Kollagen Typ I induziert die Phosphorylierung von
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Universitätsklinikum Ulm Abteilung Innere Medizin I Leiter: Prof. Dr. Guido Adler Kollagen Typ I induziert die Phosphorylierung von Cateninen und die Dissoziation des E-Cadherin-Catenin-Komplexes in Pankreaskarzinomzelllinien Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Claudia Müller Geburtsort: Ottobeuren Jahr der Vorlage: 2005 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: PD Dr. Andre Menke 2. Berichterstatter: PD Dr. Rainer Voisard Tag der Promotion: 19.01.2006 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis..........................................................................................III 1 Einleitung ............................................................................................................ 1 1.1 Das Pankreaskarzinom ............................................................................................. 1 1.2 Die Zelladhäsion....................................................................................................... 1 1.3 Der E-Cadherin-Catenin-Komplex........................................................................... 3 1.3.1 E-Cadherin......................................................................................................... 3 1.3.2 Catenine ............................................................................................................. 4 1.4 Regulation der E-Cadherin-Catenin-Komplexstabilität ........................................... 5 1.5 Die Kinasen FAK und Src ........................................................................................ 6 1.6 Die Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 ................................................................... 7 1.7 Die extrazelluläre Matrix.......................................................................................... 9 1.8 Tumorgenese ............................................................................................................ 9 2 Zielsetzung der Arbeit...................................................................................... 11 3 Material und Methoden ................................................................................... 12 Material .................................................................................................................. 12 3.1.1 Antikörper........................................................................................................ 12 3.1.2 Puffer und Lösungen ....................................................................................... 14 3.1.3 Proteinase- und Phosphataseinhibitoren.......................................................... 16 3.1.4 Geräte .............................................................................................................. 17 3.1.5 Sonstiges.......................................................................................................... 17 3.2 Methoden................................................................................................................ 18 3.2.1 Zellkultur ......................................................................................................... 18 3.2.2 Herstellung von Proteinlysaten........................................................................ 19 3.2.3 Membranpräparation ....................................................................................... 20 3.2.4 Immunpräzipation............................................................................................ 21 3.2.5 Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA ............................................ 22 3.2.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese............................................................. 23 3.2.7 Färbung der Proteingele mit Coomassie-Blau................................................. 25 3.2.8 Immunblot ....................................................................................................... 25 3.2.9 Ponceaurotfärbung von Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membranen .................. 25 3.2.10 Immunfärbung ................................................................................................. 26 3.2.11 Proteindetektion durch Chemilumineszenz ..................................................... 26 3.2.12 Proteindetektion durch alkalische Phosphatase............................................... 27 3.2.13 Immunfluoreszenzfärbung............................................................................... 27 3.2.14 Statistik und Auswertung ................................................................................ 28 3.1 4 Ergebnisse.......................................................................................................... 29 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 Kollagen Typ I führt zu einer Abnahme der E-Cadherin-CateninProteinkonzentration................................................................................................ 29 Analyse des E-Cadherin-Komplexes in Abhängigkeit der Matrixproteine............. 31 Lokalisationsänderung des E-Cadherin-Komplexes in den Zelllinien Panc-1 und BxPc-3 durch Komponenten der extrazellulären Matrix...................... 34 Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin auf den E-CadherinAdhäsionskomplex .................................................................................................. 38 Veränderung der Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes unter dem Einfluss der verschiedenen Matrixproteine ............................................ 40 Inhaltsverzeichnis 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 II Assoziation der Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 mit dem E-Cadherin-Komplex .............................................. 42 Einfluss von Kollagen I und Fibronektin auf die Lokalisation der Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 .................... 44 Veränderung der Proteinmenge von FAK, Src sowie PTEN und SH-PTP2 am E-Cadherin-Komplex in Abhängigkeit der Matrixproteine............................... 48 Veränderung der Phosphorylierung von FAK, Src, PTEN und SH-PTP2 durch die Komponenten der extrazellulären Matrix ............................... 51 Nach Stimulation mit Kollagen Typ I lässt sich β-Catenin im Zellkern nachweisen .............................................................................................................. 56 Kollagen Typ I führt zu einer Zunahme der Proliferation....................................... 58 5 Diskussion.......................................................................................................... 60 5.1 5.2 5.3 5.2 6 Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes durch Kollagen Typ I ............................ 61 Aktivitätsänderung der Tyrosinkinasen FAK und Src sowie der PI 3-Kinase unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin.............. 62 Kollagen Typ I führt zu einer Inhibition von PTEN am E-Cadherin-Komplex...... 66 Translokation von β-Catenin in den Zellkern sowie Zunahme der Proliferation unter dem Einfluss von Kollagen Typ I ............................................. 69 Zusammenfassung ............................................................................................ 71 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................I Danksagung..........................................................................................................XIV Abkürzungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis AK Antikörper AP Alkalische Phosphatase APC adenomatous polyposis coli APS Ammoniumperoxidisulfat BSA Rinderserumalbumin CMF Calcium-Magnesium-Frei Da Dalton DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol DMEM Dulbecco`s modifiziertes Eagle Medium DTT 1,4 Dithio-DL-threitol E-Cadherin epitheliales Cadherin ECL enhanced chemiluminescence ECM extrazelluläre Matrix EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) EGFR Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor receptor) EGTA Ethylenglykol-bis(2-aminoethyl)-tetraessigsäure ERK extracellular signal-regulated kinase FAK focal adhesion kinase Fc konstantes Fragment von Antikörpern nach Papainspaltung FCS Fötales Kälberserum FN Fibronektin HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-2-ethansulfonsäure HRP Meerrettichperoxidase (horse radish peroxidase) IF Immunfluoreszenz IgG Immunglobulin G IP Immunpräzipitation Koll I Kollagen I KRH Krebs-Ringer-HEPES LEF lymphoid enhancer factor Abkürzungsverzeichnis IV MAPK mitogen activated protein kinase mk monoklonal M/V Masse pro Volumen n Anzahl der Ergebnisse PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS Phosphat gepufferte Saline PDGF platelet-derived growth factor PI 3-Kinase Phosphatidylinositol 3-Kinase PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat pk polyklonal PP2A Protein Phosphatase 2A PTEN phosphatase and tensin homolog PVDF Polyvinylidenfluorid RIPA radioimmunoprecipitation assay buffer SDS Natriumdodecylsulfat SH-PTP2 src-homology-2-phosphotyrosine-phosphatase Src Sarcoma STI Sojabohnentrypsininhibitor TBS Tris gepufferte Saline TCF T cell factor TCP tissue culture plastic TEMED N,N,N`,N`-Tetraethylmethylendiamin Tris Tris-(hydromethyl)-aminomethan Triton X-100 Polyoxyethylen-p-t-octylphenol TWEEN 20 Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat V/V Volumen pro Volumen WB Westernblot Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Das Pankreaskarzinom Das Pankreaskarzinom rangiert in den westlichen Industrieländern als fünfhäufigste, in den USA sogar als vierthäufigste Todesursache unter allen Krebserkrankungen (Murr et al., 1994; Gress et al., 1997; Lowenfels et al., 2002). In mehr als 75% der Fälle handelt es sich um ein Adenokarzinom, welches überwiegend vom Gangepithel und selten vom Azinusepithel ausgeht. Die genauen Ursachen der Entstehung sind unbekannt, wobei bestimmte Risikofaktoren angenommen werden. So führt der regelmäßige Nikotinabusus zu einem zweifach erhöhten Erkrankungsrisiko. Auch die chronische Pankreatitis, die oft durch Alkoholmissbrauch verursacht wird, stellt einen weiteren Risikofaktor dar. Drei bis fünf Prozent aller Pankreaskarzinome sind auf eine genetische Prädisposition zurückzuführen (Murr et al., 1994; Chappuis et al., 2001; Lowenfels et al., 2002). Die Prognose des Pankreaskarzinoms ist sehr schlecht. Die mittlere Überlebenszeit beträgt bei unbehandelten Patienten nur sechs Monate (Gress et al., 1997; Renz-Polster et al., 1999). Trotz intensiver Forschungen sind die therapeutischen Möglichkeiten begrenzt und eine kurative Therapie nur in den frühen Erkrankungsstadien möglich. Ausschlaggebend für die schlechte Prognose sind zum einen die frühe Metastasierung und Infiltration in das umliegende Gewebe und zum anderen die meist sehr unspezifischen Frühsymptome, so dass das Pankreaskarzinom in der Regel erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird (Hall et al., 1993; Gress et al., 1997). 1.2 Die Zelladhäsion Adhäsive Interaktionen zwischen einzelnen Zellen und Zellverbänden höherer Organismen sind elementar für deren Struktur und Funktion. Diese Interaktionen beruhen auf direkten Zell-Zell-Kontakten sowie auf Wechselwirkungen zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (Gumbiner, 1996). Stabile Zell-Zell-Interaktionen sind für solide Gewebe essentiell, wobei dynamische Veränderungen in der Embryonalentwicklung, Zellmotilität, Proliferation und Differenzierung eine wichtige Rolle spielen. Adhäsionsvorgänge haben einen entscheidenden Einfluss auf invasives Wachstum und Metastasierung von Tumorzellen (Takeichi, 1993; Gumbiner, 1996; Mareel et al., 1997). Es wird zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen unterschieden. Hierzu gehören die Cadherine, Integrine, Selektine sowie die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie (Hynes et al., 1992). Einleitung 2 Alle Zelltypen, die solide Zellverbände bilden, exprimieren Cadherine (Takeichi, 1991). Diese Adhäsionsmoleküle sind calciumabhängige, transmembranäre Glykoproteine (Takeichi et al., 1988; Kemler 1993). Hierbei lassen sich über 16 verschiedene Cadherine mit ähnlicher Primärstruktur, bestehend aus 723 bis 748 Aminosäuren, unterscheiden (Takeichi, 1990). Cadherine sind aus einer großen aminoterminalen extrazellulären Domäne, einem hydrophoben transmembranären Segment sowie einer carboxyterminalen zytosolischen Domäne aufgebaut (Abb.1). Der extrazelluläre Bereich wird in fünf Domänen von je 113 Aminosäuren unterteilt. (Takeichi, 1990; Chen et al., 1997). Abb. 1: Aufbau der klassischen Cadherine. Die verschiedenen Cadherine bestehen aus einer aminoterminalen extrazellulären Domäne, einem hydrophoben transmembranären Segment und einer carboxyterminalen zytosolischen Domäne. Die größte Gruppe nehmen die klassischen Cadherine ein. Ihre wesentlichen Vertreter sind das E-Cadherin, welches überwiegend in epithelialen Geweben vorkommt und auch dort zum ersten Mal isoliert wurde, das N-Cadherin des Nervengewebes und das P-Cadherin der Plazenta (Aberle et al., 1996). Neben den klassischen Cadherinen gibt es noch weitere Untergruppen, wie die desmosomalen Cadherine, zu denen die Desmocolline sowie die Desmogleine gehören, die Protocadherine sowie das LI- und T-Cadherin, welches nur eine sehr kurze bzw. gar keine zytoplasmatische Domäne aufweist (Takeichi, 1995; Aberle et al., 1996). Ein bestimmter Zelltyp exprimiert dabei nicht nur einen Cadherinsubtyp, sondern eine Kombination von unterschiedlichen Cadherinen, welche für die jeweilige Zellart spezifisch ist (Takeichi, 1995). Einleitung 3 1.3 Der E-Cadherin-Catenin-Komplex 1.3.1 E-Cadherin E-Cadherin ist entscheidend an der Aufrechterhaltung der strukturellen und funktionellen Organisation von polarisierten epithelialen Zellen beteiligt. Dieses Cadherin ist seit längerer Zeit als Tumorsuppressor bekannt. Es konnte ein direkter Zusammenhang zwischen invasivem Tumorwachstum und gestörter E-Cadherin-vermittelter Zell-Zell-Adhäsion nachgewiesen werden (Frixen et al., 1991; El-Hariry et al., 1999). Besondere Bedeutung für die Aufrechterhaltung stabiler Zell-Zell-Adhäsionen kommt vor allem der extrazellulären Domäne von E-Cadherin zu. Nakamura et al., 2005, beschreiben einen engen Zusammenhang zwischen zellulärer Dissoziation und reduzierter Expression der extrazellulären Domäne von E-Cadherin. Diese Domäne weist fünf zu je 30% homologe Regionen auf, die als E-Cadherin-Domänen (EC1-5) bezeichnet werden. Jede dieser Domänen besteht aus 113 Aminosäuren und enthält zwei Ca2+-Bindungsstellen. Ca2+-Ionen sind essentiell für eine stabile Zell-Zell-Adhäsion. Werden diese Ionen oder deren Bindungsstellen entfernt, so lösen sich die Zell-Zell-Kontakte auf (Takeichi, 1990; Kemler, 1993). Vermutlich spielt das in der ersten extrazellulären Domäne (EC1) lokalisierte HAV-Motiv, ein Tripeptid aus den Aminosäuren Histidin, Alanin und Valin, eine entscheidende Rolle in der homophilen Bindung der E-Cadherine, denn Veränderungen in dieser Region führen zu einer Störung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion (Takeichi, 1995; Aberle et al., 1996) Die extrazellulären Domänen von jeweils zwei E-Cadherin-Molekülen innerhalb einer Zelle bilden cis-Dimere, wohingegen die E-Cadherine benachbarter Zellen trans-Dimere oder auch sogenannte Adhäsions-Dimere ausbilden (Abb. 2). Die adhäsiven Interaktionen zwischen den einzelnen E-Cadherinen sind nicht als starrer sondern als dynamischer Prozess anzusehen, wobei zuerst multiple instabile Kontakte gebildet werden und anschließend die Cadherin-Moleküle zweier benachbarter Zellen reißverschlussartig miteinander verbunden werden (Kemler, 1993). Es wurde lange Zeit angenommen, dass die Bindung der ECadherine ausschließlich homophil ist. In letzter Zeit konnten jedoch heterophile Bindungen zwischen den E-Cadherinen und Integrinen nachgewiesen werden, so dass die ECadherine in ein noch viel komplexeres Adhäsionsnetzwerk als bisher vermutet involviert sind (Takeichi, 1995). Einleitung 4 Die zytoplasmatische Domäne, die aus ungefähr 170 Aminosäureresten besteht, ist nichtkovalent mit den zytoplasmatischen Cateninen assoziiert, die wiederum mit dem Aktinzytoskelett interagieren (Ozawa et al., 1992; Chen et al., 1997). Abb. 2: Struktur des E-Cadherin-Catenin-Komplexes. Die extrazelluläre Domäne besteht aus fünf homologen Cadherin-Domänen, welche die homophile E-Cadherin-Bindung zur Nachbarzelle vermitteln. Die zytoplasmatische Domäne bindet entweder an β- oder γ-Catenin, welches wiederum an α-Catenin bindet. Alpha-Catenin ist mit dem Aktinzytoskelett assoziiert. P120ctn bindet an der zur Zellmembran gerichteten Region der zytoplasmatischen E-Cadherin-Domäne. 1.3.2 Catenine Catenine sind zytoplasmatische Proteine, die mit dem epithelialen Zelladhäsionsmolekül E-Cadherin assoziieren. Diese Catenine verbinden E-Cadherin mit dem Aktinzytoskelett und spielen somit eine entscheidende Rolle in der E-Cadherin-vermittelten Zell-ZellAdhäsion. Dabei bindet die zytoplasmatische Seite von E-Cadherin entweder an β-Catenin oder an γ-Catenin. Diese assoziieren wiederum mit α-Catenin. Somit gibt es mindestens zwei verschiedene E-Cadherin-Catenin-Komplexe, bei denen jedoch bisher keine funktionellen Unterschiede bekannt sind (Butz et al., 1994). Alpha-Catenin ist darüber hinaus entweder direkt oder indirekt über die Proteine α-Actinin oder Vinculin mit dem Aktinzytoskelett assoziiert (Knudsen et al., 1995). Humanes α-Catenin ist ein Protein mit einer Molekülgröße von 102 kDa. Drei Domänen von α-Catenin sind zu 30% homolog mit Vinculin, einem peripheren zytoplasmatischen Einleitung 5 Protein (Kemler, 1993; Aberle et al., 1996). Alpha-Catenin verbindet als Linker-Protein den E-Cadherin-Adhäsionskomplex mit dem Aktinzytoskelett und ist somit entscheidend an der Aufrechterhaltung des E-Cadherin-Catenin-Komplexes beteiligt (Kemler, 1993). Das humane β-Catenin, welches ein Molekulargewicht von 94 kDa aufweist, spielt eine wichtige Rolle in der E-Cadherin-regulierten Zell-Zell-Adhäsion (Kemler, 1993; Gumbiner, 1995). Darüber hinaus ist β-Catenin an der Regulation der Genexpression beteiligt. Es spielt eine entscheidende Rolle als Effektor der Wnt/Wg Signalkaskade. Stimulation dieser Signalkaskade führt zur Akkumulation von β-Catenin im Zytoplasma. Das zytoplasmatisch angereicherte β-Catenin transloziert in den Zellkern, wo es mit Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie interagiert (Behrens et al., 1998; Behrens, 1999). Dieser Komplex bindet an die DNA-Bindungssequenz der LEF/TCF`s und aktiviert die Expression von Zielgenen wie c-myc und Cyclin D1 (He et al., 1998; Tetsu et al., 1999; Persad et al., 2001). Humanes γ-Catenin hat ein Molekulargewicht von 86 kDa. Dieses Catenin interagiert sowohl mit den desmosomalen als auch mit den klassischen Cadherinen (Cowin et al., 1986). Das γ-Catenin weist eine zu über 60%ige Homologie mit β-Catenin auf (Butz et al., 1992; Gumbiner, 1995). P120ctn ist ein weiteres Protein der Catenin Familie, welches mit der juxtamembranären Region der zytoplasmatischen Domäne der klassischen Cadherine, jedoch nicht direkt mit den anderen Cateninen assoziiert. Über die genaue Funktion von p120ctn an der Regulation der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion ist bisher noch sehr wenig bekannt (Ohkubo et al., 1999; Harington et al., 2000). 