entwicklung eines multiplex Pcr

entwicklung eines multiplex Pcr-Systems zum schnellen und einfachen
nachweis von Krankheitserregern in der lebensmittelkette
D i p l . - L e b e n s m i t t e l c h e m . A . D a c k e , D r . W. H a u s e r , P r o f . D r . H . W e b e r
ProBlemStellung
zi el Set zung
Humanpathogene Keime in Lebensmitteln sind eine der
Nachweis für Bakterien etabliert. Diese Methode erlaubt die
Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines innovativen mole-
wesentlichen Ursachen für Erkrankungen des Menschen.
spezifische Vervielfältigung schon geringer Mengen geneti-
kularbiologischen Verfahrens zur Lebensmittelanalyse in Form
Die Notwendigkeit einer schnellen und sicheren Analytik
schen Erbmaterials, sowie eine exakte Identifizierung und
eines »ready to use« Multiplex-PCR-Schnelltests mit den fol-
dieser Erreger wird immer deutlicher. Infolgedessen sind in
die Quantifizierung dessen.
genden Eigenschaften:
» effektivität Eine Lebend/Tot-Unterscheidung der Zielorga-
der modernen Lebensmittelanalytik molekularbiologische
Verfahren zunehmend fester Bestandteil der mikrobiolo-
Die Grenzen des PCR-Verfahrens liegen in der fehlenden
gischen Diagnostik. Neben den langwierigen kulturellen
Unterscheidung zwischen den lebenden und toten Keimen
» effizienz Analyseergebnisse innerhalb von 4 Stunden
Methoden hat sich vor allem die Real-Time-PCR (Echtzeit
in einer Lebensmittelprobe und kann zu falsch-positiven
(nach Voranreicherung) bei gleichzeitiger Identifizierung
Polymerase-Kettenreaktion) als schneller und sensitiver
Ergebnissen führen.
und Quantifizierung mehrerer Parameter
nismen für ein verlässlicheres Analyseergebnis
Pri nziP d er Sc hne l l me thode
zellanreicherung Für die Analyse einer Verdachtsprobe wird
Analysemethode Die Real-Time-PCR ermöglicht es, spezifisch
vorab eine Vorkultur angesetzt, um darin enthaltene Keime
definierte DNA-Sequenzen zu vervielfältigen und diese auch
anzureichern. Aus der Voranreicherung werden dann die Ziel-
gleichzeitig durch den Einsatz fluoreszenzmarkierter Primer-
organismen isoliert und direkt eine Lebend/Tot-Unterschei-
1. Denaturation bei 95 °C
- Trennung der DNA-Doppelhelix in ihre Einzelstränge
Reporter
sonden zu detektieren. Die Vermehrung der Ziel-DNA erfolgt in
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Vorwärtsprimer
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einer temperaturabhängigen zyklischen Reaktion von wieder-
dung durchgeführt.
holten Phasen der Denaturierung, des Primer-Annealing und
tote Zelle
PMA diffundiert nicht in lebende Zellen
Quencher
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Rückwärtsprimer
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der Strangsynthese mit Hilfe einer Polymerase (s. Abb. 2).
lebende Zelle
2. Annealing bei 64 °C
Während eines Zyklus wird zunächst die doppelsträngige DNA
PMA-Inkubation / Licht
- Sequenzspezifische Anlagerung der PCR-Primer und der Fluoreszenz-Sonde
- eine intakte Sonde sendet kein Fluoreszenzsignal
durch Erhitzen (ca. 95 °C) in ihre Einzelstränge aufgetrennt
(1). In der folgenden Annealing-Phase binden die sequenzDNA der toten Zellen ist PMA-verlinkt und
wird in der PCR nicht mehr amplifiziert
spezifischen Primer und die fluoreszenzmarkierte Sonde an
Abb. 1 – DNA-Verlinkung der toten Zellen mit Propidium-Monoazid
ihre passenden Bindungsstellen auf den Einzelsträngen (2).
PmA-Behandlung Die Unterscheidung zwischen lebenden
Ausgehend von den beiden Primern werden nun durch das
und toten Keimen (s. Abb. 1) gelingt mit dem Fluoreszenzfarb-
Enzym Polymerase, bei ca. 72 °C komplementäre DNA-Stränge
stoff Propidium Monoazid (PMA). Das Reagenz bindet und ver-
synthetisiert (3). Trifft die Polymerase dabei auf die markierte
linkt – nach einer Photoreaktion – irreversibel mit der doppel-
Sonde, wird diese abgebaut und so der Fluoreszenzfarbstoff
strängigen DNA. Eine Amplifikation der verlinkten DNA mit der
frei. Durch Wiederholung der Zyklen vervielfältigt sich das PCR-
PCR ist nicht mehr möglich. Bei der Vorbehandlung der Zellen
Produkt und entsprechend steigt die Stärke des Fluoreszenz-
wird ausgenutzt, dass PMA biologisch intakte Zellmembra-
signals.
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selektive Bestimmung der infektiösen Keime möglich. Für die
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3. Elongation bei 72 °C
- die Polymerase erzeugt den neusynthetisierten DNA-Strang und spaltet die Sonde ab
- Fluoreszenzsignal ist messbar
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nen nicht durchdringen kann und so nur an die DNA der membrangeschädigten Zellen (tote Keime) bindet. Somit ist eine
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Polymerase
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Als Multiplex-PCR durchgeführt, werden für jeden Nachweis
auf definierte DNA-Sequenzen verschiedene Primerpaare und
anschließende Detektion mit der Real-Time-PCR wird die DNA
Sonden mit entsprechend unterschiedlicher Fluoreszenzmar-
der Zellen extrahiert.
kierung verwendet.
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Abb. 2 – Vereinfachte Darstellung des Real-Time-PCR Verfahrens
e tA PPen d eS Proje KteS
» Etablierung einer einheitlichen Probenextraktion
» Optimierung des Protokolls für die Lebend/Tot-Unterscheidung (PMA-Behandlung)
» geeignete Zielsequenzen auf dem Genom der zu bestimmenden Keime ermitteln, um die entsprechenden Primer-
» gleichzeitige Analyse mehrere Parameter mit der MultiplexPCR-Methode
systeme zu designen
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