Reverse Phase-Proteinarrays in der Krebsforschung

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WISSENSCHAFT · SPECIAL: BIOCHIPS IN DER KREBSFORSCHUNG
Signaltransduktion
Reverse Phase-Proteinarrays
in der Krebsforschung
ULRIKE KORF 1 , CHRISTIAN LÖBKE 1 , FLORIAN HALLER 2 , ANNEMARIE POUSTKA 1 ,
HOLGER SÜLTMANN 1 ,
1 ABTEILUNG FÜR MOLEKUL ARE GENOMANALYSE, DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM, HEIDELBERG
2 INSTITUT FÜR PATHOLOGIE, UNIVERSITÄT GÖTTINGEN
Wegen ihres hohen Probendurchsatzes und ihrer großen Empfindlichkeit
entwickeln sich Proteinarrays immer mehr zur Technologie der Wahl bei
der quantitativen Messung komplexer biologischer Prozesse in der Krebsforschung.
Aktuelle Herausforderungen der
Tumorbiochemie
ó Eine große Herausforderung für die Aufklärung der Mechanismen von Tumorentstehung und -progression liegt in der Messung
der zentralen Schlüsselproteine in krebsre-
levanten Signaltransduktionswegen. Die
exakte Bestimmung der Proteinaktivität liefert wertvolle Erkenntnisse über die biologischen Prozesse in Krebserkrankungen sowie
Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Diagnose- und Therapiestrategien.
In den vergangenen Jahren wurden molekulare Vorgänge in menschlichen Tumoren
überwiegend auf der Ebene der Genexpression (z. B. mithilfe von DNA-Mikroarrays)
untersucht. Jedoch korrelieren mRNA- und
Proteinmengen oftmals nicht miteinander.
Zudem ergibt sich aus der Analyse von
mRNA-Transkripten kein direkter Hinweis
auf den Aktivierungsstatus von Proteinen,
die z. B. entscheidende Schritte der Signaltransduktion regulieren. Obwohl Proteine in
vielfältiger Weise an zellulären Regulationsprozessen beteiligt sind, sind die verfügbaren Methoden zur quantitativen Bestimmung
von Proteinen und Proteinaktivierungen im
hohen Durchsatz bislang nicht zufrieden stellend. Dies liegt vor allem an den gegenwärtig
hinsichtlich Durchsatz und Empfindlichkeit
unzureichend etablierten proteinchemischen
Methoden.
Methoden der quantitativen Proteinbestimmung
˚ Abb. 1: Reverse Phase-Proteinarrays. A, Tumorproben werden mit einer Tropfengröße von 1 nl abgegeben und regelmäßig auf einem Nitrozellulose-Träger angeordnet. Jede Probe ist adressierbar durch
ihre Koordinaten auf dem Array. Es lässt sich eine große Anzahl identischer Arrays parallel produzieren.
B, Der Nachweis eines bestimmten Proteins oder einer Phosphorylierungsstelle erfolgt mithilfe eines
spezifischen Antikörpers, der in einem zweiten Inkubationsschritt mithilfe eines farbstoffmarkierten
Antikörpers sichtbar gemacht wird. Zum Auslesen der Arrays wird ein geeignetes Instrument (Scanner)
eingesetzt, das den Farbstoff detektieren kann. C, Anordnung der Proben auf den Reverse Phase-Proteinarrays. Eine Verdünnungsreihe dient der Kalibrierung, um den Zusammenhang zwischen Probenmenge und Signalstärke zu ermitteln. Jede Probe wird in einer einzigen Verdünnungsstufe, aber mit vier
technischen Replikaten gespottet. Daraus lässt sich für jede Probe die relative Menge des untersuchten Proteins berechnen.
Zur quantitativen Bestimmung von Proteinen
wird sehr häufig der Western Blot als ein Gelbasierendes Verfahren eingesetzt. Dieser
Ansatz ist einfach durchzuführen und die
experimentellen Voraussetzungen sind in
jedem Labor zu finden. Dennoch weist die
Methode einige entscheidende Nachteile auf:
So führen nicht-homogene Prozesse bei der
Proteintrennung im SDS-Gel sowie beim
elektrophoretischen Transfer zu einer hohen
Standardabweichung (20–30 %). Als Detektionsmethode wird in der Regel die Chemolumineszenz eingesetzt, deren Signale zeitabhängig sind und nur einen geringen linearen Bereich aufweisen. Aufgrund der hohen
Standardabweichung erfordern Western Blotbasierende Methoden eine umfangreiche Normalisierung. Auch massenspektrometrische
Verfahren wurden – u. a. in Verbindung mit
2-D-Gelelektrophorese – an die Erfordernisse
einer quantitativen Bestimmung von Proteinen und Proteinmodifizierungen angepasst.