1.4 Regulation der E-Cadherin-Catenin-Komplexstabilität Die Regulationsmechanismen der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion sind sehr komplex und bisher nur ansatzweise geklärt. Bekannt ist, dass die Stabilität des ECadherin-Catenin-Komplexes unter anderem über Tyrosinphosphorylierung reguliert wird, wobei den Proteintyrosin Phosphatasen sowie den Tyrosinkinasen eine wesentliche Bedeutung zukommt. Es wurde von zahlreichen Autoren beschrieben, dass die Dissoziation des E-Cadherin-Catenin-Komplexes mit einer verstärkten Phosphorylierung von β-Catenin und möglicherweise auch von p120ctn verbunden ist. Die Tyrosinkinase c-Src sowie der EGFRezeptor induzieren eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung von β-Catenin und von p120ctn, was wiederum zu einer Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes führt (Behrens et al., 1993; Müller et al., 1999, Roura et al., 1999). Eine Zunahme der Phosphorylierung mit Einleitung 6 nachfolgender Dissoziation korreliert mit einer Abnahme der Zell-Aggregation sowie mit einer Zunahme der Zellmigration (Krypta et al., 1996). Auch Phosphatasen sind an der Tyrosinphosphorylierung des E-Cadherin-CateninKomplexes beteiligt. So führt die Dephosphorylierung von β-Catenin wieder zu einer Zunahme der Komplexstabilität und zu einer verstärkten Zell-Zell-Adhäsion. Dephosphorylierung von β-Catenin ist mit einer Inhibition der epithelialen Zellmigration verbunden (Müller et al., 1999; Lilien et al., 2002). 1.5 Die Kinasen FAK und Src Phosphorylierung von Proteinen spielt eine entscheidende Rolle im Zellwachstum sowie in der Proliferation und Differenzierung. Der Grad der Phosphorylierung wird durch das antagonistische Verhalten der Proteinkinasen und Proteinphosphatasen reguliert (BradyKalnay et al., 1995; Vincent et al., 1995). Die Familie der Src-Kinasen zählt neun Mitglieder. Src, der Prototyp der Familie der SrcKinasen, ist eine zytoplasmatische tyrosinspezifische Proteinkinase mit einem Molekulargewicht von 60 kDa. Eine Zunahme der Src-Aktivität führt zu Wachstum und Transformation. In vielen malignen epithelialen Tumoren wie im Kolonkarzinom und Mammakarzinom sowie im Pankreaskarzinom ist die Aktivität der Src-Kinase erhöht (Lutz et al., 1998; Frame et al., 2002; Playford et al., 2004). Src besteht aus einer Kinase-Domäne mit dem Tyrosinrest 416, einem carboxyterminalen Ende mit dem Tyrosinrest 527 und einem aminoterminalem Ende, das eine Myristinsäuresequenz zur Verankerung von Src in der Zellmembran enthält (Frame et al., 2002). Die Src-Kinase wird in komplexer Weise reguliert. Eine Zunahme der Phosphorylierung von Src an ihrem Tyrosinrest 527 führt über intramolekulare Umlagerung zu einer Inaktivierung, eine verstärkte Phosphorylierung am Tyrosinrest 416 hingegen zu einer Aktivierung der Src-Kinase (Harvey et al., 1989; Frame et al., 2002). Interessant ist die im Zusammenhang der Src-Aktivität verbundene Lokalisation der Src-Kinase in der Zelle. So lässt sich inaktives Src vor allem in der perinukleären Region und aktives Src in der Zellperipherie nachweisen (Weernink et al., 1995; Fincham et al., 2000). Die Tyrosinkinase Src interagiert direkt mit der Kinase FAK („focal adhesion kinase“), welche ebenfalls eine zytoplasmatische Tyrosinkinase ist. Die FAK besitzt ein Molekulargewicht von 125 kDa und spielt eine wichtige Rolle in der Zellproliferation und Migration (Jones et al., 2000; Salazar et al., 2001). Diese Kinase ist in vielen Tumoren überexprimiert. Es gibt einige Untersuchungen, die einen Zusammenhang zwischen der Überexpres- Einleitung 7 sion von FAK und einem invasiven Verhalten der Tumorzellen zeigen (Owens et al., 1995). Die FAK besitzt sechs Tyrosinphosphorylierungsstellen, die zu einer Zunahme der Aktivität dieser Kinase führen (Schlaepfer et al., 1999; Salazar et al., 2001). Die FAK spielt eine zentrale Rolle in der Integrin-vermittelten Signalübertragung (Schlaepfer et al., 1996; Manes et al., 1999; Salazar et al., 2001). Die durch die Integrine aktivierte Tyrosinkinase Src führt zu einer Phosphorylierung der Tyrosinreste 576, 577 und 925 der FAK und induziert die Autophosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397, was zu einer Zunahme der FAK-Aktivität führt (Achison et al., 2001; Salazar et al., 2001). Die autophosphorylierte und somit aktivierte FAK interagiert wiederum mit der Tyrosinkinase Src (Salazar et al., 2001; Playford et al., 2004). Somit besteht ein sehr enger Zusammenhang zwischen den Tyrosinkinasen FAK und Src in der Integrin-vermittelten Signaltransduktion. Die zytoplasmatischen Kinasen Src und FAK führen über Tyrosinphosphorylierung verschiedenster Proteine zu einer Aktivierung des PI 3-Kinase- und des MAP-Kinase-Signalwegs, welche die Zellmotilität, die Zelladhäsion und -proliferation beeinflussen und die Apoptose unterdrücken (Guan et al., 1997; Schlaepfer et al., 1999; Frame et al., 2002). 1.6 Die Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 PTEN (phosphatase and tensin homolog) ist sowohl eine Lipid- als auch eine Tyrosin- und Serin/Threonin-Phosphatase mit einem Molekulargewicht von 55 kDa (Tamura et al., 1999 b). Das aminoterminale Ende von PTEN weist Ähnlichkeiten mit Tensin auf, einem Protein, welches mit FAK interagiert (Kotelevets et al., 2001). PTEN wurde als Tumorsuppressor-Gen MMAC1 am Chromosom 10q23 identifiziert (Steck et al., 1997). In vielen malignen Tumoren, wie Glioblastomen, Endometriumkarzinomen sowie anderen epithelialen Tumoren konnten Deletionen oder Mutationen dieses Gens nachgewiesen werden (Li et al., 1997; Steck et al., 1997; Haier et al., 2002). Im Pankreaskarzinom ließ sich eine verminderte Expression von PTEN im Vergleich zu gesundem Pankreasgewebe nachweisen (Asano et al., 2004). Die PTEN-Aktivität inhibiert die Zellmigration, die Zellproliferation sowie die Tumorinvasion und induziert Apoptose (Tamura et al., 1999 a; Haier et al., 2002). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass PTEN das second-messenger Lipidmolekül PIP3 (Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat) dephosphoryliert, welches durch die PI 3Kinase aktiviert wird. Somit antagonisiert PTEN den PI 3-Kinase Signalweg (Kotelevets et al., 2001; Vazquez et al., 2001). Zudem kann PTEN die Tyrosinkinase FAK selektiv Einleitung 8 dephosphorylieren, was zu einer Inhibition der Zellmigration sowie Tumorinvasion führt (Tamura et al., 1999 a). Bei der Phosphatase SH-PTP2 handelt es sich um eine zytoplasmatische PhosphotyrosinPhosphatase, welche ubiquitär in verschiedenen Geweben und Zelltypen exprimiert wird (Wu et al., 2001; Qu, 2002). Über deren Regulation weiß man bisher noch sehr wenig. Es wird vermutet, dass die Aktivität dieser Phosphatase über Tyrosin- sowie über Serin/Threonin-Phosphorylierung reguliert wird (Vincent et al., 1995). Eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung von SH-PTP2 führt vermutlich zu einer Konformationsänderung und Aktivierung dieser Phosphatase (Hof et al., 1998; Qu, 2002). SH-PTP2 ist in verschiedenste Signalwege eingebunden. Zahlreiche Studien belegen, dass diese Phosphatase viele Signalwege aktiviert. So verstärkt SH-PTP2 das Signal von EGFR (Qu et al., 1999; Qu, 2002), beeinflusst die Aktivierung der Erk MAP-Kinase Signaltransduktionskaskade (Cunnick et al., 2002), verstärkt die PI 3-Kinase/AKT-Aktivierung (Wu et al., 2001) und wurde als positiver Effektor in der Integrin-vermittelten Signalübertragung beschrieben (Oh et al., 1999; Lacalle et al., 2002). Darüber hinaus konnte eine Assoziation von SHPTP2 mit der Kinase Src nachgewiesen werden, wobei SH-PTP2 höchstwahrscheinlich über Dephosphorylierung die Src Kinase aktiviert (Peng et al., 1995). Diese Phosphatase scheint die Signaltransduktion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen sowie der extrazellulären Matrix positiv zu beeinflussen und so das Zellwachstum und die Zellmigration zu stimulieren (Yu et al., 1998; Wu et al., 2001). Bestimmte intrazelluläre Signalvorgänge wie der durch Interferon-α und -γ induzierte Jak-Stat-Signalweg werden durch die Phosphatase SH-PTP2 jedoch negativ beeinflusst (Qu, 2002). Die komplexen Regulationsmechanismen der Phosphatase SH-PTP2 sind nur ansatzweise geklärt. Bekannt ist, dass SH-PTP2 in viele Signalwege involviert ist, welche Proteine es jedoch gezielt dephosphoryliert, ist zum größten Teil noch ungeklärt (Yu et al., 1998; Oh et al., 1999). Einleitung 9 1.7 Die extrazelluläre Matrix Unter der extrazellulären Matrix versteht man die Interzellularsubstanz des Bindegewebes, welche sich aus fibrillären Proteinen, zu denen insbesondere Kollagen und Fibronektin gehören, und einer amorphen Grundsubstanz, die aus Proteoglykanen, Glykoproteinen und einer interstitiellen Flüssigkeit besteht, zusammensetzt (Adams et al., 1993). Interaktionen zwischen den Zellen und den Proteinen der extrazellulären Matrix spielen eine zentrale Rolle in der Proliferation, Migration und Differenzierung von epithelialen Zellen (Adams et al., 1993; Lam et al., 2001; Stagge et al., 2001). Die Zellen des Pankreaskarzinoms sind, im Unterschied zu Zellen anderer solider Tumore, in eine wesentlich größere Menge an extrazellulärer Matrix eingebettet (Löhr et al., 1994; Gress et al., 1995; Löhr et al., 1996). In verschiedenen Arbeiten wurde beschrieben, dass die extrazelluläre Matrix unter anderem über Aktivierung von β1-haltigen Integrinen die E-Cadherin vermittelte Zell-ZellAdhäsion stört und dass eine gestörte E-Cadherin-Funktion zu einer verstärkten Proliferation und Migration, sowie zu invasivem Tumorwachstum führt (Gumbiner et al., 1995; Boudreau et al., 1999; Menke et al., 2001). Auch konnte gezeigt werden, dass die extrazelluläre Matrix zu einer mesenchymalen Transformation von epithelialen Zellverbänden führt, welches vermutlich im Zusammenhang mit dem invasiven Zellwachstum steht (Genda et al., 2000; Menke et al., 2001). 1.8 Tumorgenese Die Tumorgenese ist sehr komplex. Viele Faktoren sind an der Auslösung der Progression beteiligt und führen dazu, dass eine normale Zelle maligne entartet und in ein unkontrolliertes Wachstum übergeht. Genetische Veränderungen spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Mutationen, Deletionen sowie Translokationen können zu einer Aktivierung von Onkogenen und zu einer Inhibition von Tumor-Suppressorgenen führen. Durch diese genetischen Veränderungen wird die Differenzierung und das kontrollierte Zellwachstum gestört und somit invasives und destruierendes Wachstum sowie Metastasierung in entfernte Organe induziert (Frixen et al., 1991; Aken et al., 2001). Störungen der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion sind entscheidend am invasiv destruierenden Wachstum und am Metastasierungsprozess der Tumorzellen beteiligt. Bei niedrig differenzierten Tumoren, die ein invasives Wachstumsmuster sowie eine ausgeprägte Metastasierungstendenz zeigen, lässt sich häufig eine Störung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion nachweisen (Takeichi, 1993; Genda et al., 2000). Hochdifferenzierte, kaum invasiv wachsende Tumore exprimieren demgegenüber deutlich mehr E-Cadherin. Einleitung 10 Eine beeinträchtigte E-Cadherin-Expression führt zur Entdifferenzierung bis hin zur mesenchymalen Transformation, welche mit stark invasivem Wachstum korreliert (Frixen et al., 1991). Aufgrund dieser Ergebnisse kann dem E-Cadherin eine Tumorsuppressorfunktion zugeschrieben werden (Chen et al., 1991; Frixen et al., 1991). In vielen humanen Karzinomen konnten genetische Veränderungen der Cadherin-Moleküle nachgewiesen werden (Genda et al., 2000). In neueren Arbeiten konnte ein Zusammenhang zwischen Integrin-vermitttelter ZellMatrix-Adhäsion und E-Cadherin-vermittelter Zell-Zell-Adhäsion nachgewiesen werden. Dabei zeigten Pankreaskarzinomzellen nach Stimulation mit Kollagen Typ I bzw. Kollagen Typ III eine verminderte E-Cadherin-Genexpression (Menke et al., 2001). Auch bei hepatozellulären Karzinomzellen, die starke Zell-Zell-Adhäsionen aufwiesen, konnte nach Stimulation mit den Proteinen der extrazellulären Matrix eine Vereinzelung der Zellen aus dem Zellverband beobachtet werden (Genda et al., 2000). Die Regulationsvorgänge der Zell-Zell- sowie der Zell-Matrix-Adhäsion sind komplex und von sehr vielen Faktoren abhängig, so dass die genauen Regulationsmechanismen der Tumorinvasion und Metastasierung nach wie vor ungeklärt sind. Zielsetzung der Arbeit 11 2 Zielsetzung der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss der Proteine der extrazellulären Matrix auf die Phosphorylierung und Stabilität des E-Cadherin-Komplexes in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien zu untersuchen. Ein intakter E-Cadherin-Komplex ist Vorraussetzung für eine stabile Zell-Zell-Adhäsion. Zahlreiche Arbeiten beschreiben einen Zusammenhang zwischen gestörter E-Cadherin-vermittelter Zell-Zell-Adhäsion und invasivem Verhalten der Tumorzellen. Es konnte gezeigt werden, dass die Proteine der extrazellulären Matrix die E-Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion stören und dass der Verlust von E-Cadherin das Proliferations- und Migrationverhalten der Tumorzellen steigert. In diesem Zusammenhang sollte untersucht werden, welchen Einfluss die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin der extrazellulären Matrix auf die Stabilität des E-Cadherin-Komplexes haben. Dabei sollte analysiert werden, ob die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin zu einer Lokalisationsänderung von E-Cadherin sowie α- und β-Catenin führen, wobei vor allem der Translokation von β-Catenin eine zentrale Bedeutung zukommt. Darüber hinaus sollte geklärt werden, wie Kollagen Typ I oder Fibronektin die Proteinmenge der Catenine am ECadherin-Komplex beeinflussen. Weiter sollte untersucht werden, ob Kollagen Typ I bzw. Fibronektin die Phosphorylierung von α- und β-Catenin verändern. Von zentraler Bedeutung in diesem Zusammenhang ist, welche Kinasen und Phosphatasen nach Stimulation mit den Proteinen Kollagen Typ I und Fibronektin einen Einfluss auf die Phosphorylierung des E-Cadherin-Komplexes nehmen könnten. Dabei wurde zuerst analysiert, welche Kinasen und Phosphatasen am E-CadherinKomplex gebunden vorliegen. Anschließend sollte geklärt werden, wie sich die Proteinmenge der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen und Phosphatasen unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin verändert. Um Aussagen über Aktivierung bzw. Inhibition der Kinasen und Phosphatasen im Zusammenhang mit der Phosphorylierung des E-Cadherin-Komplexes machen zu können, wurde der Phosphorylierungsgrad der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen und Phosphatasen nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin untersucht. Darüber hinaus sollte das Proliferationsverhalten der Zelllinie Panc-1 in Abhängigkeit der Matrixproteine näher analysiert werden. Die verschiedenen Analysen sollen den Einfluss der Proteine der extrazellulären Matrix auf die E-Cadherin vermittelte Zell-Zell-Adhäsion näher erklären, um so neue Erkenntnisse über Regulation der Proliferation, Metastasierung und invasives Tumorwachstum von Pankreaskarzinomzellen zu erhalten. Material und Methoden 12 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antikörper Tab. 1: Erstantikörper 1. Antikörper aus Spezies Hersteller Typ AntikörperVerdünnung Anti-β-Aktin Maus Sigma WB: 1:5000 Anti-α-Catenin Maus Transduction Labo- WB: 1:1000 ratories IF: 1:100 Sigma WB: 1:5000 Anti-α-Catenin Kaninchen IF: 1:500 Anti-β-Catenin Anti-β-Catenin Maus Kaninchen Transduction Labo- WB: 1:2000 ratories IF: 1:200 Sigma WB: 1:5000 IF: 1:500 Anti-E-Cadherin Anti-FAK Maus Maus Anti-FAK Kaninchen Phosphotyrosin 397 Anti-p120ctn Transduction Labo- WB: 1:4000 ratories IF: 1:100 Transduction Labo- WB: 1:1000 ratories IF: 1:100 BioSource WB: 1:2000 International Transduction Labo- WB: 1:1000 ratories IF: 1:100 Santa Cruz Biotech- WB: 1:1000 nology IF 1: 100 Anti-Phosphotyrosin: Maus Transduction Labo- WB: 1:2500 HRPO (py 20) ratories Anti-p120 ctn Maus (S-19) Kaninchen Anti-PI3-Kinase Kaninchen Upstate WB: 1:2000 Anti-PP2A Maus Transduction Labo- WB: 1:5000 ratories Material und Methoden 1. Antikörper 13 aus Spezies Hersteller Typ Anti-PTEN AntikörperVerdünnung Kaninchen Alexis Biochemicals WB: 1:1000 IF: 1:100 Anti-PTEN Kaninchen Cell Signaling Tech- Phosphoserin 380 WB: 1:1000 nology Anti-SH-PTP2 Kaninchen Anti-Src Maus Anti-Src Kaninchen Phosphotyrosin 416 Santa Cruz Biotech- WB: 1:2000 nology IF: 1:100 Upstate Biotech- WB: 1:1000 nology IF: 1:100 Cell Signaling Tech- WB: 1:1000 nology Tab. 2: Zweitantikörper 2. Antikörper aus Spezies Hersteller gekoppelt mit AntikörperVerdünnung Anti-Maus IgG Ziege Sigma alkalische WB 1:5000 Phosphatase Anti-Maus IgG Ziege Pierce Peroxidase WB: 1:7500 Anti-Maus IgG Ziege Dianova Cy3 IF: 1:1000 Anti-Kaninchen Maus Dianova alkalische WB: 1:5000 IgG Anti-Kaninchen Ziege Phosphatase Sigma Peroxidase WB: 1:5000 Pierce Peroxidase WB: 1:7500 Dianova Cy3 IF: 1:1000 Anti-Kaninchen Ziege Alexis Alexa 488 IF: 1:1000 IgG Biochemicals IgG Anti-Kaninchen Ziege IgG Anti-Kaninchen Ziege IgG Material und Methoden 3.1.2 14 Puffer und Lösungen Alle verwendeten Puffer und Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser hergestellt und autoklaviert bzw. steril filtriert. Alkalischer 50 mM Tris-HCL Phosphatasepuffer: 50 mM MgCl2 pH=9,4 Antikörperverdünnungslösung: 0,3% BSA (M/V) in CMF-PBS CMF-PBS: 140 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM KH2PO4 10 mM NaH2PO4 pH=7,4 CMF-PBS mit Tween : CMF-PBS und 0,02% Tween (V/V) Elektrophoreselaufpuffer (10 x): 0,5 M Trisma Base 1,5 M Glycin 1% SDS (M/V) Immunpräzipitations- 20 mM Tris-HCl, pH=7,4 Puffer (2 x): 300 mM NaCl 2% Triton (V/V) 1% Nonidet P-40 (V/V) KRH-Puffer (10 x): 250 mM HEPES, pH=7,4 1,04 M NaCl 50 mM KCl 10 mM KH2PO4 12 mM MgSO4 Material und Methoden 15 Nährlösung für „Dulbecco`s modified Eagle medium” Zellkultur: 10% FCS (fötales Kälberserum) (V/V) 1% L-Glutamin (V/V) 1% nicht essentielle Aminosäuren (V/V) NOP-Lysepuffer: 10 mM Tris-HCl, pH=7,8 150 mM NaCl 1 mM MgCl 1 mM CaCl2 1% Nonidet P-40 (V/V) Proteinprobenpuffer 4 x 62,5 mM Tris-HCl, pH= 6,8 (nach Laemmli): 2% SDS (M/V) 10% Glycerol (V/V) 5% Mercaptoethanol (V/V) 0,2% Bromphenolblau (M/V) Proteinprobenpuffer 0,2 M Tris-HCl, pH=8,8 Stammlösung: 1 M Saccharose 5 mM EDTA 0,2% Bromphenolblau (M/V) pro 250 µl Stammlösung, Zugabe von: 50 µl SDS 20 mg DTT (1,DithioDL-threitol) Puffer für Plasmamembran- Puffer A: präparation: 50 mM HEPES, pH=7,6 10 mM EDTA 10 mM EGTA Puffer B: Puffer A und 8,6% Saccharose (M/V) Material und Methoden 16 Puffer C: Puffer A und 40% Saccharose (M/V) RIPA-Puffer: 1% Triton X-100 (V/V) 1% Natrium Deoxycholat (M/V) 0,1% SDS (M/V) 150 mM NaCl 50 mM Tris-HCl, pH=7,2 20 mM EDTA 20 mM EGTA TBS-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH= 7,4 1,5 M NaCl Protein- 25 mM Trisma Base Transferpuffer : 0,1% SDS (M/V) 1,5% Glycin (M/V) 20% Methanol (V/V) mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt Triton Puffer: KRH-Puffer (1 x) 0,5% Triton X-100 (V/V) 0,3 M Saccharose 3.1.3 Proteinase- und Phosphataseinhibitoren (Konzentration der Endlösung) Proteinaseinhibitoren: Leupeptin 10 µM (Roche) Pefabloc 1 mM (Roche) Pepstatin 10 µM (Sigma) STI 5 mM (Roche) Trasylol 5 µM (Bayer) Material und Methoden 17 Phosphataseinhibitoren: 3.1.4 β-Glycerophosphat 1 mM (Sigma) Natriumfluorid 1 mM (Sigma) Natriumorthovanadat 5 mM (Sigma) Natriumpyrophosphat 1 mM (Fluka) Geräte Fluoreszenzmikroskop, DMIRB (Leica) Gelelektrophoresekammer, SDS-PAGE (Sigma) Immunoblot Transferkammer (Sigma) Inkubator, Heracell (Kendro Laboratory Products) Kühlzentrifuge, Biofuge Fresco (Heraeus) Laborzentrifuge, Labofuge 400 (Heraeus) Phasenkontrastmikroskop, Axiovert (Zeiss) pH-Meter (Siemens) Photometer, Smart SpecTM 3000 (BIO RAD) sterile Werkbank, HERA SAFE (Kendro Laboratory Products) Tischzentrifuge, 5417C (Eppendorf) Ultrazentrifuge, TL-100 (Beckmann) 3.1.5 Sonstiges Acrylamid 30% (M/V) (Roth) Bisacrylamid 2% (M/V) (Roth) ECL-Western Blot Detektionskit (Pierce) Nitrocellulose BA 85 (Schleicher und Schüll) PVDF-Membran (Millipore) Röntgenfilm, Cronex 5 (Agfa) Zellkulturmaterialien (Falcon, Becton Dickinson) Molekulargewichtsstandard für Proteine: „Sigma prestained molecular weight standard mixture”, (Sigma) „Sigma low range”, „ Sigma high range” (Sigma) Protein-A-Affinity-Gel (Sigma) Material und Methoden 18 3.2 Methoden 3.2.1 Zellkultur Tab 3: verwendete Zelllinien Zelllinie Herkunft Bezugsquelle AsPc-1 humane Pankreaskarzinom- ATCC zelllinie Nr. CRL-1682 humane Pankreaskarzinom- ATCC zelllinie Nr. CRL-1687 humane Pankreaskarzinom- ATCC zelllinie Nr. CRL-1469 humane ATCC Kolonkarzinomzelllinie Nr. CRL-228 BxPc-3 Panc-1 SW-480 ATCC= American Type Culture Collection Die Zelllinie AsPc-1 stammt aus der Aszitesprobe einer 62 jährigen Patientin mit einem Adenokarzinom des Pankreas. Es handelt sich hierbei nach histologischer Untersuchung des Primärtumors um ein gut differenziertes duktales Karzinom (Chen et al., 1982). Die Zelllinie BxPc-3 wurde aus einer Biopsie eines Adenokarzinoms des Pankreaskorpus einer 61 jährigen Patientin gewonnen. In der histologischen Untersuchung ist dieser Tumor mäßig bis schlecht differenziert (Tan et al., 1986). Die Zelllinie Panc-1 stammt aus dem Pankreaskarzinom eines 56jährigen Mannes, das ein gering differenziert duktales Adenokarzinom war (Lieber et al., 1975). Die Kolonkarzinomzelllinie SW-480 wurde aus einem primären Adenokarzinom des Kolons eines 50 jährigen Mannes gewonnen (Lelbovitz et al., 1979). Die Zellen wurden in Brutschränken bei 37°C und 10% CO2 in „Dulbecco`s modified Eagle Medium“ (DMEM) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% L-Glutamin und 1% nicht essentiellen Aminosäuren kultiviert. Alle zwei Tage wurde das Nährmedium gewechselt. Zellen mit einer Konfluenz von 80 bis 100% wurden auf folgende Weise umgesetzt: Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit CMF-PBS-Puffer unter Zusatz von 5 mM EDTA und 5 mM EGTA 1 Minute für Panc-1 und SW-480, 5 Minuten für AsPc-1 und 10 Minuten für BxPc-3 gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit einer Trypsinlösung aus CMF-PBS und 1% Rinderpankreastrypsin versetzt. Je nach Zelllinie dauerte der Ablösevorgang 1-15 Minuten. Um die Enzymreaktion zu stoppen, wurde Material und Methoden 19 Wachstumsmedium dazugegeben. Die Zellsuspension wurde anschließend 3 Minuten bei 200x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Zellsediment in 6 ml Wachstumsmedium resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden im Verhältnis 1:4 bis 1:9 in neue Zellkulturgefäße mit vorgelegtem Medium gleichmäßig verteilt. Für Immunblot- und Immunfluoreszenz-Analysen wurden 1x104 bis 1x106 Zellen auf unbeschichtete sowie auf Kollagen Typ I- und Fibronektin-beschichtete 10 cm Schalen bzw. Deckgläschen ausgesät. Hierfür wurden die Zellen, nachdem sie abzentrifugiert wurden, in eine Neubauer-Zählkammer gebracht und im Mikroskop die Zellzahl im Zählkreuz bestimmt. 3.2.2 Herstellung von Proteinlysaten Zur Analyse der Proteinlysate wurden 90 bis 100% konfluent gewachsene Zellen in 60 mm oder 100 mm Schalen mit NOP-, RIPA- bzw. Triton-Puffer aufgearbeitet. Die verschiedenen Puffer unterscheiden sich durch ihre Detergenzien. Während bei der Aufarbeitung mit NOP-Puffer die Proteinkomplexe weitgehend erhalten bleiben, führt die RIPAAufarbeitung zur Auftrennung in Einzelproteine. Triton-Puffer löst die Membran auf, so dass die frei im Zytosol gelösten Proteine sowie die löslichen Membranproteine (tritonlösliche Fraktion) von den Proteinen, die mit dem Zytoskelett verankert sind (tritonlösliche Fraktion), getrennt werden können. Für die Herstellung der Proteinlysate wurden die Zellen mit 4°C kaltem CMF-PBS-Puffer gewaschen und anschließend mit 400 µl (60 mm Schalen) bzw. 600 µl (100 mm Schalen) 4°C kaltem NOP- oder RIPA-Puffer, welchem die Proteinaseinhibitoren Leupeptin (0,1 mM), Pefabloc (1 mM), Pepstatin (10 µM), STI (5 mM) und Trasylol (5 µM) zugesetzt wurden, auf Eis 1 Minute inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Gummischaber abgekratzt und in einem Dounce-Glashomogenisator durch 10 Züge zerkleinert. Die homogenisierten Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben und 15 Minuten bei 4°C und 13 000x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei –80°C für weitere Analysen (Westernblot und Immunpräzipitation) eingefroren. Die gesamte Zellaufarbeitung wurde auf Eis bei 0°C durchgeführt. Um den Phosphorylierungsgrad der verschiedenen Proteine nachweisen zu können, wurden die Zellen 10 Minuten im Inkubator bei 37°C und 10% CO2 mit 125 µM Natriumorthovanadat und 125 µl Wasserstoffperoxid stimuliert. Die Zellen wurden danach mit 4°C kaltem TBS-Puffer gewaschen. Die Aufarbeitung erfolgte wie oben, nur dass zu dem verwendeten Material und Methoden 20 Puffer inklusiv Proteinaseinhibitoren noch zusätzlich die Phosphataseinhibitoren βGlycerophosphat (1 mM), Natriumfluorid (1 mM), Natriumorthovanadat (5 mM) und Natriumpyrophosphat (1 mM) zugegeben wurden. Für die Auftrennung der Proteine mit Triton X-100 wurden die Zellen wie oben mit CMFPBS-Puffer gewaschen, mit 400 µl (bei 60 mm Schalen) bzw. 600 µl (bei 100 mm Schalen) 4°C kaltem Triton-Puffer, dem vorher Proteinaseinhibitoren zugegeben wurde, versetzt und danach 10 Minuten schüttelnd auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Gummischaber abgekratzt, mit einer Injektionsnadel durch dreimaliges Aufund Abziehen durch Scherkräfte aufgeschlossen, in ein Reaktionsgefäß überführt und 10 Minuten bei 4°C und 13 000x g zentrifugiert. Der Überstand (tritonlösliche Fraktion) wurde abgenommen und bei –80°C eingefroren. Das Sediment wurde mit 150 bzw. 250 µl RIPA-Puffer mit den zuvor zugesetzten Proteinaseinhibitoren resuspendiert und mit dem Dounce-Homogenisator zerkleinert. Die Zellsuspension wurde erneut 10 Minuten bei 4°C und 13 000x g zentrifugiert. Der Überstand enthält nun die tritonunlösliche Fraktion. Dieser wurde ebenfalls bei –80°C für weitere Analysen eingefroren. 3.2.3 Membranpräparation Mit dieser Methode lassen sich Proteine, die an oder in der Zellmembran lokalisiert sind von denen, die frei im Zytoplasma gelöst vorliegen, trennen. Für die Aufreinigung von Plasmamembranen wurden 90 bis 100% konfluent bewachsene 150 cm2 Zellkulturflaschen, nach Absaugen des Nährmediums, mit 4°C kaltem CMF-PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml 4°C kaltem Puffer B mit den zugesetzten Proteinaseinhibitoren Leupeptin (23 mM), Pefabloc (1 mM), Pepstatin (14,7 mM), STI (500 mM) überschichtet und gleich danach mit einem Gummischaber abgekratzt. Mit Hilfe eines Teflonhomogenisators erfolgte die manuelle Zerkleinerung der Zellen durch 10 Züge. Vorher wurden 2,4 ml 4°C kalter Puffer C mit den entsprechenden Proteinaseinhibitoren in ein Ultrazentrifugenröhrchen gegeben. Das Homogenat wurde danach vorsichtig darüber geschichtet, so dass sich zwei Schichten bilden. Anschließend wurden die Röhrchen, nachdem sie auf der Waage austariert wurden, in die Ultrazentrifuge gegeben und 30 Minuten bei 4°C und 100 000x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation lassen sich drei Schichten erkennen. Die oberste enthält die zytosolische Fraktion, welche abgenommen und bei –80°C eingefroren wurde. Die mittlere, an der Grenze der beiden Lösungen, besteht aus einem dünnen weißlichen Band. Hierbei han- Material und Methoden 21 delt es sich um die Plasmamembranfraktion. Diese wird abgenommen und deren Volumen mit einer Pipette gemessen. Anschließend wird die Membranfraktion in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen gebracht. Dessen Volumen wird mit dem vierfachen Volumen von Puffer A und den darin gelösten Proteinaseinhibitoren verdünnt. Das Sediment enthält Kerne, Mitochondrien und weitere große Bestandteile. Die mit dem Puffer A verdünnte Membranfraktion wurde bei 4°C und 100 000x g für 60 Minuten in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Das Sediment enthält die Membranfraktion und wurde mit 100 µl 4°C kaltem RIPA-Puffer und den vorher zugesetzten Proteinaseinhibitoren resuspendiert. Die Plasmamembranfraktion wurde ebenfalls zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Alle Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt. 3.2.4 Immunpräzipitation Unter Immunpräzipitation versteht man die Ausfällung eines löslichen Antigens durch Antikörper. Werden nun lösliche Antigene mit den für sie spezifischen Antikörpern vermischt, führt dies zur Antigen-Antikörper-Reaktion. Als Trägersubstanz wurde Protein-AAffinitäts-Gel, ein IgG Rezeptor aus Staphylokokkus aureus, eingesetzt. Das Protein-AAffinitäts-Gel bindet IgG Antikörper an ihrem Fc-Ende. Die immobilisierten Antikörper erkennen nun das Antigen, was zu einer spezifischen Anreicherung des Antigens und somit zu einer Extraktion der Antigen-Antikörper-Komplexe aus dem Zelllysat führt. Bei der Immunpräzipitation wurde zuerst 30 µl Protein-A-Affinity-Gel mit je 500 µl Immunpräzipitations-Puffer zweimal gewaschen. Dies bedeutet, dass jeweils 500 µl des Puffers zum Protein-A-Affinitäts-Gel in ein Reaktionsgefäß zugegeben, danach durch invertieren gemischt, anschließend 1 Minute bei 1 000x g zentrifugiert und zum Schluss der Überstand abgenommen wurde. Je nachdem welcher Proteinkomplex aus dem Zelllysat extrahiert werden soll, wurden anschließend 4 bis 7 µl des Antikörpers gegen das zu analysierende Antigen mit Protein-A-Affinitäts-Gel und 500 µl Immunpräzipitations-Puffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dies führt zur Bindung des Antikörpers an das Protein-A-Affinitäts-Gel. Nach der Inkubation wurde der Antikörper-Protein-A-Affinitäts-Gel-Komplex eine Minute bei 1 000x g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Anschließend wurden die vorher auf Eis aufgetauten Proteinlysate (500 µg bis 4000 µg, je nach dem zu untersuchenden Proteinkomplex) dem Sediment zugegeben. Danach wurden die Proben mit 4°C kaltem Material und Methoden 22 Immunpräzipitations-Puffer, der vorher mit den Proteinaseinhibitoren Leupeptin (10 µM), Pefabloc (1 mM), STI (5 mM) und Trasylol (5 µM) bzw. um den Phosphorylierungsgrad der Proteine bestimmen zu können, noch zusätzlich mit den Phosphataseinhibitoren βGlycerophosphat (1 mM), Natriumfluorid (1 mM), Natriumorthovanadat (5 mM) und Natriumpyrophosphat (1 mM) versetzt wurde, auf 750 µl aufgefüllt. Die Proben wurden durch invertieren gemischt und 2 Stunden bei 4°C im “Überkopf-Schüttler“ inkubiert, um die Bindung des Antigens an den Protein-A-gekoppelten Antikörper zu gewährleisten und somit das Protein bzw. den Proteinkomplex aus dem Zelllysat zu extrahieren. Nach der Inkubation wurden die Proben wieder eine Minute bei 1 000x g in der Kühlzentrifuge bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit der Mikroliterspritze abgesaugt. Je nach eingesetzter Proteinmenge (500 µg bis 4000 µg) wurden die Proben drei- bis sechsmal mit 500 µl Immunpräzipitations-Puffer, dem vorher Proteinaseinhibitoren bzw. zusätzlich Phosphataseinhibitoren zugegeben wurde, gewaschen. Nach jedem Waschvorgang wurden die Proben wie oben zentrifugiert. Durch die einzelnen Waschschritte werden die unspezifisch gebundenen bzw. frei im Zelllysat vorhandenen Proteine eliminiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand vollständig mit einer Mikroliterspritze abgesaugt. Das Sediment wurde in 25 µl Proteinprobenpuffer resuspendiert. Danach wurden die Proben 10 Minuten bei 95°C in einem Heizblock erhitzt und kurz abzentrifugiert. Das Aufkochen führt zur Denaturierung sowie zu einer Trennung der Antigen-AntikörperKomplexe von dem Protein-A-Affinitäts-Gel und zu einer Dissoziation des Antigens vom Antikörper. Anschließend wurden die extrahierten Proteine mittels Gelelektrophorese und Immunblotverfahren nachgewiesen. 3.2.5 Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA (Bicinchoninic Acid) Die Bestimmung der Konzentration der Proteine im Zelllysat erfolgte spektralphotometrisch nach dem Lambert-Beerschen Gesetz. Dazu wurde ein Kit der Firma Sigma (Nr. BCA-1) verwendet. Um den Proteingehalt der Proben zu bestimmen, wurden jeweils 5 µl des Proteinlysates mit 45 µl Wasser 1:10 verdünnt und zu jeder Probe 1 ml Farbreagenz, bestehend aus 50 Teilen „Bicinchoninic Acid“ Lösung und einem Teil Kupfer-II-sulfatLösung, gegeben. Die Proben wurden gemischt, 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Als Bezug dient eine Eichgerade. Hierfür wurde mit einer BSA-Stammlösung eine Konzentrationsreihe von 0 µg, 20 µg, 40 µg, 60 µg, 80 µg sowie 100 µg Protein/ml und 1 ml Material und Methoden 23 Farbreagenz hergestellt. Daraufhin wurde die Absorption der Proben im Photometer bei λ 562 nm gemessen. Die Proteinkonzentration kann entweder graphisch aus der Steigung der Eichgeraden abgelesen oder berechnet werden. Nach mathematischer Berechnung ergibt sich die Proteinkonzentration in mg/ml aus dem Mittelwert der Absorptionswerte multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor und dividiert durch die eingesetzte Proteinmenge in ml. 3.2.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die zu analysierenden Proteingemische wurden in den von Laemmli (1970) beschriebenen diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen nach ihrem Molekulargewicht elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurde die eindimensionale SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), eine Vertikalapparatur, bestehend aus zwei senkrechten, 6 x 8 cm großen Glasplatten, im Abstand von 1 mm, verwendet. Die Auftrennung erfolgte in einer Matrix aus Acrylamid, das durch Bisacrylamid quervernetzt wird. Durch Inkubation mit dem anionischen Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) werden über hydrophobe Wechselwirkungen die Eigenladungen der Proteine so stark überdeckt, dass sie vernachlässigt werden können. Somit ist, aufgrund der konstanten negativen Ladung, die Beweglichkeit der Proteine proportional zu ihrer Masse. Um die chemische Polymerisation der Acrylamidmonomere zu starten, wurde APS (Ammoniumperoxidisulfat) eingesetzt, während TEMED (Tetramethylethylendiamin) die Reaktion katalysierte. Für die elektrophoretische Trennung der Proteine wurden, je nach Molekulargewicht des gesuchten Proteins und je nach erforderlicher Trennschärfe, unterschiedlich konzentrierte acrylamidhaltige Trenngele hergestellt, wobei hoch konzentrierte Gele für Proteine mit geringer Masse verwendet wurden. Diese hochkonzentrierten Gele liefern darüber hinaus auch eine höhere Trennschärfe. Material und Methoden 24 Tab 4: Zusammensetzung der Gele Trenngel Trenngel Trenngel Trenngel Sammelgel 7,5% 8,5% 10% 12% 7,5% 30% Acrylamid 0,81 ml 1,4 ml 1,6 ml 2,0 ml 190 µl 2% Bisacrylamid 0,32 ml 0,57 ml 0,65 ml 0,81 ml 75 µl Tris-HCl (3 M, pH 8,8) 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml - Tris-HCl (1 M, pH 6,8) - - - - 190 µl SDS 10%ig 48 µl 48 µl 48 µl 48 µl 15 µl Saccharose 60% - - - - 375 µl dest. Wasser 3,0 ml 2,1 ml 1,9 ml 1,3 ml 0,65 ml TEMED 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2,5 µl APS 10%ig 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 15 µl Trennbereiche (kDa) 90-150 kDa 70-120 kDa 40-100 kDa 20-60 kDa Gelmenge Zunächst wurden die Trenngele durchmischt und zwischen die zwei mit Alkohol gereinigten und abgedichteten Glasplatten bis ca. 2 cm unterhalb der oberen Glaskante gegossen. Zum Schutz gegen Austrocknung wurden die Gele mit Wasser überschichtet. Nach einer Polymerisationszeit von mindestens zwei Stunden wurde das überstehende Wasser entfernt und der Gelrand mit Filterpapier getrocknet. Anschließend wurde das Sammelgel durchmischt, bis zur Oberkante der Glasplatten eingefüllt und mit Hilfe eines Kammes Taschen für die verschiedenen Proben hergestellt. Die zu analysierenden Proben wurden mit 1/3 Proteinprobenpuffer nach Leammli versetzt und bei 95°C für 10 Minuten erhitzt. Das dem Puffer zugesetzte SDS führt durch Aufspaltung der Wasserstoffbrückenbindungen zur Auflösung der Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine. Durch die Thiolverbindungen Mercaptoethanol oder Dithiothreithol werden die Disulfidbrückenbindungen zwischen den Molekülen gespalten. All diese Vorgänge führen zur Denaturierung der Proteine. Die nun vorbereiteten Proben wurden in die Taschen gefüllt. Um die Molekulargewichte der einzelnen Proteine bestimmen zu können, wurden standardisierte Größenmarker wie „Sigma prestained“, „Sigma high range“ und „Sigma low range“ verwendet. Die Identifizierung der Molekülgrößen der gesuchten Proteine erfolgte nun aus dem Vergleich der Banden mit dem im Gel mitlaufenden Marker. Danach wurden die Proteine zunächst im Sammelgel bei 80 V und 400 mA und anschließend im Trenngel bei 140 V und 400 mA getrennt. Material und Methoden 25 Die Acrylamidgele wurden im Westernblot auf Nitrocellulose- bzw. PVDF-Membranen transferiert oder mit Coomassie-Blau gefärbt. 