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Die Chemie der DNA, DNA-Synthese
Phosphoramidit-Methode (Caruthers JACS81, 3185)
PIII ist reaktiver (schnellere Kupplung) als PV, Aktivierung als Phosphoramidit-Bausteine
Schutzgruppen
5´-O-Dimethoxytrityl (DMT), Isobuttersäure, Benzoesäure, Cyanoethyl für Phosoramidit
Temporäre Schutzgruppen werden nach jedem Kupplungsschritt gespalten (DMT). Permanente
Schutzgruppen werden erst am Ende der Synthese abgespalten (N6-Benzoyladenin, N2Isobutyrylguanin). Cyanoethyl wird nach der Oxidation des P entfernt.
Festphasensynthese DNA
Modular aufgebauter Biopolymere werden über Festphasensynthese aufgebaut. Zur
chemischen Synthese von Biopolymeren wie Oligonukleotiden ist eine seit Jahren etablierte
Methode.
Zur Anknüpfung an den Träger CPG wird der Linker Succinat verwendet. Das fertige
Oligonucleotid wird mit NH3 (fl) vom Träger abgespalten und entschützt.
Die Phosphit-Triestermethode (Phosphoramiditmethode): 1. Entschützung des 5'-OH, 2.
Kopplung eines Phosphoramidits, 3. Maskierung der freien OH-Gruppen mit Acetanhydrid, 4.
Oxidation der Phosphors.
Um die Zahl der Nebenprodukte gering zu halten, werden die nicht verlängerten DNA-Stränge
nach dem Kopplungsschritt zunächst acetyliert, um nicht reagierte Hydroxylfunktionen zu
maskieren. Anschließend werden die bei der Kopplung entstandenen Phosphorigsäuretriester
zu Phosphorsäuretriestern oxidiert. Nach Abspaltung der 5'-DMT-O-Schutzgruppe wird dann ein
neuer Zyklus eingeleitet.
A Geyer
OC4 2011
Mit zunehmender Kettenlänge der DNA wird die Gesamtausbeute der Synthese schlechter.
Deshalb ist es notwendig, sehr gute Ausbeuten in jedem Verlängerungszyklus zu erzielen.
1977 Synthese eines Gens, heute 99,8% Verknüpfungseffizienz
Bei der RNA-Synthese muss die 2'-OH-Gruppe während der Synthese geschützt sein.
Abgestufte Reaktivität von P(III)-Derivaten PCl3, P(NR2)3, P(OR)3,
Synthese der Phosphorigsäuremonoamide (Phosphorsäureamidite) aus PCl3,
Mechanismen der Esterspaltung, Hydrolyse der Phosphorsäure-mono-, di, und triester.
Aufbau der Nucleotide für die Synthese
Dabei wird zuerst die NH2-Gruppe mit der benzoyliert, dann eine 5'-O-DMT-Schutzgruppe
eingeführt und schließlich in 3'-Position phosphinyliert Exozyklischen Aminofunktionen werden
normalerweise als Amide geschützt. Diese gewährleisten ausreichende Stabilität bei den für die
Oligonukleotidsynthese üblichen pH-Werten, lassen sich aber bei Bedarf basisch spalten. Die
Benzoylschutzgruppe ist die klassische Schutzgruppe für Adenosin und dessen Derivate in der
Oligonukleotidsynthese. Spaltung erfolgt mit wässrigem Ammoniak innerhalb von 120 min bei
70 °C quantitativ.
Es wird man zunächst die freien OH-Gruppen transient mit Trimethylchlorosilan geschützt mit
Überschuss an TMS-Cl. Umsetzung des TMS-geschützten Zwischenproduktes mit einem
Überschuss an Benzoylchlorid ergab das benzoylierte 2'-O-Me-Adenosin. Die TMS-Gruppen
wurden mit verdünntem Ammoniak abgespalten und der Ansatz anschließend eingeengt.
