Präparate zum CD34- / beziehungsweise PodoplaninAntigen-Nachweis für weitere fünf Minuten in Phosphate-buffered saline (PBS;
pH 7,4), beziehungsweise in Tris-buffered saline (TBS) für den Nachweis des
D2-40-Antigens, eingestellt wurden. Für den Nachweis des CD34-Antigens erfolgte eine zusätzliche enzymatische Vorbehandlung mit dem proteolytischen
Enzym Trypsin (0,001%). Die Trypsinierung erfolgte mittels auf 37°C vorgewärmter Trypsinlösung für zehn Minuten.
17
Nach dreimaligem Spülen mit destilliertem Wasser wurden die Präparate erneut
in TBS- / beziehungsweise PBS-Puffer gestellt.
4.1.3 Blockierung
Aufgrund des Vorkommens der endogenen Peroxidase in Granulozyten, Erythrozyten und Mastzellen (aber auch zum Beispiel im Epithel des Dünndarms
und in Nervenzellen), muss zum Ausschluss von Fehlinterpretationen diese
blockiert werden. Die endogene Peroxidase bildet mit dem Substratpuffer, H2O2
als Katalysator und dem Chromogen 3,3’ Diaminbenzidin-Tetrahydrochlorid
(DAB) ein farbiges Endprodukt, welches nicht vom Endprodukt der eigentlichen
Reaktion des verwendeten ABC-Systems mit Peroxidase zu unterscheiden ist.
Um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die CD34- und Podoplanin-Präparate vor der eigentlichen Färbung für dreißig Minuten in einer 0,3%igen Perhydrol-Lösung inkubiert.
Nachdem die Schnitte in Leitungswasser und destilliertem Wasser gespült wurden, wurden sie in Tris-buffered saline gestellt.
Um unspezifische Antikörperbindungsstellen abzusättigen und somit falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, wurden alle Präparate vor dem Aufbringen des
Primär-Antikörpers mit 100μl Normalserum vom Pferd beträufelt [Verdünnung
bei Verwendung von D2-40: Serum mit Antibody Diluent der Firma DAKO 1:5
bis 1:10; Verdünnung bei Verwendung von CD34 und Podoplanin: 1ml Phosphate-buffered saline / Bovine Serum Albumin (PBS / BSA) 1% + 15μl Serum].
Nach halbstündiger Inkubation in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur
wurde das Normalserum abgeklopft.
4.1.4 Immunhistochemische Färbung von CD34 und Podoplanin
Die immunhistochemische Färbung mit den Antikörpern CD34 und Podoplanin
erfolgte mittels der Avidin-Biotin-Enzym-Komlex-Methode (ABC-Methode). Der
ABC-Komplex ist ein Komplex aus Avidin und biotinyliertem Enzym. Avidin besitzt eine hohe Affinität zu Biotin, von dem es bis zu vier Moleküle binden kann.
Die Immunreaktion erfolgt in mehreren Schritten. Nach Applikation und
Inkubation des unkonjugierten Primär-Antikörpers wird in einem zweiten Schritt
18
der biotinylierte Sekundär-Antikörper aufgetragen. Nach erneuter Inkubation
wird das mit einem Enzym gebundene Avidin dazugegeben. Das Enzym katalysiert das Substrat, welches die Reaktion durch Färbung sichtbar macht. Das
Nachweisenzym ist Peroxidase, das Substrat 3,3’ Diaminbenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB).
Gefärbt wurde manuell bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer.
Zuerst wurden jeweils 100μl der mit Phosphate-buffered saline / 1% Bovine Serum Albumin vorverdünnten Primär-Antikörper auf die Präparate pipettiert und
für eine Stunde inkubiert. Bei den Antikörpern gegen CD34 und Podoplanin
handelt es sich um monoklonale Antikörper von der Maus. Sie wurden in einer
Verdünnung mit PBS / 1% BSA von 1:200 für CD34 und 1:100 für Podoplanin
auf die Schnitte pipettiert. Nach Spülen der Schnitte mit PBS erfolgte die Inkubation des biotinylierten Sekundär-Antikörpers (anti-Maus aus dem Pferd) für
eine weitere halbe Stunde.
Nachdem erneut mit PBS gespült wurde, folgte die Nachweisreaktion mittels
ABC-Komplex mit Peroxidase. Der Komplex wurde dreißig Minuten vor Gebrauch angesetzt. Die Inkubationszeit betrug zwanzig Minuten.
Das Chromogen DAB für die Farbreaktion wurde erst kurz vor dem Gebrauch
angesetzt. Im Anschluss an das Spülen in PBS erfolgte die Färbung unter
Sichtkontrolle und dauerte maximal zehn Minuten pro Schnitt. Die Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun erfolgte nach Spülen in destilliertem Wasser für
fünfzehn bis dreißig Sekunden.
Nachdem die Schnitte in Leitungswasser für etwa zehn Minuten gebläut wurden, schloss sich die Dehydrierung in einer aufsteigenden (50%, 70%, 96%,
100%) Alkoholreihe an.
Anschließend wurden die Objektträger über Roti-Histol mit Eukitt eingedeckt.
4.1.5 Immunhistochemische Färbung von D2-40
Das Antigen M2A, nachgewiesen mit dem Antikörper D2-40, wurde mittels der
APAAP-Methode untersucht.
Die APAAP-Methode (Alkalische Phosphatase anti-Alkalische Phosphatase Methode), die seit der Publikation von Cordell et al. (1984) breite Anwendung in
der Immunhistochemie gefunden hat, wird hauptsächlich zur Bestimmung von
19
Rezeptoren, Neurotransmittern, Peptidantigenen, Wachstumsfaktoren, Immunglobulinen und Proliferationsmarkern benutzt.
Die endogene alkalische Phosphatase-Aktivität des Gewebes wird hier durch
den Zusatz von Levamisol zur Substratlösung unterdrückt, ohne andere Antigene zu denaturieren. Zudem kann bei dieser Färbetechnik die Stärke der Farbreaktion durch wiederholtes Auftragen des Brückenantikörpers und des APAAPKomplexes gesteigert werden. Die wiederholte Applikation bringt zusätzliche
Enzymmoleküle an die Antigenbindungsstelle und bewirkt daher bei der Umwandlung der Phosphatase durch das anschließend aufgetragene Fast RedChromogen eine intensivere Färbereaktion.
Die immumhistochemische Färbung erfolgte bei Raumtemperatur im Färbeautomaten TechMate 500 der Firma DAKO.
Bei dem Antikörper handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper von der
Maus in einer Verdünnung von 1:40 mit Antikörper-Diluent. Der Primär-Antikörper wurde fünfundzwanzig Minuten inkubiert und anschließend mit Spülpuffer
(DAKO) abgespült.
Dann erfolgte die Inkubation mit dem gebrauchsfertigen Brücken-Antikörper
(LINK, APAAP-Kit, DAKO), einem Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin für weitere fünfundzwanzig Minuten und nach erneutem Spülen mit Spülpuffer, die Inkubation der Schnitte mit dem ebenfalls gebrauchsfertigen APAAP-Komplex
(APAAP Kit, DAKO), wiederum für fünfundzwanzig Minuten.
Zur Verstärkung des Farbsignals wurde nach erneutem Spülen mit Puffer der
Brücken-Antikörper sowie der APAAP-Komplex für jeweils weitere zehn Minuten auf die Schnitte gegeben.
Auch bei dieser Methode wurde das Chromogen, in diesem Fall der Azofarbstoff Fast Red, erst kurz vor dem Gebrauch angesetzt und für zehn Minuten inkubiert. Das Blockieren der endogenen alkalischen Phosphatase wurde, wie
schon erwähnt, mit Levamisol (APAAP Kit, DAKO), das der Substratlösung zugesetzt wurde, durchgeführt.
Die Inkubationszeit betrug viermal fünf Minuten. Zwischen jedem dieser Schritte
wurden die Präparate immer mit Puffer gespült.
Auch hier erfolgte nach einem letzten Spülen in destilliertem Wasser die Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun mit anschließender Dehydrierung, gefolgt
vom Eindecken der Präparate mit Eukitt.
20
4.2
Negativ- und Positivkontrollen
Bei immunhistochemischen Untersuchungen werden zum Nachweis der Gültigkeit der Ergebnisse Negativ- und Positivkontrollen mitgeführt. Negativkontrollen
dienen dem Ausschluss falsch positiver Ergebnisse, Positivkontrollen dem Ausschluss falsch negativer Ergebnisse.
Um falsch positive Ergebnisse nachzuweisen und somit die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktion zu gewährleisten, wurden bei allen Färbungen Negativkontrollen mitgeführt. Dafür wurde an Stelle des Primärantikörpers eine Negativkontrolllösung auf ein Schnittpräparat appliziert. Im Falle einer positiven
Reaktion würde es sich um eine unspezifische Reaktion als Folge einer
fehlerhaften Probenvorbereitung oder fehlerhafter Reagenzien handeln. Der
Färbevorgang müsste in diesem Fall wiederholt werden.
In Schnittpräparaten der Haut findet man reichlich vaskuläres und lymphatisches Endothel. Daher bedienten wir uns hier der so genannten internen Positivkontrolle. Positive Reaktion des Blutgefäßendothels mit dem Antikörper gegen CD34 und des lymphangischen Endothels mit dem Antikörper D2-40 beziehungsweise dem Antikörper gegen Podoplanin im gesunden Gewebe bestätigen die Sensitivität der Antikörper und korrekte Behandlung der Proben, beziehungsweise Umgang mit den Reagenzien.
21
4.3
Computergestützte Auswertung der immunhistochemischen Färbung
Abb. 5:
Automated Cellular Image System ACIS: in der rechten Bildhälfte die ACIS
Workstation, in der die Präparate eingescannt und analysiert werden; auf der
linken Seite der angeschlossene Computer, in dem die Daten auf Plausibilität
geprüft und gespeichert werden können.
Das Automated Cellular Image System (ACIS, ChromaVision, San Juan Capistrano, CA) ist ein Bild-Analyse-System, welches, laut Hersteller, eine schnelle,
zuverlässige und reproduzierbare Analyse immunhistochemisch gefärbter Präparate erlaubt. Ursprünglich zur rare-event Detektion entwickelt, das heißt zum
Nachweis einzelner positiv gefärbter Zellen, wurde das System zu einer Methode quantitativer Analyse von immunhistochemisch gefärbten Präparaten überarbeitet und in diesem Sinn diagnostisch erstmals zur quantitativen Analyse von
HER-2 eingesetzt (Instrumention Development, 2003; Cregger et al., 2006).
Nach Studien zur Detektion okkulter Knochenmetastasen (Bauer et al., 2000)
oder
zirkulierender
Tumorzellen
bei
Patientinnen
mit
Mammacarcinom
(Bauernhofer et al., 2005), zur Untersuchung nukleärer Antikörper, wie ki-67,
p53 und p120 (Hilbe et al., 2003) und zur Kontrolle der HER-2 Therapie (Instrumention Development, 2003; Bloom and Harrington, 2004; Tawfik et al., 2006),
ist dieses System laut Literatur mit der konventionellen manuellen Auswertung
22
des Pathologen mittels Mikroskop vergleichbar und in einigen Bereichen sogar
besser. Die Vorteile liegen laut Literatur in der Reproduzierbarkeit (Instrumention Development, 2003; Witzig et al., 2002; Hilbe et al., 2003) und der guten
Quantifizierung (Instrumention Development, 2003; Bauernhofer et al., 2005).
Anders als bei der subjektiven Auswertung des Pathologen, liefere ACIS durch
Standardisierung vergleichbare Ergebnisse (Instrumention Development, 2003).
Einschränkend wird in der Literatur angemerkt, dass Proben mit nicht plausiblen
(ACIS-) Ergebnissen auf Artefakte (Lufteinschlüsse im Eindeckmedium, schwache Färbung, zu dünne Schnitte oder ähnliches) untersucht und ausgeschlossen werden müssen (Witzig et al., 2002; Hilbe et al., 2003). Des Weiteren kann
Hintergrundfärbung zu falsch positiven Messergebnissen führen (Grupka et al.,
2004). Jedoch erlaubt die Bildanalyse auch, diese durch Festlegen von Schwellenwerten für die Farbintensität herauszufiltern (Divi et al., 2001).
Der Arbeitsablauf des ACIS für die hier vorliegende Arbeit ist relativ einfach.
Nach Erstellen einer Arbeitsliste, in der die Fallnummer des Präparates und der
zu untersuchende Marker eingegeben wird, werden die gefärbten Objektträger
zur Identifikation jeweils mit einem Barcode versehen und in eine entsprechende Halterung der ACIS Workstation für insgesamt vier Objektträger
eingespannt. Danach wird der mit den Objektträgern beladene Träger in die Ladestation des Gerätes eingelegt. Nach automatischem Einscannen des Barcodes werden die Objektträger automatisch in den Mikroskopierbereich weiter
transportiert. Dort werden die einzelnen Präparate in kleinster Vergrößerung
(10x) komplett automatisch von einem Hellfeld-Mikroskop mit angeschlossener
digitaler Kamera durchgemustert. Die CCD- (Charged-Coupled Device) Kamera
erzeugt ein Spannungssignal proportional zur ausgesendeten Lichtintensität,
welches dann in eine numerische Dichtemessung (Intensität) konvertiert wird.
Aufgrund der Programmierung ist sicher gestellt, dass jede Region des Objektträgers gemustert wird. Simultan werden Level des Farbtons, der Farbsättigung
und der Helligkeit detektiert. In der vorliegenden Studie wurden, basierend auf
spezifischen Kriterien wie Farbe, Farb- beziehungsweise Chromogenintensität,
Größe, Lokalisation und Form, die Menge der Tumorzellen sowie auch der Hintergrund ausgewertet. Die nach diesen Kriterien charakterisierten positiven Bereiche werden erneut in einer höheren Vergrößerung (40x, 60x) analysiert. Die
23
gescannten Bilder (”Images”) und Analysedaten werden nach dem Importieren
in den angeschlossenen Computer auf Plausibilität, zum Beispiel extreme
Werte verursacht durch Artefakte, überprüft und anschließend gespeichert
(Abb. 5; Abb. 7; Abb. 8; Abb. 9).
Der Auswertung lag das so genannte EGFR-Programm zugrunde. Dieses Programm wurde ursprünglich zur immunhistochemischen Messung von mittels
Antikörper gegen EGFR (epidermal growth factor receptor) gefärbten Präparaten erstellt. Für die vorliegende Studie wurde es so bearbeitet, dass es allgemein zur Messung von immunhistochemisch gefärbten Membranen sowie zytoplasmatischen Anfärbungen eingesetzt werden kann. Gemessen wurde neben
der Größe der positiv gefärbten Tumorfläche auch deren Farbintensität,
definiert als Graustufen von 0 bis 255. Sowohl die (immunhistochemisch)
gefärbte Tumorfläche als auch die Farbintensität wurden von dem Programm in
einem Mittelwert angegeben.
Da ACIS Hohlräume, Spalten, Fettzellen, Gefäßlumina artifiziell, bedingte Spalten (Abb. 6) und ähnliches - wie zum Beispiel mit D2-40 nicht gefärbtes Tumorstroma - innerhalb der immunhistochemisch gefärbten Tumorfläche automatisch
als ungefärbt und damit als negativ bewertet, kann nie eine 100% positiv gefärbte Tumorfläche gemessen werden. Das bedeutet, dass der tatsächliche
Wert der Tumorfläche stets über dem ACIS-Wert liegt. Daher ist bei hohen
ACIS-Werten auch die Wahrscheinlichkeit größer, einen Wert zu erhalten, der
dem wahren Wert nahe kommt. Dabei handelt es sich um einen systematischen Fehler, der alle Messungen (D2-40, Podoplanin und CD34) betrifft.
Abb. 6:
Beispiel für Artefakte: artifizielle Spalten im Gewebe werden automatisch als
immunhistochemisch nicht gefärbte Tumorflächen gewertet.
24
Des Weiteren ist zu berücksichtigen, dass die positiv reagierenden Endothelzellen der Gefäße im Tumorstroma (interne Positivkontrolle) vom Computer als
positive Reaktion mit gemessen werden. Dadurch ergeben sich in Fällen mit
zum Beispiel fehlender D2-40-Tumorreaktion, sehr niedrige, aber dennoch positive Messwerte.
Um die Werte der quantitativen ACIS-Messung mit denen der manuellen Mikroskopie vergleichen zu können, wurde die vom ACIS-System ermittelte Färbeintensität (0 - 100) in einen Score von 0 bis 3 überführt: 0 = 0; 1 bis 33 = 1;
34 bis 66 = 2 und 67 bis 100 = 3. Anschließend wurde zur Bestimmung des Immunreaktivitätsscores (IRS), das heißt einem Wert, in den die immunhistochemisch gefärbte Fläche sowie die Farbintensität eingeht, mit der Intensität multipliziert und durch 100 dividiert.
25
Abb. 7:
Beispiel für ein ACIS-Auswertungsprotokoll des Tumormarkers D2-40: Obere
Protokollhälfte: Angaben zum Patienten, Befunder / Arzt; zur Probe, Datum des
Protokolls, der Originalfallnummer und des zu untersuchenden Markers (D2-40).
Mittlerer Protokollabschnitt: Analysewerte für Intensität und Anteil der immunhistochemisch positiv reagierenden Tumorfläche. Unterer Protokollabschnitt:
Bildausschnitt (links) und graphische Darstellung des Anteils der positiv reagierenden Tumorfläche (rechts).
26
Abb. 8:
Beispiel für ein ACIS-Auswertungsprotokoll für die Messung der CD34Expression.
27
Abb. 9:
Beispiel für ein ACIS-Auswertungsprotokoll für die Messung der PodoplaninExpression.
28
4.4
Manuelle Mikroskopie:
Ermittlung des Immunreaktivitätsscore (IRS)
Die Auswertung von D2-40 und Podoplanin mittels manueller Mikroskopie erfolgte mittels eines Lichtmikroskopes der Firma Zeiss. Die Präparate wurden je
viermal mikroskopiert und jeweils der Prozentsatz gefärbter Tumorfläche mit der
immunhistochemischen Farbintensität multipliziert und durch 100 dividiert. Als
Ergebnis erhielt man einen Wert, der als Immunreaktivitätsscore (IRS) bezeichnet wird. Aus den vier IRS-Werten wurde jeweils ein Mittelwert errechnet.
