Zelluläre Mechanismen der progressiven linksventrikulären
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Zelluläre Mechanismen der progressiven linksventrikulären Hypertrophie - Zeitabhängige Transkriptom- und Proteomänderungen nach experimenteller Aortenstenose Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Julia Rüdebusch geboren am 02. Juni 1985 in Stralsund Greifswald, 25.06.2014 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Klaus Fesser 1. Gutachter: Prof. Dr. rer.nat. Uwe Völker 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Michael Gotthardt Tag der Promotion: 29.10.2014 In liebevoller Erinnerung an meinen Großvater Gerhard Hofmann (*22.06.1934 †10.11.2013) Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ..................................................................................................................... - 1 1.1 Chronische Herzinsuffizienz ................................................................................................................. - 1 - 1.2 Ursachen und Entwicklung einer Herzinsuffizienz ............................................................................... - 2 - 1.3 Kardiales Remodeling .......................................................................................................................... - 3 - 1.3.1 1.3.1.1 Neurohumorale prohypertrophe Signaltransduktion ......................................................... - 6 - 1.3.1.2 Biomechanische prohypertrophe Signaltransduktion ........................................................ - 7 - 1.3.2 Antihypertrophe Signaltransduktion im Kardiomyozyten .......................................................... - 8 - 1.3.3 Transkriptionsfaktoren und die Reexpression des fötalen Genprogramms ................................ - 9 - 1.4 2. Prohypertrophe Signaltransduktion im Kardiomyozyten ........................................................... - 5 - Aufgabenstellung ................................................................................................................................ - 11 - Material und Methoden ............................................................................................ - 13 2.1 Material.............................................................................................................................................. - 13 - 2.1.1 Chemikalien, Substanzen und Kits ........................................................................................... - 13 - 2.1.2 Tiere.......................................................................................................................................... - 13 - 2.1.3 Hilfsmittel und Geräte .............................................................................................................. - 14 - 2.1.4 MRT und Zubehör .................................................................................................................... - 15 - 2.1.5 Software .................................................................................................................................... - 15 - 2.2 Methoden............................................................................................................................................ - 16 - 2.2.1 Transverse Aortenkonstriktion (TAC) ...................................................................................... - 16 - 2.2.1.1 Operative Aortenkonstriktion (TAC) in der Maus .......................................................... - 17 - 2.2.2 Magnetresonanztomografie (MRT) .......................................................................................... - 18 - 2.2.3 Versuchsaufbau und Zeitpunkte der Probenentnahme .............................................................. - 20 - 2.2.3.1 2.2.4 Isolation der Herzen und Probenvorbereitung ................................................................. - 21 - Genexpressionsanalyse ............................................................................................................. - 21 - 2.2.4.1 RNA-Isolation und Bestimmung von RNA-Qualität und RNA-Konzentration .............. - 21 - 2.2.4.2 Probenmanagement ......................................................................................................... - 23 - 2.2.4.3 Affymetrix GeneChip® Analyse..................................................................................... - 24 - 2.2.4.3.1 Präparation der Target-ssDNA ................................................................................... - 24 - 2.2.4.3.2 Hybridisierung ............................................................................................................ - 25 - 2.2.4.3.3 Auswertung der Microarrays ...................................................................................... - 26 - 2.2.4.4 2.2.4.4.1 Validierung der Microarraydaten .................................................................................... - 26 Quantitative Real-time PCR ....................................................................................... - 27 - 2.2.5 Proteomanalyse ......................................................................................................................... - 28 - 2.2.6 Histologische Bestimmung der Fibrosierung ........................................................................... - 29 - 2.2.7 Statistische Analysen ................................................................................................................ - 29 - 3. Ergebnisse .................................................................................................................. - 31 3.1 Charakterisierung der murinen Herzfunktion nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung ............................................................................................................................................ - 31 3.1.1 Bildgebende Darstellung der murinen Herzaktion mittels Magnetresonanztomografie ........... - 31 - 3.1.2 Erhebung der kardialen Funktionsparameter und Charakterisierung des Krankheitsverlaufs .. - 32 - 3.2 Charakterisierung der kardialen Fibrosierung nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung ......................................................................................................................... - 36 3.3 Genexpressionsanalyse der linken und rechten Ventrikel nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung ......................................................................................................................... - 39 3.3.1 Einfluß der Aortenstenose auf das linksventrikuläre Genexpressionsprofil ............................. - 43 - 3.3.2 Validierung der Microarray-basierten Expressionsdaten .......................................................... - 53 - 3.3.2.1 Auswahl der Kandidatengene für die relative Quantifizierung ....................................... - 54 - 3.3.2.2 Validierung der Affymetrix GeneChip® mouse gene ST Array Ergebnisse mit RT-PCR (TLDA) ........................................................................................................................................ - 57 - 3.3.3 3.4 Korrelation der Genexpression mit kardialen Funktionsparametern ........................................ - 60 - Proteomanalyse der linken und rechten Ventrikel nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung ......................................................................................................................... - 65 3.4.1 4. Funktionelle Klassifizierung der im linken Ventrikel differenziell exprimierten Proteine ....... - 68 - Diskussion ................................................................................................................... - 70 4.1 Etablierung des Tiermodells der transversen Aortenkonstriktion und Charakterisierung der Herzfunktion nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung ..................................... - 70 4.2 Genexpressionsanalyse nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung........... - 73 - 4.2.1 Genexpressionsanalyse der linken und rechten Ventrikel im Zeitverlauf der Erkrankung ....... - 73 - 4.2.2 Zeitlicher Verlauf der linksventrikulären Expression Hypertrophie-assoziierter Gene ............ - 74 - 4.2.3 Zeitlicher Verlauf der linksventrikulären Expression Fibrose-assoziierter Gene ..................... - 77 - 4.2.4 Differentielle Genexpression im Zeitverlauf der Erkrankung und Identifizierung potentieller Kandidatengene ...................................................................................................................................... - 80 4.2.5 4.3 Die Rolle des Wnt-Signalings bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz ..................... - 83 - Proteomanalyse nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung ...................... - 88 - 5. Zusammenfassung ..................................................................................................... - 91 - 6. Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 94 Eidesstattliche Erklärung .................................................................................................... 101 Lebenslauf ............................................................................ Fehler! Textmarke nicht definiert. Danksagung ........................................................................................................................... 102 7. Anhang........................................................................................................................... 103 Abkürzungsverzeichnis AHA American Heart Association ANP Atriales natriuretisches Peptid Base Baseline BNP Natriuretisches Peptid B cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat COMP Cartilage Oligomeric Matrix Protein cRNA komplementäre Ribonukleinsäure CTGF Connective Tissue Growth Factor dsDNA doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure dUTP Desoxyuridintriphosphat ECM Extrazelluläre Matrix fc Fold change, Änderungsfaktor HI Herzinsuffizienz IL Interleukin IPA Ingenuity Pathway Analysis Software LV Linker Ventrikel LVEDV Linksventrikuläres enddiastolisches Volumen LVEF Linksventrikuläre Ejectionsfraktion LVESV Linksventrikuläres endsystolisches Volumen LVM Linksventrikuläre Masse MA Microarray MHC Myosin heavy chain MMP Matrixmetalloproteinasen MRT Magnetresonanztomografie NYHA New York Heart Association PDE 5 Phosphordiesterase 5 postOP postoperativ RT-PCR Real-time PCR RV Rechter Ventrikel SD Standard deviation, Standardfehler SFRP Secreted frizzled-related protein ssDNA einzelsträngige (single strand)Desoxyribonukleinsäure TAC Transverse Aortenkonstriktion TGFβ Transforming growth factor β TIMP Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases TL Tibialänge TLDA Taqman Low Density Array vs. versus Einleitung 1. -1- Einleitung 1.1 Chronische Herzinsuffizienz Die chronische Herzinsuffizienz (HI) ist definiert als das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge zur Versorgung des Gewebestoffwechsels in Ruhe und bei Belastung zu fördern [1]. Somit stellt die Herzinsuffizienz das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Laut Statistischem Bundesamt waren 2011 kardiale Erkrankungen mit über 20% die häufigste Todesursache in Deutschland, wobei allein 5,6 % aller Todesfälle auf eine chronische Herzinsuffizienz zurückzuführen waren. Die Inzidenz und Prävalenz sind altersabhängig. So sind weniger als 1% in der Altersgruppe zwischen 45 bis 55 Jahren betroffen, jedoch 2-5 % im Alter zwischen 65 und 75 Jahren. In der Gruppe der über 80Jährigen leiden bereits fast 10 % an einer chronischen Herzinsuffizienz [2]. Mit einer Geschlechterrelation von 1,5:1 sind Männer häufiger betroffen als gleichaltrige Frauen, jedoch nimmt mit höherem Lebensalter der Anteil der erkrankten Patientinnen zu [3]. Klinisch zeigt sich die HI in Dyspnoe, Flüssigkeitsretention und schneller Erschöpfbarkeit. Dabei kann der Schweregrad bzw. das Stadium der Erkrankung nach den funktionellen Kriterien der NYHA (New York Heart Association) und der AHA (American Heart Association) gegliedert werden. So kann die HI in die NYHA-Stufen 1 (ohne Beschwerden) bis 4 (mit Beschwerden bereits in Ruhe) bzw. in die AHA-Stadien A (hohes Risiko, keine strukturelle Herzkrankheit) bis D (schwer therapierbare HI) eingeteilt werden (siehe Tab. 1.1). Zur Diagnostik einer HI muss neben der Anamnese (Leistungsabnahme, Luftnot) und des körperlichen Untersuchungsbefundes (Ödeme, Tachykardie) auch das Röntgen der Thoraxorgane und eine transthorakale Echokardiographie durchgeführt werden. Des Weiteren dienen Laboruntersuchungen bzw. Blutbildanalysen der Diagnosefindung. Dazu zählen laut den Leitlinien zur Therapie der chronischen Herzinsuffizienz sowohl die Bestimmung des Serumkreatinin-Wertes, der der Beurteilung der Nierenfunktion dient und Auswirkungen auf die Pharmakotherapie hat, als auch die Bestimmung weiterer Biomarker [1]. Als wichtige Biomarker gelten Noradrenalin und natriuretische Peptide wie BNP (natriuretisches Peptid B) bzw. dessen Vorläufer NT-proBNP. Sie werden zur Diagnosestellung der HI und zur Beurteilung der klinischen Situation genutzt und können für die Abschätzung der Prognose und die Einstellung der medikamentösen Therapien hilfreich sein. Jedoch ist die Prognose der Herzinsuffizienz trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie auch heute noch Einleitung -2- schlecht. So ist z.B. eine linksventrikuläre Ejektionsfraktion von <30 % immer noch mit einer 5-Jahresmortalität von über 50 % assoziiert. Tab. 1.1 Einteilung der Herzinsuffizienz Stadieneinteilung und Klassifizierung der Herzinsuffizienz nach den aktuellen Leitlinien der New York Heart Association (NYHA) und der American Heart Association (AHA) NYHA-Klassifikation AHA-Klassifikation I Herzerkrankung bekannt, aber keine Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit A Hohes Risiko, aber weder eine strukturelle Herzkrankheit noch Symptome II Körperliche Leistungsfähigkeit leicht eingeschränkt, keine Beschwerden in Ruhe, Beschwerden bei alltäglicher körperlicher Belastung B Strukturelle Herzkrankheit, aber noch keine Symptome der Herzinsuffizienz III Körperliche Leistungsfähigkeit stark eingeschränkt, Beschwerden bereits bei geringer körperlicher Belastung, noch keine Beschwerden in Ruhe C Strukturelle Herzkrankheit und frühere oder gegenwärtig vorhandene Symptome IV Beschwerden bei allen körperlichen Aktivitäten und auch in Ruhe, Bettlägerigkeit D Schwer therapierbare Herzinsuffizienz, die eine spezielle Intervention erfordert 1.2 Ursachen und Entwicklung einer Herzinsuffizienz Induziert wird eine HI durch eine Vielzahl an Stimuli. Hypertonie, Myokardinfarkt, koronare Herzkrankheit aber auch eine Myokardititis, Diabetes mellitus oder eine Aortenstenose können Ursachen sein. Die aus diesen Stimuli resultierenden Myokardschädigungen bzw. die Druck- und/oder Volumenüberlastung führen zu einer veränderten bzw. eingeschränkten Pumpleistung des Herzens. Als Reaktion auf das abnehmende Herzzeitvolumen werden neurohumorale Kompensationsmechanismen aktiviert, die auf eine Verbesserung der Perfusion peripherer Organe abzielen. Die persistierende Aktivierung des Renin-AngiotensinAldosteronsystems (RAAS), sympathischen Nervensystems und natriuretischen Peptidsystems geht mit der Ausschüttung von Angiotensin II, Aldosteron, Katecholaminen und anderen vasoaktiver Substanzen, wie Endothelin und Vasopressin einher. Dies führt zur Einleitung -3- arteriellen und venösen Vasokonstriktion, Flüssigkeitsretention, Vor- und Nachlasterhöhung, sowie einer Steigerung der myokardialen Inotropie und Chronotropie. Diese zunächst physiologisch sinnvollen Kompensationsmechanismen führen jedoch langfristig zu einer Schädigung des Myokards und zur Progression der Erkrankung. Bei der Entwicklung einer Herzinsuffizienz durchläuft das Herz zunächst eine Phase der Hypertrophie, bei der sich auf Grund der gesteigerten Herzbelastung die einzelnen Kardiomyozyten in Länge und Breite vergrößern. Dies hat schließlich die Verdickung des Herzmuskels zur Folge [4, 5]. Solange die Pumpfunktion aufrechterhalten werden kann, spricht man in dieser Phase von einer kompensierten Hypertrophie. Bleibt die Belastung bestehen, kann sich aus der reversiblen kompensierten Form eine dekompensierte Herzinsuffizienz mit Dilatation und stark eingeschränkter Herzfunktion entwickeln. Diese funktionellen und strukturellen Veränderungen des Herzens während der Progression einer HI werden als kardiales Remodeling bezeichnet und beinhalten Veränderungen auf Zell-, Molekular- und Expressionsebene, die sich klinisch in Veränderungen der Größe, Form und Funktion des Herzens manifestieren. 1.3 Kardiales Remodeling Kardiales Remodeling kann als ein physiologischer oder pathologischer Zustand beschrieben werden. Als physiologisches Remodeling werden die kompensatorischen Veränderungen des Herzens auf physiologische Stimuli wie sportliche Betätigung und Schwangerschaft verstanden. Pathologisches Remodeling tritt hingegen nach Myokardinfarkt, Drucküberlastung bei Aortenstenose, Hypertonie, Myokarditis oder Volumenüberlastung auf und bezeichnet den Übergang von einem Kompensationsprozess zu einer Fehlanpassung [6]. Eine Drucküberlastung führt zu einem konzentrischen linksventrikulären Remodeling, das durch einen Anstieg der ventrikulären Wanddicke und der myokardialen Masse gekennzeichnet ist. Dabei kommt es auf zellulärer Ebene zu einer vermehrten Synthese von Sarkomeren mit paralleler Anordnung zu den bereits existierenden Myofibrillen, was eine Verdickung der einzelnen Kardiomyozyten zur Folge hat. Bei einer Volumenüberlastung hingegen entsteht eine exzentrische linksventrikuläre Hypertrophie [7]. Hierbei erhöhen sich die kardiale Masse und das Kammervolumen. Die Kardiomyozyten wachsen in die Länge, da Einleitung -4- sich die Sarkomere in Reihe anordnen. Eine Kombination aus exzentrischer und konzentrischer Hypertrophie kann nach einem Myokardinfarkt beobachtet werden (Abb. 1.1). Abb 1.1 Die drei Hauptformen des ventrikulären Remodelings nach Opie et al. [8] Ein durch Drucküberlastung hervorgerufenes Dickenwachstum der Kardiomyozyten führt zu einer konzentrischen linksventrikulären Hypertrophie. Eine Volumenüberlastung führt zum Längenwachstum der Myozyten, wodurch eine exzentrische linksventrikuläre Hypertrophie entsteht. Eine Mischung aus exzentrischer und konzentrischer Hypertrophie ist nach einem Myokardinfarkt zu beobachten . Das Remodeling ist mit einer Vielzahl zellulärer Veränderungen wie Myozytenhypertrophie, Zellverlust durch Apoptose [9, 10] oder Nekrose [11], Fibroblastenproliferation [12] und Fibrose assoziert [13, 14]. Dabei sind die Kardiomyozyten fundamental beteiligt. Nach einem Myokardinfarkt kommt es zu einem massiven Absterben der Myozyten und somit zu einer Verminderung der Zellzahl. Dies hat zur Folge, dass die überlebenden Kardiomyozyten stark hypertrophieren, wodurch sich die gesamte Ventrikelwand verdickt. Dieser Kompensationsmechanismus soll die Aufrechterhaltung der Pumpfunktion gewährleisten [6, 15]. Veränderte Füllungsverhältnisse im Herzen bewirken eine Dehnung der Zellmembran und erhöhen die Wandspannung, was vermutlich die Expression Hypertrophie-assoziierter Gene induziert. Dies führt zur Neusynthese von kontraktilen Proteinen und zur Aggregation von Sarkomeren. Die Anordnung dieser Proteine wiederum bestimmt die Morphologie des hypertrophierten Kardiomyozyten (s.o). Zusätzlich führt die Vergrößerung der Kardiomyozyten zu einer lokalen Produktion bzw. Ausschüttung von Angiotensin II, Einleitung -5- Norepinephrin und Endothelin, was eine weitere Stimulation der Proteinexpression und Myozytenhypertrophie bewirkt. Erhöhte Konzentrationen von Angiotensin II und Aldosteron, verbunden mit der Ausschüttung von Zytokinen wie TGF-β und IL-1β führen zu einer vermehrten Kollagensynthese, zur Fibrose und zum Remodeling der extrazellulären Matrix [16-19]. Da die Anzahl der Kapillaren bei Hypertrophie nicht zunimmt und sich die Diffusionsstrecke des Sauerstoffs durch die steigende Wanddicke vergrößert, kommt es zur Ischämie und somit zu einer Unterversorgung des Gewebes mit Sauerstoff (relative Kapillarinsuffizienz). Neben den gestiegenen Wanddicken führt die zunehmende Wandspannung zu einem Energieungleichgewicht und einem erhöhten Sauerstoffbedarf. So entsteht ein circulus vitiosus aus zunehmender Wanddicke und -spannung mit einhergehender fortschreitender Ischämie und Myozytenverlust. Eine weitere wichtige Rolle für die Progression einer Hypertrophie spielt fibrilläres Kollagen, welches sich netzartig durch das Myokardgewebe zieht. Kollagensynthese durch Fibroblasten und Degradation durch lokal produzierte Matrixmetalloproteinasen (MMP) befinden sich dabei in einem eng regulierten Gleichgewicht. Tritt eine Schädigung des Myokards bzw. eine Erhöhung des mechanischen Stresses auf, gehen die Fibroblasten in einen aktiven Phänotyp über und starten eine extensive Kollagensynthese [20]. Dies zieht eine Fibrosierung des geschädigten, aber auch des nichtgeschädigten Herzgewebes nach sich [6, 21]. Die fortschreitende Fibrose führt zu einer vermindert Kontraktilität des Gewebes, was die Pumpfunktion des Herzmuskels stört und Rhythmusstörungen induziert. 1.3.1 Prohypertrophe Signaltransduktion im Kardiomyozyten Eine Hypertrophie ist gekennzeichnet durch die Vergrößerung von Myozyten, eine gesteigerte Proteinsynthese und Veränderungen der Sarkomerorganisation. Diese Veränderungen des zellulären Phänotyps werden durch die Reexpression des sogenannten fötalen Genprogramms verursacht. Über biomechanischen oder neurohumoralen Stress können unterschiedliche Signalkaskaden aktiviert werden, die die kardiale Genexpression durch verschiedene signalabhängige Transkriptionsfaktoren beeinflussen. Das Netzwerk miteinander kommunizierender Signalmoleküle ist komplex und lässt so eine äußert fein abgestimmte Modulation einzelner Prozesse vermuten. Eine allgemeine Übersicht ist in Abbildung 1.2 dargestellt, einzelne Signalwege sind nachfolgend beschrieben. Einleitung -6- 1.3.1.1 Neurohumorale prohypertrophe Signaltransduktion Katecholamine wie Noradrenalin und Adrenalin, Endothelin-1, Angiotensin II und IGF-I (Insulin-like Growth Factor 1) sind neurohumorale Substanzen, die über spezifische membranständige Rezeptoren der Kardiomyozyten agieren. Diese binden an G-Protein gekoppelte Rezeptoren und induzieren über die Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und Produktion von Inositol-1,4,5-triphosphat eine Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern. Der steigende Kalziumspiegel bewirkt die Aktivierung von Calcineurin und dessen Bindung an einen Transkriptionsfaktor der NFAT-Familie (nuclear factor of activated Tcells) [22]. Der Transkriptionsfaktor wird daraufhin desphosphoryliert und transloziert zum Zellkern. Hier kommt es anschließend zu einer Aktivierung verschiedener prohypertroph wirkender Gene [23]. Neben der Induktion der Calcineurin/NFAT-Signalkaskade werden kalziumabhängig weitere pathologische Signalsysteme aktiviert, hierzu zählen die Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase II (CaMKII)-Signaltransduktion und die Proteinkinase C (PKC). CaMKII und PKC vermitteln die Phosphorylierung von Histon-Deacetylasen der Subklasse II (HDAC II), was deren Export aus dem Nucleus zur Folge hat [24]. Im Zellkern bewirken HDACs eine dichte Faltung des Chromatins und verhindern somit die Anlagerung von Transkriptionsfaktoren. Eine Translokation der Deacetylasen fördert somit direkt die Transkriptionsinitiation der entsprechenden prohypertroph wirkenden Gene [25]. Auch die sogenannten MAPKs (mitogen-activated protein kinase) können bei der Entstehung der Hypertrophie eine entscheidende Rolle spielen. Die MAPK-Signalkaskade wird sowohl durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch durch pathologischen Stimuli wie mechanischer Stress oder Hypoxie induziert und besteht aus mehreren nachgeschalteten Signalelementen. Das MAPK-Signaling resultiert in der Phosphorylierung und Aktivierung von p38-Kinase, c-Jun N-terminal Kinasen (JNKs) und den ERKs (extracellular signalregulated kinases). Diese phosphorylieren ihrerseits eine Vielzahl an Transkriptionsfaktoren, die wiederum das fötale Genprogramm induzieren können [26]. Neben den GPCRs kann der MAPK-Signalweg auch über die Rezeptoren von TGF-β (transforming growth factor β) [27] und den Zytokinrezeptor Glykoprotein 130 (Gp 130), der mit dem LIF-Rezeptor (Leukemia inhibitory factor) assoziert ist, aktiviert werden [28]. Der Gp 130/LIF-Rezeptor ist zusätzlich Mediator eines weiteren Signalwegs zur Induktion kardialer Hypertrophie. So führt das prohypertroph wirksame Peptid Angiotensin II zur verstärkten Synthese verschiedener Zytokine der Interleukin-6-Familie (IL-6), wie LIF und Cardiotrophin-1 (CT-1) [29]. Der aktivierte Gp 130/LIF-Komplex interagiert daraufhin mit der Janus Kinase 1 (JAK1), was Einleitung -7- nachfolgend zur Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren der STAT–Familie (signal transducer and activator of transcription) führt. Als Hypertrophie induzierend gilt vor allem STAT3, der als Antwort auf die Gp 130 Aktivierung zum Nucleus transloziert wird und dort zur Transkription prohypertroph wirkender Gene führt [30]. Neben dem IL-6 werden auch andere inflammatorische Proteine wie IL-1, IL-18 und TNF-α (tumor necrosis factor α) bei kardialer Hypertrophie vermehrt sekretiert. TNF-α aktiviert über verschiedene Kinasen den Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor κB), der in den Nucleus transloziert und dort eine Expression verschiedener prohypertroph und proinflammatorisch wirkender Gene bewirkt [31-33]. Die Phosphoinositid 3-Kinase (PI3K) ist ein Schlüsselenzym in der Wachstumsregulation des Myozyten. Die PI3K kann von verschiedenen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, wie beispielsweise dem IGF-1-Rezeptor, aber auch von verschiedenen GPCRs aktiviert werden [34]. Die PI3K phosphoryliert AKT/PKB (Protein Kinase B), die anschließend die GlycogensynthaseKinase-3β (GSK-3β) inhibiert. Die Hemmung der GSK-3β induziert eine hypertrophe Reaktion, da sie als konstitutiv aktives Enzym eine negative Regulation auf Hypertrophieinduzierende Effektoren wie β-Catenin, GATA-4, und NFAT ausübt [35]. Neben der GSK3β-Inhibition kann AKT/PKB auch über die Aktivierung von mTOR (mammalian target of Rapamycin) eine gesteigerte Proteinsynthese bewirken. So reguliert mTOR über eine Aktivierung von verschiedenen Kinasen eine Steigerung der ribosomalen Biosynthese und stimuliert die Initiation der Proteintranslation [36]. 1.3.1.2 Biomechanische prohypertrophe Signaltransduktion Neben der klassischen Ligand-Rezeptor-Bindung können auch sensorische Reize eine Induktion prohypertropher Signale bewirken. So können Dehnung und Deformation über einen internen sensorischen Apparat wahrgenommen werden. Dieser besteht aus Integrinen, die als heterodimere transmembranäre Rezeptoren eine Verbindung zwischen der extrazellulären Matrix und dem intrazellulären Zytoskelett des Kardiomyozyten herstellen. Integrine aktivieren FAKs (Focal Adhesion Kinase) und die GTPasen Ras und Rho, die als Effektoren auf JNKs und ERKs wirken [37]. Melusin, ein mit Integrin interagierendes Molekül, wird ebenfalls als Sensor für mechanischen Stress angenommen und ist essentiell für die Phosphorylierung und somit Inaktivierung von GSK-3β [38]. Auch Proteine der Wnt-Familie, die in der Zell-Zell-Kommunikation involviert sind und eine essentielle Rolle in der kardiovaskulären Entwicklung spielen, dienen als Mediatoren äußerer Einleitung -8- Einflüsse. Wnt bindet an den Frizzled Rezeptor, was eine Aktivierung von Dvl-Protein (dishevelled-protein) und die Inhibierung der GSK-3β zur Folge hat [39]. Ein weiterer sensorischer Apparat wird auf der Ebene der Z-Disk angenommen. Dabei agiert das small LIM-domain Protein MLP (muscle LIM protein), das mit der Z-Disk verankert ist, über einen Komplex von transduzierenden Proteinen als interner Dehnungssensor [40]. Die über MLP ablaufende Signaltransduktion induziert das Calcineurin-NFAT-Signaling und somit wiederum eine prohypertrophe Reaktion [41]. Abb 1.2 Schematische Übersicht der Signaltransduktionswege in der Hypertrophie (nach Frey und Olsen) [42] Die Induktion der Hypertrophie am Kardiomyozyten kann über eine Vielzahl intrazellulärer Signaltransduktionswege verlaufen, die über neurohumorale oder biomechanische Aktivierung verschiedener Rezeptoren als gemeinsamen Endeffekt eine Modulation der Genexpression bewirken. 