Jedoch ist diese Methode in erster Linie zum
Screening und nicht für die quantitative
Untersuchung bekannter Signalwege geeigBIOspektrum | 07.07 | 13. Jahrgang
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net. Schließlich werden Antikörper-basierende Methoden, u. a. ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay), in vielen Variationen
eingesetzt. Diese Technik ist aufgrund der
oftmals beträchtlichen Standardabweichung
nicht kompatibel mit den Anforderungen an
quantitative Proteinbestimmungen im Hochdurchsatz. Allen diesen Methoden gemeinsam ist außerdem ein hoher Verbrauch biologischen Materials und ein relativ niedriger
Durchsatz.
In jüngerer Zeit wurde die Technologie der
Proteinarrays als wichtige alternative Methode zur Quantifizierung von Proteinen entwickelt. Proteinarrays bestehen aus winzigen
Proben, die auf einem Träger angeordnet werden (Abb. 1). Die Probenabgabe erfolgt dabei
sehr präzise mithilfe eines Laborroboters.
Aufgrund der geringen Spotgröße können bis
zu 500 verschiedene Proben auf einem Träger
in der Größe eines Standard-Objektträgers
aufgebracht werden. Ausgehend von Probenvolumina von 10 μl können 50–200 identische Arrays produziert werden. Jeder Array
wird mit einem Antikörper inkubiert, der spezifisch gegen das Protein von Interesse (oder
dessen Modifizierung) gerichtet ist. Auf diese Weise lassen sich mit einer einzigen Produktionscharge detaillierte Informationen
über die Mengen von bis zu 200 Zielproteinen
gewinnen. Zudem kann auch eine absolute
Quantifizierung von Proteinen durchgeführt
werden. Protein-Mikroarrays besitzen daher
ein enormes Potenzial für die Analyse von
Proteinprofilen (Tab. 1).
Tab. 1: Vorteile von Proteinarrays
• geringer Probenverbrauch
• Parallelisierung möglich
• hohe Sensitivität
• große Probenkapazität
Die Idee, das vollständige Proteom eines
Tumors als Mikrospot zu immobilisieren und
die Expression eines bestimmten Proteins
mithilfe von Antikörpern nachzuweisen, wurde 2001 von Paweletz et al. vorgestellt[1]. Im
Gegensatz zu den forward phase-ProteinMikroarrays wird in dem reverse phase-Ansatz
nicht eine Messsonde (z. B. Antikörper) immobilisiert, sondern die zu untersuchende komplexe Probe selbst. Mithilfe von spezifischen
Antikörpern können Proteine in Femtogramm-Mengen nachgewiesen werden. Diese
Empfindlichkeit ist ausreichend, um zelluläre Regulationsmechanismen zu quantifizieBIOspektrum | 07.07 | 13. Jahrgang
ren. Insbesondere die reverse phase-Proteinmikroarrays (RPPA) haben sich als ideale Strategie für die Hochdurchsatz-Analyse von Proteinprofilen erwiesen, da sie wegen ihrer
hohen Sensitivität und ihres geringen Probenverbrauchs alle Bedingungen für die quantitative Bestimmung von Proteinen erfüllen.
Sie eigenen sich für die Untersuchung sowohl
von zellulären Lysaten als auch von medizinischem Untersuchungsmaterial.
Proteinmikroarrays: technische
Aspekte, Probenvorbereitung und
Normalisierung
Technische Parameter wie Probenvorbereitung und Normalisierung beeinflussen entscheidend die Qualität der experimentellen
Daten von Proteinarrays. In einem ersten
Schritt der Technologieentwicklung wurden
daher umfangreiche Tests zum Aufschluss
der Zellen und zur Isolierung des Probenmaterials durchgeführt und die Bedingungen für
die Probenabgabe optimiert[2].
Anschließend wurden verschiedene Ansätze zur Normalisierung der Daten für eine
nachfolgende quantitative Analyse getestet:
Die Normalisierung kann zum einen anhand
der Zellzahl, zum anderen durch Bestimmung
der Gesamtproteinkonzentration erfolgen.