Da die untersuchten Angiosarkome fokal unterschiedlich starke Anfärbungen
aufwiesen, wurden bei der manuellen Mikroskopie fokal unterschiedliche Werte
für die Farbintensität und die dazugehörige Tumorfläche berücksichtigt. So wurde vom Untersucher pro Präparat jeweils ein Mittelwert aus den unterschiedlich
angefärbten Tumorarealen gebildet. Dazu wurde der Prozentsatz der mit einer
bestimmten Farbintensität markierten Tumorfläche mit der Farbintensität multipliziert. Bei der manuellen Mikroskopie wurde immer eine Gesamttumorfläche
von 100% zugrunde gelegt, da auch die mit D2-40 oder Podoplanin negativ reagierenden Tumorflächen, wie zum Beispiel Tumorstroma, bei der manuellen Mikroskopie-Diagnostik automatisch vom Diagnostiker mit zur Tumorfläche gezählt wurden.
Die Färbeintensität wurde in vier Grade von 0 bis 3 unterteilt, wobei 0 einer negativen und 3 einer dreifach positiven Färbeintensität entsprach.
Beispiel 1 für die Ermittlung des IRS-Wertes mittels manueller Mikroskopie bei
Anfärbung der Gesamttumorfläche mit zum Beispiel D2-40 (= 100% positive Tumorreaktion): 30% des Tumors zeigten eine Farbintensität von 3, 70% des Tumors die Farbintensität 1.
Immunreaktiver Score IRS = 30 x 3 + 70 x 1 = 160; 160: 100 = 1,6
Beispiel 2 für ein Angiosarkom, bei dem nur ein Teil der Tumorfläche mit dem
Antikörper reagierte, ergibt sich folgende Berechnung: 60% der Tumorfläche
zeigen eine Anfärbung mit der Intensität 2, 20% mit der Farbintensität 1, 20%
mit der Farbintensität 0.
IRS = 60 x 2 + 20 x 1 + 20 x 0 = 140; 140: 100 = 1,4
29
4.5
Statistik
Für das Sammeln der Daten, deren Dokumentation und Verwaltung sowie für
das Erstellen einfacher Diagramme (Art des Untersuchungsgutes, Lokalisation
der Probenentnahme, Verteilung Männer zu Frauen, Diagramme zu den Patientenfällen mit zwei und mehr Rezidiven, Vergleich manueller und quantitativer
(ACIS) D2-40- beziehungsweise Podoplanin-Auswertung,) wurde das Microsoft
Excel 2003 Programm verwendet.
Die weiterführenden statistischen Auswertungen erfolgten mit dem statistischen
Programm SPSS 12.0 und wurden durch Frau Dipl. Math. Schneider im Institut
für Medizinische Biometrie, Epidemiologie und Informatik des Fachbereichs Medizin der Johannes Gutenberg Universität Mainz betreut.
Das Hauptziel der Studie bestand in der Bestimmung des Anteils an mischdifferenzierten Angiosarkomen, welcher mittels einer computergestützten (ACIS)
D2-40-Messung gemessen und konfirmatorisch ausgewertet wurde. Mittels eines einseitigen Binominaltests (diskrete Wahrscheinlichkeitsverteilung) wurde
überprüft, ob der Anteil an mischdifferenzierten Angiosarkomen mehr als 55%
beträgt.
Zusätzlich wurde das 97,5%-Konfidenzintervall (Vertrauensbereich) für die Häufigkeit mischdifferenzierter Angiosarkome ermittelt.
Aufgrund des multiplen Testens wurde eine Niveauadjustierung nach Bonferonni vorgenommen, so dass der einseitige Binominaltest zu einem multiplen
Niveau von 5% durchgeführt wurde (p-Werte unter 0.025 deuten auf ein statistisch signifikantes Ergebnis hin). Die Breite des Konfidenzintervalles ist, unter
anderem, durch die geringe Fallzahl bedingt. Der Anteil an mischdifferenzierten
Angiosarkome wurden konfirmatorisch ausgewertet, so dass statistisch gesicherte Schlussfolgerungen gezogen werden konnten, falls der ermittelte p-Wert
unterhalb des, für multiplen Testens adjustierten, Signifikanzniveaus lag.
Im Rahmen einer explorativen Auswertung (explorativ: keine statistisch gesicherten Schlussfolgerungen möglich) wurden zusätzlich die D2-40-Werte bezüglich ihres Ausprägungsgrades in Untergruppen zur Ermittlung welcher
Mischdifferenzierungsprozentsatz am häufigsten vorlag, unterteilt, relative Häufigkeiten mit entsprechenden simultanen 95%-Konfidenzintervallen wurden ermittelt. Des Weiteren wurde die manuelle Mikroskopie, der computergestützten
30
Auswertungsmethode bezüglich der verschiedenen Messungen gegenübergestellt.
Differenzenboxplots, die die Differenzen zweier (miteinander verglichener) Werte darstellen, wurden genutzt, um die Unterschiede der beiden Verfahren graphisch herauszuarbeiten.
Der verbundene Wilcoxon Test (Vergleich der Mediane zweier Stichproben)
wurde durchgeführt um zu untersuchen, ob sich die Auswertungsmethoden
voneinander unterscheiden. Der in diesem Fall berichtete p-Wert wird als rein
deskriptiv verstanden. Zum Schluss wurden die mittels manueller Mikroskopie
gemessenen Werte von D2-40 und Podoplanin miteinander verglichen.
Für die ACIS-Messung wurde die Mischdifferenzierung wie folgt definiert: eine
Tumorreaktion über 1% und unter 85% des Tumors wurde als mischdifferenziert eingestuft. Angiosarkome mit ≤1% positiver Reaktion mit dem D2-40-, beziehungsweise Podoplanin-Marker sind als Hämangiosarkome anzusehen, bei
mehr als 85% positiv markierter Tumorfläche ist von einem Lymphangiosarkom
auszugehen.
Um die Ausprägung der Mischdifferenzierung genauer untersuchen zu können,
wurden Untergruppen gebildet. Zuerst wurden alle Angiosarkome mit einem
Mischdifferenzierungsanteil von mindestens 20% betrachtet. Zur Ermittlung welcher Mischdifferenzierungsprozentsatz am häufigsten vorlag, wurden kleinere
Gruppeneinteilungen gewählt (Untergruppen von ≤1%, 2 - 10%, 11 - 25%, 26 40%, 41 - 60%, 61 - 85%, >85%), um herauszufinden, in welchem Bereich der
größte Anteil einer Mischdifferenzierung vorliegt.
Für die manuelle Mikroskopie wurde die Mischdifferenzierung wie folgt festgelegt: keine Reaktion mit den Tumormarkern D2-40 und Podoplanin entspricht einem Hämangiosarkom; eine 100% positive Reaktion der Tumorfläche spricht
für ein Lymphangiosarkom; alle Messungen, in denen sich der Tumor aus positiv und negativ reagierenden Tumorzellen jeglichen Verhältnisses zusammensetzte, wurden als mischdifferenziert gewertet.
31
5
Ergebnisse
5.1
ACIS-Analyse der immunhistochemischen Färbungen
5.1.1 D2-40
5.1.1.1
Deskriptive Auswertung
Bei der ACIS-Messung der Angiosarkome der 1. Serie reagierten im Median
20,5% (1. Quartil 4,25% und 3. Quartil 44,5%) der Tumorfläche eines jeden
Tumors positiv mit dem Antikörper D2-40. Das Minimum der Ausprägung lag
bei 1,0%, das Maximum bei 90,0% (Abb. 10; Abb.11).
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
D2-40 - positive Tumorfläche (%) der 1. Serie
Abb. 10: Computergestützte (ACIS-) Bestimmung der mit dem Antikörper D2-40 positiv
reagierenden Tumorfläche (1. Serie).
32
12
Anzahl der Proben
10
8
6
4
2
Mean = 27,5313
Std. Dev. = 25,81945
N = 32
0
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
D2-40-positive Tumorfläche (%) 1. Serie
Abb. 11: Computergestützte (ACIS-) Bestimmung der mit dem Antikörper D2-40 positiv
reagierenden Tumorfläche (1. Serie).
Betrachtet man die Ausprägung der D2-40-Werte unter dem Aspekt der
Tumorlokalisation, findet man bei den am Kopf lokalisierten Tumoren (n = 22)
bezüglich
der
immunhistochemisch
positiv
reagierenden
Tumorfläche
tendenziell höhere Werte mit größerer Streuung als bei Lokalisation an den
oberen Extremitäten (n = 5). Auf einen Vergleich der Streuung in den übrigen
Lokalisationen unter diesem Aspekt wurde aufgrund der jeweils kleinen
Fallzahlen (n ≤ 2 / Lokalisation) verzichtet (Abb. 12).
100,00
D2-40-positiveTumorfläche (%)
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
Kopf
Rumpf
obere
Extremität
untere
Extremität
andere
Lokalisation
Lokalisation 1. Serie
Abb. 12: M2A-Expression in den verschiedenen Lokalisationen der 1. Serie: Im Vergleich
zur oberen Extremität größere Streuung der Werte als bei Tumoren am Kopf.
33
Die Verteilung der D2-40 Ausprägung war bei beiden Geschlechtern fast identisch
(Abb. 13).
100,00
D2-40-positive Tumorfläche (%)
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
männlich
weiblich
Geschlecht
Abb. 13: M2A-Expression der 1. Serie bei beiden Geschlechtern: fast identische Ausprägung in den Geschlechtern.
5.1.1.2
Anteil mischdifferenzierter Angiosarkome (Haupthypothese)
Zur Überprüfung der Haupthypothese: „Der Anteil der mischdifferenzierten Tumoren liegt über 55%“ wurde mittels ACIS der Anteil an D2-40-positiver Tumorfläche - bezogen auf die von ACIS als Gesamttumorfläche definierte Fläche –
ermittelt. Danach zeigten 30 von 32 angiosarkomatösen Tumoren eine Mischdifferenzierung.
Gemäß dem einseitigen Binominaltest lag der Anteil an mischdifferenzierten angiosarkomatösen Tumoren statistisch signifikant über 55% (p < 0.001). Die
Wahrscheinlichkeit, dass ein Angiosarkom eine Mischdifferenzierung aufweist,
das heißt sowohl eine lymphangioendotheliale als auch eine hämangioendotheliale Differenzierung aufweist, lag bei 96,88% (97,5%-Konfidenzintervall:
[81,67%; 99,96%]).
5.1.1.2.1 Relative Häufigkeit Tumoren mit Mischdifferenzierungsanteil
>20%
Der Anteil von Tumoren, die zu mehr als 20% mischdifferenziert sind, lag bei
50% (95%-Konfidenzintervall: [31,90%; 68,11%]). Bei diesen Werten ist zu berücksichtigen, dass die hier präsentierten Werte rein deskriptiv zu verstehen
34
sind. Von einer nötigen Niveauadjustierung aufgrund multiplen Testens wurde
aufgrund der geringen Fallzahl Abstand genommen.
5.1.1.2.2 Relative Häufigkeiten der verschiedenen MischdifferenzierungsUntergruppen
Bei Betrachtung der Tabelle der relativen Häufigkeiten der Mischdifferenzierungsanteile stellte man fest, dass die Tumoren mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 2 - 10% (31,3% der Fälle) beziehungsweise von 11 - 25%
(28,1% der Fälle) den Hauptteil aller untersuchten Angiosarkome bildeten. Wesentlich geringere Werte (jeweils 12,5% der Fälle) wiesen die zu gleichen Teilen
vertretenen Gruppen der zu 25 - 40% beziehungsweise 41 - 60% mischdifferenzierten Angiosarkome auf. Der Anteil der angiosarkomatösen Tumoren, deren
Mischdifferenzierung ≤1% beziehungsweise über 85% lag, stellte den kleinsten
Teil der untersuchten Tumore dar (jeweils eine Probe) (Tab. 2; Tab. 3; Abb. 14).
Tab. 2:
Absolute und relative Häufigkeiten der D2-40-Differenzierungen der 1. Serie
Absolute Häufigkeit
Gültig
Relative Häufigkeit
≤ 1%
1
3,1%
2% - 10%
10
31,3%
11% - 25%
9
28,1%
26% - 40%
4
12,5%
41% - 60%
4
12,5%
61% - 85%
3
9,4%
> 85%
1
3,1%
Gesamt
32
100,0%
35
Tab. 3:
Simultane 95%-Konfidenzintervalle für den Anteil an mischdifferenzierten Angiosarkomen in den durch den D2-40-Mischdifferenzierungsgrad definierten Untergruppen der 1. Serie.
Untergruppe
Punktschätzer
simultanes 95%-Konfidenzintervall
≤1%
3,13%
[ 0,02%; 21,27%]
2 – 10%
31,25%
[13,38%; 55,37%]
11 – 25%
28,13%
[11,23%; 52,50%]
26 – 40%
12,50%
[ 2,42%; 34,57%]
41 – 60%
12,50%
[ 2,42%; 34,57%]
61 – 85%
9,38%
[ 1,23%; 30,11%]
>85%
3,13%
[ 0,02%; 21,27%]
Anzahl der Proben (%)
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
< 1%
2% - 10%
11% 25%
26% 40%
41% 60%
61% 85%
> 85%
Mischdifferenzierungsuntergruppen 1. Serie
Abb. 14: Verteilung der D2-40-Expression in den durch Mischdifferenzierungsanteil
definierten Untergruppen der 1. Serie: insgesamt findet sich am häufigsten ein
Mischdifferenzierungsanteil von 2 - 10% beziehungsweise 11 - 25%.
Bei Betrachtung der D2-40-Ausprägung bezogen auf die Lokalisation zeigte
sich, dass bei den vom Kopf stammenden Angiosarkomen die Untergruppe der
2 - 10% mischdifferenzierten Tumore dominierte. Es folgten in dieser Lokalisation die Gruppen der Angiosarkome mit einem Mischdifferenzierungsanteil von
11 - 25%, 26 - 40% und 41 - 60%, wobei diese Untergruppen zu jeweils glei36
chen Anteilen vorlagen. Tumoren mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 61
- 85% lagen bezüglich der Häufigkeit an vorletzter Stelle. In einer einzigen Probe lag der mittels ACIS ermittelte Mischdifferenzierungsanteil bei knapp 1%,
definitionsgemäß entsprechend einem reinen Hämangiosarkom.
Zusammenfassend zeigten somit die am Kopf lokalisierten Angiosarkome das
ganze Spektrum möglicher Mischdifferenzierungsanteile und ein reines Hämangiosarkom. Ein Lymphangiosarkom wurde hier nicht detektiert.
In den beiden Proben vom Rumpf fanden sich Tumore mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 2 - 10% und 11 - 25% und zwar jeweils zu gleichen Teilen.
Auch in Proben der oberen Extremität lag der Mischdifferenzierungsanteil zwischen 2% und 25%. Allerdings überwog hier der Anteil der zu 11 - 25% mischdifferenzierten Angiosarkome.
In der unteren Extremität zeigte eine Probe einen Mischdifferenzierungsanteil
von 2 - 10% und reihte sich so in die Gruppe der am häufigsten vorkommenden
Untergruppen ein. Eine weitere Probe dieser Lokalisation wurde aufgrund des
lymphangioendothelialen Tumorphänotyps (>85% D2-40 positiver Tumorfläche
als Lymphangiosarkom eingeordnet.
Eine einzelne Probe aus einer nicht weiter beschriebenen Lokalisation fügte
sich in das Bild der Hauptgruppe der von 11 - 25% mischdifferenzierten Tumoren ein (Abb. 15).
37
6
< 1%
2% - 10%
11% - 25%
26% - 40%
5
41% - 60%
61% - 85%
Anzahl der Proben
> 85%
4
3
2
1
0
Kopf
Rumpf
obere
Extremität
untere
Extremität
andere
Lokalisation
Lokalisation 1. Serie
Abb. 15: Verteilung der D2-40-Mischdifferenzierungsuntergruppen pro Tumorlokalisation:
die zahlenmäßig stärkste Untergruppen (2 - 10% beziehungsweise 11 - 25%
mischdifferenzierte Angiosarkome) finden sich in allen Lokalisationen; Proben
ohne Mischdifferenzierungsanteile stammen von der unteren Extremität (>85 %,
Lymphangiosarkom) und vom Kopf (≤1%, Hämangiosarkom).
38
5.1.2 Podoplanin
Gemäß der ACIS-Messung mittels des Antikörpers gegen Podoplanin markierten Tumorfläche in Angiosarkomen der 1. Serie reagierten im Median 9,0% [1.
Quartil 3,0%; 3. Quartil 16,0%] der Angiosarkomflächen positiv mit dem Antikörper gegen Podoplanin. Das Minimum der Ausprägung lag bei 1,0%, das Maximum bei 70,0%. Betrachtet wurden hier, im Gegensatz zur D2-40-Messung, nur
31 Fälle, da eine Probe aufgrund stark ausgeprägter Artefakte mittels ACIS
nicht ausgewertet werden konnte (Abb. 16).
70,00
60,00
5
12
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Podoplanin - positive Tumorfläche (%) der 1. Serie
Abb. 16: Computergestützte (ACIS-) Bestimmung der mit dem Antikörper gegen Podoplanin positiv reagierenden Tumorfläche (1. Serie).
Das Diagramm der computergestützten Messung der Färbungen mit dem Antikörper gegen Podoplanin zeigt, dass der Hauptteil der Tumorflächen, die mit
dem Antikörper gegen Podoplanin gefärbt wurden, in einem Bereich zwischen
0% und 30% lag. Im Gegensatz zur ACIS-Bestimmung der mittels D2-40 gefärbten Tumorfläche fand sich bei Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin keine Probe mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 30% - 50%. Ähnlich
wie bei D2-40 zeigten auch hier nur wenige Proben eine Mischdifferenzierung
von 50% - 70% des Tumors. Mittels des Antikörpers gegen Podoplanin konnte
39
kein Lymphangiosarkom (>85% Podoplanin-positive Tumorfläche) ermittelt werden (Abb. 17).
20
Anzahl der Proben
15
10
5
Mean = 12,9677
Std. Dev. = 16,03223
N = 31
0
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Podoplanin-positive Tumorfläche (%)
Abb. 17: Prozentuale Podoplanin-Expression / Tumor in "1. Serie": die Mehrzahl der
immunhistochemisch mit dem Antikörper gegen Podoplanin positiv reagierenden
Angiosarkome weist einen Anteil von 0 - 10% positiv reagierender Tumorfläche
auf.
Eine differenzierte Darstellung der mittels des Antikörpers gegen Podoplanin
positiv reagierenden Tumorfläche liefert das folgende Diagramm. Hier erkennt
man, dass sechs Angiosarkome einen Anteil von 1% immunhistochemisch reagierender Tumorfläche aufwiesen. Bei der ACIS-Auswertung wurden mittels des
Antikörpers Podoplanin folglich sechs Angiosarkome definitionsgemäß entsprechend einem Hämangiosarkom (≤1% Podoplanin-positive Tumorfläche) erkannt. Mit dem Antikörper gegen Podoplanin konnte, im Gegensatz zur Anfärbung mit dem Antikörper gegen D2-40, kein Lymphangiosarkom ermittelt werden (Abb. 18).