1.3.2 Antihypertrophe Signaltransduktion im Kardiomyozyten Unter pathologischen Bedingungen werden viele Signalwege im Herzen aktiviert, die ein hypertrophes Wachstum stimulieren und zu einer Progression der kontraktilen Dysfunktion und Herzinsuffizienz führen. Jedoch gibt es einige Signalwege, die von essentieller Bedeutung für eine Adaptation des Herzens an pathologische Stimuli sind. So sind die natriuretischen Peptide (NPs) und Stickstoffmonoxid (NO), die im Herzen selbst produziert werden, endogene Inhibitoren der maladaptiven Hypertrophie. Einleitung -9- Das atriale natriuretische Peptid (ANP) und das B-Typ natriuretische Peptid (BNP) sind Hormone mit potenter natriuretischer, diuretischer und vasodilatativer Wirkung, die einen starken Einfluss auf den Blutdruck und das Plasmavolumen ausüben. BNP und ANP agieren über den natriuretischen Peptidrezeptor A (NPR-A), der als membranständige Guanylatcyclase fungiert. Die Aktivierung führt zur Umwandlung von GTP in den second messenger cGMP. Downstream Effektor für cGMP ist die PKG-1 (cGMP-dependent protein kinase), die ihrerseits L-Typ-Kalzium-Kanäle (LTCC) inhibiert und somit die Verfügbarkeit von Kalziumionen reduziert und die durch Calcineurin vermittelte Translokation des NFAT blockiert [43]. Ähnlich wie die NPs wirkt auch NO als Stimulator für cGMP, welcher somit ebenfalls antihypertrophe Effekte vermitteln kann [44]. 1.3.3 Transkriptionsfaktoren und die Reexpression des fötalen Genprogramms Die Induktion der Hypertrophie am Kardiomyozyten verläuft über eine Vielzahl intrazellulärer Signalwege, die als gemeinsamen Endeffekt eine Modulation der Genexpression bewirken. Dabei kann zwischen zwei Mechanismen unterschieden werden. So wird ein Signal über Proteinkinasekaskaden durch das Zytoplasma übertragen und führt zum einen zur Phosphorylierung von im Nukleus lokalisierten Transkriptionsfaktoren, die sich daraufhin in ihren transaktivierenden Eigenschaften verändern. Zum Zweiten können im Zytoplasma befindliche Transkriptionsregulatoren wie z.B. GATA4 und NFAT phosphoryliert bzw. dephosphoryliert werden und zum Nucleus migrieren, wo sie in die Regulation der Genexpression eingreifen. Eine pathologische Hypertrophie wird mit der Induktion von im fötalen Herzen aktiven Genen wie ANP, BNP, α-skeletal actin, atrial MLC-1 (Myosin Light Chain) und β-MHC (Myosin Heavy Chain) assoziert. Gene, die im adulten Herzen unter physiologischen Bedingungen exprimiert werden, z.B. α-MHC und SERCA2a, werden in ihrem Expressionsniveau abgesenkt [45-47]. MHC ist die Hauptkomponente des Myosins, welches als Proteinkomplex die Kontraktion in den Muskelzellen maßgeblich steuert. β-MHC findet sich als predominante Isoform im prenatalen Herzen und wird kurz nach der Geburt, wenn αMHC expremiert wird, herunter reguliert [48]. Während einer pathologischen Hypertrophie steigt die Expression von β-MHC im adulten Herzen an, wohingegen α-MHC niedriger exprimiert wird. Da β-MHC die Hydrolyse von ATP und somit die chemische Reaktion zum Antreiben der Kontraktion langsamer katalysiert als α-MHC, führt dies zu einer verlangsamten, ökonomischeren kontraktilen Funktion [49, 50]. Diese Änderung der Einleitung - 10 - Zusammensetzung der kontraktilen Proteine kann bei der physiologischen Hypertrophie (beispielsweise bei Ausdauersportlern oder Schwangeren) nicht beobachtet werden und scheint somit eine Adaption an die pathologischen Veränderungen zu sein [51]. Einleitung - 11 - 1.4 Aufgabenstellung Die chronische Herzinsuffizienz bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der chronischen Herzinsuffizienz auch heute noch schlecht. So ist z.B. eine linksventrikuläre Auswurffraktion von <30 % immer noch mit einer 5Jahresmortalität von über 50 % assoziiert. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer Herzinsuffizienz, die sich klinisch in Veränderung der Größe, Form und Funktion des Herzens manifestieren, sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Die umfassende zeitabhängige Untersuchung der Genexpression während der Ausbildung einer HI ist auch zur Identifizierung von neuen Biomarkern dienlich. Bisher bekannte Biomarker (z.B. nt-pro-BNP) können zwar zum Ausschluss einer manifesten Herzinsuffizienz herangezogen werden, interessanter jedoch wären neue Biomarker, die bereits im subklinischen Stadium messbar sind und somit rechtzeitig vor Auftreten einer irreversiblen Myokardschädigung einen frühzeitigen Therapiebeginn mit zielgerichteten spezifischen Interventionen ermöglichen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, zeitabhängige Veränderungen während des Krankheitsverlaufs auf Transkriptom- und Proteomebene zu charakterisieren und mögliche neue Biomarkerkandidaten bei der Entstehung einer chronischen Herzinsuffizienz zu definieren. Hierfür war es zunächst nötig, das Herzinisuffizienzmodell der transversen Aortenkonstriktion (TAC) in Mäusen zu etablieren, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert und damit alle Stadien von einer subklinischen Organschädigung bis zur Ausbildung einer Herzinsuffizienz experimentell erfasst. Durch den Einsatz des bildgebenden Verfahrens der Magnetresonanztomografie (MRT) sollte die kardiale Funktion der Mäuse zeitabhängig nach einem stadartisiertem Protokoll dokumentiert und parallel dazu die Veränderungen des Einleitung - 12 - Genexpressions- und Proteinmusters im Gewebe der rechten und linken Ventrikel in den einzelnen Krankheitsstadien analysiert werden. Material und Methoden 2. - 13 - Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien, Substanzen und Kits Name Hersteller Ambion WT Expression Kit Affymetrix Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit Agilent Braunoderm Braun Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic®) Essex Pharma Chloroform Roth Ethanol 99,8% Roth GeneChip® Hybridization, Wash and Stain Kit Affymetrix GeneChip® Poly-A RNA Control Kit Affymetrix GeneChip® WT Terminal Labeling Kit Affymetrix High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems Isofluran Dalta Select Natriumchlorid 0,9 % Braun Nuklease-freies Wasser Ambion PBS (phosphate buffered saline) PAA PCR Master Mix Applied Biosystems Qiazol Qiagen RNA 6000 Nano LabChip Agilent RNA 6000 Pico LabChip Agilent RNase-Zap Ambion RNeasy Mini Kit Qiagen Thiopental-Natrium (Trapanal®) Nycomed 2.1.2 Tiere Mäuse C57Bl/6N, Charles River, Sulzfeld Material und Methoden - 14 - 2.1.3 Hilfsmittel und Geräte Name Hersteller 384-well microfluidic cards TaqMan custom made Applied Biosystems 6-0 Faden DSM 11 Catgut 7-0 Faden 2xHRM 20-6 Catgut 7-TeslaClinScan Bruker ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems Bioanalyzer 2100 Agilent GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array Affymetrix GeneChip® Sample Clean Up Modul Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 Affymetrix Heizblock QBT2 Grant Heraeus Biofuge Pico Thermo Heraeus Multifuge 3S Thermo Hybridisierungsofen 540 Affymetrix Kaltlichtlampe KL 1500 LCD Schott, Mainz Mikroskop, Mantis Compact Vision Engineering NanoDrop 1000 ND UV/VIS-Spektrophotometer Thermo OP-Besteck Fine Science Tools Pipetten (P-2, P-20, P-200, P-1000) Gilson QIAcube Qiagen QIAshredder Säulen Qiagen RNase-freie Reaktionsgefäße Ambion Sterile, RNase-freie Filterspitzen (gestopft) Nerbe Steritop-GP, 0,22 μm Filtereinheit Millipore TaqMan Array Sealer Applied Biosystems T-Gradient 96 Cycler Biometra Waschstation - Fluidics Station 450 Affymetrix Material und Methoden - 15 - 2.1.4 MRT und Zubehör Name Hersteller Atemkissen (Graseby®) Smiths Medical Atem-Transmitter Modul SA Instruments Augensalbe (Bepanthen) Bayer Digitalwaage (Maul alpha 500) JakobMaul EKG-/Temperatur-Transmitter Modul SA Instruments Infrarotlichtlampe (808) Efbe-Scholl Isofluran-Vaporisator (19.3) Dräger Klebestreifen (Leukosilk S, 2,5 cm × 9,2m) BSN medical Messschlitten (Bio R.Bed 72 Slider) Bruker MRT-System (ClinScan 70/30) Bruker RF-Spule (ClinScan 300 1H 2×2 APR R.BR) Bruker Sauerstoffmischanlage (Carbamed) Draeger Temperatursonde SA Instruments Überwachungselektroden für Frühgeborene 3M Health Care Wasserbad SA Instruments 2.1.5 Software Name Hersteller Graph Pad Prism 5 GraphPad Software; Inc BZ II Analyzer Software Keyence Rosetta Resolver 7.2.2 Affymetrix Data Assist 3.01 Applied Biosystems RQ Manager 1.2 Applied Biosystems SDS 2.3 Applied Biosystems Rosetta Elucidator 3.3 Ceiba Solutions, MA, USA 2100 Expert Software (Version B02.05.SI360) Agilent Segment (1.9R1897) Medviso Material und Methoden - 16 - 2.2 Methoden Für die Versuche wurden acht Wochen alte männliche C57Bl/6N Mäuse der Firma Charles River Laboratories (Sulzfeld) verwendet. Alle Operationen und tierexperimentellen Untersuchungen erfolgten nach Genehmigung des Versuchsvorhabens durch das Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei (LALLF) Mecklenburg- Vorpommern (AZ: 7221.3-1.1-058/11). 2.2.1 Transverse Aortenkonstriktion (TAC) Ziel dieser Arbeit war es, Pathomechanismen der progressiven Herzinsuffizienz auf Transkriptom- und Proteomebene zu analysieren. Auf Grund der menschenähnlichen Physiologie des Herzens und des bekannten Genoms wurde die Maus als Modellorganismus und die Konstriktion der Aorta (transverse aortic constiction, TAC) als Krankheitsmodell gewählt. Hierbei wird der Durchmesser der Aorta ascendens abrupt auf ein definiertes Maß verringert und so der Druck auf den linken Ventrikel massiv gesteigert (siehe Abb 2.1). Auf diese Art und Weise können Bedingungen, die bei einer arteriellen Hypertonie vorliegen, sehr elegant simuliert werden. Es wird angenommen, dass die stark erhöhte Nachlast zunächst zu kompensatorischen Anpassungsprozessen wie beispielsweise einer linksventrikulären Hypertrophie mit weitgehend erhaltener Pumpleistung führt, die aber relativ schnell in eine Herzinsuffizienz mit Ventrikeldilatation und stark verminderter Herzfunktion mündet. Da zu Beginn der Arbeit ein solches Tiermodell in unserer Arbeitsgruppe nicht etabliert war, musste zunächst die Operationstechnik erlernt und der Verlauf der murinen Herzfunktion über die Zeit dokumentiert werden. Material und Methoden - 17 - Abb. 2.1 Schematische Darstellung der transversen Aortenkonstriktion (TAC) Durch das Abbinden der Aorta zwischen Truncus brachiocephalicus und der Arteria carotis communis sinistra wird eine Nachlasterhöhung bewirkt (Modifizierte Darstellung nach Tarnavski, 2009) 2.2.1.1 Operative Aortenkonstriktion (TAC) in der Maus Zu OP-Beginn wurde die Maus initial mit 5 % Isofluran sediert, auf dem Rücken liegend fixiert und endotracheal intubiert. Zur Intubation wurde der Kopf der Maus leicht überstreckt, die Zunge vorsichtig mit einer Pinzette herausgezogen und der Hals mit einer Kaltlichtlampe beleuchtet. Entsprechend einer laryngoskopischen Einstellung war nun die Trachea sichtbar und ein als Tubus geformter peripherer Venenkatheter (Braunüle®, Braun) konnte vorsichtig eingeführt werden. Das Ende der Braunüle wurde an die Beatmungseinheit angeschlossen und die Maus anschließend mit einem Gemisch aus 1,5 % Isofluran in Raumluft beatmet (200 µl, 200 Atemzüge/min). Zur Analgesie wurden 0,1 mg/kg Körpergewicht Buprenorphin s.c. injiziert. Der Brustbereich wurde rasiert und desinfiziert (Braunoderm®, Braun), anschließend die Haut eröffnet und der Thorax freigelegt. Ein Schnitt entlang des Sternums bis auf Höhe des 2. Intercostalbereichs diente dem Zugang zu Herz und Aortenbogen. Hierfür wurde der Brustkorb mit Hilfe eines durch den Wundrand gestochenen 6-0 Fadens (linke Seite) und eines Retraktors (rechte Seite, siehe Abb. 2.2) leicht aufgespreizt. Anschließend wurde ein 7-0 Faden zwischen dem Truncus brachiocephalicus und der Arteria carotis communis sinistra unter die Aorta gelegt und ein loser Knoten gebunden. In diese Schlaufe wurde eine abgestumpfte 26-Gauge-Kanüle eingeführt und der Knoten festgezogen. Nach Sicherung des Knotens mit mehreren Gegenknoten wurde die Nadel entfernt und die Aorta somit auf einen definierten Innendurchmesser dauerhaft konstringiert (Kanülendurchmesser 0,4 mm). Der Thorax wurde mittels Einzelknopf- und die Haut durch eine fortlaufende Naht mit einem 6-0 Faden geschlossen. Abschließend wurde die Hautnaht nochmals desinfiziert Material und Methoden - 18 - und die Narkose ausgeleitet. Das frisch operierte Tier wurde in einen extra Käfig gelegt, bis zum Erwachen mit einer Wärmelampe bestrahlt und bis zur vollkommenen Wiederherstellung der Mobilität nachbeobachtet. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, die eine der TAC-OP entsprechende Sham-Operation durchlaufen hatten. Bei diesen wurde ebenfalls der Brustkorb eröffnet, die Aorta ascendens exponiert, aber nicht ligiert. Abb. 2.2 Fotografische Dokumentation des Verlaufes einer TAC-OP Die Maus wird endotracheal intubiert (1) der Thorax entlang des Sternums eröffnet (2)und aufgespreizt (3). Die exponierte Aorta wird mit einem Faden umschlungen(4) und mit Hilfe einer Nadel konstringiert (5). Die Nadel wird entfernt und die Operationswunde mit einer Naht verschlossen (6). 2.2.2 Magnetresonanztomografie (MRT) Zur Erfassung der Hämodynamik des murinen Herzens kranker und auch gesunder Tiere wurde das bildgebende Verfahren der Magnetresonanztomografie (MRT) genutzt. Hierfür wurde das 7 Tesla (300 Hz) ClinScan Kleintier-MRT der Firma Bruker verwendet. Dieses System besteht aus einem horizontalen, supraleitenden Magneten mit einem Bohrloch von 130 mm Durchmesser, einer Konsole mit Siemens-Syngo-Oberfläche (MR B15) und einem Gradientensystem (Gradientenfeldstärke 290 mT/m, slew rate 1160 × T/m/s). Als Sender- und Empfängereinheit wurde eine phasenkodierte Oberflächenspule (RatBrain 2×2, innerer Durchmesser: 20 mm) genutzt. Das Verfahren der Magnetresonanztomografie macht sich den Eigendrehimpuls (Spin) der Atome im Körper zu nutze. Durch das Einwirken eines starken Magneten auf den Körper wird die unter natürlichen Bedingungen zufällige Anordnung der Atome gerichtet, was eine Anordnung der Atome parallel oder antiparallel der Feldstärke zur Material und Methoden - 19 - Folge hat. Wird in dieses Magnetfeld Anregungsenergie in Form hochfrequenter Radiowellen abgegeben, nimmt das Atom Energie auf, was eine kurzzeitige Positionsänderung bewirkt. Nach dem Impuls kommt es zur Wiederausrichtung des Atoms am äußeren Magnetfeld. Dabei wird Energie in Form von Wärme frei. Die Dauer der Wiederausrichtung ist gewebsspezifisch und kann mittels computergestützter Verfahren sichtbar gemacht und in einem Graustufenbild angezeigt werden. Die Bestimmung der kardialen Funktionsparameter mittels Kleintier-MRT erfolgte durch Herrn Axel Poesch, der im Rahmen seiner Promotion diese Methode etabliert und validiert hat. Dabei stellt sich die Mess- und Auswerteprozedur in Kürze wie folgt dar: Nach einer initialen Isoflurannarkose wurde das Tier in Bauchlage auf den Messschlitten des MRT-Gerätes positioniert, so dass sich der Thorax innerhalb des Zentrums der Oberflächenspule befand. Zur Überwachung und Regulation der Körpertemperatur wurde eine rektale Temperatursonde eingeführt und ein Wärmekissen auf dem Tier fixiert. Da es sich bei den zu messenden Mäusen teilweise um sehr schwer erkrankte Tiere handelte, für die diese Messprozedur eine unter Umständen lebensbedrohliche Belastung darstellt, wurden die Messungen unter leicht hypothermen Bedingungen (35°C) durchgeführt. Des Weiteren wurden die Atmung mittels drucksensitivem Atemkissen und die Herzfrequenz durch an den Vorderläufen platzierte EKG-Sonden überwacht. Zur Narkotisierung des Tieres wurde über den gesamten Messzeitraum eine konstante Isofluran/Sauerstoff-Zufuhr gewährleistet. Die Bilddaten wurden mittels 2D-Gradientenechosequenzen erstellt (repetition time: 5,7 ms, echo time: 2,25 ms, Flip-Winkel 25°). Das field of view (FOV) betrug 35×35 mm, die Schichtdicke 1 mm, der Abstand zwischen den einzelnen Schichten (gap) entsprach 20 % (0,2 mm) und die Auflösung betrug 192×192 Pixel. Die Bilder wurden in drei Hauptebenen aufgenommen. Dazu gehörten der 2-Kammerblick (2CV, 2 chamber view) und der 4 Kammerblick (4CV), die an der langen Achse des linken Ventrikels ausgerichtet sind, sowie der kurze Achse Blick (SAX, short axis view) der orthogonal zum 2 CV und 4 CV liegt. Die Auswertung der Bilder erfolgte mit der „Segment“ Software. Somit konnten das linksventrikuläre enddiastolische (LVEDV) und endsystolische Volumen (LVESV), als auch das daraus resultierende linksventrikuläre Schlagvolumen (LVSV=LVEDV–LVESV) und die Ejektionsfraktion (LVEF=LVSV/LVEDV×100) bestimmt werden. Die linksventrikuläre Masse (LVM) wurde mit Hilfe des linksmyokardialen Volumens und der Dichte von Myokardgewebe (1,05 g/cm3) kalkuliert. Material und Methoden - 20 - 2.2.3 Versuchsaufbau und Zeitpunkte der Probenentnahme Zur Beantwortung der Fragestellung war es nötig, den Verlauf der Erkrankung von einem gesunden Herzen über eine kompensierte Herzhypertrophie bis hin zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz zu analysieren. Um einen Einblick in den progressiven Krankheitsverlauf zu bekommen, wurden Vorversuche durchgeführt, in denen die Herzfunktion der Tiere nach TAC-OP in engmaschigen Abständen im MRT vermessen wurde. Es zeigte sich, dass ab acht Wochen nach OP die Mortalität rapide anstieg und auch nur ein kleinerer Anteil der Tiere die Belastung durch Narkose und MRT-Messung überlebte. Somit wurde der Endpunkt des Versuches bei 56 Tagen festgelegt. Die erste MRT-Messung wurde vier Tage nach OP durchgeführt. Dies sollte den Tieren ausreichend Zeit geben, sich von Narkose und OP und dem damit verbundenen Stress zu erholen. Um möglichst alle Stadien der Erkrankung untersuchen zu können, wurden vier weitere Messzeitpunkte in die Zeitspanne zwischen Tag 4 und 56 gesetzt. Dementsprechend ergaben sich 6 postoperative Messzeitpunkte: 4, 14, 21, 28, 42 und 56 Tage. An jedem dieser Zeitpunkte wurden jeweils 6 TAC- und 6 Sham-Tiere im MRT untersucht und anschließend deren Herzen entnommen. Da es aus technischen Gründen leider nicht möglich war, die Herzfunktion der Mäuse auch vor der Operation zu bestimmen, wurden zusätzlich 6 nichtoperierte Tiere (baseline) untersucht. Insgesamt wurden dementsprechend 78 Mäuse in den Versuch eingeschlossen. Zur Verdeutlichung ist inAbb 2.3 der Versuchsaufbau schematisch dargestellt. Abb. 2.3 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 6 TAC- und 6 Sham-Tiere einer MRT-Messung unterzogen, die Herzen entnommen und weiterführenden Analysen zugeführt. 6 nichtoperierte BL/6-Mäuse dienten als „baseline“-Kontrolle. Material und Methoden - 21 - 2.2.3.1 Isolation der Herzen und Probenvorbereitung Im Anschluss an die MRT-Messung wurde die jeweilige Maus mit Trapanal (2,5 % Lösung, 100 µl, i.p.) sediert, Brust- und Bauchraum chirurgisch eröffnet, das Herz über die abdominale Aorta mit eiskalter 0,9 %-iger Kochsalzlösung blutleer gespült und entnommen. Anschließend wurden die Vorhöfe abgetrennt, der linke (ohne Septum) und rechte Ventrikel präpariert und die Proben separat in flüssigem Stickstoff eingefroren. 2.2.4 Genexpressionsanalyse Im Rahmen dieser Arbeit war angestrebt, das gewonnene Herzgewebe sowohl auf TACinduzierte Transkriptom- als auch Proteomänderungen hin zu untersuchen. Hierfür war es nötig, die Proben so aufzuarbeiten, dass trotz der limitierten Probenmenge beide Analysen durchgeführt werden können. Aus diesem Grund wurden die einzelnen Proben zunächst in flüssigem Stickstoff unter Benutzung eines Pistills zu einem feinen Puder zermahlen. Der Gewebepuder wurde anschließend geteilt, ein Teil der Proteomanalyse zugeführt, der andere Teil in 700 µl Lysereagenz (QIAzol) aufgenommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur RNA Isolation bei -80°C gelagert. 2.2.4.1 RNA-Isolation und Bestimmung von RNA-Qualität und RNA-Konzentration Auf Grund der hohen Probenanzahl (n=156: 78 x linker Ventrikel, 78 x rechter Ventrikel) wurde die RNA-Isolation semiautomatisch unter Benutzung des QiaCube Pipettierroboters durchgeführt. Die Durchführung erfolgte nach dem Herstellerprotokoll („Purification of Total RNA from Animal Tissues“ Qiagen). Die in QIAzol vorliegenden Proben wurden über Qiashredder Säulen nochmals homogenisiert und anschließend mit Chloroform versetzt. Das Chloroform führt zur Ausbildung eines 2– Phasen-Systems, wobei die untere organische Phase die Proteine, die obere wässrige Phase die RNA enthält. Die obere Phase wurde abgenommen und im QIAcube weiter prozessiert. Dieses Gerät übernimmt auf Basis des miRNeasy Mini Kit die Fällung, Reinigung und Elution der RNA. Pro Probe lagen nach Isolation und Aufreinigung jeweils 40 µl RNALösung vor, welche bis zur weiteren Nutzung bei -80°C gelagert wurde. Die Konzentrationen der extrahierten Gesamt-RNAs wurden durch eine Absorptionsmessung bei 260 nm am NanoDrop ND-1000 Spektrometer bestimmt und lag zwischen 35-120 ng/µl. Material und Methoden - 22 - Um Verunreinigungen der RNA mit Proteinen bzw. organischen Lösungsmitteln beurteilen zu können, wurde zusätzlich der Quotient mit dem Absorptionsmaximum von Proteinen (280 nm) gebildet. Der Absorbtionsquotient A260/A280 wies im Mittel einen Wert von 2,0 ± 0,05 auf, womit die RNA als nahezu frei von Proteinkontamination angesehen werden konnte. Als zusätzliche Qualitätskontrolle wurde die RNA-Integrität mittels des RNA 6000 Nano LabChip Kit im Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) nach Herstellerprotokoll untersucht. Dabei wird eine Kapillarelektrophorese auf einem Chip basierenden System durchgeführt. Die zuvor bei 70°C (2 min) denaturierte und fluoreszenzmarkierte RNA wird durch ein System von Mikrokanälen bezüglich ihrer Fragmentgrößen aufgetrennt. Dies wird von einem Detektor erfasst und in einem Elektropherogramm und in einem daraus abgeleiteten Gel-Bild dargestellt (Abb. 2.4). Bei der Auftrennung grenzen sich die beiden ribosomalen 18S und 28S als zwei deutlich voneinander getrennte RNA-Banden ab. Aus dem Verhältnis von 18S und 28S-rRNAs zur Basislinie und dem Gesamterscheinungsbild des Elektropherogramms generiert die 2100 Expert Software (Version B02.05.SI360) einen RNAIntegritätswert (RIN), der eine Beurteilung der RNA hinsichtlich des Degradationsstatus ermöglicht. Der RIN nimmt hierbei Werte zwischen 1 (stark degradiert) und 10 (exzellente Integrität) an, wobei in den untersuchten Proben kein RIN unter 8,2 ermittelt wurde. Marker 28 srRNA 18 srRNA Abb. 2.4 Elektropherogramm einer aus dem murinen linken Ventrikel (baseline) isolierten RNA-Probe Dargestellt sind das Elektropherogramm (links) und das digitalisierte RNA-Elektrophoresebild (rechts). Nach elektrophoretischer Auftrennung der RNA-Probe zeigen sich zwei sehr gut voneinander abgrenzbare Banden, die den Untereinheiten der ribosomalen RNA entsprechenDer RIN dieser Probe beträgt 9,2. Material und Methoden - 23 - 2.2.4.2 Probenmanagement Auf Grund der hohen Probenanzahl von 156 wurden die einzelnen RNA-Proben für die Genexpressionsanalyse gepoolt. So wurden pro Messzeitpunkt jeweils die sechs linken und sechs rechten Ventrikel der baseline-, Sham- bzw. TAC-Tiere zu einer Probe zusammengefasst. Hierfür wurden von den einzelnen RNA-Proben jeweils 250 ng entnommen und innerhalb der Gruppe und für die jeweilige Bedingung miteinander vermischt. So wurde sichergestellt, dass für jede Probe ausreichend RNA für weitergehende Analysen auf Einzeltierebene vorhanden war. Insgesamt standen 26 Poolproben zur Verfügung: baseline (linker und rechter Ventrikel), jeweils linker und rechter Ventrikel von TAC- und Sham-Tieren pro Zeitpunkt 4, 14, 21, 28, 42 und 56 Tage postOP. Zur Verdeutlichung ist in Abb. 2.5 das Poolen der Proben exemplarisch für den postoperativen Tag 14 dargestellt. Abb. 2.5 Exemplarisches Schema zum Poolen der Proben Für den postoperativen Tag 14 lagen Herzen von 6 TAC-und 6 Sham-Mäusen vor. Diese wurden in linke und rechte Ventrikel geteilt und die Gesamt-RNA isoliert. Daraus resultierten 24 Einzelproben für diesen Zeitpunkt. Je 250 ng der RNA-Proben einer Gruppe wurden gepoolt und die einzelnen Pools einer Genexpressionsanalyse unterzogen. Material und Methoden - 24 - 2.2.4.3 Affymetrix GeneChip® Analyse Zur genomweiten Expressionsanalyse wurde der Affymetrix GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array verwendet. Die Funktionsweise der GeneChip® DNA-Technologie beruht auf dem Prinzip der Hybridisierung von Nukleinsäuren. Dabei werden synthetisch hergestellte Oligonucleotide in spezifischer Anordnung durch ein photolithographisches Verfahren direkt auf die Quarzoberfläche des Chips synthetisiert. Diese kurzen, meist 25-mer langen Oligonucleotidsequenzen fungieren als Sonden, die unikal auf ein Gen zurück zu führen sind. Dies bietet die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom auf einem Chip abzubilden. Durch die Hybridisierung mit einer aus der RNA-Probe amplifizierten und biotinylierten, komplementären ssDNA (single strand DNA, Target) ist es möglich, das gesamte Transkriptom zu untersuchen. 2.2.4.3.1 Präparation der Target-ssDNA Zunächst mussten die gepoolten RNA-Proben unter Benutzung des Ambion® WT Expression Kit in ssDNA umgeschrieben werden. Die Prozedur erfolgte nach Herstellerangaben. Hierfür wurden jeweils 150 ng RNA eingesetzt, die mit einer Poly-A Kontroll-RNA (Spike-in RNA) versetzt wurden (GeneChip®Poly-A RNA Control Kit). Spike-in RNAs dienen der Kontrolle der Amplifikation und der internen Kalibration des Microarrays. Die Synthese der ssDNA verläuft über mehrere Teilschritte. Zunächst wird die RNA in zwei Syntheseschritten (Erststrang- und Zweitstrangsynthese) in dsDNA umgeschrieben. Um eine Vervielfachung der eingesetzten RNA-Menge zu erreichen, wird die dsDNA in-vitro zu cRNA transkribiert. Anschließend erfolgen Reinigungsschritte, in denen Enzyme, Salze, anorganische Phosphate und nicht gebundene Nucleotide entfernt werden. Die gereinigte cRNA wird unter zur Hilfenahme von Random Primern, die sich in zufälliger Verteilung an die RNA anlagern und somit die Startsequenz für die reverse Transkriptase bilden, in ssDNA unter Inkorporation von dUTP umgeschrieben. Die template cRNA (Matrize) wird anschließend durch Hydrolyse mit RNAse H degradiert. Die ssDNA wird gereinigt und somit für die Fragmentierung und Markierung vorbereitet. Die Fragmentierung und Markierung der ssDNA erfolgte mit dem GeneChip® WT Terminal Labeling Kit nach Herstellerangaben. Der DNA-Einzelstrang wird durch eine Kombination aus Uracil DNA Glycosylase (UDG) und A-Purin-A-Pyrimidin-Endonuklease 1 (APE1) fragmentiert. Die Markierung der Fragmente erfolgt mittels einer TdT (Terminal Material und Methoden - 25 - Deoxynucleotidyl Transferase) über ein kovalent gebundenes Biotin-DNA Labeling Reagenz. Zur Qualitätskontrolle der einzelnen, während der Prozedur entstandenen Nukleinsäuren (ssDNA und fragmentierter ssDNA) wurden Nano Chip Messungen (Abs 2.2.4.1) am Bioanalyzer 2100 vorgenommen (Abb2.5). Abb. 2.5 Repräsentative Elektropherogramme von ssDNA und framentierter ssDNA Die Elektropherogramme zeigen amplifizierte ssDNA in unfragmentierter (oben) bzw. fragmentierter Form (unten), wobei letztere die Target-DNA darstellt. 2.2.4.3.2 Hybridisierung Für die nachfolgenden Schritte wurde das GeneChip® Hybridization, Wash and Stain Kit nach Herstellerprotokoll verwendet. Für die Hybridisierung wurde ein Hybridisierungscocktail, der neben den biotinylierten DNA Fragmenten (Targets) auch Kontrolloligonucleotide und Hybridisierungskontrollen enthält, auf den Array gegeben und für 16 h inkubiert. Die Biotin-markierten B2-Kontrolloligonukleotide werden zur Abgrenzung des Leserasters verwendet, da sie mit spezifischen Sonden am Rand des Arrays hybridisieren. Die aus markierter E.coli- bzw. P1-Bakteriophagen-RNA bestehenden Hybridisierungskontrollen werden in verschiedenen Konzentrationen von der unteren Detektionsgrenze bis hin zum Detektionsmaximum zugesetzt (bioB (1,5 pM), bioC (5 pM), bioD (25 pM), cre (100 pM)) und dienen zur Qualitätskontrolle hinsichtlich der Sensitivität des Lasers und der Hybridisierung. Nach erfolgter Hybridisierung wurde das Waschen und Färben der Chips in der Array-Waschstation GeneChip® Fluidics Station 450 nach dem Protokoll des Herstellers prozessiert. Für die Färbung der hybridisierten DNA-Fragmente wurde ein Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat genutzt. Das Scannen der Arrays erfolgte im konfokalen Scanner 3000 (Affymetrix). Die Menge des vom gebundenen Phycoerythrins emittierten Lichts bei 570 nm ist dabei proportional zu den gebunden Targets. Diese Intensitäten werden an jeder Position des Arrays aufgezeichnet und abschließend als Bilddatei (.dat) ausgegeben. Material und Methoden 2.2.4.3.3 - 26 - Auswertung der Microarrays Die Bilddateien (.dat) wurden mittels Affymetrix GeneChip® Console (AGCC) in CEL-files konvertiert und mit der Rosetta Resolver 7.2.2 Software analysiert. Entsprechend des Mouse Gene ST 1.0 Array Typs wurde der Robust-Multi-Array (RMA) Algorithmus via Affymetrix Power Tools (APT) zur Datenextraktion und Normalisierung angewendet. Zudem wurden für über den Hintergrund detektierte Sequenzen (Transkripte) p-Werte angegeben, die mit p<0,05 als sicher detektiert angenommen wurden. Die Transkriptomanalyse sah die Verwendung gepoolter Proben vor, die eine statistische Analyse auf Basis von biologischen Replikaten nicht ermöglichen. Um verlässliche Ergebnisse zu generieren, wurden nur Sequenzen/Transkripte verwendet, die einen pWert <0,05 aufwiesen. Zudem wurden Ratios (TAC/Sham) gebildet, die auf Basis des Rosetta Resolver Fehlermodells die Analyse differentiell exprimierter Sequenzen/Transkripte in den zu betrachtenden Gruppen und Zeitpunkten ermöglichen. Differentiell exprimierte Sequenzen/Transkripte mit einer mindestens 2-fachen Änderung (fold change (fc) ≥ 2) und einem p-Wert <0,05 gingen in die funktionellen Analysen ein. Dazu wurde die Ingenuity Pathway Analysis V.2012 Software (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) verwendet. Mit dieser Software ist es möglich, die zu untersuchenden differenziell exprimierten Gene eines Datensatzes mit einer auf wissenschaftlichen Publikationen basierenden Datenbank bzw. Referenzset abzugleichen und zu funktionellen und biologischen Kategorien zusammenzufassen. Dabei wird eine Überrepräsentation von Genen einer Kategorie im Vergleich zum Referenzset in Form eines p-Wertes und eines Verhältnisfaktors (Anzahl differenziell regulierter Gene vs. Referenzset je Kategorie) angegeben. 