1 Skript UWM_2014

Umweltmikrobiologie
Mikrobiologie und Biotechnologie
Universität Ulm
Dr. Erhard Stupperich
Sommersemester
2014
Inhaltsverzeichnis
Inhalt
1 Lernziele
3
2 Versuche
2.1 Anreicherung von Staphylokokken
2.2 Biochemische Teste auf Staphylokokken Virulenzfaktoren
2.3 Nachweise der thermostabilen Nuklease
2.4 Multiresistenz des Staphylococcen-Isolates
2.5 Molekularbiologischer Nachweis von Staphylokokken-Virulenzfaktoren durch KoloniePCR
2.5.1 Nachweis und Identifizierung der Staphylokokken durch PCR ihres 16S rRNA Gens
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3 Keimgehalt von Milchproben
3.1 Rückstandsanalytik auf Antibiotika in Milchproben
3.2 Gewürze, ihr Keimgehalt und ihre antibiotische Wirkung
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4 Chemische und mikrobiologische Wasserparameter
4.1 Gesamtkeimzahl
4.2 Keimzahlbestimmung durch MPN
4.3 Analyse Antibiotika-resistenter Keime im Abwasser
4.4 Nachweis des Integronsystems durch die PCR-Methode
4.4.1 Analyse der PCR-Produkte:
4.4.2 Ansatz für den Restriktionsverdau des PCR-Amplifikats durch PvuII bzw. BglI
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5 Phagennachweis
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6 Quantifizieren von Luftkeimen
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7 Biologische Brennstoffzelle - Stromerzeugung mit Bakterien
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8 Pilze - Nachweise und Bestimmungen
8.1 Candida albicans
8.2 Isolierung von Pilzen aus natürlichen Standorten
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9 Exkursionen
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10 Anhang
10.1 Pseudomonas aeruginosa Integrase-Gen
10.2 Testunterlagen zu Slidex Staph Plus
10.3 Übersicht zu Experimenten
10.4 Tabelle chemische Wasserparameter
10.5 Tabelle mikrobiologischer Wasserparameter
10.6 Tabellen Badewasserqualitäten und mikrobiologische Grenzwerte für Trinkwasser
10.7 Antibiotika
10.8 Standards für Agarosegelelektrophoresen
10.9 Feller Tabelle
10.10 McCrady Tabelle
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Umweltmikrobiologie
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1 Lernziele
In diesem Praktikum werden Umweltproben mikrobiologisch, molekularbiologisch und (bio)-chemisch untersucht. Die Methoden und Standorte sind u.a.:
Anreicherungen von Staphylococcen, Milchsäurebakterien und antibiotikaproduzierenden
Streptomyceten. Es werden folgende Biotope beprobt:
Abwasser: Darin werden multiresistente Keime nachgewiesen. Aus ihrer DNA wird mit Hilfe
der PCR das Integron-System als ein Multiresistenzsystem analysiert. Das Integron-Amplifikat
wird in einer RFLP (restriction fragment length polymorphism) genauer untersucht.
Flußwasser: Mikrobiologische und chemische Analyse von Flußwasser (Donau, Iller, Weihung)
in der Nähe des Trinkwasserschutzgebietes der Stadt Ulm. Bestimmung der chemischen Parameter: pH, Leitfähigkeit, Sauerstoff sowie die mikrobiologische Qualität dieser Oberflächengewässer nach der MPN-Methode.
Milch: Sie analysieren den Keimgehalt verschiedener Milchproben. Außerdem lernen Sie ein
Verfahren kennen, mit dem biozide Stoffe (z.B. Antibiotika) in der Milch nachgewiesen werden.
Zusätzlich werden Sie in einer biologischen Brennstoffzelle mit Milchsäurebakterien (oder mit
Hefen) Strom erzeugen.
Luft: Mit einem Luftkeimsammler werden Luftproben im Bereich der Belebungsbecken des städtischen Klärwerks und anderer Probenstellen genommen, u.a. im Universitätsbereich. Die benutzte Technik entspricht den vorgeschriebenen Methoden der Industrie zur mikrobiologischen
Kontrolle ihrer Räumlichkeiten.
Eigene Haut/Lebensmittel: Staphylokokken aus der Nase. Das Isolat wird auf Virulenzfaktoren
wie "Koagulase" molekularbiologisch und auf Protein A immunologisch analysiert. Außerdem Hefen und Pilze, u.a. Edelschimmel von Käsesorten und ein Test auf Candida albicans aus dem
Mund.
Gewürze: Keimbelastung bzw. ihre antibiotische Wirkungsamkeit gegen Gram-negative und
Gram-positive Bakterien.
Boden: Anreicherung Antibiotika-produzierender Streptomyceten mit biologischem Nachweis der
Antibiotika durch Geobacillus stearothermophilus
Exkursionen: Durch Besuch eines Trinkwasserwerkes (Landeswasserversorgung, Langenau)
und einer Kläranlage (städtisches KW Ulm) vertiefen Sie ihr Verständnis für die Wasserkreisläufe, von denen unsere Existenz essentiell abhängt.
Ein Protokoll ist spätestens 8 Tage nach Ende des Praktikums als pdf-Dokument an mich
([email protected]) zu schicken. Weitere Hinweise zum Protokoll siehe das gesonderte Dokument.
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1.1 Zeitrahmen
Methode
Praktikumstage
Mo Di Mi Do Fr
Mo Di
Mi Do Fr
Medien herstellen
Streptomyceten
Antibiotika-Produktion
Staphylokokken
Virulenzfaktoren
Pilze
Milch
Antibiotika
Brennstoffzelle
Antibiotika-Resistenz
PCR
RFLP
Luftkeime
Wasserparameter
Keimzahl (MPN)
chemische Parameter
DNA-Isolierung
Phagennachweis
Exkursionen
Zu den Versuchen gibt es im Anhang Übersichts-/Aktivitätsdiagramme
2 Versuche
Ein wichtiges mikrobiologisches Qualitätskriterium ist die Gesamtkeimzahl. Darunter werden alle
lebensfähigen Keime (KBE = Koloniebildende Einheit, auch CFU) verstanden, die auf einem
komplexen Nährboden züchtbar sind. Es wird jedoch geschätzt, dass nur etwa 1 % aller Keime
aus natürlichen Standorten überhaupt angezüchtet werden können.
Isolierung von Streptomyceten und Nachweis Antibiotika-produzierender Stämme
Zur Gattung Streptomyces gehören typische Gram-positive Bodenbakterien mit einem vielfältigen
Sekundärmetabolismus. Als Besonderheit können diese Bakterien der Ordnung Actinomycetales
pilzähnlich mit Substrat- und Luftmycelien wachsen. Aus den Streptomyceten wurden sehr viele
Antibiotika isoliert, z.B. das Streptomycin. Da sie gegen ihre eigenen antibakteriellen Produkte
resistent sein müssen, könnte dieser Ansatz u.a. für eine Anreicherung gewählt werden. Außerdem produziert Streptomyces violaceus das Biotin-bindende Protein Streptavidin. Streptomyceten sind erkennbar am Geosmin-Geruch, dem typischen "Bodengeruch".
Ziel unseres Versuches ist die Anreicherung von Streptomyceten aus verschiedenen Bodenproben. Diese Anreicherungen werden anschließend mit dem Antibiotika-empfindlichen Geobacillus
stearothermophilus überschichtet und nach Bebrütung auf Hemmhöfe kontrolliert, die um Antibiotika-bildende Streptomyceten-Kolonien gebildet werden.
2.0.1 Isolierungsverfahren
1 g luftgetrocknete Erde (Kompost, Wald- oder Gartenerde) werden mit 0,1 g CaCO3 (10:1, w/w)
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gut vermischt und 2 Tage bei 37°C im 50 ml Falcon inkubiert. Dann wird 5 ml steriles 0,9 % NaCl
(Ringerlösung) zugegeben. Die Überstände werden unverdünnt und 10-2 bzw. 10-4 verdünnt
über Nacht (16 h) im Wasserbad bei 45°C inkubiert. Durch diese Behandlung trennen sich die
Sporen von den vegetativen Zellen. Anschließend erfolgt die Ausplattierung auf Actinomyceten
Isolierungsagar (AIA; Difco 212168). Bebrütet wird für mehrere Tage bei 28°C. Dann wird 3 ml einer Geobacillus stearothermophilus Kultur im 50 °C warmen Agar auf die Unterschichtplatte gegossen und auf der Laborbank abgekühlt. Dieser Ansatz wird nach Verfestigung des Agars bei
60°C für ein bis zwei Tage inkubiert. Achtung: Agarplatten für die Inkubation mit Parafilm verschließen oder in einer Plastiktüte verpacken, um ihr Austrocknen zu verhindern!
Zusammensetzung des Actinomyceten Isolierungsagars (AIA, g/L): Natrium-Casein 2, Asparagin 0,1; Na-Propionat 4; K2HPO4 0,5; MgSO4 0,1; Fe(II)SO4 0,001; Agar 15. Zur Hemmung des
Pilzwachstums kann zusätzlich 300 I.E./ml Nystatin zugesetzt werden.
Ansetzen des AIA: 22 g/L gut lösen + 5 g Glycerin zugeben und autoklavieren (121°C, 20 min, 1
bar Wasserdampfüberdruck)
Geobacillus-Kultur: eine Vorkultur von Geobacillus stearothermophilus wird in 1,5 ml LB-Medium über Nacht bei 60 °C im Schüttler angezüchtet. Diese Kultur wird mit 1,5 ml 2,5%-igem Agar
in LB Medium gut gemischt und auf die Streptomyceten-bewachsenen Agarplatten ausgegossen.