Letztere Möglichkeit ist kompatibel mit einer
Quantifizierung nach dem Drucken der
Arrays und kann daher für die Korrektur von
Fehlern bei der Lyse wie auch beim Drucken
der Arrays herangezogen werden. Um eine
Normalisierung über die pro Spot tatsächlich
vorhandene Proteinmenge durchführen zu
können, haben wir einen zusätzlichen Normalisierungsschritt eingeführt. Dieser beruht
auf einer Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAST Green FCF auf einem Array
jeder Produktionscharge. Anfänglich wurden
die Proben als Duplikate in einer 8-stufigen
Verdünnungsreihe gespottet. Die lineare Korrelation zwischen Probenmenge und Signalintensität wurde anschließend zur Bestimmung der Proteinmenge herangezogen. Die
hohe Anzahl von Spots begrenzte jedoch die
Zahl der Proben pro Mikroarray. Daher
drucken wir jede Probe in nur einer einzigen Konzentration, jedoch als Quadruplikat
(Abb. 1). Zur Kalibrierung dient eine Verdünnungsreihe eines Proteinlysats. Insgesamt können so mit einem einzigen Mikroarray bis zu 500 verschiedene Proben untersucht werden.
Die Spezifität der Antikörper muss vor der
Routineanwendung in einer rigorosen Qualitätskontrolle untersucht werden. Diese wird
in der Regel mithilfe eines Western Blots
durchgeführt. Sofern die korrekte Größe des
Zielproteins in einer singulären Bande detektiert wird, ist der Antikörper spezifisch und
kann für alle weiteren Experimente auf Proteinarrays eingesetzt werden. Nach unseren
Erfahrungen erfüllen jedoch nur 20–30 % aller
getesteten Antikörper diese Qualitätskontrollen nicht und müssen verworfen werden.
Informationen über die Verwendbarkeit von
Antikörpern für Mikroarray-Applikationen
finden mehr und mehr Eingang in die Publikationen und reduzieren so den Aufwand der
Spezifitätsbestimmung für jede einzelne
Arbeitsgruppe.
Anwendungen von RPPAs in der
Tumorforschung
Proteinmikroarrays und insbesondere der
RPPA-Ansatz haben sich als wertvolle experimentelle Plattform für die Untersuchung
von dynamischen Ereignissen wie der Regulation der Genexpression durch transiente
Phosphorylierung von Proteinen bei der Signaltransduktion erwiesen. Die Aktivierung
bestimmter Proteinkinasen in Tumoren oder
Tumorzellen – ein Kennzeichen der Tumorprogression – lässt sich mithilfe von Proteinarrays in hohem Durchsatz und bei geringem
Zeitaufwand untersuchen. In der Regel enthält das Material einer Tumorbiopsie genug
Zellen für eine umfassende histologische Charakterisierung und die Untersuchung mithilfe von Proteinarrays.
Zunächst wurden RPPAs als experimenteller Ansatz für die Analyse von Prostata-Biopsieproben getestet[1]. Dabei wurde eine im
Vergleich zu Normalgewebe verstärkte Phosphorylierung von phospho-AKT (PKB, v-aktmurine thymoma oncogene homolog 1) und
phospho-ERK1/2 (extracellular signal regulated kinase) festgestellt, die Aktivierung beider
Proteine spielt eine Rolle bei der Umgehung
der Apoptose und der Zellzyklusprogession.
Eine verstärkte Phosphorylierung von AKT
deutet auf eine Unterdrückung der Apoptose
hin, was mit der malignen Progression des
Tumors korreliert.
Quantitative Proteinarrays mit Detektion
im Nah-Infrarot-Bereich (infrared-based protein detection arrays with quantitative readout)
wurden von uns für die Untersuchung von
Biopsieproben von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) eingesetzt[3]. Tumoren
erleiden häufig einen Verlust chromosomaler Bereiche: Bei 70 % der im Magen lokalisierten GISTs wird ein Verlust von 14q beobachtet. Eines der in diesem Bereich kodier-
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˚ Abb. 2: Analyse von AKT und phospho-AKT in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) mit RPPA. A, Tumoren erleiden häufig genomische Veränderungen, z. B. den Verlust von chromosomalen Abschnitten wie von 14q. Neben anderen Genen befindet sich auf diesem chromosomalen Abschnitt auch das
Gen für die Proteinkinase AKT1. B, Vergleichende Analyse von Tumoren mit einem Verlust von 14q mit solchen, die nicht über diese chromosomale Aberration verfügen. Eine verminderte Expression von AKT1 konnte auf der mRNA- wie auch auf der Proteinebene nachgewiesen werden. Jedoch ist diese Veränderung ohne großen Einfluss auf die phospho-AKT1 Konzentration in den Tumoren.