2.2.4.4 Validierung der Microarraydaten Zur Validierung der Microarray Daten wurden TaqMan Low Density Arrays genutzt. Hierbei wurden jedoch nicht die gepoolten RNAs eingesetzt, sondern die RNAs der Einzelproben der linken Ventrikel von Sham- und TAC-Tieren. Dies hatte den Vorteil, dass neben der Validierung auch die gruppeninterne Varianz der Genexpression geprüft und Korrelationsanalysen zu den erhobenen kardialen Funktionsparametern durchgeführt werden konnten. Material und Methoden 2.2.4.4.1 - 27 - Quantitative Real-time PCR Die TaqMan Low Density Arrays (TLDA) beruhen auf der Methode der quantitativen realtime PCR (qRT-PCR). Die quantitative Bestimmung der PCR-Produkte erfolgt durch den Einsatz einer TaqMan-Sonde, an deren 5`-Ende sich ein hochenergetischer Fluoreszenzfarbstoff (Reporter) befindet. Ist diese Sonde intakt wird die Fluoreszenz des Reporters vom am 3`-Ende befindlichen niederenergetischen Quentscher absorbiert. Während der Amplifikation wird die Sonde aufgrund der 5`-3`-Exonukleaseaktivität der DNAPolymerase abgebaut. Es entfernen sich Reporter und Quentscher voneinander und die steigende Reporterfluoreszenz kann gemessen werden. Die Quantifizierung erfolgt über den Ct-Wert (cycle treshhold). Dieser Wert beschreibt den PCR-Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität erstmals exponentiell über den Hintergrund steigt. Der verwendete TLDA umfasst 384-wells mit 8 fill ports, so dass sich jeweils ein Set von 48 wells ergibt. Da sich in jedem well Primer und Sonden für jeweils ein Transkript befinden, können einzelne, unabhängige qPCR Reaktionen (Assays) ablaufen. Somit erlaubt dieser TLDA die simultane Messung von 48 Genen in 8 Proben. Um die Verwertbarkeit der Daten zu steigern, wurden jedoch nur 4 Proben je Array in Doppelbestimmung gemessen. Bei der relativen Quantifizierung wird die Menge des Transkripts eines Zielgens im Verhältnis zu einem oder mehreren Referenzgenen bestimmt. Voraussetzung für diese Referenzgene ist ein konstantes Expressionsniveau über den Verlauf des Experiments, also auch in allen Gruppen. Auf Grund dessen wurde neben den 44 Zielgenen auch die Expression der ribosomalen Gene Rpl32, Rpl4, Rs18 und Polr2a, welches für eine Untereinheit der RNA-Polymerase II kodiert, als Referenz gemessen. Für die Messung wurden je Probe 600 ng RNA in cDNA umgeschrieben. Dies erfolgte unter Verwendung des High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems) nach dem Protokoll des Herstellers. Anschließend wurde die Probe in zwei Ansätze geteilt, der TaqMan Universal PCR MasterMix zugegeben und in die fill ports pipettiert (300 ng cDNA je Port). Nach zweimaliger kurzer Zentrifugation, bei der sich der cDNA-Mix aus den fill ports gleichmäßig in die wells verteilt, wurde die Karte versiegelt und im ABI HT7900 RTPCR System gemessen. Die Messung erfolgte über 40 Zyklen (30 s 97°C, 1 min 59,7°C), denen zwei initiale Temperaturschritte (2 min 50°C, 10 min 94,5°C) vorausgingen. Die Ausgabe der Rohwerte der Messungen am ABI HT 7900 RT PCR System (Applied Biosystems) erfolgte über die SDS 2.3 Software. Diese stellt in einem RQ (Relative Quantifizierung) Dokument die Ct-Werte der einzelnen Assays zusammen und bietet die Möglichkeit, die Amplifikationsplots graphisch darzustellen. Die Amplifikationsplots Material und Methoden - 28 - mussten einzeln begutachtet werden, um die Qualität des Laufs zu beurteilen und falsch positive Werte bzw. Ct-Artefakte auszuschließen. Anschließend erfolgte die Analyse der RQ Daten mit der Data Assist Software (Applied Biosystems). Hierbei wurden die relativen Quantitäten der Transkripte über den geNorm berechneten Normalisierungsfaktor (NF) ermittelt. Dieser von Vandesompele et al. (Vandesompele et al., 2002) eingeführte Algorithmus dient der Bestimmung der stabilsten Referenz bzw. house keeping-Gene, die aus einem Set getesteter Kandidaten besteht. Der Normalisierungsfaktor berechnet sich dabei aus dem geometrischen Mittel der eingesetzten Referenzgene (Polr2a, Rpl4, Rpl32, Rs18). Dadurch ist dieses Modell robust gegen Ausreißer bzw. Schwankungen in der Expression der Referenzgene und erlaubt eine verlässliche quantitative Aussage über die Expression der Zielgene. 2.2.5 Proteomanalyse Die Aufarbeitung der Herzproben für die Proteomanalyse und die entsprechende Auswertung wurde von Alexander Benkner im Rahmen seiner Diplomarbeit am Interfakultären Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung durchgeführt. Dabei standen ihm die in Abschnitt 2.2.4 genannten Gewebepuder der linken und rechten Ventrikel zur Verfügung. Die Analyse der Proteinmuster wurde mittels Massenspektrometrie durchgeführt. Die Probenvorbereitung und –analyse wurde wie im Folgenden beschrieben durchgeführt: Der zur Verfügung gestellte Gewebepuder wurde unter Benutzung einer Kugelmühle mechanisch aufgeschlossen, in 1x UT (8M Harnstoff/2M Thioharnstoff) -Puffer aufgenommen und kurz mit Ultraschall behandelt. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Proteinkonzentration bestimmt. Jeweils 20 µg Protein der einzelnen Proben wurde nach dem bereits für die Transkriptomanalyse verwendeten Schema gepoolt (2.2.4.2). Von den resultierenden Poolproben wurden jeweils 4 µg Protein einem Flüssigverdau mit LysC und Trypsin zugeführt. Das entstandene Peptidgemisch wurde entsalzt, mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie aufgetrennt und im LTQ-OrbitrapVelos Massenspektrometer vermessen. Die Auswertung der massenspektrometrischen Rohdaten erfolgte mit der Rosetta Elucidator Software. Material und Methoden - 29 - 2.2.6 Histologische Bestimmung der Fibrosierung Mit Hilfe histologischer Färbemethoden sollte ermittelt werden, inwieweit fibrotische Veränderungen der Herzen nach TAC-OP auftraten. Hierfür wurden erneut Tiere wie unter 2.2.3 beschrieben einer Aortenstenose unterzogen und pro Zeitpunkt je 3 Sham- und 3 TAC-Mäuse im MRT vermessen. Zusätzlich wurden 3 baseline-Tiere mitgeführt. Anschließend wurden die Herzen über die abdominale Aorta mit einer paraformaldehydhaltigen Fixierlösung (Ringerlösung, 3 % Paraformaldehyd, 4 % Dextran, 2 % Glutaraldehyd, pH 7,4) gespült, entnommen und in einer Nachfixier-Lösung (3% Paraformaldehyd in PBS) aufbewahrt. Die fixierten Mäuseherzen wurden in Paraffin eingebettet und axial zur Herzmitte 7µm dicke Schnitte angefertigt. Um den Anteil des Kollagens im Herzgewebe zu bestimmen, wurde eine Färbung mit Siriusrot durchgeführt. Dabei wird Kollagen rot angefärbt, wohingegen das restliche Gewebe eine gelbliche Färbung aufweist. Die Paraffinschnitte und die histologischen Färbungen wurden am Institut für Pathologie der Universitätsmedizin Greifswald angefertigt. Die mikroskopischen Aufnahmen der Herzschnitte wurden mit dem Keyence BZ9000 Floureszenzmikroskop durchgeführt. Pro Herz standen 3 mit Siriusrot gefärbte Schnitte zur Verfügung. Pro Herzquerschnitt wurden in 10-facher Vergrößerung rasterartig mehrere Einzelbilder aufgenommen und mittels BZ II Analyzer Software (Keyence) zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Anschließend konnten die Gesamtflächen der Schnitte bestimmt und die Fläche der fibrotischen Areale mittels eines semi-automatischen PixelFarbdeterminierungsalgorithmus der BZ II Analyzer Software quantifiziert werden. Daraus wurde der prozentuale Anteil der Fibrose berechnet und der Mittelwert der 3 verschiedenen Schnitte pro Herz gebildet. 2.2.7 Statistische Analysen Für die Auswertung der Microarray- bzw. TLDA-Daten wurde die oben beschriebene Software Rosetta Resolver 7.2.2 (Rosetta Inpharmatics LLC) bzw. Data Assist 3.01 (Applied Biosystems) genutzt. Die funktionelle Kategorisierung der differenziell regulierten Gene wurde mit Ingenuity Pathway Analysis V.2012 Software (Ingenuity® Systems) durchgeführt. Für die statistische Auswertung der kardialen Funktionsparameter (Mann-Whitney-U-Test) und der Fibrose (Students t-Test), als auch für die Korrelationsanalysen der TLDA-Messwerte Material und Methoden - 30 - (Spearman) mit den funktionellen Herzparametern wurde Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software) verwendet. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant bewertet. Ergebnisse 3. - 31 - Ergebnisse Ziel dieser Arbeit war es, den progressiven Krankheitsverlauf einer chronischen Herzinsuffizienz auf Transkriptom- und Proteomebene zu untersuchen. Dafür wurde das Modell der experimentellen Aortenstenose (TAC) in der Maus etabliert. Bei diesem Tiermodell entsteht durch eine definierte Konstriktion der Aorta eine Drucküberlastung des linken Ventrikels, die zur Ausbildung einer Herzinsuffizienz führt. Die aus der Drucküberlastung resultierenden pathologischen Veränderungen des Herzens wurden über einen Zeitraum von 56 Tagen beobachtet. An den dabei untersuchten Zeitpunkten 4, 14, 21, 28, 42 und 56 Tage nach der OP wurden die kardialen Funktionen mittels Magnetresonanztomografie evaluiert. Im Anschluss an die funktionellen Messungen wurden die Herzen für die Transkriptom- und Proteomuntersuchungen entnommen und jeweils in linke und rechte Ventrikel geteilt. Als Kontrollgruppen fungierten scheinoperierte Tiere (Sham), die zwar der OP-Prozedur unterlagen, jedoch keine Konstriktion der Aorta vorgenommen wurde. Zudem stellten nicht operierte Tiere eine baseline-Kontrollgruppe. Für die mRNA- und Proteinanalyse wurden die linken bzw. rechten Ventrikel gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und hinsichtlich ihrer Veränderungen während der Progression einer Herzinsuffizienz untersucht. Für den folgenden Ergebnisteil wurde als Nomenklatur der Gene die Kleinschreibung (z.B. Postn) und für das ensprechende Protein die Schreibweise in Kaptitalen (z. B. POSTN) festgelegt. 3.1 Charakterisierung der murinen Herzfunktion nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung 3.1.1 Bildgebende Darstellung der murinen Herzaktion mittels Magnetresonanztomografie Durch das bildgebende Verfahren der Magnetresonanztomografie war es möglich, hochauflösende Bilder der Herzaktion einzelner Tiere zu generieren und somit die entsprechenden Funktionsparameter präzise zu erheben. Des Weiteren konnte über die Aufnahme des Aortenbogens sichergestellt werden, dass in TAC-operierten Tieren tatsächlich eine Gefäßverengung vorhanden war. Abb. 3.1 zeigt den Vergleich zwischen einem Sham- Ergebnisse - 32 - und einem TAC-operierten Tier. Dargestellt ist der sogenannte 4-Kammerblick, in dem die vier Herzkammern und der Aortenbogen erkennbar sind. Deutlich sichtbar ist die Verengung der Aorta des abgebildeten TAC-Tieres (rechts). Abb. 3.1 Kardio-MRT Aufnahme des Herzens einer TAC-operierten Maus im Vergleich zum Herzen eines Sham- Tieres Dargestellt ist der 4-Kammerblick einer Sham- (links) und einer TAC- (rechts) operierten Maus. Die Aorta des TAC-Tieres ist durch die Aortenkonstriktion deutlich verengt (Pfeil). 3.1.2 Erhebung der kardialen Funktionsparameter und Charakterisierung des Krankheitsverlaufs Im Rahmen dieser Arbeit sollte der progrediente Krankheitsverlauf einer induzierten Herzinsuffizienz abgebildet werden. Vorversuche haben ergeben, dass 56 Tage nach TACOperation ein Stadium erreicht wurde, an dem die Herzfunktion bereits stark abgesunken war und die Tiere sehr sensibel auf äußere Einflüsse wie Narkose und MRT-Messung reagierten. Aus diesem Grund wurde der Tag 56 als Versuchsendpunkt definiert. Um alle Krankheitsstadien im Einzelnen untersuchen zu können, wurden weitere Zeitpunkte wie folgt festgelegt: 4, 14, 21, 28 und 42 Tage nach Operation (Sham und TAC). Es wurden pro Messzeitpunkt jeweils 6 Sham- und 6 TAC-Tiere untersucht. Zusätzlich fungierten 6 nicht operierte C57Bl/6N Mäuse als baseline-Gruppe. Abb. 3.2 zeigt repräsentative MRT-Aufnahmen einer baseline-Maus und von TAC-operierten Mäusen zu den einzelnen Versuchszeitpunkten. Bei TAC-Tieren konnte eine stetige Größenzunahme der Herzen beobachtet werden, bereits nach 14 Tagen postOP zeigte sich auch eine Zunahme der Wanddicke der Ventrikel. Die Kammervolumina nahmen ebenfalls über den Zeitverlauf zu, wohingegen die zunächst hypertrophe Steigerung der Wanddicke ab Ergebnisse - 33 - Tag 42 in eine Dilatation der Ventrikel mündete. Am Versuchsende zeigte sich ein massiv vergrößertes Herz mit stark dilatierten Ventrikeln. Abb 3.2 Repräsentative Kardio-MRT-Aufnahmen der Mausherzen im Zeitverlauf nach TAC-OP Dargestellt ist der 4-Kammerblick eines basline Mausherzens (base) und der Herzen an den Tagen 4, 14, 21, 28, 42 und 56 nach TAC-OP. Es zeigt sich eine Größenzunahme der Herzen über die Zeit. Die finale Dilatation der Ventrikel an Tag 56 verdeutlicht zusätzlich die Aufnahme im 2-Kammerblick (unten rechts). Die Kardio-MRT-Aufnahmen Herzfunktionsparameter zu wurden bestimmen. genutzt, Die um die durchschnittliche linksventrikulären linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) betrug in den gesunden baseline-Mäusen 56,5 ± 1,2 %. Bereits vier Tage nach TAC-OP verschlechterte sich die LVEF auf 38,2 ± 4,3 % und sank an Tag 14 auf 28,3 ± 2,9 % ab. Dieses Niveau konnte bis zum Tag 42 (28,3 ± 6,2 %) aufrechterhalten werden. Bis zum Tag 56 trat eine weitere deutliche Verschlechterung der linksventrikulären Pumpfunktion ein (16,0 ± 2,2 %). Im Gegensatz dazu konnte in den Sham-Tieren keine Abnahme der LVEF über die Zeit beobachtet werden, hier zeigten sich konstante Werte von 55,4 ± 1,9 % (Abb 3.3 A). Die in den MRT-Aufnahmen bereits sichtbare Vergrößerung der Herzen konnte durch eine Bestimmung der linksventrikulären Masse (LVM) bestätigt werden. Um ein eventuell vorhandenes unterschiedliches Wachstumsverhalten einzelner Tiere in die Auswertung mit einzubeziehen, wurde die ermittelte LVM auf die zugehörige Tibialänge normalisiert. Während der Quotient in den Sham-Tieren über die Zeit nur leicht anstieg (LVM/TL, 34,5 ± 3,5 vs. 36,7 ± 1,8 mg/cm), wiesen TAC-Tiere eine sehr starke Massezunahme auf. Auch in diesem Parameter lässt sich eine treppenförmige Erhöhung bei TAC-Tieren erkennen: eine leichte Zunahme zu Tag 4 (43,7 ± 3,9 mg/cm) und Tag 14 (56,4 ± 6,7 mg/cm), eine nur mäßige Erhöhung von LVM/TL bis zum Tag 42 Ergebnisse (61,5 ± 6,5 mg/cm) - 34 und dann ein wieder stärkerer Anstieg bis zum Tag 56 (76,4 ± 13,4 mg/cm) (Abb. 3.3 B). Die bereits erwähnte stufenartige Progression konnte auch bei den Parametern LVEDV (linksventrikuläres enddiastolisches Volumen) und LVESV (linksventrikuläres endsystolisches Volumen) beobachtet werden (Abb 3.3 C, D). Ausgehend von dem LVEDV der Herzen der baseline-Gruppe (56,6 ± 3,0 µl) kam es bei den TACMäusen auch hier über Tag 4 (68,8 ± 4,4 µl) bis hin zu Tag 14 (90,0 ± 6,9 µl) zu einem initialen Anstieg, die Werte verblieben zwischen den Versuchstagen 21-42 ( 95,59 ± 9,5 µl) auf einem konstant erhöhten Niveau und zeigten an Tag 56 (140,0 ± 16,24 µl) nochmals eine massive Steigerung. Ein ähnliches Bild zeigten die TAC-Mäuse hinsichtlich des LVESV, das sich über Tag 4 (42,7 ± 5,2 µl) und 14 (64,3 ± 6,1 µl) vergrößerte, zwischen Tag 21-42 (69,1 ± 10,3 µl) konstant verhielt und final weiter (117,7 ± 15,7 µl) zunahm. Die linksventrikulären Volumina der Enddiastole (60,7 ± 5,6 µl) und Endsystole (27,3 ± 7 µl) in den Sham-Tieren blieben an allen Messzeitpunkten unverändert. Insgesamt war in den TAC-Tieren bereits ab Tag 4 bei allen untersuchten kardialen Funktionsparametern eine signifikante Verschlechterung in Bezug auf die entsprechende Sham-Gruppe zu verzeichnen. Zur Verdeutlichung der Ergebnisse sind die kardialen Funktionsparameter in Abb. 3.3 graphisch dargestellt, die Tab 3.1 zeigt eine Zusammenfassung der erhobenen Daten und die entsprechenden Signifikanzen. Ergebnisse - 35 - A B C D Abb. 3.3 Zeitlicher Verlauf der erhobenen kardialen Funktionsparameter LVEF, LVM/Tibialänge, LVEDV und LVESV in baseline-, Sham- und TAC-Tieren Die mittels Kleintier-MRT erhobenen Daten sind als Einzelwerte und Mittelwerte ± SD (rot) dargestellt. In den TAC-Mäusen (schwarz) konnte über die Zeit eine stufenartige Progression der Erkrankung beobachtet werden. Dabei zeigte sich der Verlust der Pumpfunktion in der abfallenden linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) (A), die Herzhypertrophie in einem Anstieg des Quotienten aus linksventrikulären Masse (LVM)/Tibialänge (B) und die fortschreitende Ventrikeldilatation in der Vergrößerung der linksventrikulären enddiastolischen (LVEDV) (C) und endsytolischen Volumina (LVESV) (D). In Sham-Tieren (blau) veränderten sich die Funktionsparameter über die Zeit nicht und zeigten keine signifikanten Unterschiede zu nicht operierten baseline-Tieren (grün). Tab. 3.1 Werte der erhobenen kardialen Funktionsparameter LVEF, LVM/Tibialänge, LVEDV und LVESV in baseline, Sham- und TAC-Tieren Die mittels Kleintier-MRT ermittelten Parameter sind als Mittelwerte ± SD aufgeführt. Alle untersuchten kardialen Funktionsparameter zeigten zu jedem Zeitpunkt signifikant schlechtere Werte (**p≤0,01, * p≤0,05) in TAC-Tieren im Vergleich zu den Sham-Tieren. base LVEF (%) LVM/Tibialänge (mg/cm) LVEDV(µl) LVESV(µl) 56,5 ± 1,2 32,5 ± 4,3 56,7 ± 3 24,8 ±1,5 Sham TAC Sham TAC Sham TAC Sham TAC 4d 54,7 ± 2 38,2 ± 4,3** 34,5 ± 3,5 43,7 ± 3,9** 56 ± 2,5 68,8 ± 4,4** 25,3 ± 2 42,7 ± 5,2** 14d 54,3 ± 1,4 28,3 ± 2,9** 36,6 ± 3 56,4 ± 6,7** 59,5 ± 5,3 90 ± 7** 29 ± 2,6 64,3 ±6,1** 21d 54,7 ± 1,2 28,2 ± 2,6** 37,8 ± 3,7 59,8 ± 6,3** 62,5 ± 6,7 91,7 ± 9,9** 28,3 ± 3 66 ± 8,9** 28d 55,8 ± 2,4 27,5 ± 2,2** 35,8 ± 1,6 61 ± 7,5** 58,3 ± 5,9 96 ± 5,7** 25,7 ± 2,7 69,5 ± 5,5** 42d 57 ± 1,3 28,3 ± 6,3** 38,5 ± 4,4 61,5 ± 6,5** 67,7 ± 1 99,3 ± 3,5** 29 ± 1 71,8 ± 15,1** 56d 56,2 ± 1,6 16 ± 2,2** 36,7 ± 1,8 76,4 ± 13,4** 59,3 ± 4,2 140 ± 16,2** 26,2 ± 2,5 117,7 ± 15,7** Ergebnisse - 36 - Zusammenfassend haben diese Untersuchungen gezeigt, dass eine mittels Aortenkonstriktion hervorgerufene Herzinsuffizienz durch einen stufenartigen Krankheitsverlauf gekennzeichnet ist. Die initial hypertrophe Reaktion mit Zunahme der linksventrikulären Masse und der Verschlechterung der Pumpfunktion repräsentiert die erste Phase der einsetzenden Remodelingprozesse. In der sich anschließenden Plateauphase, in der sich die Herzfunktion auf konstant erniedrigtem Niveau hält, scheint sich eine kompensierte kardiale Hypertrophie einzustellen. Zu Versuchsende zeigt sich ein final erkranktes Herz durch eine massive Ventrikeldilatation und stark eingeschränkte Pumpfunktion. Diese Daten bestätigen sowohl die Eignung des Tiermodells, als auch die gewählten Zeitpunkte für die Untersuchungen der Remodelingprozesse während der Ausbildung einer Herzinsuffizienz. 3.2 Charakterisierung der kardialen Fibrosierung nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung Um zu untersuchen, inwieweit fibrotische Veränderungen bei Hypertrophie und Herzinsuffizienz nach TAC auftreten, wurden weitere Mäuse nach dem oben genannten Schema operiert. Die verschiedenen Gruppen (baseline, Sham, TAC) und Untersuchungszeitpunkte wurden beibehalten, es wurden jeweils drei Tiere in einer Gruppe untersucht. Die Herzfunktion der Tiere wurde auch hier nach einer magnetresonanztomografischen Untersuchung erhoben. Anschließend wurden die Herzen entnommen, in Paraffin eingebettet, geschnitten und Kollagenfasern mittels Siriusrot-Färbung markiert und quantifiziert. Nach Auswertung der MRT-Aufnahmen zeigte sich ein vergleichbares Bild zu den ersten Funktionsmessungen (siehe Kapite 3.1). Da in dem ersten Probenset der Einfluss des Wachstums auf die Herzgröße ausgeschlossen werden konnte, wurde auf die Normalisierung der LVM auf die Tibialänge verzichtet. Die einzelnen kardialen Parameter sind zur Übersicht in Tabelle 3.2 dargestellt. Ergebnisse - 37 - Tab. 3.2 Kardiale Funktionsparameter der für die histologischen Untersuchungen genutzten Herzen Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der LVEF, der LVM, des LVEDV und LVESV der baseline-, Sham- und TAC-Tiere zu den unterschiedlichen postoperativen Zeitpunkten. LVEF (%) LVM (mg) LVEDV(µl) LVESV(µl) 58 ± 3 60 ± 0,6 59,3 ± 1,2 25 ± 1,7 Base Sham TAC Sham TAC Sham TAC Sham TAC 4d 57 ± 3,5 33,3 ± 1,52 70 ±3,5 84,6 ±9,7 57,6 ±7,2 79,3 ± 4,1 24,3 ± 2,9 53 ± 3,5 14d 57 ± 5,3 26,3 ± 8,5 66,6 ± 3 112,3 ± 16 62 ± 2 95,6 ± 12,7 27 ±3 71,6 ± 17,2 21d 60 ±1,7 22,6 ± 1,52 67,6 ± 2,5 123,3 ± 7,4 64 ± 5 112 ± 8,2 25,6 ± 2,3 86,6 ± 4,5 28d 60 ± 3 29,6 ± 9,6 65,6 ± 6,4 119 ± 25 73 ± 14,1 105 ± 24 29 ± 4,6 76 ± 26,8 42d 59 ±1,7 18,6 ± 9 72,6 ± 5,7 127 ± 25,4 63 ± 7,2 128 ±28,5 25,6 ± 4 104,6 ± 32,9 56d 58,6 ± 1,5 17 ± 2 73,6 ± 4 149,6 ± 10,6 59 ± 3 148 ± 17 24,6 ± 2 123 ± 10,6 Nach Auswertung und Berechnung des prozentualen Anteils fibrosierter Fläche jedes einzelnen Herzens zeigte sich, dass der Anteil fibrosierten Gewebes in den TAC-Mäusen zu allen Zeitpunkten höher war als in den Sham-Herzen. Dennoch konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden, was wahrscheinlich der geringen Gruppengröße (n=3) geschuldet ist. Im Trend ist jedoch erkennbar, dass es über die Zeit zu einer Zunahme der Kollagenfasern in den TAC-Tieren kam, wohingegen die ShamTiere relativ wenig fibrotisches Gewebe ausbildeten. Die Abb 3.4 zeigt repräsentative Hellfeldaufnahmen der unterschiedlichen Herzen und Abb 3.5 führt die quantifizierten Flächen des fibrotischen Gewebes auf. Ergebnisse - 38 - Abb. 3.4 Repräsentative Hellfeldaufnahmen von Sham- und TAC-Herzen an den postoperativen Tagen 4 und 56 Die Siriusrot Färbung zeigte eine deutliche Zunahme fibrotischer Fasern (rot) im Gewebe des TAC-Herzens an Tag 56. In den Sham-Herzen als auch im TAC-Herz an Tag 4 zeigten sich die Kollagenfasern lediglich an Gefäßrändern. Abb.3.5 Quantifizierung fibrotischer Areale Dargestellt ist die fibrotische Fläche in Prozent der Gesamtherzfläche (±SD) für baseline (grün)-, Sham (blau)und TAC (schwarz)-Tiere (jeweils n=3) zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten. Die TAC-Herzen zeigten im Allgemeinen einen höheren Anteil fibrotischer Areale als die Sham-Tiere. Im Trend scheint die Fibrose über die Zeit in den TAC-Tieren zuzunehmen. Die Quantifizierung der kardialen Fibrose zeigte eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach Aortenkonstriktion. Des Weiteren konnte bei dieser Analyse die Reproduzierbarkeit der Methode der operativen Aortenkonstriktion bzw. die Konformität der Progression der Erkrankung in den Mäusen bestätigt werden. Ergebnisse - 39 - 3.3 Genexpressionsanalyse der linken und rechten Ventrikel nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung Die linken (LV) und rechten Ventrikel (RV) wurden wie unter 2.2.4.2 beschrieben gepoolt und mittels GeneChip® Mouse ST Array analysiert. Die Intensitäten der einzelnen Genprodukte wurden den einzelnen Gruppen zugeordnet und je Zeitpunkt die Intensität in der TAC-Gruppe auf die der jeweiligen Sham-Gruppe bezogen (TAC vs. Sham). Die ermittelten Ratios wurden in fold changes (Änderungsfaktor; x-fache Änderung) umgerechnet und nach dem Rosetta Resolver Algorithmus in Form eines p-Wertes statistisch beurteilt. Zunächst wurden nur die Gene betrachtet, die in den TAC-Mäusen im Vergleich zu Sham-Tieren mindestens 2-fach höher oder niedriger exprimiert wurden. Da die Software (Rosetta Resolver) bei der Berechnung des fold changes (fc) diesen statistisch bewertet und einen pWert zuordnet, wurden die Gene zusätzlich nach diesem p-Wert gefiltert. So gingen nur die Gene in die weitere Analyse ein, die mindestens zu einem Zeitpunkt (Tag 4, 14, 21, 28, 42 oder 56) mindestens 2-fach differenziell (fc≥±2, TAC vs. Sham) exprimiert wurden und einen p-Wert ≤0,05 aufwiesen. Durch diese Vorauswahl ergaben sich über den gesamten Untersuchungszeitraum 125 differenziell regulierte Gene im linken und 93 im rechten Ventrikel. Von diesen wiederum wiesen 54 Gene in beiden Ventrikeln zu mindestens einem Zeitpunkt eine veränderte Expression auf (Abb. 3.6, oben). Beim Vergleich der Genexpression der linken und rechten Ventrikel der unoperierten baseline-Tiere hingegen konnten keine bzw. nur sehr gering ausgeprägte Unterschiede zwischen beiden Ventrikeln nachgewiesen werden, womit die Genexpressionsunterschiede alleinig auf die Aortenkonstriktion zurückzuführen sind (Anhang Tab. 7.1). Zu den einzelnen Zeitpunkten wurden durch die Aortenstenose jeweils mehr Gene verstärkt transkribiert als reprimiert (Abb. 3.6, unten). Auffallend war, dass im LV eine hohe Anzahl an Genen an Tag 4 (49↑, 8↓) und 56 (78↑, 9↓) reguliert waren, wohingegen zu den Zeitpunkten 14 (22 ↑3↓), 21 (16↑1↓), 28 (14↑,7↓) und 42 (19↑,7↓) Tage postOP offenbar weniger genregulatorische Prozesse abliefen. Dies war auch im rechten Ventrikel der Fall, obwohl hier weitaus weniger Gene reguliert waren als im linken. Eine Auflistung aller signifikant regulierten Gene des linken und rechten Ventrikels ist im Anhang (Tab. 7.2, Tab 7.3) zu finden. Ergebnisse - 40 - Abb. 3.6 Anzahl der nach Aortenstenose im Vergleich zu Sham-operierten Tieren differentiell exprimierten Gene im linken und rechten Ventrikel Gezeigt ist die Anzahl der Gene im linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel, die zu mindestens einem Zeitpunkt mindestens 2–fach differenziell mit p≤0,05 (TAC vs. Sham) exprimiert wurden. Insgesamt wurden im LV 125 und RV 93 Gene differenziell exprimiert. Für 54 dieser Gene wurden Änderungen in beiden Ventrikeln gemessen (oben). An den Tagen 4 und 56 zeigte sich im Vergleich zum Zeitraum zwischen Tag 14 und 42 eine höhere Anzahl an regulierten Genen. Dabei waren mehr Gene verstärkt exprimiert als reprimiert. Um neben den Unterschieden zwischen TAC- und Sham-Tieren je Zeitpunkt auch den zeitlichen Verlauf innerhalb der Gruppe betrachten zu können, wurde für einzelne Gene auch eine Auswertung der Signalintensitäten über den Krankheitsverlauf vorgenommen (baseline, Sham, TAC, jeweils LV und RV, siehe Abb. 3.7 A und B). In diese Überprüfung wurden die Gene Nppb (natriuretisches Peptid B, BNP), Nppa (atriales natriuretisches Peptid, ANP), Acta1 (α-Aktin) und Postn (Periostin) einbezogen. Diese Gene wurden ausgewählt, da sie einerseits als klassische HI-assoziierte Gene gelten und andererseits auch wie erwartet einen fold change TAC/Sham von über 2 zeigten. Bei der Betrachtung der einzelnen Signalintensitäten der Poolproben von baseline-, Sham-und TAC-Herzen zeigten die Sham-Tiere eine konstant niedrige Expression der betrachteten HIassoziierten Gene (Abb. 3.7 A,B). Die Intensitäten verblieben auf dem Ausgangsniveau der baseline-Herzen. Zudem konnten weder in den baseline- noch in den Sham-Tieren Unterschiede zwischen den Intensitäten im linken und rechten Ventrikel festgestellt werden. Die linken Ventrikel der TAC-Tiere hingegen wiesen bereits an Tag 4 eine massive Änderung im Vergleich zum baseline bzw. Sham-Wert auf. Darüber hinaus zeigten sich auch deutliche Unterschiede zwischen den Genexpressionshöhen in den linken und rechten Ventrikeln. Nppb wurde in den TAC-Tieren bereits an Tag 4 nach OP stark im LV exprimiert und verblieb an allen untersuchten postoperativen Zeitpunkten auf einem konstant hohen Level. Die Expression von Nppa war initial (Tag 4) ebenfalls hoch, stieg aber noch bis Tag 21 an und verminderte sich anschließend an Tag 28 und 42 wieder auf das Niveau des 4. Tages. An Ergebnisse - 41 - Tag 56 konnte wiederum ein massiver Anstieg der Genaktivität von Nppa verzeichnet werden. Das Expressionsprofil von Nppb und Nppa der LV konnte in den rechten Ventrikeln der TAC-Herzen nicht beobachtet werden. Hier zeigte sich bis einschließlich Tag 42 eine unverändert niedrige Expression, die erst final an Tag 56 stark anstieg. Abb 3.7A Signalintensitäten der Herzinsuffizienz-assoziierten Gene Nppb und Nppa Dargestellt sind die Signalintensitäten der Gene Nppb und Nppa in linken (LV) und rechten (RV) Ventrikeln von baseline (base-), Sham- und TAC-Tieren zu den jeweilig untersuchten Zeitpunkten. Im linken Ventrikel war bereits 4 Tage nach TAC eine stärkere Änderung in der Expression zu beobachten als in den korrespondierenden rechten Ventrikel. Erst am postoperativen Tag 56 konnte auch im RV der TAC-Tiere eine erhöhte Signalintensität dieser Gene gemessen werden. Die gemessenen Signalintensitäten in den Sham-Tieren blieben über die Zeit in LV und RV konstant auf einem den baseline-Tiere vergleichbaren Niveau. Das Intensitätsprofil für das α-Aktin-kodierende Gen Acta1 zeigte in den linken Ventrikeln der TAC-Gruppe einen ähnlichen Verlauf wie Nppa. So konnte initial ebenfalls ein Anstieg bis Tag 21 mit einem anschließenden Abfall der Genexpression an Tag 28 und 42 und einer starke Erhöhung der Transkription an Tag 56 beobachtet werden. Periostin (Postn), dessen Expression mit der Regulation und Ausbildung der kardialen Fibrose assoziiert ist, wurde an Tag 4 in den linken Ventrikeln der TAC-Gruppe stark exprimiert. Anschließend nahm die Expressionshöhe in der Zeit von Tag 14 bis Tag 42 stetig ab, konnte jedoch final an Tag 56 wieder in verstärktem Maße detektiert werden. Werden die Signalintensitäten der Gene Acta1 und Postn in den rechten Ventrikeln der TAC-Gruppe Ergebnisse - 42 - betrachtet, fällt auch hier im Vergleich zum LV wieder ein geringeres Expressionsniveau auf. Im Gegensatz zu Nppa und Nppb beschreiben die Intensitätsprofile von Acta1 und Postn im RV aber einen dem LV ähnlichen Verlauf. Abb 3.7B Signalintensitäten der Herzinsuffizienz-assoziierten Gene Acta1 und Postn Bereits kurz nach TAC-OP konnte eine vermehrte Expression dieser Gene im linken Ventrikel nachgewiesen werden. Die Signalintensitäten im rechten Ventrikel waren zwar geringer als in den korrespondierenden linken Ventrikel, zeigten jedoch im Trend einen ähnlichen Verlauf. Die Expression im LV und RV der Sham-Tiere verblieb auch hier auf basalem Niveau. Zusammenfassend hat diese Betrachtung gezeigt, dass alle untersuchten HI-assoziierten Gene bereits 4 Tage nach der Induktion der Drucküberlastung insbesondere im linken Ventrikel verstärkt exprimiert werden, wohingegen die Expression in den Sham-Tieren auf einem den baseline-Tieren vergleichbaren niedrigem Niveau verblieb. Dementsprechend scheint nur der Stimulus der TAC- und nicht schon die OP-Prozedur das Expressionsmuster zu beeinflussen. Die Prüfung weiterer Gene zeigte, dass sich die Intensitätsprofile der linken und rechten Ventrikel im Trend ähnlich verhielten, wobei im Allgemeinen weniger Transkripte im RV gemessen wurden. Somit scheint die Drucküberlastung die Genaktivität im linken Ventrikel stärker (Acta1, Postn) bzw. zu einem früheren Zeitpunkt (Nppb, Nppa) zu beeinflussen. Folglich sollten krankheitsbedingte Veränderungen des Expressionsmusters primär im linken Ventrikel sichtbar und dort stärker ausgeprägt sein. Auf Grund dessen wurde in den folgenden Ergebnisse - 43 - Analysen der Schwerpunkt auf die zeitlichen Veränderungen der Genexpression im linken Ventrikel gelegt. 