Die doppelschichtigen Agarplatten werden dann bei 60 °C ein bis zwei Tage (Deckel nach oben!)
inkubiert. Achtung: Agarplatten zur Inkubation mit Parafilm verschließen oder in einer Plastiktüte
verpacken, um ihr Austrocknen zu verhindern! Dokumentieren Sie das Ergebnis durch ausmessen der Hemmhöfe und erstellen Sie ein Foto (auf der Fotodok oder mit der Digitalkamera eventuell in einer Gegenlichtaufnahme).
2.1 Anreicherung von Staphylokokken
Staphylococcus epidermidis ist ein Leitkeim unserer Hautflora: Nase, Achseln, Leistengegend,
Zehenzwischenraum. Daneben kommt Staphylococcus aureus bei etwa 30 % der Bevölkerung
vor. In etwa 10-30 % der S. aureus-Fälle kann es sich dabei um pathogene Arten handeln, die diverse Pathogenitätsmechanismen ausbilden. Bekannt ist der MRSA (Methicilin resistente S. aureus), dessen Stämme häufig auch multiresistent sind. Die nationale Fachkompetenz zu Staphylokokken ist im Nationalen Referenzzentrum in Wernigerode/Harz zusammengefasst.
In diesem Versuchsabschnitt werden Staphylokokken angereichert und auf einige ihrer möglichen Virulenzfaktoren getestet.
1. Bereiten Sie den Vogel-Johnson-Agar vor. Typische Zusammensetzung (g/Liter):
Pepton aus Casein: 10, Hefeextrakt: 5, D(-)-Mannit 10, K2HPO4: 5, Lithiumchlorid: 5,
Phenolrot (pH-Indikator): 0,025, Glycin: 10, Agar: 15.
Nach dem Autoklavieren werden 20 ml einer sterilen Kaliumtelluritlösung 1 g/100 ml
pro Liter Nähragar zugegeben.
Wirkungsweise:
Mit diesem Medium werden Koagulase- und Mannit-positive Stämme isoliert. Gelbe Zonen um die Kolonien zeigen die Verwertung des Mannit an: der pH-Indikator Phenolrot
schlägt wegen der Bildung von Acetat + CO2 unter aeroben und Lactat unter anaeroben
Bedingungen um. Schwarze Kolonien rühren überwiegend von Staphylococcus aureus
her, der Tellurit zu metallischem Tellur reduziert. Tellurit, Lithiumchlorid und die hohe
Glycinkonzentration hemmen die Begleitflora wenigstens in einer Anfangsphase (37 °C,
24 h).
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2. Streichen Sie mit einem sterilen Q-Tipp aus der eigenen Nase und anderen Hautpartien bzw.
von kontaminierten Lebensmitteln auf 4-fach sektorierte Vogel-Johnson Agarplatten aus: 2 Sektoren für Eigenisolate und zwei für die beiden Referenz-Stämme.
3. Bebrüten Sie die Agarplatten bei 37 °C für 1-2 Tage.
4. Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtung: Bei Farbumschlag nach gelb in der Nähe einer
Kolonie sollten Mannit-Verwerter vorhanden sein. Enthält ein solcher Hof eine schwarze Kolonie,
so kann Staphylococcus aureus vorliegen. Grauschwarze Kolonien können überwiegend aus
Staphylococcus epidermidis bestehen.
5. Führen Sie auf gleichem sektorierten Nähragar Reinigungsausstriche durch.
6. Streichen Sie eine Kolonie der vermuteten Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis Kulturen auf einer sektorierten Blutagarplatte aus; 4 Sektoren: 2 für Eigenisolate und
zwei für die beiden Referenz-Stämme. Im Fall von Hämolysehöfen um die Kolonien muss an pathogene Eigenschaften des Isolates gedacht werden.
7. Differenzieren Sie ihre Isolate nach folgendem Schema. Beginnen Sie mit einem mikroskopischen Präparat; es sollten Kokken erkennbar sein. Katalase-Test: tropfen Sie auf eine Kolonie
bzw. einer nicht bewachsenen Agarfläche einen Tropfen 3%-iges H2O2 auf. Gasbildung in weniger als 1 min Inkubationszeit ist Zeichen einer Katalase-positiven Reaktion.
Abbildung 2.1: Differenzierungsschema für Staphylokokken. Katalase wird mit 3 % H2O2 auf einer Kolonie bzw. einer unbewachsenen Agaroberfläche getestet. Säurebildung wird durch Umschlag des pH-Indikators Phenolrot nach gelb angezeigt. Koagulase wird einem Testkit (Pastorex
Staph Plus, BioRad) geprüft.
2.2 Biochemische Teste auf Staphylokokken Virulenzfaktoren
Staphylococcus aureus bildet verschiedene Virulenzfaktoren, u.a. Koagulase, Protein A, Toxine
(β-Hämolyse, siehe Kapitel 2.2 Punkt 6), Multiresistenz gegen Antibiotika, extrazelluläre thermostabile Nuclease, etc. Wir werden einige Gene dieser Virulenzfaktoren bei den Eigenisolaten
mit der PCR bzw. durch biochemische Testverfahren überprüfen. Es wird bei diesen Untersuchungen der Referenzstamm Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA252) mitgeführt.
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Koagulase ist ein Protein, dass bei Staphylococcus aureus vorkommt und Thrombin zu
Staphthrombin umsetzt. Staphthrombin aktiviert dann Fibrinogen zu Fibrin. Dieses Fibrin lagert
sich auf den Zelloberflächen ab, wodurch Staphylococcus für unser Immunsystem maskiert wird.
Koagulase ist also ein Virulenzfaktor, der frei im Medium oder als zellgebundener clumping factor (CF) vorkommt.
Abbildung 2.2: Durch Staphylokokken-Koagulase ausgelöste Reaktionen im Plasma.
Protein A ist ein Oberflächen-Protein, das an den Fc-Teil der IgG Antikörper bindet. Dadurch
richten sich die Antikörper in der "falschen" Orientierung auf der Bakterienoberfläche aus, die ungünstig für deren Opsonierung ist. Wird die Oberfläche des Bakteriums wie in der Koagulase-Reaktion mit körpereigenen Proteinen beladen, so wird eine Abwehr körperfremder Zellen/Substanzen erschwert.
Der Nachweis von Koagulase, Protein A und einem Staphylokokken-typischen Oberflächen Antigen erfolgt mit dem Pastorex Staph Plus (oder alternativ mit Slidex Staph Plus Kit).
Auf zwei Felder der Vorlagen werden jeweils ein Tropfen (ca. 20 µl) Reagenz R1 und Reagenz
R2 aufgetragen. Dann wird Koloniematerial von Staphylococcus aureus bzw. Staphylococcus
epidermidis von einer LB-Agarplatte mit den mitgelieferten Plastikstäbchen entnommen und in
die Reagenzlösungen für 10 sec eingerieben (Achtung: gute Verteilung des Zellmaterials in der
Lösung!). Nach etwa 20-30 sec wird das Ergebnis der Reaktion abgelesen: Verklumpung (= positiv) bzw. homogene Suspension = negativ.
Aufgabe: Führen Sie den Test durch, beschreiben (fotografieren) Sie das Ergebnis und interpretieren Sie ihr Resultat.
2.3 Biochemischer Nachweise der thermostabilen Nuklease
Zur Bestätigung des Stammes Staphylococcus aureus und zur Abgrenzung dieses Isolates gegenüber Staphylococcus epidermidis werden jeweils einzelne Kolonien dieser beiden Stämme in einem kurzen Ausstrich auf einer sektorierten DNase-Testagarplatte (8
Sektoren auf einer heipha, 2070e) ausgestrichen. Der Ausstrich wird 18-24 h bei 37 °C
bebrütet. Anschließend wird diese Agarplatte mit 1 ml 2 N HCl überschichtet. Nach wenigen Minuten (< 10 min) erscheint um Staphylococcus aureus ein heller Hof (= Nuklease
positiv), während bei Staphylococcus epidermidis der Agar trüb bleibt (= Nuklease negativ).
Achtung: HCl kann beim Verspritzen auf die Kleidung Löcher verursachen.
Auswertung: Fotographieren Sie das Ergebnis dieses Plattentestes und stellen Sie alle
geprürften Kriterien in einer Tabelle zusammen, die für die Isolierung eines Staphylococcus aureus Stammes sprechen.
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2.4 Multiresistenz des Staphylokokken-Isolates
Ziel ist es, die Antibiotika-Resistenz des eigenen Staphylococcus-Isolates zu überprüfen. Dazu
wird folgender Versuch durchgeführt:
Verfahren (siehe auch Versuch 2.2 bzw. 2.3)
1. Resuspendieren Sie eine Kolonie aus der Staphylococcus-Anreicherung in 1 ml steriler
0,9%-igen NaCl-Lösung.
2. Streichen Sie 2 x 100 µl dieser Suspension mit dem Drigalskispatel auf jeweils einer
Antibiotika-freien LB-Agarplatte aus.
3. Legen Sie den Antibiotika-Testring (Mast Diagonstics Mastring M43 bzw. den Oxacillin
Teststreifen) auf jeweils eine Agarplatte. Pressen Sie den Testring und den Teststreifen leicht mit einer sterilen Pinzette auf die Agaroberfläche und inkubieren Sie die
Agarplatten bei 37 °C über Nacht im Brutschrank. Bezeichnung der Antibiotika auf dem
Testring siehe 4.3 "Analyse Antibiotika-resistenter Keime im Abwasser".
4. Messen und fotografieren (Fotodok) Sie die Hemmhofdurchmesser um die einzelnen
Testantibiotika. Erstellen Sie eine Messwert-Tabelle!