40
6
Anzahl der Fälle
5
4
3
2
1
0
1,00
3,00
2,00
6,00
4,00
9,00
12,00
14,00
20,00
26,00
58,00
13,00
16,00
25,00
28,00
70,00
Podoplanin-positive Tumorfläche (%)
Abb. 18: Differenzierte Darstellung der prozentualen Podoplanin-Expression / Tumor: 6
Fälle wurden als Hämangiosarkome (≤1% positive Tumorfläche) erkannt, ein
Lymphangiosarkom konnte mittels Podoplanin nicht detektiert werden.
5.1.3 Podoplanin und D2-40: Vergleich der ACIS-Ergebnisse
Bei Darstellung der immunhistochemischen Ergebnisse für D2-40 und Podoplanin mittels eines Differenzenboxplot, der die Differenz der immunhistochemischen Reaktionen von Podoplanin und D2-40 beschreibt, zeigte sich, dass die
Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin - bezogen auf die angefärbte
Tumorfläche - tendenziell zu niedrigeren Messwerten führte als die Färbung
mit D2-40 (Abb. 19).
41
20,00
0,00
-20,00
-40,00
25
18
-60,00
32
-80,00
Differenz Podoplanin - D2-40-positive Tumorfläche
Abb. 19: Differenzenboxplot Podoplanin-Expression - M2A-Expression (1. Serie): die
Färbungen mit dem Antikörper D2-40 ergeben tendenziell größere Tumorflächen
(= höhere Werte) als die Färbungen mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
Zur Überprüfung, ob die Marker lymphangischen Endothels D2-40 und Podoplanin austauschbar sind, wurde eine Äquivalenzschranke (tolerable Differenz)
von 8% festgelegt.
Das berechnete 95 % - Konfidenzintervall der mittleren Differenz zwischen den
Messungen von Podoplanin und D2-40 lag bei [-20,8; -7,6]. Es wird daher von
dem Äquivalenzbereich [-8; 8] für die Ähnlichkeit der beiden Marker nicht vollständig überdeckt. Man kann daher nicht von einer Gleichwertigkeit der beiden
Marker sprechen.
Mittels einer linearen Regression wurde der Zusammenhang der Messergebnisse für D2-40 und Podoplanin, welcher durch den Differenzenboxplot bereits
sichtbar wurde, detaillierter untersucht.
Die so ermittelte Regressionsgerade erlaubte, bei gegebenen Podoplaninwert,
den durch das lineare Regressionsmodell vorhergesagten D2-40-Wert zu bestimmen.
Der nach Spearman ermittelte Korrelationskoeffizienten von r = 0,78 wies auf
einen guten bis sehr guten positiven Zusammenhang zwischen den
Podoplanin- und D2-40-Werten hin.
42
Die Regressionsgleichung zur Errechnung des vorausgesagten D2-40- Wertes
lautet:
D2-40-Wert (vorausgesagt durch lineares Modell) = 15,29+0,918 x Podoplaninwert
15,29 = Konstante; 0,918 = Vorfaktor
Beispielrechnung:
Nimmt man einen von ACIS ermittelten Wert für Podoplanin von 9 und setzt diesen in die Gleichung ein, so errechnet sich der D2-40-Wert wie folgt:
D2-40-Wert (vorausgesagt) = 15,29 + 0,918 x 9 = 23,55
Dass der Antikörper gegen Podoplanin tendenziell niedrigere Werte ermittelt als
der Antikörper D2-40 zeigen die folgenden Abbildungen, die den gleichen Fall
einmal immunhistochemisch gefärbt mit dem Antikörper gegen Podoplanin
(Abb. 20) und einmal immunhistochemisch gefärbt mit dem Antikörper D2-40
zeigen (Abb. 21).
Abb. 20: Beispiel für tendenziell niedrigere Werte der mittels des Antikörpers gegen Podoplanin immunhistochemisch gefärbten Tumorfläche: während Podoplanin 16%
der Tumorfläche markierte, fand sich bei der Färbung mittels des Antikörpers
D2-40 in der gleichen Probe eine 21% positiv reagierende Tumorfläche
(Vergleich: Abb. 21).
43
Abb. 21: Gleicher Fall wie in Abb. 20: vergleicht man die mittels des Antikörpers gegen
Podoplanin positiv gefärbte Tumorfläche mit der mittels des Antikörpers D2-40
gefärbten Tumorfläche ermittelt ACIS für D2-40 höhere Werte (Podoplanin: 16%;
D2-40: 21%).
5.1.4 Patientengruppen mit zwei und mehr Rezidiven
Bei der Untersuchung der Patientengruppe, bei denen zwei und mehr Rezidive
operiert wurden, konnte bedingt durch die niedrige Fallzahl (n =7), keine einheitliche Tendenz bezüglich einer zu- oder abnehmenden lymphangioendothelialen Differenzierung in den Rezidiven beobachtet werden. Mit zunehmender
Rezidivzahl gab es weder eine Tendenz zu einer Zunahme der Mischdifferenzierung, noch hin zu einer Abnahme der Mischdifferenzierung.
Im Folgenden werden zunächst die Fälle getrennt nach Reaktion der Rezidive
mit dem Antikörper D2-40 beziehungsweise dem Antikörper gegen Podoplanin
dargestellt und abschließend als vergleichende Gegenüberstellung der mittels
D2-40 beziehungsweise Podoplanin ermittelten Mischdifferenzierungsanteile.
D2-40-Expression:
Im Folgenden werden die Rezidiv-Fälle der 7 Patienten bezüglich des mittels
D2-40 ermittelten lymphendothelialen Phänotyps dargestellt.
Patient 1: Bei den Rezidiven dieses Patienten kam es zu einer stetigen Abnahme der mit dem Antikörper D2-40-positiv gefärbten Tumorfläche (von 20% auf
4%), entsprechend einer Abnahme der lymphangioendothelialen Differenzie44
rung mit zunehmender Rezidivzahl hin zu einer hämangioendothelialen Differenzierung (Abb. 22).
Patient 2: Mittels D2-40 war beim 1. Rezidiv (Probe 2) im Vergleich zum Primärtumor keine nennenswerte Veränderung der lymphangioendothelialen
Mischdifferenzierung (2%) nachweisbar, während es in Probe 3 (2. Rezidiv)
dann zu einem diskreten Rückgang auf 1% der lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung kam (Abb. 22).
Patient 3: Die mit dem Antikörper D2-40 positiv reagierende Tumorfläche des
Primärtumors betrug 21%. Beim ersten Rezidiv (Probe 2) nahm die mit D2-40
gefärbte Tumorfläche auf mehr als das Doppelte (52%) zu, um dann beim 2.
Rezidiv (Probe 3) wieder unter den Ausgangswert (9%) abzusinken (Abb. 22).
Patient 4: Während beim 1. Rezidiv (Probe 2) kaum eine Veränderung der mittels D2-40 ermittelten Tumorfläche zum Ausgangswert vorlag (24% / 22%), war
beim 2. Rezidiv (Probe 3) ein Anstieg der mit D2-40 positiv reagierenden Tumorfläche um mehr als das doppelte des Ausgangswertes (59%) zu belegen,
das heißt es kam beim 2. Rezidiv zu einer Zunahme des Tumoranteils mit
lymphangioendothelialer Mischdifferenzierung. Die Probe 4 (3. Rezidiv) zeigte
dann jedoch nur noch 3% mit dem Antikörper D2-40-positiv reagierende
Tumorfläche. Die Mischdifferenzierung veränderte sich damit in Richtung auf
ein reines Hämangiosarkom (Abb. 22).
Patient 5: Zeigten die ersten zwei Proben (Probe 1 = Primärtumor; Probe 2 = 1.
Rezidiv) noch ähnliche Werte (5% / 2%) bezüglich einer Mischdifferenzierung,
so stieg die mit dem Antikörper D2-40 positiv reagierende Tumorfläche ab Probe 3 (2. Rezidiv; 10%) stetig bis zur Probe 4 auf 19%, das heißt auf das vierfache des Ausgangswertes, an (Abb. 22).
Patient 6: Die Werte des mittels des Antikörpers D2-40 immunhistochemisch
ermittelten Mischdifferenzierungsanteils der ersten drei Proben lagen bei 51%
(Primärtumor) beziehungsweise 40% (Probe 2; 1. Rezidiv) beziehungsweise
49% (2. Rezidiv). Das 3. Rezidiv (Probe 4) wies dann eine deutliche Abnahme
45
der D2-40-positiv reagierenden Fläche auf 30% auf, passend zu einer Abnahme
des lymphangioendothelialen Mischdifferenzierungsanteils auf ein Drittel der
Tumorfläche (Abb. 22).
Patient 7: Bei diesem Patienten zeigten sich bis zur vierten Probe (3. Rezidiv)
keine wesentliche Veränderung der D2-40-Reaktion (0% bis 2%). Die fünfte
Probe (4. Rezidiv) wies zwar mit 9% einen fast fünffach höheren Mischdifferenzierungsanteil auf; bezogen auf die gesamte Tumorfläche war diese Zunahme
des Mischdifferenzierungsanteils aber nur als eine insgesamt schwache Zunahme hin zu
einer lymphangioendothelialen Differenzierung einzustufen (Abb.
22).
Zusammenfassend konnte mittels Nachweis der M2A-Expression in den Rezidiven keine einheitliche Veränderung des Mischdifferenzierungsanteils mit zuneh-
D2-40-positive Tumorfläche (%)
mender Rezidivzahl nachgewiesen werden (Abb. 22).
70
Patient 1
60
Patient 2
50
Patient 3
40
patient 4
30
Patient 5
20
Patient 6
10
Patient 7
0
1
2
3
4
5
Anzahl der vorliegenden Proben
Abb. 22: M2A-Expression in den Angiosarkomrezidiven: keine einheitliche Tendenz einer
Zu- oder Abnahme der lymphangioendothelialen Differenzierung in den
Rezidiven.
Podoplanin:
Patient 1: Im Gegensatz zur D2-40-Expression dieses Patienten zeigte sich für
Podoplanin keine einheitliche Tendenz bezüglich einer (abnehmenden) lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung. Während die positiv reagierende Tu46
morfläche bei Färbung mit dem Antikörper D2-40 stetig abnahm, nahm die mit
Podoplanin gefärbte Tumorfläche im 1. Rezidiv (Probe 2) verglichen mit dem
Ausgangswert (Probe 1) von 4% auf 8% zu, um dann im 2. Rezidiv (Probe 3)
wieder auf 2% abzufallen. (Abb. 23).
Patient 2: Bei Patient 2 nahm zwar die mittels Podoplanin ermittelte lymphangioendotheliale Differenzierung gering vom Primärtumor zum 1. Rezidiv (Probe
2) zu, jedoch kehrte der Podoplanin-Wert in Probe 3 (2. Rezidiv) wieder auf den
Ausgangswert zurück. Bei Werten zwischen 1% und 3% waren diese Veränderungen der lymphangioendothelialen Differenzierung insgesamt nur als sehr
diskret zu werten (Abb. 23).
Patient 3: Bei diesem Patienten ergaben die Färbungen mit D2-40 und Podoplanin einen ähnlichen Verlauf der lymphangioendothelialen Differenzierung im
Rezidverlauf: Für Podoplanin stieg der Wert der positiv reagierenden Fläche in
der Probe 2 (1. Rezidiv) um mehr als das Doppelte über den Ausgangswert an
(16% / 41%), um dann in der Probe 3 (2. Rezidiv) - analog zu D2-40 - unter den
Ausgangswert auf 8% zu sinken (Abb. 23).
Patient 4: Auch die Proben des 4. Patienten zeigten bezüglich Podoplanin ein
zu D2-40 vergleichbares lymphangioendotheliales Expressionsverhalten: der
Wert der mittels Podoplanin positiv markierten Tumorfläche nahm zunächst gering (Probe 1: 4%; 1. Rezidiv: 7%), in Probe 3 (2. Rezidiv) deutlich (22%) zu,
um dann im weiteren Verlauf (Probe 4; 3. Rezidiv) unter den Ausgangswert auf
3% abzusinken (Abb. 23).
Patient 5: Ähnlich wie bei D2-40 nahm bei Patient 5 bis zur Probe 3 (2. Rezidiv)
die mittels Podoplanin gefärbte Tumorfläche leicht zu (Probe 1 und 2: je 1% /
Probe 3: 9%). Im Gegensatz zu D2-40, bei dem es dann zu einer weiteren Vergrößerung der positiv mit Podoplanin gefärbten Tumorfläche kam, fiel der Wert
der positiven Tumorfläche bei Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin
im 3. Rezidiv (Probe 4) wieder auf 6% ab (Abb. 23).
Patient 6: Bei diesem Patient unterscheiden sich die mittels Podoplanin mischdifferenzierten Tumorflächen deutlich von den mittels D2-40 ermittelten misch47
differenzierten Tumorflächen. Lagen die Werte für D2-40 bis zur 3. Probe zwischen 40% und 51%, so nahm bei der Färbung mit Podoplanin die positiv markierte Tumorfläche von Probe 1 zu Probe 2 (1. Rezidiv) um mehr als das vierfache (12% / 55%) zu. Auch die 3. Probe (2. Rezidiv) wies mit 49% eine ausgeprägte lymphangioendotheliale Mischdifferenzierung auf. Wie bei D2-40, jedoch
etwas stärker, sank der Wert für die positiv reagierende Tumorfläche beim 3.
Rezidiv (Probe 4) ab und zwar auf 20% (Abb. 23).
Patient 7: Bei Patient 7 nahm die mit Podoplanin markierte Tumorfläche im 1.
Rezidiv (Probe 2) zunächst zu (von 2% auf 7%), fiel dann auf den Ausgangswert zurück (2. Rezidiv, Probe 3), nahm in Probe 4 (3. Rezidiv) minimal ab (1%)
und kehrte dann auf den Ausgangswert von 2% in Probe 5 (4. Rezidiv) zurück
(Abb. 23).
Betrachtet man zusammenfassend die Podoplanin-Expression in den Proben
der 7 Patienten mit Angiosarkom-Rezidiven im Verlauf, so ist - wie zuvor schon
bei der Expression von D2-40 beschrieben - kein einheitlicher Trend bezüglich
der lymphangioendothelialen oder hämangioendothelialen Differenzierung im
Podoplanin-positive Tumorfläche (%)
Rezidivverlauf zu erkennen (Abb. 23).
60
Patient 1
50
Patient 2
40
Patient 3
30
Patient 4
20
Patient 5
10
Patient 6
Patient 7
0
1
2
3
4
5
Anzahl der vorliegenden Proben
Abb 23:
Podoplanin-Expression in den Proben der 7 Patienten mit Rezidiven: Variation
der mittels des Antikörpers gegen Podoplanin markierten lymphangioendothelialen Tumorfläche im Rezidivverlauf.
48
D2-40 und Podoplanin:
Im Folgenden werden die mittels des Antikörpers D2-40 beziehungsweise mit
dem Antikörper gegen Podoplanin gefärbten Angiosarkomrezidive pro Fall
dargestellt.
Patient 1: Es zeigte sich bei diesem Patienten eine Tendenz zur Abnahme des
lymphangioendothelialen Phänotyps mit zunehmender Rezidivzahl; dabei fiel
auch hier die Bewertung der D2-40-Färbungen stärker aus als mit Podoplanin.
Der Anteil immunhistochemisch positiv reagierender Tumorfläche lag für D2-40
beim Primärtumor bei 20%. Beim 2. Rezidiv (Probe 3) lagen die mittels ACIS ermittelten Farbwerte sowohl für D2-40 (4%) als auch Podoplanin (2%) unter dem
Ausgangswert. Während diese Abnahme der lymphangioendothelialen Differenzierung für D2-40 kontinuierlich verlief, wurde mittels Podoplanin eine von Rezidiv zu Rezidiv variierende lymphangioendotheliale Differenzierung markiert. In
der 1. Tumorprobe lag der mittels des Antikörpers gegen Podoplanin dargestellte Tumoranteil bei 4%, in Probe 2 (1. Rezidiv) bei 8 % und in Probe 3 (2.
Rezidiv) bei 2% (Abb. 24)
positiv reagierende
Tum orfläche (% )
25
20
15
D2-40
10
Podoplanin
5
0
1
2
3
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 24: M2A- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 1: Tendenz zur Abnahme der lymphangioendothelialen Differenzierung mit zunehmender
Rezidivzahl.
Patient 2: Bei Patient 2 zeigte sich bei Färbung mit D2-40 für das erste Rezidiv
(Probe 2) zunächst eine gleichbleibende lymphangioendotheliale Differenzierung (2% positiv markierte Tumorfläche), die bei Probe 3 dann abnahm (1% positiv markierte Tumorfläche). Im Unterschied dazu fiel der Nachweis der lymphangioendothelial differenzierten Tumorfläche bei der Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin uneinheitlich aus. Danach nahm die lymphangioendotheliale Differenzierung vom Primärtumor (Probe 1) zu Probe 2 (1.Rezidiv) zu (von
49
1% auf 3%), um dann in Probe 3 (2. Rezidiv) wieder auf einen Wert, der identisch dem D2-40-Wert (1%) war, abzufallen (Abb. 25).
positiv reagierende
Tumorfläche (%)
3,5
3
2,5
D2-40
2
1,5
Podoplanin
1
0,5
0
1
2
3
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 25: D2-40- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 2: leichte Abnahme
der D2-40-Expression mit zunehmender Rezidivzahl, gegenüber uneinheitlichem
Verlauf der Podoplanin-Expression.
3. Patient: Beim 3. Patienten zeigten die Färbungen mit Podoplanin und D2-40
für alle Proben jeweils vergleichbare Werte. Bei Verwendung beider Antikörper
zeigte das erste Rezidiv mehr als eine Verdoppelung des Wertes gegenüber
dem Ausgangswert - und damit der lymphangioendothelialen Differenzierung (D2-40: Probe 1: 21%; Probe 2: 52%; Podoplanin: Probe 1: 16%, Probe 2:
41%). Beim 2. Rezidiv (Probe 3) zeigte sich ein Absinken der lymphangioendothelialen Ausprägung unter den jeweiligen Ausgangswert (Probe 3: D2-40: 9%,
Probe 3: Podoplanin: 8%) (Abb. 26).
positiv reagierende
Tum orfläche (% )
60
50
40
D2-40
30
Podoplanin
20
10
0
1
2
3
Anzahl derProben/Patient
Abb. 26: D2-40- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 3: bei vergleichbaren Werten für Podoplanin und D2-40 zunächst Zunahme, später Absinken
der lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung unter den jeweiligen
Ausgangswert des Primärtumors.