3.3.1 Einfluß der Aortenstenose auf das linksventrikuläre Genexpressionsprofil In den linken Ventrikeln wurden über die Zeit nach TAC insgesamt 125 Gene differenziell exprimiert (fc≥±2, p≤0,05, TAC vs. Sham, siehe Abb 3.6). Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde mittels Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) eine funktionelle Klassifizierung der Gene durchgeführt. Diese Software erlaubt es, auf Basis publizierter Daten Gene verschiedenen Signalwegen und funktionellen Kategorien zuzuordnen. Dabei wird als Maß für eine signifikante Häufung von Genen einer Kategorie im Vergleich zum Anteil der entsprechenden Kategorie am Referenzset ein p-Wert generiert (Fisher’s Exact Test). Insgesamt wurden die durch die TAC-Operation beeinflußten Gene 38 Signalwegen (p≤0,05) zugeordnet. In Abb 3.8 sind der Übersichtlichkeit wegen nur die Signalwege dargestellt, die an mehreren Zeitpunkten signifikant vertreten waren. Dabei wurde ein Großteil der an Tag 4 und Tag 56 regulierten Gene der „hepatischen Fibrose“ zugeordnet, die auf Grund der hohen Anzahl gleicher beteiligter Gene, wie Col1a2, Col3 (Kollagen 1a2, 3), Fn1 (Fibronektin1) und Ctgf (Connective Tissue Growth Factor) ebenfalls für fibrotische Veränderungen in kardialem Gewebe zutreffen kann. Des Weiteren konnten die vor allem zu frühen Zeitpunkte regulierten Gene dem „ILK (Integrin Linked Kinase)-“ und dem „Aktinzytoskelett-Signalweg“ zugeordnet werden. Die Kategorie „Zelluläre Effekte von Sildenafil“ war über alle Zeitpunkte signifikant vertreten. Diese Kategorie beschreibt die Auswirkungen des Phosphodiesterase 5 (PDE 5) Antagonisten Sildenafil, der durch Hemmung des Abbaus von cGMP (zyklisches Guanosinmonophosphat) u.a eine vasodilative Wirkung hat. Als ebenfalls zu allen Zeitpunkten betroffener Signalweg zeigte sich die „BMP (Bone morphogenetic protein) -Rezeptor vermittelte Kardiomyozytendifferenzierung“. Die BMPs und deren Rezeptoren spielen vor allem in der Embryonalentwicklung eine entscheidende Rolle. Auffällig war die relativ geringe Repräsentation des „KalziumSignalweges“. Lediglich an Tag 4 wurde eine Expressionsänderung bei einer höheren Anzahl von Genen dieses Signalwegs bestimmt. Ergebnisse - 44 - Abb. 3.8 Zuordnung differentiell exprimierter Gene zu Signalwegen anhand der Software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Die Überrepräsentation von Kategorien durch Gene mit veränderter Expression nach TAC-OP im Vergleich zum Referenzset wird im Fisher’s Exact Test kalkuliert und als -log(p-Wert) angegeben. Über alle Zeitpunkte wurde für 38 Signalwege eine signifikante Anreicherung (p≤0,05) gefunden. Für die am stärksten repräsentierten Kategorien (zu mehr als einem Zeitpunkt überrepräsentiert) sind hier die Daten zu allen Zeitpunkten vergleichend dargestellt. Aus den Ergebnissen der IPA Analysen konnte kein alleiniger Hauptsignalweg identifiziert werden, der zur Ausbildung der HI führt, vielmehr zeigte sich eine Beteiligung mehrerer Signalwege zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dies kann der Tatsache geschuldet sein, dass die stark regulierten und über die Zeit dauerhaft in ihrere Expression veränderten Gene (Nppa, Nppb, Postn, Acta1) einer Vielzahl an Signalwegen zugeordnet werden können, was eine Einordnung erschwert. Daher sollte durch eine andere Betrachtungsweise, die die Anzahl der regulierten Gene und somit den Einfluß auf die Transkriptionsprozesse berücksichtigt, versucht werden, die Progression der druckinduzierten Herzinsuffizienz zu charakterisieren. Ausgehend von der Gesamtheit der in den linken Ventrikeln nach TAC über die Zeit differenziell exprimierten 125 Gene (fc≥±2, p≤0,05, TAC vs. Sham, siehe Abb 3.6) wurden vor allem die Tage 4 und 56 als die mit den stärksten Änderungen identifiziert, wohingegen die Tage 14 bis 42 geringere Unterschiede der Expressionsmuster im Vergleich zu den ShamTieren zeigten. Auf Grund dessen wurden die betroffenen Gene der Tage 4 und 56 gesondert und die der Tage 14 bis 42 als Gesamtheit zusammengefasst und neu analysiert. Ergebnisse - 45 - So wiesen von 87 an Tag 56 signifikant differenziell regulierten Genen 46 allein nur an diesem Tag eine veränderte Expression auf. 9 Gene wurden nur an Tag 4 und 56 signifikant reguliert. 13 Gene waren an einem oder mehreren Zeitpunkten des Zeitraums zwischen 14 und 42 Tagen und an Tag 56 verändert exprimiert. 23 der an Tag 4 regulierten Gene wurden an keinem anderen Tag signifikant reguliert. Lediglich zwei Gene waren an Tag 4 und dem Zeitraum von 14 bis 42 Tagen, jedoch nicht an Tag 56 reguliert. 13 Gene zeigten nur an mindestens einem Zeitpunkt der Tage 14 bis 42 eine Regulation (Abb. 3.9) Abb. 3.9 Vergleich differenziell exprimierter Gene im linken Ventrikel an Tag 4, Tag 56 und dem Zeitraum von Tag 14 bis 42 19 Gene waren an Tag 4, 56 und an mindestens einem Zeitpunkt zwischen Tag 14 bis 42 differenziell exprimiert (TAC vs. Sham, fc≥±2, p≤ 0,05). 23 Gene zeigten nur an Tag 4 und 46 Gene nur an Tag 56 eine signifikante Regulation. 13 Gene waren nur in der Zeit zwischen Tag 14 und 42, jedoch nicht an Tag 4 und 56 signifikant exprimiert. Von den 19 Genen, die an Tag 4, Tag 56 und an mindestens einem Zeitpunkt zwischen Tag 14 und 42 reguliert waren, zeigten lediglich 9 eine signifikant differenzielle Expression an allen untersuchten Zeitpunkten. Für alle betreffenden Gene wurde nach TAC-OP eine verstärkte Expression gemessen (Tab. 3.3), konstant reprimierte Gene wurden nicht beobachtet. Neben den bereits bekannten Herzinsuffizienz-assoziierten Genen Nppb (BNP), Nppa (ANP), Acta1 (α-Aktin) und Postn (Periostin) zeigten sich auch Fibrose-, extrazelluläre Matrix- und Zytosklett-assoziierte Gene als dauerhaft stark exprimiert (Tab. 3.3). Ergebnisse - 46 - Tab. 3.3 Gene mit signifikant differenzieller Expression an allen untersuchten Zeitpunkten nach TAC-OP Dargestellt sind die fold changes (TAC vs. Sham) der Gene und die Funktion der Genprodukte, die an allen untersuchten Zeitpunkten in TAC-Mäusen mindestens 2-fach differenziell gegenüber den Sham-Tieren reguliert waren. Genname 4d 14d 21d 28d 42d 56d Funktion des Genproduktes Postn (Periostin) 6,4 4,71 4,73 4,71 4,28 11,29 Thbs4 (Thrombospondin 4) 2,94 3,28 2,66 2,14 2,1 8,23 Col8A1 (Collagen VIII) 4,28 3,76 3,42 3,09 3,30 5,29 Acta1 (α-Actin) 3,60 3,94 5,04 4,3 3,85 4,55 Nppa (ANP) Mfap5 (microfibrillar associated protein 5) 2,48 3,57 4,33 3,09 2,64 4,51 2,66 3,29 3,04 2,00 3,10 4,28 Thbs1 (Thrombospondin 1) 3,71 2,19 2,32 2,46 4,57 3,5 2,02 2,40 2,28 2,32 2,24 3,02 2,91 2,1 2,02 2,31 2,23 2,38 Fibroseregulator Zell-Zell-, Zell-MatrixInteraktion Kollagen, Fibrose Strukturelle Zellorganisation, Zytoskelett Natriuretisches Peptid Strukturelle Zellorganisation, Zytoskelett Zell-Zell-, Zell-MatrixInteraktion Strukturelle Zellorganisation, Zytoskelett Natriuretisches Peptid Xirp2 (Xin actin-binding repeat containing 2) Nppb (BNP) Eine Einordnung der Produkte aller signifikant regulierten Gene (TAC vs. Sham, fc≥±2, p≤0,05) von Tag 4, Tag 56 und Tag 14 bis 42 entsprechend ihrer Lokalisation zeigte, dass vor allem Gene, die für die extrazelluläre Matrix kodieren, reguliert waren (Abb. 3.10). Als zweitstärkste Fraktion traten Gene auf, deren Genprodukte im Zytoplasma lokalisiert sind. Weitaus weniger betroffen durch die TAC-OP waren Gene mit im Zellkern oder in der Plasmamembran lokalisierten Genprodukten. Es finden sich bei dieser Zuordnung keine prägnanten Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten. Somit scheint die extrazelluläre Matrix den meisten Regulationsprozessen während der Ausbildung einer Herzinsuffizienz unterworfen zu sein. Ergebnisse - 47 - Abb. 3.10 Zuordnung der differenziell exprimierten Gene entsprechend der Lokalisation des Genproduktes Es zeigten sich an allen Zeitpunkten überwiegend Gene, die für Proteine der extrazellulären Matrix kodieren als differenziell reguliert (TAC vs. Sham, fc≥±2, p≤ 0,05). Des Weiteren konnte eine hohe Anzahl an Genen dem Zytoplasma zugeordnet werden. Die funktionelle Klassifizierung der differenziell exprimierten Gene an Tag 4 (n=53), Tag 14 bis 42 (n=47) und Tag 56 (n=87) erfolgte mittels Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Zunächst wurden die Gene hinsichtlich der molekularen und zellulären Funktion in Kategorien, deren Überrepräsentation im Vergleich zum Referenzset mit dem Fisher’s Exact Test kalkuliert und als -log(p-Wert) angegeben wurde, zusammengefasst. Die Top 10 der zugeordneten Kategorien pro Zeitpunkt bzw. Zeitraum sind in Abb. 3.11 dargestellt. Auch hier zeigte die IPA-Analyse, dass nicht eine dominierende Funktion pro Zeitpunkt bzw. Zeitraum, sondern eine Vielzahl an Kategorien an den einzelnen Untersuchungstagen/zeitraum überrepräsentiert war. An Tag 4 konnte die höchste Anzahl an Genen den Kategorien „Zellulärer Aufbau und Organisation“ (Cellular Assembly and Organisation) und „Aufrechterhaltung der zellulären Funktion“ (Cellular Function and Maintenance) zugeordnet werden. Dabei zeigte eine zusätzliche funktionelle Unterteilung dieser Kategorien, dass hier vor allem die Organisation von Kollagenfibrillen, Filamenten und Ergebnisse - 48 - Organellen am stärksten vertreten war. Als zweitstärkste Kategorie war die „Zellbewegung“ (Cell Movement) überrepräsentiert, die u.a. die Migration von Muskel- und Endothelzellen mit einschließt. Diese Kategorie erreichte auch im Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen die höchste Bewertung, gefolgt von „Zelltod und Überleben“ (Cell Death and Survival), wobei hier vor allem die Apoptose von Endothelzellen und Kardiomyozyten am stärksten vertreten war. Des Weiteren wurden die differenziell exprimierten Gene an den Tagen 14, 21, 28, und 42 der Funktion des „Molekularen Transports“ (Molecular Transport), insbesondere den Untergruppen „Konzentration und Akkumulation von cyclischem GMP“ und „Fettstoffwechsel“ zugeordnet. Auch an Tag 56 führte die „Zellbewegung“ wieder die Rangliste an. Wie auch an Tag 4 konnte eine Vielzahl an regulierten Genen dem „Zellulären Aufbau und Organisation“ zugeordnet werden. Als stärkste Unterkategorie zeigte sich hier ebenfalls die Organisation von Kollagenfibrillen und Filamenten. Nachfolgend wurde das „Zelluläre Wachstum und Proliferation“ (Cellular Growth and Proliferation) präsentiert, welches insbesondere die Proliferation von Bindegewebs- und Muskelzellen am stärksten bewertete. Ergebnisse - 49 - Abb. 3.11 Klassifizierung der differentiell exprimierten Gene nach molekularen und zellulären Funktionen mit Hilfe der Software Ingenuity Pathway Analysis IPA basierte Zuordnung der an Tag 4, an den Tagen 14 bis 42 und Tag 56 regulierten (TAC vs. Sham, fc≥±2, p≤ 0,05) Gene in Kategorien der molekularen und zellulären Funktion, deren Überrepräsentation in Form eines – log(p-Wert) angegeben wurde. Wurden die differenziell exprimierten Gene pro Zeitpunkt hinsichtlich ihrer physiologischen Funktion klassifiziert, zeigten sich ebenfalls mehrere überrepräsentierte Kategorien (Abb 3.12). Dabei wurde die höchste Anzahl der an Tag 4 regulierten Gene der Kategorie „Entwicklung und Funktion des kardiovaskulären Systems“ zugeordnet, gefolgt von „Entwicklung des Organismus“ (Organismal Development) und „Organismische Funktion“ (Organismal Function), wobei hier die Unterkategorie der Wundheilung am stärksten repräsentiert war. Die im Zeitraum 14 bis 42 Tage differenziell exprimierten Gene wurden der Kategorie „Bindegewebe und Funktion“ (Connective Tissue and Function) zugeordnet, wozu u.a. die Adhäsion von Fibroblasten gezählt wird. Außerdem wurde eine Anreicherung von Genen der Ergebnisse - 50 - Kategorie „Entwicklung des Skelett-und Muskelsystems“ (Skeletal and Muscular System Development and Function) und „Gewebemorphologie“ (Tissue Morphology) verzeichnet. Am Tag 56 wies die Kategorie„Gewebemorphologie“ die höchste Signifikanz auf, wobei vor allem Gene zur Strukturierung von Bindegewebe betroffen waren. Des Weiteren lassen sich viele der an diesem Zeitpunkt regulierten Gene der „embryonalen Entwicklung“ (Embryonic Development) zuordnen. Abb. 3.12 Klassifizierung der differentiell exprimierten Gene nach physiologischen Funktionen mit Hilfe der Software Ingenuity Pathway Analysis IPA basierte Zuordnung der an Tag 4, an den Tagen 14 bis 42 und Tag 56 veränderten (TAC vs. Sham, fc≥±2, p≤ 0,05) Gene in Kategorien physiologischer Funktionen, deren Überrepräsentation in Form eines –log(p-Wert) angegeben wurde. Eine hohe Anzahl der an Tag 56 mindestens 2-fach differenziell regulierten Gene wurde in der IPA-Analyse der Kategorie der „Embryonalen Entwicklung“ zugordnet. Somit scheinen verschiedene Gene exprimiert zu sein, die dem fötalen Genexpressionsprogramm angehören. Ergebnisse - 51 - Eine pathologische Hypertrophie wird mit der Reexpression von fötalen Genen, wie die bereits betrachteten Gene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Acta1 (α-Aktin) assoziiert. Aber auch ein Switch von α-MHC zu β-MHC (Myosin Heavy Chain) ist ein Indikator für die Reinduktion der fötalen Genexpression. Als dominante Isoform in gesunden adulten Herzen findet sich α-MHC (Myh6). Bei einer Hypertrophie kommt es zur Herunterregulation des Gens und zur verstärkten Transkription der β-MHC kodierenden Gens Myh7, dessen Genprodukt die prädominate Isoform im pränatalen Herzen darstellt. Diese genregulatorischen Prozesse wurden auch in dem hier untersuchten Probenset gefunden. Dabei zeigte sich bereits kurz nach Induktion der Drucküberlastung eine erhöhte Expression von Myh7 in den linken Ventrikeln der TAC-Tiere im Vergleich zu den Sham-Tieren, die an Tag 56 nochmals massiv anstieg. Die Expression von Myh6 hingegen, zeigte sich lediglich sehr schwach repremiert und wies somit über die Zeit keine signifikanten Unterschiede zu den Sham-Tieren auf (Abb. 3.13). Abb. 3.13 Expression der α- und β-MHC (Myosin Heavy Chain) kodierenden Gene in LV von TAC-Tieren im Vergleich zu Sham-Tieren Die Reinduktion des fötalen Genexpressionsprogramms wird durch die verstärkte Expression von Myh7, welches für die prädominate MHC- Isoform im pränatalen Herzen kodiert, bestätigt. Die Genregulation von Myh6, dessen Genprodukt die adulte MHC-Isoform darstellt, zeigte hingegen kaum Veränderungen über die Zeit. Eine ebenfalls entscheidende Rolle für die Progression einer Hypertrophie spielt die Fibrosierung des Herzgewebes. Die fortschreitende Fibrose vermindert die Kontraktilität des Gewebes und stört somit die Pumpfunktion. Die im Herzen überwiegend vorkommenden Kollagene I und III werden durch Fibroblasten synthetisiert und durch lokal produzierte Kollagenasen, die Matrixmetalloproteinasen (MMP) degradiert. Die MMPs wiederum werden spezifisch von den TIMPs (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases) inhibiert. Im normalen gesunden Gewebe besteht ein Gleichgewicht zwischen Kollagensynthese und degradation und somit auch von MMPs und TIMPs. Dieses Gleichgewicht ist im Ergebnisse - 52 - hypertrophen Herzen oftmals gestört. Ein weiterer profibrotischer Faktor ist CTGF (Connetctive Tissue Growth Factor). Dieser induziert über verschiedene Signalmoleküle eine Zellproliferation und die vermehrte Produktion von extrazellulärer Matrix. Bei Betrachtung der Transkription der Gene, die diese Fibrosefaktoren kodieren, war zunächst die starke Hochregulation der herzspezifischen Kollagene I und III (Col1a1, Col3a1) an Tag 4 in den TAC-Tieren im Vergleich zu den Sham-Tieren auffällig. Diese war an den Tagen 21, 28 und 42 weniger stark ausgeprägt und stieg final an Tag 56 an. Die Kollagendegradierenden MMPs wiesen initial lediglich geringe Genexpressionsunterschiede zwischen Sham- und TAC-Tieren auf. Mmp 9 zeigte an Tag 4 und 14 eine etwas verminderte Expression und blieb anschließend unverändert. Auch Mmp12 wies in den TAC-Tieren bis Tag 42 keine ausgeprägten Unterschiede im Vergleich zu den Sham-Tieren auf, wurde aber final an Tag 56 deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu Mmp9 und Mmp12 zeigte Mmp2 ab Tag 14 eine geringe aber dennoch konstant erhöhte Genexpression über die Zeit auf. Die Gene Timp1 (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases1) und Ctgf (Connective Tissue Growth Factor) wiesen über den gesamten Zeitraum eine erhöhte Expression in den TAC-Tieren auf. Timp1 zeigte bereits an Tag 4 nach Induktion der Aortenstenose und final an Tag 56 einen massiven Anstieg des mRNA-Level. Dieser war an den Tagen 14 bis 42 weniger stark ausgeprägt. Ctgf hingegen zeigte konstante Genexpressionsunterschiede zwischen den Sham- und TAC-Gruppen, die mit zunehmender Dauer der Stenose an Tag 42 und 56 zunahmen. Die Veränderungen der Fibrose-assoziierten Gene nach TAC-OP sind in Abb. 3.14 dargestellt. Ergebnisse - 53 - Abb. 3.14 Genregulation ausgewählter Fibrose-assozierter Gene Dargestellt sind die Ratios (TAC vs. Sham) Fibrose-assoziierter Gene. Col1a1 (Kollagen I) und Col3a1 (Kollagen III) zeigen in den TAC-Tieren an Tag 4 und 56 eine verstärkte Expression im Vergleich zu den ShamTieren, wohingegen die Unterschiede an den Zeitpunkten 14, 21, 28 und 42 geringer ausfallen (A). Die Unterschiede in der Expression der Matrixmetalloproteinasen (MMP) zwischen TAC- und Sham-Gruppen sind nur schwach ausgeprägt. Lediglich Mmp12 zeigt eine deutliche 2-fach differenzielle Regulation an Tag 56 (B). Der Tissue Inhibitor of MMP (Timp1) zeigt an den postoperativen Tagen 4 und 56 eine massive Regulation, die sich an den dazwischen liegenden Zeitpunkten vermindert (C). Die Expression des Connective Tissue Growth Factor (Ctgf) weist moderate Unterschiede zwischen Sham- und TAC-Gruppen auf, die sich jedoch mit zunehmender Dauer der Stenose (Tag 42, Tag 56) steigern (D). 3.3.2 Validierung der Microarray-basierten Expressionsdaten Zur Validierung der Microarray-Daten wurde eine relative Quantifizierung mittels TLDA (TaqMan Low Density Array) durchgeführt. Diese Technik erlaubt es, mehrere Gene gleichzeitig zu untersuchen. So konnte zur Validierung die Expression mehrerer bekannter Herzinsuffizienz-assoziierter Gene (Nppa, Nppb, Periostin, Acta1 etc.) überprüft, im Zuge dessen aber auch weniger bekannte und potentielle neue Kandidatengene untersucht werden. Da es sich bei den Microarray-Daten um Analysen mit gruppenspezifisch gepoolter RNA handelte, wurde die quantitative TLDA-Analyse auf Einzeltierebene durchgeführt. Dies erlaubt zusätzlich eine Aussage über die Homogenität der Gruppe, aber auch Korrelationsanalysen mit den erhobenen Herzfunktionsparametern. Da sich bereits in den Microarray-Analysen herausstellte, dass der rechte Ventrikel hinsichtlich der Genexpression Ergebnisse - 54 - weniger bzw. schwächer auf den Stimulus der Aortenkonstriktion reagierte, flossen in die TLDA-Analyse nur RNAs der linken Ventrikel der Versuchstiere ein. 3.3.2.1 Auswahl der Kandidatengene für die relative Quantifizierung Die Auswahl der Kandidatengene erfolgte unter der Einbeziehung der Erkenntnisse aus den physiologischen Daten. Die Analyse der Herzfunktionsparameter zeigte eine stufenartige Progression der Herzinsuffizienz in den TAC-Tieren. Die Verschlechterung der Herzfunktion schien in 3 Phasen abzulaufen. So zeigte sich initial an den Tagen 4 und 14 (1. Phase) ein Abfall der LVEF. Diese niedrige aber aufrechterhaltene Pumpfunktion blieb bis zum Tag 42 stabil (2. Phase). An Tag 56 wiederum konnte ein massiver Abfall der LVEF verzeichnet werden. Hierin zeigt sich das Endstadium der Herzinsuffizienz mit einer stark eingeschränkten Pumpfunktion und Dilatation des Ventrikels (3. Phase). Als interessant erwiesen sich die Gene, die ähnlich den physiologischen Phasen reguliert wurden. Dementsprechend sollten markante Expressionsunterschiede zwischen der 1. (Tag 4 und 14) und der 2. Phase (Tag 21-42) als auch zwischen der 2. und der 3. Phase (Tag 56) bestehen. Um ein möglichst großes Spektrum an unterschiedlichen Genen abzudecken zu können, wurden die Microarray-Daten weniger stringent als bei den vorangegangenen Analysen gefiltert. Somit wurden auch Gene in die Analyse miteinbezogen, die nicht zwingend 2-fach differenziell exprimiert wurden bzw. einen p-Wert≤0,05 aufwiesen. Unter Einbeziehung dieser Kriterien ergab sich für die TLDA-Analyse ein Set aus 36 Kandidatengenen. Zusätzlich wurden 8 bereits aus der Literatur bekannte HI-assoziierte Gene (Nppa, Nppb, Acta1, Postn, CTGF, Col1a1, Myh7, Myh6) und 4 Referenzgene (Rs18, Polr 2a, Rpl4, Rpl32) untersucht. Die in die TLDA-Analyse aufgenommenen Gene mit ihren Array-basierten fold changes (TAC vs. Sham) sind in Tab. 3.4 zusammengefasst. Ergebnisse - 55 - Tab. 3.4 Auswahl der Kandidatengene für die TLDA-Analyse Zur Validierung einzelner Kandidatengene wurden TLDA (Taq Man Low Density)-Messungen auf Einzeltierebene vorgenommen. Die Tabelle zeigt die in die Analyse eingeschlossenen Gene und deren Microarray-basierten fold changes (Tac vs. Sham) und den korrespondierenden p-Wert (Rosetta Resolver Error Model) zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten. Symbol Genname Abra 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert Actin-binding Rho activating protein 1,46 0,286 1,40 0,333 1,59 0,179 1,91 0,077 2,29 0,028 2,39 0,018 Acta1 Actin, alpha 1 3,60 0,001 3,94 0,001 5,04 0,000 4,30 0,000 3,85 0,000 4,55 0,000 Aebp1 AE binding protein 1 1,32 0,565 1,56 0,391 1,27 0,632 1,32 0,596 1,27 0,658 2,02 0,167 Ankrd23 Ankyrin repeat domain 23 1,77 0,071 1,50 0,192 1,51 0,176 1,85 0,056 1,58 0,141 2,48 0,008 Apod Apolipoprotein D -1,03 0,935 1,77 0,164 2,06 0,075 1,68 0,249 1,50 0,369 2,74 0,016 Aspn Asporin 1,51 0,258 1,92 0,065 1,74 0,124 1,96 0,086 1,67 0,187 2,25 0,033 Ces1d Carboxylesterase 1d -1,90 0,107 -3,12 0,009 -2,44 0,030 -2,79 0,019 -3,53 0,007 -5,70 0,001 Cfh Complement component factor h -1,39 0,314 1,27 0,458 1,10 0,765 1,33 0,381 1,37 0,347 2,08 0,033 Col1a1 Collagen, type I, alpha 1 2,65 0,018 2,26 0,051 1,79 0,149 1,96 0,094 1,73 0,182 2,83 0,014 Comp Cartilage oligomeric matrix protein, thromospondin 5 1,04 0,952 1,79 0,415 1,37 0,621 1,58 0,483 1,75 0,413 4,87 0,009 Cpxm2 Carboxypeptidase X 2 (M14 family) 1,15 0,801 1,58 0,349 1,74 0,243 1,90 0,203 2,49 0,060 2,54 0,038 Ctgf Connective tissue growth factor 1,95 0,043 2,11 0,026 1,96 0,041 1,96 0,040 2,49 0,008 3,32 0,001 Emp1 epithelial membrane protein 1 2,82 0,007 2,69 0,008 2,23 0,027 1,87 0,077 2,56 0,013 3,31 0,002 Fxyd5 FXYD domain-containing ion transport regulator 5 1,57 0,164 1,69 0,106 1,54 0,174 1,50 0,206 1,66 0,116 2,65 0,007 Fxyd6 FXYD domain-containing ion transport regulator 6 1,19 0,645 1,29 0,492 1,33 0,428 1,33 0,445 1,55 0,247 2,28 0,030 Inmt Indolethylamine N-methyltransferase -3,40 0,014 -1,52 0,265 -1,36 0,431 -1,50 0,313 -2,38 0,054 -2,40 0,041 Itgbl1 Integrin, beta-like 1 1,59 0,374 2,07 0,147 2,28 0,107 2,89 0,046 3,22 0,038 4,00 0,007 Kif5b Kinesin family member 5B 1,20 0,585 1,01 0,970 1,30 0,441 1,17 0,660 1,40 0,347 2,06 0,042 Lcn2 Lipocalin 2 -1,11 0,778 1,03 0,932 1,48 0,270 1,33 0,481 -1,31 0,504 2,33 0,030 Lox Lysyl oxidase 3,82 0,020 2,10 0,211 2,53 0,117 1,40 0,620 1,33 0,680 7,63 0,001 Loxl1 Lysyl oxidase-like 1 2,28 0,050 2,06 0,085 1,75 0,170 1,57 0,288 1,71 0,211 2,56 0,026 Lum Lumican 1,44 0,314 1,97 0,061 1,81 0,105 2,36 0,032 1,78 0,144 1,65 0,170 Mfap4 Microfibrillar-associated protein 4 2,34 0,062 3,28 0,008 2,77 0,016 2,46 0,047 3,62 0,009 4,23 0,003 Mfap5 Microfibrillar associated protein 5 2,66 0,011 3,29 0,003 3,04 0,004 2,00 0,054 3,10 0,005 4,28 0,001 Ergebnisse - 56 - Symbol Genname Myh6 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert Myosin, heavy polypeptide 6, cardiac muscle, alpha -1,09 0,762 -1,32 0,338 -1,08 0,790 -1,03 0,907 -1,20 0,525 -1,03 0,908 Myh7 Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle, beta 2,51 0,017 2,86 0,011 3,00 0,009 3,79 0,002 1,97 0,068 7,43 0,000 Nd5/6 NADH Dehydrogenase 6 1,49 0,248 1,14 0,806 2,10 0,134 -1,40 0,381 -1,25 0,540 -2,26 0,022 Nmrk2 Nicotinamide Riboside Kinase 2 3,84 0,013 1,60 0,382 2,09 0,188 1,33 0,601 1,60 0,383 4,63 0,005 Nppa Natriuretic peptide precursor type A 2,48 0,007 3,57 0,001 4,33 0,000 3,09 0,002 2,64 0,005 4,51 0,000 Nppb Natriuretic peptide precursor type B 2,91 0,003 2,10 0,023 2,02 0,030 2,31 0,013 2,23 0,016 2,38 0,010 Nuak1 NUAK family, SNF1-like kinase, 1 1,44 0,323 1,67 0,154 1,70 0,145 2,08 0,053 1,87 0,099 2,53 0,015 Nupr1 Nuclear protein 1 1,12 0,838 1,54 0,402 1,40 0,509 1,44 0,446 2,07 0,147 2,25 0,133 Postn Periostin, osteoblast specific factor 6,40 0,000 4,71 0,000 4,73 0,000 4,71 0,000 4,28 0,001 11,29 0,000 Ppbp Pro-platelet basic protein -2,27 0,026 -2,50 0,031 -1,24 0,505 -2,95 0,011 -1,08 0,842 -2,96 0,008 Sfrp2 Secreted frizzled-related protein 2 1,22 0,688 2,01 0,178 2,24 0,103 1,36 0,547 1,43 0,437 2,49 0,048 Srpx2 Sushi-repeat-containing protein, X-linked 2 1,95 0,205 2,08 0,148 1,66 0,311 1,27 0,654 1,67 0,344 2,69 0,058 Stc1 Stanniocalcin 1 1,27 0,618 1,93 0,167 2,24 0,088 1,77 0,236 1,99 0,198 2,49 0,051 Svep1 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain containing 1 1,44 0,404 2,08 0,100 2,29 0,061 2,41 0,072 2,02 0,149 3,05 0,013 Thbs4 Thrombospondin 4 2,94 0,037 3,28 0,025 2,66 0,053 2,14 0,140 2,10 0,149 8,23 0,000 Timp1 Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 11,93 0,000 3,99 0,020 4,15 0,014 2,43 0,140 3,24 0,101 11,86 0,000 Tubb2a Tubulin, beta 2A 1,74 0,255 1,19 0,723 1,42 0,487 1,15 0,795 1,14 0,811 2,03 0,153 Wisp2 WNT1 inducible signaling pathway protein 2 1,61 0,294 1,96 0,136 2,22 0,085 2,24 0,072 1,79 0,195 3,42 0,007 Xirp1 Xin actin-binding repeat containing 1 1,44 0,277 1,03 0,932 1,49 0,247 1,49 0,241 1,29 0,453 1,90 0,065 Xirp2 Xin actin-binding repeat containing 2 2,02 0,033 2,40 0,010 2,28 0,014 2,32 0,016 2,24 0,020 3,02 0,002 Ergebnisse - 57 - 3.3.2.2 Validierung der Affymetrix GeneChip® mouse gene ST Array Ergebnisse mit RT-PCR (TLDA) Um die mittels Microarray erhobenen Daten zu validieren, wurden die ausgewählte Gene anhand des Taq Man-Low-Density Arrays (TLDA) gemessen. Dazu wurde die RNA aus den linken Ventrikeln der Mäuse eingesetzt. Im Gegensatz zum Microarray wurden die RNAs nicht in den Gruppen gepoolt, sondern auf Einzeltierebene gemessen, wodurch die Möglichkeit bestand, biologische Replikate mit in die Analyse einzubeziehen. Als Übersichtsanalyse wurden zunächst die durch Data Assist ermittelten Ratios aller Gene (TAC/Sham) mit den korrespondierenden aus der Microarray-Analyse verglichen. Eine Korrelation (Spearman) der Ratios zeigte einen erwarteten starken Zusammenhang der Werte (rho=0,9, Abb. 3.15). Lediglich bei einem Gen (Nd5/Nd6) ergaben sich an drei Zeitpunkten eine dem Microarray entgegensetzte Regulation. Eine Tabelle aller durch Microarray und TLDA ermittelten Ratios ist im Anhang (Tab. 7.4) zu finden. Abb. 3.15 Vergleich der für 44 Kandidatengene erhaltenen RT-PCR-Resultate mit den Microarrayergebnissen Mittels Korrelationsanalyse (Spearman, Korrelationskoeffizient rho) wurde die Assoziation zwischen den Ratios (TAC vs. Sham) aus Microarray- (y-Achse) und TLDA-Messungen (x-Achse) berechnet. Es zeigte sich eine starke Korrelation (rho = 0,9) der Werte. Für das Gen Nd5/Nd6 wurden in Microarray und TLDA konträre Expressionsveränderung ermittelt (rot). Die eingefügte Gerade dient zur Visualisierung der Korrelation der Werte. Ergebnisse - 58 - Werden die Ratios der HI-assoziierten Gene Nppa, Nppb und Acta1 betrachtetet, zeigten die mittels TLDA evaluierten Werte über alle Zeitpunkte eine stärkere Änderung der Genexpression nach TAC-OP im Vergleich zu Sham-Tieren. Jedoch konnte der Verlauf über die Zeit im Trend bestätigt werden (Abb. 3.16). Im Gegensatz dazu waren die ermittelten Ratios hinsichtlich des Gens Postn in beiden Methoden vergleichbar. Die höheren Expressionsunterschiede zwischen Sham und TAC sind hier wahrscheinlich der höheren Sensitivität der TaqMan-Messung, sowie dem Einsatz der Einzeltier-RNA geschuldet. Dennoch konnte die nach Microarrayanalyse ermittelten Genexpressionsunterschiede nach Aortenstenose im Vergleich zu Sham-Tieren mit dem TLDA sehr gut bestätigt werden. Abb. 3.16 Vergleich der TaqMan (TLDA) basierten und Microarray evaluierten Ratios (TAC vs. Sham) Dargestellt sind die nach TLDA (rosa) und Microarry-(grau) -Analyse ermittelten Ratios (TAC/Sham) der Gene Nppa, Nppb, Acta1 und Postn. Nppa, Nppb und Acta1 zeigen eine im Trend gleichgerichtete Regulation, wobei die TLDA-Werte einen weitaus höheren Unterschied zwischen Sham- und TAC-Tieren zeigen als die Microarray-Daten. Im Gegensatz dazu waren bei Postn die durch die zwei Methoden evaluierten Expressionsunterschiede vergleichbar. Um die Homogenität innerhalb der gepoolten Gruppen (Microarray) beurteilen zu können, wurden für die biologischen Replikate innerhalb einer Gruppe der Variationskoeffizient aus den 6 Einzeltierwerten der normalisierten relativen Quantitäten (2-Δct) für die einzelnen Gene pro Zeitpunkt bestimmt. In den Sham-Gruppen wiesen die meisten Gene an allen untersuchten Zeitpunkten einen Variationskoeffizienten zwischen 10% und 40% auf, wobei kein Zeitpunkt bzw. Gen als auffällig hoch variabel identifiziert werden konnte (Abb. 3.17). Ergebnisse - 59 - In den TAC-Tieren war eine etwas höhere Varianz zu beobachten. Hier lagen die Variationskoeffizienten größtenteils zwischen 10 % und 50 % (Abb. 3.17). Da es sich um biologische Replikate kranker Tiere handelte, kann die interindividuelle Varianz innerhalb der gepoolten Gruppen insgesamt jedoch als relativ gering eingestuft werden. Somit können die durch den Microarray erhobenen Daten aus den gepoolten Proben auch hier als valide bezeichnet werden. Abb. 3.17 Variationskoeffizienten in Sham- und TAC-Tieren für die 44 mittels TLDA analysierten Gene Die Histogramme zeigen die Varianz innerhalb der Gruppen der Sham- und TAC-Tiere anhand der Variabilität der 2-Δct Werte der einzelnen im TLDA untersuchten Gene pro Zeitpunkt. In den Sham-Tieren zeigen die meisten Gene eine Varianz zwischen 10% und 40%. Bei den TAC-Tieren konnte eine leichte Erhöhung der Variabilität der Geneexpression innerhalb der Gruppen beobachtet werden. Die Varianz lag hier bei 10-50%. Ergebnisse - 60 - 3.3.3 Korrelation der Genexpression mit kardialen Funktionsparametern Bei der Analyse der kardialen Funktionsparameter linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF), linksventrikuläre enddiastolische- und endsystolische Volumina (LVEDV, LVESV) und Masse (LVM) zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den Sham- und TAC-Tieren. Auch gruppenintern kam es insbesondere in den kranken Tieren über die Zeit zu Veränderungen der Herzfunktion. Zur Charakterisierung der Assoziationen zwischen der Genexpression (TLDA) und den einzelnen Herzfunktionsparametern wurden SpearmanKorrelationsanalysen basierend auf den detektierten normalisierten relativen Quantitäten (2-Δct) durchgeführt. Die Daten flossen gruppenabhängig (Sham und TAC), jedoch zeitpunktunabhängig in die Korrelationsanalyse ein. Es zeigte sich, dass in den TAC-Tieren eine Vielzahl der im TLDA untersuchten Gene eine starke Korrelation zu den einzelnen Herzfunktionsparametern aufwiesen, wohingegen in der Sham-Gruppe keine signifikanten Zusammenhänge beobachtet werden konnten. Dabei zeigten überwiegend die gleichen Gene einen starken Zusammenhang mit den unterschiedlichen Herzparametern. Eine Auflistung der Gene, die signifikant mit mindestens einem der evaluierten Herzparameter korrelieren, ist in Tabelle 3.5 zu finden. Ergebnisse - 61 - Tab. 3.5 Korrelation der Genexpression (TLDA-Daten) mit den kardialen Funktionsparametern Dargestellt sind die Korrelationskoeffizienten rho (Spearman) und die dazugehörigen p-Werte der Gene, deren normalisierte Quantitäten (2-Δct) signifikant mit der LVEF, dem LVEDV, LVESV und/oder der LVM korrelieren (p<0,001). Dabei zeigten überwiegend die gleichen Gene einen starken Zusammenhang zwischen Expression und Herzfunktion. Gen Name Funktion des Genprodukts Itgbl1 Apod Integrin, beta-like 1 Cartilage oligomeric matrix protein, Thromospondin 5 Apolipoprotein D Cpxm2 LVEF LVEDV LVESV rel. LVM rho p-Wert rho p-Wert rho p-Wert rho p-Wert Transmembranprotein, Zell-Zell-Interaktion -0,8059 < 0.0001 0,8235 < 0.0001 0,8193 < 0.0001 0,7712 < 0.0001 Zell-Zell-, Zell-Matrix- Interaktion -0,7637 < 0.0001 0,8063 < 0.0001 0,7963 < 0.0001 0,7721 < 0.0001 Transportprotein -0,7546 < 0.0001 0,7702 < 0.0001 0,7665 < 0.0001 0,673 < 0.0001 Carboxypeptidase X 2 (M14 family) Zell-Zell-Interaktionen -0,7394 < 0.0001 0,8809 < 0.0001 0,8426 < 0.0001 0,937 < 0.0001 Nppa Natriuretic peptide precursor type A Natriuretisches Peptid -0,7287 < 0.0001 0,5917 0,0001 0,6359 < 0.0001 0,4976 0,002 Nupr1 Genexpressionsregulation -0,7117 < 0.0001 0,6207 < 0.0001 0,6338 < 0.0001 0,593 0,0001 Modulator des Wnt-Signalwegs -0,6806 < 0.0001 0,6139 < 0.0001 0,6492 < 0.0001 0,4968 0,0021 Motorprotein, Strukturelle Zellorganisation -0,6542 < 0.0001 0,7008 < 0.0001 0,6957 < 0.0001 0,6197 < 0.0001 Sfrp2 Nuclear protein 1 WNT1-inducible signaling pathway protein Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle, beta Secreted frizzled-related protein 2 Modulator des Wnt-Signalwegs -0,6406 < 0.0001 0,763 < 0.0001 0,7228 < 0.0001 0,7444 < 0.0001 Thbs4 Thrombospondin 4 Zell-Zell-, Zell-Matrix- Interaktion -0,6284 < 0.0001 0,4876 0,0026 0,5218 0,0011 0,3784 0,0229 Cfh Regulator des Komplementsystems -0,6169 < 0.0001 0,7083 < 0.0001 0,6867 < 0.0001 0,6565 < 0.0001 Transmembranprotein, Ionentransport -0,6133 < 0.0001 0,7633 < 0.0001 0,7242 < 0.0001 0,8057 < 0.0001 Ctgf Complement component factor H FXYD domain-containing ion transport regulator Connective tissue growth factor Wachstumsfaktor -0,5822 0,0002 0,7022 < 0.0001 0,6729 < 0.0001 0,7245 < 0.0001 Mfap4 Microfibrillar-associated protein 4 Strukturelle Zellorganisation, Cytoskelett -0,5803 0,0002 0,5537 0,0005 0,5595 0,0004 0,5426 0,0006 Stc1 Stanniocalcin 1 Zelluläre Calcium/Phosphat homeostase -0,5755 0,0002 0,499 0,002 0,5573 0,0004 0,5337 0,0008 Acta Actin, alpha 1 Strukturelle Zellorganisation, Cytoskelett -0,5686 0,0003 0,5435 0,0006 0,5604 0,0004 0,5625 0,0004 Mfap5 Microfibrillar-associated protein 5 Strukturelle Zellorganisation, Cytoskelett -0,5417 0,0006 0,3037 0,0717 0,3682 0,0271 0,2245 0,188 Nuak1 NUAK family, SNF1-like kinase, 1 Serine/Threonine-kinase,Zell-Zell Interaktion -0,486 0,0027 0,6579 < 0.0001 0,6341 < 0.0001 0,7207 < 0.0001 Abra Actin-Binding Rho Activating Protein Rho-Aktin-Signaling -0,4843 0,0028 0,6114 < 0.0001 0,5874 0,0002 0,7312 < 0.0001 Kif5b Kinesin Family Member 5B Microtubuli Organisation -0,4515 0,0057 0,59 0,0002 0,5491 0,0005 0,6489 < 0.0001 Nppb Natriuretic peptide precursor type B Natriuretisches Peptid -0,4212 0,0105 0,5234 0,0011 0,493 0,0023 0,5392 0,0007 Ankrd23 Ankyrin Repeat Domain 23 Transkriptionsregulator -0,267 0,1155 0,3627 0,0297 0,3477 0,0377 0,5523 0,0005 Ces1d Carboxylesterase 1d Detoxifizierung 0,5518 0,0005 -0,5272 0,001 -0,5447 0,0006 -0,3924 0,0179 Comp Wisp2 Myh7 Fxyd6 Ergebnisse - 62 - Die Korrelationsanalyse der Genexpression der TAC-Tiere mit der LVEF ergab für 18 der 44 im TLDA untersuchten Gene eine signifikante Korrelation (p≤0,001). Darunter fanden sich die aus der Literatur bekannten Markergene Nppa (ANP) und Ctgf (Connective tissue growth factor). Nppa, dessen Genprodukte ANP bzw. pro-ANP auch klinisch zur Einschätzung einer Herzinsuffizienz dienen, zeigte eine starke negative Korrelation mit der LVEF (rho = -0,71), wohingegen das ebenfalls klinisch relevante Nppb (BNP) einen weniger stringenten Zusammenhang mit der Ejektionsfraktion aufwies. Es konnte aber auch bei weniger bekannten Genen wie Comp (Cartilage Oligomeric Matrix Protein, Thrombospondin 5), Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2), Itgbl1(Integrin, beta-like 1) oder Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) eine starke, negative Korrelation mit der Auswurffraktion beobachtet Korrelationen zeigt Abb. 3.18. werden. Eine detaillierte Darstellung der genannten Ergebnisse - 63 - rho= -0,72 rho= -0,58 rho= -0,76 rho= -0,68 rho= -0,81 rho= -0,64 Abb. 3.18 Korrelationen zwischen der Genexpression und der LVEF nach TAC-OP Mittels Korrelationsanalyse (Spearman, Korrelationskoeffizient rho, p<0,0001) wurde die Assoziation zwischen den normalisierten Quantitäten verschiedener Gene und der LVEF nach TAC-OP untersucht. Sowohl die Markergene Nppa (ANP) und Ctgf (Connective Tissue Growth Factor) als auch die weniger bekannten Gene Comp (Cartilage Oligomeric Matrix Protein, Thrombospondin 5), Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2), Itgbl1(Integrin, beta-like 1) oder Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) zeigten eine starke, negative Korrelation (rho<-0,6) mit der LVEF. Die eingefügte Gerade dient zur Verdeutlichung der Richtung der Korrelation. Bei den linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Volumina zeigten sich ebenfalls starke Abhängigkeiten zwischen der Genexpression und den kardialen Parametern (Abb. 3.19). Gene, deren Expressionsniveau nach TAC-OP mit der LVEF korrelierten, zeigten in den überwiegenden Fällen auch eine Korrelation mit den Parametern LVEDV und LVESV. Auch hier wiesen wiederum die Gene Itgbl1, Comp, Wisp2 und Sfrp2 die stringentesten Korrelationen (Rho>0,7) auf. Ergebnisse - 64 - rho= 0,8 rho= 0,79 rho= 0,61 rho= 0,65 rho= 0,82 rho= 0,81 rho= 0,76 rho= 0,72 Abb.3.19 Korrelationen zwischen der Genexpression und den linksventrikulären Volumina LVEDV und LVESV nach TAC-OP. Mittels Korrelationsanalyse (Spearman, Korrelationskoeffizient rho, p<0,0001) wurde die Assoziation zwischen den normalisierten relativen Quantitäten verschiedener Gene und den Volumina LVEDV und LVESV nach TAC-OP untersucht. Die Gene Comp (Cartilage Oligomeric Matrix Protein, Thrombospondin 5), Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2), Itgbl1(Integrin, beta-like 1) und Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) wiesen eine starke, positive Korrelation (rho >0,7) mit den linksventrikulären Volumina auf. Die eingefügte Gerade dient zur Verdeutlichung der Richtung der Korrelation. Die durchgeführten Analysen der Genexpression im Zeitverlauf geben einen umfassenden Überblick über die transkriptionellen Veränderungen, denen das Herz während der Ausbildung einer Herzinsuffizienz unterliegt. Dabei konnte kein explizierter Signalweg bzw. Ergebnisse - 65 - keine alleinige physiologische bzw. pathophysiologisch relevante Funktion identifiziert werden, die als Ursache der Verschlechterung der Herzleistung auftritt. Vielmehr zeigte sich eine Beteiligung vieler Prozesse und Signalwege, die zum Remodeling des Herzgewebes führen. Auffällig war die sofortige Erhöhung der Genexpression bekannter Markergene wie Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Acta 1 (α-Aktin), die bereits kurz nach TAC, also in der ersten Phase der druckinduzierten Herzinsuffizienz stimuliert wurden. Die Suche nach Kandidatengenen, deren Expression zum Verständnis der Remodelingprozesse bzw. der Einschätzung des Krankheitsstadiums beitragen soll, eröffnete wiederum die Möglichkeit weiterer Analysen. So zeigten Sfrp2 und Wisp 2 (WNT1 inducible signaling pathway protein), die mit dem Wnt-Signalweg assoziiert sind, eine starke Korrelation mit der Herzfunktion und können so mögliche neue prognostische Marker darstellen. Da die mRNA aber postranskriptionellen Modifikationen, wie z.B. dem alternativen Spleißen unterworfen ist, wurde zusätzlich eine Gesamtproteinanalyse unternommen, die zu einem tiefer greifenden Verständnis der molekularen Prozesse bei der Ausbildung einer Herzinsuffizienz beitragen sollte. 3.4 Proteomanalyse der linken und rechten Ventrikel nach experimenteller Aortenstenose (TAC) im Zeitverlauf der Erkrankung Zur genaueren Beurteilung der Expressionsänderungen während der Ausbildung einer Herzinsuffizienz wurden die Proben nicht nur auf Transkriptom-, sondern zusätzlich auf Proteinebene untersucht. Diese Analyse wurde von Alexander Benkner (Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung) im Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt und die erhobenen Daten für eine weitergehende Auswertung zur Verfügung gestellt. Für die Probenanalyse wurden Gesamtproteinlysate hergestellt und die linken und rechten Ventrikel der einzelnen Gruppen und Zeitpunkte gepoolt (Schema siehe Abb. 2.5). Nach der massenspektrometrischen Analyse wurden die Proteine näher betrachtet, die in ihrer Abundanz einen mindestens 2-fachen Unterschied von (TAC vs. Sham) aufwiesen. Insgesamt konnten 1297 Proteine im linken und 1225 Proteine im rechten Ventrikel detektiert werden. Von den identifizierten Proteinen wurden Unterschiede in der Menge für 314 Proteine im linken und 237 Proteine im rechten Ventrikel zu mindestens einem Zeitpunkt (Tag 4, 14, 21, 28, 42 oder 56) gefunden (TAC vs. Sham). Davon wurden für 85 Proteine Abundanzunterschiede in beiden Ventrikeln bestimmt. Die höchste Anzahl der in ihrer Ergebnisse - 66 - Abundanz veränderten Proteine trat im linken Ventrikel an den Tagen 14 (LV103↑, 42↓), 21 (LV87↑, 45↓) und 42 (LV 30↑, 69↓) auf. Im rechten Ventrikel waren die stärksten Veränderungen im Proteinmuster an den Tagen 28 (71↑, 48↓), 42 (37↑, 37↓) und 56 (41↑, 58↓) zu finden. Eine graphische Darstellung der Anzahl der regulierten Proteine ist in Abb. 3.20 gezeigt. Abb. 3.20 Anzahl der Proteine im linken und rechten Ventrikel, für die nach TAC eine mehr als 2-fache Änderung ihrer Abundanz im Vergleich zur Sham-Gruppe detektiert wurden Insgesamt wiesen im LV 314 und im RV 237 Proteine eine mindestens 2-fache Veränderung (TAC vs. Sham) in der Menge auf. 85 dieser Proteine waren in beiden Ventrikeln präsent (oben). Anzahl der Proteine, die an den jeweiligen Zeitpunkten (4, 14, 21, 28, 42 und 56d postoperativ) einen fc ≥±2 (TAC vs. Sham) aufwiesen. Um die Veränderungen während der Ausbildung einer druckinduzierten HI nach TAC im linken und rechten Ventrikel einschätzen zu können, wurden auch hier die Veränderungen der Proteinmengen (TAC vs. Sham) einiger HI-assoziierter Proteine genauer betrachtet (Abb. 3.21). So konnten erhöhte Proteinmengen von ANF (ANP) im LV der TAC-Tiere im Vergleich zu den Sham-Tieren bereits ab Tag 14 detektiert werden, wobei die stärkste Erhöhung an Tag 56 zu verzeichnen war. Im Gegensatz dazu, konnten im RV vor allem an den Tagen 4 und 21 nach TAC-OP weitaus geringere Abundanzen als in den Sham-Tieren gefunden werden. Erst an Tag 56 konnte ANP auch im RV in höheren Mengen detektiert werden, die Proteinmenge blieb jedoch weit hinter der des LV zurück. ACTS (α-Aktin) zeigte im LV eine konstant hohe Abundanz ab Tag 14, die, wenn auch weniger stark ausgeprägt, ebenfalls im RV zu verzeichnen war. An Tag 56 wiesen beide Ventrikel im Vergleich zu ihrer Sham-Gruppe ein ähnliches Änderungsniveau auf. Ergebnisse - 67 - Auch für Periostin (POSTN) konnten deutlich erhöhte Abundanzen im LV der TAC-Gruppe gefunden werden, die final an Tag 56 den stärksten Anstieg zeigten. Im rechten Ventrikel hingegen waren die Unterschiede zum Sham-Tier nur sehr gering ausgeprägt. Die vermehrte Expression von β-MHC (MYH7) im LV, die sich bereits auf Transkriptionsebene darstellte, zeigte sich auch in der Proteomanalyse. Ab Tag 14 trat βMHC vermehrt im LV auf, wobei an Tag 56 die größte Veränderung beobachtet werden konnte. Ein ähnlicher Trend war auch im rechten Ventrikel zu verzeichnen, doch war die Proteinmenge weitaus geringer. A B C D Abb. 3.21 Vergleich der Proteinmengen HI-assoziierter Proteine zwischen TAC und Sham-Tieren im linken und rechten Ventrikel Dargestellt sind die durch massenspektrometrische Analysen ermittelten Ratios (TAC/Sham) der Proteine (A) ANF (ANP), (B) ACTS (α-Aktin), (C) POSTN (Periostin) und (D) MYH7 (β-MHC) im linken (schwarz) und rechten Ventrikel (grau). Bereits 14 Tage nach TAC-OP konnte im LV eine Zunahme dieser Proteine im Vergleich zu der Sham-Gruppe detektiert werden. Der RV wies weitaus geringere Abundanzunterschiede (TAC vs. Sham) dieser Proteine auf. Erst an Tag 56 konnten auch im RV erhöhte Abundanzen der HI-assozierten Proteine gefunden werden. Ergebnisse - 68 - Die HI-Marker wiesen auch auf Proteinebene starke Unterschiede zum Sham-Tier auf, wobei die intial starken Zunahmen an Tag 4, wie sie auf Transkriptomebene zu beobachten war, ausblieb. Des Weiteren zeigten diese Marker, wie auch schon in der Genexpression, eine verzögerte und weniger ausgeprägte Reaktion des rechten Ventrikels. Auf Grund dessen wurde der Fokus für die weitergehende Analyse auf die zeitlichen Veränderungen im linken Ventrikel gelegt. 3.4.1 Funktionelle Klassifizierung der im linken Ventrikel differenziell exprimierten Proteine Wie auch bei den Genexpressionsanalysen (Abs. 3.3.1) wurde eine funktionelle Klassifizierung der Proteine in Signalwege mittels IPA vorgenommen. Als Datenset dienten hierbei die 314 Proteine, die im linken Ventrikel nach TAC-OP eine mindestens 2-fache Änderung aufwiesen. Diese wurden 105 Signalwegen zugeordnet. Die Signalwege mit der stärksten Anreicherung von Proteinen des Datensets sind in Abb. 3.22 zusammengefasst. Es zeigte sich hierbei, dass über alle Zeitpunkte hinweg eine Vielzahl der regulierten Proteine der Umstrukturierung des Zytoskeletts dienen. Dies zeigt die Zuordnung der Proteine zu den Kategorien „Aktinzytoskelett Signaling“, wie auch den als „Regulation der aktinbasierten Motilität durch Rho“ bezeichneten Signalweg, der die dynamische Organisation des Aktinzytoskeletts durch die kleinen GTPasen der Rho Familie beschreibt. Des Weiteren konnte auch das Kalziumsignaling, was eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie z.B. die Muskelkontraktion und Zellproliferation umfasst, als einer der zu allen Zeitpunkten betroffenen Hauptsignalwege identifiziert werden. Auffällig war, dass vor allem zu den früheren Zeitpunkten (Tag 4, 14, 21) Proteine in ihrer Abundanz verändert waren, die mit dem Phospholipase C (PLC)- und Proteinkinase A (PKA)- Signalweg assoziiert sind, wohingegen zu den späteren Zeitpunkten (Tag 42 und 56) vor allem metabolische Prozesse, wie der „Galaktosemetabolismus“, die „Glykolyse/Glykoneogenese“ und der „Pentosephosphatweg“ repräsentiert wurden. Ergebnisse - 69 - Abb. 3.22 Vergleichsanalyse der Klassifizierung der nach TAC in ihrer Abundanz veränderten Proteine anhand der Software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Mittels IPA wurden die Proteine, die zu den einzelnen Zeitpunkten in der TAC-Gruppe eine mindestens 2-fache Änderung ihrer Abundanz im Vergleich zur Sham-Gruppe aufwiesen bekannten Signalwegen zugeordnet. Die Überrepräsentation der Signalwege im Vergleich zum Referenzset wird in Form eines -log(p-Wert) angegeben. Die am stärksten repräsentieren Kategorien sind hier je Zeitpunkt zusammengefasst . Die Analyse der während der Entwicklung einer Herzinsuffizienz veränderten Proteine des linken und rechten Ventrikels zeigte, dass die Aortenkonstriktion wie auch schon in der Genexpressionsanalyse einen geringeren Effekt auf das Expressionsmuster des RV als auf das des LVs hatte. Im Vergleich zum LV wurden im RV weitaus weniger in ihrer Abundanz veränderte Proteine gefunden. Auch im Vergleich der Expression einzelner HI-assoziierter Proteine waren die Unterschiede zum Sham-Tier im LV deutlich stärker und früher ausgeprägt als im RV. IPA-Analysen der differenziell exprimierten Proteine des linken Ventrikels zeigten eine deutliche Zuordnung der Proteine zu Signalwegen der Zytoskelettumstrukturierung und des Kalziumsignalings über alle Zeitpunkte hinweg. Des Weiteren wurden vor allem zu den frühen Zeitpunkten eine Vielzahl der Proteine dem PLCund PKA-Signalweg zugeschrieben, wohingegen an den späteren Zeitpunkten Signalwege metabolischer Prozesse beeinflusst waren. Diskussion 4. - 70 - Diskussion Auf pathologische Stimuli wie mechanischen Stress, Druckbelastung oder abnorme neurohumorale Aktivierung reagiert das Herz mit Hypertrophie und Remodeling. Dieser Prozess ultrastruktureller Umgestaltung zeigt sich unter anderem in einer Zunahme der Kardiomyozytenquerschnitte, interstitieller Fibrose, Apoptose und Reinduktion des fötalen Genexpressionsprogramms. Obwohl diese Regulationsmechanismen zunächst kompensatorisch sind und der Aufrechterhaltung der kardialen Leistung dienen, führen sie auf Dauer zur Herzinsuffizienz (HI), einer der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Während der letzten Jahre wurde eine Vielzahl an Genen und damit assoziierte Signalwege identifiziert, die bei pathologischen kardialen Hypertrophien und ventrikulärer Dilatation verändert exprimiert vorliegen [22]. Allerdings liegen bisher keine Studien vor, die umfassende Analysen beginnend vom schädigenden Ereignis über die subklinischen Stadien bis hin zum Vollbild der HI beinhalten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, sowohl die Veränderungen der Genexpression als auch der Proteinmengen während des kompletten Krankheitsverlaufes zu charakterisieren und somit das Verständnis der zu Grunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen und beteiligten Signalwege des kardialen Remodelings zu verbessern. Um die kardiale Antwort auf einen pathologischen Stimulus umfassend zu analysieren, sollten zusätzlich vergleichende Analysen der Expressionsmuster in linken und rechten Ventrikeln durchgeführt werden. Ein hierfür geeignetes Tiermdodell ist die sogenannte transverse Aortenkonstriktion (TAC) in der Maus. In diesem wird durch eine definierte Verkleinerung des Aortenlumens die Nachlast des linken Ventrikels stark erhöht und so die Ausbildung einer Herzinsuffizienz über die Zeit induziert. Da dieses international anerkannte Verfahren zu Beginn der Arbeit am Standort bisher nicht genutzt wurde, musste es zunächst etabliert und charakterisiert werden. 4.1 Etablierung des Tiermodells der transversen Aortenkonstriktion und Charakterisierung der Herzfunktion nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung Im Bereich der medizinischen Grundlagenforschung besteht die Möglichkeit, sowohl humanes Material als auch solches tierischen Ursprungs und im Speziellen verschiedene Diskussion - 71 - Tiermodelle zu nutzen. Soll auf Proben menschlichen Ursprungs zurückgegriffen werden, so muss jedoch bedacht werden, dass aufgrund seiner potentiellen Infektiösität spezielle Vorsichtsmaßnahmen im Umgang ergriffen werden müssen. Oftmals ist humanes Material schlecht verfügbar, die Qualität ist vielfach nicht ausreichend und geeignete Kontrollproben können fehlen. Es müssen ethische Aspekte berücksichtigt werden, weiterhin ist es selten möglich, größere Gewebeproben und ganze Organe zu untersuchen. Aus diesen Gründen bieten Tiermodelle viele Vorteile. Zwar muss hier die Frage nach der Übertragbarkeit auf den Menschen gestellt werden, denn obwohl das Genom der Maus nahezu identisch mit dem des Menschen [52] ist, sind Aussagen über z.B. inflammatorische Erkrankungen und Reaktionen im Mausmodell umstritten [53]. Nichtsdestotrotz stellen Spezies wie Hund, Schwein und Kaninchen und insbesondere Ratte und Maus gut geeignete Studienobjekte dar. So ist es möglich, im Gesamtorganismus Erkrankungen zu induzieren und deren Verläufe isoliert ohne mögliche Beeinflussung durch Komorbiditäten wie beispielsweise Bluthochdruck, Übergewicht und Diabetes mellitus zu betrachten. Des Weiteren können Proben wie Blut, Urin oder auch ganze Organe zu definierten Zeitpunkten entnommen und mit einer entsprechenden Kontrollgruppe verglichen werden. Zur Induktion einer chronischen HI wurde in dieser Arbeit das in vivo-Modell der transversen Aortenkonstriktion in der Maus gewählt. Dieses Modell bietet u.a. den Vorteil, dass die Progression der HI in Anwesenheit aller Organe und des Blutkreislaufs sowie weiterer Einflüsse wie Immunreaktionen und neurohumorale Faktoren betrachtet werden kann. Des Weiteren können alle Stadien der Erkrankung vom gesunden bis zum insuffizienten Tier in einem kurzen, überschaubaren Zeitraum analysiert werden. Von besonderem Interesse sind hierbei molekulare Veränderungen in subklinischen Stadien, in denen die Herzfunktion noch nicht oder nur wenig eingeschränkt ist. Diese könnten langfristig dazu dienen, neue Biomarker zu definieren, die bei Patienten eine Prognose über den Krankheitsverlauf bzw. einen frühzeitigen Therapiebeginn noch vor Auftreten einer Myokardschädigung ermöglichen würden. Desweiteren können auch für die Ausblidung einer HI kausal beteiligte Mediatoren identifiziert werden, die in weitergehenden Studien therapeutisch adressiert werden sollen. Im klinischen Alltag gilt die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) als Standard zur Diagnostik von systolischen Herzfunktionsstörungen. Dieser Parameter gibt den prozentualen Anteil des sich im linken Ventrikel befindlichen Blutes an, der während der systolischen Kontraktionsphase in die Peripherie ausgeworfen wird. Dabei gilt im Patienten (wie auch im Versuchstier) eine LVEF von ≥55 % als normal und <30% als stark eingeschränkt. Zur Abbildung des progredienten HI-Verlaufs wurden im Rahmen des hier durchgeführten Diskussion - 72 - Tierversuches nach der TAC- bzw. sham-OP sechs dicht zusammenliegende Zeitpunkte gewählt, zu denen mit Hilfe der Magnetresonanztomografie die Herzfunktion der Mäuse evaluiert wurde. Diese sechs Zeitpunkte wurden nach Vorversuchen gewählt, um den Verlauf der Herzfunktion und der linksventrikulräen Hypertrophie nach TAC über die Entwicklung einer subklinischen HI mit beginnender systolischen Dysfunktion bis zur Ausbildung einer HI im Endstadium engmaschig zu überwachen. Es konnte gezeigt werden, dass die Pumpfunktion nach TAC nicht in einer gleichmäßigen Verschlechterung über die Zeit verläuft, sondern vielmehr eine stufenartige Progression aufweist. So kam es zunächst zu einem Absinken der LVEF bis Tag 14, was die erste Stufe der Schädigung des Myokardgewebes infolge akuter Nachlasterhöhung darstellt. Diese initiale Einschränkung der Pumpfunktion wurde von einer Massenzunahme des linken Ventrikels (LVM), als auch von der Zunahme der Kammervolumina in Diastole (LVEDV) und Systole (LVESV) begleitet. Diese erste Phase kann mit dem Einsetzen der Remodelingprozesse assoziiert werden. Hierbei versucht das Herz, sich an die durch die Aortenkonstriktion entstandenen neuen Druckverhältnisse im linken Ventrikel anzupassen. Diese Kompensationsprozesse erhielten in den darauffolgenden Untersuchungszeitpunkten 21, 28 und 42 Tage postOP die Herzfunktion, so dass sich zunächst keine weitere Verschlechterung zeigte und die untersuchten Parameter auf einem konstant erniedrigten Niveau verblieben. Im Patienten werden Symptome in dieser als kompensierte Hypertrophie bezeichneten Phase weitestgehend nur unter Belastung wahrgenommen. Das final erkrankte Herz zeigte sich in den Mäusen an Tag 56 nach TAC. Zu diesem Zeitpunkt war die LVEF nochmals stark abgefallen und die Vergrößerung der Volumina und Masse wiesen auf eine kaum noch erhaltene Pumpfunktion eines massiv dilatierten Herzens hin. Begleitet wurde dieser stufenartige Abfall der kardialen Funktionsparameter von einer Zunahme interstitieller Kollagenfasern (Fibrose) in den TACTieren zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu der jeweiligen Sham-operierten Gruppe (Abb 3.4). Aufgrund der geringen Gruppengrößen ließen sich zwar keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Fibrose zwischen den TAC- und Sham-Tieren