2.5 Molekularbiologischer Nachweis von Staphylokokken-Virulenzfaktoren durch
Kolonie-PCR
Auf der Haut kommen verschiedene Staphylokokken vor, u.a. der opportunistische S. aureus und
der Leitkeim S. epidermidis.
Hier wird eine Auswahl von Genen nachgewiesen, die für Virulenzfaktoren in Staphylococcus aureus kodieren. Der Nachweis solcher Gene durch PCR sagt allerdings nichts zur Expression dieser Faktoren. Umgekehrt ist eine kontrollierte negative Reaktion ein Indiz für das Fehlen dieser
Virulenzfaktoren im eigenen Isolat.
Material und Methode:
Es werden 1-2 Kolonien Staphylococcus aureus bzw. Stapyhlococcus epidermidis getrennt mit
gelben Pipettenspitzen von der Vogel-Johnson-Agarplatte in jeweils ein 2 ml Eppendorf Tube gefüllt mit 0,1 mm Glas beads und 100 µl TER-Lysispuffer (wird gestellt) resuspendiert. Diese Eppendorfreaktionsgefäß fwerden für 10 min bei 95°C im Heizblock inkubiert und dann auf Eis abgekühlt. Dann werden die Gram-poistiven Zellen im Ribolyser (6500, 2 x 45 sec) aufgeschlossen
und anschließend die Zelltrümmer abzentrifugiert (5 min, 13 000 xg) und der DNA-haltige Überstand zur PCR verwendet. Als Referenz für diese PCR-Untersuchungen dient genomische DNA
aus Staphylococcus aureus MRSA 252 (ATCC 43300, wird gestellt) bzw. aus Staphylococcus
epidermidis (selbst zu isolieren).
TER-Lysispuffer zum Zellaufschluss (wird gestellt):
1 % Triton X 100
0,5 % Tween 20
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM EDTA
Ansatz des Lysispuffers (TER-Puffer):
0,5 ml Tris-EDTA-Puffer pH 8,0 (100 x) (z. B. TE- Puffer)
0,5 ml Triton X 100 ( z. B. Sigma, Best.-Nr. T8787)
0, 25 ml Tween 20 ( z. B. Sigma, Best.-Nr. P9416)
ad 50 ml autoklaviertes Aqua dest.
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Die Eigenisolate werden über Abstriche mit einem Q-tip aus der Nase, dem Mund (Zahntaschen
und Zunge) auf Vogel-Johnson-Agar erhalten. Staphylococcus aureus Kolonien zeigen auf diesem Medium einen gelben Rand (pH-Indkator zeigt Mannitverwertung, siehe 2.2).
Dann werden mit dem DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702) eine Multiplex-PCR auf drei Virulenzgene im 20 µl Ansatz durchgeführt: 7 µl H2O, 1 µl fw-Primer, 1 µl rvPrimer, 1 µl template DNA (Überstand) und 10 µl 2x Dreamtaq Mastermix.
PCR-Bedingungen:
Denaturierung: 5 min 95°C
35 Zyklen mit 30 sec 95°C, 30 sec annealing bei 52 °C und 60 sec Polymerisation bei 72°C. Abschließend wird 5 min bei 72°C vervollständigt.
Methicillinresistenz (mecA)
mec_fw: 5'-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3´
mec_rev: 5'-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3´
Produktlänge: 533 Bp
Koagulase (coa):
coa_fw: 5`-ATA GAG ATG CTG GTA CAG G-3´
coa_rv: 5´-GCT TCC GAT TGT TCG ATG C-3´
Produktlänge: Stamm-variabel von 500 bis 900 Bp
thermostabile, S. aureus spezifische Nuclease (nucI; EC 3.1.31.1)
nuc_fw:_285: 5´-AGCGATTGATGGTGATACGG-3´
nuc-rev_507: 5´-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3´
Produktlänge: 223 Bp
Die PCR-Produkte (10 µl) werden in einer 2%-igen Agarosegelelektrophorese mit 4 µl der 50
Bp-Ladder (siehe Anhang 10.8) und mit Ethidiumbromid gefärbt. Das Ergebnis wird fotographiert
und mit der Voraussage verglichen.
2.5.1 Nachweis und Identifizierung der Staphylokokken durch PCR ihres 16S rRNA
Gens
Isolierung chromosomaler DNA aus Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA252, wird gestellt) bzw. aus Staphylococcus epidermidis und aus einem Eigenisolat. Dazu wird das Verfahren
zur Isolierung von chromosomaler DNA unter Punkt 2.5 verwendet. Als Primer zum Nachweis
des 16S rRNA Gens werden die "universellen EUB-Primer" eingesetzt:
Material und Methoden:
universal EUB primer: 27f und 1492r (Mit diesen Primern können sehr viele Eu-Bakterien
in gleicher Weise bestimmt werden.)
27f: 5´-AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG-3´
1492r: 5´-GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T-3´
PCR-Gerät
0,8%-iges Agarosegel in 1x TAE-Puffer
1 kb Ladder (Fermentas)
Zur eindeutigen molekularbiologischen Identifizierung wird ein Staphyolococcus epidermidis Isolat aus dem Versuch 2.2 in 5 ml LB-Röhrchen über Nacht bei 37 °C angezüchtet.
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Ein ml dieser Kultur wird abzentrifugiert (3 min, 13000 g), der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 50 µl Wasser aufgenommen und bei 95 °C für 15 min inkubiert, um die chromosomale DNA freizusetzen. Dann wird auf Eis abgekühlt (2 min) und abzentrifugiert (3 min, 13000
g). Der Überstand mit der chromosomalen Staphylococcus-DNA wird in ein steriles Eppendorfreaktionsgefäß überführen.
PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl: siehe 2.5
PCR-Bedingungen: siehe 2.5
Die PCR-Amplifikate werden in einem 0,8 %-igen Agarosegel analysiert. Als Längenstandard
wird die "1 kb DNA Ladder" (Fermentas, siehe Anhang 10.8) benutzt.
Aus dem 20 µl PCR-Ansatz werden 5 µl unverdaut und jeweils 5 µl mit EcoRI bzw. HindIII in 30
min bei 37 °C verdaut und auf das Agarosegel aufgetragen. Das Agaraosegel wird in Ethidiumbromid gefärbt und auf der Fotodok abgelichtet.
Mit den Verdauen durch die beiden Restriktionsendonukleasen wird eine so genannte RFLP =
restriction fragment length polymorphism, durchgeführt. Durch eine solche Analyse wird die Identifizierung des Eigenisolates als Staph. epidermidis oder Staph. aureus zusätzlich bestätigt.
Tabelle: Fragmentlängen nach RFLP-Analyse der 16S rRNA-Produkte
EcoRI
HindIII
Staphylococcus Bacillus subtilis
682/800
682/800
1128/426
-
E. coli
682/800
640/890
Für die eindeutige Identifizierung der Staphylococcus-Isolate müssten deren 16S rRNA Gene
über die PCR-Technik nicht nur amplifiziert, sondern deren Nukleotidsequenz mit dem frei zugänglichen Internetprogrammen "Ribosomal Database Project II" oder mit "NCBI Database" analysiert werden.
3 Keimgehalt von Milchproben
Abbildung 3.1: Übersicht über die Versuche mit Milchproben
1. Setzen Sie Chinablau-Lactose Medium an.
Typische Zusammensetzung des Chinablau-Lactose Mediums (g/Liter):
Pepton 5, Fleischextrakt 3, Lactose 10, Natriumchlorid 5, Chinablau 0,375, Agar 12, pH 7
Wirkungsweise:
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Chinablau-Lactose ist ein hemmstofffreier Standardnährboden zur Differenzierung von
Bakterien aus Milch. Der pH-Indikator differenziert zwischen Lactose-positiven und negativen Keimen. Daher kann dieser Nährboden zum Nachweis von Streptokokken und
Staphylokokken aber auch für den Nachweis von Keimen der Coli-Aerogenes Gruppe
verwendet werden.
Große, blaue Kolonien (= Lactose-positiv): E. coli und andere Coliforme, kleine Kolonien:
Streptokokken und Staphylokokken (mikroskopisches Präparat zur Kontrolle!)
Farblose Kolonien (= Lactose-negativ): Salmonella, Serratia, Proteus
2. Setzen Sie EMB Agar an.
Typische Zusammensetzung des EMB-Agars (g/Liter):
Pepton 10, Lactose 10, Dikaliumhydrogenphosphat 2, Eosin G 0,4, Methylenblau 0,065,
Agar 15, pH 6,8
Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 50 -60 °C und dann zur Oxidation des Methylenblaus schütteln. Das Präzipitat sollte homogen verteilt sein. Lichtgeschützte Lagerung.
Wirkungsweise:
Eosin und Methylenbau hemmen Gram-positive Keime. Beide Farbstoffe bilden bei saurem pH-Wert ein Präzipitat.
Mit diesem Agar ist bei Zusatz von Tetracyclin und 10 %-iger CO2-Atmosphäre in 1-2
Tage bei 37 °C auch der Nachweis der Hefen Candida albicans möglich. E. coli bildet
metallisch grüne Kolonien.
Sektorieren Sie eine EMB-Agarplatte und streichen Sie auf einen Sektor E. coli auf den
anderen Sektor Bacillus subtilis als Referenzkulturen aus.
3. Setzen Sie 2 LB-Agarplatten für die Gesamtkeimzahlbestimmung an.
4. Es werden jeweils 100 µl unverdünnte und 10-2 verdünnte Rohmilch vom Bauern und Handelsmilch auf jeweils einer Chinablau-Lactose Agarplatte bzw. auf einer EMB-Agarplatte mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die Verdünnung: mit steriler Pipette werden 100 µl Milch auf 10 ml
sterile physiologische Kochsalzlösung pipettiert und mit dem Vortexer gemischt.