4. Patient: Bei Patient 4 wurden für Podoplanin und D2-40 - wie bei Patient 3 ebenfalls vergleichbare Werte ermittelt, wobei aber die Werte für D2-40 auch
hier jeweils höher lagen als die für Podoplanin. Hier lagen die Werte bei 4%
(Probe 1, Primärtumor) und 7% (Probe 2, 1. Rezidiv) für Podoplanin und bei
50
24% (Probe 1) und 22% (Probe 2, 1. Rezidiv) für D2-40. Hingegen nahm in
Probe 3 (2. Rezidiv) sowohl bei Färbung mit dem Antikörper D2-40 als auch mit
dem Antikörper gegen Podoplanin die lymphangioendotheliale Differenzierung
jeweils um etwa das dreifache der Ausgangswertes zu (D2-40: 59%; Podoplanin: 22%), um dann in der 4. Probe (3. Rezidiv) unter (für D2-40) beziehungswiese auf (Podoplanin) den Ausgangswert (jeweils 3%) zu sinken (Abb. 27).
positiv reagierende
Tumorfläche (%)
70
60
50
40
D2-40
30
Podoplanin
20
10
0
1
2
3
4
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 27: M2A- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 4: bei unterschiedlicher Expressionsstärke von M2A und Podoplanin vergleichbarer diskontinuierlicher Verlauf der lymphangioendothelialen Differenzierung; mit deutlich
vermehrter Podoplanin- und D2-40 Reaktion im 2. Rezidiv (Probe 3).
Patient 5: Beim 5. Patienten zeigte sich bezüglich Podoplanin im Vergleich zum
Primärtumor bei Probe 2 keine Veränderung der Mischdifferenzierung (1. Rezidiv: 1%). Im 2. Rezidiv (Probe 3) zeigte sich eine vermehrte lymphangioendotheliale Differenzierung (9%), beim 3. Rezidiv (Probe 4: 6%) eine Abnahme derselbigen. Mit dem Antikörper D2-40 zeigte sich zunächst ein leichtes Absinken
der lymphangioendothelialen Differenzierung unter den Ausgangswert von 5%
auf 2%. In Probe 3 (2. Rezidiv) nahm die lymphangioendotheliale Differenzierung auf zunächst 10% (Probe 3) und dann 19% (Probe 4, 3. Rezidiv) zu. Die
sich mittels des Antikörpers gegen Podoplanin darstellende lymphangioendotheliale Differenzierung verlief bis zum 2. Rezidiv (Probe 3) weitgehend vergleichbar, nahm aber - im Gegensatz zur Färbung mit dem Antikörper D2-40 in Probe 4 (3. Rezidiv) wieder ab (Abb. 28).
51
p o s it iv re a g ie re n d e
T u m o rf lä c h e ( % )
20
15
D2-40
10
5
Podoplanin
0
1
2
3
4
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 28: D2-40- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 5: ab dem 2. Rezidiv (Probe 3) Zunahme der lymphangioendothelialen Differenzierung bei
Färbung mit dem Antikörper D2-40, bis Probe 3 auch mittels des Antikörpers
gegen Podoplanin, dann Abnahme der Podoplanin-Expression.
Patient 6: Bei Patient 6 fanden sich sehr unterschiedliche lymphangioendotheliale Differenzierungen, abhängig von der Färbung mit dem Antikörper D2-40 beziehungsweise mit dem Antikörper gegen Podoplanin: Mittels des Antikörpers
D2-40 ergab sich bis zur Probe 3 (2. Rezidiv) eine diskontinuierliche lymphangioendotheliale Mischdifferenzierung. Die Werte der mittels Färbung mit dem
Antikörper D2-40 positiv reagierenden Tumorfläche lagen für Probe 1 (Primärtumor) bei 51%, für Probe 2 (1. Rezidiv) bei 40% und für Probe 3 (2. Rezidiv)
bei 49%. Die Probe 4 (3. Rezidiv) zeigte eine Abnahme der positiv reagierenden Tumorfläche auf 30%. Bei Färbung mit Podoplanin stellte sich zunächst
eine Zunahme der lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung vom Primärtumor (Probe 1; 12%) zum 1. Rezidiv (Probe 2; 55%) dar, gefolgt von einem
kontinuierlichen Absinken auf 49% (Probe 3) beziehungsweise 20% (Probe 4)
p o s it iv re a g ie re n d e
T u m o rf lä c h e ( % )
(Abb. 29).
60
50
40
D2-40
30
Podoplanin
20
10
0
1
2
3
4
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 29: D2-40- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 6: ab Probe 2 (1.
Rezidiv) Abnahme der lymphendothelialen Differenzierung bei Färbung mit dem
Antikörper gegen Podoplanin; mittels D2-40 deutliche Abnahme der
Mischdifferenzierung erst ab dem 3. Rezidiv.
52
Patient 7: Bei Patient 7 zeigte sich ebenfalls ein diskontinuierlicher Verlauf der
lymphendothelialen Mischdifferenzierung in Abhängigkeit von dem verwendeten
Antikörper. Die Größe der mit dem Antikörper D2-40 positiv reagierenden
lymphangioendothelial-differenzierten Tumorfläche lag bis Probe 4 zwischen 0
und
2%. Erst beim 4. Rezidiv (Probe 5) ergab die immunhistochemische Fär-
bung einen lymphangioendothelialen Differenzierungsanteil von 9%, das heißt
eine leichte Zunahme des lymphangioendothelialen Differenzierungsanteils. Die
Werte bei Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin lagen für die 1., 3., 4.
und 5. Probe bei 1% beziehungsweise 2%, entsprechend einem nahezu unveränderten lymphangioendothelialen Mischdifferenzierungsanteil. Lediglich die
Probe 2 (1. Rezidiv) wich hiervon ab. Sie zeigte mit 7% einen vergleichsweise
hohen Anteil einer positiv mit dem Antikörper gegen Podoplanin markierten Tu-
positiv reagierende
Tumorfläche (%)
morfläche (Abb. 30).
10
8
6
4
2
0
-2
D2-40
Podoplanin
1
2
3
4
5
Anzahl der Proben/Patient
Abb. 30: M2A- und Podoplanin-Expression in Rezidiven von Patient 7: die Mischdifferenzierung weicht für den Antikörper D2-40 wesentlich von der mittels des
Antikörpers gegen Podoplanin ermittelten lymphangioendothelialen Differenzierung ab.
Die bei Betrachtung der Diagramme auf den ersten Blick zum Teil erheblich erscheinenden Unterschiede zwischen der mittels Podoplanin beziehungsweise
D2-40 ermittelten Tumorfläche ist in der Darstellungsform der Diagramme begründet: die kleinen Achsenabschnitten der y-Achse, die aufgrund des Computerprogrammes jeweils nur bis zum höchsten Wert und nicht bis 100% reichen,
ergeben ein verzerrtes Bild des Kurvenverlaufes. Könnten die Werte jeweils auf
100% bezogen werden, würden sich die Differenzen der Werte zwischen D2-40
und Podoplanin relativieren. Diese Verzerrung wird auch deutlich, wenn man
die absoluten Zahlenwerte betrachtet. Dabei kann man leicht feststellen, dass
53
zwischen den Werten für Podoplanin und D2-40 nur relativ kleine Unterschiede
bestehen.
5.1.5 CD34-Messung
Bei der Messung der Angiosarkome der 1. Serie reagierten im Median 9,5% [1.
Quartil 5,0%; 3. Quartil 29,75 %] der Tumorfläche positiv mit dem Antikörper gegen CD34. Das Minimum der Ausprägung lag bei 2,0%, das Maximum bei 67%
(Abb. 31).
70,00
1
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
CD34 - positive Tumorfläche (%) der 1. Serie
Abb. 31: Computergestützte (ACIS-) Bestimmung der mit dem Antikörper gegen CD34
positiv reagierenden Tumorfläche (1. Serie).
Bezogen auf die CD34-Expression in den verschiedenen Tumorlokalisationen
fand sich, anders als bei der ACIS-Messung der mittels des Antikörpers D2-40
gefärbten Tumorflächen, die größte Streuung in den Proben vom Rumpf und
den unteren Extremitäten.
Analog zur D2-40-Messung stellten sich in Proben der Kopfregion tendenziell
höhere Werte mit einer größeren Streuung dar als in den Proben von den oberen Extremitäten. Aufgrund der geringen Fallzahlen (n ≤2) wurde auf eine Betrachtung der Streuung in den weiteren Lokalisationen verzichtet. (Abb. 32).
54
70,00
15
CD34-positive Tumorfläche (%)
60,00
12
3
50,00
26
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Kopf
Rumpf
obere
Extremität
untere
Extremität
andere
Lokalisation
Lokalisation 1. Serie
Abb. 32: Verteilung der CD34-Expression in Angiosarkomen verschiedener Lokalisationen (1. Serie): die größte Streuung der lymphendothelialen Differenzierung
zeigen die vom Kopf stammenden Proben.
Bezüglich der Geschlechter zeigte sich ein Unterschied in der Ausprägung der
CD34-Expression. Frauen wiesen tendenziell eine höhere CD34- Ausprägungen auf (Abb. 33).
70,00
60,00
CD34-positive Tumorfläche (%)
12
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
männlich
weiblich
Geschlecht
Abb. 33: CD34-Expression in angiosarkomatösen Tumoren der 1. Serie bei Männern und
Frauen: größere Streuung sowie stärkere Ausprägung der CD34-Expression in
Tumoren von Patientinnen.
55
Bei Gruppierung der Angiosarkome nach der relativen Häufigkeit der mittels immunhistochemischer CD34-Färbung markierten Tumorfläche zeigte sich, dass
Tumoren mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 1 - 10% die Hälfte der untersuchten Angiosarkome (50% der Fälle) ausmachten. In absteigender Reihe
folgten Angiosarkome mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 11 - 25%
(21,9% der Fälle) und - zu gleichen Anteilen - Angiosarkome mit einem Mischdifferenzierungsanteil 26 - 40% und von 41 - 60% (jeweils 12,5% der Fälle).
Den kleinsten Anteil stellten die Angiosarkome mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 61 - 85% dar (Tab. 4; Abb. 34).
Tab. 4:
Absolute und relative Häufigkeiten der CD34-Differenzierungen in der 1. Serie:
Absolute Häufigkeit
Gültig
Relative Häufigkeit
2 % - 10 %
16
50,0 %
11 % - 25 %
7
21,9 %
26 % - 40 %
4
12,5 %
41 % - 60 %
4
12,5 %
61 % - 85 %
1
3,1 %
Gesamt
32
100,0 %
50,0%
Anzahl der Proben (%)
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
2% - 10%
11% - 25%
26% - 40%
41% - 60%
61% - 85%
Mischdifferenzierungsuntergruppen 1. Serie
Abb. 34: CD34-Expression: Verteilung der Untergruppen der 1. Serie: die Untergruppen
mit einer positiven immmunhistochemischen Reaktion von 2 - 10% beziehungsweise 11 - 25% pro Tumorfläche stellen die stärksten Untergruppen dar.
56
Bei Betrachtung der Mischdifferenzierungsanteile bezogen auf die Lokalisation
des Primärtumors fanden sich zu D2-40 vergleichbare Ergebnisse. Wie bei
D2-40 dominierte auch bei der Färbung mit dem Antikörper gegen CD34 ein
Mischdifferenzierungsanteil von 1 - 10% bei Tumoren aus der Kopfregion und
von den oberen Extremitäten. Der Mischdifferenzierungsanteil von 11 - 25%
fand sich, außer in der Probe mit nicht weiter beschriebener Lokalisation, in
allen anderen Entnahmeorten (Kopf: 4 Proben; Rumpf, obere Extremität und
untere Extremität: jeweils 1 Probe). Proben mit einem Mischdifferenzierungsanteil von 26 - 40% und 41 - 60% waren zu gleichen Teilen vertreten (n = 4). Der
Untergruppe "Mischdifferenzierungsanteil von 61 - 85%" war bei Färbung mit
dem Antikörper gegen CD34 nur eine Probe vom Kopf zuzuordnen (Abb. 35).
14
2% - 10%
11% - 25%
26% - 40%
41% - 60%
12
61% - 85%
Anzahl der Proben
10
8
6
4
2
0
Kopf
Rumpf
obere
Extremität
untere
Extremität
andere
Lokalisation
Lokalisation 1. Serie
Abb. 35: CD34-Expression der Untergruppen bezogen auf die verschiedenen Lokalisationen: die Hälfte aller Angiosarkome der 1.Serie weisen eine Mischdifferenzierungen von 2 - 10 % auf; bezogen auf die Lokalisation stammen diese
Tumoren ausschließlich vom Kopf und oberen Extremitäten.
57
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Angiosarkom bei der Färbung mit dem Antikörper gegen CD34 mischdifferenziert ist, liegt bei 100% (95%-Konfidenzintervall:
[89,11%; 100%])
Dieser Wert ist nur rein deskriptiv zu sehen, von einer nötigen Niveauadjustierung aufgrund des multiplen Testens wurde Abstand genommen. Der Anteil an
Mischdifferenzierungen mit einer Ausprägung von mehr als 20% bei immunhistochemischer Färbung mit dem Antikörper gegen CD34 wurde analog zu D2-40
untersucht. Für die immunhistochemische Färbung mit dem Antikörper gegen
CD34 lag die Wahrscheinlichkeit, dass ein Angiosarkom mehr als 20% immunhistochemisch gefärbte Tumorfläche aufwies, bei 31,25% (95%-Konfidenzintervall: [16,12%; 50,01%]).
Die sich für die simultanen 95%-Konfidenzintervalle ergebenden Werte sind in
Tabelle (Tab. 5) wiedergegeben.
Tab. 5:
Simultane 95%-Konfidenzintervalle des CD34-Mischdifferenzierungsanteils der
Mischdifferenzierungs-Untergruppen der 1. Serie.
Untergruppe
Punktschätzer
simultanes 95%-Konfidenzintervall
2 - 10%
50,00%
[ 28,39%; 71,76%]
11 - 25%
21,28%
[ 7,74%; 44,57%]
26 - 40%
12,50%
[ 2,67%; 32,82%]
41 - 60%
12,50%
[ 2,67%; 32,82%]
61 - 85%
3,13%
[ 0,03%; 19,57%]
58
5.2
Manuelle
Mikroskopie
der
immunhistochemischen
Färbungen: D2-40 und Podoplanin
Betrachtete man die Differenzen der manuellen Mikroskopie von D2-40 und Podoplanin bezüglich der immunhistochemisch mit diesen beiden Markern positiv
reagierenden Tumorflächen, so lag der Median bei 0 (1. Quartil 0; 3. Quartil 0),
das Minimum bei -50,00 und das Maximum bei 30. Auch wenn die beiden Marker demzufolge insgesamt eine relativ gute Deckung aufwiesen, gab es einzelne Ausreißer. Dementsprechend fand man im Differenzenboxplot der positiv reagierenden Tumorflächen eine gute Deckung der mittels manueller Mikroskopie
ermittelten Werte für die Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin beziehungsweise dem Antikörper D2-40 (Abb. 36).
40,00
3
20,00
2
11
28
17
0,00
15
23
8
-20,00
19
-40,00
13
-60,00
D2-40 - Podoplanin positiv gefärbte Fläche manuelle Mikroskopie
Abb. 36: Differenzenboxplot D2-40 - Podoplanin: bei manueller Mikroskopie der mit D240 und Podoplanin angefärbten Tumorflächen findet man abgesehen von
einzelnen Ausreißern gute Deckung der Messwerte (Median:0).
Veranschaulicht wird dieser Sachverhalt auch bei direkter Gegenüberstellung
der einzelnen Fälle (Abb. 37).
59
100
positiv gefärbte Fläche (%)
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Fallnummer
Podoplanin
D2-40
Abb. 37: Per manueller Mikroskopie ermittelte, mit dem Antikörper D2-40 und dem Antikörper gegen Podoplanin positiv reagierende Tumorflächen der einzelnen
Tumorfälle: in mehr als der Hälfte der Fälle identische Messergebnisse für die
beiden Marker.
Der Vergleich der Ergebnisse der manuellen Mikroskopie bezüglich der mit beiden lymphangioendothelialen Markern angefärbten Tumorfläche ergab, im Gegensatz zur Auswertung mittels ACIS, eine sehr gute Übereinstimmung der mittels des Antikörpers D2-40 und dem Antikörper gegen Podoplanin gefärbten
Tumorflächen.
Die Frage, ob Podoplanin ein ähnlich guter Marker wie der bereits länger etablierte D2-40 Marker ist, konnte somit für die Auswertung mittels manueller Mikroskopie bestätigt werden.
60
Verglich man die mittels manueller Mikroskopie ermittelten Werte der immunhistochemischen Färbungen von D2-40 und Podoplanin im Bezug auf die ermittelte Farbintensität, zeigten sich für D2-40 tendenziell gering höhere Werte als
für Podoplanin (Abb. 38; Abb. 39).
Abb. 38: Manuelle Mikroskopie eines mit dem Antikörpers gegen Podoplanin (Chromogen
DAB) gefärbten angiosarkomatösen Tumors: die Farbintensität des Antikörpers
gegen Podoplanin wird subjektiv als schwächer empfunden als die Farbintensität
mittels des Antikörpers D2-40 (Chromogen Fuchsin) (Vergleich Abb. 39).
Abb. 39: Manuelle Mikroskopie eines mit dem Antikörper D2-40 (Chromogen Fuchsin) gefärbten angiosarkomatösen Tumors,: die Farbintensität wird subjektiv stärker
empfunden als die Farbintensität des Antikörpers gegen Podoplanin
(Chromogen DAB) (Vergleich Abb.38); es resultieren leicht höhere IRS-Werte.
61
Bei Berechnung der Differenzen der Immunreaktivitätsscores (IRS: Produkt
aus Farbintensität und gefärbter Tumorfläche) lag der Median bei 0 (1. Quartil 0,09; 3. Quartil 0,28). Das Minimum der Differenzen betrug
-1,50, das
Maximum 0,95 (Abb. 40).
1,00
3
1
0,50
0,00
-0,50
19
-1,00
-1,50
13
IRS D2-40 - Podoplanin manuelle Mikroskopie
Abb. 40: Differenzenboxplot der mittels manueller Mikroskopie ermittelten D2-40- und
Podoplanin-Immunreaktivitätsscores (IRS): die Färbungen mit dem Antikörper
D2-40 lieferten tendenziell gering höhere Werte.
Auch bei direkter Gegenüberstellung der Immunreaktivitätsscores von Podoplanin und D2-40 für jeden Fall zeigten sich für D2-40 in der Mehrzahl der Fälle
gering höhere IRS-Werte als für Podoplanin (Abb. 41).