ten Proteine ist die Proteinkinase AKT1, die
als möglicher diagnostischer Faktor für die
Beurteilung des metastatischen Potenzials
von Tumoren bekannt ist. Mithilfe von quantitativer PCR konnten wir nachweisen, dass in
Tumoren mit 14q-Verlust tatsächlich eine
reduzierte Menge der AKT1-mRNA vorliegt
(Abb. 2). Anschließend setzten wir die iPAQTechnologie ein, um zu klären, wie sich der
Verlust einer Kopie des AKT1-Gens auf das
Proteom in den Tumoren auswirkt. Wir beobachteten eine geringere Expression von AKT1,
bei der allerdings interessanterweise der Aktivierungszustand des Proteins nahezu unverändert blieb. Dies kann entweder mit einer
verstärkten Phosphorylierung von AKT1 oder
aber mit einer verstärkten Expression des
verwandten Proteins AKT2 erklärt werden.
Auf diesem Weg hält die Tumorzelle offenbar
die Funktion des für sie überlebenswichtigen
zellulären Netzwerks aufrecht.
Gastrointestinale Stromatumore mit Verlust einer Kopie des Chromosoms 9p zeichnen sich durch höhere Malignität und eine
höhere Mitosenzahl aus. Dies deutet auf ein
starkes Ungleichgewicht zwischen Zellzyklusprogression und Apoptose hin. Mit
Proteinarrays konnten wir zeigen, dass
Tumoren mit 9p-Verlust – im Vergleich zu
solchen mit diploidem Chromosom 9p-Status – eine verstärkte Phosphorylierung des
Tumorproteins RB an den Serinresten 807
und 811 aufweisen, die zudem eindeutig mit
einer verstärkten Expression der Zellzykluskinase CDK2 korreliert. Beide Proteine
wirken entscheidend bei der Tumorprogression mit.
Die zuverlässige Analyse des Tumor-Proteoms führt zu einem besseren Verständnis der
molekularen Mechanismen, die es der Tumorzelle ermöglichen zu proliferieren und der
Apoptose zu entgehen. Die Hoffnung ist,
durch Aufklärung des zeitlichen und räumlichen Zusammenspiels der deregulierten Prozesse individuelle Therapien wählen zu können, die optimal auf den Tumor des betroffenen Patienten abgestimmt sind. Proteinarrays und insbesondere der RPPA-Ansatz stellen hierfür eine geeignete experimentelle
Plattform dar.
Danksagung
Die Autoren danken dem BMBF für die Förderung dieser Arbeiten im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) sowie
Prof. Laszló Füzesi (Universität Göttingen).
ó
Literatur
[1] Paweletz, C. P., Charboneau, L., Bichsel, V. E., Simone, N.
L., Chen, T., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R., Roth, M. J.,
Petricoin III, E. F., Liotta, L. A. (2001): Reverse phase protein
microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.
Oncogene 20: 1981–1989.
[2] Loebke, C., Sueltmann, H., Schmidt, C., Henjes, F.,
Wiemann, S., Poustka, A., Korf, U. (2007): Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics 7:
558–564.
[3] Haller, F., Loebke, C., Ruschhaupt, M., Schulten, H. J.,
Gunawan, B., Sueltmann, H., Korf, U., Füzesi, L.: Loss of chromosome 9p contributes to inactivation of the retinoblastoma
protein RB via hyperphosphorylation on Serine 807 and
Serine 811 in gastrointestinal stromal tumors (GISTs), enabling increased E2F1-dependent gene transcription and amplified cell proliferation. Eingereicht.
Korrespondenzadresse:
Dr. Ulrike Korf
Abteilung Molekulare Genomanalyse
Deutsches Krebsforschungszentrum
Im Neuenheimer Feld 580
D-69120 Heidelberg
Tel.: 06221-42 4765
Fax: 06221-42 3454
[email protected]
AUTOREN
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Die Abteilung Molekulare Genomanalyse am DKFZ
in Heidelberg, geleitet von Prof. Annemarie Poustka, entwickelt neue Arbeitstechniken auf den Gebieten der Genom-, Transkriptom- und Proteomforschung. Für die Hochdurchsatzanalyse von Tumoren und anderen Proben hat Dr. Ulrike Korf (1) die
Proteinarray-Technologie etabliert. In Zusammenarbeit mit PD Dr. Holger Sültmann (mRNA-Expressions-Analysen) und dem Institut für Pathologie an
der Universität Göttingen wurden quantitative
Untersuchungen von gastrointestinalen Stromatumoren durchgeführt. Christian Löbke (2) ist Doktorand in der Abteilung Molekulare Genomanalyse
und Dr. Florian Haller als Pathologe an der Universität Göttingen tätig.
BIOspektrum | 07.07 | 13. Jahrgang