5. Bebrüten der Agarplatten bei 37 °C für 1-2 Tage.
6. Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtung: Die Anzahl der Kolonien auf Chinablau-Lactose
Agar gibt einen Hinweis auf die Keimbelastung der Milchprobe. Metallisch grüne Kolonien auf
EMB-Agar sprechen für E. coli bzw. für Enterobakterien und damit für eine fäkale Verunreinigung
der Milchprobe.
3.1 Rückstandsanalytik auf Antibiotika in Milchproben
Hierzu verwenden Sie den Delvo-Test, eine Fertigkultur mit Geobacillus stearothermophilus als
Testkeim. Dieser Test ist für die schnelle und empfindliche Routinebeprobung in der Milchwirtschaft entwickelt worden. Er schützt die Starterkulturen in den Molkereien und den Verbraucher
vor unerwünschten Antibiotikarückständen. Der Test kann auch zur Beproben anderer Flüssigkeiten außer Milch auf Hemmstoffe (Antibiotika, Reinigungsmittel, etc.) genutzt werden!
Material: Delvo-Test SP-NT von DSM zu beziehen über Milku Tierhygiene, Bovenden-Lenglern.
Verschiedene Milchproben mit und ohne Antibiotikum.
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Verfahren:
1. Durchstechen Sie die Alufolie der Teströhrchen mit einem kleinen Loch und geben Sie 0,2 ml
Milch ins Probenröhrchen. Sie erhalten verschiedene Milchproben, von denen eine mit Antibiotika belastet ist. Beschriften Sie die Teströhrchen mit den Codes dieser Milchproben.
2. Inkubieren Sie die Ansätze bei 64 °C für 3 Stunden im Wasserbad oder im Heizblock.
3. Notieren (fotografieren) Sie den Testansatz vor und nach der Inkubation.
Interpretationshilfe: Wenn ein Umschlag des pH-Indikators Bromcresol von blau nach gelb stattfindet, dann konnte Geobacillus stearothermophilus wachsen und Säuren bilden; er wurde also
nicht durch Antibiotika gehemmt. Wenn sein Wachstum z.B. durch Antibiotika oder andere
Hemmstoffe (wie Reinigungsmittel, Detergenzien) gehemmt wurde, dann schlägt der Indikator
nicht um.
Der thermophile Testorganismus bietet einen wichtigen Vorteil für die Praxis: mesophile Verunreinigungen (z.B. Streptokokken der Haut) werden bei der Inkubationstemperatur inaktiviert. Daher werden lebensfähige Kontaminationen und somit falsch-positive Ergebnisse vermieden.
3.2 Gewürze, ihr Keimgehalt und ihre antibiotische Wirkung
Abbildung 3.2.1: Übersicht zu den Verfahrensschritten der mikrobiologischen Gewürz-Analyse.
Problem: Gewürze können nicht autoklaviert werden, weil durch dieses Hitzebehandlung die Geschmacksstoff eliminiert würden. Da die Gewürze vermutlich in einem ländlichen Gebiet gewachsen sind, kann ihre Oberfläche kontaminiert sein.
Methode:
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Sie haben verschiedene Gewürzproben (Pfeffer, Knoblauch, Thymian, Curry, Teebaumöl,
Zwiebel / Zwiebelextrakt, etc.)
Streichen Sie 100 µl E. coli bzw. Bacillus subtilis auf LB-Agarplatten mit dem
Drigalskispatel aus. (Im Fall von Thymian und Knoblauch auch auf Sabouraud-Agar)
Sektorieren und beschriften Sie diese Agarplatten entsprechend der Anzahl der zu
testenden Gewürze.
Geben Sie die Gewürze mit einer sterilen Pinzette oder einer sterilen Pipettenspitze auf
die gekennzeichneten Sektoren der Agarplatten.
Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 °C für 2-3 Tage.
Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtungen. Interpretieren Sie die Ergebnisse
anhand der Gramreaktion beider Testorganismen.
4 Chemische und mikrobiologische Wasserparameter
Aus Proben der Oberflächenwässer werden mit Elektroden die Temperatur, der pH-Wert, der
Sauerstoffgehalt und die Leitfähigkeit gemessen. Diese Werte werden in eine Tabelle eingetragen (siehe auch den Anhang). Es werden beprobt: die Donau, die Iller und die Weihung in der
Nähe der Roten Wand, dem Trinkwasserschutzgebiet der Stadt Ulm. Außerdem der Zu- und Auslauf des städtischen Klärwerks Steinhäule in Neu-Ulm. Im Klärwerk wird die Sauerstoffzehrung
im Belebtschlammbecken ermittelt, in dem eine Probe entnommen wird und im Plastikbecher sofort der O2-Verbrauch bestimmt wird.
Probennahme
Temp
(°C)
pH
O2
(mg/l)
Leitfähigkeit
(µS/cm)
MPN/ml
E. coli
Gesamt
KBE/ml
Coliforme
Donau
Iller
Weihung
KW Zulauf
Belebtbecken
NK-Becken
Trinkwasser
Demin
Das Leitfähigkeitsmessgerät wird mit 0-10 mM NaCl kalibiert. Es werden die NaCl-Konzentrationen gegen die gemessenen Leitfähigkeiten in einer Graphik aufgetragen. Die Messergebnisse
der Gewässerproben werden dann als NaCl-Equivalent angegeben.
Aufgaben:
1. Erstellen Sie mit NaCl-Lösungen aus jeweils 30 ml demin. Wasser eine Kalibierkurve zur Leitfähigkeit in µS/cm: 10 mM; 5 mM; 2,5 mM; 0,5 mM; 0,05 mM; 0,005 mM: Von jeder Messprobe liegen mehr als 20 ml im 50 ml-Platikbecher vor.
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2. Berechnen Sie die NaCl-Äquivalente in mM NaCl in den Gewässerproben!
3. Messen Sie auch das Trinkwasser der Universitäts-internen Hausleitung und weiterer Probestellen: Teichwasser, etc.
4. Komplettieren Sie mit allen Messergebnissen die obige Tabelle für Ihr Protokoll.
5. Da aus Zeitgründen keine Phosphatbestimmung durchgeführt werden kann, werden wir den
aktuellen Wert aus dem Klärwerk Steinhäule zur Grundlage einer Rechnung verwenden. Wir
werden die Produktion von Biomasse und die Sauerstoffzehrung in einem Gewässer abschätzen, in das eine bestimmten Phosphatmenge eingeleitet wird.
4.1 Gesamtkeimzahl
Die mikrobiologischen Proben werden mit sterilen 1L-Schottglas-Flaschen genommen und aufgearbeitet. Die Flaschen werden in einem Auslegerarm mit sterilen Gummistopfen verschlossen,
in denen eine Öse eingeschraubt ist. In diese Öse wird ein Neylonfaden mit Karabienerhaken
eingesetzt, so dass der Stopfen aus der Flasche gezogen werden kann, wenn die Flasche 20 cm
tief unter der Wasseroberfläche positioniert ist.. Proben dürfen wegen der veränderten Biologie
an der Wasseroberfläche (Kahmhaut!) nicht direkt aus diesem Gewässerbereich entnommen
werden.
Die Keimzahlen werden nach dem MPN-Verfahren ermittelt, wie in Versuch 4.2 beschrieben. Als
Referenzwerte können die Keimzahlen für Badewasser (Anhang 10.6) und aus der Trinkwasserverordnung (Versuchsvorbesprechung) verwendet werden.
Material und Methode
CASO-Agar ist ein komplexer Nährboden, der in Abhängigkeit seiner Natriumchloridkonzentration vielen Bakterien das Wachstum ermöglicht.
Typische Zusammensetzung des CASO-Agar (auch Tryptic Soy Agar, TSA): 15 g Caseinpepton, 5 g Sojamehlpepton, 5 g/L Natriumchlorid, pH 7,3 ± 0,2.
Gesamtkeimzahlen sollen aus folgenden Proben bestimmt werden:
Abwasser aus dem Nachklärbecken, Flusswasser, Teichwasser und Augendusche. Im Fall der
Augendusche werden mit einem Q-Tipp Proben von den Oberflächen des Duschkopfes und des
zuführenden Schlauches genommen und in 1 ml 0,9%-ige NaCl ausgewaschen.
Dazu werden 100 µl unverdünnte Probe sowie im Fall von Abwasser und Flusswasser aus einerVorverdünnug (Tabelle in 4.2) ausgestrichen. Die Agarplatten werden bei 30 °C bis zu drei
Tagen bebrühtet. Achtung : Schutz vor Austrocknung durch versiegeln der Agarplatten mit Parafilm.
Auswertung: Zusammen mit den Ergebnissen der MPN-Bestimmung (4.2) in einer Tabelle. Zur
Vorlage siehe Anhang 10.5.
4.2 Keimzahlbestimmung durch MPN
Das MPN-Verfahren (most probabale number, ISO 9308-2:2012) ist eine statistische Methode
zur Keimzahlbestimmung. Wir wenden diese Methode an zur Titerbestimmung von E. coli und
Coliformen Keimen in Oberflächenwässern. Dazu werden von einer Wasserprobe 1 ml, 0,1 ml
bzw. 0,01 ml Probe in jeweils 3 Röhrchen beimpft. Nach der Bebrütung wird auf folgende drei
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Parameter geprüft:
Trübung (= Wachstum)
Gasbildung (im Durhamröhrchen)
Fluoreszenz (nach Anregung bei 256 nm).