62
3,0
2,5
IRS-Wert
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Fallnummer
Podoplanin
D2-40
Abb. 41: Mittels manueller Mikroskopie gemessene Immunreaktivitätsscores (IRS) von
D2-40 und Podoplanin im direkten Fallvergleich: bei Färbung mit dem Antikörper
D2-40 ergeben sich gering höhere Immunreaktivitätsscorewerte als bei Färbung
mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
63
5.3
Vergleich der ACIS-Analyse mit der manuellen Mikroskopie
5.3.1 D2-40
Betrachtete man die Ergebnisse der ACIS-Auswertung und die der manuellen
Mikroskopie
unter
dem
Aspekt
der
immunhistochemisch
gefärbten
Tumorfläche, so zeigte sich Folgendes:
Gemäß ACIS reagierten im Median 20,5% der jeweiligen Angiosarkomfläche
mit dem Antikörper D2-40 (1. Quartil 4,25%; 3. Quartil 44,50%). Das Minimum
der immunhistochemisch positiv reagierenden Tumorfläche lag bei 1%, das Maximum bei 90%. Gemäß der manuellen Mikroskopie reagierten im Median
87,10% der jeweiligen Tumorfläche mit dem Antikörper gegen D2-40 (1. Quartil
20,31; 3. Quartil 100%). Hier lag das Minimum bei 0% und das Maximum bei
100%. Somit ergab die Auswertung der mittels D2-40 gefärbten Tumorfläche
bei Einsatz der manuellen Mikroskopie viel höhere Werte als bei Einsatz des
ACIS (Abb. 42).
100
80
60
40
20
0
ACIS
manuelle Mikroskopie
Abb. 42: Vergleich der mit dem Antikörper D2-40 positiv reagierenden Tumorfläche ermittelt per ACIS (links) und manueller Mikroskopie (rechts): mittels manueller Mikroskopie werden größere Werte für die immunhistochemisch gefärbte Tumorflächen ermittelt.
Der Differenzenboxplot, der die Differenz der Ergebnisse der manuellen Mikroskopie und der ACIS-Werte darstellt, zeigte eine klare Tendenz, dass die manu64
elle Mikroskopie der D2-40-Färbung höhere Prozentzahlen positiv reagierender
Tumorflächen ermittelt als ACIS. Der Median lag hierfür bei 47,00 (1. Quartil
1,75; 3. Quartil 74,93) (Abb. 43).
100,00
50,00
0,00
-50,00
-100,00
positive Fläche manuelle Mikroskopie - ACIS
Abb. 43: Differenzenboxplot der Werte der manuellen Mikroskopie - ACIS für die mit D240 positiv reagierenden Tumorflächen: die manuelle Mikroskopie ermittelt
höhere Werte.
Der Wilcoxon-Test für gepaarte Proben (p <0.001) unterstützt zusätzlich die
Annahme, dass sich beide Methoden unterscheiden.
Betrachtet man die Korrelation der Messwerte, so ergibt sich ein Korrelationskoeffizient von 0,324. Dieser lässt auf einen nur sehr schwachen Zusammenhang
zwischen ACIS und manueller Mikroskopie schließen.
Führt man eine Verhältnisstatistik durch, so liegt das mediane Verhältnis der
manuellen Mikroskopie zur computergestützten Auswertung (ACIS) bei 2,02
(95%-Konfidenzintervall: [1,19; 4,76]). Die Werte der manuellen Mikroskopie
liegen, auf den Median bezogen, folglich etwa doppelt so hoch wie die mittels
ACIS erhobenen Werte.
Die Durchführung der Regression ergab mit einem p-Wert von 0.082, dass in einem linearen Regressionsmodell die manuelle D2-40-Auswertung nicht geeignet ist, Rückschlüsse auf die ACIS-gestützte D2-40-Auswertung zu ziehen. Die
von dem ermittelten linearen Modell für eine Auswertung mit ACIS vorhergesag65
ten D2-40-Werte wichen deutlich von den per manueller Mikroskopie ermittelten
Werten ab. Man kann daher nur bedingt von einem linearen Zusammenhang
zwischen den verschiedenen Auswertungsmethoden sprechen.
In einer Kreuztabelle wurden die mittels ACIS und manueller Mikroskopie mit
dem Antikörper D2-40 als mischdifferenziert erkannten Tumoren einander zugeordnet. Nur in 32,3% der Fälle, in denen ACIS eine Mischdifferenzierung er
kannte, konnte auch mittels manueller Mikroskopie eine Mischdifferenzierung
identifiziert werden (Tab. 6).
Tab. 6:
Kreuztabelle: durch ACIS und manuelle Mikroskopie ermittelte Mischdifferenzierungen bei Färbung mit dem Antikörper D2-40.
D2-40 semiquantitativ
nicht
mischdifferenziert
D2-40
quantitativ
Mischdifferenziert
nicht
mischdifferenziert
Anzahl
Mischdifferenziert
Anzahl
21
(67,7%)
10
(32,3%)
31
(100%)
Anzahl
22
(68,8%)
10
(31,3%)
32
(100%)
Gesamt
Tab. 7:
Gesamt
1
(100%)
0
1
(100%)
Manuelle Mikroskopie versus ACIS: Anteil mischdifferenzierter Angiosarkome
bei immunhistochemischer Färbung mit den Antikörper D2-40
100% negativ (manuelle
Mikroskopie)
beziehungsweise ≤1%
negativ (ACIS) reagierende
Angiosarkome
mischdifferenzierte
Angiosarkome
100 %positiv (manuelle
Mikroskopie)
beziehungsweise >85%
positiv (ACIS) reagierende
Angiosarkome
manuell
5 (15,63%)
13 (40,63%)
14 (43,75%)
ACIS
1
30 (93,75%)
1 (3,13%)
(3,13%)
Betrachtet man die manuelle Mikroskopie, so lag bei 13 Fällen (40,63%) eine
Mischdifferenzierung vor (Tab.7; Abb. 44). Bei 14 (43,75%) der untersuchten
Proben reagierte der Antikörper D2-40 mit 100% des Tumors (Tab.7; Abb. 45),
bei 5 (15,63%) kam es zu keiner immunhistochemischen Reaktion der Tumorfläche mit dem Antikörper D2-40 (Tumor 100% negativ) (Tab. 7; Abb. 46). Die
computergestützte Auswertung ermittelte in 30 Fällen (93,75%) eine Mischdiffe66
renzierung (Tab. 7; Abb. 47), in einem Fall (3,13%) ein Lymphangiosarkom
(>85% mittels dem Antikörper D2-40 gefärbte Tumorfläche) (Tab. 7; Abb. 48)
und in einem weiteren Fall (3,13%) ein Hämagiosarkom (≤1% positiv gefärbte
Tumorfläche)(Tab. 7; Abb. 49).
Abb. 44: Mischdifferenziertes Angiosarkom: nur ein Teil der Tumorfläche zeigt eine
immunhistochemisch positive Reaktion (rot) mit dem Antikörper D2-40; ein Teil
der Tumorfläche bleibt jedoch ungefärbt.
Abb. 45: Lymphangiosarkom: 100% der Tumorfläche zeigen eine positive Reaktion mit
dem Antikörper D2-40.
67
Abb. 46: Hämangiosarkom: keine Reaktion der Tumorzellen mit dem Antikörper D2-40.
Abb. 47: Mischdifferenzierung: der von ACIS ermittelte D2-40-Wert
immunhistochemisch positiv reagierende Tumorfläche beträgt 46%.
für
die
68
Abb. 48: Lymphangiosarkom: der mittels ACIS ermittelte D2-40-Wert für die immunhistochemisch positiv reagierende Tumorfläche beträgt 90%.
Abb: 49: Hämangiosarkom: der von ACIS ermittelte D2-40-Wert für immunhistochemisch
positiv reagierende Tumorfläche beträgt 1%.
69
Bei der manuellen Mikroskopie lag der Immunreaktivitätsscore (IRS) für den
Antikörper gegen D2-40 im Median bei 2,12 (1. Quartil 0,45; 3. Quartil 2,80).
Das Minimum der IRS-Werte lag bei 0, das Maximum bei 3. Bei der Messung
mittels ACIS lag der Immunreaktivitätsscore des Antikörper D2-40 im Median
bei 0,66 (1. Quartil 0,11; 3. Quartil 1,34), das Minimum bei 0,03 und das Maximum bei 2,7 (Abb. 50).
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
manuelle Mikroskopie
ACIS
Abb. 50: D2-40-Immunreaktivitätsscores ermittelt mittels manueller Mikroskopie (links)
und ACIS (rechts): tendenziell deutlich höhere Werte in der manuellen
Mikroskopie.
Auch der Differenzenboxplot, der die Differenz des Immunreaktivitätsscores mittels manueller Mikroskopie beziehungsweise mittels ACIS darstellt, zeigte eine
klare Tendenz, dass bezüglich des Antikörpers D2-40 die manuelle Mikroskopie
höhere Werte ergibt als die ACIS-Auswertung. Der Median lag bei 1,08 (1.
Quartil 0,12; 3. Quartil 1,49) (Abb. 51).
70
3,00
2,00
1,00
0,00
-1,00
D2-40 IRS manuelle Mikroskopie - ACIS
Abb. 51: Differenzenboxplot der Immunreaktivitätsscores der manuellen Mikroskopie ACIS für D2-40: höhere IRS-Werte bei manueller Mikroskopie.
Der auch hier durchgeführte Wilcoxon-Test für gepaarte Proben (p <0.001)
zeigte auch in diesem Fall, dass sich die Methode der manuellen Mikroskopie
von der ACIS-Methode unterscheidet.
Betrachtete man die Korrelation nach Spearman-Rho, so ergab sich ein Korrelationskoeffizient von 0,651. Dieser ließ auf einen mäßigen Zusammenhang
zwischen ACIS und manueller Mikroskopie schließen.
Die Verhältnisstatistik zeigte, dass das mediane Verhältnis manueller zu computergestützter Auswertung bei 1,87 (95%-Konfidenzintervall: [1,20; 2,57]) lag.
Der Wert der manuellen Mikroskopie lag, auf den Median bezogen, analog zur
Flächenbetrachtung fast doppelt so hoch wie der per ACIS ermittelte Wert (Abb.
52).
71
3,00
Immunreaktivitätsscore
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
39
37
35
33
31
29
27
25
23
21
19
17
D2-40 manuelle Mikroskopie
15
13
11
9
7
5
3
1
D2-40 ACIS
Proben 1 bis 32
Abb. 52: Gegenüberstellung des D2-40-Immunreaktivitätsscores, ermittelt per manueller
Mikroskopie beziehungsweise ACIS für jede Probe: die manuelle Mikroskopie
ermittelt in allen Fällen höhere Werte.
5.3.2 Podoplanin
Die Messung der mit dem Antikörper gegen Podoplanin gefärbten Tumorfläche
ergab bei Einsatz von ACIS folgende Werte: Median: 9,00% (1.Quartil 3,00%; 3.
Quartil 16,00%), Minimum: 1,00%, Maximum: 70,00%.
Hingegen ergab die manuelle Mikroskopie einen Median von 100 % (1. Quartil
17,81%; 3. Quartil 100%), ein Minimum von 0% und ein Maximum von 100%
(Abb. 53).
72
100
80
5
60
12
40
20
0
ACIS
manuelle Mikroskopie
Abb. 53: Mit dem Antikörper gegen Podoplanin positiv reagierende Tumorflächen,
ermittelt mittels manueller Mikroskopie (links) und ACIS (rechts): höhere
Messwerte bei manueller Mikroskopie.
Die Spanne zwischen computergestützter und manueller Auswertung spiegelt
sich im Differenzenboxplot wider. Es ergibt sich eine klare Tendenz, dass die
manuelle Mikroskopie höhere Werte ermittelt (Median: 68,00; 1. Quartil 10,25;
3. Quartil 88,00) (Abb. 54).
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00
Podoplanin positive Fläche manuelle Mikroskopie - ACIS
Abb. 54: Differenzenboxplot der Werte der manuellen Mikroskopie - ACIS: für die mit dem
Antikörper gegen Podoplanin immunhistochemisch positiv gefärbten Tumorflächen: die manuelle Mikroskopie ermittelt höhere Werte.
73
Der durch den Wilcoxon-Test für gepaarte Daten ermittelte p-Wert (p< 0.001)
unterstützt zusätzlich die Annahme, dass sich die durch diese Methoden ermittelten Werte unterscheiden.
Der Korrelationskoeffizient von 0,308 spricht für einen sehr schwachen Zusammenhang der Werte der manuellen Mikroskopie und ACIS bei Einsatz des Antikörpers gegen Podoplanin zum Nachweis eines lymphangioendothelialen Phänotyps in Angiosarkomen.
Die Verhältnisstatistik zeigt für den Vergleich der manuellen Mikroskopie mit der
computergestützten ACIS-Auswertung der Tumorfläche ein medianes Verhältnis von 7,14 (95%-Konfidenzintervall für Median: [2,50; 11,11]). Das heißt, dass
bei der manuellen Mikroskopie der Wert für die angefärbte Tumorfläche, auf
den Median bezogen, um mindestens das 2,5-fache (maximal 11,11-fache)
größer ist als bei der computergestützten Auswertung.
Bei Verwendung der manuellen Mikroskopie zur Bestimmung des Mischdifferenzierungsanteils in Angiosarkomen bei Färbung mit dem Antikörper gegen
Podoplanin wiesen 5 (16,13%) Fälle keine immunhistochemische Reaktion auf
und waren demzufolge als Hämangiosarkom zu werten (Tab.8; Abb. 52). In 10
Fällen (32,25%) der untersuchten Angiosarkome zeigte sich eine Mischdifferenzierung (Tab. 8; Abb. 53) und in 17 Fällen (54,84%) eine 100% positive Reaktion der Tumorfläche. Letztere waren somit als Lymphangiosarkome zu bewerten (Tab. 8; Abb. 54).
Die Auswertung der Mischdifferenzierungsanteile mittels ACIS ergab 26
(80,64%) mischdifferenzierte Angiosarkome und 6 (19,35%) Hämangiosarkome
(Tab. 8; Abb. 55). Mit dem Antikörper gegen Podoplanin konnte mittels ACIS
kein Lymphangiosarkom ermittelt werden (Tab. 8; Abb. 59 ).
74
Tab. 8:
Manuelle Mikroskopie versus ACIS: Anteil mischdifferenzierter Angiosarkome
bei immunhistochemischer Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
100% negativ (manuelle
Mikroskopie)
beziehungsweise
≤1%
negativ (ACIS) reagierende Angiosarkome
mischdifferenzierte
Angiosarkome
manuell
5 (16,13%)
10 (32,25%)
ACIS
6 (19,35%)
26 (80,64%)
100% positiv (manuelle
Mikroskopie)
beziehungsweise
>85%
positiv (ACIS) reagierende
Angiosarkome
17 (54,84%)
0
(0%)
Abb. 55: Hämangiosarkom: keine Reaktion mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
75
Abb. 56: Mischdifferenziertes Angiosarkom: nur ein Teil der Tumorzellen reagiert
immunhistochemisch positiv mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
Abb. 57: Lymphangiosarkom: 100% der Tumorzellen reagieren positiv mit dem Antikörper
gegen Podoplanin.
76
Abb. 58: ACIS-Auswertung eines gemäß der ACIS-Auswertung mischdifferenzierten
Angiosarkoms (Färbung: Antikörper gegen Podoplanin).
Abb. 59: ACIS-Auswertung: gemäß der ACIS-Auswertung mit dem Antikörper gegen
Podoplanin ermitteltes Hämangiosarkom.
77
Die Auswertung der immunhistochemischen Farbintensität bei Färbung mit
dem Antikörper gegen Podoplanin zeigte bereits in der direkten Gegenüberstellung der Immunreaktivitätsscores (IRS) erhebliche Unterschiede. Der Immunreaktivitätsscore lag bei der manuellen Mikroskopie im Median bei 2,19 (1.
Quartil 0,26; 3. Quartil 2.64), das Minimum bei 0, das Maximum bei 3. Bei der
computergestützten ACIS-Auswertung lag der Median des IRS bei 0,38 (1.
Quartil 0,07; 3. Quartil 0,47), das Minimum, genauso wie bei der manuellen
Auswertung, bei 0 und das Maximum bei 2,1 (Abb. 60).
3,00
2,50
5
2,00
12
1,50
1,00
0,50
0,00
manuelle Mikroskopie
ACIS
Abb. 60: Podoplanin-Immunreaktivitätsscores, ermittelt per manueller Mikroskopie (links)
beziehungsweise ACIS (rechts): höhere Werte bei manueller Mikroskopie.
Der Differenzenboxplot, der die Differenz zwischen manueller Mikroskopie und
computergestützter ACIS-Auswertung darstellt, zeigte eine klare Tendenz, dass
die manuelle Mikroskopie für den Podoplanin-Immunreaktivitätsscore höhere
Werte lieferte. Die Differenz betrug im Median 1,74 (1. Quartil 0,14; 3. Quartil
2,18) (Abb. 61).
78
3,00
2,00
1,00
0,00
IRS Podoplanin manuelle Mikroskopie - ACIS
Abb. 61: Differenzenboxplot des Immunreaktivitätsscores der manuellen Mikroskopie –
ACIS bei Färbung mit dem Antikörper gegen Podoplanin: manuelle Mikroskopie
ermittelt höhere Werte.
Der Korrelationskoeffizient nach Spearman von 0,284 wies auf einen sehr
schwachen Zusammenhang zwischen den Werten der manuellen und der computergestützten Auswertung hin.
In der Verhältnisstatistik lag der Median für die Differenz manuelle Mikroskopie ACIS bei 5,19 (95%-Konfidenzintervall für Median: [1,71; 8,89]). Der mittels manueller Mikroskopie bestimmte Wert für den Immunreaktivitätsscore lag somit
auf den Median bezogen fünfmal höher als der von ACIS ermittelte. Dieses wird
in der direkten Gegenüberstellung verdeutlicht (Abb. 62).
79
3,00
Immunreaktivitätsscore
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Podoplanin manuelle Mikroskopie
Proben 1 bis 31
Podoplanin ACIS
Abb. 62: Gegenüberstellung des Podoplain-Immunreaktivitätsscores, ermittelt mittels
manueller Mikroskopie beziehungsweise ACIS für jede Probe: die manuelle
Mikroskopie liefert in jedem Fall deutlich höhere Werte als ACIS.