detektieren, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass bei einer entsprechend umfangreichen Analyse eine belastbare Auswertung hätte durchgeführt werden können. Da aber bekannt ist, dass es unter Aortenstenose sehr schnell zu fibrotischen Ablagerungen kommt, wurde in Hinblick auf die 3R-Regel (Replacment, Reduction and Refinement) darauf verzichtet, weitere Tiere zu opfern [54, 55]. Diskussion 4.2 Genexpressionsanalyse - 73 - nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung Die Herzinsuffizienz ist eine Erkrankung, die eine Vielzahl verschiedener zellulärer Mechanismen beinhaltet, die zu dem bekannten Phänotyp des verringerten ventrikulären Kontraktionsvermögens und Ventrikeldilatation führen. Um diese Mechanismen besser verstehen zu können, wurden bereits einige Genexpressionsstudien an menschlichem [56-58] und murinem insuffizienten Myokard durchgeführt [59-61]. Dabei stand vor allem der Vergleich zwischen gesunden und stark erkrankten Herzen im Mittelpunkt. Es konnten somit hauptsächlich die Veränderungen der Genexpression im finalen Stadium der HI beschrieben werden. Nur sehr wenige Studien gehen auf die Veränderungen in der Genexpression im Krankheitsverlauf ein [62, 63]. Diese verzichteten dabei jedoch auf eine umfassende Analyse der Herzfunktion und waren durch eine geringe Gruppengröße limitiert. Auch die Genexpressionsveränderungen im rechten Ventrikel wurden nicht berücksichtigt. Auf Grund dessen wurde in dieser Arbeit das Hauptaugenmerk auf den zeitlichen Verlauf der Genregulation im linken und rechten Ventrikel gelegt und erfasst somit auch Veränderungen der Genexpression im subklinischen Stadium der HI. 4.2.1 Genexpressionsanalyse der linken und rechten Ventrikel im Zeitverlauf der Erkrankung In diesem Teil der Arbeit wurde mittels Microarray die Genexpression nach Aortenkonstriktion im rechten und linken Ventrikel (RV und LV) untersucht. Dabei zeigte sich, dass im Zeitverlauf im rechten Ventrikel eine geringere Anzahl an Genen signifikant beeinflusst war als im linken Ventrikel. Jedoch war der Großteil der im rechten Ventrikel regulierten Gene auch im linken verändert. Die Expression bekannter Herzinsuffizienzmarker (ANP, BNP, α-Aktin, Periostin, Abb.3.7) war im rechten Ventrikel weitaus weniger stark ausgeprägt als im linken Ventrikel. Diese Markergene wurden erst am finalen Zeitpunkt im RV vermehrt exprimiert, wobei die Intensität stark hinter der des LV zurück blieb. Somit scheint der rechte Ventrikel trotz des prinzipiell ähnlichen histologischen Aufbaus anders bzw. weniger ausgeprägt auf die pathologische Veränderung zu reagieren. Im gesunden Herzen ist das Schlagvolumen in beiden Ventrikeln gleich, aber auf Grund des geringen vaskulären Widerstandes der Pulmonalgefäße muss der RV lediglich 25% der Schlagkraft des Diskussion - 74 - LV aufbringen und ist somit auch dünner als dieser [64]. Die Nachlasterhöhung durch TAC wirkt sich zunächst auf den linken Ventrikel aus und schädigt erst bei Einsetzen einer linksventrikulären Dysfunktion mit Ausbildung eines Rückwärtsversagens des linken Ventrikels und konsekutiver Enstehung einer Druckerhöhung im kleinen Kreislauf (pulmonale Hypertonie) sekundär den rechten Ventrikel durch eine Nachlasterhöhung. Infolgedessen sind die im Genexpressionsprofil nachgewiesenen Veränderungen des LV zu den gewählten Zeitpunkten deutllich prominenter. Doch nicht nur durch die unterschiedlichen Druckverhältnisse, auch in der Embryonalentwicklung weisen der RV und LV Unterschiede auf. Beide Ventrikel entwickeln sich aus unterschiedlichen Bereichen des präkardialen Mesoderms. So formt das erste Herzfeld den späteren linken Ventrikel und die Zellen des zweiten Herzfeldes bilden den späteren rechten Ventrikel [65]. Obwohl beide Ventrikel eine unterschiedliche Entstehung aufweisen, zeigte der Vergleich der Genexpressionsmuster der Ventrikel in gesunden Herzen nur geringfügige Abweichungen (Abs. 3.3), was auch vorhergehende Vergleichsanalysen zeigten [66]. Eine unterschiedliche Genexpression konnte erst nach Induktion des pathologischen Stimulus der Drucküberlastung beobachtetet werden, wobei diese im RV verzögert und weniger stark ausgeprägt auftrat. Da pathologische Veränderungen im Transkriptom des linken Ventrikels früher und deutlicher erkennbar waren, wurde auf eine tiefergehende Analyse des rechten Venrikels verzichtet und vornehmlich die Genexpression des linken Ventrikels untersucht. 4.2.2 Zeitlicher Verlauf der linksventrikulären Expression Hypertrophie-assoziierter Gene Vor allem die Gene der bekannten HI-Marker ANP (Atriales natriuretisches Peptid, NPPA) und BNP (B-typ natriuretisches Peptid, NPPB), beide werden für die Diagnose und Einschätzung des Schweregrades der Erkrankung genutzt [67], waren bereits 4 Tage nach TAC im LV stark hochreguliert und verblieben über den betrachteten Zeitraum auf diesem Expressionsniveau (Abb 3.7). ANP und BNP können in großen Mengen während der embryonalen Entwicklung und in kardialem Gewebe von Neugeborenen gefunden werden, sind aber im adulten gesunden Herzen nicht präsent [68]. In kardialen Zellen wird durch hypertrophe Stimuli wie mechanischer Stress die Aktivierung von ANP- bzw. BNPPromotoren unter Beteiligung einzelner oder durch das Zusammenwirken verschiedener Transkriptionsfaktoren (z.B. GATA-4 und SRF (Serum Response Factor) induziert [69]. Es Diskussion - 75 - wird angenommen, dass die Reexpression von ANP und BNP im Myokard eine antihypertrophe Wirkung hat und somit einen Kompensationsmechanimus darstellt [70]. So zeigen ANP-defiziente Mäuse bereits unter Basalbedingungen einen erhöhten Blutdruck und Hypertrophie und reagieren unter Volumen- oder Druckbelastung mit einer stärkeren hypertrophen Antwort als Wildtyp-Tiere [71]. Des Weiteren konnte bei Abwesenheit von ANP eine gesteigerte Expression extrazellulärer Matrixproteine beobachtet werden, was eine antihypertrophe Wirkung von ANP auf Grund der Inhibition des ECM-Aufbaus nahe legt [72]. Die Deletion von BNP dagegen führte zu einer gesteigerten interstitiellen Fibrose, die sich nach Ventrikelüberlastung verstärkte [73]. Der durch natriuretische Peptide (NP) vermittelte antihypertrophe Effekt scheint über die Produktion von cGMP (cyclisches Guanosinmonophosphat) zu verlaufen. Eine Stimulation adulter Kardiomyozyten mit einem cGMP-Analogon zeigt die gleichen antihypertrophen Effekte wie das direkte Einwirken der NPs [74]. C-GMP wird von der Phosphodiesterase-5A (PDE-5A) abgebaut. Wird diese durch den PDE-5A Antagonisten Sildenafil inhibiert, führt dies zu einer geringeren Hypertrophie und einer verbesserten Herzfunktion in Mäusen mit TAC, was nahe legt, dass sich eine höhere Bioverfügbarkeit von cGMP günstig auf eine Hypertrophie auswirkt [75]. Diese Effekte der NPs auf cGMP beinhalten u.a. auch den als „Zelluläre Effekte von Sildenafil“ bezeichneten Signalweg der hier durchgeführten IPA-Analysen, der sich vor allem an den Zeitpunkten zwischen 4 und 28 Tagen als signifikant beeinflusst zeigte (Abb. 3. 8). Periostin ist ein sekretorisches Protein, das direkt an Matrixproteine bindet und die ECMIntegrität reguliert. Es ist hauptsächlich in dem kollagenreichen Gewebe der Herzklappen, jedoch nur minimal im adulten ventrikulären Myokardium exprimiert. Nach pathologischem Stress wie einer Drucküberlastung oder einem Myokardinfarkt wird es hingegen verstärkt von residenten Fibroblasten exprimiert [76-78]. Es wird angenommen, dass Periostin im starken Zusammenhang mit dem ECM-Metabolismus und der Fibrose steht und somit als ein Regulator des kardialen Remodelings fungiert. So konnte in humanen insuffizienten Herzen in Abhängigkeit des Fibrosegrades eine gesteigerte Expression nachgewiesen werden, was Periostin zu einem potentiellen zukünftigen Biomarker des kardialen Remodelings bei der HI macht [79]. Auch in den hier untersuchten TAC-Mäusen zeigte sich im Vergleich zu den jeweiligen Sham-Gruppen über die Zeit eine verstärkte Expression, die wie auch bei ANP und BNP frühzeitig nach TAC auftrat, zu den mittleren Zeitpunkten etwas absank und final an Tag 56 die stärkste Expression aufwies. (Abb. 3.7). Einen ähnlichen Trend zeigte, wenn auch nicht statistisch signifikant, die Quantifizierung der Fibroseareale (Abb. 3.5). Dies lässt die Vermutung eines Zusammenhangs zwischen Fibrose und Periostinexpression zu, konnte Diskussion - 76 - jedoch auf Grund der geringen Probenanzahl in der histologischen Untersuchung nicht statistisch verifiziert werden. Ein weiteres beeinflusstes und auch in dieser Arbeit genauer betrachtetes Gen stellt α-Aktin (ACTA1) dar. Wie auch bei den natriuretischen Peptiden wird die Expression des skelettalen α-Aktins bei hypertrophen Stimuli u.a. über SRF in Kardiomyozyten reinduziert. α-Aktin, eigentlich ein Bestandteil der Filamente der adulten Skelettmuskulatur, ist die vorherrschende Aktinisoform im fötalen Herzen, die jedoch nach der Geburt nicht mehr exprimiert wird [8082]. Auch dieses Gen wurde bereits an Tag 4 nach TAC als induziert detektiert und über den gesamten Untersuchungszeitraum auf hohem Niveau nachgewiesen. Analog zu den NPs gilt auch die Expression von α-Aktin als ein weiterer Indikator für die Reaktivierung des fötalen Genomprogramms. Nach IPA-Analysen wurde die Expression von α-Aktin mehreren Signalwegen, wie dem „Aktinzytoskelett-Signaling“ und dem „ILK (Integrin linked kinase)Signaling“ zugeordnet, wobei letzterem vor allem an den frühen Zeitpunkten bis Tag 21 nach TAC eine hohe Beteiligung zugeschrieben wurde (Abb. 3.8). Zytoskelettproteine wie Aktin können mit Adhäsionsmolekülen wie beispielsweise Integrinen kooperieren und somit Dehnungssignale, wie sie bei starker mechanischer Belastung auftreten, als hypertrophen Stimulus empfangen. Dies wiederum begünstigt die Reorganisation des Aktinzytoskeletts und stellt die Endstruktur der hypertrophen Antwort dar [83]. Neben den als Marker bezeichneten Genen wurde in dieser Arbeit auch die Expression weiterer HI-assoziierter Gene im Verlauf der Entstehung einer Herzinsuffizienz genauer betrachtet. Dazu gehören die Gene der Sarkomerproteine α- und β-MHC (Myosin Heavy Chain). Ein Kennzeichen der kardialen Hypertrophie ist der Anstieg von β-MHC und ein Absinken der α-MHC Expression [84]. In Mausventrikeln dominiert während der fötalen Herzentwicklung β-MHC, nach der Geburt wird diese durch α-MHC ersetzt. Dieser Wechsel der Isoformen scheint ein wichtiger Prozess zu sein, das Herz passt sich dadurch an die mechanische Leistung und Effektivität des postnatalen Kreislaufs an. Während der Entstehung einer Hypertrophie bzw. Herzinsuffizienz wird die Expression von β-MHC, wie auch anderer fötaler Gene wie ANP, BNP und α-Aktin (s.o.) reinduziert [85]. Auch unter TAC zeigte sich eine verstärkte Expression von β-MHC im linken Mausventrikel, die bereits 4 Tage nach Druckinduktion zu beobachten war. α-MHC zeigte sich hingegen als nicht bzw. sehr schwach repremiert (Abb 3.13). Da β-MHC die Hydrolyse von ATP und somit die chemische Reaktion zum Antreiben der Kontraktion langsamer katalysiert als α-MHC, führt dies zu einer verlangsamten, ökonomischeren kontraktilen Funktion und somit zur Adaptation an die veränderten Druckverhältnisse [49, 50]. In Bezug auf die Expression dieser Diskussion - 77 - Sarkomerprotein-kodierenden Gene ist die Übertragbarkeit auf den Menschen nur eingeschränkt gegeben. In adulten humanen Herzen, die eine weitaus geringere Herzfrequenz als Ratte oder Maus aufweisen, bestehen 90% des totalen MHC-Pools aus der β-MHC Isoform. Jedoch ist, wenn auch nicht sehr stark ausgeprägt, das Verhältnis von α- zu β-MHC in humanen insuffizienten Ventrikeln reduziert [86, 87]. Wie auch die Expression von ANP, BNP und α-Aktin konnte die Induktion von β-MHC im Mausmodell mehreren für die Zellmotilität essentiellen Signalwegen wie dem „ILK-„ als auch dem „AktinzytoskelettSignaling“ zugeordnet werden. Die Betrachtung einzelner HI assoziierter Gene zeigte, dass bereits eine kurzeitige Änderung der Druckverhältnisse im Herzen zu einer sofortigen Expression dieser Markergene führt und diese frühzeitig die beginnenden Remodelingprozesse anzeigen. Die Expression des fötalen Genprogramms wird im gestressten Myokard reinduziert. Dies scheint sehr schnell nach Auftreten des pathologischen Stimulus zu geschehen, da alle hier untersuchten in der Fötalperiode aktiven Gene bereits an Tag 4 nach TAC eine vermehrte Expression aufwiesen. Dieser initial adaptive Prozess, der zur Steigerung der Kontraktilität, Erregbarkeit und Plastizität der Myozyten benötigt wird, bleibt über die Zeit an allen untersuchten Zeitpunkten erhalten und wird somit zur Grundlage des maladaptiven Prozesses der Herzinsuffizienz. 4.2.3 Zeitlicher Verlauf der linksventrikulären Expression Fibrose-assoziierter Gene Ein weiteres Kennzeichen des maladaptiven Remodelings ist die kardiale Fibrose. Es ist bekannt, dass eine chronische Drucküberlastung mit einer massiven Zunahme von Kollagen einhergeht, welche die myokardiale Steifigkeit erhöht und die Herzfunktion beeinträchtigt. Studien zeigten, dass eine vermehrte interstitielle Fibrose die elektrische Kopplung zwischen einzelnen Kardiomyozyten beeinträchtigt und dass durch Zunahme der extrazellulären Matrix (ECM) die Kapillardichte ab- und damit die Sauerstoffdiffusionsstrecke zunimmt [88]. Somit führt die Fibrosierung des Gewebes zur Hypoxie der Kardiomyozyten und verändert damit den Metabolismus der Zellen grundlegend, was sich letztendlich auch auf die ventrikuläre Funktion negativ auswirkt. Eine entscheidende Rolle für das myokardiale Remodeling spielen die Fibroblasten. Sie stellen die größte Gruppe der im Herzen vorhandenen Zelltypen und synthetisieren ECM-Proteine wie Laminin, Fibronektin und Kollagen I und III. Ein Schlüsselereignis in der Entwicklung der kardialen Fibrose ist die Transformation der Fibroblasten in ihren aktiven Phänotyp des Myofibroblasten [20]. Myofibroblasten kommen nur im gestressten Myokardium vor, wo sie eine gesteigerte Kollagensynthese, α-Aktin- Diskussion - 78 - Expression und Sekretion proinflammatorischer Zytokine aufweisen [89, 90]. Die Anreicherung von Kollagen und anderen sezernierten Proteinen führt zur veränderten Zusammensetzung, Verteilung und Vergrößerung der extrazellulären Matrix und somit zur Verminderung der linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktion [91, 92]. Die am häufigsten vorkommenden Kollagene im Herzen sind die fibrillären Kollagene Typ I und III, die zusammen über 90% des totalen Kollagengehalts ausmachen und die Hauptproteine der extrazellulären Matrix bilden. Kollagenmoleküle des Typ I lagern sich zu dicken Fasern zusammen, die sehr belastbar sind und strukturelle Unterstützung geben. Typ III Kollagen hingegen formiert ein feines Netzwerk aus Fibrillen, die vor allem die Elastizität des Gewebes sicherstellen [93]. In dieser Arbeit konnte ebenfalls eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach TAC beobachtet werden (Abb. 3.5). Beide Kollagentypen zeigten einen ähnlichen Verlauf der Expressionsstärken, so waren die mRNA-Spiegel von Kollagen I (COL1A1) und III (COL3A1) an Tag 4 postOP stark erhöht, sanken bis zum Tag 42 kontinuierlich ab, wobei die Expressionslevel aber noch deutlich über denen der Sham-Tiere lagen. An Tag 56 zeigten beide Kollagene nochmals eine erhöhte Expression. Die ECM ist eine komplexe und dynamische Struktur, deren Komponenten proteolytischen Prozessen unterliegen, womit sich ein Gleichgewicht zwischen Auf- und Abbauprozessen einstellt. Dabei spielen die kollagendegradierenden Matrixmetalloproteinasen (MMP) und deren Inhibitoren, die Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinasen (TIMP) eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der strukturellen Charakteristik der ECM. Eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen diesen beiden Enzymklassen verändert die Struktur und Funktion der ECM und hat somit direkten Einfluss auf die linksventrikuläre systolische und diastolische Leistung [94]. So konnte in myokardialen Biopsien von Patienten mit Aortenstenose und damit einhergehender linksventrikulärer Drucküberlastung eine erhöhte Expression und Aktivität von MMP2 gefunden werden [95]. In MMP2-defizienten Mäusen zeigen sich nach TAC verringerte fibrilläre Kollagenakkumulationen und eine verbesserte linksventrikuläre diastolische Funktion [96]. Eine ähnlich positive Auswirkung auf das Remodeling konnte auch bei MMP9 knock-out Mäusen nachgewiesen werden, die nach Volumenüberlastung eine verringerte linksventrikuläre Dilatation und Dysfunktion aufweisen [97]. Auch in dieser Arbeit konnte eine verstärkte Expression von MMP2 beobachtet werden. Da sich diese jedoch erst 14 Tage nach Drucküberlastung zeigte und nicht wie die Kollagenexpression bereits an Tag 4, scheint die Expression von MMP2 ein Kompensationsmechanismus zur Regulation des verstärkten ECM-Aufbaus zu sein. Als relativ gering verändert erwies sich hingegen die MMP9, die lediglich an Tag 4 schwach Diskussion - 79 - herunterreguliert war. Zusätzlich zu diesen bereits im Kontext mit Herzinsuffizienz beschriebenen MMPs konnte an Tag 56 eine vermehrte Expression von Mmp12 nachgewiesen werden. Diese von Makrophagen sezernierte MMP scheint insbesondere bei inflammatorischen Prozessen relevant zu sein und wurde in atherosklerotischen Läsionen und Aneurysmen als verstärkt exprimiert gefunden [98]. Die Hochregulation der MMP12 im finalen Stadium der Herzinsuffizienz könnte demnach ein Hinweis auf inflammatorische Prozesse im Herzgewebe sein. Als posttranslationelle Kontrolle der proteolytischen MMP-Aktivität dienen die TIMPs. Bisher sind vier verschiedene Subtypen bekannt, die an die verschiedenen MMPs mit unterschiedlicher Affinität binden [99]. Im Kontext des LV Remodelings nach Volumenüberlastung konnten relativ zu MMP erhöhte Level an TIMP1 gefunden werden, was eine profibrotische Wirkung auf Grund der Reduktion der ECM-Degradation nahe legt [100, 101]. Eine verstärkte Expression von TIMP1 nach Drucküberlastung wurde auch in den hier durchgeführten Experimenten bestätigt. So wurden insbesondere an den Tagen 4 und 56 erhöhte Transkriptmengen für TIMP1 in den TAC-Tieren im Vergleich zu den Sham-Tieren gemessen. Zusammen mit der vermehrten Kollagenexpression deutet dies darauf hin, dass es als frühzeitige Antwort auf den pathologischen Stimulus zu einer profibrotischen Verschiebung des Gleichgewichts in der ECM kommt. Die leicht erhöhte Expression von MMP2 scheint nicht auszureichen, um das Gleichgewicht wieder herstellen zu können, was womöglich zur verstärkten Fibrosierung der TAC-Herzen von Beginn an und über alle Zeitpunkte hinweg beitragen konnte (Abb. 3.5). Ein weiterer Faktor in der Kontrolle der interstitiellen Fibrose stellt TGFβ (Transforming Growth Factor β) dar. Dieses lokal produzierte Zytokin steht im starken Zusammenhang mit Fibrose und kardialem Remodeling. So wird im heterozygoten TGFβ-knock-out die Fibrose im alternden Herzen vermindert, eine Überexpression dagegen resultiert in verstärktem hypertrophen Myozytenwachstum und interstitieller Fibrose. [102, 103] Auch in drucküberlasteten humanen Herzen ist TGFβ signifikant hochreguliert [104]. Eine verstärkte Expression von TGFβ konnte in diesem experimentellen Setup erst an Tag 56, also bei stark eingeschränkter Herzfunktion beobachtetet werden (Anhang Tab. 7.2). Jedoch zeigte CTGF (Connctive Tissue Growth Factor) - ein entscheidendes profibrotisches Zielgen von TGFβ eine verstärkte Expression über die Zeit, die mit zunehmender Dauer der Stenose an Tag 42 und 56 nochmals stark zunahm (Abb. 3.14). CTGF scheint wesentlich für die TGFβinduzierte Kollagensynthese und beeinflusst durch Interaktion mit Integrinen und Proteoglykanen die Matrixorganisation und Zelladhäsion [105, 106]. CTGF wird Diskussion - 80 - überwiegend von Fibroblasten exprimiert, kann aber während der Prozesse des kardialen Remodelings auch von Myozyten sezerniert werden [107, 108]. So zeigen in vitro-Studien, dass CTGF als einer der ersten Wachstumsfaktoren nach hypertropher Stimulation von Myozyten transkribiert wird [109]. Da in der vorliegenden Arbeit die transkriptionellen Änderungen im Gesamtgewebe des Ventrikels betrachtet wurden, kann keine Aussage über den exprimierenden Zelltyp getroffen werden. Jedoch tritt CTGF ebenfalls als einer der ersten signifikant exprimierten Wachstumsfaktoren in dieser Analyse auf, was auch auf eine mögliche Beteiligung von TGFβ als Fibroseinitiator hinweist. 4.2.4 Differentielle Genexpression im Zeitverlauf der Erkrankung und Identifizierung potentieller Kandidatengene Die Analyse der Microarray-Daten ergab 125 verschiedene Gene, die über den gesamten Untersuchungszeitraum in den linken Ventrikeln der TAC-Tiere differenziell reguliert waren. Die Aufschlüsselung der Anzahl der regulierten Gene pro Tag zeigte, dass vor allem an Tag 4 und 56 die höchste Anzahl an Genen eine veränderte Expression aufwies, wohingegen die Änderungen des Genexpressionsmusters in den dazwischen liegenden Zeitpunkten weniger stark ausgeprägt waren (Abb. 3.6). Dieses Muster zeigte sich ebenfalls in den Herzfunktionsparametern. So konnte eine starke Verschlechterung der Herzfunktion bis Tag 14 beobachtet werden, die dann auf einem erniedrigten aber konstanten Niveau verblieb (Phase der Kompensation) und zum finalen Tag eine weitere ausgeprägte Verschlechterung aufwies. Auf Grund dessen ist anzunehmen, dass es in der ersten Phase bis Tag 4 zur Initiation der Adaption des Herzens auf die veränderten Druckverhältnissen kommt, die auf der Beteiligung vieler verschiedener Gene beruht. Die dadurch hervorgerufenen Veränderungen scheinen in der nachfolgenden Phase (Tag 14-42) dazu beizutragen, die kardiale Leistung aufrecht zu erhalten. Jedoch führt der anhaltende Stimulus der Aortenkonstriktion zu einem pathologischen Remodeling, das an Tag 56 in Dekompensation und Versagen der Pumpfunktion endet. Analog dazu konnten in dieser letzten Phase wiederum vermehrt genregulatorische Prozesse detektiert werden. Werden nur die Gene betrachtet, die zu allen Zeitpunkten stark hochreguliert wurden, so fallen insbesondere die bereits diskutierten Markergene ANP, BNP, Periostin und α-Aktin auf. Zusätzlich wurden aber auch die Gene XIRP2 (Xin actin-binding repeat containing 2), MFAP5 (Microfibrillar associated factor) sowie Thrombospondin 1 und 4 (THBS1, THBS4) Diskussion - 81 - (Tab. 3.3) über alle Zeitpunkte hinweg verstärkt exprimiert. Die Produkte dieser Gene sind vor allem mit der strukturellen Zellorganisation und Zell-Matrix-Interaktion assoziiert. Auch bei Betrachtung der Lokalisation der Genprodukte der zu den verschiedenen Phasen (Tag 4, Tag 14-42, Tag 56) regulierten Gene zeigte sich, dass die extrazelluläre Matrix den stärksten Veränderungen unterworfen ist (Abb. 3.10). Diese Aussage wird ebenfalls durch die funktionelle und physiologische Klassifizierung mittels IPA unterstützt. Die „strukturelle Zellorganisation“, die „Gewebemorphologie“, aber auch „Bindegewebe und Funktion“, waren die überrepräsentierten Kategorien in allen Phasen (Abb. 3.11/3.12). Somit scheint die Reorganisation der existierenden Gewebestrukturen einer der stärksten maladaptiven Mechanismen in der Ausbildung einer HI zu sein. Diese Umstrukturierung scheint bereits kurz nach Auftreten des pathologischen Stimulus aktiviert zu werden und sich über den gesamten Zeitraum der Krankheitsentwicklung zu erstrecken. Somit tragen vermutlich nicht nur Veränderungen der Myozytenfunktion und -struktur sondern auch die der extrazellulären Matrix zur Progression der HI bei. Neben der Untersuchung der zellulären oder pathophysiologischen Mechanismen bei der Ausbildung einer HI bestand ein Ziel der Arbeit in der Suche nach geeigneten Kandidatengenen und damit verbundenen zukünftigen Forschungsansätzen. Auf Grund der stufenförmigen Verschlechterung der Herzfunktion wurde nach Genen gefiltert, die in den verschiedenen Phasen Veränderungen in ihrer Expression aufwiesen. Als interessant erwiesen sich somit die Gene, die ähnlich den Phasen der Herzfunktion, von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI, reguliert wurden. Dementsprechend sollten markante Expressionsunterschiede zwischen der 1. (Tag 4 und 14) und der 2. Phase (Tage 2142) sowie zwischen der 2. und der 3. Phase (Tag 56) bestehen. Mit diesem Analyseansatz fielen Gene auf, die zuvor nur teilweise oder gar nicht mit der Herzinsuffizienz assoziiert wurden und nun weitergehend untersucht werden sollten. Ein Nachteil der hier durchgeführten Microarray-Analyse ist, dass gepoolte Proben der linken Ventrikel vermessen wurden und somit keine Rückschlüsse auf gruppeninterne Variationen gezogen werden können. Ob verlässliche Ergebnisse erhoben wurden, kann deshalb nur geprüft werden, indem die Expressionslevel ausgewählter Gene auf Einzeltierebene validiert werden. Hierfür kamen TaqMan Low Density Arrays (TLDA) zum Einsatz, mit Hilfe derer neben vier verschiedenen Referenzgenen auch die bereits beschriebenen Markergene und zusätzlich die hier neu ausgewählten Kandidatengene vermessen wurden (siehe Tab. 3.4). Für 43 der 44 untersuchten Genen konnten die Ergebnisse der Microarray-Analyse bestätigt werden; nur für das Transkript ND5/6 ergab sich nach RT-PCR zu einzelnen Zeitpunkten ein im Vergleich zu den Diskussion - 82 - Microarraydaten inverses Ergebnis. Auch die interindividuelle Varianz innerhalb der einzelnen Gruppen war gering, so dass die Datenerfassung mittels Microarray-Analyse als sehr verlässlich bewertet werden kann (Abb. 3.17). Neben der Validierung des Microarrays ermöglichten die TLDA-Untersuchungen auf Einzeltierebene Korrelationsanalysen zwischen der Expression einzelner Zielgene und der Herzfunktionsparameter. Auffällig dabei war, dass einige der Kandidatengene eine stärkere Korrelation mit der Herzfunktion aufwiesen als die bekannten HI-assoziierten Gene ANP und BNP, die teilweise bereits als diagnostische Marker eingesetzt werden [110]. Dabei zeigten vor allem COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) und die Gene SFRP2 (Secreted frizzled-related protein 2) und WISP2 (Wnt-1-induced signaling pathway protein 2) eine starke Korrelation. COMP, auch bekannt unter dem Namen Thrombospondin 5, ist ein matrizelluläres Protein und wurde ursprünglich im Knorpelgewebe identifiziert [111]. Es stellt einen wichtigen Faktor in der Genese der Osteoarthritis dar. Im Gegensatz zu den Thrombospondinen 1, 2 und 4 wurde ihm im Herzen bisher keine Funktion zugesprochen [112, 113]. Erst in den letzten Jahren finden sich einige wenige Studien, die COMP als einen essentiellen Modulator des vaskulären Remodelings beschreiben, jedoch gibt es zunächst nur eine Studie, die erste Hinweise auf die Bedeutung dieses Thrombospondins im insuffizienten Herzen liefert. So konnten Huang et al. zeigen, dass ein COMP knock-out in Mäusen zu einer spontanen und progressiven Ventrikeldilatation und kontraktilen Dysfunktion führt, die von ultrastrukturellen Defekten, Myozytenverlusten und MMP-Aktivierung begleitet wird. Zudem wurde in Herzbiopsien von DCM-Patienten eine geringere COMP Expression im Vergleich zu gesunden Personen festgestellt. So postulieren die Autoren, dass COMP eine essentielle Rolle während der Initiation und Progression der DCM zukommt [114, 115]. Auch in dieser Arbeit zeigten sich die stärksten Änderungen in der COMP-Expression vor allem an Tag 56, jedoch konnte im Gegensatz zu den in der Studie untersuchten DCM-Patienten in den final erkrankten Mäusen eine höhere Expressionen gemessen werden. Die COMP-Expression korrelierte dabei stark negativ mit der LVEF und zeigte hinsichtlich der linksventrikulären Volumina und der Masse eine positive Korrelation. Somit führen die hier vorliegenden Ergebnisse zu der Hypothese, dass eine steigende COMP-Expression mit einer Verschlechterung der Herzfunktion einhergeht. Trotz konträrer Aussagen über die Expression scheint dieses Gen bzw. dessen Protein eine nicht zu vernachlässigende Rolle im kardialen Krankheitsgeschehen einzunehmen und stellt einen vielversprechenden Forschungsansatz dar. Neben COMP zeigten auch die Gene SFRP2 und WISP2, als Modulatoren des Wnt- Diskussion - 83 - Signalwegs beschriebene sekretorische Proteine, eine vermehrte mRNA-Expression, deren Höhe ebenfalls stringent mit der Herzfunktion korrelierte. Das Wnt-Signaling ist in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der kardialen Forschung gerückt. Während der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie werden verschiedene Gene wie ANP (Nppa), BNP (Nppb) und β-MHC (Myh7), die normalerweise nur während der fötalen Herzentwicklung aktiviert sind, reexprimiert (Abs 1.3.3). Auch der Wnt-Signalweg spielt während der Embryonalperiode eine entscheidende Rolle, weshalb die Vermutung einer Beteiligung an pathologischen hypertrophen Prozessen nahe legt. Der Wnt-Signalweg ist eine in Eukaryoten stark konservierte Signaltransduktionskaskade, die essentiell für die Entwicklung und Embryogenese ist und u.a. die Zellproliferation, Differenzierung, Zellpolarität und Migration reguliert. Postnatales Wnt-Signaling ist in verschiedenen biologischen Prozessen der Kanzerogenese sowie in neurologischen, metabolischen und inflammatorischen Krankheiten involviert [116]. 