Material
✹ McCrady Tabelle zur Auswertung (siehe Anhang 10.10)
✹ Inkubator bei 36 °C
✹ 10 sterile Reagenzgläser gefüllt mit 10 ml MUG-Laurylsulaftmedium (4-Methylumbelliferyl-β-Dglucuronid) und jeweils versehen mit einem Durhamröhrchen. Wirkungsweise: Spaltung des
MUG durch die β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31) liefert das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon. Laurylsulfat (SDS) ist ein Detergenz, dass Wachstum der Begleitkeime hemmt. Ein unbeimpftes Röhrchen zur Kontrolle auf die Fluoreszenz zurückhalten!
Abbildung 4.2.1.: MUG-Reaktion der β-Glucuronidase (E. coli spezifisch)
Durchführung
Von einer Wasserprobe (Flusswasser; Klärwerksablauf in den Vorfluter, etc.) werden nach folgender Tabelle Vorverdünnung in 0,9 % NaCl-Lösung angelegt. Diese Vorverdünnungen richten
sich nach der Wetterlage an den Vortagen und dem Wasserstand der Gewässer. Aus den Verdünnungen werden dreimal 1 ml, 0,1 ml und 0,01 ml Probe in jeweils 10 ml MUG-Laurylsulfatmedium pipettiert. Damit erhalten Sie 3 x 3 Ansätze pro Probe. Achten Sie auf die korrekte Beschriftung der Teströhrchen: Probe, Verdünnungsstufe, Gruppen-Nummer.
Tabelle 4.2.1: Probenstellen und empfohlene Verdünnungen
1. Verdünnung
KW-Zulauf
10-6
Belebtbecken
10-6
Nachklärbecken unverd
Iller
unverd
Weihung
10-3
Donau
10-3
Uni-Teich
unverd
2. Verdünnung
10-9
10-9
10-3
10-3
10-6
10-6
10-3
Die beimpften Röhrchen und ein nicht beimpftes Röhrchen zur Kontrolle der Fluoreszenz
werden im Ständer stehend bei 36 ± 1 °C für 19 ± 1 h bebrütet. Anschließend werden diese
Röhrchen bei Tageslicht und bei Anregung der Fluoreszenz mit Licht der Wellenlänge 256 nm
begutachtet:
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Abbildung 4.2.2.: Links: nicht bebrütete Reagenzgläser mit MUG-Laurylsulfat und Durhamröhchen. Mitte und rechts Trübung (= Wachstum) und Gasbildung im Durhamröhrchen. Rechts:
Auswertung unter UV-Licht: die drei linken Röhrchen zeigen Fluoreszenz = sie enthalten E. coli,
die beiden nicht fluoreszierenden Röhrchen enthalten lediglich Coliforme Keime. Achtung: Zur
Kontrolle der Fluoreszenz wird ein nicht beimpftes Röhrchen mitgeführt.
Dabei könnten z.B. folgende Befunde erhalten werden, die mit 1 = bewachsen und 0 = unbewachsen klassifiziert werden. Sie erhalten also für jede Verdünnungsstufe bestehend aus drei
Röhrchen einen Code.
Abbildung 4.2.3: Auswertung im MPN-Verfahren. Der Code im dargestellten Schema ist 3,2,2.
Er steht laut McCrady Tabelle (siehe Anhang 10.10) für 21,0 Keime pro ml Probe.
Aufgabe: Bestimmen Sie über den Code die MPN der verschiedenen Gewässerproben. Dokumentieren Sie das Ergebniss durch Fotographien bei Tageslicht und nach Anregung der Fluoreszenz bei 254 nm.
Erstellen Sie mit den Ergebnissen aus 4.1 eine gemeinsamte Tabelle (Anhang 10.5), die von der
Tabelle oben abgeleitet ist. Diskutieren Sie den Anteil Coliformer Keime an der Gesamtkeimzahl!
4.3 Analyse Antibiotika-resistenter Keime im Abwasser
Achtung: bei diesem Experiment ist mikrobiologisch korrektes Arbeiten unbedingt erforderlich.
Abwasser kann humanpathogene Viren und pathogene Keime enthalten. Sie halten sich unbedingt an die Anweisungen!
In diesem Experiment analysieren Sie physiologisch sowie molekularbiologisch auf zwei Wegen
multiresistente Keime:
1. Das Wachstum multiresistenter Keime auf Agarplatten in Gegenwart von drei Antibiotika: Ampicillin, Chlormaphenicol und Tetracyclin. Diese drei Antibiotika stehen für drei
unterschiedliche Resistenzmechanismen. Außerdem wird ein Antibiogramm erstellt.
2. Molekularbiologischer Nachweis: Sie isolieren durch eine Hitzebehandlung chromosomale (und Plasmid-)DNA aus den Isolaten. Diese DNA dient als Vorlage für PCR-Reaktionen auf das Integronsystem.
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Abbildung 4.3.1: Experimentelle Verfahrensschritte der Antibiotika-Resistenzanalyse
Bereiten Sie CASO-Agarplatten vor. Nach dem Autoklavieren wird das Medium auf etwa 45
45 °C abgekühlt. Dann wird dem Agar 100 µg/ml Ampicillin, 10 µg/ml Tetracyclin und 30
µg/ml Chloramphenicol zugesetzt. Mischen Sie die Lösung gut. Fertige Agarplatten werden bei 4 °C im Kühlschrank (dunkel !) bis zum Gebrauch gelagert.
Streichen Sie jeweils 100 µl der Probe auf dieser Antibiotika-haltigen und einer AB-freien
CASO-Agarplatte aus. Inkubieren Sie diese Agarplatten bei 37 °C für 1 Tag.
Probenstellen: KW-Zulauf, Belebtschlamm, Nachklärbecken, Weihung
eine Gruppe pro Probenstelle: Verdünnungen der Tabelle 4.2.1 berücksichtigen!
auf die Antibiotika-freie Agarplatte wird ein Antibiotika-Testring aufgelegt (Antibiogramm)
Für die Antibiotika und ihre Konzentrationen siehe Tabelle unten (*)
inkubieren Sie diese Ansätze für 1-2 Tage bei 37 °C
(*) Drücken Sie die AB-haltigen Plättchen mit einer sterilen Pinzette leicht auf die Agaroberfläche.
Antibiotikatestringe Mast Diagnostica
Antibiotika
Kürzel
Beladung (µg)
Mastring M14 für Gram-negative
Ampicillin
AP
Cefalotin
CP
Colistinsulfat
CO
Gentamicin
GM
Streptomycin
S
Sulfatriad
ST
Tetracyclin
T
Cotrimoxazol
TS
10
5
25
10
10
200
25
25
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Auswertung: Messen Sie die Hemmhofdurchmesser und zählen Sie die Kolonien (= Resistenten) innerhalb dieser Hemmhöfe. Fotographieren Sie das Ergebnis!
2. Verfahren, molekularbiologischer Nachweis: Zentrifugieren Sie 0,5 ml Belebtschlamm (1
min, 5000 g) und waschen Sie den Niederschlag 5-mal in 1 ml PBS und dann in Wasser. Geben
Sie 100 µl Wasser zu diesem Niederschlag und inkubieren Sie diese Proben für 10 min bei 95 °C
(Hitzeaufschluss). Anschließed wird die Probe für 5 min auf Eis gekühlt und dann abzentrifugiert
(1 min, 13000 g). Der Überstand wird in ein frisches steriles Eppendorfgefäß überführt; er enthält
die chromosomale (und Plasmid-) DNA insbesondere aus Gram-negativen Bakterien. Diese
DNA wird mit der PCR auf das Integronsystem untersucht (Kapitel 4.4).
4.4 Nachweis des Integronsystems durch die PCR-Methode
Die Integrase, eine Rekombinase, ist die charakteristische Grundlage eines sehr erfolgreichen
mehrfachen Antibiotika-Resistenzmechanismus bei vielen Proteobakterien. Bei Nachweis des
kodierenden Gens kann also von einer mehrfachen Antibiotikaresistenz in der untersuchten Bakterienkultur ausgegangen werden. Im Anhang finden Sie detaillierte Hinweise zum kodierenden
Gen aus Pseudomonas aeruginosa, den Positionen der verwendeten Primer und der AmplifikatFragmente nach Resitriktionsverdau (10.1).
Material
DNA-Probe aus Versuch 4.3 (oder einer Kolonie aus dem Hemmhof, nach 10 min Vorinkubation
im PCR-Ansatz bei 95 °C)
Eppendorfzentrifuge und sterile Eppendorfgefäße
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702)
steriles Wasser
PCR-Gerät
PCR-Primer:
int1.F: 5´-GGGTCAAGGATCTGGATTTCG-3
int1.R: 5´-ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3´
Produktlänge: 484 Bp
PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl:
1-3 µl template DNA (aus Versuch 4.3)
10 µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702)
1 µl (10 pmol) Primer int.F
1 µl (10 pmol) Primer int.R
steriles Wasser ad 20 µl
PCR-Temperaturprogramm:
Denaturierung: 94,0 °C 1 min
35 Zyklen:
- 94,0 °C 1 min
- 54,0 °C 30 sec
- 72,0 °C 2,5 min
Komplettierung: 72 °C, 10 min
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4.4.1 Analyse der PCR-Produkte:
1.) 2%-ige Agarose in 1x TAE-Puffer; 10 V/cm.
Färbung: Ethidiumbromid-Alternative GelRed, wobei ein Volumen Probe und ein Volumen ladder jeweils mit einem Volumen 1:3000 im Wasser verdünnten GelRed vor dem Auftrag
auf das Agarosegel gemischt werden.
Aufgetragen werden 7 µl PCR-Amplifikat mit 6x loading dye.