80
6
Diskussion
Seit einigen Jahren wird in der Literatur beschrieben, dass Angiosarkome verschiedenster Lokalisationen sowohl hämangio-, als auch lymphangioendotheliale Tumorzellen besitzen können (Breiteneder-Geleff et al., 1999 a; Kahn et al.,
2002; Erovic et al., 2003; Kaiserling, 2004; Ordonez, 2005). Kahn et al. (2002)
fanden in 3 von 7, Ordonez (2005) in 2 von 5 und Fukunaga (2005) in 7 von 15
Angiosarkomen ohne nähere Lokalisationsangabe positive Reaktionen der Tumorzellen mit dem Antikörper D2-40 beziehungsweise Podoplanin. In 11 untersuchten Angiosarkomen der Haut, der Weichgewebe und Angiosarkome
visceraler Lokalisation fand Breiteneder-Geleff et al. (1999 a) in 10 Fällen dieser
untersuchten Gefäßtumoren eine Mischdifferenzierung. Studien mit größeren
Fallzahlen zu dermalen Angiosarkomen sind bisher nicht publiziert.
In der vorliegenden Studie wurde für dermale Angiosarkome von 32 Patienten
der Anteil einer etwaigen lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung - nachgewiesen unter Verwendung des spezifischen lymphangioendothelialen Antikörpers D2-40 und dem ebenfalls spezifischen lymphangioendothelialen Antikörpers gegen Podoplanin (Breiteneder-Geleff et al., 1999 b; Kriehuber et al.,
2001; Kahn et al., 2002; Matsui et al., 2003; Sonne et al., 2006, Evangelou et
al., 2005) - mittels computergestützter Messung (ACIS) und manueller lichtmikroskopischer Beurteilung untersucht. Weiterhin wurde die Vergleichbarkeit
der Marker D2-40 und Podoplanin sowie die konventionelle manuelle Mikroskopie im Vergleich zur computergestützten Auswertung (ACIS) in der Diagnostik dermaler Angiosarkome überprüft.
Die Haupthypothese, dass mehr als 55% der dermalen Angiosarkome mischdifferenziert sind, wurde mittels computergestützter Auswertung
bestätigt (p
<0.001). Die Ergebnisse der manuellen Mikroskopie zeigten jedoch, dass dermale Angiosarkome mehrheitlich eher als Lymphangiosarkome zu klassifizieren
sind. Bei Vergleich der ACIS-Befunde mit der manuellen Mikroskopie zeigte die
computergestützte Auswertung für die immunhistochemisch positiv reagierende
Tumorfläche niedrigere Werte. Dies verhinderte die Diagnosestellung von
Lymphangiosarkomen mittels ACIS. Die Tumormarker D2-40 und Podoplanin
erwiesen sich mittels manueller Lichtmikroskopie als gleichwertige Marker bezüglich des Nachweises einer lymphendothelialen Mischdifferenzierung.
81
Zur Mischdifferenzierung:
Mittels ACIS wurden bei Verwendung des Antikörpers D2-40 30 der 32 dermalen Angiosarkome als mischdifferenziert erkannt. Die Wahrscheinlichkeit für die
Hypothese, dass bei Einsatz von ACIS mehr als 55% der dermalen Angiosarkome mischdifferenziert sind, lag bei 96,88%. In der computergestützten Messung
konnte die Haupthypothese, dass mehr als 55 % der Angiosarkome mischdifferenziert sind, bestätigt werden. Bei Verwendung des Antikörpers gegen Podoplanin wurden 26 der 31 (81,25%) untersuchten Angiosarkome von ACIS als
mischdifferenziert erkannt. Aufgrund dieser Werte war der Anteil an reinen
Hämangio-, sowie reinen Lymphangiosarkomen bei der computergestützten
Auswertung sehr gering. Aufgrund der ACIS-Werte konnte mit dem Antikörper
D2-40 lediglich 1 Probe (3,13%) als Lymphangiosarkom und eine weitere Probe
(3,13%) als Hämangiosarkom klassifiziert werden. Mit dem ebenfalls lymphangioendothelialen Marker Podoplanin konnten sechs Proben (18,75%) als
Hämangiosarkome klassifiziert werden, jedoch keine (reine) Lymphangiosarkome.
In der manuellen Mikroskopie zeigte sich, dass ein Teil dieser, von ACIS als
mischdifferenziert bewerteten, Angiosarkome eigentlich als Lymphangiosarkome zu diagnostizieren sind. So wurden mittels manueller Mikroskopie mit dem
Antikörper D2-40 13 (40,63%) und dem Antikörper gegen Podoplanin 10
(32,25%) der untersuchten Angiosarkome als mischdifferenziert bewertet. Mit
dem Antikörper D2-40 wurden mittels manueller Lichtmikroskopie 14 (43,75%)
Angiosarkome als reine Lymphangiosarkome und 5 (15,63%) als Hämangiosarkome (= 100% des Tumors: D2-40 negativ) klassifiziert, mit dem Tumormarker
Podoplanin 17 (54,84%) als reine Lymphangiosarkome und 5 (16,13%) als reine Hämangiosarkome.
Anzumerken ist, dass der cut-off-Wert für die ACIS-Auswertung, ab dem ein angiosarkomatöser Tumor als Lymphangiosarkom definiert wurde, aufgrund der
pathomorphologischen Definition dieses Tumors in der vorliegenden Arbeit als
>85% definiert wurde. Das ACIS kann aufgrund technischer Limitationen (durch
fehlende Einbeziehung negativer Areale, Lumina oder Spalten) nie eine Gesamttumorfläche von 100% ermitteln. Unter diesem Gesichtspunkt ist ein cutoff-Wert von mindestens 85% positiver Tumorzellen als Kriterium zur Diagnose
″
Lymphangiosarkom“ vergleichsweise sehr hoch angesetzt. Es ist davon auszu82
gehen, dass bei Herabsetzen dieses Schwellenwertes auch für die computergestützte Analyse ein höherer Anteil reiner Lymphangiosarkome erkannt würden.
Dieses Herabsetzen würde aber der Definition des Lymphangiosarkoms widersprechen.
In der Literatur findet man sehr unterschiedliche Angaben über den Anteil einer
lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung in Angiosarkomen. So zeigen
nach Kahn et al. (2002), Ordonez (2005) und Fukanaga (2005) 40% der Angiosarkome - allerdings ohne nähere Lokalisationsangaben - eine positive
Reaktion mit dem Antikörper D2-40. Die Autoren geben nicht an, wie stark die
Ausprägung dieser lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung ist. Insofern
können die in der Literatur genannten Werte nur bedingt mit denen der hier
vorgelegten manuellen Mikroskopie verglichen werden. In einer Studie von Breiteneder-Geleff et al. (1999 a) reagierten in 10 von 11 Angiosarkomen (davon 4
dermale Angiosarkome, die 7 anderen entstammten visceraler Lokalisation und
dem Weichgewebe) 5 - 70% der Tumorzellen positiv mit dem Antikörper gegen
Podoplanin. Der Anteil an lymphangioendothelial differenzierten Tumorzellen in
den 4 untersuchten dermalen Angiosarkomen lag zwischen 10% und 60%.
Auch wenn einschränkend anzumerken ist, dass es sich in der Studie von Breiteneder-Geleff et al. um eine sehr kleine Fallzahl handelt, entsprechen die Werte denen der hier vorgelegten Studie.
Für die Verlässlichkeit der in der vorliegenden Studie getroffenen Aussage,
dass ein hoher Tumoranteil eine lymphangische Differenzierung aufweist,
sprechen auch die Ergebnisse der computergestützten CD34-Auswertung. Hier
zeigten 50% der dermalen Angiosarkome nur eine minimale CD34-Expression
in 1 - 10% der Tumorfläche und 47% der dermalen Angiosarkome eine CD34Expression in bis maximal 60% der Tumorfläche. Gleichartige Ergebnisse beschreiben Ramini et al. (1990) und Kuzu et al. (1992). Nach ihnen reagiert der
gegen hämangisches Endothel gerichtete Antikörper CD34 in Angiosarkomen
nur gelegentlich positiv. Nach Mentzel und Kutzner (2002) reagiert das Endothel von Lymphgefäßen und lymphendothelialer Gefäßtumoren im Gegensatz
zu Endothelzellen von Blutgefäßen und benignen angiomatösen Neoplasien
(bei gleichzeitiger CD31-Positivität) mehrheitlich gar nicht oder nur sehr fokal
mit dem Antikörper gegen CD34. Erovic et al. (2003) haben in ihrer Studie unter
83
anderem 5 Angiosarkome (ohne nähere Lokalisationsangabe) untersucht. Von
den 3 der 5 Angiosarkome, die mit dem Antikörper gegen CD34 angefärbt
wurden, zeigte eines eine negative immunhistochemische Reaktion mit dem
Antikörper gegen CD34, die anderen beiden wiesen mit 80 - 100% CD34-positiv
gefärbter Tumorzellen eine starke immunhistochemische Reaktion auf. Diese 2
Angiosarkome zeigten beide keine Reaktion mit dem Antikörper gegen CD9
(ein weiterer Marker lymphangischen Endothels). Einen weitaus höheren Anteil
CD34-positiver Angiosarkome (25 von 27) beschrieben Miettinen et al. (1994).
Die dabei untersuchten 5 kutanen Angiosarkome zeigten ein Reaktionsspektrum des Antikörpers gegen CD34 von fokal positiv bis zu 90% positiv reagierenden Tumorzellen. Hier ist allerdings die Frage zu stellen, ob die nur fokal mit
CD34 reagierenden Tumorzellen als lymphangioendothelial-differenzierte Tumoren eingeordnet hätten werden müssen. Für Fiedler et al. (2006) handelt es
sich bei CD34 um ein speziell von tumorassoziierten lymphangischen Endothelzellen exprimiertes Antigen, das mit den mittels der lymphangioendothel-spezifischen Markern LYVE-1 und Podoplanin nachgewiesenen Antigenen koexprimiert wird.
Zusammengefasst zeigen dermale Angiosarkome einen variabel ausgeprägten
lymphangioendothelialen Phänotyp auf. In der vorliegenden Arbeit war dies teilweise so stark ausgeprägt, dass die angiosarkomatösen Tumoren als Lymphangiosarkome zu bewerten waren. Hieraus leitet sich die Empfehlung ab, in der
Diagnostik von dermalen angiosarkomatösen Gefäßtumoren neben der routinemäßig durchgeführte HE-Färbung und den klassischen immunhistochemischen
hämangioendothelialen Markern (CD31, von Willebrandfaktor, CD34) immer zusätzlich auch lymphendothel-spezifische Antikörper einzusetzen. Dass dies bei
der Diagnostik der hier untersuchten Proben nicht der Fall war, ist darauf zurückzuführen, dass
diese lymphangioendothelialen immunhistochemischen
Marker erst seit vergleichsweise kurzer Zeit kommerziell verfügbar sind. Die
Frage, wieso in der Primärdiagnose die Diagnose "Lymphangiosarkom" so selten gestellt wurde, ist zum Einen mit der relativ kurzen kommerziellen Verfügbarkeit der lymphangioendothelialen Marker zu erklären, zum Anderen mit dem
im Vergleich zur Literatur in der hier vorgelegten Arbeit sehr großen Probengut
aus einem Zeitraum von 19 Jahren.
84
Zur Vergleichbarkeit der Tumormarker D2-40 und Podoplanin
Bei Quantifizierung der immunhistochemisch gefärbten Tumorflächen mittels
ACIS wurden für D2-40 tendenziell höhere Werte als für Podoplanin bestimmt,
und zwar sowohl innerhalb eines Tumors als auch bei Betrachtung der Gesamtheit aller analysierten Tumore. Bei einer maximal tolerablen Differenz von 8%
Abweichung der Werte wurden für D2-40 und Podoplanin unterschiedliche Flächenbestimmungen ermittelt. Da bei der Färbung mit Podoplanin die Tumorflächen nicht nur tendenziell schwächer angefärbt wurden, sondern auch kleinere
Tumorflächen markiert wurden als bei Färbung mit D2-40, lagen die mittels Podoplanin als lymphangioendothelial-differenzierte Tumorareale ermittelten Werte unter denen von D2-40.
Bei Auswertung der Färbungen mit dem Antikörper gegen Podoplanin mittels
ACIS muss man berücksichtigen, dass die Angiosarkome, die in der D2-40-Färbung nur einen geringen Anteil an lymphangioendothelial differenzierter Tumorfläche aufwiesen, aufgrund der Ergebnisse der (vergleichsweise schwächeren)
Podoplanin Färbung gegebenenfalls fälschlicherweise als lymphangioendothelial-negativ bewertet würden.
Aufgrund der in dieser Arbeit ermittelten Regressionsgleichung kann jedoch von
(niedrigen) Podoplanin-Werten auf den, vom Regressionsmodell vorhergesagten, D2-40-Wert rück geschlossen werden. Für die Fälle, in denen mittels Podoplanin-Färbung positiv gefärbte Tumorflächen nachgewiesen werden können –
und sei dieser Anteil noch so gering – kann mittels der in der hier vorgestellten
Arbeit ermittelten Regressionsgleichung ein Rückschluss auf den (vorhergesagten) D2-40-Wert gezogen werden.
Podoplanin ist gemäß der computergestützten Auswertung nicht ohne weiteres
mit D2-40 zu vergleichen. Zurzeit liegen noch keine publizierten Studien zum
Vergleich der Antikörper D2-40 und Podoplanin mittels der computergestützten
Analyse vor.
Bei Auswertung mittels manueller Lichtmikroskopie wurden auf der Basis des
Immunreaktivitätsscores zwar ebenfalls tendenziell höhere Farbintensitätswerte
für D2-40 als für Podoplanin ermittelt (Median 0; 1. Quartil -0,09; 3. Quartil
0,28), jedoch lagen die Messwerte für beide Antikörper - im Vergleich zur ACIS-
85
Auswertung - sehr dicht beieinander. Eine gute Übereinstimmung beider Marker
ergab sich bezüglich der von ihnen angefärbten Tumorfläche.
Somit sind nach den vorliegenden manuellen lichtmikroskopischen Befunden
D2-40 und Podoplanin gut geeignete Marker zur Detektion lymphangioendothelial-differenzierter Tumorzellen. Die Verlässlichkeit dieser lymphangioendothelialen Marker wurde - teils für D2-40, teils für Podoplanin - auch von
Breitenender-Geleff et al. (1999 b), Kriehuber et al. (2001), Kahn et al. (2002),
Matsui et al. (2003), Evangelou et al. (2005), sowie Sonne et al. (2006) beschrieben. Dass D2-40 und Podoplanin ein vergleichbares Reaktionsspektrum
haben, wurde bereits von Kaiserling et al. (2004) berichtet und in der auf manueller Lichtmikroskopie beruhenden Studie von Evangelou et al. (2005) bestätigt.
Vergleich von ACIS und manueller Mikroskopie
Sowohl im Bezug auf die Tumorfläche als auch auf den Immunreaktivitätsccore
ergaben sich bei der computergestützten Analyse (ACIS) im Vergleich zur manuellen Mikroskopie Unterschiede. Wie oben bereits dargestellt, ergab die
ACIS-Analyse sowohl für die D2-40- als auch Podoplanin-Färbungen jeweils
bezüglich der Fläche als auch der Färbeintensität niedrigere Werte als die manuelle Mikroskopie.
Die Unterschiede zwischen manueller Mikroskopie und ACIS waren für Podoplanin stärker ausgeprägt als für D2-40. Die Werte des Medians lagen bei der
manuellen Mikroskopie um das fünf- (Immunreaktivitätsscore) beziehungsweise
siebenfache (Fläche) höher als bei der ACIS-Analyse.
Es stellt sich daher die Frage, in wieweit ACIS als ein verlässliches diagnostisches System bewertet werden kann.
In der Literatur werden zahlreiche Vorteilen einer computergestützten Auswertung immunhistochemisch gefärbter Schnittpräparate genannt.
An erster Stelle steht die Zeitersparnis, da das Einscannen der Objektträger unbeaufsichtigt über Nacht erfolgen kann und der Hauptfokus nicht auf dem
Durchmustern der Präparate, sondern der Ermittlung der positiv reagierenden
Fläche liegt (Bauer et al., 2000; Bauernhofer et al., 2005). Manuelles Zählen
von Zellen ist mühsam und zeitraubend. Mit dem Einsatz von ACIS können, im
Gegensatz zu einigen hundert bei manueller Auswertung, tausende Zellen ein86
fach gezählt werden (Zhang et al., 2006). Eine weitere Zeitersparnis liegt nach
Hilbe et al. (2003) vor, wenn technische Assistenten die ″Voranalyse″ (Kontrolle, ob im Präparat tatsächlich die ″region of interest″ gemessen wird) durchführen.
Da mittels ACIS Schwellenwerte für jeden Durchgang festgelegt werden können, erlaubt ACIS eine Eliminierung von Hintergrundfärbung (Divi et al., 2001;
Messersmith et al., 2005). Mittels morphologischer Filter können unerwünschte
morphologisch vorgegebene Strukturen (wie zum Beispiel Zelltrümmer und
Zellkerne, die aufgrund ihrer Morphologie nicht den zu untersuchenden Kriterien
entsprechen) eliminiert werden (Divi et al., 2001).
Während das menschliche Auge nur - wie in der vorliegenden Arbeit - zum Beispiel 4 Intensitätsgrade des Scores graduieren kann (von 0 bis 3+), kann mittels
ACIS die Färbeintensität in einem umfangreicheren Spektrum ermittelt werden
(0 - 255 Graustufen), einschließlich einer exakteren Bestimmung schwacher
Färbeintensitäten (Witkiewicz et al., 2005). Noch wichtiger ist, dass die ACISErgebnisse eine gute Reproduzierbarkeit (= gleiche Ergebnisse bei Mehrfachmessungen) besitzen (Bauer et al., 2000; Witzig et al., 2002; Messersmith et
al., 2005). Interobserver-Variabilitäten manueller Zählungen können reduziert
und so die Reproduzierbarkeit und Exaktheit der Ergebnisse maximiert werden
(Zhang et al., 2006). Auch Zusatzinformationen, wie zum Beispiel Angaben
über die Gesamtzellzahl aller ausgezählten Zellen (Bauernhofer et al., 2005),
die Speicherung der Daten (Hilbe et al. 2003; Bauernhofer et al., 2005) und die
Identifikation einzelner positiver Zellen mittels hot-spot-Option (Hilbe et al.,
2003) werden als Vorteile von ACIS genannt. Mittels Telepathologie kann ein
niedergelassener Pathologe mit eingeschränkten immunhistochemischen Möglichkeiten Gewebe an ein zertifiziertes ChromaVision Referenzlabor schicken.