4.2.5 Die Rolle des Wnt-Signalings bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz Die Bezeichnung Wnt setzt sich aus Wg für wingless und Int-1 zusammen. Der wingless-type beschreibt eine flügellose Variante der Drosophila melanogaster, die auf Grund von Mutationen im Wg-Gen hervorgebracht wurde. Dieses Gen weist eine starke Sequenzhomologie mit dem Int-1 Gen der Vertebraten auf, was zur Kombination beider Termini führte [117, 118]. Es können 19 verschiedene humane Wnt-Liganden unterschieden werden, die durch Interaktion mit transmembranären Frizzled-Rezeptoren komplexe Signalkaskaden aktivieren. Bei den Frizzled-Rezeptoren konnten bisher 10 verschiedene Typen identifiziert werden, deren Größen zwischen 500 und 700 Aminosäuren variieren. Der N-terminale Teil des Rezeptors besitzt eine cysteinreiche Domäne, die die Bindungsstelle für den Wnt-Liganden darstellt. Neben den Frizzeld-Rezeptoren gibt es verschiedene CoRezeptoren, wie die Lipoprotein receptor-related Proteins (LRP) 5 und 6, die eine Bindungsstelle für Axin darstellen [119, 120]. Der Wnt-Signalweg kann in drei verschiedene Signalkaskaden unterteilt werden: den kanonischen β-Catenin-abhängigen Signalweg und die nichtkanonischen Signalwege RhoA/JNK und Kalzium (Abb 4.1). Diskussion - 84 - Abb.4.1 Schematische Darstellung der Wnt-Signaltransduktionswege nach Marchetti und Pluchino [121] Es wird zwischen drei verschiedenen Wnt-Signalwegen unterteilt: den kanonischen β-Catenin abhängigen und den nicht-kanonischen Wnt/PCP und Wnt/Ca2+ Signalweg. (a) Im β-Catenin Signalweg wird in Abwesenheit eines Wnt-Liganden (oder in Anwesenheit der Wnt-Inhibitoren WIF, SFRP oder DKK) zytosolisches β-Catenin durch den adenomatous poliposis coli (APC) destruction complex–(Axin–Glycogen synthase kinase-3β (GSK3β)–Casein kinase 1 (CK1)) der proteolytischen Degradation zugeführt. Bei Aktivierung durch einen WntLigand wird über Dishevelled (Dvl) der β-Catenin-destruction complex inhibiert. β-Catenin akkumuliert im Zytoplasma, transloziert in den Zellkern und beeinflusst durch Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor die Expression von Zielgenen. (b) Beim nicht-kanonischen Wnt/Ca2+ Signalweg führt die Bindung von Wnt zu einer Fzd-vermittelten Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern und so stimulieren Ca2+-abhängige Effektormoleküle. Im nichtkanonischen Wnt/PCP-Signalweg führt die Bindung von Wnt an Fzd über RhoA, Cdc42 oder Rac1 zur Aktivierung von JNK, was in den NFAT-Signalweg mündet. Der β-Catenin-abhängige Signalweg ist der bisher am umfangreichsten charakterisierte. Ein Schlüsselmolekül dieses Signalweges ist die Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3β), die bei Abwesenheit eines Wnt-Signals einen Komplex mit Axin und APC (Adonomatous Polypolis Coli) eingeht, der als β-Catenin destruction complex bezeichnet wird. Dieser Komplex bindet an β-Catenin, welches wiederum durch GSK3β und Caseinkinase 1 (CK-1) phosphoryliert wird. Das phosphorylierte β-Catenin wird anschließend dem Proteasom zugeführt und Diskussion - 85 - degradiert, dementsprechend liegen im Zytoplasma unter basalen Bedingungen nur niedrige -Cateninspiegel vor [122]. Kommt es jedoch zur Bindung eines Wnt-Liganden an einen Frizzled-LRP5/6 Rezeptorkomplex, aktiviert dieser das nachgeschaltete Protein Dishevelled (Dvl). Dvl interagiert wiederum mit Axin und führt so zur Zerstörung des destruction complex, wodurch β-Catenin nicht mehr degradiert werden kann und im Zytoplasma akkumuliert. β-Catenin transloziert in den Zellkern und interagiert dort mit den Transkriptionsfaktoren TCF/LEF (T-cell factor/ lymphoid enhancer factor). Diese binden an die DNA und führen zur Transkription von Zielgenen wie C-MYC, Cyclin D1, WISP-1 (Wnt1-induced secreted protein 1) und IGF-1 (Insulin-like growth factor), die mit Zellproliferation, -überleben und –differenzierung assoziert sind [119, 123, 124]. Neben der Initiation von Transkriptionsfaktoren ist β-Catenin als Teil der adherens junctions im Catenin/Cadherin-Komplex für die Zellstruktur und –adhäsion von Bedeutung. Aber auch in der kardialen Hypertrophie scheint β-Catenin involviert zu sein. So konnten in Kardiomyozyten, die zuvor mit den Hypertrophie-induzierenden Stimulantien Endothelin-1 und Phenylepinephrin behandelt wurden, erhöhte β-Catenin Level nachgewiesen werden. Des Weiteren induzierte die Überexpression von β-Catenin ein hypertrophes Wachstum in diesen Zellen [125, 126]). In vivo ist die Datenlage widersprüchlich. Mäuse mit einer kardiomyoztenspezifischen Deletion von β-Catenin zeigten zwar eine geringere Hypertrophie nach TAC, wurde hingegen Angiotensin II als Stimulus eingesetzt, konnte eine gesteigerte hypertrophe Antwort beobachtet werden [127, 128]. In der hier vorliegenden Arbeit konnte allerdings keine veränderte Expression von β-Catenin in den TAC-Mäusen gefunden werden. Auch vorgeschaltete Faktoren wie Dvl und Axin zeigten keine Regulation als Antwort auf die Aortenstenose. Neben dem kanonischen β-Catenin-abhängigen Signalweg kann das Wnt-Signal auch über die Jun N-terminal Kinase (JNK) und/oder Kalzium transduziert werden. Beim Wnt/JNKSignaling, welches auch als PCP-Weg (Planar Cell Polarity) bezeichnet wird, führt die WntLiganden-Bindung zur Aktivierung der GTPasen Rac, Cdc42 und Rho, die ihrerseits die Rho Kinase (ROCK) und JNK aktivieren. Letztere reguliert über c-Jun den Transkriptionsfaktor AP-1 (Activating Protein-1), der die Transkription verschiedener Zielgene beeinflusst. Der Wnt/Kalzium Signalweg führt über Aktivierung der Phospholipase C (PLC) zur Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration, was wiederum kalziumabhängige Enzyme wie die CAMK II (Calcium/Calmodulin-dependent Kinase II), PKC (Phosphokinase C) oder Calcineurin aktiviert. Diese Enzyme regulieren unterschiedliche Transkriptionsfaktoren wie NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) und NFκB (Nuclear Factor κB) [129]. Beiden Diskussion - 86 - nicht-kanonischen Signalwegen kann ebenfalls eine Rolle in der kardialen Hypertrophie zugesprochen werden, da sie Proteine aktivieren, die auch Effektoren anderer Signalkaskaden darstellen. So resultierte die Aktivierung von JNK in vitro in einem hypertrophen Phänotyp. In vivo führte eine Überexpression zu einer letalen restriktiven Kardiomyopathie und Induktion des fötalen Genprogramms, wobei die Inaktivierung von JNK eine Hypertrophie nach TAC abschwächt [130]. Des Weiteren ist bekannt, dass Kalzium vermittelte Signalwege stark mit der Ausbildung einer HI assoziiert sind. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass eine Aktivierung von Calcineurin und NFAT eine kardiale Hypertrophie in Mäusen auslöst, wohingegen deren Inaktivierung die hypertrophe Antwort inhibierte [131]. Da diese Signalkaskaden aber über verschiedene G-Protein gekoppelte Rezeptoren und deren Agonisten aktiviert werden, bleibt der Einfluss der Frizzled-Rezeptoren bzw. der nichtkanonischen Wnt-Signalwege zunächst unklar. Neben den Wnt-Proteinen, die als Agonisten der Signalkaskade dienen, wurden bereits auch verschiedene endogene Antagonisten beschrieben. So inhibiert Dickkopf (DKK) die Formierung des Komplexes aus LRP, Frizzled und Wnt. Des Weiteren führt eine Interaktion von DKK1 und Kremen zur Internalisierung des LRP Corezeptors, was dessen Degradation bewirkt [132, 133]. Bei Betrachtung der Regulation der DKK-Familie in dem hier vorliegenden Microarray-Datenset findet sich eine erhöhte, jedoch nicht signifikante Expression des DKK3 an Tag 42 und 56 (Anhang Tab.7.5). Dies steht im Widerspruch zu jüngst veröffentlichten Daten der Gruppe um Zhang et al., die eine verminderte Expression dieses DKK-Subtyps in Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) fanden. Zudem zeigten sie, dass DKK3-k.o. Mäuse nach TAC eine verstärkte Hypertrophie, Fibrose und Dysfunktion aufwiesen, wohingegen DKK3-überexprimierende Mäuse vor kardialem Remodeling geschützt waren [134]. Somit könnte die in dieser Arbeit beobachtete verstärkte Expession des DKK3 als Schutzmechanismus gegen die fortschreitende kardiale Belastung gewertet werden. Eine weitere Gruppe von Modulatoren stellen die SFRPs (Secreted frizzled-related protein) dar. Diese sekretorischen Proteine gleichen Frizzled-Rezeptoren, jedoch fehlt ihnen die Transmembrandomäne. Sie sind in der Lage, Wnt-Proteine zu binden und konkurrieren so mit den Frizzled-Rezeptoren um die Liganden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von SFRP2 stark mit der Herzfunktion korrelierte (Abb. 3.18). Mit Zunahme der SFRP2-mRNA gingen eine verschlechterte LVEF und steigende linksventrikuläre Volumina einher. In der Literatur wurde die Wirkung von SFRP2 bisher nur in der Myokardinfarktinduzierter HI beschrieben und wies dabei gegensätzliche Effekte auf. So zeigte ein muriner Diskussion - 87 - k.o. nach einem experimentellen Myokardinfarkt eine verminderte kardiale Fibrose und verbesserte Herzfunktion [135], wurde jedoch Wildtyp-Ratten nach einem MI rekombinantes SFRP2 direkt in das Herzgewebe injiziert, wurde eine um 66% reduzierte Fibrose beobachtet [136]. Somit wurde in Mäusen bei Fehlen des SFRP2 eine Schutzwirkung beobachtet, in Ratten jedoch die positive Wirkung bei verstärktem Vorhandensein des SFRP2 dokumentiert. Dementsprechend ist bisher nicht geklärt, welche Rolle dieses Protein bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz spielt. Neben SFRP2 konnten in dieser Arbeit auch andere Mitglieder dieser Familie in den Poolproben als reguliert gefunden werden (Anhang Tab. 7.5). SFRP3 (FRZB) wies bereits nach 4 Tagen Aortenkonstriktion eine erhöhte Expression auf, die auch über alle Zeitpunkte hinweg erhalten blieb. Diese Beobachtung geht mit einer Studie konform, in der ebenfalls erhöhte Expressionslevel von SFRP3 in kardialen Biopsien von herzinsuffizienten Patienten gefunden wurden [137]. Auch die Micoarraydaten von SFRP5 und SFRP1 zeigten eine Regulation vor allem zu den späteren Zeitpunkten. Ein an Tag 56 stark exprimierter Modulator des Wnt-Signalwegs ist das WISP2. Die Expression dieses auch als CCN5 bekannten matrizellulären Proteins zeigte ebenfalls eine stringente Korrelation mit der Herzfunktion (Abb 3.18). Es konnten bereits hemmende Effekte von WISP2 auf Hypertrophie und Fibrose nach TAC demonstriert werden, doch ist die funktionelle Rolle im Herzen weitestgehend unbekannt [138]. Das Wnt-Signaling beinhaltet Signalwege hoher Komplexität, die bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Vorgängen wie beispielsweise Arthritis, Tumorgeschehen und Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle einnehmen. Auf Grund der hier vorliegenden Daten scheint auch eine Beteiligung des Wnt-Signalings an der Progression einer HI wahrscheinlich. Bisher sind diese Signalwege und dessen endogene Modulatoren im Zusammenhang mit kardiovaskulären Erkrankungen nur wenig untersucht. Somit ergeben sich hier interessante Ausgangspunkte für detaillierte Untersuchungen und mögliche Angriffspunkte für Interventionsstudien. Des Weiteren muss geprüft werden, inwieweit die Modulatoren des Wnt-Signalings das Potential haben, als prognostische Marker der Progression und/oder Therapie einer HI zu dienen. Diskussion - 88 - 4.3 Proteomanalyse nach experimenteller Aortenstenose im Zeitverlauf der Erkrankung Die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen der Genexpression im Zeitverlauf geben einen umfassenden Überblick über die transkriptionellen Veränderungen, denen das Herz während der Progression einer Herzinsuffizienz unterliegt. Eine mögliche Limitation dieser Studie ist aber, dass sich die bisher getroffenen Aussagen ausschließlich auf die mRNA bzw. Transkripte in den untersuchten Proben beziehen. Da die mRNA einer Vielzahl von posttranskriptionellen und nach Translation weiteren Modifikationen unterworfen ist, spiegelt die Transkriptmenge nicht zwangsläufig die Abundanz des von ihr kodierten Proteins wider. Da die Proteine die letztendlichen Effektoren im biologischen System sind, sollten diese gesondert untersucht werden. Hierfür wurden dieselben Herzen einer Gesamtproteomanalyse unterworfen. Dies sollte zusätzlich zum Verständnis der molekularen Prozesse bei der Ausbildung einer Herzinsuffizienz beitragen. Für die Analyse der Proteinmuster der linken und rechten Ventrikel der TAC- bzw. ShamTiere wurden die Proben gepoolt und mittels Massenpektrometer untersucht. Dabei zeigte sich, dass über die Zeit im linken Ventrikel weitaus mehr in ihrer Abundanz veränderte Proteine detektiert wurden als im rechten Ventrikel. Vor allem zu den früheren Zeitpunkten von Tag 4 bis Tag 28 unterlag der LV im Vergleich zum RV den stärksten Veränderungen (Abb. 3.20). Somit wurde die bereits in der Microarray-Analyse beobachtete weniger stark ausgeprägte Reaktion des RVs bestätigt. Betrachtet man die Anzahl der pro Zeitpunkt regulierten Proteine, so zeigte sich ein der Transkriptomanalyse konträres Bild. Die stärksten Veränderungen im Proteinmuster waren an Tag 14, 21 und 28 zu beobachten, die auf Grund der Herzfunktionsdaten der Kompensationsphase zugeschrieben wurden und nur sehr geringe Veränderung in der Genexpression aufwiesen. Dies könnte drauf hindeuten, dass bereits geringe Veränderungen der mRNA-Menge, die auf Grund des gesetzten fold changes nicht in die Analyse einflossen, relativ starke Veränderungen auf Proteinebene erzeugen. Da Veränderungen der mRNA- Stabilität durch postranskriptionelle Modifikation wie das alternative Splicing in den Transkriptionsmessungen sichtbar wären, könnte die Mehrfachtranslation eine mögliche Erklärung dafür sein. Wie bereits in Absatz 1.3.3 beschrieben, ist das kardiale Remodeling und die Progression der HI durch die Reexpression des fötalen Genprogramms gekennzeichnet. Dies war auch auf Proteinebene sichtbar. Zu den am stärksten regulierten Proteinen in beiden Ventrikeln zählten das β-MHC (MYH7), α-Aktin (ACTS) und ANP (ANF). Diese Proteine zeigten bereits an Diskussion - 89 - Tag 4 erhöhte Abundanzen im LV der TAC-Tiere, die bis Tag 56 nochmals massiv zunahmen (Abb 3.21). Hinsichtlich dieser Proteine kann die auf Transkriptionsebene beobachtete frühe Reaktion des LVs auf die Aortenkonstriktion bestätigt werden. Wird die Expression dieser Proteine im RV betrachtet, zeigt sich, wie auch schon in den Genexpressionsanalysen, die verzögerte Reaktion des rechten Ventrikels. So stieg beispielsweise die Expression von ANP erst an Tag 56, wohingegen zu früheren Zeitpunkten eine geringere Proteinmenge im Vergleich zu Sham-Tieren zu beobachten war. Da durch die Aortenstenose eine Nachlasterhöhung entsteht, ist vor allem der linke Ventrikel gezwungen, sich in einem hohen Maße an die veränderten Druckverhältnisse anzupassen, weshalb die ausgeprägte Reaktion des LV zu erwarten war. Auf Grund der verspäteten und weniger ausgeprägten Reaktion des RV wurde der Fokus für die weiterführenden Analysen auf die zeitlichen Veränderungen im linken Ventrikel gelegt. Dabei waren im LV vor allem Struktur- und Motorproteine zu allen Zeitpunkten die am stärksten in ihrer Abundanz veränderten Proteine. Die IPA-basierten Analysen bestätigten dies durch die Überrepräsentation der Signalwege „Regulation der aktinbasierten Motalität durch Rho“ und „Aktinzytosklett-Signaling“, die an allen untersuchten Tagen betroffen waren (Abb. 3.22). Wie bereits aus den Genexpressionsdaten ersichtlich wurde, scheint die Reorganisation der bestehenden Strukturen der am stärksten ausgeprägte Prozess bei der Entwicklung der HI zu sein. Auch das „Kalzium Signaling“ gehörte zu den Kategorien, die zu allen Zeitpunkten durch die regulierten Proteine überrepräsentiert wurden. Die bei diesen Proteinen auftretenden Veränderungen haben vermutlich eine Störung der Kalziumhomöostase zur Folge, die auch einen charakteristischen pathologischen Prozess im Remodeling darstellt und zur kontraktilen Dysfunktion und Arrhythmien führt. Im Vergleich zur Genxpression konnte in den Proteomanalysen auch eine Regulation der bereits mit HI assoziierten kalziumabhängigen Kinasen Calcineurin (CANB) und Calmodulin (KCC1A) beobachtet werden, deren Expressionen mit prohypertrophen Prozessen in Zusammenhang stehen [139, 140]. Des Weiteren wurde eine Vielzahl der zu den frühen Zeitpunkten (Tag 4, 14, 21) regulierten Proteine den PLC (Phopholipase C)- und PKA (Proteinkinase A)- Signalwegen zugordnet. Jedoch sind diese Signalwege durch verschiedenste Stimulantien induzierbar und mit diversen Signalwegen verknüpft. So ist die PLC ein Element der G-protein gekoppelten Signaltransduktion und die PKA ein cAMP-abhängiger Effektor z.B. im Kalzium Signaling. Auffällig war, dass vor allem zu den späteren Zeitpunkten an Tag 42 und 56, also am Ende der Kompensationsphase zum Übergang in die Dekompensation die Signalwege des Diskussion - 90 - Energiemetabolismus wie der „Pentosephosphatweg“, „Galaktosemetabolismus“ oder der „oxidativen Phosphorylierung“ eine starke Beteiligung zeigten. Während der Progression einer HI kommt es zu einem tiefgreifenden Wandel in Struktur und Funktion, die einen hohen Energieaufwand und starke metabolische Veränderungen bedeuten. Auf Grund dessen muss angenommen werden, dass der Energiegewinnung eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der HI zugeschrieben werden muss. Unter normalen Bedingungen wird über 95% des ATPs im Herzen durch oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien generiert und durch die kontinuierliche mechanische Arbeit in hohem Maße wieder hydrolysiert. Da der hochenergetische Phosphatpool im Herzen relativ klein und damit nach wenigen Sekunden erschöpft ist, hängt die Herzleistung stark von der ATP-Produktion ab, so dass Beeinträchtigungen in diesem Prozess schnell zur kontraktilen Dysfunktion führen können [141]. Metabolisches Remodeling in der HI ist durch eine verminderte kardiale Energieproduktion charakterisiert, die womöglich aus einer eingeschränkten Substratnutzung und mitochondrialen Funktion resultiert. Die Frage, ob die Umstellung des Substratmetabolismus protektiv oder maladaptiv im insuffizienten Herzen ist, bleibt jedoch nach wie vor unbeantwortet [142]. Die Analyse der Gen- und auch der Proteinexpression zeigte eine Beteiligung vieler molekularer und zellulärer Mechanismen, die dem kardialen Remodeling zugrunde liegen. Dabei waren die Veränderung des Genexpression- und Proteinmusters im linken Ventrikel deutlich stärker und früher ausgeprägt als im rechten Ventrikel. Bereits kurz nach Induktion der Drucküberlastung konnten bekannte Merkmale der HI wie Fibrose oder die Reinduktion des fötalen Genprogramms im linken Ventrikel beobachtet werden. Da für die Analysen das gesamte ventrikuläre Gewebe genutzt wurde, kann hier jedoch nicht zwischen den verschiedenen kardialen Zelltypen differenziert werden. Die vermehrte Regulation von matrizelluären-, Struktur- und Motorproteinen bzw. Genen deutet darauf hin, dass die Reorganisation der existierenden Gewebestrukturen einer der stärksten maladaptiven Mechanismen bei der Ausbildung einer HI ist. Die hier vorliegende Arbeit bietet somit einen umfassenden Überblick über die zeitabhängigen Veränderungen auf Transkriptom- und Proteomebene während des kardialen Remodelings bis hin zur manifesten Herzinsuffizienz. Es konnte eine valide Datenbank erstellt werden, die eine Grundlage für bestehende und potentiell neue Forschungsansätze in der Aufklärung der zugrundeliegenden druckinduzierten Herzinsuffizienz darstellt. Mechanismen bei der Ausbildung einer Zusammenfassung 5. - 91 - Zusammenfassung Noch immer stellen kardiovaskuläre Erkrankungen in den Industrienationen die häufigste Todesursache dar. Sie haben somit sowohl eine große medizinische als auch ökonomische Bedeutung. Die Herzinsuffizienz (HI) wird als eine Abnormität der Herzstruktur oder Herzfunktion bezeichnet, die zum Unvermögen des Herzens führt, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern. Sie stellt das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Hierbei können unterschiedliche Auslöser wie beispielsweise eine koronare Herzerkrankung, arterielle Hypertonie, kardiale Inflammation und Diabetes mellitus bis zum akuten Herzversagen führen. Der Krankheitsverlauf ist durch ein ausgeprägtes Wechselspiel zwischen Herzfunktion, Kreislauf, Nierenfunktion und zentral-hormonellen Veränderungen gekennzeichnet und führt zunächst zur Steigerung der Herzfrequenz, Inotropie, Vor- und Nachlast. Dies dient dazu, eine ausreichende linksventrikuläre Funktion in einem physiologischen Rahmen aufrecht zu erhalten und wird als kompensierte Hypertrophie bezeichnet. Hält die Aktivierung jedoch über einen längeren Zeitraum an, so münden diese Veränderungen in eine Myozytenschädigung, Fibrose und Ventrikeldilatation, was mit einer progredienten Verschlechterung dementsprechend schlechter der Prognose Pumpfunktion einhergeht. So (dekompensierte HI) versterben optimierter trotz und medikamentöser Therapien über 50 % der Patienten mit dieser Erkrankung innerhalb der ersten fünf Jahre nach Diagnosestellung. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse an neuen Biomarkern, die bereits im subklinischen Stadium eine Prognose über den Krankheitsverlauf bzw. einen frühzeitigen Therapiebeginn noch vor Auftreten einer Myokardschädigung ermöglichen würden. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA- und Proteinebene während der Progression der Herzinsuffizienz. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Zusammenfassung - 92 - Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Shamoperierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern LVM (linksventrikuläre Masse) und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina (LVESV, LVEDV) beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und Herzinsuffizienzmarker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (α-Aktin), Myh7 (β-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HIassoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNAExpression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (βMyosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Zusammenfassung - 93 - Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKC-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren. Somit konnte mit Hilfe dieser Arbeit eine valide Datenbank geschaffen werden, die die zeitabhängigen Veränderungen auf Transkriptom- und Proteomebene bei der Ausbildung einer druckinduzierten HI beschreibt und Ausgangspunkt weiterer Untersuchungen sein wird. Literaturverzeichnis 94 6. Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 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Eidesstattliche Erklärung 101 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe. Greifswald, 25.06.2014 Julia Rüdebusch Danksagung 102 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Stephan B. Felix aus der Klinik für Innere Medizin B für die Möglichkeit zur Anfertigung der Dissertation und Herrn Prof. Dr. Uwe Völker aus dem Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung für die erfolgreiche Zusammenarbeit und Begutachtung dieser Arbeit. Dr. Karina Grube möchte ich ganz herzlichen für die Unterstützung, die stete Bereitschaft zu wissenschaftlichen Diskussionen und ihrer Freundschaft danken. Ich bedanke mich auch bei Herrn Alexander Benkner der im Rahmen seiner Diplomarbeit die Proteomanalyse der vielen Proben durchgeführt hat. Desweitern gilt mein Dank auch Frau Dr. Sabine Ameling, Frau Dr. Elke Hammer und ihren Mitarbeitern aus dem Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung für die stets gute Zusammenarbeit. Auch bei Herrn Pösch und Herrn Stefan Hadlich möchte ich mich für die MRT-Messungen und die vielen lustigen Stunden im MRT bedanken. Ein Dank geht auch an Frau Dr. Silvia Ribback und ihren Mitarbeitern aus dem Institut für Pathologie für das Anfertigen und Färben der histolgischen Schnitte. Ich bedanke mich bei der gesamten Arbeitsgruppe „Molekularen Kardiologie“ für das freundliche Arbeitsklima. Insbesondere Frau Dr. Yvonne Reinke und Frau Dr. Jeannine Witte für den experimentellen Erfahrungsaustausch, die interessanten Diskussionen und das gute Essen. Desweitern bedanke ich mich bei meinen Freunden, vor allem meinen Mädels Jule, Viv und Susi für die schönen Stunden außerhalb des Laboralltags. Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, die mich in guten und in schweren Tagen immer unterstütz, aufgemuntert und nie allein gelassen haben. Anhang 103 7. Anhang Microarray-Analysen der gepoolten linken (LV) und rechten Ventrikel (RV) unter basalen Bedingungen (LV vs. RV) Tab 7.1 Vergleich der Genexpression der linken und rechten Ventrikel unoperierter basline-Tiere Unter basalen Bedingungen konnten lediglich 9 Gene als differentiell exprimiert (LV vs. RV, mind. 2-fach Änderung, p<0,05 (Rosetta Resolver Error Model)) nachgewiesen werden. Gen Symbol Annotiation Nppb Acta1 Ptgds Myl4 Ppbp H19 Myl7 Alb Mup1 natriuretic peptide type B actin, alpha 1, skeletal muscle prostaglandin D2 synthase 21kDa (brain) myosin, light chain 4, alkali; atrial, embryonic pro-platelet basic protein (chemokine (C-X-C motif) ligand 7) H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding) myosin, light chain 7, regulatory albumin major urinary protein 1 Entrez gene ID 18158 11459 19215 17896 57349 14955 17898 11657 17840 fold change (LV vs. RV) 4,15 2,90 2,20 -2,17 -2,51 -2,57 -2,62 -3,18 -5,16 p-Wert 0,0012 0,0042 0,0235 0,0236 0,0125 0,0438 0,0194 0,0057 0,0046 Anhang 104 Microarray-Analysen der linken und rechten Ventrikel nach transverser Aortenkonstriktion (TAC vs. Sham) Tab 7.2 Differentiell exprimierte Gene im linken Ventrikel nach transverser Aortenkonstriktion (TAC) Nach Vorrausetzung einer differentiellen Expression an mindestens einem Zeitpunkt nach transverser Aortenkonstriktion (TAC vs. Sham, mind. 2-fach Änderung, p<0,05 (Rosetta Resolver Error Model)), zeigten im linken Ventrikel 125 Gene eine Expressionsänderung. Dargestellt sind die fold changes (fc) (TAC vs. Sham) und der enstprechende p-Wert an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42 und 56. 