2.) Da die PCR-Amplifikate des Integron-Gens aus sehr vielen Enterobakterien etwa 484 Bp lang
sind, kann die einfache Fragmentlängenbestimmung in der Agarosegelelektrophorese nicht für
eine sichere Identifizierung verwendet werden. Eine eindeutige Bestimmung wird erst möglich
durch Klonierung mit anschließender Nukleotidsequenzierung. Da dieser Ansatz für Reihenuntersuchungen teuer und aufwändig ist, wird ersatzweise das Restriktionsfragmente-Muster (RFLP)
nach Verdau mit Restrikionsenzymen ausgewertet. Die Längen aller Teilfragmente aus den einzelnen Verdauen addieren sich jeweils auf ca. 484 Bp.
Eine Voraussage zum Bandenmuster nach Behandlung mit verschiedenen Restriktionsenzymen
(siehe Anhang 10.1) kann mit dem im Internet frei verfügbaren Programm NEBcutter (http://
tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) und z.B. der Nukleotidsequenz (DQ219465, siehe Anhang
10.1) für die class I-Integrase aus Pseudomonas aeruginosa vorausgesagt werden.
4.4.2 Ansatz für den Restriktionsverdau des Integron-PCR-Amplifikats durch PvuII bzw.
BglI
10 µl des PCR-Ansatzes (mit Integron-Amplifikat)
7 µl steriles Reinstwasser
2 µl RE-Puffer
1 µl RE-Enzym
Gesamtvolumen des Ansatzes: 20 µl
Inkubation bei 37°C für 30-40 min.
Mischen Sie 10 µl dieses Verdaus mit 2 µl loading dye und tragen Sie diese Probe auf ein 2%iges Agarosegel auf. Tragen Sie zur Kontrolle vom unverdauten PCR-Produkt ebenfalls 5 µl auf.
Zur Längenbestimmung der Fragmente wird der 50 Bp-Marker (Anhang 10.8) in einer Spur aufgetragen. Entwickeln Sie das Agarosegel bei 120 V für ca. 30-45 min. Färben Sie das Agarosegel im Ethidiumbromidbad (Handschuh) und dokumentieren Sie mit der Fotodok das Ergebnis.
Auswertung: Das Ergebnis wird im Vergleich zu den vorausgesagten Fragmenten (siehe Anhang 10.1) interpretiert.
5 Phagennachweis
Phagen sind Viren der Bakterien. Sie nutzen als molekulare Parasiten den Stoffwechsel ihres
Wirtes, um neue Phagen zu produzieren. Bei der Phagenfreisetzung wird die Wirtszelle häufig lysiert (lysogener Zyklus), und die freigesetzten Phagenpartikel infizieren benachbarte Wirtszellen.
Durch diesen Vorgang entsteht ein Phagenhof = Plaque. Je nach Art des lytischen Phagen werden große oder kleinere Plaques gebildet. Hier werden Sie E.coli-Phagen aus dem Abwasser
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nachweisen, da gerade im Abwasser viele E. coli (Enterobakterium) vorkommen (siehe 4.2) und
damit auch viele seiner Phagen zu erwarten sind.
Abbildung 5.1: Übersicht zum Ablauf des Phagennachweises.
Material:
• Phagenwirtsstamm: E. coli DSM 613 auf LB Medium mit 10 mM Arabinose
• 4 Unterplatten aus LB-Agar + 10 mM Arabinose (aus 2.1) als Nähragar
• frisches Abwasser aus dem KW-Zulauf. Vorsicht: es können human pathogene Viren vorkommen!
• Sterilfilter: 0,45 µm Poren
• Verdünnungsreihe in drei kleinen Reagenzgläsern: jeweils 5 ml steriles 0,9%-iges NaCl
Zugabe von 50 µl Phagensuspension (= 10-2), mischen
• steriler Weichagar: 8 g Agar/Liter LB-Medium + 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 und 10 mM
Arabinose; davon 3 ml pro Probe im kleinen Reagenzglas bei 45-47 °C im Wasserbad
flüssighalten.
• Phagensuspension: jeweils unverdünntes Sterilfiltrat (0,45 µm), 10-2 bis 10-6 Verdünnung in steriler 0.9%-iger NaCl-Lösung.
Verfahren:
Lassen Sie die frische Abwasserprobe kurz stehen, um Grobbestandteile zu sedimentieren.
Der Überstand wird durch ein 0,45 µm Filter sterilfiltriert. Das Permeat wird in einem sterilen
1 ml Eppendorfreaktionsgefäß aufgefangen.
Aus dieser unverdünnten Phagensuspension wird in einer 10-2-Verdünnung (50 µl/5 ml) in
steriler 0,9%-iger NaCl Lösung Subkulturen angelegt. Daraus werden 0,1 ml zusammen mit
0,2 ml Wirtsbakterien (E. coli DSM 613) in die Weichagarröhrchen pipettiert. Diese Röhrchen
werden durch Rollen zwischen den Händen gut gemischt und dann sofort auf die Nähragarplatten gegossen. Durch leichtes Schwenken sollte der Weichagar möglichst gleichmäßig
auf deren Oberfläche verteilt werden.
Nach dem Erstarren des Weichagars werden die Agarplatten dann stehend im Brutschrank
bei 37 °C für 1-2 Tage inkubiert. Je nach Phagentiter in der unverdünnten Phagensuspension sollten in einigen der Verdünnungsstufen einzelne Plaques erkennbar sein, die sich in ih-
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21
rem Durchmesser unterscheiden. Es handelt sich um verschiedene E. coli-Phagen.
Beschreiben und photographieren Sie diese Agarplatten. Berechnen Sie aus den Plaques/
Agarplatte den E. coli-Phagentiter für jede Plaque-Morphologie in der unverdünnten Suspension.
6 Quantifizieren von Luftkeimen
In vielen Bereichen der Pharma- und Lebensmittelindustrie, Krankenhäuser, etc ist die Überwachung von Luftkeimen (Bakterien und Pilze) ein wichtiger Parameter der mikrobiologischen Qualitätskontrolle. Hier lernen Sie mit einem professionellen Gerät (Merck MAS-100) solche bakteriellen Luftkeime zu quantifizieren, genau wie es auch in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle
geschieht. Für den Nachweis von Bakterien verwenden wir CASO-Agar, für den Nachweis von
Pilzen wird Sabouraud-Agar eingelegt. Die Agarplatten sollten mit 25-28 ml Medium befüllt sein,
um die Luftführung nicht zu verfälschen.
Desinfizieren Sie den Lochdeckel innen und außen mit 80 %-igem Ethanol.
Setzen Sie eine Agarplatte (CASO oder Sabouraud) ein
Schließen Sie den Deckel mit der Lochblende
Befestigen Sie den Lufkeimsammler auf einem Stativ
Lassen Sie das Gerät 100 L Luft ansaugen
Entnehmen Sie die Agarplatte und verschließen Sie sie mit Parafilm
Inkubieren Sie die Agarplatte für 2-4 Tage bei 30 °C für Bakterien bzw. bei RT für Pilze.
Quantifizieren und fotographieren Sie täglich die Kolonien
Berechnen Sie die Keimzahl/m3 Luft unter zur Hilfenahme der Korrekturtabelle nach Feller
(siehe Anhang 10.9)
Der erhaltene Wert muss mit Faktor 10 multipliziert werden, um das Luftsammelvolumen
von 100 L Luft auf 1 m3 umzurechnen.
Bedienung des Merck MAS-100
22
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Abbildung 6.1: Luftkeimsammler im geschlossenen (links) und geöffneten Zustand (Mitte) sowie
ein Schema zur Luftführung (rechts).
Nach dem Starten des Gerätes leuchtet eine grüne LED-Lampe auf der Bedienfläche auf. Für
100 L benötigt der MAS-100 etwa eine Minute. Das Gerät ist Volumen- und nicht Zeit-gesteuert!
Achtung: Entfernen Sie sich um mindestens 2 m nach dem Start des air samplers vom Gerät, um eine Kontamination durch den Probennehmer zu vermeiden.
Wenn das Gerät ausgelaufen ist leuchtet eine rote LED-Lampe auf der Bedienfläche auf.
Aufgabe: Inkubieren Sie die Agarmedien für drei Tage bei 30 °C. Notieren und fotographieren
Sie täglich die Anzahl der sichtbaren Kolonien, ihre Größe und Koloniemorphologie. Erstellen
Sie zu diesen Werten eine Tabelle, in der die Anzahl der Kolonien, ihr Kolonietyp und ihre GramReaktion in der KOH-Methode (siehe unten) zusammengefasst sind.
Am dritten Tag führen Sie von representativen Kolonietypen eine schnelle Gram-Reaktion mit
10%-iger KOH durch. Dazu entnehmen Sie mit einer gelben Pipettenspitze eine Kolonie und verreiben diese in 20 µl 10 % KOH. Nach etwa 20-30 Sekunden versuchen Sie durch vorsichtiges
Anheben der Pipettenspitze (ca. 1 cm Höhe), ob "Fäden" gezogen werden können. Für den Fall,
dass ein farbloser Faden sichtbar ist, sind die Zellen Gram-negativ. Nutzen Sie von ihren Anreicherungen Referenzmaterial: E. coli als Gram-negatives, Bacillus als Gram-positives Beispiel.
Erklärung: Gram-neagtive Zellwände bestehen aus wenigen Mureinschichten, die unter diesen
chemischen Bedingungen rasch hydrolysiert werden. Dadurch wird die polymere genomische
DNA der Zellen freigesetzt, die als "Faden" zu sehen ist.
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7 Biologische Brennstoffzelle - Stromerzeugung mit Bakterien
Lässt sich Strom mit biologischen Zellen erzeugen? Wenn wir Strom als Elektronenfluß auffassen, dann sollte auch im biologischen Stoffwechsel ein solcher Elektronenfluß vorhanden sein,
der zur Stromerzeugung genutzt werden kann. Die Elektronen stammen dabei ursprünglich aus
dem Wasser (2 H2O = 4 [H] + O2), das in der Photosynthese (entspricht technisch einer "Photovoltaik-Anlage") zusammen mit Kohlendioxid zum reduzierten Zucker Glucose umgesetzt wird.