A Geyer
OC4 2011
Übung 4
Doppelhelix, Basenpaarung DNA, Entwerfen eines Komplementärstranges,
Nucleotidsynthese, Depurinierung von Adenosin, Reagenzien DNA-Synthese,
Festphasensynthese Vorteile/Nachteile
Fragen und Aufgaben
Machen Sie einen Strukturvorschlag für ein CyanoethyldiisopropylaminoPhosphor(III)amidit des 2´-Deoxyadenosins. Welche weiteren funktionellen Gruppen
müssen geschützt werden? Schlagen Sie geeignete Schutzgruppen für die DNAFestphasensynthese vor.
Vervollständigen eines des Kreisprozess der Kupplungsschritte Phosphoramidit-Methode:
Anknüpfung an CPG, geschützte P(III)-Derivate, Abspaltung und Entschützung
RNA ist labiler gegen Hydrolyse als DNA. Geben Sie eine Erklärung für diese
Beobachtung.
Ordnen Sie die nachfolgenden Reagenzien nach steigender Acidität (Säurestärke) und
schlagen Sie vor welche Schutzgruppen oder funktionellen Gruppen bei der
Phorphoramiditmethode der DNA- Synthese aktiviert oder gespalten werden:
Dichloressigsäure. Tetrazol, Ammoniak und HCl.
Nennen Sie jeweils vier mögliche Vorteile sowie Nachteile der Festphasensynthese von
DNA am polymeren Träger im Vergleich zur Synthese in homogener Lösung.
Vervollständigen Sie die fehlenden Reagenzien oder Zwischenprodukte einem cyclischen
Reaktionsschema zur Festphasensynthese von DNA.
A Geyer
OC4 2011
B-DNA unter physiologischen Bedingungen
Basenabstand: 3.4 A
Durchmesser: 20 A
Watson-Crick-Basenpaarung
Schnelle Basenrotation der isolierten Nucleoside.
In DNA vollständig in anti-Konformation.
A Geyer OC4 2011
O
HN
O
N
N
N
HN
DNA-Synthese mit der Phosphoramiditmethode
N
dRib
N
BzA
N
O
N
N
NH
N
dRib
O
OMe
O
O
dRib
BzC
HN
N
N
H
O
N
OCH3
IbG
N
O
N
O
HN
Schutzgruppen auf
den Nucleobasen
DMT
(= 4,4'-Dimethoxytrityl)
N
MeO
N C
O
O
O
P
O
O
N
O
O
O
Bs (gesch.)
CH3O
O
CPG
O
NC
Der geschützte Baustein
für die Synthese
P
N(iPr)2
O
O
Phosphoramidit
(= Phosphorigsäuremonoamid)
M.H. Caruthers Acc. Chem. Res. 1991, 278
A Geyer OC4 2011
Aktivierung des Phosphoramidits durch Tetrazol
DMTO
O
Bs
(g.)
N
DMTO
N
NH
N
O
P
NC
N
O
N(iPr)2
O
Bs (g.)
O
P
NC
N
DMTO
N
O
N
Bs (g.)
O
O
NC
O
DMTO
O
Bs (g.)
O
OH
Cl
O
O
O
Bs (g.)
Phosphit
OH
Cl
O
P
Bs (g.)
O
O
O
O
O
Entschützung des an CPG
(graue Kugel) gebundenes
Nucleosids
Festphasensynthese auf
CPG: controlled pore glass
A Geyer OC4 2011
Oxidation zum Phosphorsäuretriester und nächster Kupplungsschritt
"Capping"
DMTO
O
O
O
NC
via
Cl
O
O
Bs (g.)
Cl
OH
1) Ac2O, DMAP,
2,6-Lutidin
2) I2, H2O
P
O
Bs (g.)
O
O
NC
DMTO
Bs (g.)
O
P
O
O
O
Bs (g.)
O
Phosphit
O
P
O
O
Phosphat
I
O
I
O
O
Finale Entschützung
DMTO
O
DMTO
Bs (g.)