Der angefertigte Objektträger wird im Referenzlabor gescannt und die Bilder
des gesamten Objektträgers eingelesen. Die fertigen ″Images″ können dann
dem einsendenden Pathologen rück übersandt werden, der mit einer modifizierten ACIS-Workstation die Analyse an dem unter Standardbedingungen entstandenen Image durchführen kann (Instrumentation Development, 2003).
Die Einsatzmöglichkeiten des ACIS-Systems reichen von der einfachen Messung von Proteinexpressionen wie Pin-1 (Bao et al., 2004) oder TamoxifenDNA-Addukten (Divi et al., 2001), über die rare-event Detektion zum Auffinden
87
einzelner positiv gefärbter Zellen (Instrumentation Development, 2003), wie
zum Beispiel im Blut zirkulierende Tumorzellen (Witzig et al., 2002; Bauernhofer
et al., 2005) oder okkulter Knochenmetastasen (Bauer et al., 2000), bis hin zur
HER-2-Analyse und -Medikamentenkontrolle. Der bei der HER-2-Analyse
ermittelte Score gilt derzeit als ein wichtiges diagnostisches und prognostisches
Kriterium in der Mammacarcinomdiagnostik, das auch für die weitere Therapie
von großer Bedeutung ist. Da bei einer manuellen Mikroskopie die Ergebnisse
und damit die Zuordnung der Patientinnen zu einer Therapiegruppe - auch
aufgrund der Erfahrung und subjektiven Bewertung des einzelnen Pathologen zu
variabel
wären,
wurde
die
computergestützte
Auswertung
für
immunhistochemische Daten zu HER-2 mehrfach in Studien überprüft. ACIS
zeigte bei der HER-2-Analyse eine gute Korrelation zur manuellen Mikroskopie
und zu FISH (Bloom and Harrington, 2004; Tawfik et al., 2006), auch konnte
mittels ACIS die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit gesteigert werden
(Instrumentation Development, 2003).
Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit wurde außer für HER-2-neu (Bloom and
Harrington, 2004) auch für die Proteine Pin-1 (Bao et al., 2004) und EGFR
(Messersmith et al., 2005) eine gute Korrelation zwischen computergestützter
und manueller Mikroskopie beschrieben. Nach Bauernhofer et al. (2005) ist bei
der Untersuchung von im Blut zirkulierenden Tumorzellen ACIS bei hoher
Zellzahl der manuellen Auswertung (aufgrund der hohen, zu untersuchenden
Zellzahl) überlegen. Auch bei Vergleich mit dem quantitativen ELISA
(Messersmith et al., 2005) und dem ebenfalls quantitativen CIA zeigte ACIS
eine gute Korrelation (Divi et al., 2001). Von Bauer et al. (2000) wurde der
ACIS-Analyse sogar eine Qualitätskontroll-Funktion zugesprochen: manuell
vom Pathologen zunächst (falsch) negativ bewertete Proben wurden nach der
ACIS-Analyse vom gleichen Pathologen bei einer Reevaluation - allerdings
unter Kenntnis der positiven ACIS-Befunde - als positiv gewertet (Bauer et al.,
2000).
Die in der Literatur als Nachteile genannten Aspekte des ACIS beziehen sich
vor allem auf mangelhafte Präparate, da Artefakte verschiedenster Natur die
ACIS-Auswertung empfindlich stören und zum Analyseausschluss von Proben
führen können (Witzig et al., 2002 ; Hilbe et al., 2003). So schloss Witzig et al.
(2002) bei seiner Analyse Cytokeratin-positiver Blutzellen 18 von 133 Proben
88
aufgrund schlechter Zytomorphologie, spärlicher Zellzahl oder falsch positiver
Färbungen aus. Auch Hilbe et al. (2003) schloss Präparate mit präparativen
Artefakten - von ihm definiert als dünne Schnitte, zu schwache Färbung,
Vorliegen
anthrakotischen
Pigments
oder
Luftblasen
-
aufgrund
ihrer
Beeinflussung der Messergebnisse von der Messung aus. Interessanterweise
konnten jedoch alle von der ACIS-Auswertung ausgeschlossenen Proben von
einem erfahrenen Pathologen ausgewertet werden (Hilbe et al., 2003).
In einer Studie zum Nachweis EGFR-positiver Metastasen im zentralen Nervensystem von Grupka et al. (2004) unterschieden sich in 3 von 55 Fällen die Ergebnisse der manuellen Mikroskopie von denen der ACIS-Analyse. Der Grund
lag bei 2 Fällen in einer leichten unspezifischen Hintergrundfärbung der Präparate, die von ACIS fälschlicherweise als positiv gewertet wurde. (Grupka et al.,
2004). Falsch positive Ergebnisse durch Hintergrundfärbung fand auch Hilbe et
al. (2003). Daher ist eine Grundvoraussetzung für gute und vergleichbare ACISErgebnisse die standardisierte Vorbehandlung und Färbung der Proben (Hilbe
et al., 2003).
Ein weiterer Nachteil von ACIS ist, dass alle Probenergebnisse von einem Pathologen nachkontrolliert werden müssen. Nur so kann sicher gestellt werden,
dass das diagnostisch ″richtige″ (= wichtige) Präparateareal ausgewertet wurde
(Witzig et al., 2002).
Bei Vergleich der ACIS-Werte der vorliegenden Arbeit mit den Ergebnissen der
manuellen Mikroskopie fiel auf, dass mittels ACIS lediglich die Flächen positiv
gefärbter Tumorzellen und deren Farbintensität ermittelt wurden. Bei Gleichsetzung des vom Pathologen ausgesuchten untersuchten Tumorareals mit 100%
Tumorfläche wurden ungefärbtes Tumorstroma, Gefäßlumina und (artifizielle)
Gewebespalten (aufgrund fehlender immunhistochemischer Anfärbung) von
ACIS nicht als Tumorareal erkannt. Aufgrund dieser technischen Limitationen
entsprach in keinem Fall die von ACIS bewertete Tumorfläche der tatsächlich
existierenden Tumorfläche und lag damit stets unter 100% Gesamttumorfläche.
Daher konnte bei einem cut-off-Wert von 85% positiv reagierender Tumorfläche
mittels ACIS gemessenen Werten nur in einem von 32 Fällen ein Lymphangiosarkom ermittelt werden.
Da bei der manuellen Mikroskopie diese ″negativen“ Flächen (zum Beispiel Gefäßlichtungen, Gewebespalten) nicht mit in die immunhistochemische Bewer89
tung Eingang fanden, lag der Anteil an Tumoren, bei denen mehr als 85% der
Tumorfläche mit D2-40 beziehungsweise Podoplanin angefärbt waren und die
damit als Lymphangiosarkome zu bewerten sind, im Vergleich zur ACIS-Messung um ein Vielfaches höher.
Ein weiterer Nachteil des ACIS-Systems in der vorliegenden Studie war, dass
ACIS nur einen Mittelwert für die gesamte Tumorfläche und die Farbintensität
ermitteln konnte. Im Gegensatz dazu analysiert der pathomorphologisch geübte
Diagnostiker die Präparate unter dem Aspekt der etwaigen Tumorheterogenität.
In dieser Bewertung werden auch Artefakte (zum Beispiel Hintergrundfärbung,
zu schwache Färbung) - in Abhängigkeit von der Erfahrung des Begutachters berücksichtigt und fließen mit in die Diagnose ein.
Zwar erlaubt ACIS eine sehr genaue Bestimmung der Intensitäten der Proteinexpressionen und damit der Farbintensität. Diese Faktoren spielen bei der histomorphologischen Diagnostik und Klassifizierung der Angiosarkome beziehungsweise Lymphangiosarkome jedoch eine untergeordnete Rolle. Vielmehr
sind hier morphologische Kriterien und die Einschätzung der Relation der immunhistochemisch positiv reagierenden lymphangioendothelialen Tumorflächen
zu den immunhistochemisch nicht mit D2-40 oder Podoplanin reagierenden
(= hämangioendothelialen) Tumorflächen von Bedeutung.
Neben dem in dieser Studie verwendeten Image-Analyse-System ACIS wird in
der Literatur eine Vielzahl anderer Systeme verwendet - mit Ziel der Quantifizierung der immunhistochemischen Farbprodukte - die größtenteils nach ähnlichen
Prinzipien arbeiten.
Die Analyse unter Verwendung des Computerprogramms Adobe Photoshop ein für jedermann erwerb- und nutzbares, einfaches und kostengünstiges Programm zur Image-Analyse - ermittelt ebenfalls Farbintensitäten. In der Literatur
wird es unter anderem als Methode zur Quantifizierung der Progesteron- (PR-)
und Östrogen- (ER-) Rezeptoranalyse beschrieben. Dazu werden digitalisierte
Bilder in Photoshop mit verschiedenen Werkzeugen bearbeitet. So wird zum
Beispiel ein positiv gefärbter Nukleus markiert; mit dem Befehl ″similar″ werden
automatisch alle gleichartig gefärbte Kerne markiert. Das so generierte Bild wird
in eine 8-bit Graustufenskala transformiert. Mittels eines Diagramms wird die
optische Dichte der ausgewählten Bereiche angegeben. Die Farbintensität wird
90
festgelegt, wobei der Mittelwert die Farbintensität des repräsentativ ausgewählten Nukleus wiedergibt. Nach gleichem Verfahren wird die Hintergrundfärbung
quantifiziert. Die immunhistochemische Farbintensität wird anschließend als Differenz zwischen nukleärer und Hintergrundfärbung bestimmt und als immuncytochemischer Index - mit willkürlich gewählten Einheiten (= arbitrary units) festgelegt. Bei der Bestimmung von ER / PR mittels Immunhistochemie zeigten
sich gute Übereinstimmungen mit den quantitativen Methoden DCC und EIA
(Lehr et al., 1997). In einer weiteren Versuchsreihe gelang Lehr et al. (1999) mit
Photoshop
die
komplette
Chromogen-Separation
in
doppelt
gefärbten
immunhistochemisch gefärbten Präparaten. Weitere 4 Jahre später konnte
mittels technisch hoch entwickelter Photoshop-Werkzeuge an Sudan-gefärbten
atherosklerotischen Präparaten die Areale positiver Färbung, die mittlere Dichte
der atherosklerotischen Areale und die Chromogendichte quantifiziert werden.
Dies erlaubte im Weiteren eine 3-dimensionale Messung der atherosklerotischen Läsion (Lehr et al., 2001). Matkowskyj et al. (2000 und 2003) gingen
einen Schritt weiter. Sie kombinierten die Image-Analyse von Photoshop mit
dem ″Matlab-Program″, einer Computer-Software zur Lösung mathematischer
Probleme und zur grafischen Darstellung der Ergebnisse (Matlab, 2007). In
Photoshop wurde die interessierende Region ausgeschnitten und als neues
Image in Matlab analysiert. Im Gegensatz zu Photoshop wurde hier statt der
Differenz von Chromogen und Hintergrundfärbung die Intensität des reinen
Chromogens über einen mit dem Primärantikörper gefärbten Objektträger
minus Kontrollobjektträger ohne Primärantikörper berechnet. Der zur DABChromogen-Auswertung genutzte Algorithmus kann auch für andere Chromogene genutzt werden und ermöglicht deren Quantifizierung mit guten Ergebnissen (Matkowskyj et al., 2003). Im Weiteren erlaubt ein modifizierter Algorithmus
(von (Matkowskyj et al. TIFFalyzer genannt), basierend auf mathematischen
Funktionen und physikalischen Gesetzen, eine quantitative Rezeptorzahlbestimmung. Dies wäre allein mit dem Photoshop-System, das nur Pixelzahl und
Farbintensität bestimmt, nicht möglich (Matkowskyj et al., 2003).
Photoshop und weitere publizierte Bildanalyse-Methoden, zum Beispiel
ImageLab (de Matos et al., 2006), AQUA (Camp et al., 2002), CMYK (Pham et.
al, 2007), Windows XP Pro / Image Pro-Plus (Tsambias et al., 2006;
Wattanapitayakul et al., 2000), CS-CAIA (Underwood et al., 2001), Opitmas
91
(Kuniyasu et al. 2000, 2003), NHI image software (Ohmori et al., 2006), RGBFarbabgleich (Cappallo et al., 2002), RGB/HSL (Hatanaka et al., 2003), IDRA
(Mink et al., 1992) oder das Micrometastasis Detection System MDS (Ellis et
al., 2002) messen lediglich Färbeintensitäten. Sie sind somit zur Quantifizierung
von Proteinexpressionen und zur Ermittlung von Immunreaktivitätsscores
geeignet. Da all die hier genannten ähnliche technische Limitationen aufweisen,
wären diese Systeme im Vergleich zu dem hier verwendeten ACIS nicht
geeigneter für die Beantwortung der vorliegenden Fragestellungen gewesen.
Lediglich Brey et al. (2003) lagen mittels der BN-Methode bei der
Quantifizierung der prozentualen Fläche exakt im Konfidenzintervall der
manuellen Mikroskopie, die als Goldstandard galt. Bei dieser Methode wurden
von Brey et al. 4 ″Images″ von einer randomisiert ausgewählten Stelle des
Objektträgers generiert, ein Weiß-Abgleich durchgeführt und das Rauschen
reduziert. Mittels manueller Selektion wurden DAB-positiv gefärbte Bereiche
von 2 Untersuchern mittels der Werkzeuge ″paintbrush″ und ″region of interest″
im Softwareprogramm IPLab markiert und
diese 24-bit Bilder in 8-bit
normalized blue Images konvertiert. Die Messgenauigkeit (= im Vergleich zur
manuellen Mikroskopie) der Methode wurde, basierend auf der prozentualen
Übereinstimmung der gefärbten Gewebe, durch die manuelle Selektion und
durch Kalkulieren der Variationen der Quantifizierung eines Färbeparameters
erreicht. Basierend auf der manuellen Observation DAB-gefärbter Pixel wurde
der Goldstandard für jedes Image konstruiert, die automatisierte Methode mit
dem Goldstandard verglichen und der Prozentsatz falsch klassifizierter Pixel
(= nicht übereinstimmend mit Goldstandard) berechnet (Brey et al. 2003).
Dass die computergestützte Image-Analysis keine diagnostische Klassifikation
ermöglicht, belegt auch die Studie von Lahm et al. (2004). Bei dieser Untersuchung zur Regeneration von Gelenkknorpel ließ sich lediglich ein Unterschied
der Knorpelbefunde ″vor Trauma / nach Trauma″ nachweisen, jedoch keine
Aussagen bezüglich einer etwaigen Graduierung, das heißt des Ausmaßes, der
Arthrose treffen.
Die manuelle Messung der vorliegenden Arbeit zeigte eine gute Übereinstimmung der D2-40- und Podoplaninwerte bezüglich der Farbintensität. Zwar wurden für D2-40 tendenziell geringfügig höhere Werte ermittelt, jedoch war der
92
Unterschied zu Podoplanin nur minimal (Median 0; 1. Quartil -0,09; 3. Quartil
0,28). Ein Grund für diese tendenziell höheren D2-40-Werte könnte sein, dass
es sich bei dem Farbprodukt für die Färbung mit dem Antikörper D2-40 um eine
intensive Rotfärbung der Antigene handelt (bei APAAP-Methode: Chromogen
Fuchsin). Dies kann eventuell subjektiv als ein intensiverer Farbeindruck gewertet werden als das mittels DAB erzeugte braune Farbprodukt bei immunhistochemischer Färbung der Präparate mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
Des Weiteren muss man beim Vergleich der manuellen Mikroskopie mit der
computergestützten Analyse berücksichtigen, dass das menschliche Auge ″optimale″ Farben nur mangelhaft als exakt definierte Farben wahrnehmen kann.
Der Einsatz der digitalen Mikroskopie ermöglicht dem Benutzer (per Computer)
eine absolute Farberkennung mit 256 Intensitätsleveln zu bestimmen. Das
Auge kann - bei der konventionellen Lichtmikroskopie - hingegen in der Regel
nur 4 (0 bis 3+) Farblevel unterscheiden; gerade auf der Farbpalette sehr dicht
beieinander liegende Farben können vom Auge ohne Hilfsmittel nicht ohne
weiteres als verschiedene Farben wahrgenommen werden (Bloom and
Harrington, 2004; Messersmith et al., 2005). Daher liegt die ″Hauptfehlerquelle“
der manuellen Mikroskopie nach Bloom und Harrington (2004) in der mangelnden “absoluten“ Farberkennnung.
Mit den Schwierigkeiten bei der Analyse von immunhistochemisch gefärbten
Präparaten sowohl mittels manueller (konventioneller) Mikroskopie als auch
computergestützter Image-Analyse haben sich auch Walker (2006) sowie
Taylor und Levenson (2006) beschäftigt. Walker (2006) weist darauf hin, dass
die manuelle Auswertung abhängig von der subjektiven Wahrnehmung, von
der Aufmerksamkeit und der abschließenden Interpretation des Untersuchers
ist. Dabei kann die Bewertung der Reaktivität als präsent / nicht präsent beurteilt werden, in Relation zum Ausmaß der Färbung oder in Relation zur Farbintensität stehen oder eine Kombination aus Ausmaß und Intensität sein. Ein Problem der automatisierten Analyse speziell bei Verwendung des Chromogens
DAB besteht in dem nicht-linearen Zusammenhang zwischen Färbeintensität
und Antigenmenge: bei niedriger Antigenmenge ist der Zusammenhang zwischen Antigenmenge und Farbintensität linear; die Farbintensität nimmt jedoch
mit zunehmender Antigenmenge nicht linear zu und kann in diesem Bereich in
ungenauen Messungen resultieren (Walker, 2006).
93
In der vorliegenden Arbeit, in der für Podoplanin ebenfalls das DAB-Chromogen
verwendet wurde, ging es jedoch lediglich um die Frage, ob eine Tumorzelle
das Antigen aufweist - und damit eine lymphangioendotheliale Differenzierung
zeigt - oder nicht. Der Nachweis hoher Antigenmengen war daher für die vorliegende Fragestellung ohne Relevanz.
Taylor und Levenson (2006) sehen die Hauptprobleme bei der Beurteilung immunhistochemisch gefärbter Präparate mittels konventioneller Mikroskopie,
ähnlich wie Walker (2006), in der subjektiven Interpretation. Im Bezug auf die
computergestützte Auswertung weisen sie darauf hin, dass selbst das beste
Image-Analyse-System keine exakten Resultate liefern kann, wenn die immunhistochemischen Färbungen nicht reproduzierbar sind, das heißt kein Färbestandard existiert (Taylor and Levenson, 2006).