Grundsätzlich kann jede reduzierte Verbindung, auch viele Abfallstoffe, bei ihrer Oxidation Elektronen abgeben, die dann zur Stromerzeugung gewonnen werden können.
In diesem Versuch wird eine biologische Brennstoffzelle mit Lactobacillen (Joghurt-Kulturen) und
Lactose als Elektronen-Donor betrieben. Gemessen werden die Spannung (mV) und der Stromfluss (µA).
Material für die biologische Brennstoffzelle
✹ Plastikzelle mit Schrauben, Silikondichtungen und Elektroden (siehe Schema in Abbildung
7.2)
✹ Digital-Multimeter
✹ Kabel mit Krokodilklemmen
✹ Plastik-Petrischalen (wegen möglicher Leckage der Brennstoffzellen)
✹ Plastikspritzen: 10 - 20 ml mit Kanülen
✹ 100 µl Pipette (zum Pipettieren der Methylenblaulösung)
✹ Stoppuhren (für Messwerte)
✹ Falcon Röhrchen: 20 oder 50 ml Volumen, zum Auflösen der Lyophilisate
✹ Protonenausstauschermembran: Nafion (z.B. Nafion perfluorinated membrane 117, thickness
0,007; von Sigma-Aldrich (Bestell-Nr.: 274674-1EA)
✹ Vorlagen: Diagramm bzw. Tabelle für Messwerte
✹ Stammlösungen:
100 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7
4,08 Na2HPO4
3,29 g NaH2PO4 x 2 H2O
gelöst in 500 ml Wasser
folgende Lösungen im Na-Phosphatpuffer:
0,02 M
6,6 g/ 100 ml
K3Fe(CN)6
Lactose
0,5 M
1,8 g/10 ml
Methylenblau
5 mM
0,16 g/ 10 ml
✹ Lyophilisat von Hefen (oder von Joghurt Starterkulturen, Reformhaus, enthalten bereits Lactose!): im Falcon-Röhrchen werden 10 bzw. 50 mg Lyophilisat jeweils in 11 ml Na-PP gelöst und
mit 100 µl 5 mM Methylenblau (giftig!) als Redoxmediator gemischt.
Abbildung 7.1: Strukturformel des Elektronenfängers und Überträgers Methylenblau, einem
Phenothiazin. Links: reduzierte= farblose Form.
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Methode
Zusammenbau der biologischen Brennstoffzelle nach diesem Schema:
Abbildung 7.2: Schematischer Aufbau einer biologischen Brennstoffzelle
Abbildung 7.3: Funktionsweise einer Brennstoffzelle. Die Anodenkammer enthält die Testkeime.
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Biologische Brennstoffzelle
Zusammenbau der Brennstoffzelle nach der Schema-Zeichnung
Hinweis: es empfiehlt sich, eine Rückplatte mit den Schrauben auf die Laborbank
zu stellen und die weiteren Teilstücke auf diese Grundplatte aufzubauen. Fertige
Zelle in den Deckel einer Plastikpetrischale stellen.
handfest zusammenschrauben und in eine Plastikpetrischale stellen
Hinweis: es kann vorkommen, dass die Brennstoffzellen undicht sind. Kleine Leckagen haben keinen Einfluss auf die prinzipielle Funktionsweise der BZ.
Milchsäurebakterien in 10 ml 0,5 M Lactose in NaPP, pH 7 aufnehmen
Hinweis: es können die Bakterien auch in reinem Puffer ohne Lactose vorgelegt
werden. Der Zucker kann dann nachgegeben werden, um so den Reaktionsstart
besser verfolgen zu können.
Alternativ kann die Bakteriensuspension auch im Eisbad abgekühlt werden, um
den Stoffwechsel der Bakterien zu verlangsamen.
100 µl 5 mM Methylenblau in NaPP, pH 7 dazugeben
Achtung: Methylblau ist giftig. Eventuell Einmalhandschuhe anziehen. Das E°´
von Methylenblau (MB) beträgt etwa +100 mV. MB ist der Redoxmediator zum
Abgreifen der Elektronen im Stoffwechsel der Bakterienzellen.
eine Halbkammer mit ca. 10 ml dieser Suspension füllen (Anode)
Hinweis: es sollten etwa 11 ml zur Verfügung stehen. Notfalls mit etwas NaPP
auffüllen.
die andere Halbkammer mit ca. 10 ml 20 mM K3Fe(CN)6 in NaPP, pH 7
befüllen (Kathode)
Hinweis: auch hier etwa 11 ml zur Verfügung halten
Elektroden über Kabel mit Krokodilklemmen an Millivoltmeter anschließen
Achtung: Beim Anklemmen der Krokodilklemmen an das Elektrodengewebe
kann dieses ausfransen. Möglichst wenig mechanisch belasten!
das Millivoltmeter auf VDC stellen
Hinweis: Es kann auch hin und wieder auf µA umgestellt werden. Die Werte sind
instabil; sie fallen anfangs relativ rasch. Daher sollte der Anfangswert aufgetragen
werden.
erzeugte Spannung über die Zeit in ein Diagramm eintragen
Es können verschiedene Variationen dieses Grundexperimentes durchgeführt werden:
✹ unterschiedliche Zellmassen
✹ geänderte Konzentration des Methylenblaus
✹ anderer Elektronenüberträger
✹ gekühlter Ansatz = reduzierter Stoffwechsel
✹ Reihen- und Serienschaltung der Stacks
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8 Pilze - Nachweise und Bestimmungen
Eukaryotische Pilze spielen in der Natur eine wichtige Rolle beim Abbau organischer Verbindungen (Saprophyten), in der Synthese von biotechnologisch interessanten Produkten (Antibiotika,
Enzyme) und duch Bildung von Mykotoxinen (Aflatoxine, etc). Außerdem sind Pilze als Pathogene von Bedeutung für Menschen und Tiere. Unter diesen Gesichtspunkten beachtenswerte PilzGattungungen sind Candida, Aspergillus und Fusarium. Sie wachsen in einem weiten aW-Bereich, d.h. sie kommen an feuchten, aber auch vergleichsweise trockenen Standorten vor. "Trockenheit" kann z.B. chemisch durch hohe Konzentrationen an Zuckern erzeugt werden. Dies ist
ein Grund dafür, dass Marmelade "schimmelt" und kaum Bakterienwachstum aufweist.
Abbildung 8.1: Übersicht zu den Versuchen mit Pilzen
8.1 Candida albicans
Candida albicans ist ein einzelliger Pilz (Hefe), der fakultativ pathogen ist (S2) und bei 30-50 %
der Menschen opportunistisch auf Scheimhäuten z.B. im Mund und in der Vagina vorkommt. Diese Hefe kann die Candidose (Soor) verursachen. Es wird auch ein Zusammenhang mit Karies
diskutiert.
Nehmen Sie einen Abstrich mit dem Q-Tipp von Zähnen, Zahnfleischtaschen, Zunge, etc und
streichen Sie ihn auf Sabouraud-Nährboden (g/L) aus:
Caseinpepton (pankreatisch) 5, Fleischpepton (peptisch verdaut) 5, Glucose 20,0, pH 5,7 ± 0,2.
Für Agarplatten wird dem Medium 15 g/L zugesetzt. Agarplatten werden in 4 Sektoren eingeteilt,
um mehrere Hautpartien testen zu können. Bebrütet wird 1-2 Tage bei 37°C. Kleine weiße Kolonien sprechen für Candida. Im mikroskopischen Präparat sollten einzelne Hefezellen bzw. Diplokokken-ähnliche große Zellen (ca. 5-10 µm) erkennbar sein.
Als alternatives Medium kann Kartoffelextrakt-Glucose Agar (g/L) verwendet werden: Kartoffelextrat 4, Glucose 20, Agar 15, pH 5,6. Dieser Agar kann nach dem Autoklavieren und abkühlen
auf 50°C mit 1 ml steriler 10%-iger Milchsäure oder 1,4 ml Weinsäure pro 100 ml Medium auf pH
3,5 gesenkt werden. Durch diesen sauren pH-Wert wird bakterielles Wachstum unterdrückt.
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Nachweis durch PCR: Es wird maximal die Hälfte einer Kolonien mit einer sterilen gelben Pipettenspitze entnommen und direkt in den PCR-Ansatz eingerührt/pipettiert. Der Ansatz wird 10 min
bei 95 °C inkubiert. Anschließend werden die Primer und die Dream-Taq Polymerase zugegeben
sowie die PCR-Zyklen gestartet.
Im 18S rRNA Gen der Eukaryoten können mit den folgenden Primern Amplifikate bei Pilzen, nicht
aber beim Menschen, Maus oder Bakterien erhalten werden:
FF1: 5′-GTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3′
FR1: 5′-CTCTCAATCTGTCAATCCTTATT-3′
Die Länge des Amplifikats über die V4 und V5 variablen Regionen ist 630 Bp.
Andere Primer sind gegen die ITS Bereiche (internal transcribed spacer) im Genom dieser Pilze
gerichtet. Dieser Bereich überspannt die 5.8S rRNA und wird als nützlich für die Identifizierung
von Pilzen auf der Spezies-Ebene angesehen. Sequenzinformationen für Candida gibt es unter:
http://www.candidagenome.org
Abbildung 8.1 : Organisation des Genclusters für die Kodierung der eukaryotischen ribosomalen
Pilz-RNA. Die ITS (intergenic transcribed spacers) oder das 18S rRNA Gen dienen der PrimerHybridisierung. ETS = external transcribed spaces. In der Regel existieren 100-200 solcher Cluster-Kopien in einem Pilz-Genom.
PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl:
template DNA: ≤ 50 % einer Candida-Kolonie
10 µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702)
8 µl steriles Wasser
Inkubation für 15 min bei 95 °C,
dann:
1 µl (10 pmol) FF1 primer
1 µl (10 pmol) FR1 primer
PCR-Temperaturprogramm:
anfängliche Denaturierung: 95°C für 3 min, dann
35 Zyklen:
- 94°C
1 min
- 52°C
60 sec
- 72°C
2 min
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Komplettierung/Elongation: 72 °C, 10 min
Analyse der PCR-Produkte:
2%-ige Agarose in 1x TAE-Puffer; 10 V/cm.
Färbung: Ethidiumbromidbad (1 µg EtBr/ml TAE-Puffer)
Aufgetragen werden 7 µl PCR-Amplifikat mit 6x Auftragepuffer
Zur Kontrolle wird Saccharomyces cerevisiae ebenfalls in einer Kolonie-PCR unter Verwendung
dieser Primer untersucht.
Aufgabe: Fassen Sie insbesondere die Ergebnisse zur eigenen Candida-Anreicherung zusammen: (1.) Erscheinungsform auf Agarplatten, (2.) Größe der Zellen und ihre Form im mikroskopischen Präparat (3.) Ergebnisse der PCR auf Hefen.
8.2 Isolierung von Pilzen aus natürlichen Standorten
8.2.1 Lebensmittel: Saccharomyces cerevisiae, die Bäckerhefe, wird aus einem Lyophilisat aktiviert und auf Sabouraud-Agarplatte ausgestrichen. Außerdem werden diese Zellen wie Candida
aufgeschlossen (Kapitel 8.1), DNA isoliert und anschließend eine PCR durchgeführt mit dem
Pilz-spezifischen Primern.
Ein wenig Pilzkultur von Lebensmitteln (z.B. Käse wie Brie/Camembert und Roquefort) wird auf
eine Sabouraud-Agarplatte ausgebracht und für 3-5 Tage bei RT inkubiert. Achtung: die Agarplatte wird mit dem Boden nach unten inkubiert! Diese Anreicherung hat den Vorteil, dass keine
pathogenen Pilze angezüchtet werden. Vom auswachsenden Mycel wird ein mikroskopisches
Präparat angelegt (siehe unten). Auf Camembert ist Penicillium camemberti und auf Roquefort
der Blauschimmel Penicillium roqueforti zu erwarten.
8.2.2 Mikroskopische Präparate vom Pilzmyzel
Pilzmycelien zeichnen sich häufig durch eine hydrophobe Oberfläche aus, wodurch es schweirig
wird, ein mikroskopisches Präparat in der sonst gewohnten wässerigen Umgebung anzufertigen.
Außerdem wird die Anordnung der Conidiosporen durch mechanische Belastung sehr schnell
zerstört. Conidiosporen sind wichtige Bestimmungsmerkmale für die Bestimmung der Pilzart.
Verfahren: Mit einem durchsichtigen Tesaband wird vorsichtig auf die Oberfläche einer Pilzkolonie gedrückt. Dieses Tesaband wird dann auf einen Objektträger geklebt, auf dem 50 µl Lactophenolbau (gebrauchsfertige Lösung, Roth 3097.1) aufgetragen worden sind. Bei 40-facher
Vergrößerung sind dann die Pilzstrukturen blau angefärbt.
Aufgabe: Legen Sie ein wässeriges mikroskopisches Präparat von Saccheromyces cerevisiae
an (z.B. aus dem Brennstoffzellen-Versuch 7). Messen Sie die Zellen mit dem Okularmikrometer
aus und notieren Sie die Zellgrößen im Vergleich zu E. coli und Bacillus subtilis. Messen Sie
auch den Zelldurchmesser der Fadenpilze (von Käsepräparaten) und deren Conidiosporen.
8.2.3 Tierbürsten: Auf eine Sabouraud-Agarplatte wird ein Abklatsch von einer Pferdebürste
oder einer Pflegebürste des privaten Tieres (Hund, etc) abgedrückt. Die Deckel der Agarplatten
werden mit Parafilm verschlossen. Auch diese Agarplatten werden für 3-5 Tage bei RT bzw. bei
30 °C inkubiert.
Aufgabe: Ein Foto der Agarplatte von oben und von unten belegt die Vielfalt der Pilze. Im mikroskopischen Präparat könnte über Conidiosporen eine Identifzierung der Pilzarten erfolgen.
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9 Exkursionen
Wir werden zwei Exkursionen durchführen, eine zu Beginn des Praktikums ins städtische Klärwerk und zu den Probestellen an den Gewässern sowie eine weitere zur Landeswasserversorgung (LWV) in Langenau. Zu beiden Exkursionen wird jeweils mindestens eine DIN A4 Seite an
Daten protokolliert.
10 Anhang
10.1 Pseudomonas aeruginosa Integrase-Gen
(1014 bp, 61% GC)
Zugriffsnummer in der NCBI-Datenbank: U12338
1 atgaaaaccg ccactgcgcc gttaccaccg ctgcgttcgg tcaaggttct ggaccagttg
61 cgtgagcgca tacgctactt gcattacagt ttacgaaccg aacaggctta tgtcaactgg
121 gttcgtgcct tcatccgttt ccacggtgtg cgtcacccgg caaccttggg cagcagcgaa
181 gtcgaggcat ttctgtcctg gctggcgaac gagcgcaagg tttcggtctc cacgcatcgt
241 caggcattgg cggccttgct gttcttctac ggcaaggtgc tgtgcacgga tctgccctgg
301 cttcaggaga tcggaagacc tcggccgtcg cggcgcttgc cggtggtgct gaccccggat
361 gaagtggttc gcatcctcgg ttttctggaa ggcgagcatc gtttgttcgc ccagcttctg
421 tatggaacgg gcatgcggat cagtgagggt ttgcaactgc gggtcaagga tctggatttc
481 gatcacggca cgatcatcgt gcgggagggc aagggctcca aggatcgggc cttgatgtta
541 cccgagagct tggcacccac gctgcgcgag cagctgtcgc gtgcacgggc atggtggctg
601 aaggaccagg ccgagggccg cagcggcgtt gcgcttcccg acgcccttga gcggaagtat
661 ccgcgcgccg ggcattcctg gccgtggttc tgggtttttg cgcagcacac gcattcgacc
721 gatccacgga gcggtgtcgt gcgtcgccat cacatgtatg accagacctt tcagcgcgcc
781 ttcaaacgtg ccgtagaaca agcaggcatc acgaagcccg ccacaccgca caccctccgc
841 cactcgttcg cgacggcctt gctccgcagc ggttacgaca ttcgaaccgt gcaggatctg
901 ctcggccatt ccgacgtctc tacgacgatg atttacacgc atgtgctgaa agttggcggt
961 gccggagtgc gctcaccgct tgatgcgctg ccgcccctca ctagtgagag gtag
Primer intI.F : 5´-GGGTCAAGGATCTGGATTTCG-3´
Primer intI.R : 5´- ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3` = 3´-cgacgatg atttacacgc atgt-5´
PCR Amplifikat-Länge: 484 bp (63% GC)
Schnitte von Restriktionsendonukleasen im PCR Amplifikat für die RFLP :
Restriktionsendonuklease
PvuII
BglI
Schnitt bei
(Bp)
113
163
Voraussagen zu Mustern von Restriktionsverdauen des Integrase-Amplifikates
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Abbildung: Restriktionsverdau des Integrasegen-Amplifikates durch die PCR mit den Int-Primern. Auftrennung des Verdaus im 2 %-igen Agarosegel. Links: PvuII Verdau; rechts mit BglI
Verdau.
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10.2 Testunterlagen zu Slidex Staph Plus
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10.3 Übersicht zu Experimenten
Die Zahlen in Klammern verweisen auf die Kapitel!
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10.4 Tabelle chemische Wasserparameter
Parameter
Temperatur
(°C)
O2
(mg/l)
Leitfähigkeit
(µS/cm)
pH
Phosphat
(µM)
Probenahme
Iller
Weihung
Donau
Klärwerk
10.5 Tabelle mikrobiologischer Wasserparameter
Parameter
Gesamtkeime (ml)
Coliforme
(MPN/ml)
E. coli
(MPN/ml)
Probenahme
Iller
Weihung
Donau
Klärwerk,
Auslauf
10.6 Tabellen Badewasserqualitäten und mikrobiologische Grenzwerte
für Trinkwasser
Trinkwasser (Probevolumen: 100 ml)
Gesamtkeime: 100 cfu/ml
E. coli, Coliforme und Enterokokken dürfen in 100 ml nicht nachweisbar sein.
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10.7 Antibiotika
Tabelle: Wirkstofftest auf das Staphylococcus-Isolat
Wirkstoff
CAS-Nr.
Amoxicillin
26787-78-0
(Amoxicillin +)
Clavulansäure
58001-44-8
Cephalexin
15686-71-2
Ciprofloxacin
85721-33-1
Doxycyclin
564-25-0
Norfloxacin
70458-96-7
Ofloxacin
82419-36-1
Roxithromycin
80214-83-1
Sulfamethoxazol
723-46-6
Strukturformel
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10.8 Standards für Agarosegelelektrophoresen
:
Abbildung: Längenstandards für Agarosegelelektrophoresen, Links: 1 kB Ladder; rechts: 50
Bp-Ladder
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10.9 Feller Tabelle
Statistische Umrechnung der gezählten Kolonien pro Agarplatte (r) in die wahrscheinliche Keimbelastung (Pr) der Luft.
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10.10 McCrady Tabelle
Statistische Auswertung von Wasserproben nach der MPN-Methode.
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