4d 14d 21d 28d 42d 56d Entrez gene ID fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 223513 1,46 0,286 1,40 0,333 1,59 0,179 1,91 0,077 2,29 0,028 2,39 0,018 11421 1,45 0,298 1,76 0,120 1,77 0,113 1,78 0,114 1,75 0,126 2,08 0,046 Acta1 actin-binding Rho activating protein angiotensin I converting enzyme (peptidyldipeptidase A) 1 actin, alpha 1, skeletal muscle 11459 3,60 0,001 3,94 0,000 5,04 0,000 4,30 0,000 3,85 0,000 4,55 0,000 Adamtsl2 ADAMTS-like 2 77794 1,61 0,349 2,40 0,085 2,42 0,083 2,51 0,084 3,55 0,034 3,18 0,025 Alb albumin 11657 1,01 0,989 1,09 0,825 1,31 0,627 -8,25 0,000 6,18 0,001 -1,93 0,120 Angptl7 angiopoietin-like 7 654812 -1,14 0,804 2,34 0,086 1,88 0,178 3,17 0,034 3,17 0,039 1,22 0,660 Ankrd23 ankyrin repeat domain 23 78321 1,77 0,071 1,50 0,192 1,51 0,176 1,85 0,056 1,58 0,141 2,48 0,008 Anxa2 annexin A2 12306 2,13 0,044 1,46 0,294 1,46 0,301 1,35 0,410 1,19 0,639 1,85 0,087 Apoa1 apolipoprotein A-I 11806 -1,22 0,739 1,09 0,883 1,35 0,658 -4,33 0,012 1,43 0,512 -1,14 0,829 Apod apolipoprotein D 11815 -1,03 0,935 1,77 0,164 2,06 0,075 1,68 0,249 1,50 0,369 2,74 0,016 Aqp8 aquaporin 8 11833 1,49 0,592 1,68 0,476 2,62 0,158 2,30 0,193 2,04 0,264 4,30 0,019 Aspn asporin 66695 1,51 0,258 1,92 0,065 1,74 0,124 1,96 0,086 1,67 0,187 2,25 0,033 Bgn biglycan 12111 1,75 0,076 1,85 0,052 1,84 0,055 1,87 0,051 1,96 0,038 2,52 0,007 Casq1 calsequestrin 1 (fast-twitch, skeletal muscle) 12372 2,48 0,044 1,60 0,286 1,80 0,207 1,50 0,428 1,59 0,413 -1,29 0,610 Ccna2 cyclin A2 12428 5,30 0,011 1,85 0,323 1,62 0,447 1,28 0,721 1,86 0,429 1,58 0,490 Ccnb1 cyclin B1 268697 6,06 0,041 1,66 0,547 1,70 0,546 -1,30 0,769 -1,02 0,985 1,51 0,645 Ccnb2 cyclin A2 12442 3,53 0,028 1,55 0,404 1,67 0,344 1,05 0,926 1,14 0,822 1,96 0,285 Ces1d carboxylesterase 1D 104158 -1,90 0,107 -3,12 0,009 -2,44 0,030 -2,79 0,019 -3,53 0,007 -5,70 0,001 Cfh complement factor H 12628 -1,39 0,314 1,27 0,458 1,10 0,765 1,33 0,381 1,37 0,347 2,08 0,033 Gen Symbol Annotiation Abra Ace Anhang Gen Symbol 105 Annotiation 4d 14d 21d 28d 42d 56d Entrez gene ID fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 214425 3,18 0,078 3,86 0,045 2,86 0,090 2,87 0,112 3,37 0,098 6,76 0,002 Col14a1 cartilage intermediate layer protein, nucleotide pyrophosphohydrolase collagen, type XIV, alpha 1 12818 1,77 0,229 1,86 0,221 2,00 0,152 2,04 0,181 1,52 0,463 2,77 0,046 Col15a1 collagen, type XV, alpha 1 12819 2,73 0,027 2,10 0,080 1,90 0,131 1,61 0,258 1,84 0,174 2,22 0,065 Col1a1 collagen, type I, alpha 1 12842 2,65 0,018 2,26 0,051 1,79 0,149 1,96 0,094 1,73 0,182 2,83 0,014 Col1a2 collagen, type I, alpha 2 12843 2,28 0,046 2,19 0,066 1,74 0,185 1,72 0,189 1,81 0,174 2,47 0,032 Col3a1 collagen, type III, alpha 1 12825 2,61 0,024 2,11 0,082 1,68 0,227 1,86 0,160 1,62 0,281 2,30 0,059 Col8a1 collagen, type VIII, alpha 1 12837 4,28 0,002 3,76 0,002 3,42 0,004 3,09 0,011 3,30 0,009 5,29 0,001 Comp cartilage oligomeric matrix protein 12845 1,04 0,952 1,79 0,415 1,37 0,621 1,58 0,483 1,75 0,413 4,87 0,009 Cpxm2 carboxypeptidase X (M14 family), member 2 55987 1,15 0,801 1,58 0,349 1,74 0,243 1,90 0,203 2,49 0,060 2,54 0,038 Ctgf connective tissue growth factor 14219 1,95 0,043 2,11 0,026 1,96 0,041 1,96 0,040 2,49 0,008 3,32 0,001 Egr2 early growth response 2 13654 2,68 0,062 2,12 0,142 2,01 0,146 1,63 0,343 1,71 0,300 2,91 0,034 Emp1 epithelial membrane protein 1 13730 2,82 0,007 2,69 0,008 2,23 0,027 1,87 0,077 2,56 0,013 3,31 0,002 Enah enabled homolog (Drosophila) 13800 1,45 0,293 1,37 0,367 1,45 0,290 1,58 0,202 1,86 0,093 2,24 0,028 Enpp1 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 18605 2,35 0,085 2,33 0,076 1,85 0,201 1,49 0,444 2,02 0,191 2,94 0,028 Fbln2 fibulin 2 14115 1,86 0,090 1,53 0,233 1,83 0,101 1,61 0,181 1,81 0,104 2,23 0,029 Fbn1 fibrillin 1 14118 2,65 0,014 2,18 0,047 2,07 0,059 1,99 0,090 2,02 0,094 3,07 0,007 Fgl2 fibrinogen-like 2 14190 1,69 0,178 1,42 0,365 1,38 0,413 1,13 0,770 1,59 0,305 2,63 0,021 Fhl1 four and a half LIM domains 1 14199 2,53 0,010 2,15 0,028 1,84 0,070 1,62 0,157 1,96 0,055 2,43 0,013 Fibin fin bud initiation factor homolog (zebrafish) 67606 1,55 0,451 2,85 0,048 3,03 0,051 2,08 0,173 2,05 0,253 2,54 0,084 Flnc filamin C, gamma 68794 1,88 0,067 1,39 0,327 1,53 0,208 1,53 0,210 1,51 0,223 2,01 0,043 Fmod fibromodulin 14264 1,23 0,731 1,72 0,409 1,23 0,707 1,41 0,525 1,41 0,570 3,20 0,038 Fn1 fibronectin 1 14268 2,32 0,027 2,17 0,041 2,19 0,040 1,84 0,115 1,78 0,157 3,50 0,003 Frzb frizzled-related protein 20378 1,89 0,286 2,94 0,080 2,41 0,129 1,50 0,547 1,77 0,338 3,04 0,045 Fstl1 follistatin-like 1 14314 2,68 0,009 2,55 0,012 2,39 0,018 1,88 0,086 1,94 0,081 3,35 0,002 Fut11 fucosyltransferase 11 (alpha (1,3) fucosyltransferase) 73068 1,65 0,396 -1,03 0,973 1,09 0,914 -1,68 0,315 1,07 0,887 -4,12 0,016 Fxyd5 FXYD domain containing ion transport regulator 5 18301 1,57 0,164 1,69 0,106 1,54 0,174 1,50 0,206 1,66 0,116 2,65 0,007 Fxyd6 FXYD domain containing ion transport regulator 6 group-specific component (vitamin D binding protein) 59095 1,19 0,645 1,29 0,492 1,33 0,428 1,33 0,445 1,55 0,247 2,28 0,030 14473 -1,31 0,717 1,06 0,939 1,46 0,673 -3,60 0,041 1,51 0,540 -1,50 0,563 Cilp Gc Anhang 106 Gen Symbol Annotiation Entrez gene ID Hbegf heparin-binding EGF-like growth factor Hist1h2ad histone cluster 1, H2ad Hist1h2bb Hist1h2bk 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 15200 1,42 0,412 1,29 0,534 1,42 0,395 1,60 0,263 1,62 0,285 2,87 0,017 319165 2,41 0,011 1,54 0,177 1,46 0,234 1,44 0,246 1,36 0,335 1,31 0,396 histone cluster 2, H2be 319178 3,72 0,023 -1,02 0,977 1,40 0,574 1,25 0,658 -1,23 0,695 1,48 0,521 histone cluster 1, H2bk 319184 2,16 0,029 1,39 0,319 1,48 0,245 1,19 0,585 1,14 0,692 1,41 0,307 Hist1h2bl histone cluster 1, H2bl 319185 2,16 0,028 1,32 0,399 1,48 0,239 1,23 0,523 1,12 0,734 1,40 0,309 Hist1h3a histone cluster 1, H3a 360198 2,54 0,007 1,45 0,236 1,52 0,190 1,39 0,290 1,36 0,344 1,51 0,200 Hist2h2be histone cluster 2, H2be 319190 2,21 0,025 1,38 0,328 1,46 0,258 1,18 0,601 1,25 0,506 1,45 0,274 Hist2h3c histone cluster 2, H3c 319148 2,63 0,006 1,47 0,222 1,56 0,167 1,33 0,357 1,35 0,348 1,58 0,156 Hspa1a heat shock 70kDa protein 1A 193740 1,01 0,989 1,08 0,856 -1,03 0,940 1,26 0,568 1,30 0,534 2,61 0,022 Igfbp3 insulin-like growth factor binding protein 3 16009 -1,05 0,901 1,34 0,471 1,16 0,711 1,29 0,542 1,11 0,803 2,71 0,016 Inmt indolethylamine N-methyltransferase 21743 -3,40 0,014 -1,52 0,265 -1,36 0,431 -1,50 0,313 -2,38 0,054 -2,40 0,041 Itgbl1 integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains) 223272 1,59 0,374 2,07 0,147 2,28 0,107 2,89 0,046 3,22 0,038 4,00 0,007 Kif5b kinesin family member 5B 16573 1,20 0,585 1,01 0,970 1,30 0,441 1,17 0,660 1,40 0,347 2,06 0,042 Lcn2 lipocalin 2 16819 -1,11 0,778 1,03 0,932 1,48 0,270 1,33 0,481 -1,31 0,504 2,33 0,030 Lgals3 lectin, galactoside-binding, soluble, 3 16854 1,45 0,478 1,27 0,669 1,04 0,941 1,12 0,828 1,23 0,699 3,06 0,024 Lox lysyl oxidase 16950 3,82 0,020 2,10 0,211 2,53 0,117 1,40 0,620 1,33 0,680 7,63 0,001 Loxl1 lysyl oxidase-like 1 16949 2,28 0,050 2,06 0,085 1,75 0,170 1,57 0,288 1,71 0,211 2,56 0,026 Loxl2 lysyl oxidase-like 2 94352 3,14 0,023 1,84 0,207 2,30 0,109 2,13 0,172 1,75 0,308 2,51 0,058 Loxl3 16950 1,47 0,503 1,46 0,524 1,57 0,453 1,05 0,932 1,65 0,427 3,42 0,030 16997 1,57 0,461 2,28 0,202 1,45 0,516 1,66 0,393 2,14 0,222 4,67 0,009 Lum lysyl oxidase-like 3 latent transforming growth factor beta binding protein 2 lumican 17022 1,44 0,314 1,97 0,061 1,81 0,105 2,36 0,032 1,78 0,144 1,65 0,170 Meox1 mesenchyme homeobox 1 17285 2,60 0,112 1,73 0,343 1,82 0,295 1,62 0,451 2,27 0,189 3,98 0,018 Mest mesoderm specific transcript homolog (mouse) 17294 3,03 0,048 1,43 0,434 1,29 0,626 1,18 0,779 1,24 0,737 1,51 0,427 Mfap4 microfibrillar-associated protein 4 76293 2,34 0,062 3,28 0,008 2,77 0,016 2,46 0,047 3,62 0,009 4,23 0,003 Mfap5 microfibrillar associated protein 5 50530 2,66 0,011 3,29 0,003 3,04 0,004 2,00 0,054 3,10 0,005 4,28 0,001 Mgp matrix Gla protein 17313 1,07 0,826 2,03 0,041 1,43 0,278 1,32 0,402 1,49 0,234 2,10 0,033 Mki67 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 17345 3,80 0,045 1,28 0,711 1,55 0,474 1,17 0,807 1,09 0,908 1,42 0,598 Mup1 major urinary protein 1 17840 2,97 0,021 1,23 0,458 4,61 0,015 -18,47 0,000 3,65 0,003 -1,11 0,792 Ltbp2 Anhang 107 Gen Symbol Annotiation Entrez gene ID Mup4 major urinary protein 1 Myh7 myosin, heavy chain 7, cardiac muscle, beta Myl4 Myl7 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 17843 2,61 0,044 1,31 0,679 4,91 0,118 -16,53 0,000 3,91 0,038 -1,10 0,833 140781 2,51 0,017 2,86 0,011 3,00 0,009 3,79 0,002 1,97 0,068 7,43 0,000 myosin, light chain 4, alkali; atrial, embryonic 17896 -2,10 0,035 1,42 0,330 -1,50 0,236 -1,33 0,406 1,68 0,137 1,42 0,300 myosin, light chain 7, regulatory 17898 -3,18 0,013 1,28 0,634 -2,07 0,123 -1,51 0,417 1,22 0,684 1,16 0,747 Mylk4 myosin light chain kinase family, member 4 238564 -1,47 0,237 -1,85 0,069 -1,44 0,269 -1,69 0,126 -1,52 0,215 -2,23 0,026 Myot myotilin 58916 1,08 0,820 1,66 0,138 1,49 0,228 2,15 0,037 1,89 0,068 2,17 0,027 Nd6 NADH dehydrogenase, subunit 6 (complex I) 17722 1,49 0,248 1,14 0,806 2,10 0,134 -1,40 0,381 -1,25 0,540 -2,26 0,022 Nmrk2 nicotinamide riboside kinase 2 69564 3,84 0,013 1,60 0,382 2,09 0,188 1,33 0,601 1,60 0,383 4,63 0,005 Nppa natriuretic peptide A 230899 2,48 0,007 3,57 0,001 4,33 0,000 3,09 0,002 2,64 0,005 4,51 0,000 Nppb natriuretic peptide type B 18158 2,91 0,003 2,10 0,023 2,02 0,030 2,31 0,013 2,23 0,016 2,38 0,010 Nuak1 77976 1,44 0,323 1,67 0,154 1,70 0,145 2,08 0,053 1,87 0,099 2,53 0,015 69564 1,47 0,605 2,63 0,191 2,56 0,156 1,84 0,357 1,44 0,606 4,29 0,024 Pcolce NUAK family, SNF1-like kinase, 1 peptidase domain containing associated with muscle regeneration 1 procollagen C-endopeptidase enhancer 18542 1,97 0,052 1,73 0,121 1,97 0,058 1,60 0,175 1,59 0,184 2,02 0,044 Penk proenkephalin 18619 -1,80 0,235 -1,58 0,304 -2,14 0,112 -1,59 0,329 -2,00 0,158 -5,06 0,005 Pla2g5 phospholipase A2, group V 18784 -1,61 0,189 -2,60 0,019 -1,87 0,093 -2,00 0,061 -1,89 0,081 -3,03 0,007 Postn 50706 6,40 0,000 4,71 0,000 4,73 0,000 4,71 0,000 4,28 0,001 11,29 0,000 57349 -2,27 0,026 -2,50 0,031 -1,24 0,505 -2,95 0,011 -1,08 0,842 -2,96 0,008 96875 1,72 0,209 2,11 0,130 2,03 0,094 2,49 0,048 2,01 0,139 5,50 0,001 19225 3,65 0,030 2,69 0,087 2,78 0,070 1,88 0,227 1,70 0,326 2,78 0,056 Rcan1 periostin, osteoblast specific factor pro-platelet basic protein (chemokine (C-X-C motif) ligand 7) proteoglycan 4 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) regulator of calcineurin 1 54720 1,84 0,096 1,40 0,354 1,60 0,190 1,55 0,240 2,31 0,033 2,91 0,006 Rnu73b U73B small nuclear RNA 19871 -1,04 0,921 -1,39 0,416 -1,15 0,725 1,01 0,981 -3,69 0,006 -1,85 0,428 Rny1 RNA, Ro-associated Y1 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3 serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator inhibitor type 1), member 1 serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 antiplasmin, pigment epithelium derived factor), 1 19872 -1,17 0,648 -1,02 0,946 1,08 0,820 -1,22 0,527 -1,88 0,066 -2,04 0,045 20700 -1,21 0,833 1,01 0,989 1,17 0,879 -7,17 0,009 2,62 0,231 -1,75 0,484 - 1,01 0,966 2,12 0,051 1,88 0,064 1,93 0,082 1,40 0,379 6,24 0,000 18787 2,06 0,039 1,49 0,227 1,77 0,090 1,89 0,060 1,78 0,086 3,19 0,002 20317 1,79 0,136 2,16 0,044 2,10 0,051 1,91 0,096 2,08 0,065 3,08 0,006 Pamr1 Ppbp Prg4 Ptgs2 Serpina1 Serpina3 Serpine1 Serpinf1 Anhang 108 Gen Symbol Annotiation Entrez gene ID Sfrp1 secreted frizzled-related protein 1 Sfrp2 secreted frizzled-related protein 2 Snora28 Snora3 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 20377 1,36 0,516 1,59 0,337 1,99 0,138 1,55 0,411 1,17 0,765 2,77 0,029 20319 1,22 0,688 2,01 0,178 2,24 0,103 1,36 0,547 1,43 0,437 2,49 0,048 small nucleolar RNA, H/ACA box 28 100316932 -1,12 0,775 -1,06 0,876 1,02 0,954 -1,25 0,579 -3,48 0,014 -1,73 0,185 small nucleolar RNA, H/ACA box 3 100302499 -1,63 0,139 -1,71 0,106 -1,30 0,409 -1,90 0,052 -2,06 0,034 -1,35 0,355 Snord22 small nucleolar RNA, C/D box 22 83673 1,13 0,796 -1,08 0,848 -1,03 0,953 -1,14 0,717 -2,29 0,037 -2,46 0,058 Snord33 small nucleolar RNA, C/D box 33 27208 1,05 0,903 -1,29 0,514 1,03 0,950 -1,15 0,739 -3,47 0,011 -1,80 0,153 Snord53 small nucleolar RNA, C/D box 53 100217456 1,63 0,454 -1,03 0,964 1,11 0,857 1,08 0,892 -2,78 0,048 -1,43 0,558 Sparc secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) 20692 1,87 0,047 1,76 0,070 1,80 0,060 1,66 0,102 1,74 0,076 2,20 0,016 Spp1 secreted phosphoprotein 1 20750 11,17 0,004 2,28 0,402 1,30 0,788 1,28 0,813 2,01 0,511 11,94 0,002 Sprr1a small proline-rich protein 1A 20753 3,55 0,043 2,39 0,197 2,12 0,305 1,28 0,715 1,13 0,847 9,65 0,001 Stmn1 stathmin 1 16765 2,70 0,024 1,35 0,457 1,30 0,518 -1,06 0,889 1,08 0,867 -1,11 0,799 Svep1 sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain containing 1 64817 1,44 0,404 2,08 0,100 2,29 0,061 2,41 0,072 2,02 0,149 3,05 0,013 Tfrc transferrin receptor (p90, CD71) 22042 2,16 0,049 -1,05 0,901 1,64 0,222 1,59 0,392 1,31 0,625 1,47 0,400 Tgfb2 transforming growth factor, beta 2 21808 1,44 0,487 1,56 0,381 1,58 0,372 1,11 0,841 1,49 0,483 2,91 0,043 Thbs1 thrombospondin 1 21825 3,71 0,002 2,19 0,047 2,32 0,031 2,46 0,027 4,57 0,001 3,50 0,003 Thbs4 thrombospondin 4 21828 2,94 0,037 3,28 0,025 2,66 0,053 2,14 0,140 2,10 0,149 8,23 0,000 Timp1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 21857 11,93 0,000 3,99 0,020 4,15 0,014 2,43 0,140 3,24 0,101 11,86 0,000 Tnc 21923 10,25 0,003 2,56 0,239 1,73 0,508 1,14 0,870 -1,15 0,863 3,01 0,186 27279 2,29 0,030 1,58 0,211 1,85 0,091 1,85 0,095 2,26 0,030 2,63 0,012 TP53I11 tenascin C tumor necrosis factor receptor superfamily, member 12A tumor protein p53 inducible protein 11 277414 1,53 0,249 1,32 0,412 1,44 0,290 1,37 0,388 1,30 0,476 2,46 0,017 Uck2 uridine-cytidine kinase 2 80914 2,76 0,007 1,98 0,050 2,48 0,013 1,77 0,105 1,94 0,066 3,85 0,001 Vcan versican 13003 2,77 0,027 2,50 0,055 2,15 0,087 2,01 0,156 2,71 0,054 4,02 0,005 Wisp2 WNT1 inducible signaling pathway protein 2 22403 1,61 0,294 1,96 0,136 2,22 0,085 2,24 0,072 1,79 0,195 3,42 0,007 Xirp2 xin actin-binding repeat containing 2 241431 2,02 0,033 2,40 0,010 2,28 0,014 2,32 0,016 2,24 0,020 3,02 0,002 Tnfrsf12a Anhang 109 Tab 7.3 Differentiell exprimierte Gene im rechten Ventrikel nach transverser Aortenkonstriktion (TAC) Nach Vorrausetzung einer differentiellen Expression an mindestens einem Zeitpunkt nach transverser Aortenkonstriktion (TAC vs. Sham, mind. 2-fach Änderung, p<0,05 (Rosetta Resolver Error Model)), zeigten im rechten Ventrikel 93 Gene eine Expressionsänderung. Dargestellt sind die fold changes (fc) (TAC vs. Sham) und der enstprechende p-Wert an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42 und 56. Gen Symbol Annotiation 2210407C 18Rik Abra RIKEN cDNA 2210407C18 gene Entrez gene ID 4d 14d fc p-Wert fc 78354 3,33 0,009 actin-binding Rho activating protein 223513 1,41 0,348 Acta1 actin, alpha 1, skeletal muscle 11459 3,16 Ahsg alpha-2-HS-glycoprotein 11625 -4,62 Alb albumin 11657 Aldo2 aldolase B, fructose-bisphosphate Ambp Ankrd1 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert -1,31 pWert 0,547 -1,06 0,910 -1,07 0,890 1,56 0,474 -1,38 0,538 1,30 0,456 1,79 0,145 1,56 0,232 2,08 0,070 2,67 0,009 0,003 4,45 0,000 5,42 0,000 5,55 0,000 4,44 0,000 6,79 0,000 0,003 -1,36 0,561 -1,07 0,908 -1,34 0,596 1,31 0,610 -1,23 0,668 -12,49 0,000 -1,24 0,550 -1,72 0,410 -1,64 0,180 6,40 0,000 -3,50 0,003 230163 -3,95 0,015 -1,69 0,368 -2,22 0,175 -2,01 0,222 -1,55 0,386 -4,01 0,017 alpha-1-microglobulin/bikunin precursor 11699 -4,63 0,038 1,06 0,948 1,06 0,950 1,01 0,994 -1,12 0,883 -1,33 0,759 ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle) 107765 2,09 0,023 2,20 0,015 2,22 0,015 2,20 0,016 1,99 0,031 2,34 0,010 Ankrd23 ankyrin repeat domain 23 78321 1,82 0,067 1,96 0,040 1,87 0,057 2,22 0,019 2,32 0,015 2,72 0,005 Apoa1 apolipoprotein A-I 11806 -11,39 0,000 -1,14 0,812 -1,05 0,944 -1,55 0,397 2,78 0,045 -2,33 0,122 Apoa2 apolipoprotein A-II 11807 -8,41 0,000 1,21 0,729 -1,10 0,877 -1,47 0,436 1,26 0,640 -1,49 0,438 Apob apolipoprotein B (including Ag(x) antigen) 238055 -5,52 0,025 -1,01 0,991 1,14 0,880 -1,13 0,879 1,13 0,874 -1,35 0,723 Apoc1 apolipoprotein C-I 11812 -5,80 0,007 -1,10 0,908 -1,10 0,917 -1,44 0,625 1,94 0,352 -1,49 0,602 Apoc3 apolipoprotein C-III 11814 -6,23 0,002 -1,25 0,738 1,30 0,718 -1,44 0,550 2,24 0,178 -1,85 0,352 Apoh apolipoprotein H (beta-2-glycoprotein I) 11818 -4,69 0,046 -1,12 0,912 1,28 0,808 -1,11 0,919 1,23 0,810 -1,16 0,889 Apold1 apolipoprotein L domain containing 1 381823 1,30 0,418 1,57 0,179 2,38 0,020 1,47 0,247 1,58 0,210 2,00 0,047 Ca3 carbonic anhydrase III, muscle specific 12350 -6,50 0,001 1,71 0,246 -2,71 0,090 -1,08 0,841 1,70 0,241 -1,02 0,954 Ces1b/Ces 1c Ces1d carboxylesterase 1C 13884 -10,37 0,006 -1,23 0,857 1,55 0,691 -1,06 0,959 1,12 0,910 -1,76 0,602 carboxylesterase 1D 104158 -1,31 0,424 -1,51 0,226 -1,27 0,488 -1,38 0,356 -1,14 0,713 -2,36 0,022 Cldn5 claudin 5 12741 1,33 0,404 1,69 0,125 2,22 0,035 1,74 0,127 1,40 0,358 1,73 0,118 Col1a1 collagen, type I, alpha 1 12842 3,05 0,006 1,59 0,257 1,05 0,900 1,19 0,655 1,30 0,533 1,78 0,179 Anhang 110 Gen Symbol Annotiation Col1a2 collagen, type I, alpha 2 Col3a1 Entrez gene ID 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc pWert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 12843 2,58 0,020 1,54 0,305 1,21 0,639 1,06 0,878 1,18 0,697 1,66 0,238 collagen, type III, alpha 1 12825 3,05 0,008 1,57 0,305 1,38 0,467 1,31 0,542 1,21 0,694 1,81 0,192 Col8a1 collagen, type VIII, alpha 1 12837 2,56 0,043 2,74 0,022 2,26 0,093 2,23 0,089 2,36 0,099 3,37 0,011 Cps1 carbamoyl-phosphate synthase 1, mitochondrial 227231 -6,28 0,009 1,26 0,793 -1,21 0,853 -1,09 0,929 2,46 0,313 -1,88 0,469 Cpxm2 carboxypeptidase X (M14 family), member 2 55987 -1,16 0,817 1,17 0,791 1,74 0,416 1,40 0,575 2,11 0,232 3,02 0,037 Ctgf connective tissue growth factor 14219 1,24 0,478 1,33 0,361 1,23 0,496 1,29 0,405 1,36 0,319 2,23 0,016 CYP2A13 /CYP2A6 Cyp2d26 cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6 13087 -6,53 0,036 1,30 0,820 1,19 0,881 1,07 0,943 -1,11 0,929 -1,18 0,887 cytochrome P450, family 2, subfamily d, polypeptide 26 76279 -4,82 0,033 -1,12 0,895 1,08 0,935 1,24 0,758 1,08 0,925 -1,42 0,653 Cyp2e1 cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 13106 -12,97 0,000 1,24 0,689 -1,50 0,538 -1,68 0,329 1,39 0,550 -1,20 0,732 Fbn1 fibrillin 1 14118 2,12 0,053 1,68 0,195 1,72 0,192 1,45 0,366 1,63 0,283 2,39 0,035 Fbp1 fructose-1,6-bisphosphatase 1 14121 -5,68 0,034 -1,33 0,805 -1,27 0,858 0,01 0,993 2,03 0,564 -1,91 0,540 Fgb fibrinogen beta chain 110135 -4,09 0,011 -1,01 0,994 1,13 0,854 -1,09 0,898 1,26 0,700 -1,35 0,653 Fgg fibrinogen gamma chain 99571 -4,58 0,025 -1,16 0,887 -1,17 0,873 -1,10 0,910 1,39 0,714 -1,68 0,576 Fhl1 four and a half LIM domains 1 14199 1,72 0,109 1,84 0,072 1,61 0,164 1,46 0,258 1,63 0,160 2,27 0,020 Fn1 fibronectin 1 14268 2,69 0,008 1,59 0,196 1,42 0,373 1,54 0,260 1,26 0,562 1,77 0,131 Fstl1 follistatin-like 1 14314 1,99 0,054 1,48 0,257 1,48 0,282 1,60 0,198 1,88 0,116 2,18 0,037 G6pc glucose-6-phosphatase, catalytic subunit 14377 -7,24 0,028 -1,16 0,906 -1,08 0,957 1,08 0,952 1,79 0,634 -1,71 0,646 Gc group-specific component (vitamin D binding protein) 14473 -11,04 0,000 -1,98 0,268 -1,21 0,799 -1,77 0,356 2,03 0,196 -3,42 0,060 Hamp hepcidin antimicrobial peptide 84506 -4,27 0,020 -1,51 0,669 -1,69 0,633 -1,04 0,962 -2,39 0,311 1,26 0,781 Hpd 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 15445 -4,69 0,035 1,14 0,870 -1,16 0,830 -1,22 0,809 1,02 0,982 -1,02 0,979 Ifit3 15959 2,93 0,015 1,22 0,658 1,02 0,972 1,34 0,514 1,35 0,526 -1,02 0,959 Inmt interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 indolethylamine N-methyltransferase 21743 -1,91 0,081 -1,24 0,516 -1,97 0,092 -1,36 0,382 -1,05 0,885 -2,20 0,035 Kng1 kininogen 1 16644 -8,16 0,003 1,05 0,957 -1,02 0,984 -1,44 0,671 1,13 0,886 -1,73 0,533 Mat1a methionine adenosyltransferase I, alpha 11720 -7,11 0,008 -1,06 0,951 -1,06 0,955 1,63 0,553 -1,03 0,968 -1,49 0,645 Mfap5 microfibrillar associated protein 5 50530 1,91 0,081 1,90 0,082 1,54 0,235 1,60 0,194 2,02 0,080 2,46 0,020 Mug-ps1 murinoglobulin 1 17835 -11,33 0,001 -1,06 0,938 1,52 0,507 -1,32 0,630 -1,13 0,811 -2,49 0,235 Anhang 111 Gen Symbol Annotiation Mup1 major urinary protein 1 Myh7 Entrez gene ID 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc pWert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 17840 -7,19 0,000 -2,03 0,114 -1,56 0,764 -2,81 0,048 7,40 0,001 -9,83 0,000 myosin, heavy chain 7, cardiac muscle, beta 140781 2,15 0,061 2,56 0,025 1,78 0,171 2,82 0,023 1,56 0,259 5,91 0,000 Myl4 myosin, light chain 4, alkali; atrial, embryonic 17896 -1,65 0,114 1,09 0,804 0,000 -1,78 0,072 -2,19 0,021 3,00 0,003 Myl7 myosin, light chain 7, regulatory 17898 -1,98 0,062 -1,32 0,550 0,000 -2,25 0,033 -3,13 0,010 3,54 0,003 Myot myotilin 58916 1,07 0,867 1,78 0,122 11,47 11,14 2,20 0,064 2,65 0,021 2,84 0,018 3,01 0,005 Nppa natriuretic peptide A 230899 -1,25 0,463 1,52 0,178 -2,00 0,036 -1,48 0,203 -1,58 0,142 3,06 0,002 Nppb natriuretic peptide type B 18158 3,13 0,004 1,87 0,066 2,58 0,012 2,61 0,010 2,69 0,009 5,85 0,000 Orm1 orosomucoid 1 18405 -3,88 0,036 -1,04 0,969 -1,05 0,956 1,17 0,861 1,10 0,893 -1,07 0,940 Otud1 OTU domain containing 1 71198 1,55 0,257 1,65 0,198 1,90 0,127 1,95 0,088 1,70 0,210 2,41 0,028 Pck1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (soluble) 18534 -4,04 0,031 1,08 0,914 -1,02 0,978 -1,43 0,645 1,39 0,612 1,27 0,731 Pon1 paraoxonase 1 18979 -7,54 0,027 1,01 0,995 1,14 0,905 -1,12 0,928 1,55 0,692 -1,19 0,875 Postn periostin, osteoblast specific factor 50706 4,10 0,001 2,49 0,016 2,01 0,073 1,84 0,100 2,34 0,042 3,94 0,001 Ppbp 57349 -1,10 0,749 -1,09 0,788 1,16 0,659 -1,83 0,062 -1,28 0,447 -2,03 0,038 Prnd pro-platelet basic protein (chemokine (C-X-C motif) ligand 7) prion protein 2 (dublet) 26434 3,53 0,036 1,69 0,297 1,17 0,801 -1,21 0,761 1,14 0,833 1,62 0,375 Ptgds prostaglandin D2 synthase 21kDa (brain) 19215 -1,43 0,281 1,28 0,449 2,18 0,030 1,65 0,135 1,48 0,232 1,54 0,182 Pzp pregnancy zone protein 11287 -7,19 0,001 -1,15 0,858 -1,12 0,881 -1,34 0,690 1,59 0,519 -1,43 0,634 Rbp4 retinol binding protein 4, plasma 19662 -9,72 0,001 -1,23 0,803 -1,49 0,687 -1,18 0,843 1,17 0,840 -1,47 0,635 Rcan1 regulator of calcineurin 1 54720 1,39 0,370 1,15 0,704 1,33 0,481 1,25 0,548 1,66 0,203 2,58 0,015 Rnu73b U73B small nuclear RNA 19871 1,03 0,940 -1,07 0,875 -3,05 0,047 -2,65 0,019 -1,07 0,869 1,08 0,884 Rny1 RNA, Ro-associated Y1 19872 -1,27 0,506 1,05 0,903 -3,56 0,003 -1,75 0,091 1,39 0,340 -1,15 0,707 Rpl13a ribosomal protein L13a 22121 1,06 0,922 -1,04 0,941 -2,31 0,204 -3,13 0,023 -1,33 0,621 1,11 0,871 Scarna17 small Cajal body-specific RNA 17 -1,12 0,739 -1,33 0,401 -2,25 0,037 -1,47 0,246 -1,28 0,463 -1,36 0,390 Scd1 stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 100217 466 20249 -3,24 0,004 1,16 0,704 -1,31 0,549 1,11 0,789 1,73 0,174 -1,22 0,606 Serpina1c serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 20702 -16,08 0,000 -1,04 0,950 2,02 0,522 -1,36 0,670 2,49 0,188 -2,38 0,182 20714 -6,08 0,010 -1,39 0,684 1,11 0,911 -1,03 0,975 1,52 0,566 -1,51 0,617 Serpina3k Anhang Gen Symbol 112 Annotiation Entrez gene ID 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc pWert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert 20716 1,51 0,195 1,17 0,676 -1,05 0,886 1,91 0,096 -1,00 0,996 2,29 0,021 20493 -5,69 0,027 -1,18 0,869 1,03 0,977 -1,03 0,975 1,48 0,687 -1,68 0,619 -1,62 0,143 -1,66 0,130 -2,47 0,012 -1,47 0,217 1,07 0,823 1,02 0,938 -1,05 0,872 -1,33 0,366 -3,16 0,004 -1,27 0,434 -1,14 0,678 1,92 0,052 -1,07 0,889 1,05 0,910 -2,47 0,039 -1,84 0,104 -1,57 0,229 -1,16 0,775 Snora3 antiproteinase, antitrypsin), member 3 serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 small nucleolar RNA, H/ACA box 3 Snord104 small nucleolar RNA, C/D box 104 SNORD2 2 Snord33 small nucleolar RNA, C/D box 22 100302 499 100216 537 83673 small nucleolar RNA, C/D box 33 27208 -1,00 0,994 -1,24 0,609 -3,54 0,025 -1,67 0,198 -1,40 0,456 1,27 0,605 Snord35a small nucleolar RNA, C/D box 35A 27211 1,11 0,797 1,03 0,947 -2,54 0,043 -1,62 0,185 1,25 0,551 -1,04 0,921 Snord35b small nucleolar RNA, C/D box 35B 27212 1,08 0,861 -1,11 0,833 -3,99 0,042 -1,62 0,262 -1,20 0,720 1,29 0,600 Snord53 small nucleolar RNA, C/D box 53 -1,14 0,841 1,05 0,932 -1,55 0,470 -2,94 0,039 -2,74 0,052 -1,13 0,858 Snord82 small nucleolar RNA, C/D box 82 100217 456 80828 -1,06 0,864 1,05 0,871 -2,65 0,009 -1,48 0,208 1,07 0,838 -1,22 0,541 Tat tyrosine aminotransferase 234724 -6,56 0,002 -1,08 0,910 -1,00 0,995 -2,04 0,310 1,49 0,537 -2,06 0,262 Tdo2 tryptophan 2,3-dioxygenase 56720 -9,42 0,017 1,19 0,899 1,10 0,946 1,19 0,888 1,47 0,749 -1,29 0,830 Thbs1 thrombospondin 1 21825 2,76 0,012 1,54 0,255 1,52 0,301 1,48 0,295 2,03 0,093 2,43 0,022 Timp1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 21857 7,11 0,001 1,89 0,304 1,49 0,579 1,00 0,996 1,13 0,854 3,32 0,036 Tnc tenascin C 21923 7,89 0,010 1,43 0,684 1,04 0,968 1,55 0,643 1,30 0,769 1,71 0,579 Tnfrsf12a 27279 2,24 0,052 1,84 0,118 2,22 0,068 1,89 0,106 1,91 0,111 4,61 0,001 TRDN tumor necrosis factor receptor superfamily, member 12A triadin 76757 -1,32 0,425 1,20 0,588 -1,10 0,764 -1,16 0,635 1,07 0,820 -2,08 0,043 Ttr transthyretin 22139 -9,80 0,000 -1,01 0,984 1,05 0,939 -1,02 0,979 1,98 0,259 -1,86 0,316 Uck2 uridine-cytidine kinase 2 80914 1,47 0,261 1,64 0,153 1,61 0,190 1,66 0,164 1,79 0,125 2,46 0,016 Wisp2 WNT1 inducible signaling pathway protein 2 22403 1,33 0,546 1,66 0,300 1,78 0,237 1,35 0,505 1,24 0,653 2,72 0,039 Xirp2 xin actin-binding repeat containing 2 241431 1,51 0,203 2,02 0,035 1,97 0,051 1,72 0,107 1,75 0,101 2,34 0,013 Serpina3n Slc10a1 Anhang 113 TLDA-Analysen der linksventrikulären Genexpression Tab. 7.4 Vergleich der durch TLDA und Microarray evaluierten Genexpression Dargestellt sind die Ratios (TAC/Sham) der im TaqMan Low Density Array (TLDA) auf Einzeltierebene untersuchten Gene im Vergleich mit den korrespondierenden Ratios aus der Microarray-Analyse (MA) der Poolproben. 4d Assay 14d 21d 28d 42d 56d TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA Abra-Mm00615375_m1 1,53 1,46 1,33 1,40 1,74 1,59 2,47 1,91 2,40 2,29 2,34 2,39 Acta1-Mm00808218_g1 7,66 3,60 8,22 3,94 10,87 5,04 11,57 4,30 10,75 3,85 8,52 4,55 Aebp1-Mm00477402_m1 1,91 1,32 1,90 1,56 1,67 1,27 1,58 1,32 1,28 1,27 2,31 2,02 Ankrd23-Mm00463265_m1 2,66 1,77 1,81 1,50 1,93 1,51 2,31 1,85 2,43 1,58 3,45 2,48 Apod-Mm00431817_m1 0,93 0,97 2,09 1,77 1,92 2,06 2,61 1,68 2,16 1,50 3,04 2,74 Aspn-Mm00445945_m1 1,73 1,51 2,13 1,92 1,85 1,74 2,30 1,96 2,02 1,67 1,83 2,25 Ces1d-Mm00474816_m1 0,40 0,53 0,27 0,32 0,32 0,41 0,32 0,36 0,32 0,28 0,15 0,18 Cfh-Mm01299243_m1 0,64 0,72 1,25 1,27 1,06 1,10 1,31 1,33 1,26 1,37 1,68 2,08 Col1a1-Mm00801666_g1 4,49 2,65 3,71 2,26 2,72 1,79 2,75 1,96 2,58 1,73 4,92 2,83 Comp-Mm00489490_m1 0,98 1,04 5,14 1,79 2,22 1,37 2,66 1,58 4,09 1,75 11,26 4,87 Cpxm2-Mm00502123_m1 1,28 1,15 2,12 1,58 2,00 1,74 2,18 1,90 2,65 2,49 3,47 2,54 Ctgf-Mm01192932_g1 2,51 1,95 2,52 2,11 2,49 1,96 3,16 1,96 3,33 2,49 5,58 3,32 Emp1-Mm00515676_m1 3,05 2,82 2,78 2,69 2,10 2,23 2,51 1,87 2,79 2,56 3,93 3,31 Fxyd5-Mm00435435_m1 1,87 1,57 1,63 1,69 1,58 1,54 1,64 1,50 1,65 1,66 2,41 2,65 Fxyd6-Mm00445583_m1 1,24 1,19 1,36 1,29 1,30 1,33 1,44 1,33 1,63 1,55 2,33 2,28 Inmt-Mm00493537_m1 0,18 0,29 0,64 0,66 0,58 0,73 0,52 0,67 0,46 0,42 0,30 0,42 Itgbl1-Mm00520942_m1 1,75 1,59 3,00 2,07 2,57 2,28 2,87 2,89 3,20 3,22 4,36 4,00 Kif5b-Mm00515276_m1 1,32 1,20 1,02 1,01 1,26 1,30 1,36 1,17 1,26 1,40 1,61 2,06 Lcn2-Mm01324470_m1 0,76 0,90 0,90 1,03 1,41 1,48 1,41 1,33 0,81 0,77 2,77 2,33 Anhang 114 4d Assay 14d 21d 28d 42d 56d TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA TLDA MA Lox-Mm00495386_m1 4,35 3,82 2,95 2,10 2,61 2,53 2,18 1,40 2,01 1,33 8,23 7,63 Loxl1-Mm01145738_m1 2,27 2,28 2,08 2,06 2,04 1,75 1,81 1,57 2,38 1,71 3,17 2,56 Lum-Mm00500510_m1 1,20 1,44 2,72 1,97 1,72 1,81 1,58 2,36 4,35 1,78 2,08 1,65 Mfap4-Mm00840681_m1 3,12 2,34 4,94 3,28 3,48 2,77 3,78 2,46 5,21 3,62 7,08 4,23 Mfap5-Mm00489404_m1 2,72 2,66 3,13 3,29 2,91 3,04 2,82 2,00 2,96 3,10 4,62 4,28 Myh6-Mm00440359_m1 0,84 0,92 0,54 0,76 0,74 0,93 0,79 0,97 0,62 0,83 0,60 0,97 Myh7-Mm01319006_g1 4,13 2,51 6,89 2,86 7,48 3,00 11,19 3,79 3,59 1,97 19,82 7,43 ND5;ND6-Mm04225315_s1 0,76 1,49 0,74 1,14 0,74 2,10 0,84 0,72 0,89 0,80 0,73 0,44 Nmrk2-Mm01172899_g1 11,03 3,84 3,86 1,60 4,54 2,09 2,70 1,33 2,99 1,60 12,99 4,63 Nppa-Mm01255747_g1 4,19 2,48 8,92 3,57 7,22 4,33 6,77 3,09 5,93 2,64 11,89 4,51 Nppb-Mm01255770_g1 4,29 2,91 2,45 2,10 2,89 2,02 3,16 2,31 3,19 2,23 4,01 2,38 Nuak1-Mm01250704_m1 1,28 1,44 1,22 1,67 1,38 1,70 1,68 2,08 1,45 1,87 2,23 2,53 Nupr1-Mm00498104_m1 1,32 1,12 2,07 1,54 1,87 1,40 2,12 1,44 2,05 2,07 3,50 2,25 Postn-Mm00450111_m1 9,91 6,40 7,12 4,71 5,88 4,73 5,88 4,71 5,51 4,28 14,66 11,29 Ppbp-Mm01347901_g1 0,42 0,44 0,32 0,40 0,84 0,81 0,32 0,34 0,68 0,93 0,30 0,34 Sfrp2-Mm01213947_m1 1,59 1,22 2,58 2,01 2,44 2,24 2,03 1,36 2,26 1,43 4,18 2,49 Srpx2-Mm01354530_m1 2,27 1,95 1,74 2,08 1,85 1,66 1,61 1,27 1,67 1,67 2,29 2,69 Stc1-Mm00436798_m1 1,50 1,27 2,23 1,93 2,38 2,24 2,29 1,77 2,12 1,99 2,70 2,49 Svep1-Mm01346904_m1 1,50 1,44 2,27 2,08 2,73 2,29 2,63 2,41 2,17 2,02 3,57 3,05 Thbs4-Mm03003598_s1 9,14 2,94 14,31 3,28 9,90 2,66 13,00 2,14 12,27 2,10 39,08 8,23 Timp1-Mm00441818_m1 11,85 11,93 4,82 3,99 3,94 4,15 3,71 2,43 3,83 3,24 16,54 11,86 Tubb2a-Mm00809562_s1 2,11 1,74 1,31 1,19 1,23 1,42 1,51 1,15 1,44 1,14 1,97 2,03 Wisp2-Mm00497471_m1 2,48 1,61 3,41 1,96 4,26 2,22 2,69 2,24 3,31 1,79 6,69 3,42 Xirp1-Mm03038568_s1 1,51 1,44 0,93 1,03 1,36 1,49 1,62 1,49 1,41 1,29 1,81 1,90 Xirp2-Mm01335343_m1 2,66 2,02 2,81 2,40 2,51 2,28 2,79 2,32 2,31 2,24 3,90 3,02 Anhang 115 Linksventrikuläre Expression Wnt-Sigalweg assozierter Gene nach TAC Tab. 7.5 Genexpressionsänderung Wnt-assozierter Gene im linken Ventrikel Dargestellt sind die fold changes (TAC vs. Sham) und die entsprechende p-Werte (Rosetta Resolver Error Model) der mit dem Wnt-Signalweg assozierten Gene, die in den Microarray-Analysen an mindestens einem der postoperativen Untersuchungszeitpunkte (Tag 4, 14, 21, 28, 42 und 56) einen Änderungsfaktor von mindestens 1,5 aufwiesen. Gen Symbol Annotiation Entrez gene ID 4d 14d 21d 28d 42d 56d fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert fc p-Wert Fzd3 frizzled homolog 3 (Drosophila) 14365 -1,14 0,91 -1,45 0,74 -1,05 0,96 -1,10 0,93 1,54 0,72 -1,36 0,79 Sfrp1 secreted frizzled-related protein 1 20377 1,36 0,52 1,59 0,34 1,99 0,14 1,55 0,41 1,17 0,76 2,77 0,03 Sfrp2 secreted frizzled-related protein 2 secreted frizzled-related sequence protein 5 dickkopf homolog 3 (Xenopus laevis) wingless-related MMTV integration site 5A wingless-related MMTV integration site 8A wingless related MMTV integration site 2b kringle containing transmembrane protein 1 20319 1,22 0,69 2,01 0,18 2,24 0,10 1,36 0,55 1,43 0,44 2,49 0,05 54612 -1,00 1,00 1,03 0,98 -1,19 0,84 1,29 0,78 -2,26 0,40 -1,17 0,86 50781 1,29 0,69 1,33 0,68 -1,12 0,86 1,05 0,94 1,93 0,38 2,03 0,25 22418 -1,15 0,84 -1,59 0,53 -1,25 0,76 -1,20 0,80 1,43 0,62 1,00 1,00 20890 -1,56 0,62 1,11 0,91 -1,13 0,88 1,26 0,78 -1,01 0,99 -1,42 0,68 22414 -1,00 1,00 1,24 0,83 1,07 0,94 -1,13 0,89 -1,54 0,65 1,10 0,92 84035 1,24 0,54 1,18 0,64 1,24 0,54 1,34 0,42 1,23 0,58 1,65 0,16 Sfrp5 Dkk3 Wnt5a Wnt8a Wnt2b Kremen1