O
O
Bs
+
konz. NH4OH
H
NC
H
O
O
- NC
O
P
O
O
O
O
O
O
O
O
Bs
+
O
H2N
+
O
O
HO
O
H2N
O
P
Bs (g.)
+
NH
H2N
Ph
N
H
A Geyer OC4 2011
Die Wiederholungsschritte im Überblick
A Geyer OC4 2011
Anknüpfung des ersten Bausteins an das Trägermaterial CPG (controlled pore glass)
DMTO
DMTO
O
Base
O
O
O
DMTO
O
O
Base
DMAP, py
H2N-CPG
OH
O
DCC
O
Base
O
CPG
N
O
OH
wird leicht durch
Aminolyse gespalten
O
O
H
Synthese des Kupplungsbausteins ausgehend vom geschützten Nukleosid
NHBz
N
NHBz
N
N
2N NaOH
HO
H2O/MeOH/THF
BzO
O
N
N
N
N
O
N
selektiv nur
OBz-Verseifung
OBz
NHBz
OH
N
NHBz
Cl
DMTCI
Bu4N ClO4
py
N
N
DMTO
O
N
N
DMTO
P
N
N
O
O
N
CN
N
selektiv primäre OH
Hünig-Base, THF, DIPEA
OH
N
O
P
CN
O
Cyanoethoxy-bis-(diisopropylamino)-phosphin
A Geyer OC4 2011
Synthese der Nukleoside
Bei Ribose hilft der Nachbargruppeneffekt bei der
diastereoselektiven Bildung des -Nucleosids
Base
BzO
BzO
O
OBz
OAc
O
LewisSäure
-Selektivität
O+
O
OBz
OBz
N
Ph
BzO
O
NHBz
Fehlender Nachbargruppeneffekt: Bei Deoxyribose
gibt es Gemische, die getrennt werden müssen
NHBz
O
SiMe3
BzO
O
OAc
H3C
N
BSA
SiMe3
N
BzO
OBz
N
N
BzO
O
OBz
H
O
N
OBz
N
NHBz
Me3Si
N
N
N
NHBz
N
N
N
OBz
N
N,O-bis(trimethylsilyl)acetamid
NHBz
N
BzO
SnCl4, CH3CN
(auch TMSTf)
OBz
N
N
N
N
N
NHBz
N
O
N
N
N
N
bessere Löslichkeit
bevorzugt N9-Nucleophilie
Selektivität:
-N9 > -N7 >> -N9 > -N7
A Geyer OC4 2011
Die Chemie
der DNA
Die Doppelhelix der 2´-Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic
acid) ist auf Histone (basische Strukturproteine) aufgewickelt, welche sich
zu supramolekularen Überstrukturen
organisieren, die als Chromosome im
Mikroskop sichtbar sind.
A Geyer OC4 2011
Digitalisierung von Information
Speicherung enormer Datenmengen mit wenigen Zeichen
Computer: 0, 1
4-Bit Binärcode
DNA: A, T, C, G
Der genetische Code:
Drei Basenpaare kodieren eine
Aminosäure: 64 mögliche Zeichen
A Geyer OC4 2011
Laborchemie
Zellchemie
Sequentielle Änderung der chemischen
Umgebung
Parallele Reaktionen, Netzwerke,
Fließgleichgewicht
Selektivität durch getrennte
Reaktionskolben
Selektivität durch molekulare Erkennung
Semipermeable Membranen
batch-weise Zugabe der Reagentien
1 bar, RT, enger pH-Bereich
Variation Lösemittel, pH, Temperatur,
Druck
mRNA, trRNA, Ribosomen, Proteine
D. S. Goodsell Sci. Am. 2000, 230
A Geyer OC4 2011
Blick in eine Zelle
Die richtige zeitliche und räumliche
Kombination von Lipiden, Aminosäuren,
Kohlenhydraten und Nukleinsäuren ist
essentiell für das Leben.