3.2.7 Färbung der Proteingele mit Coomassie-Blau Um die Qualität der aufgearbeiteten Proteine beurteilen zu können und auch um deren Gleichmäßigkeit beim Auftragen zu überprüfen, wurden die Gele in einer Coomassieblaulösung (0,025% Coomassie Brilliant Blue, 10% Essigsäure und 25% Isopropanol in Wasser) fixiert und gefärbt. Danach wurden sie wieder in einer Lösung aus 10% Essigsäure und 12,5% Isopropanol in Wasser so weit entfärbt, bis der unspezifische Hintergrund entfernt und nur noch die Proteinbanden angefärbt waren. Die Gele wurden anschließend in einer Folie getrocknet. 3.2.8 Immunblot Für die Übertragung der Proteine kam ein Blot mit folgendem Aufbau zum Einsatz: Anodengitter, Faserpolster, Filterpapier, Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membran, Trenngel, Filterpapier, Faserpolster, Kathodengitter. Vor dem Zusammenbauen der Blots wurden Faserpolster, Filterpapier und Trenngel 10 Minuten in Transferpuffer bzw. die Membranen 10 Minuten in destilliertem Wasser gewaschen, wobei die PVDF-Membran zuvor noch mit Methanol aktiviert werden musste. Anschließend wurden die Blots in die TankblotKammer eingesetzt und mit Transferpuffer überschichtet. Der Proteintransfer auf die Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membran erfolgte bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren über eine Dauer von 10 Stunden. Dabei wurde eine Spannung von 20 V und eine Stromstärke von 150 mA angelegt. Hierdurch wanderten die negativ geladenen Proteine von der Kathode zur Anode und wurden somit vom Acrylamidgel auf die Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membran transferiert. 3.2.9 Ponceaurotfärbung von Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membranen Zur Beurteilung der Effizienz des Proteintransfers wurden die Nitrozellulose- bzw. PVDFMembranen zuerst mit Wasser gewaschen und anschließend mit Ponceaurot reversibel gefärbt. Bei gelungenem Übertragungsvorgang ließen sich die Proteinbanden gleichmäßig und gut erkennbar anfärben. Die Banden der Referenzproteine wurden mit Kugelschreiber markiert. Danach wurden die Blots zurechtgeschnitten und mit CMF-PBS wieder entfärbt. Material und Methoden 26 3.2.10 Immunfärbung Um die gesuchten Proteine auf der Nitrozellulose- bzw. PVDF-Membran nachweisen zu können, wurden die Membranen in einer Lösung aus einem spezifischen Antikörper, der gegen das zu analysierende Antigen gerichtet ist, inkubiert. Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen auf der Nitrozellulose- bzw. PVDFMembran wurden die Blots zuerst, je nach Antikörper, in CMF-PBS mit 3% Magermilchpulver, in CMF-PBS mit 3% BSA oder in einer Lösung aus 3% Magermilchpulver und 2% BSA in CMF-PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C auf einem Schüttler inkubiert. Nach diesem Vorgang wurde der Blot mit CMF-PBS gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem ersten Antikörper in der entsprechenden Verdünnung (Tab. 1) in CMF-PBS mit 0,3% BSA 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C schüttelnd inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Membran einmal mit CMF-PBS und 0,02% Tween und zweimal mit CMF-PBS jeweils 5 Minuten gewaschen. Je nachdem, mit welcher Färbemethode (Chemilumineszenz oder alkalische Phosphatase) die gesuchten Proteine nachgewiesen werden sollen, wurden unterschiedliche Zweitantikörper (die an das Enzym Peroxidase oder alkalischer Phosphatase gekoppelt) in der empfohlenen Verdünnung (Tab. 2), verwendet. Um den Phosphorylierungsgrad, der auf die Nitrozellulose- oder PVDF-Membran transferierten Proteine nachweisen zu können, wurden zuerst die freien Bindungsstellen der Membran mit 3% BSA oder 5% Magermilchpulver in TBS und 0,1% Tween, je nach Antikörper, 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und anschließend mit TBS gewaschen. Danach wurde die Membran mit einem spezifischen gegen Tyrosin- oder Serinphosphorylierungsstellen des entsprechenden Proteins gerichteten Erstantikörper bei 4°C über Nacht inkubiert. Der Antikörper wurde gemäß der empfohlenen Verdünnung (Tab. 1) in eine Lösung aus 5% BSA in TBS und 0,1% Tween gegeben. Der Blot wurde wiederum dreimal jeweils 5 Minuten mit TBS gewaschen und mit einem HRP-gekoppelten Zweitantikörper (Tab. 2) in TBS und 0,1% Tween mit 5% Magermilchpulver 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. 3.2.11 Proteindetektion durch Chemilumineszenz Bei der ECL (enhanced chemiluminescence) Entwicklung erfolgte der Nachweis des gesuchten Proteins durch einen Zweitantikörper, an den das Enzym HRP (Meerettichperoxidase) gekoppelt ist. Material und Methoden 27 Zur Detektion der Proteine wurden die beiden ECL-Reagenzien in einen Verhältnis von 1:1 gemischt und die Blots mit dieser Lösung 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Membranen getrocknet, auf eine Glasplatte gebracht und mit einer Frischhaltefolie abgedeckt. Die Chemilumineszenz konnte dann durch Auflegen eines Röntgenfilms dargestellt werden. Hierbei wird das in den ECL-Kits enhaltene Luminol in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oxidiert und in einen energiereicheren angeregten Zustand überführt. Unter Photonenemission wird der Grundzustand wieder erreicht, was zur Schwärzung des aufgelegten Röntgenfilms führt. Die Belichtungszeit variiert je nach Stärke des Signals zwischen 2 Sekunden und 45 Minuten. 3.2.12 Proteindetektion durch alkalische Phosphatase Die alkalische Phosphatase-Entwicklung stellt eine weitere Färbemethode dar, um gesuchte Proteine zu detektieren. Hierbei können auch Blots, bei denen bereits Proteine durch Chemilumineszenz nachgewiesen wurden, nachgefärbt werden. Bei der Proteindetektion durch alkalische Phosphatase ist der Zweitantikörper an das Enzym alkalische Phosphatase gekoppelt. Nach dreimaligem Waschen der Blots mit CMF-PBS folgten zwei Waschschritte mit alkalischem Waschpuffer. Zur Entwicklung der Blots wurde ein Teil NBT (30 mg 4-Nitroblau Tetrazolium Chlorid, gelöst in 1 ml 70% N,N-dimethylformamid) und ein Teil BCIP (15 mg 5-Brom-4-Chlor-Indolyl-Phosphat, gelöst in 1 ml 100% N,N-dimethylformamid) mit 100 Teilen alkalischem Phosphatpuffer gemischt. Mit dieser Färbelösung wurden die Blots bis zum Sichtbarwerden der gesuchten Banden im Dunkeln inkubiert. Dabei findet folgende chemische Reaktion statt: Die Abspaltung eines Phosphatrestes von BCIP wird durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysiert. Das so entstandene Indoxylderivat wird durch NBT oxidiert und lässt sich als blauer Niederschlag erkennen. Dieser wird durch das reduzierte ebenfalls blaue NBT verstärkt. Nach Erreichen der gewünschten Intensität wurde die Reaktion durch Abwaschen der Membranen mit destilliertem Wasser abgestoppt. Die noch feuchten Blots wurden gleich danach eingescannt, da die Kontraste sich bei trockenen Blots verringern. 3.2.13 Immunfluoreszenzfärbung Mit der Immunfluoreszenzfärbung kann die räumliche Lokalisation der verschiedenen Proteine in der Zelle nachgewiesen werden. Hierfür wurden 1x104 bis 5x105 Zellen auf unbe- Material und Methoden 28 schichtete und auf Kollagen Typ I- bzw. Fibronektin-beschichtete Deckgläschen in 6erWell-Kulturplatten ausgesät. Nachdem die Zellen auf den Deckgläschen 70 bis 80% konfluent gewachsen waren, wurden sie mit CMF-PBS gewaschen, mit –20°C kaltem Methanol und Aceton im Verhältnis 1:1 überschichtet und bei Raumtemperatur 20 Minuten fixiert. Nach erneutem Waschen mit CMF-PBS wurden unspezifische Bindungen 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 3% BSA in CMF-PBS blockiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem ersten Antikörper, sowie für den Nachweis der Zellkernmorphologie mit DAPI, in einer feuchten Kammer, in der in Tab. 1 vorgegebenen Verdünnung in CMF-PBS mit 0,3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Deckgläschen wurden einmal mit CMF-PBS und 0,02% Tween und zweimal mit CMF-PBS für jeweils 5 Minuten gewaschen und anschließend bei Raumtemperatur 1 Stunde abgedunkelt mit dem zweiten Antikörper nach Tab. 2 in einer Lösung aus 0,3% BSA in CMF-PBS inkubiert. Der Zweitantikörper ist an den Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder Alexa 488 gekoppelt. Die Zellen wurden wieder dreimal mit CMF-PBS und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach wurden die Deckgläschen mit einem Tropfen Mowiol-Lösung auf einem Objektträger fixiert. Mit dem Fluoreszenzmikroskop von Leica wurden die Objekte betrachtet und die Lokalisation der Proteine in der Zelle photografisch dokumentiert. 3.2.14 Statistik und Auswertung Die durch Chemilumineszenz sowie alkalischer Phosphatase nachgewiesenen Proteine wurden eingescannt und mit Hilfe des PC-Programms Adobe Photoshop 5.0 bearbeitet. Die Auswertung der Immunfluoreszenzfärbungen erfolgte im Openlab-Programm. Die Proliferationsanalyse der Zellen, welche auf den verschiedenen Proteinen der extrazellulären Matrix gewachsen waren, wurde statistisch ausgewertet. Es wurden drei unabhängige DAPI-Färbungen, mit denen die Mitosen der Zellkerne nachgewiesen werden können, durchgeführt. Die DAPI-Färbungen wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop von Leica mit einer Vergrößerung von 63 x aufgenommen. Die mathematische Signifikanzprüfung der gewonnenen Ergebnisse wurde mittels t-Test durchgeführt. Dabei dienten Zellen, die auf TCP gewachsen waren als Kontrolle gegenüber den Zellen, die mit Kollagen Typ I bzw. Fibronektin stimuliert wurden. Ergebnisse 29 4 Ergebnisse 4.1 Kollagen Typ I führt zu einer Abnahme der E-Cadherin-CateninProteinkonzentration Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf die Zell-Zell-Adhäsion zu untersuchen, wurde der E-Cadherin-Catenin-Komplex, welcher eine entscheidende Rolle in der Stabilisierung von Zell-Zell-Kontakten spielt, in den Pankreaskarzinomzelllinien AsPc-1, BxPc-3 und Panc-1 genauer analysiert. Dabei wurden die verschiedenen Zelllinien auf Kollagen Typ I- und Fibronektin-beschichteten Zellkulturschalen bzw. auf TCP („tissue culture plastic“), also auf unbeschichteten Zellkulturschalen, die als Kontrolle dienten, ausgesät. Bei einer Konfluenz von 90 bis 100% wurden diese Zelllinien mit RIPA-Puffer aufgearbeitet. Zunächst wurde die Proteinkonzentration von E-Cadherin bzw. α- und βCatenin in den verschiedenen Zelllinien, die auf den unterschiedlichen Matrixproteinen gewachsen waren, im Gesamtzelllysat mit Hilfe des Westernblots untersucht. Abb. 3: Einfluss der Komponenten der extrazellulären Matrix auf die Proteinkonzentration des E-Cadherin-Catenin-Komplexes in den Zelllinien AsPc-1, Panc-1 und BxPc-3 im Gesamtzelllysat. Kollagen Typ I führt in der Zelllinie Panc-1 zu einer starken, bei AsPc-1-Zellen zu einer mäßigen und in der Zelllinie BxPc-3 nur zu einer minimalen Abnahme der E-Cadherin-, α-und β-Catenin-Konzentration im Vergleich zu TCP und Fibronektin. Pro Fraktion wurden 20 µg Protein eingesetzt. Als Beladungskontrolle wurden die Westernblots mit anti-β-Aktin nachgefärbt. Die Größenmarker beziehen sich auf die mittleren Banden der jeweiligen Westernblot-Analysen. Die Abbildung zeigt repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 30 Kollagen Typ I führt im Gesamtzelllysat in der Pankreaskarzinomzelllinie AsPc-1 zu einer leichten Abnahme der E-Cadherin-Proteinkonzentration sowie zu einer starken Reduktion der α-Catenin-Konzentration, während Fibronektin keinen Einfluss auf deren Proteinkonzentration im Vergleich zu TCP hat. Nach Stimulation mit Kollagen Typ I kommt es zu einer mäßigen Abnahme der β-Catenin-Proteinkonzentration im Vergleich zu TCP. Auch Fibronektin führt zu einer Abnahme der β-Catenin-Konzentration verglichen mit TCP (Abb. 3). Die Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 zeigt unter dem Einfluss von Kollagen Typ I eine deutliche Abnahme der E-Cadherin- und α-Catenin-Konzentration sowie eine mäßig starke Abnahme der β-Catenin-Konzentration verglichen mit TCP und Fibronektin. Somit führt in der Zelllinie Panc-1 nur Kollagen Typ I, nicht aber Fibronektin zu einer Abnahme der Proteinkonzentration des E-Cadherin-Catenin Komplexes im Gesamtzelllysat (Abb. 3). Auch in der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 lässt sich eine Abnahme der Proteinkonzentration von E-Cadherin nach Stimulation mit Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP erkennen, welche jedoch schwächer ist als in der Zelllinie Panc-1. Kollagen Typ I führt im Gesamtzelllysat in der Zelllinie BxPc-3 nur zu einer minimalen Abnahme der Proteinkonzentration von α- und β-Catenin im Vergleich zu TCP und Fibronektin (Abb. 3). Ergebnisse 31 4.2 Analyse des E-Cadherin-Komplexes in Abhängigkeit der Matrixproteine Aufgrund der Abnahme der Proteinkonzentration von E-Cadherin, α- und β-Catenin im Gesamtlysat durch Kollagen I-Stimulation wurde weiter untersucht, ob die Proteine der extrazellulären Matrix nur einen Einfluss auf die Proteinkonzentration des E-CadherinKomplexes haben oder ob Kollagen Typ I bzw. Fibronektin eine Dissoziation des ECadherin-Catenin-Komplexes herbeiführen. Eine Möglichkeit, die Lokalisation der verschiedenen Proteine zu analysieren, besteht in der Zellaufarbeitung mit Triton-Puffer, wodurch zwei Fraktionen gewonnen werden. Die tritonlösliche Fraktion enthält Proteine, die frei im Zytoplasma gelöst vorliegen sowie lösliche Membranproteine, während in der tritonunlöslichen Fraktion Proteine, die mit dem Zytoskelett verbunden sind, nachgewiesen werden können. Die anschließende Westernblot-Untersuchung (Abb. 4) zeigte, dass E-Cadherin sowie αund β-Catenin in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 sowohl in der tritonlöslichen als auch in der tritonunlöslichen Fraktion nachgewiesen werden konnte. Weiterhin lässt sich beobachten, dass bei Panc-1-Zellen, die auf TCP gewachsen waren, ein hoher Anteil von E-Cadherin sowie von α- und β-Catenin in der tritonunlöslichen Fraktion vorhanden ist, während die tritonlösliche Fraktion nur wenig frei im Zytoplasma gelöstes E-Cadherin, αund β-Catenin enthält. Dies deutet darauf hin, dass ein Komplex vorliegt, der überwiegend an das Aktinzytoskelett gebunden ist. Panc-1-Zellen, die auf Kollagen Typ I gewachsen waren, zeigen eine deutliche Abnahme von E-Cadherin bzw. von α- und β-Catenin in der tritonunlöslichen Fraktion, wobei fast kein α-Catenin mehr in der tritonunlöslichen Fraktion zu erkennen ist. In der tritonlöslichen Fraktion lässt sich hingegen eine Zunahme des frei im Zytoplasma gelösten ECadherins sowie α- und β-Catenins nach Stimulation mit Kollagen Typ I detektieren. Das extrazelluläre Matrixprotein Fibronektin führt zu keiner nennenswerten Umverteilung des E-Cadherin-Catenin-Komplexes. Ergebnisse 32 Abb. 4: Veränderung der Zusammensetzung des E-Cadherin-Komplexes in der tritonlöslichen und tritonunlöslichen Fraktion unter dem Einfluss von Kollagen Typ I in der Pankreaskarzinomzellinie Panc-1. E-Cadherin lässt sich in beiden Fraktionen nachweisen. Kollagen Typ I führt zu einer starken Abnahme der E-Cadherin-Konzentration in der tritonunlöslichen Fraktion und zu einer deutlichen Zunahme in der tritonlöslichen Fraktion. Auch α- und β-Catenin lassen sich in beiden Fraktionen detektieren und zeigen durch Kollagen I-Stimulation eine deutliche Abnahme in der tritonunlöslichen Fraktion und eine Zunahme in der tritonlöslichen Fraktion. Fibronektin führt zu keiner nennenswerten Umverteilung von E-Cadherin, α- und β-Catenin. Als Beladungskontrolle wurde β-Aktin eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative Westernblot-Analysen (n=3). Ähnliche Veränderungen des E-Cadherin-Komplexes durch die Komponenten Kollagen Typ I und Fibronektin der extrazellulären Matrix lassen sich in der Zelllinie AsPc-1 nachweisen (Abb. 5). Auch in dieser Zelllinie konnte E-Cadherin, α- und β-Catenin sowohl in der tritonlöslichen als auch in der tritonunlöslichen Fraktion nachgewiesen werden. Es konnte ebenso gezeigt werden, dass AsPc-1-Zellen, die auf TCP gewachsen waren, einen höheren Anteil von E-Cadherin, α- und β-Catenin in der tritonunlöslichen Fraktion aufweisen. Kollagen Typ I führt in der Zelllinie AsPc-1 auch zu einer Abnahme der Proteinkonzentration von E-Cadherin, α- und β-Catenin in der tritonunlöslichen Fraktion und zu einer Zunahme in der tritonlöslichen Fraktion. Die Ab- bzw. Zunahme zwischen den beiden Fraktionen ist jedoch nicht so ausgeprägt wie in Panc-1-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass Kol- Ergebnisse 33 lagen Typ I in der Pankreaskarzinomzelllinie AsPc-1 ebenfalls zu einer Dissoziation des ECadherin-Komplexes führt, wobei jedoch nur ein geringer Anteil dieser Proteine ins Zytoplasma transloziert und nach wie vor ein Komplex vorliegt, der überwiegend an das Aktinzytoskelett gebunden ist. Fibronektin führt ebenso wie in Panc-1-Zellen zu keiner nennenswerten Umverteilung des E-Cadherin-Komplexes verglichen mit TCP. Sowohl in der Zelllinie Panc-1 als auch in der Pankreaskarzinomzelllinie AsPc-1 führt Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP zu einer Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes, wobei Fibronektin keinen Einfluss auf die Stabilität dieses Komplexes hat. Abb. 5: Matrix-induzierte Veränderung des E-Cadherin-Komplexes in der tritonlöslichen und tritonunlöslichen Fraktion in der Karzinomzelllinie AsPc-1. Sowohl E-Cadherin als auch α- und β-Catenin sind in der tritonlöslichen und in der tritonunlöslichen Fraktion zu detektieren. Kollagen IStimulation führt zu einer leichten Abnahme von E-Cadherin, α- und β-Catenin in der tritonunlöslichen Fraktion und zu einer schwachen Zunahme in der tritonlöslichen Fraktion. Die E-Cadherin-, αund β-Catenin-Konzentration verändert sich nicht nennenswert unter dem Einfluss von Fibronektin. Als Beladungskontrolle wurde β-Aktin verwendet. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 34 4.3 Lokalisationsänderung des E-Cadherin-Komplexes in den Zelllinien Panc-1 und BxPc-3 durch Komponenten der extrazellulären Matrix Die Immunfluoreszenzuntersuchung zeigt in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1, welche auf unbeschichteten Deckgläschen für sechs Tage gewachsen war, E-Cadherin sowie αund β-Catenin an der Plasmamembran, insbesondere in Zell-Zell-Kontakten (Abb. 6a, 6d und 6g). Panc-1-Zellen, die auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen für ebenfalls sechs Tage gewachsen waren und eine Konfluenz von ca. 80% aufwiesen, zeigen ebenso eine Plasmamembranlokalisation von E-Cadherin bzw. α- und β-Catenin, diese ist jedoch schwächer, als in Zellen auf unbeschichteten Deckgläschen (Abb. 6c, 6f und 6i). Im Gegensatz dazu lässt sich bei Panc-1-Zellen, die auf Kollagen Typ I-beschichteten Deckgläschen ausgesät wurden, welche auch sechs Tage gewachsen waren und eine Konfluenz von ungefähr 90% aufwiesen, eine Lokalisationsänderung des E-CadherinKomplexes nachweisen. Unter dem Einfluss von Kollagen Typ I konnte E-Cadherin im Zytoplasma nachgewiesen werden, wobei keine Membranfärbung mehr zu erkennen war (Abb. 6b). Auch die Lokalisation von α-Catenin ändert sich nach Stimulation mit Kollagen Typ I. Hierbei zeigen Panc-1-Zellen, die auf Kollagen Typ I-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, eine deutliche zytoplasmatische α-Catenin-Lokalisation, wobei nur noch eine schwache Membranlokalisation im Vergleich zu Zellen auf unbeschichteten und auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen zu beobachten ist (Abb. 6e). Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigt somit die Westernblot-Ergebnisse der Tritonfraktionierung, bei der es durch Kollagen I-Stimulation zu einer Abnahme der E-Cadherin- sowie α-CateninKonzentration in der tritonunlöslichen und zu einer Zunahme in der tritonlöslichen Fraktion kommt (Abb.4). In Panc-1-Zellen führt Kollagen Typ I zudem zu einer Lokalisationsänderung von βCatenin. Dabei konnte in der Immunfluoreszenzfärbung, nach Stimulation mit Kollagen Typ I, β-Catenin im Zellkern nachgewiesen werden, wobei kein β-Catenin mehr an der Zellmembran zu erkennen war. (Abb. 6h). Die Lokalisation von β-Catenin im Zellkern nach Stimulation mit Kollagen Typ I wurde durch die β-Catenin-DAPI-Doppelfärbung bestätigt (Abb. 23). Das ebenfalls am E-Cadherin-Komplex lokalisierte p120ctn wies in der Immunfluoreszenzfärbung von Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten sowie auf Kollagen Typ I- und Fibro- Ergebnisse 35 nektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, eine zytoplasmatische Lokalisation auf (Abb. 6j, 6k und 6l). Kollagen Typ I, wie auch Fibronektin führen somit zu keiner Lokalisationsänderung von p120ctn. Anschließend wurde die Lokalisation von E-Cadherin, α- und β-Catenin sowie von p120ctn unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin in der Zelllinie BxPc-3 analysiert. Bei der Zelllinie AsPc-1 wurde keine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, da in der Tritonaufarbeitung nur eine schwache Umverteilung des E-Cadherin-Komplexes unter dem Einfluss von Kollagen Typ I nachgewiesen werden konnte. Auch bei BxPc-3-Zellen, welche sieben Tage auf unbeschichteten bzw. auf Fibronektinbeschichteten Deckgläschen 80% konfluent gewachsen waren, konnte wie in der Zelllinie Panc-1 eine Membranlokalisation von E-Cadherin, α- und β-Catenin nachgewiesen werden (Abb. 7a,c sowie 7d,f und 7g,i). Im Gegensatz zur Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 ließ sich in der Zelllinie BxPc-3, die sieben Tage auf Kollagen Typ I-beschichteten Deckgläschen gewachsen war und eine Konfluenz von ungefähr 80% aufwies, E-Cadherin, α- und β-Catenin ebenso wie bei BxPc-3-Zellen, die auf unbeschichteten sowie auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, an der Plasmamembran nachweisen (Abb. 7 b, 7e und 7h) In der Zelllinie BxPc-3, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen war, lässt sich p120ctn an der Plasmamembran detektieren (Abb. 7 j). Auch nach Stimulation mit Kollagen Typ I sowie mit Fibronektin ist p120ctn an der Plasmamembran nachweisbar (Abb. 7k und 7l). Diese Proteine der extrazellulären Matrix führen demnach zu keiner Lokalisationsänderung von p120ctn . Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Kollagen Typ I in der Zelllinie Panc-1 zu einer Lokalisationsänderung sowohl von E-Cadherin, als auch von α- und β-Catenin im Vergleich zu Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten sowie auf mit Fibronektinbeschichteten Deckgläschen gewachsen waren, führt. In der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 zeigt sich hingegen unter dem Einfluss von Kollagen Typ I keine Translokation des E-Cadherin-Komplexes. E-Cadherin, α- und β-Catenin sind nach wie vor an der Plasmamembran lokalisiert. Ergebnisse 36 Abb. 6: Immunfluoreszenzfärbungen der Komponenten des E-Cadherin-Komplexes in Panc1-Zellen. Die Zelllinie Panc-1 ist sechs Tage auf unbeschichteten sowie sechs Tage auf mit Kollagen Typ I- oder Fibronektin-beschichteten Deckgläschen bis zu einer Konfluenz von ungefähr 80% gewachsen. Die konfluenten Deckgläschen wurden mit kaltem Methanol/Aceton fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen E-Cadherin, α- und β-Catenin oder p120ctn inkubiert. Ein Balken entspricht 25 µm. Ergebnisse 37 Abb. 7: Immunfluoreszenzfärbungen der Proteine des E-Cadherin-Komplexes in BxPc-3Zellen. Die Zelllinie BxPc-3 wurde ebenfalls auf unbeschichtete sowie auf mit Kollagen Typ I- und Fibronektin-beschichtete Deckgläschen ausgesät. Nach einer Wachstumsperiode von sieben Tagen wiesen die Zellen eine Konfluenz von ca. 80% auf. Die konfluenten Deckgläschen wurden ebenso mit kaltem Methanol fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen E-Cadherin, αund β-Catenin sowie p120ctn inkubiert. Ein Balken entspricht 25 µm. Ergebnisse 38 4.4 Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin auf den E-CadherinAdhäsionskomplex Um den Einfluss der Proteine der extrazellulären Matrix auf die Stabilität des E-CadherinKomplexes näher zu untersuchen, wurde die Veränderung der Proteinmenge der Catenine, die an E-Cadherin gebunden sind, in den Pankreaskarzinomzelllinien AsPc-1, Panc-1 und BxPc-3 analysiert. Dabei wurden Immunpräzipitationen mit einem Antikörper gegen ECadherin durchgeführt und die verschiedenen Catenine in der Westernblot-Analyse nachgewiesen. Kollagen Typ I führt in der Pankreaskarzinomzelllinie AsPc-1 zu einer geringen Abnahme der an E-Cadherin gebundenen Proteinmenge α- und β-Catenin im Vergleich zu Zellen, die auf TCP bzw. auf Fibronektin gewachsen waren (Abb. 8). Die Proteinmenge von p120ctn an E-Cadherin nimmt jedoch durch Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP und Fibronektin stark zu (Abb.8). Abb. 8: Veränderung der an E-Cadherin gebundenen Proteinmenge von α- und β-Catenin sowie von p120ctn unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin in der Zelllinie AsPc-1. Kollagen Typ I führt zu einer leichten Abnahme der an E-Cadherin gebundenen α- und βCatenin-Proteinmenge im Vergleich zu Zellen auf TCP und Fibronektin. Jedoch lässt sich eine starke Zunahme der mit E-Cadherin assoziierten p120ctn-Proteinmenge nach Stimulation mit Kollagen Typ I erkennen. Als Beladungskontrolle dient die Nachfärbung mit anti-E-Cadherin. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 39 In der Zelllinie Panc-1 lässt sich nach Immunpräzipitation mit anti-E-Cadherin eine schwache Abnahme der Proteinmenge von α- und β-Catenin an E-Cadherin nach Stimulation mit Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP und Fibronektin erkennen (Abb. 9). Abb. 9: Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin auf die an E-Cadherin gebundene Proteinmenge α- und β-Catenin in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1. Kollagen Typ I führt zu einer schwachen Abnahme der Proteinmenge von α- und β-Catenin an E-Cadherin verglichen mit TCP und Fibronektin. Als Beladungskontrolle wurden die Blots mit anti-E-Cadherin nachgefärbt. Die Größenmarker beziehen sich auf die mittleren Banden der Abbildung. Die Darstellung zeigt repräsentative Westernblots (n=2). Auch die Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 zeigt eine leichte Abnahme der an E-Cadherin gebundenen Proteinmenge von α- und β-Catenin nach Stimulation mit Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP und Fibronektin (Abb. 10). Abb. 10: Veränderung der mit E-Cadherin gebundenen Proteinmenge von α- und β-Catenin in der Zelllinie BxPc-3 in Abhängigkeit der verschiedenen Matrixkomponenten. Zellen, die mit Kollagen Typ I stimuliert wurden, zeigen sowohl eine leichte Abnahme der α- als auch der βCatenin-Proteinmenge an E-Cadherin verglichen mit TCP und Fibronektin. Nachfärbungen der Blots mit anti-E-Cadherin dienen als Beladungskontrolle. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=2). Ergebnisse 40 4.5 Veränderung der Phosphorylierung der Proteine des E-CadherinKomplexes unter dem Einfluss der verschiedenen Matrixproteine Sowohl die Analysen mit Triton-Puffer als auch die Co-Immunpräzipitationen zeigen, dass Kollagen Typ I zu einer Umverteilung des E-Cadherin-Komplexes führt (Abb. 4 und. Abb. 5 sowie Abb. 8, Abb. 9 und Abb. 10). Zudem ließ sich in der Immunfluoreszenzfärbung eine Translokation der Komponenten des E-Cadherin-Komplexes von der Plasmamembran ins Zytosol bzw. in den Zellkern unter dem Einfluss von Kollagen Typ I nachweisen (Abb. 6). All diese Analysen weisen darauf hin, dass Kollagen Typ I zu einer Umverteilung des E-Cadherin-Komplexes führt, was mit einer Beeinträchtigung der Stabilität dieses Adhäsionskomplexes in Zusammenhang gebracht werden kann. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde anschließend untersucht, ob die Proteine Kollagen Typ I sowie Fibronektin einen Einfluss auf die Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes haben könnten. Hierzu wurden die Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1 und BxPc-3 mit RIPA-Puffer aufgearbeitet, da RIPA-Puffer die Proteinkomplexe zerstört und somit zur Auftrennung in Einzelproteine führt. Anschließend wurde eine Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen β-Catenin durchgeführt, um dieses Protein aus dem Gesamtproteinlysat zu isolieren. Zur Analyse der Phosphorylierung von β-Catenin unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin, wurde ein Antikörper Py 20, der sämtliche Tyrosinphosphorylierungsstellen erkennt, eingesetzt. Dieselben Analysen wurden auch mit einem Antikörper gegen αCatenin durchgeführt. Kollagen Typ I führt in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 zu einer Zunahme der Tyrosinphosphorylierung sowohl von β- als auch von α-Catenin im Vergleich zu TCP und Fibronektin (Abb. 11). In der Zelllinie BxPc-3 lässt sich hingegen eine minimale Zunahme der Phosphorylierung von β-Catenin sowie eine stärkere Zunahme der Phosphorylierung von α-Catenin unter dem Einfluss von Fibronektin im Vergleich zu Kollagen Typ I nachweisen, wobei Fibronektin im Vergleich zu TCP zu keiner Veränderung der Phosphorylierung führt (Abb. 12). Ergebnisse 41 Abb. 11: Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes in der Zelllinie Panc-1. Kollagen Typ I führt zu einer Zunahme der Tyrosinphosphorylierung sowohl von β- als auch von α-Catenin im Vergleich zu TCP und Fibronektin. Die Immunpräzipitationen wurden mit dem jeweiligen Antikörper, mit dem die Immunpräzipitation durchgeführt wurde, nachgefärbt. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=2). Abb. 12: Veränderung der Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes in der Zelllinie BxPc-3 unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin. Fibronektin führt zu einer minimalen Zunahme der Phosphorylierung von β-Catenin sowie zu einer stärkeren Zunahme der Phosphorylierung von α-Catenin im Vergleich zu Kollagen Typ I, zeigt jedoch keine Veränderung der Phosphorylierung im Vergleich zu TCP. Nachgefärbt wurden die Immunpräzipitationen mit dem jeweiligen Antikörper, der für die Immunpräzipitation eingesetzt wurde. Die Abbildung zeigt repräsentative Westernblots (n=2). Ergebnisse 42 4.6 Assoziation der Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 mit dem E-Cadherin-Komplex In zahlreichen Veröffentlichungen ist beschrieben, dass die Dissoziation des E-CadherinKomplexes mit einer verstärkten Phosphorylierung der in diesem Komplex beteiligten Proteine verbunden ist (Müller et al., 1999; Roura et al., 1999). In dieser Arbeit wurde bereits die Dissoziation (Abb. 4 und Abb. 5) und Phosphorylierung (Abb. 11 und Abb. 12) der Proteine des E-Cadherin-Komplexes unter dem Einfluss von Kollagen Typ I analysiert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde untersucht, welche Kinasen bzw. Phosphatasen an der Phosphorylierung des E-Cadherin-Komplexes beteiligt sein könnten. Dabei wurde die Assoziation der Kinasen FAK („focal adhesion kinase“) und Src sowie der Phosphatasen PTEN („phosphatase and tensin homolog“), PP2A („Protein Phosphatase 2A“) und SHPTP2 („src-homology-2-phosphotyrosine-phosphatase“) am E-Cadherin-Komplex in den Pankreaskarzinomzelllinien AsPc-1, BxPc-3 und Panc-1 sowie in der Kolonkarzinomzelllinie SW-480 analysiert. Hierbei wurden Immunpräzipitationen mit einem Antikörper gegen E-Cadherin durchgeführt und die verschiedenen Kinasen bzw. Phosphatasen in der Westernblot-Analyse nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Tyrosinkinase FAK vor allem in der Karzinomzelllinie Panc-1, aber auch in der Zelllinie BxPc-3 am E-Cadherin-Komplex gebunden vorliegt. In der Zelllinie AsPc-1 ist nur eine geringe Menge von FAK mit dem E-Cadherin-Komplex assoziiert. Diese Tyrosinkinase ist in der Kolonkarzinomzelllinie SW-480 nicht am ECadherin-Komplex lokalisiert (Abb. 13). Sowohl in der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 sowie in der Zelllinie AsPc-1 lässt sich eine geringe Menge der Tyrosinkinase Src am E-Cadherin-Komplex gebunden nachweisen, während in den Zelllinien Panc-1 und SW-480 kein mit dem E-Cadherin-Komplexassoziiertes Src detektiert werden konnte (Abb. 13). Die Phosphatase PTEN ist in allen vier Zelllinien am E-Cadherin-Komplex lokalisiert, wobei eine starke Assoziation von PTEN mit diesem Adhäsions-Komplex in den Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1 und BxPc-3 zu erkennen ist (Abb. 13). Auch die Tyrosinphosphatase SH-PTP2 lässt sich in allen vier Zelllinien als an den ECadherin-Komplex gebunden nachweisen, jedoch liegt in der Kolonkarzinomzelllinie SW480 nur eine geringe Menge von SH-PTP2 mit dem E-Cadherin-Komplex assoziiert vor (Abb. 13). Die Serin-Threonin-Phosphatase PP2A ist in keiner dieser vier Zelllinien am E-CadherinKomplex lokalisiert (Abb. 13). Ergebnisse 43 Abb. 13: Assoziation der Tyrosinkinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 mit dem E-Cadherin-Komplex. FAK ist vor allem in der Zelllinie Panc-1 sowie in der Zelllinie BxPc-3 am E-Cadherin-Komplex lokalisiert. Src ist nur in den Zelllinien BxPc-3 und AsPc-1 mit dem E-Cadherin-Komplex assoziiert. Sowohl PTEN als auch SH-PTP2 lässt sich in allen vier Zelllinien am E-Cadherin-Komplex nachweisen. Dabei liegt PTEN vor allem in den Zelllinien Panc1 sowie BxPc-3 und SH-PTP2 überwiegend in den Zelllinien Panc-1, BxPc-3 und AsPc-1 am ECadherin-Komplex gebunden vor. Die Serin-Threonin-Phosphatase PP2A ist in keiner dieser vier Zelllinien an diesem Adhäsions-Komplex nachweisbar. Abgebildet sind repräsentative CoImmunpräzipitationen (n=4). Ergebnisse 44 4.7 Einfluss von Kollagen I und Fibronektin auf die Lokalisation der Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 Um zu untersuchen, ob die extrazellulären Matrixproteine Kollagen Typ I und Fibronektin einen Einfluss auf die Lokalisation der Kinasen FAK und Src bzw. der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 in Panc-1- und BxPc-3-Zellen haben, wurden Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt. Die Proteine Kollagen Typ I sowie Fibronektin führen in Panc-1-Zellen zu einer Lokalisationsänderung der Tyrosinkinase FAK. Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen waren, zeigen eine schwache, punktuelle Membranfärbung der FAK (Abb 14a). Kollagen I-Stimulation führt zu einer Zunahme der FAK an der Membran (Abb. 14b). Auch unter dem Einfluss von Fibronektin konnte eine verstärkte FAKMembranfärbung im Vergleich zu unbeschichteten Deckgläschen nachgewiesen werden. Diese ist jedoch schwächer als nach Stimulation mit Kollagen Typ I (Abb. 14c). Die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin führen zu keiner Lokalisationsänderung der Tyrosinkinase Src in Panc-1-Zellen. Diese ist sowohl bei den Zellen, die auf unbeschichteten, als auch bei den Zellen, die auf Kollagen Typ I- bzw. Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, im Zytoplasma lokalisiert (Abb. 14d, 14e und 14f). Die Phosphatase PTEN ist in Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten sowie auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen ausgesät wurden, überwiegend im Zytoplasma lokalisiert. Darüber hinaus lässt sich auch eine schwache Membranlokalisation nachweisen (Abb. 14g und 14i; Pfeile). PTEN ist in Panc-1-Zellen, die auf Kollagen Typ I gewachsen waren, ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 14h). Die Tyrosinphosphatase SH-PTP2 zeigt in Panc-1-Zellen, die auf den extrazellulären Matrixproteinen Kollagen Typ I und Fibronektin gewachsen waren, keinen Unterschied bezüglich ihrer Lokalisation. Diese Phosphatase ist in der Immunfluoreszenzfärbung zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 14j, 14k und 14l). Ergebnisse 45 BxPc-3-Zellen, welche auf unbeschichtete Deckgläschen ausgesät wurden, zeigen eine zytoplasmatische Lokalisation der FAK (Abb. 15a). Dagegen lässt sich in dieser Zelllinie nach Stimulation mit Kollagen Typ I eine schwache, punktförmige FAK-Membranfärbung nachweisen (Abb. 15b; Pfeile). Auch bei BxPc-3 Zellen, die auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, kann die FAK schwach und punktförmig an der Plasmamembran lokalisiert nachgewiesen werden (Abb. 15c; Pfeile). Die Tyrosinkinase Src ist in der Zelllinie BxPc-3, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen war, zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 15d). Bei BxPc-3-Zellen, die durch Kollagen Typ I bzw. Fibronektin stimuliert wurden, lässt sich Src sowohl im Zytoplasma als auch schwach an der Membran lokalisiert (Pfeile in den Abb. 15e und 15f) nachweisen. Die Phosphatase PTEN ist nach Stimulation mit den extrazellulären Matrixproteinen Kollagen Typ I und Fibronektin ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 15g, 15h und 15i). Allenfalls könnte sich eine schwache Intensitätsabnahme der PTEN durch Kollagen IStimulation (Abb. 15h) im Vergleich zu Zellen auf unbeschichteten sowie auf Fibronektinbeschichteten Deckgläschen zeigen. Die Tyrosinphosphatase SH-PTP2 zeigt in BxPc-3-Zellen unter dem Einfluss der verschiedenen Matrixproteine keinen Unterschied in ihrer Lokalisation. Sowohl bei BxPc-3-Zellen, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen waren als auch bei den Zellen, welche mit Kollagen Typ I oder Fibronektin stimuliert wurden, lässt sich diese Phosphatase zytoplasmatisch nachweisen (Abb. 15j, 15k und 15l). Unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin könnte es höchstens zu einer schwachen Intensitätszunahme von SH-PTP2 im Vergleich zu den Zellen, die auf unbeschichtete Deckgläschen ausgesät wurden, kommen (Abb. 15k und 15l). Ergebnisse 46 Abb. 14: Immunfluoreszenzfärbungen der Kinasen FAK und Src bzw. der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 in Panc-1-Zellen. a), b) und c) FAK ist auf unbeschichteten Deckgläschen schwach und punktförmig an der Membran lokalisiert (Pfeil in Abb. a). Kollagen Typ I führt zu einer stärkeren (Pfeil in Abb. b) und Fibronektin zu einer schwächeren (Pfeil in Abb. c) Zunahme der FAK-Membranfärbung im Vergleich zu den Zellen auf unbeschichteten Deckgläschen. d), e) und f) Src ist auf allen Substraten zytoplasmatisch lokalisiert. g), h) und i) PTEN ist in Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten und Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, sowohl im Zytoplasma als auch an der Plasmamembran lokalisiert (Pfeile in den Abb. g und i). Nach Kollagen I-Stimulation lässt sich PTEN ausschließlich zytoplasmatisch nachweisen. j), k) und l) SH-PTP2 ist auf den verschiedenen Substraten jeweils zytoplasmatisch lokalisiert. Ein Balken entspricht 50 µm. (n=3). Ergebnisse 47 Abb. 15: Immunfluoreszenzfärbungen der FAK, Src, PTEN und SH-PTP2 in BxPc-3-Zellen. a), b) und c) FAK ist auf unbeschichteten Deckgläschen zytoplasmatisch lokalisiert. Nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin lässt sich FAK schwach und punktförmig an der Membran nachweisen (Pfeile in den Abb. b und c). d), e) und f) Src ist auf unbeschichteten Deckgläschen zytoplasmatisch lokalisiert. Nach Kollagen Typ I- und Fibronektin-Stimulation kann sowohl eine zytoplasmatische als auch eine schwache Membranlokalisation (Pfeile in den Abb. e und f) von Src beobachtet werden. g), h) und i) PTEN lässt sich auf allen Substraten im Zytoplasma nachweisen. j), k) und l) Auch SH-PTP2 ist auf den verschiedenen Substraten jeweils zytoplasmatisch lokalisiert. Ein Balken entspricht 25 µm. (n=3). Ergebnisse 4.8 48 Veränderung der Proteinmenge von FAK, Src sowie PTEN und SHPTP2 am E-Cadherin-Komplex in Abhängigkeit der Matrixproteine Um zu untersuchen, welchen Einfluss die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes haben, wurde analysiert, wie sich die Proteinmenge der am Komplex lokalisierten Kinasen FAK und Src bzw. Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 an diesem Adhäsions-Komplex durch Kollagen Typ I- bzw. Fibronektin-Stimulation verändert. Zur Analyse des komplexgebundenen Proteins wurde eine Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen E-Cadherin durchgeführt und anschließend die Proteinmenge der Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 am E-Cadherin analysiert. Für diese Untersuchungen wurden die Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1 und BxPc-3 verwendet, da sie den größten Anteil an komplexgebundenen Kinasen und Phosphatasen aufwiesen. Die Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 zeigt eine Zunahme der Proteinmenge der FAK am E-Cadherin-Komplex unter dem Einfluss von Fibronektin, während in Panc-1-Zellen die Menge der FAK am E-Cadherin-Komplex durch Kollagen Typ I zunimmt (Abb. 16). Die Tyrosinkinase Src ließ sich in der Zelllinie Panc-1 nicht mit E-Cadherin coimmunpräzipitieren (Abb. 13), dies bedeutet, dass Src in der Zelllinie Panc-1 nicht am ECadherin-Komplex lokalisiert ist. Dies zeigte sich auch in der Immunfluoreszenzfärbung, in der Src auf den verschiedenen Substraten ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert ist (Abb. 14). In der Zelllinie BxPc-3 konnte eine schwache Zunahme von Src am ECadherin-Komplex nach Stimulation mit Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP und Fibronektin nachgewiesen werden (Abb. 16). Außerdem wurde untersucht, ob die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin einen Einfluss auf die am E-Cadherin-Komplex lokalisierte p85-Untereinheit der PI 3-Kinase haben. In der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 ist nur eine geringe Menge von p85 der Untereinheit der PI 3-Kinase mit dem E-Cadherin-Komplex assoziiert. Sie zeigt auch keine Veränderung der Proteinmenge nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin. In der Zelllinie Panc-1 lässt sich eine größere Menge von der p85-Untereinheit der PI 3-Kinase als in der Zelllinie BxPc-3 am E-Cadherin-Komplex nachweisen. Die Proteinmenge dieser Kinase nimmt durch Fibronektin-Stimulation im Gegensatz zu TCP und Kollagen Typ I leicht ab (Abb. 16). Ergebnisse 49 Abb. 16: Einfluss der Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Proteinmenge der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen FAK und Src sowie der PI 3-Kinase. Kollagen Typ I führt in Panc-1-Zellen zu einer Zunahme der FAK und in der Zelllinie BxPc-3 zu einer geringen Zunahme der Src-Kinase am E-Cadherin-Komplex verglichen mit TCP und Fibronektin. FAK nimmt hingegen in BxPc-3-Zellen nach Stimulation mit Fibronektin im Vergleich zu TCP und Kollagen Typ I zu. Die p85-Untereinheit der PI 3-Kinase nimmt in Panc-1-Zellen unter dem Einfluss von Fibronektin im Vergleich zu Kollagen Typ I und TCP leicht ab. In der Zelllinie BxPc-3 kommt es zu keiner Veränderung der Proteinmenge der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten p85-Untereinheit der PI 3-Kinase nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin. Die Größenmarker beziehen sich auf die mittleren Banden der Abbildung. Als Beladungskontrolle dient die Nachfärbung mit anti-ECadherin. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 50 Anschließend wurde untersucht, welchen Einfluss die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Proteinmenge der Phosphatasen am E-Cadherin-Komplex haben. Dabei konnte eine deutliche Abnahme der Phosphatase PTEN am E-Cadherin-Komplex unter dem Einfluss von Kollagen Typ I sowohl in der Zelllinie Panc-1 als auch in der Zelllinie BxPc-3 im Vergleich zu TCP und Fibronektin nachgewiesen werden (Abb. 17). Demgegenüber lässt sich eine geringe Zunahme der Proteinmenge der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Phosphatase SH-PTP2 nach Kollagen I-Stimulation in beiden Zelllinien im Vergleich zu TCP detektieren. Die Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 zeigt darüber hinaus eine Zunahme der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten SH-PTP2 unter dem Einfluss von Fibronektin im Vergleich zu TCP und Kollagen Typ I (Abb. 17). Abb. 17: Veränderung der Proteinmenge der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 am ECadherin-Komplex unter dem Einfluss der Matrixproteine. Kollagen Typ I führt sowohl in der Zelllinie Panc-1 als auch in der Zelllinie BxPc-3 zu einer Abnahme der Proteinmenge von PTEN und zu einer geringen Zunahme der Proteinmenge von SH-PTP2 am E-Cadherin-Komplex. Als Beladungskontrolle dient die Nachfärbung der Blots mit anti-E-Cadherin. Die Darstellung zeigt repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 4.9 51 Veränderung der Phosphorylierung von FAK, Src, PTEN und SHPTP2 durch die Komponenten der extrazellulären Matrix Nachdem sich die Proteinmenge der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen FAK und Src sowie der Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 durch die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin der extrazellulären Matrix ändert (Abb.16 und Abb. 17), wurde weiter untersucht, ob Kollagen Typ I bzw. Fibronektin einen Einfluss auf die Aktivität dieser Kinasen und Phosphatasen haben. Hierzu wurde der Phosphorylierungsgrad entsprechender Aminosäuren dieser Kinasen und Phosphatasen nach Stimulation mit Kollagen Typ I oder Fibronektin im Vergleich zu TCP genauer analysiert. Um Aussagen über Aktivierung oder Inhibition dieser Kinasen und Phosphatasen unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin machen zu können, wurde zunächst deren Phosphorylierungsgrad im Gesamtzelllysat untersucht. Interessant ist natürlich die Phosphorylierung der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen und Phosphatasen unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin zu analysieren, um nachzuweisen, ob sich die Aktivität dieser am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Kinasen und Phosphatasen nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin ändert. Diese Analysen bringen möglicherweise neue Erkenntnisse, ob und wie die Kinasen FAK und Src sowie die Phosphatasen PTEN und SH-PTP2 an der Phosphorylierung und Stabilität des E-CadherinKomplexes unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin involviert sind. Der Phosphorylierungsgrad der Kinasen und Phosphatasen wurde in der Westernblot-Analyse mit Antikörpern, die gegen bestimmte Tyrosin- bzw. Serinphosphorylierungsstellen des entsprechenden Proteins gerichtet sind, nachgewiesen. Um die Phosphorylierung der mit dem E-Cadherin-Komplex verbundenen Kinasen und Phosphatasen zu untersuchen und somit vom Gesamtpool der Proteine abzugrenzen, wurde zuvor eine Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen E-Cadherin durchgeführt. In der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 kommt es unter dem Einfluss von Fibronektin zu einer Zunahme der Phosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397 im Vergleich zu Kollagen Typ I und TCP sowohl am E-Cadherin-Komplex als auch im Gesamtzelllysat. Im BxPc-3-Gesamtzelllysat lässt sich auch eine verstärkte Phosphorylierung der FAK nach Kollagen I-Stimulation im Vergleich zu TCP erkennen. Diese ist jedoch schwächer als nach Fibronektin-Stimulation. Der Phosphorylierungsgrad der FAK ändert sich in der Zelllinie Panc-1 nach Stimulation der Matrixproteine Kollagen Typ I und Fibronektin weder am E-Cadherin-Komplex noch im Gesamtzelllysat (Abb. 18). Ergebnisse 52 Abb. 18: Veränderung der Phosphorylierung von FAK durch die Komponenten der extrazellulären Matrix am E-Cadherin-Komplex und im Gesamtzelllysat. In der Zelllinie BxPc-3 führt Fibronektin sowohl am E-Cadherin-Komplex als auch im Gesamtzelllysat zu einer Zunahme der Phosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397 im Vergleich zu TCP und Kollagen Typ I. Im Gesamtzelllysat lässt sich in der Zelllinie BxPc-3 auch eine Zunahme der Phosphorylierung von FAK nach Kollagen I-Stimulation im Vergleich zu TCP nachweisen, welche jedoch schwächer ist als nach Fibronektin-Stimulation. In der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 haben die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin weder am E-Cadherin-Komplex noch im Gesamtzelllysat einen Einfluss auf die Phosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397. Die Größenmarker beziehen sich auf die mittleren Banden der Abbildung. Als Beladungskontrolle wurden die Immunpräzipitationen mit anti-E-Cadherin und die Westernblots des Gesamtzelllysates mit anti-β-Aktin nachgefärbt. Dargestellt sind jeweils repräsentative Westernblot-Analysen (n=3) Ergebnisse 53 Um den Phosphorylierungsgrad der Kinase Src nachzuweisen, wurde ein Antikörper, der gegen die Tyrosinphosphorylierungsstelle 416 gerichtet ist, verwendet. Sowohl in der Zelllinie BxPc-3 als auch in der Zelllinie Panc-1 führt Fibronektin im Gesamtzelllysat zu einer Zunahme der Phosphorylierung des Tyrosinsrestes 416 der Kinase Src im Vergleich zu Kollagen Typ I und TCP (Abb. 19). Eine Analyse der Phosphorylierung von Src am ECadherin-Komplex war sowohl in der Zelllinie Panc-1 als auch in der Zelllinie BxPc-3 nicht möglich, da zum einen in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 Src nicht am ECadherin-Komplex gebunden vorliegt (Abb. 13) und zum anderen in der Zelllinie BxPc-3 nur ein geringer Anteil von Src am E-Cadherin-Komlex lokalisiert ist (Abb. 13). Trotz Einsatz von 4 mg Protein, 7 µl anti-E-Cadherin und 40 µl Protein A konnte in sechs unabhängigen Experimenten keine Phosphorylierung von Src am E-Cadherin-Komplex in der Zelllinie BxPc-3 nachgewiesen werden (Daten werden nicht gezeigt). Abb. 19: Veränderung der Phosphorylierung von Src im Gesamtzelllysat unter dem Einfluss der Proteine der extrazellulären Matrix. Die Phosphorylierung von Src an ihrem Tyrosinrest 416 nimmt sowohl in der Zelllinie BxPc-3 als auch in der Zelllinie Panc-1 unter Fibronektin-Einfluss im Vergleich zu TCP und Kollagen Typ I zu. Als Beladungskontrolle dient die Nachfärbung mit β-Aktin. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=3). Weiter wurde untersucht, wie sich die Phosphorylierung der Phosphatasen nach Stimulation der Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin verändert. Die Phosphatase PTEN wird in der Zelllinie BxPc-3 sowohl am E-Cadherin-Komplex wie auch im Gesamtzelllysat an ihrem Serinrest 380 unter dem Einfluss von Kollagen Typ I im Vergleich zu TCP und Fibronektin phosphoryliert. Auch in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 führt Kollagen Typ I zu einer Zunahme der Phosphorylierung von PTEN am E-Cadhein-Komplex im Ergebnisse 54 Vergleich zu TCP und Fibronektin. Im Panc-1-Gesamtzelllysat lässt sich eine Zunahme der Phosphorylierung nach Kollagen I-Stimulation im Vergleich zu Fibronektin erkennen, jedoch ist die Serinphosphorylierung bei Panc-1-Zellen, die auf TCP gewachsen waren, noch stärker ausgeprägt (Abb. 20). Abb. 20: Veränderung der Phosphorylierung von PTEN durch die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin am E-Cadherin-Komplex und im Gesamtzelllysat. In der Zelllinie BxPc-3 führt Kollagen Typ I zu einer Zunahme der Phosphorylierung von PTEN am Serinrest 380 sowohl am ECadherin-Komplex als auch im Gesamtzelllysat im Vergleich zu Fibronektin und TCP. Bei Panc-1Zellen kommt es auch nach Stimulation mit Kollagen Typ I zu einer Zunahme der Phosphorylierung am E-Cadherin-Komplex im Vergleich zu TCP und Fibronektin. Auch im Gesamtzelllysat nimmt die Phosphorylierung unter dem Einfluss von Kollagen Typ I im Vergleich zu Fibronektin zu, jedoch lässt sich bei Zellen, die auf TCP gewachsen waren, eine noch stärkere Phosphorylierung erkennen. Als Beladungskontrolle dienen für die Immunpräzipitationen Nachfärbungen mit anti-ECadherin und für den Nachweis von PTEN im Gesamtzelllysat, Nachfärbungen mit anti-β-Aktin. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 55 Zur Analyse der Phosphorylierung von SH-PTP2 nach Stimulation durch Kollagen Typ I und Fibronektin, wurde eine Co-Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen SHPTP2 durchgeführt und anschließend der Phosphorylierungsgrad der immunpräzipitierten Proteine mit einem Antikörper Py 20, der sämtliche Tyrosinphosphorylierungsstellen erkennt, nachgewiesen. Die Co-Immunpräzipitationen wurden mit anti-SH-PTP2 nachgefärbt. Aufgrund gleicher Molekulargewichte handelt es sich bei der Tyrosinphosphorylierung höchstwahrscheinlich um das Protein SH-PTP2. In der Zelllinie BxPc-3 kommt es nach Stimulation mit Kollagen Typ I sowie mit Fibronektin zu einer Zunahme der Tyrosinphosphorylierung im Vergleich zu TCP. In Panc-1-Zellen dagegen führt Kollagen Typ I zu einer Zunahme der Phosphorylierung verglichen mit TCP und Fibronektin. (Abb. 21). Abb. 21: Veränderung der Phosphorylierung von SH-PTP2 durch die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin nach Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen SH-PTP2. In der Zelllinie BxPc-3 lässt sich eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung nach Stimulation mit Kollagen Typ I oder Fibronektin im Vergleich zu TCP nachweisen. In der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 kann nach Kollagen I-Stimulation eine Zunahme der Phosphorylierung im Vergleich zu Fibronektin und TCP erkannt werden. Zur Bestimmung der gesuchten phosphorylierten Bande wurden die CoImmunpräzipitationen mit anti-SH-PTP2 nachgefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Westernblots (n=3). Ergebnisse 56 4.10 Nach Stimulation mit Kollagen Typ I lässt sich β-Catenin im Zellkern nachweisen Sowohl die Ergebnisse der Aufarbeitung mit Triton-Puffer (Abb. 4) als auch die Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Analyse (Abb. 6) zeigen, dass Kollagen Typ I in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 zu einer Lokalisationsänderung von β-Catenin führt. In der Zelllinie BxPc-3 ließ sich im Gegensatz dazu in der Immunfluoreszenz-Untersuchung keine Lokalisationsänderung dieses Catenins nachweisen. Daraufhin wurde bei Panc-1-Zellen, die auf den verschiedenen Proteinen der extrazellulären Matrix gewachsen waren, eine Membranpräparation durchgeführt. Mit dieser Methode können Veränderungen der Konzentration von Proteinen zwischen der Membran- und Zytosolfraktion analysiert werden. Das am E-Cadherin-Komplex lokalisierte β-Catenin konnte dabei überwiegend in der Membranfraktion nachgewiesen werden, wobei β-Catenin in der Zytosolfraktion bei Panc1-Zellen, die auf TCP gewachsen waren, nicht detektiert werden konnte. Kollagen Typ I führt, in Übereinstimmung mit den vorher gezeigten Experimenten, zu einer Abnahme der β-Catenin-Proteinmenge in der Membranfraktion im Vergleich zu TCP. In der Zytosolfraktion konnte nach Stimulation mit Kollagen Typ I das Protein β-Catenin, im Vergleich zu TCP, nachgewiesen werden (Abb. 22). Abb. 22: Einfluss von Kollagen Typ I auf die β-Catenin-Proteinmenge in der Membran- sowie in der Zytosolfraktion der Zelllinie Panc-1. β-Catenin lässt sich vor allem in der Membranfraktion nachweisen. Kollagen Typ I führt zu einer Abnahme der β-Catenin-Proteinmenge in der Membranfraktion. Nach Stimulation mit Kollagen Typ I lässt sich β-Catenin im Gegensatz zu TCP auch in der Zytosolfraktion detektieren. Abgebildet sind repräsentative Westernblots (n=2). Ergebnisse 57 Die in der Immunfluoreszenz-Analyse (Abb. 6) nachgewiesene Kernlokalisation von βCatenin nach Stimulation mit Kollagen Typ I wurde durch die β-Catenin-DAPIDoppelfärbung bestätigt. Mit DAPI lassen sich die Zellkerne der verschiedenen Zellen anfärben. Die DAPI-Färbung zeigt sich unter dem Fluoreszenzmikroskop als blaue