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie erlauben die Schlussfolgerung, dass
computergestützte Auswert-Methoden in Fällen wie der vorliegenden Fragestellung, das heißt der Quantifizierung von Lymphangioendothelien - auch unter der
Frage , wie hoch der Anteil an Lymphangiosarkomen ist - die manuelle Mikroskopie lediglich komplettieren. Zu diesem Schluss kam auch Hilbe et al. (2003) in
seinen durchgeführten Untersuchungen. Unabhängig vom verwendeten System (ACIS, Photoshop oder anderes System) sind diese computergestützten
Auswertsysteme zur Diagnostik und Klassifizierung dermaler Angiosarkome als
nicht verlässlich zu bewerten. Aufgrund der vorgestellten Limitierungen ist die
Erfahrung des Pathologen für die Diagnostik angiosarkomatöser Tumoren weiterhin unabdingbar.
In der vorliegenden Arbeit lag das Verhältnis von Männern zu Frauen bei 2:1.
Dies stimmt mit den Beobachtungen von Weiss und Goldblum überein (Weiss
and Goldblum, 2001).
Auch die Altersverteilung mit einem überwiegend älteren Patientenkollektiv in
der vorliegenden Arbeit deckt sich mit der Literatur (Weiss and Goldblum 2001;
Fletcher, 2002; Abraham et al., 2007).
94
Fälle mit zwei und mehr Rezidiven
Es wurden sieben Gruppen von Patienten, bei denen aufgrund von Rezidiven
drei und mehr Proben vorlagen, gesondert untersucht. Unter der Frage, ob sich
der mischdifferenzierte Tumoranteil mit zunehmender Rezidivzahl verändert,
ließ sich in der vorliegenden Arbeit weder die Tendenz zu einer Zu- oder
Abnahme des lymphangioendothelialen Mischdifferenzierungsanteils, noch die
Tendenz eines unveränderten Mischdifferenzierungsanteils belegen. Bei der
Bewertung dieser Aussage ist zu berücksichtigen, dass hier nur sehr kleine
Fallzahlen untersucht wurden. Um eine Tendenz ermitteln zu können, sollte in
einer weiteren Studie ein Vielfaches von Proben von Patienten mit Rezidiven
unter dieser Fragestellung untersucht werden.
95
7
Zusammenfassung
In den letzten Jahren wurde nachgewiesen, dass Angiosarkome neben einer
hämangioendothelialen auch eine lymphangioendotheliale (Misch-) Differenzierung aufweisen können. Bisher gibt es keine Untersuchungen, in welchem Umfang diese Mischdifferenzierung in dermalen Angiosarkomen nachweisbar ist.
Dies mag daran liegen, dass erst seit vergleichbar kurzer Zeit zwei spezifisch
lymphangioendotheliale Antigene erkennende Antikörper verfügbar sind: der
Antikörper D2-40 gegen M2A sowie der Antikörper gegen Podoplanin.
In der vorliegenden Arbeit wurden von 32 Patienten insgesamt 58 dermale Angiosarkome (Primärtumore und Rezidive) mit dem Antikörper D2-40, beziehungsweise dem Antikörper gegen Podoplanin immunhistochemisch gefärbt
und unter folgenden Aspekten untersucht: 1. die Ausprägung einer etwaigen
lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung dermaler angiosarkomatöser
Gefäßtumoren, 2. die Vergleichbarkeit der Auswertung der immunhistochemischen Färbeergebnisse mittels manueller Mikroskopie und mittels computergestütztem Bild-Analyse-Verfahren (ACIS), 3. die Vergleichbarkeit der Marker D240 und Podoplanin und damit die sich hieraus ergebende Relevanz in der histopathomorphologischen Diagnostik und 4. eine etwaige Veränderung der lymphangioendothelialen Mischdifferenzierung in Rezidiven (19 Rezidive von 7
Patienten).
Die Haupthypothese, dass mehr als 55% (nämlich 93,75%) der dermalen Angiosarkome eine lymph- und hämangioendotheliale Mischdifferenzierung aufweisen, wurde unter Verwendung des Antikörpers D2-40 mittels der ACIS-Auswertung statistisch signifikant (p <0.001) bestätigt, ein Tumor wurde als (reines)
Lymphangiosarkom sowie ein weiterer Tumor als (reines) Hämangiosarkom
klassifiziert. Der mittels manueller Mikroskopie erhobene Anteil der mischdifferenzierten dermalen Angiosarkome lag nur bei 40,63%, jedoch wurden mittels
manueller Mikroskopie 43,75% der Fälle als Lymphangiosarkom und 15,63%
ein Hämangiosarkom detektiert. Die Diskrepanz der Werte der ACIS-Methode
und der manuellen Mikroskopie ist als Methoden-bedingt zu erklären. Aufgrund
seiner technischen Limitationen (fehlende Messung von nicht gefärbten Tumoranteilen wie Stroma) und lediglich der Angabe von Mittelwerten für die Farbintensität und die
immunhistochemisch angefärbte Tumorfläche, kann mittels
96
ACIS zwar eine Proteinexpression quantitativ bestimmt werden, jedoch ist dieses System nur sehr bedingt für die Differentialdiagnose dermales Angiosarkom / dermales Lymphangiosarkom geeignet. Dies ist mittels manueller Mikroskopie möglich, die sowohl die Färbung als auch die Tumorfläche der Präparate
differenzierter interpretiert. Somit ist für die Diagnostik der lymphangioendothelialen Differenzierung dermaler Angiosarkome die manuelle Mikroskopie der
computergestützten Auswertung überlegen.
Basierend auf den Ergebnissen der manuellen Mikroskopie sind die derzeit
kommerziell verfügbaren Marker des lymphangischen Endothels, D2-40 und
Podoplanin, als für die Diagnostik gleichwertig anzusehen. Dieses Ergebnis
stimmt mit publizierten Studien über Podoplanin und D2-40 überein. Somit sind
sowohl D2-40 als auch Podoplanin als relevante Marker zur Diagnose mischdifferenzierter dermaler angiosarkomatöser Gefäßtumoren einzustufen. Die Frage,
warum in der Primärdiagnose die Diagnose "Lymphangiosarkom" so selten gestellt wurde, ist damit zu erklären, dass diese beiden Marker erst seit relativ kurzer Zeit kommerziell verfügbar sind und dass das im Vergleich zur Literatur in
der hier vorgelegten Arbeit sehr große Probengut aus einem Zeitraum von 19
Jahren zusammengetragen wurde.
Aufgrund der hier vorliegenden Befunde eines hohen Lymphangiosarkomanteils
bei dermalen Angiosarkomen ist es daher empfehlenswert, die immunhistologische Diagnostik von Hautproben mit Verdacht auf ein Angiosarkom, um die immunhistochemische Bestimmung von M2A (mittels des Antikörpers D2-40) und
Podoplanin zu ergänzen.
In der Frage einer etwaigen Entwicklung der Mischdifferenzierung bei Angiosarkom-Rezidiven konnte kein Trend zu einer veränderten Mischdifferenzierung
beobachtet werden. Allerdings wurde in der hier vorgelegten Arbeit nur eine geringe zur Verfügung stehende Fallzahl betrachtet.
97
8
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109
9
Anhang
Puffer und Lösungen für die immunhistochemische Färbung
- 1%ige BSA / PBS:
2,00g BSA (Bovines Serum Albumin)
ad 200ml PBS auffüllen
- 10mM Citratpuffer:
2,941g Tri-Natriumcitrat-Dihydrat
ad 1000ml Aqua dest. auffüllen
pH 6 einstellen
- TBS-Puffer:
Stammlösung:
53,00g NaCl
12,00g Tris (-hydromethyl-)aminomethan
ad 1000ml mit Aqua dest. auffüllen
Gebrauchslösung:
10ml Stammlösung und 90ml Aqua dest. auf pH 7,4 einstellen
- Tris–HCl–Puffer 50mM:
60,57g Tris (-hydromethyl-)aminomethan
mit 1N HCl auf pH 7,4 einstellen
auf 1000ml mit Aqua dest. auffüllen
- Trypsinlösung:
70mg Trypsin
70mg CaCl2 x 2H2O
ad 70ml 50mM Tris-HCl-Puffer pH 7,8
- Perhydrollösung:
0,5 ml Perhydrol 30%
100ml Aqua dest.
- Normalserum:
Ansatz für 10 Schnitte: 1000μl 1%ige BSA/PBS
15μl Normalserum
- ABC-Komplex:
Ansatz für 10 Schnitte:
20μl Komponente A
20μl Komponente B
1000μl 1%ige BSA / PBS
110
Tab. A 1: Excel-Tabelle mit den erhobenen IRS-Werten für manuelle Mikroskopie und
ACIS mit dem Antikörper gegen Podoplanin.
ID
1
2
6
8
10
11
12
13
15
16
17
18
20
23
24
26
29
30
31
33
34
35
36
37
39
40
44
45
48
52
53
54
Podo_1_m Podo_2_m Podo_3_m Podo_4_m Podo_ges_m Podo_ges_ ACIS
1,3
2
0,5
3
2
2
3
2,6
2,8
2
1,4
2,5
2
2,5
2,3
2,3
0,2
2
0,1
2,2
2,7
0,4
0
0
3
3
0
0,1
0
0
0
0
0,8
2
1,3
2,5
3
2
3
3
3
3
1,8
3
3
2,5
2,2
2,4
0,1
2,4
0,2
0,9
2,4
0,05
0,06
2
3
3
0
0,3
0
0
0
0
1,1
1,8
1,1
2,5
2,5
2,5
3
2,7
3
3
2,2
3
3
2,7
2,2
2,4
0,1
2,5
0
2,5
3
0,6
0
2,5
3
3
0
0,3
0
0
0
0
1,9
1
1,3
2,5
3
2
2,5
2
3
2,5
1,2
2,3
3
2,4
1,8
1,5
0,5
1,8
0
2,5
2,5
0,1
0
2,5
3
3
0
1
0
0
0
0
1,33
1,4
1,08
2,63
2,88
2,38
2,88
2,6
2,95
1,8
1,55
2,7
3
2,53
2,2
2,37
0,25
2,18
1,8
2,4
2,65
0,29
0,2
2,5
3
3
0
0,23
0
0
0
0
0,78
0,12
0,12
0
2,1
0,03
0,18
0,6
0,75
0,09
0,84
1,74
0,03
0,27
0,36
0,36
0,03
0,42
0,03
0,27
0,78
0,39
0,27
0,42
0,03
0,48
0,12
0,12
0,03
0,12
0,12
0,06
111
Tab. A 2: Excel-Tabelle mit den erhobenen IRS-Werten für manuelle Mikroskopie und
ACIS mit dem Antikörper D2-40.
D240_1_m D240_2_m D240_3_m D240_4_m D240_ges_m D240_ges_ACIS
2,1
1,9
1,7
2,7
2,5
2
3
2,4
2,4
2,5
2,6
2,7
2
3
1,8
3
0,1
3
0,45
2,5
1,4
0,2
0,15
3
3
3
0
0,8
0,1
0
0
0,2
2,3
2,2
2,2
3
2,5
1
3
3
3
1
2,2
2,5
1,5
2,7
1,7
2,5
0,4
3
1,5
2,2
3
0
0
2,3
3
3
0,2
0,9
0
0
0
0
3
2,5
2,2
2,5
2,5
2,5
3
2,7
3
1
2
2,6
1,5
3
2,1
3
0,4
3
0,6
1,4
3
0
0
2,5
3
3
0,2
0,9
0
0
0
0
2,2
2
2
3
2,5
0
3
2,6
3
0,6
1,9
2,5
0
2,6
2,1
2,6
0,2
2,3
2
2,3
2,6
0
0
2,5
3
3
0
0,9
0
0
0
0
2,2
2,03
2,03
2,8
2,5
2,3
3
2,48
3
1,27
1,97
2,58
1,5
2,83
1,93
2,78
0,28
2,83
1,14
2,33
2,88
0,2
0,15
2,67
3
3
0
0,95
0
0
0
0
1,12
0,72
1,2
1,14
1
0,09
0,51
2,07
2,52
0,15
1,38
1,47
0,04
1,17
0,75
1,53
0,3
2,7
0,06
0,72
2,31
0,09
0,21
0,6
0,09
1,56
0,09
0,6
0,15
0,09
0,33
0,03
112
Tab. A 3: Excel-Tabelle mit den erhobenen Daten für die ACIS-Auswertung (Teil1).
ID Geschl Alter_1 Lok_1 Diag_1 d240_1 cd34_1 podo_1 Alter_2 Lok_2 Diag_2
1
2
6
8
10
11
12
13
15
16
17
18
20
23
24
26
29
30
31
33
34
35
36
37
39
40
44
45
48
52
53
54
2
2
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
2
2
1
1
1
1
2
2
2
1
2
1
1
1
1
1
85
78
77
75
86
87
80
79
75
65
74
72
81
81
80
66
77
78
65
74
63
72
71
67
56
58
48
42
21
20
33
15
1
5
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
3
1
2
3
1
1
3
4
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
3
2
5
1
34
24
40
38
50
3
17
69
84
5
46
49
2
38
25
51
15
90
3
20
2
24
77
4
7
21
3
20
5
3
11
1
67
35
34
8
16
6
7
2
5
30
6
2
56
5
18
3
6
29
17
5
2
2
6
60
15
4
42
56
13
3
21
11
26
4
4
999
70
1
6
20
25
3
28
58
1
9
12
12
1
14
1
14
1
9
26
13
9
16
4
4
1
4
4
2
999
79
74
78
999
999
999
81
999
999
999
73
82
999
80
68
999
999
65
999
999
999
999
68
999
58
999
44
22
999
999
16
999
5
1
1
999
999
999
1
999
999
999
1
1
999
1
1
999
999
1
999
999
999
999
3
999
1
999
3
4
999
999
1
999
1
1
1
999
999
999
6
999
999
999
1
1
999
1
1
999
999
1
999
999
999
999
1
999
1
999
1
3
999
999
1
113
Tab. A 4: Excel-Tabelle mit den erhobenen Daten für die ACIS-Auswertung (Teil 2).
d240_2
999
22
51
80
999
999
999
79
999
999
999
45
2
999
14
40
999
999
32
999
999
999
999
0
999
52
999
15
2
999
999
0
cd34_2
999
9
10
1
999
999
999
9
999
999
999
36
4
999
27
3
999
999
5
999
999
999
999
8
999
23
999
20
8
999
999
7
podo_2 Alter_3 Lok_3 Diag_3
999
7
25
6
999
999
999
29
999
999
999
22
3
999
6
55
999
999
10
999
999
999
999
0
999
41
999
8
1
999
999
0
999
79
999
999
999
999
999
999
999
999
999
999
82
999
999
68
999
999
999
999
999
999
999
999
999
59
999
47
22
999
999
16
999
2
999
999
999
999
999
999
999
999
999
999
1
999
999
1
999
999
999
999
999
999
999
999
999
1
999
3
4
999
999
1
999
1
999
999
999
999
999
999
999
999
999
999
1
999
999
1
999
999
999
999
999
999
999
999
999
1
999
1
3
999
999
1
d240_3
999
59
999
999
999
999
999
999
999
999
999
999
1
999
999
49
999
999
999
999
999
999
999
999
999
9
999
4
10
999
999
2
cd34_3
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35
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Tab. A 5: Excel-Tabelle mit den erhobenen Daten für die ACIS-Auswertung (Teil 3).
Lok_4 Diag_4 d240_4 cd34_4 podo_4 Alter_5 Lok_5 Diag_5 d240_5 cd34_5 podo_5
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Danksagung
Ich möchte ganz herzlich DANKE sagen….
Frau PD Dr. A. Müller für das Überlassen des Themas, für ihr Engagement, die
fachliche Unterstützung, die gute Betreuung und ihre konstruktive Kritik in allen
Phasen der Arbeit.
Herrn Dr. H. Griefingholt, Gemeinschaftspraxis für Pathologie, Bonn, der sich
trotz seiner täglichen diagnostischen Arbeit die Zeit genommen hat, diese Arbeit
bezüglich der computergestützten Auswertung aktiv zu unterstützen und für die
Anregung den Aspekt der Rezidiventwicklung mit einzubeziehen.
Frau Diplom. Math. A. Schneider aus dem Institut für Medizinische Biometrie,
Mainz, für Ihr großes Engagement und die konstruktive Kritik bei der
statistischen Auswertung.
Den MTA’s des Instituts für Kinderpathologie der Universitätsklinik, Mainz, für
Ihre Unterstützung und Hilfsbereitschaft.
Der Fachklinik Hornheide, Münster-Handorf, für das Bereitstellen des Untersuchungsgutes.
Meinem „alten“ Chef Dr. H. Bonse aus dem Pathologischen Institut des DRK–
Krankenhaus, Neuwied, der nicht nur meine Pläne zu studieren unterstützt hat,
sondern mir für diese Dissertation auch Literatur zur Verfügung stellte.
Meinen lieben Eltern, die mich in allen meinen Vorhaben immer unterstützt und
an mich geglaubt haben.
Meiner lieben Schwester Nadine für ihr akribisches Korrekturlesen und ihre
Hilfe bei kleineren Problemen mit dem Computer.
Meinem lieben Verlobten Markus für seine Unterstützung, seine Geduld und
sein Vertrauen in mich.
Michael Strack, der mir bei größeren Problemen mit dem Computer hilfreich zur
Seite stand.
Lebenslauf
•
Geboren am 31.12.1974 in Koblenz
•
August 1981 Einschulung in die Grund- und Hauptschule; Rhens
•
August 1985 bis Juni 1994 Schülerin am Staatlichen Hilda-Gymnasium;
Koblenz
•
Juni 1994 Abitur am Staatlichen Hilda-Gymnasium; Koblenz
•
September 1994 bis August 1997 Ausbildung zur MTA/L an „Die Schule“;
Koblenz
•
Während der Ausbildung Nebenbeschäftigung im Bereich Bakteriologie der
Gemeinschaftspraxis für Labormedizin und Mikrobiologie Dres. Portheine,
Schmitt, Walscheid, Thuy; Koblenz
•
September 1997 bis Juli 1999 MTA/L im Zentrallabor des DRK-Krankenhauses; Neuwied
•
August 1999 bis April 2003 MTA/L im Pathologischen Institut des DRKKrankenhauses; Neuwied
•
April 2003 Immatrikulation an der Johannes Gutenberg-Universität Mainz für
das Fach Zahnmedizin
•
März 2004 Naturwissenschaftliche Vorprüfung nach der Approbationsordnung
für Zahnärzte (Vorphysikum)
•
Oktober 2005 Zahnärztliche Vorprüfung nach der Approbationsordnung für
Zahnärzte (Physikum)
•
Juli 2008 Abschluss des Staatsexamens für Zahnmediziner
•
Während des Studiums Nebenbeschäftigung im Bereich Bakteriologie des
MVZ für Laboratoriumsmedizin Koblenz-Mittelrhein; Koblenz