CCTGAGCCAACTATTGAT
DNA
transcription
CCUGAGCCAACUAUUGAU
mRNA
translation
106 fache Vergrößerung
Transkription
DNA wird abgelesen
A Geyer OC4 2011
PEPTID
Protein
Transkription der Erbsubstanz Desoxyribonukleinsäure (DNA)
1-millionenfach
10-millionenfach
30-millionenfach vergrößerte DNA
DNA-Doppelhelix
DNA-Basenpaarung
DNA-Einzelstrang
A Geyer OC4 2011
Translation der messanger-RNA (mRNA)
Ribosom
http://www.rcsb.org/pdb/
106 fache Vergrößerung
Translation
mRNA wird in Proteine übersetzt
A Geyer OC4 2011
DNA ist der Bauplan, Proteine führen die zellulären Funktionen aus.
Synthetische Liganden (Medikamente) können auf jeder Stufe der Proteinbiosynthese
eingreifen und so die Entwicklung eines unerwünschten Organismus stören (Antibiotikum)
oder Krebszellen an der Vermehrung hindern (Cytostatikum)
A Geyer OC4 2011
Wie wurde aus der Kombination unabhängiger chemischer
Reaktionen ein komplettes Lebewesen?
Alle Lebewesen benutzen die selben vier
Nucleobasen in ihrem genetischen Code,
die selben 20 L-Aminosäuren in ihren Proteinen,
wenige meist D-konfigurierte Zucker und
Adenosintriphosphat als Energieträger.
Gab es einst weitere Lebensformen?
Es gibt (noch) keine Erklärung.
Jede Zelle ist eine komplexe Fabrik
Organische Chemie
Biochemie
Formose-Reaktion
N-Heterocyclen
Strecker-Synthese
Polyphosphate
Fe, S, FeS2
Glycolyse, Citratcyclus
DNA/RNA Transkription
Porteinbiosynthese
ATP, Energieträger
Stoffwechsel
Zeit
Präbiotische
A Geyer OC4 2011 Chemie
Ursprung
Des Lebens
Letzter gemeinsamer
Vorfahr
1953
Die supramolekulare Chemie der DNA ist inzwischen
so gut verstanden, dass man sie in beliebigen
Formen aggregieren lassen kann: Origami
Von diesem strukturellen
Verständnis ist man bei
Proteinen noch weit
entfernt. Es gibt (noch)
kein Protein-Origami.
2007
A Geyer OC4 2011
Supramolekulare Chemie der DNA
Molekulare Erkennung, Kooperative Strukturbildung, Schmelzkurven von Biomolekülen sind
Phasenübergängen vergleichbar
Die Denaturierung von Biopolymeren (DNA, Proteine) durch Temperatur, Salze, pH oder
organische Lösungsmittel zerstört die durch Wasserstoffbrücken und hydrophobe
Wechselwirkungen aufgebaute Sekundärstruktur ohne kovalente Bindungen zu brechen.
Schmelzen von DNA im 1H NMR oder UV (Hypochromizität) beobachtbar
Fragen und Aufgaben
Pyridon kann ein über Wasserstoffbrücken verknüpftes Dimer bilden. Machen Sie einen
Strukturvorschlag.
Zeichnen Sie die Nucleoside (oder Nucleotide) A, G, C, T, U.
Zeichnen Sie Watson-Crick-Paare AT, GC.
Warum eignen sich Purine wie Koffein oder Harnsäure nicht als Basen des genetischen
Codes?
Was passiert am Schmelzpunkt doppelsträngiger DNA?
Entwerfen Sie einen Komplementärstrang für 5 -d(TGGTA).
A Geyer
OC4 2011
DNA: Desoxyribonukleinsäure
In der Erbsubstanz DNA spielen Wasserstoffbrücken bei
der molekularen Erkennung eine besondere Rolle
Kooperative molekulare
Erkennung:
Sobald sich ein Paar
gefunden hat, verhält sich
das System wie ein
Reissverschluß und die
anderen Paare finden sich
fast wie von selbst.
A Geyer OC4 2011
Das Schmelzen der Sekundärstruktur ist bei allen Biopolymeren ein kooperativer (sprunghafter) Prozess
Groß genug für die direkte Beobachtung!