Fluoreszenzemission. Panc-1-Zellen wurden auf unbeschichtete bzw. auf Kollagen Typ I- oder Fibronektinbeschichtete Deckgläschen ausgesät (Abb. 23). In Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen waren, ist eine Membranlokalisation von β-Catenin zu erkennen (Abb. 23a; Pfeil). Nach Stimulation mit Kollagen Typ I lässt sich β-Catenin im Zellkern nachweisen, wobei kein β-Catenin mehr an der Zellmembran zu erkennen ist (Abb. 23b; Pfeil). Fibronektin führt zu keiner Lokalisationsänderung von β-Catenin im Vergleich zu TCP. Es ist eine deutliche Membranfärbung (Abb. 23c; Pfeil) zu erkennen und es kann kein β-Catenin im Zellkern nachgewiesen werden (Abb. 23c). Abb. 23: Nachweis der Kernlokalisation von β-Catenin nach Stimulation mit Kollagen Typ I in der Zelllinie Panc-1 durch die β-Catenin-DAPI-Doppelfärbung a) Panc-1-Zellen, die auf unbeschichtete Deckgläschen ausgesät wurden, zeigen eine Membranlokalisation von β-Catenin (Pfeil in Abb. a). b) Nach Stimulation mit Kollagen Typ I lässt sich deutlich eine Lokalisationsänderung von β-Catenin erkennen. β-Catenin kann im Zellkern nachgewiesen werden (Pfeil in Abb b). c) Fibronektin führt zu keiner Lokalisationsänderung von β-Catenin im Vergleich zu TCP. Das Protein ist ausschließlich an der Membran (Pfeil in Abb. c) und nicht im Zellkern lokalisiert. β-Catenin ist rot (Cy3) und der Zellkern blau (DAPI) angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Immunfluoreszenz-Analysen (n=3). Ein Balken entspricht 25 µm. Ergebnisse 58 4.11 Kollagen Typ I führt zu einer Zunahme der Proliferation In der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 konnte im Gegensatz zu der Zelllinie BxPc-3 nach Stimulation mit Kollagen Typ I eine Kernlokalisation von β-Catenin nachgewiesen werden. Da β-Catenin im Zellkern die Expression der LEF/TCF-Zielgene Cyclin D1 und c-myc aktiviert und diese LEF/TCF Zielgene wichtige Regulatoren der Zellproliferation darstellen (Tetsu et al., 1999; Persad et al., 2001), wurde untersucht, ob Kollagen Typ I einen Einfluss auf die Proliferation der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 hat. Daraufhin wurde die Zelllinie Panc-1 auf unbeschichtete sowie auf Kollagen Typ I- oder Fibronektinbeschichtete Deckgläschen ausgesät und die Zellkerne bei einer Zellkonfluenz von 80% mit DAPI angefärbt. Mit der DAPI-Färbung lassen sich Mitosen der Zellkerne nachweisen. Anhand der Anzahl der Mitosen pro Gesichtsfeld, welche die Teilungsaktivität der Zelle widerspiegeln, kann auf die Proliferationsrate geschlossen werden. Es wurden drei unabhängige DAPI-Färbungen mit Panc-1-Zellen, die auf den verschiedenen Proteinen der extrazellulären Matrix gewachsen waren, durchgeführt. Pro DAPI-Färbung wurden jeweils fünf Gesichtsfelder ausgezählt. Die DAPI-Färbungen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer Vergrößerung von 63x analysiert. Die in dem jeweiligen Gesichtsfeld zu erkennende Anzahl der Mitosen wurde durch die Gesamtzahl der angefärbten Zellkerne dividiert. Zur Proliferationsanalyse der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin wurde bei den jeweils fünf zufällig ausgewählten Ausschnitten der drei unabhängigen DAPI-Färbungen, der Mittelwert der ausgezählten Mitosen pro 100 Zellen gebildet. In der Zelllinie Panc-1, die auf unbeschichteten Deckgläschen gewachsen war, konnte ein Mittelwert von 5,2 mit einer Standardabweichung von 1,3 berechnet werden. Nach Stimulation mit Kollagen Typ I ließ sich im Gegensatz dazu ein Mittelwert der ausgezählten Mitosen von 15,5 mit einer Standardabweichung von 2,2 errechnen. Unter dem Einfluss von Fibronektin konnte ein Mittelwert von 7,6 mit einer Standardabweichung von 1,6 ermittelt werden (Abb. 24). Mit Hilfe des t-Tests wurde anschließend die Signifikanz der gewonnenen Ergebnisse überprüft, da die Ereignisse unabhängig voneinander sind und eine Normalverteilung vorliegt. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass Panc-1-Zellen bei einem Signifikanzniveau von α<0,05 nach Stimulation mit Kollagen Typ I signifikant schneller proliferieren als Zellen, die auf unbeschichteten oder auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren. Somit stimuliert Kollagen Typ I signifikant die Proliferation der Zelllinie Panc-1 im Vergleich zu Fibronektin oder unbe- Ergebnisse 59 schichteten Deckgläschen. Auch in der Zelllinie Panc-1, die auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen war, lässt sich eine Zunahme der Proliferation im Vergleich zu Panc-1 Zellen auf unbeschichteten Deckgläschen nachweisen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Kollagen Typ I einen signifikanten Einfluss auf die Proliferation der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 im Vergleich zu Panc-1-Zellen, die auf unbeschichteten oder auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen waren, hat, während Fibronektin zu einer geringen Zunahme der Proliferation im Vergleich zu Panc-1-Zellen auf unbeschichteten Deckgläschen führt. Abb. 24: Einfluss der Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Proliferation der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte der Mitosen pro 100 Zellen mit der jeweiligen Standardabweichung der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1, die auf unbeschichtete bzw. auf Kollagen Typ I- oder Fibronektin-beschichteten Deckgläschen gewachsen war. Diskussion 60 5 Diskussion Maligne Tumore zeigen Veränderungen im Wachstum sowie in der Differenzierung ihrer Zellverbände. Verschiedene Analysen belegen, dass Karzinomzellen eine verringerte ZellZell-Adhäsion aufweisen, was mit einer verstärkten Invasivität, einer erhöhten Metastasierungstendenz sowie mit einer Zunahme der Proliferation einhergeht (Frixen et al., 1991; Mareel et al., 1997). Voraussetzung für die Aufrechterhaltung einer stabilen Zell-ZellAdhäsion in epithelialen Zellen ist ein intakter E-Cadherin-Komplex. Beeinträchtigungen dieses Adhäsions-Komplexes führen zu einer Zunahme der Zellmigration und Proliferation sowie zu einer Entdifferenzierung und invasivem Wachstum der Zellverbände (Frixen et al., 1991; Pignatelli et al., 1994; Perl et al., 1998). Takeichi, 1993, beschreibt eine Zunahme des invasiven Tumorwachstums zum einen im Zusammenhang mit verminderter ECadherin-Genexpression und zum anderen in Korrelation einer funktionellen Störung des E-Cadherin-Catenin-Komplexes ohne Veränderung der E-Cadherin-Expression. Das Pankreaskarzinom zeichnet sich durch aggressives und invasives Wachstumsverhalten sowie durch ausgeprägte Metastasierungstendenz aus (Hall et al., 1993). Al-Aynati et al., 2004, konnten in Pankreaskarzinomzelllinien eine Umverteilung des E-CadherinKomplexes im Vergleich zu gesunden Pankreaszellen nachweisen. Die Analysen zeigen in Pankreaskarzinomzelllinien eine Abnahme von E-Cadherin an der Zellmembran sowie eine Zunahme dieses Cadherins im Zytosol. Pignatelli et al., 1994 und Toyoda et al., 2005, legen dar, dass eine verminderte membranöse E-Cadherin-Expression mit aggressivem und invasivem Wachstum korreliert. Darüber hinaus weist das Pankreaskarzinom im Gegensatz zu anderen soliden Tumoren eine enorme Menge an extrazellulärer Matrix auf (Löhr et al., 1994). Im Pankreaskarzinom konnte ein wesentlich höherer Anteil an Kollagen Typ I im Vergleich zu gesundem Pankreasgewebe nachgewiesen werden (Gress et al., 1998; Linder et al., 2001). Zahlreiche Untersuchungen zeigen, dass Interaktionen zwischen den Zellen und den Proteinen der extrazellulären Matrix die Proliferation, Differenzierung und Migration beeinflussen (Lam et al., 2001). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Einflüsse der Matrixproteine Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Zusammensetzung und Stabilität sowie auf die Phosphorylierung der Proteine des E-Cadherin-Komplexes in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien analysiert. Diskussion 61 5.1 Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes durch Kollagen Typ I Im Zusammenhang mit der beschriebenen Korrelation von invasivem Tumorwachstum und gesteigerter Proliferation unter dem Einfluss der Matrixproteine wurde die Stabilität des ECadherin-Komplexes nach Stimulation mit den Proteinen Kollagen Typ I und Fibronektin im Vergleich zu Zellen, die auf unbeschichteten Zellkulturschalen, TCP („tissue culture plastic“) gewachsen waren, analysiert. Die vorliegenden Westernblot-Analysen zeigen eine Abnahme der Proteinkonzentration sowohl von E-Cadherin als auch von α- und β-Catenin nach Stimulation mit Kollagen Typ I im Gesamtzelllysat in den Zelllinien Panc-1, BxPc-3 und AsPc-1. Darüber hinaus konnte in der Zellaufarbeitung mit Triton-Puffer eine Umverteilung des E-Cadherin-CateninKomplexes durch Kollagen Typ I nachgewiesen werden, wobei eine Abnahme der Proteinmenge von E-Cadherin, α- und β-Catenin am Aktinzytoskelett sowie eine Zunahme dieser Proteine im Zytoplasma in den Zelllinien Panc-1 und AsPc-1 zu detektieren war. Die Lokalisationsänderung von E-Cadherin, α- und β-Catenin wurde in der Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Hier konnte eine Translokation von E-Cadherin und α-Catenin von der Zellmembran in das Zytoplasma sowie eine Lokalisationsänderung von β-Catenin von der Zellmembran in das Zytoplasma und in den Zellkern nach Stimulation mit Kollagen Typ I in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 nachgewiesen werden. Anschließend wurde die Veränderung der Proteinmenge von α- und β-Catenin am E-Cadherin-Komplex untersucht, indem Immunpräzipitationen mit einem Antikörper gegen E-Cadherin durchgeführt wurden. Auch hier konnte eine Abnahme der Proteinmenge von α- und β-Catenin am ECadherin-Komplex durch den Einfluss von Kollagen Typ I in den Zelllinien AsPc-1, Panc1 und BxPc-3 beobachtet werden. Interessanterweise führt Fibronektin entweder zu keiner oder nur zu einer geringen Abnahme von E-Cadherin, α- und β-Catenin im Gesamtzelllysat. Auch konnte keine nennenswerte Umverteilung der Komponenten des E-CadherinKomplexes in der tritonlöslichen- und tritonunlöslichen Fraktion sowie keine Translokation dieser Proteine von der Zellmembran zum Zytoplasma bzw. von der Membran in den Zellkern in der Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen werden. Dies impliziert, dass nur bestimmte Proteine der extrazellulären Matrix wie Kollagen Typ I die Zusammensetzung des E-Cadherin-Komplexes verändern. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Kollagen Typ I zu einer Dissoziation des ECadherin-Catenin-Komplexes führt. Diese Daten werden durch verschiedene Veröffentlichungen bestätigt, welche nachweisen konnten, dass die Proteine der extrazellulären Mat- Diskussion 62 rix die Zell-Zell-Adhäsion durch Beeinträchtigung der funktionellen Stabilität des ECadherin-Komplexes sowie durch mesenchymale Transformation von epithelialen Zellverbänden stört (Adams und Watt, 1993; Genda et al., 2000; Menke et al., 2001). Die Assoziation von E-Cadherin mit dem Aktinzytoskelett ist für die Aufrechterhaltung einer stabilen Zell-Zell-Adhäsion von zentraler Bedeutung (Ozawa und Kemler, 1998). Tyrosinphosphorylierung von β-Catenin stört die Interaktion zwischen β-Catenin und αCatenin und entkoppelt E-Cadherin und das Aktinzytoskelett, wodurch es zu einer Beeinträchtigung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion, mit daraus folgender Zunahme der Zellmigration und Invasion kommt (Behrens et al., 1993; Takeichi, 1993; Müller et al., 1999). Auch Roura et al., 1999, wiesen nach, dass die Phosphorylierung von β-Catenin und p120ctn zu einer Dissoziation des Adhäsionsmoleküls E-Cadherin vom Aktinzytoskelett mit daraus folgender Störung der Zelladhäsion führt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung von α- und β-Catenin in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 nach Stimulation mit Kollagen Typ I. Aufgrund der gesteigerten Phosphorylierung der Komponenten des E-CadherinKomplexes durch Kollagen Typ I ist die Analyse von Kinasen und Phosphatasen, die einen Einfluss auf diese Phosphorylierung nehmen, von zentraler Bedeutung. Tyrosinkinasen führen vermutlich über Phosphorylierung der Cadherin-assoziierten Proteine zu einer Störung der Stabilität des Cadherin-Komplexes (Takeichi, 1993). In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass sowohl die Tyrosinkinase FAK in den Zelllinien Panc-1 und BxPc-3 als auch die Kinase Src in der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 am E-CadherinKomplex gebunden vorliegt. Auch die Tyrosinphosphatasen PTEN und SH-PTP2 assoziieren in den Zelllinien Panc-1 und BxPc-3 mit dem E-Cadherin-Komplex. Welchen Einfluss Kollagen Typ I und Fibronektin auf die Aktivität dieser am E-Cadherin-Komplex assoziierten Kinasen und Phosphatasen und somit auf die Phosphorylierung der Komponenten dieses Adhäsions-Komplexes haben, wird im nächsten Kapitel diskutiert. 5.2 Aktivitätsänderung der Tyrosinkinasen FAK und Src sowie der PI 3-Kinase unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin Um ein besseres Verständnis für den Einfluss der Proteine der extrazellulären Matrix auf die Stabilität des E-Cadherin-Komplexes zu erhalten, wurde analysiert, in welcher Weise die Matrixproteine Kollagen Typ I und Fibronektin die am E-Cadherin-Komplex gebundenen Tyrosinkinasen FAK und Src sowie Tyrosinphosphatasen PTEN und SH-PTP2 beeinflussen. Diskussion 63 Immunpräzipitations-Analysen mit einem Antikörper gegen E-Cadherin zeigen in der Zelllinie Panc-1 eine Zunahme der Proteinmenge der mit dem E-Cadherin-Komplex assoziierten Tyrosinkinase FAK unter dem Einfluss von Kollagen Typ I sowie in der Pankreaskarzinomzelllinie BxPc-3 nach Stimulation mit Fibronektin. Diese Proteinzunahme ist mit einer verstärkten Phosphorylierung der Kinase FAK an ihrem Tyrosinrest 397 verbunden. Phosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397 führt zu einer Aktivitätszunahme dieser Kinase (Achison et al., 2001; Salazar et al., 2001). In dieser Arbeit konnte eine Assoziation der Tyrosinkinase FAK mit dem E-Cadherin-Komplex und eine Zunahme der Phosphorylierung dieser Kinase am Adhäsions-Komplex nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin nachgewiesen werden. Diese Proteine der extrazellulären Matrix führen möglicherweise über Aktivierung und Rekrutierung der FAK zum E-CadherinKomplex zu einer Phosphorylierung von α- und β-Catenin mit nachfolgender Dissoziation des E-Cadherin-Catenin-Komplexes. In zahlreichen Veröffentlichungen wird eine Aktivierung der FAK in der Integrinvermittelten Zell-Matrix-Adhäsion beschrieben (Guan, 1997; Schlaepfer et al., 1999; Yurko et al., 2001). Darüber hinaus kann die FAK mit verschiedensten Signalproteinen wie Src, PI 3-Kinase und Paxillin interagieren und ist dadurch in ein Netzwerk der von Integrinen-stimulierten Signalwege eingebunden, welche die ERK und MAPK-Signalwege aktivieren (Calalb et al., 1995; Schlaepfer et al., 1999). Neben der Aktivierung durch ZellMatrix-Interaktionen scheint der Integrin/FAK-Signalweg auch einen Einfluss auf die Regulation von Zell-Zell-Interaktionen zu haben. Genda et al. konnten 2000 in Zelllinien von hepatozellulären Karzinomen nachweisen, dass Kollagen und Fibronektin die E-Cadherinvermittelte Zell-Zell-Adhäsion stört und dass die Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes durch die β1- und β5-Integrinuntereinheiten induziert wird. Auch Avizienyte et al., 2002, legen dar, dass die Schwächung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion durch Src von β1-Integrin sowie von der mit β1-Integrin assoziierten Kinase FAK abhängt. Owens et al., 1995, weisen auf eine Korrelation zwischen der Überexpression der Kinase FAK und invasivem Wachstum mit gestörter Zell-Zell-Adhäsion von Tumorzellen hin. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben eine Hypothese, wie die Proteine der extrazellulären Matrix und die aktivierten Integrine die Zell-Zell-Adhäsion beeinflussen können. Die Aktivierung der FAK durch Kollagen Typ I und durch die Integrine sowie die Translokation der aktivierten FAK zum E-Cadherin-Catenin-Komplex impliziert einen Mechanismus, wie es zu einer erhöhten β-Catenin-Phosphorylierung in Zellen, die auf Kollagen Typ I wachsen, kommen kann. Diskussion 64 Guan et al., zeigten 1992, dass die Tyrosinkinase Src für die bereits mehrfach und gut charakterisierte Aktivierung der FAK durch Integrin-induzierte Zell-Matrix-Adhäsion von Bedeutung ist. Die durch die Integrine aktivierte Kinase Src phosphoryliert die Tyrosinreste 576, 577 und 925 der FAK und induziert die Autophosphorylierung von FAK an ihrem Tyrosinrest 397, was zu einer Zunahme der Aktivität der FAK führt (Achison et al., 2001; Salazar et al., 2001). Die autophosphorylierte und dadurch aktivierte FAK interagiert wiederum mit der Src-Kinase (Salazar et al., 2001; Playford et al., 2004). Slack et al., 2001, konnten in ihren Untersuchungen nachweisen, dass der FAK/Src Signalweg an der Proliferation und Invasion von humanen Prostatakarzinomzelllinien beteiligt ist. Einen entscheidenden Einfluss von Src auf die Zellproliferation wird auch von Ferrand et al., 2005, beschrieben. Sie weisen auf eine zentrale Rolle der Kinase Src in der Proliferationskontrolle von Kolonkarzinomzelllinien hin. Auch Lutz et al., 1998, legen dar, dass die aktivierte Src-Kinase die Zellproliferation stimuliert. Sie konnten in ihren Analysen eine Überexpression und Aktivierung der Kinase Src in Pankreaskarzinomzelllinien zeigen. Avizienyte et al., 2002, konnten eine Korrelation der Aktivität von Src mit deren Lokalisation in der Zelle nachweisen. In Immunfluoreszenz-Analysen zeigten sie eine Zunahme der Src-Konzentration an der Zellmembran in Kolonkarzinomzelllinien, welche mit aktivem Src transfiziert wurden. Diese Beobachtungen stimmen auch mit denen von Weernink et al., 1995 und Finchmann et al., 2000, überein, die inaktives Src vor allem in der perinukleären Region und aktives Src in der Zellperipherie nachwiesen. Die Immunfluoreszenzfärbung der vorliegenden Arbeit zeigt in der Zelllinie BxPc-3 eine Membranlokalisation der Kinase Src nach Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin, im Gegensatz zu den Zellen, die auf TCP gewachsen waren. In Übereinstimmung mit den Literaturdaten ist die Membranlokalisation der Src mit einer Aktivierung dieser Kinase verbunden, so dass möglicherweise die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisationsänderung der Src an die Zellmembran durch Stimulation mit Kollagen Typ I und Fibronektin mit einer Aktivierung dieser Kinase in Zusammenhang gebracht werden kann. Irby und Yeatman, 2002, legen dar, dass die Überexpression von konstitutiv aktiven SrcMutanten zu einer Beeinträchtigung der E-Cadherin-Catenin-vermittelten Zell-ZellAdhäsion in Kolonkarzinomzelllinien führt, wobei die genauen molekularen Mechanismen noch nicht bekannt sind. Zelllinien, in denen mutiertes aktives Src überexprimiert wurde, zeigen eine Phosphorylierung mit nachfolgender Dissoziation des Cadherin-CateninKomplexes. Demgegenüber konnte in Experimenten, in denen dominant-negatives Src oder spezifische Inhibitoren der Src-Aktivität eingesetzt wurden, eine Wiederherstellung Diskussion 65 der Zell-Zell-Adhäsion nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse decken sich mit der von Behrens, 1993, beschriebenen Inhibition der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion nach Aktivierung der Tyrosinkinase Src. Auch Matsuyoshi et al., 1992, konnten in Fibroblasten nachweisen, dass v-Src vermutlich über Tyrosinphosphorylierung die Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion stört. Die Bedeutung der Tyrosinkinase Src auf die ECadherin-induzierte Zell-Zell-Adhäsion wird auch dadurch belegt, dass in Panc-1-Zellen, welche mit aktiviertem Src transfiziert wurden, eine Inhibition der E-CadherinGenexpression beobachtet werden konnte (Menke et al., 2001). Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass keine signifikanten Mengen von Src am ECadherin-Komplex gebunden vorliegen. Avizienyte et al., 2002, konnten in ihren Analysen zeigen, dass die FAK in der durch Src-induzierten Abnahme der Zell-Zell-Adhäsion involviert ist. Roura et al., 1999, konnten eine durch Src-induzierte Zunahme der β-CateninPhosphorylierung nachweisen, sie legen jedoch auch dar, dass möglicherweise andere mit β-Catenin assoziierte Kinasen, welche durch Src aktiviert werden, die Phosphorylierung der Catenine direkt induzieren. Die publizierten Daten lassen zusammen mit den Ergebnissen dieser Arbeit, die keine Phosphorylierung und Aktivitätsänderung der Src am ECadherin-Komplex zeigen konnten, vermuten, dass die Effekte der Src-Kinase auf die ECadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion nur indirekt sind. Eine weitere Kinase, die neben den Tyrosinkinasen Src und FAK eine Rolle in der Integrin-vermittelten Signalübertragung einnimmt, ist die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI 3-Kinase). In nichtadhärenten Zellen wie T-Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten ließ sich eine Integrin-induzierte Stimulation der PI 3-Kinase nachweisen. Aktivierung dieser Kinase ist für das mitogene Potential verschiedenster Wachstumsfaktoren von entscheidender Bedeutung (King et al., 1997). Die PI 3-Kinase, bei der es sich um ein Protoonkogen handelt, spielt eine zentrale Rolle in der Tumorgenese. Im Pankreaskarzinom konnte eine aktivierte PI 3-Kinase nachgewiesen werden (Asano et al., 2004). Darüber hinaus ließ sich eine Assoziation der Kinase FAK mit der PI 3-Kinase sowohl nach Fibronektin-Stimulation als auch nach Integrin-Aktivierung zeigen. Die PI 3-Kinase bindet direkt an die Tyrosinphosphorylierungsstelle 397 der FAK und die p85-Untereinheit der PI 3-Kinase wird durch die FAK phosphoryliert, was mit einer Aktivierung in Zusammenhang gebracht werden kann. Interaktionen der Integrine mit den Proteinen der extrazellulären Matrix führen zu einer Aktivierung der Tyrosinkinase FAK mit daraus folgender Assoziation der FAK mit der Tyrosinkinase Src, wobei der FAK/Src-Komplex wiederum in verschiedenste Signalwege involviert ist und zu einer Aktivierung des PI 3-Kinase führt Diskussion 66 (Guan, 1997; King et al., 1997; Xia et al., 2004). Diese Daten können mit der beschriebenen Stimulation der Zellproliferation unter dem Einfluss der PI 3-Kinase in Zusammenhang gebracht werden (Reif et al., 2003; Liu et al., 2004; Stoll et al., 2005) Asano et al., 2004 zeigen in ihren Analysen, dass der PI 3-Kinase-Signalweg unter anderem in Verbindung mit einer verminderten PTEN-Expression über Stabilisierung des Transkriptionsfaktors c-myc einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation von Pankreaskarzinomzelllinien hat. All diese Erkenntnisse geben Anlass zu untersuchen, welche Rolle die PI 3Kinase in der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion spielt. ImmunpräzipiationsAnalysen zeigen eine Assoziation von der p85-Untereinheit der PI 3-Kinase mit dem ECadherin-Komplex. Die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin führen jedoch zu keiner nennenswerten Änderung der Proteinmenge der p85-Untereinheit an diesem Komplex. Möglicherweise führt die PI 3-Kinase unter dem Einfluss der Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin nicht direkt sondern über Aktivierung weiterer Kinasen zu einer Phosphorylierung und Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes. Roymans und Slegers, 2001, weisen auf eine Aktivierung der PI 3-Kinase durch Adhäsion epithelialer Zellen mit der extrazellulären Matrix hin. Sie schreiben zudem über eine Zunahme des invasiven Wachstums durch die PI 3-Kinase. 5.3 Kollagen Typ I führt zu einer Inhibition von PTEN am E-CadherinKomplex Die mit dem E-Cadherin-Catenin-Komplex assoziierte Phosphatase PTEN zeigt sowohl in der Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 als auch in der Zelllinie BxPc-3 eine starke Abnahme der Proteinmenge nach Stimulation mit Kollagen Typ I. Diese Abnahme der Proteinmenge von PTEN am E-Cadherin-Komplex ist mit einer Zunahme der Phosphorylierung dieser Phosphatase an ihrem Serinrest 380 verbunden. PTEN besitzt eine Tyrosinphosphorylierungs-Domäne zwischen den Aminosäuren 232-241 und eine Serin-/Threoninphosphorylierungs-Domäne am carboxyterminalem Ende zwischen den Aminosäuren 354 bis 403 (Vazquez et al., 2000; Torres et al., 2001). Diese C-terminale nichtkatalytische Domäne scheint eine wichtige Rolle in der Tumorsuppressorfunktion von PTEN einzunehmen, indem es die Stabilität dieses Moleküls, vermutlich durch Phosphorylierung des Serinrestes 380 sowie des Threoninrestes 382 und 383, reguliert (Torres et al., 2001; Vazquez et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass eine Zunahme der Phosphorylierung von PTEN an ihrem Serinrest 380 zu einer Konformationsänderung und Inhibition ihrer Aktivität führt (Vazquez et al., 2001; Birle et al., 2002). Sowohl Abnahme der Proteinmenge als Diskussion 67 auch Inhibition der Aktivität von PTEN am E-Cadherin-Komplex durch Kollagen Typ I weisen darauf hin, dass PTEN die Phosphorylierung und Dissoziation des E-CadherinKomplexes in Abhängigkeit von Kollagen Typ I inhibiert und somit den E-CadherinKomplex stabilisiert. Eine essentielle Bedeutung der Phosphatase PTEN für eine stabile Zell-Zell-Adhäsion wird auch von Kotelevets et al., 2001, beschrieben. Ihre Untersuchungen legen dar, dass die Expression von PTEN die durch Src-induzierte mesenchymale Transformation wieder rückgängig machen kann. Sie implizieren jedoch auch, dass für diese epitheliale Zelltransformation die Lipidphosphataseaktivität von PTEN mehr Bedeutung hat als deren Proteinphosphataseaktivität. Die molekularen Mechanismen der Tumorsuppressor-Funktion von PTEN sind sehr komplex. Auch Persad et al., 2001, konnten in ihren Analysen eine auf die Zell-Zell-Adhäsion stabilisierende Funktion der Phosphatase PTEN nachweisen. Sie zeigten, dass PTEN zu einer Expression von E-Cadherin in Prostatakarzinomzelllinien führt, welche normalerweise kein E-Cadherin exprimieren. Darüber hinaus weisen ihre Experimente auf eine regulatorische Funktion der PTEN in Bezug auf die zytoplasmatische β-Catenin-Proteinkonzentration hin. Ihre Daten zeigen, dass die Phosphatase PTEN das nukleäre β-Catenin reduziert und dass daraus die TCF-induzierte Expression von Cyclin D1 inhibiert wird. Auch bestehen sehr enge Korrelationen zwischen der Phosphatase PTEN und der Tyrosinkinase FAK. Verschiedene Untersuchungen weisen auf eine direkte Assoziation von PTEN mit der Kinase FAK hin. So konnte nachgewiesen werden, dass PTEN die Tyrosinkinase FAK dephosphoryliert und dass dies hemmende Einflüsse auf invasives Zellwachstum hat (Tamura et al., 1998). Die Analysen von Kotelevets et al., 2001 und Vazquez et al., 2000, zeigen einen antagonistischen Effekt der PTEN auf den PI 3-Kinase Signalweg. Haier et al., 2002 und Sansal et al., 2004, legen dar, dass die Überexpression von PTEN die Zellmigration hemmt, während die Inhibition dieser Phosphatase zu einer Zunahme der Zellmigration sowie invasivem Wachstum führt. Darüber hinaus konnte PTEN als Tumorsuppressor-Gen am Chromosom 10q23 identifiziert werden (Steck et al., 1997). In vielen malignen Tumoren, wie Glioblastomen, Prostata- und Endometriumkarzinomen sowie epithelialen Tumoren lassen sich Deletionen und Mutationen dieses Gens nachweisen (Li et al., 1997; Steck et al., 1997; Sansal et al., 2004). Sowohl die in dieser Arbeit nachgewiesene Kollagen Typ I-induzierte Inhibition der PTEN-Aktivität am E-Cadherin-Komplex als auch der in der Literatur beschriebene inhibierende Einfluss der Phosphatase PTEN auf die Zellmigration, Zellproliferation und Invasivität, weisen auf stabilisierende Eigenschaften dieser Phosphatase auf die Zell-ZellAdhäsion hin. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Rekrutierung und Aktivi- Diskussion 68 tätszunahme der Tyrosinkinase FAK sowie die Dissoziation der in ihrer Aktivität inhibierten Phosphatase PTEN vom E-Cadherin-Komplex für die durch Kollagen Typ I-induzierte Phosphorylierung der Catenine von Bedeutung sein kann. Im Zusammenhang mit der vermuteten stabilisierenden Eigenschaft der Phosphatase PTEN auf die E-Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion, wurde weiter analysiert, wie sich die am E-Cadherin-Komplex lokalisierte Phosphatase SH-PTP2 unter dem Einfluss von Kollagen Typ I und Fibronektin verändert. Interessanterweise ließ sich in dieser Arbeit eine Zunahme der Proteinmenge und Tyrosinphosphorylierung der am E-Cadherin-Komplex lokalisierten Phosphatase SH-PTP2 nach Stimulation mit Kollagen Typ I in der Zelllinie Panc-1 und unter dem Einfluss von Fibronektin in der Zelllinie BxPc-3 identifizieren. Die genauen Regulationsmechanismen dieser Phosphatase sind sehr komplex und nur ansatzweise verstanden. Vermutlich wird SH-PTP2 über Tyrosin und Serin-/ThreoninPhosphorylierung reguliert, wobei eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung zu einer Konformationsänderung und Aktivierung dieser Phosphatase führt (Vogel et al., 1993; Qu, 2002). Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben eine positive Rolle der Phosphatase SHPTP2 auf verschiedene Signaltransduktionskaskaden, die einen stimulierenden Einfluss auf das Zellwachstum und die Zellmigration haben. Es konnte nachgewiesen werden, dass SHPTP2 die MAP-Kinase und die PI 3-Kinase/AKT-Aktivität stimuliert (Wu et al., 2001; Cunnick et al., 2002).Oh et al., 1999, charakterisieren die Phosphatase SH-PTP2 als positiven Effektor in der durch Integine-induzierten Signaltransduktionskaskade. Sie zeigen, dass die Zellmotilität sowie die Integrin-vermittelte Src-Aktivierung nach Stimulation durch Matrixproteine in Zellen mit mutierter SH-PTP2 inhibiert wird. Die Expression von SH-PTP2 führt jedoch wieder zu einer Zunahme der Zellmigration sowie Src-Aktivität, vermutlich über Dephosphorylierung des C-terminalen inhibitorisch wirkenden Phosphotyrosinrestes 527 der Src-Kinase. Auch Peng et al., 1995 und Playford et al., 2004, weisen auf eine Assoziation von SH-PTP2 mit der Tyrosinkinase Src hin. Sie legen dar, dass die Phosphatase SH-PTP2 über Dephosphorylierung des Tyrosinrestes 527 der Kinase Src zu einer Aktivierung dieser Tyrosinkinase führt. Höchstwahrscheinlich induziert die Phosphatase SH-PTP2 über Dephosphorylierung verschiedener Proteine, welche im dephosphorylierten Zustand enzymatisch aktiv sind, letztendlich eine Zunahme der Zellmigration und Proliferation. Diskussion 69 5.4 Translokation von β-Catenin in den Zellkern sowie Zunahme der Proliferation unter dem Einfluss von Kollagen Typ I Die durch Kollagen Typ I-induzierte Phosphorylierung der Proteine des E-CadherinKomplexes führt zu einer Zerstörung dieses Adhäsions-Komplexes mit Freiwerden seiner Komponenten. Das Ablösen von β-Catenin vom E-Cadherin-Komplex und von der Zellmembran ist mit invasivem und aggressivem Wachstum sowie mit einer erhöhten Metastasierungstendenz des Pankreaskarzinoms verbunden (Li et al., 2005). Membranpräparations-Analysen lassen nach Stimulation mit Kollagen Typ I eine Abnahme der β-Catenin-Proteinmenge an der Zellmembran erkennen, wobei im Gegensatz dazu β-Catenin im Zytosol detektiert werden kann. Dieses Ergebnis korreliert mit der in der Triton-Aufarbeitung nachgewiesenen Kollagen Typ I-induzierten Lokalisationsänderung von β-Catenin vom Aktinzytoskelett in das Zytoplasma. Darüber hinaus zeigen β-CateninDAPI-Doppelfärbungen eine Translokation von β-Catenin von der Zellmembran in den Zellkern nach Stimulation mit Kollagen Typ I, wobei das Matrixprotein Fibronektin zu keiner Lokalisationsänderung von β- Catenin führt. Akkumulation von β-Catenin im Zellkern führt zu einer Aktivierung der Expression von βCatenin-LEF/TCF Zielgenen wie Cyclin D1 und c-myc, was mit einer gesteigerten Proliferation in Zusammenhang gebracht werden kann (Tetsu et al., 1999, Persad et al., 2001; Li et al., 2005). Dies korreliert mit der in dieser Arbeit nachgewiesenen signifikanten Zunahme der Proliferation von Panc-1-Zellen nach Stimulation mit Kollagen Typ I. Die vorliegenden Ergebnisse führen zu der Annahme, dass die durch Kollagen Typ I-induzierte Translokation von β-Catenin in den Zellkern, über Aktivierung der onkogenen Gene Cyclin D1 und c-myc, die Zellproliferation stimuliert. Darüber hinaus weisen Brabletz et al., 2001, auf einen unmittelbaren Zusammenhang zwischen invasivem Tumorwachstum und der Lokalisation von β-Catenin im Zellkern hin. Die Kolonkarzinomzelllinie SW-480, in der β-Catenin im Zellkern nachgewiesen wurde, zeigt eine mesenchymale Zellmorphologie. Demgegenüber konnten sie nachweisen, dass der Übergang zu einem epithelialen Phänotyp mit einer Lokalisationsänderung von β-Catenin vom Zellkern zur Zellmembran verbunden ist. Die Untersuchungen von Irby und Yeatman, 2002, zeigen in Kolonkarzinomzellinien eine Kernlokalisation von β-Catenin nach Transfektion mit aktiviertem Src. Dies kann in Zusammenhang mit der oben beschriebenen Src-induzierten Beeinträchtigung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion mit nachfolgender Zunahme der Zellproliferation gebracht werden. Diskussion 70 Kollagen Typ I führt in der Zelllinie Panc-1 zu einer signifikanten Zunahme der Proliferation, während nach Stimulation mit Fibronektin nur eine geringe Proliferationszunahme im Vergleich zu TCP nachgewiesen werden kann. Diese vor allem durch Kollagen Typ Iinduzierte Proliferationszunahme der Zelllinie Panc-1 korreliert mit der in der Immunfluoreszenzfärbung zu beobachtenden Translokation von β-Catenin in den Zellkern unter dem Einfluss von Kollagen Typ I im Gegensatz zu Fibronektin und TCP. Zusammenfassung 71 6 Zusammenfassung Ein intakter E-Cadherin-Komplex (epithelialer Cadherin-Komplex) ist für die Aufrechterhaltung stabiler Zell-Zell-Interaktionen von entscheidender Bedeutung. Beeinträchtigungen der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion spielen in der Entstehung und Ausbreitung maligner Tumore eine zentrale Rolle. Pankreaskarzinome stellen maligne Tumore mit ausgeprägt invasivem Wachstumsverhalten und früher Metastasierung dar. Die Zellen des Pankreaskarzinoms sind, im Gegensatz zu Zellen anderer solider Tumore, in eine wesentlich größere Menge an extrazellulärer Matrix eingebettet. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Interaktionen zwischen den Zellen und den Proteinen der extrazellulären Matrix zu einer Störung der E-Cadherin-vermittelten Zell-ZellAdhäsion mit daraus folgender Zunahme der Zellproliferation führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die Proteine Kollagen Typ I und Fibronektin der extrazellulären Matrix auf die Phosphorylierung und Stabilität des ECadherin-Catenin-Komplexes in Pankreaskarzinomzelllinien haben. Die durchgeführten Analysen zeigen eine durch Kollagen Typ I-induzierte Dissoziation des E-Cadherin-Komplexes. Es konnte nachgewiesen werden, dass Kollagen Typ I zu einer Umverteilung der Proteine E-Cadherin sowie α- und β-Catenin vom Aktinzytoskelett in das Zytoplasma führt. Diese Translokation der Komponenten des E-CadherinKomplexes unter dem Einfluss von Kollagen Typ I wird durch die Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. In Immunpräzipitations-Analysen mit einem Antikörper gegen E-Cadherin kann eine Abnahme der α- und β-Catenin-Proteinmenge am E-Cadherin-Komplex durch Kollagen Typ I beobachtet werden. Darüber hinaus ließ sich eine Zunahme der Phosphorylierung von α- und β-Catenin nach Stimulation mit Kollagen Typ I detektieren. Diese Phosphorylierung von α- und β-Catenin korreliert mit der Kollagen Typ Iinduzierten Rekrutierung und Aktivierung der Tyrosinkinase FAK (focal adhesion kinase) zum E-Cadherin-Komplex sowie mit der Inhibition und Dissoziation der Phosphatase PTEN (phosphatase and tensin homolog) von diesem Adhäsions-Komplex. Die Effekte der Src-Kinase (Sarcoma-Kinase) auf die E-Cadherin-induzierte Zell-ZellAdhäsion sind nur indirekt, so dass Src möglicherweise über eine Aktivierung der Kinase FAK die E-Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion beeinträchtigt. 72 Die durch Kollagen Typ I-induzierte Translokation von β-Catenin von der Zellmembran in den Zellkern, weist darüber hinaus β-Catenin als einen prognostischen Faktor für das Pankreaskarzinom aus. Diese Translokation korreliert mit einer Zunahme der Zellproliferation. Literaturverzeichnis I Literaturverzeichnis Aberle H, Schwartz H, Kemler R: Cadherin-catenin complex: protein interactions and their implications for cadherin function. J Cell Biochem. 61: 514-523 (1996) Achison M, Elton C, Hargreaves P, Knight C, Barnes M, Farndale R: Integrinindependent tyrosine phosphorylation of p125fak in human platelets stimulated by collagen. 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Vielen herzlichen Dank an Dr. Alexander König für seine Unterstützung und seine hilfreichen Ratschläge. Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für deren Hilfe, Motivation und gute Zusammenarbeit, insbesondere bei Frau Simone Bräg, Frau Claudia Längle und Frau Dr. Yuki Imamichi bedanken. Vielen Dank auch an Mark Nguyu-lat und Oliver Waidmann. Nicht zuletzt möchte ich mich ganz herzlich bei meinen Eltern, bei Iris Schmuck und bei Steffen Epple für ihre Unterstützung bedanken.
