Antibody-Drug Conjugates: over-expression and - ETH E

Diss. ETH No. 19685
Antibody-Drug Conjugates: over-expression and site-specific
chemical modification of immunoglobulins
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Kathrin Zuberbühler
MSc Pharmaceutical Sciences, ETH
born on July 11, 1981
citizen of Schwellbrunn (AR)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Karl-Heinz Altmann, co-examiner
2011
1
Summaries
1.1
Summary
A major drawback of conventional anticancer therapeutics is presented by their poor
selectivity between tumor cells and healthy tissue, which results in a high drug-related
toxicity that limits the dosage that can be given to a patient. A promising avenue to
overcome this problem consists in the targeted delivery of bioactive agents (e.g., drugs,
radionuclides, cytokines) to the neovasculature of tumors. The formation of new blood
vessels is a crucial step for cancer progression and the modified vasculature expresses
specific
antigens
which
are
available
for
antibody-based
pharmacodelivery
applications.
In this work, we focused on vascular-targeting antibody-drug conjugates, a therapeutic
approach designed to deliver cytotoxic agents to the tumor site for cancer therapy. One
basic requirement for the development of such antibody-drug conjugates is the
availability of an ample amount of a high-affinity antibody targeting the tumor blood
vessels. Hence, in the first part of this thesis, we describe a FACS-based selection
procedure that can be used for the identification of high-producing cells, out of a
population of stably-transfected cells. This fluorescence activated cell sorting method
was exemplified using the clinical-stage human monoclonal antibody L19. This new
screening procedure reliably yielded high-expression clones and homogeneous protein
preparations. In addition, we developed a reformatting tool for scFv antibody
fragments derived from synthetic antibody libraries to create fully human IgG
antibodies.
In the second part of this thesis, we investigated chemical modification of the glycan
moiety of immunoglobulins for the efficient preparation of well-defined IgG-drug
conjugates. The analysis of the oligosaccharide structures of IgG(F8), a human antibody
specific to the alternatively-spliced EDA domain of fibronectin, indicated the
predominant presence of a fucosylated core glycan. Following a periodate-mediated
oxidation, this fucose moiety is particularly suitable for the selective generation of a
hydrazone-linked conjugate. Several hydrazide-derivatives including cemadotin
carbonylhydrazide (a dolastatin 15 analogue) were used for the site-specific
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modification of the IgG(F8) and yielded preparations with excellent homogeneity. The
ability of the cemadotin immunoconjugate to cause tumor growth retardation was
assessed in a mouse model of cancer.
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1.2
Zusammenfassung
Einer der grössten Nachteile von konventionellen Krebsmedikamenten ist die
ungenügende Selektivität zwischen Tumorzellen und gesundem Gewebe. Dies führt zu
einer hohen Arzneimittel-bedingten Toxizität was die Dosis limitiert, die dem Patienten
verabreicht werden kann. Ein vielversprechender Weg dieses Problem zu bewältigen ist,
das Medikament zielgerichtet zu den neugebildeten Blutgefässen des Tumors zu
bringen. Das Entstehen von neuen Blutgefässen, zur Versorgung des Tumors, ist ein
wichtiger Prozess im Fortschreiten von Krebs. Diese speziellen Gefässe exprimieren
spezifische Antigene, welche Antikörper-basierte Therapien ermöglichen.
In dieser Arbeit beschäftigten wir uns hauptsächlich mit Wirkstoff konjugierten
Antikörpern, welche die Blutgefässe im Tumor erkennen. Bei diesem therapeutischen
Ansatz wird ein zytotoxischer Arzneistoff, um das gesunde Gewebe zu schonen, direkt
zum Tumor gebracht. Eine Grundvoraussetzung für die Herstellung von solchen
Antikörper-Wirkstoff Konjugaten ist eine genügende Menge Tumor-Gefäss spezifischer
Antikörper für den Konjugierungsprozess. Darum beschreiben wir im ersten Teil dieser
Doktorarbeit ein FACS-basiertes Sortierverfahren, welches erlaubt aus einer Vielzahl
von stabil-transfizierten Zellen, Klone zu identifizieren, die eine überdurchschnittliche
Menge an rekombinantem Antikörper sekretieren. Dieses Verfahren wurde am Beispiel
des sich in klinischen Studien befindlichen monoklonalen Antikörpers L19 beschrieben
und zeigt eine zuverlässige Selektion von hoch-exprimierenden Klonen und eine
homogene Protein Ausbeute.
Zusätzlich entwickelten wir eine Reformatierungs-
methode um scFv Antikörperfragmente aus synthetischen Antikörper-PhagenBibliotheken in komplett humane IgG Antikörper umzuwandeln.
Im zweiten Teil der Doktorarbeit untersuchten wir die Modifikation der Glykan-Gruppe
eines Immunoglobulins um eine effiziente Herstellung gut definierter IgG-WirkstoffKonjugate zu gewährleisten. Die Analyse der Oligosaccharidstruktur des IgG(F8), ein
humaner Antikörper, welcher gegen die EDA-Domäne von Fibronektin gerichtet ist,
zeigte eine vorwiegende Fucosylierung der Kernglykane. Diese Fucose Einheit ist
besonders geeignet um Wirkstoffmoleküle über eine Hydrazonbrücke an den
Antikörper zu koppeln. Diverse Hydrazid-Derivate, unter anderem das Dolatatin 15
Analog Cemadotin Carbonylhydrazid, wurden für die Fucose-spezifische Modifikation
verwendet
und
zeigten
Konjugat-Ausbeuten
11
exzellenter
Homogenität.
Die
Auswirkungen dieses Cemadotin-Antikörper-Konjugats auf das Tumorwachstum
wurden in einem murinen Krebsmodell untersucht.
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