Spektroskopische Charakterisierung
AA
Geyer
Geyer
OC4
OC4
2011
2011
Spektroskopische Charakterisierung
A Geyer OC4 2011
Kooperativität
Umschalten zwischen zwei Zuständen
(Konformationen) oder graduelle Änderung?
A Geyer OC4 2011
Auch im 1H-NMR kann man das kooperative Schmelzen des DNA-Doppelstrangs
beobachten. Dabei wandern alle Signale im 1H-NMR innerhalb eines schmalen
Temperaturbereichs.
Auftragung der chemischen Verschiebung ausgesuchter Basenprotonen gegen die
Temperatur
zur Ermittlung der Schmelztemperatur der DNA am Beispiel eines Dodecamers.
(aus Patel D. J.; Pardi A.; Itakura K. Science 1982, 216, 581-590)
A Geyer OC4 2011
B-DNA rechtsgängige Doppelhelix
A Geyer OC4 2011
O
O
O P O
HN
O
B
B
N
O
Peptide-Nucleic acid (PNA) ist ein chemisch
vereinfachtes Strukturmodell für DNA
O
Das Oligoamid-Rückgrat trägt die Nucleobasen, die wie bei
der DNA-Synthese geschützt sein müssen
Base = T, CCbz, ACbz, GBn,
O
O
HN
O P O
O
B
N
O
B
O
O
HN
O
PNA bildet selbst keine Doppelstränge, es bindet jedoch
DNA-Doppelstränge zu tripelhelikalen Strukturen. Auf
dieser Basis versucht man Medikamente zu entwickeln.
A Geyer OC4 2011
In einer Tripelhelix bindet der dritte Strang in die große Furche der
Doppelhelix und bildet dort zusätzliche H-Brücken mit den Nucleobasen.
Dies wird als Hoogsteen-Basenpaarung bezeichnet.
A Geyer OC4 2011
A Geyer OC4 2011
DNA ist stabiler gegen Hydrolyse als RNA.
In der Zelle ist dieser Unterschied noch
größer, da RNasen die Hydrolyse von mRNA
katalysieren.
A Geyer OC4 2011
Auf der Zelloberfläche Gram-positiver Bakterien befinden sich
oligomere Glycerophosphate, sogenannte Teichonsäuren
Trotz großer struktureller Ähnlichkeit mit DNA ist fast nichts
über die helikale Konformation von Teichonsäuren bekannt.
O
O
OR
O
O
O
P
O
[Base]
_
O
O
O
Eine Lipoteichonsäure
(lipoteichoic acid LTA) ist
über ein Diacylglycerol in
der Membran verankert
Teichonsäure
P
_
O
O
DNA
R = D-Alaninester oder
N-Acetylglucosamin
Lipoteichonsäuren haben nichts mit Vererbung zu
tun. Sie sind für Entzündungsreaktionen bis hin
zum septischem Schock verantwortlich, wenn diese
Bakterien in unsern Körper gelangen.
A Geyer OC4 2011
Lebensdauer der
DNA
•Die DNA ist in der Zelle Schadstoffen und Strahlung ausgesetzt und muss
konstant repariert werden. Dies ist ein normaler Vorgang, wofür es zahlreiche
Reparaturenzyme gibt.
A Geyer OC4 2011
Lebensdauer der
DNA
A Geyer OC4 2011
Medikamente zur gezielten
DNA-Schädigung
Minor-groove
bindendes
Distamycin
Anti-Tumor- und Anti-VirusMedikamente führen zu DNASchädigungen, die durch
enzymatische Reparaturmechanismen nicht korrigiert
werden können: Zelltod
Ethidiumbromid
A Geyer OC4 2011
UV-Licht induziert die Bildung von Cyclobutan-T-T Dimeren
Diese [2+2]-Cycloaddition ist eine photochemsich induzierte pericyclische Reaktion
A Geyer OC4 2011