2. Biotechnologie Seminar Patrick Pilak Ausarbeitung

2. Seminar Biotechnologie
Ausarbeitung
Master Biotechnologie
2. Seminar
Patrick Pilak
Production of semi-synthetic Artemisinin
Paddon et al. 2013
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Zielsetzung
Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand eine alternative Methode zur Herstellung von Artemisinin zu
entwickeln, die eine kostengünstige Versorgung mit Artemisinin darstellt.
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Einleitung
2.1
Malaria
Malaria ist eine Infektionskrankheit, die vorwiegend in Entwicklungsländern in tropischen Regionen
verbreitet ist. Im Jahr 2012 wurden 660.000 Tode registriert, die durch Malaria ausgelöst worden sind.
Die Krankheit selbst wird durch die Parasiten der Spezies Plasmodium, wie beispielsweise
Plasmodium falciparum ausgelöst. Da letzteres eine Resistenz gegen das kostengünstige
Antiobiotikum Choroquin entwickelt hat, werden vorwiegend Artemisininkombinationstherapien
eingesetzt. Das Prinzip dabei beruht darauf, dass neben einem Derivat von Artemisinin noch ein
zusätzliches Medikament verabreicht wird. Diese Vorgehensweise ist zum Einen sehr effektiv und
zum Anderen reduziert dies die Behandlungsdauer. Des Weiteren wird die Wahrscheinlichkeit, dass
die Parasiten eine Resistenz gegen eines der beiden Medikamente entwickeln, auf ein Minimum
reduziert.
2.2
Artemisinin
Das Sesquiterpen Artemisinin (Abb.1) wird natürlicherweise durch den Einjährigen Beinfuß Artemisia
annua produziert und gilt laut der WHO seit 2002 als first-line Medikament gegen Malaria. Zudem
wirkt es gegen den Cytomegalovirus, Herpes simplex und Hepatitis B und C. Beispiele für Derivate
von Artemisinin sind Dihydroartemisinin und Artenusat.
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Abbildung 1: Artemisinin
2.3
Versorgung mit Artemsinin
Die Probleme der Versorgung der genannten Entwicklungsländer mit Artemisinin sind zahlreich. So
dauert es 18 Monate bis eine bestellte Lieferung Artemisinin geliefert wird, da Artemisinin
überwiegend über den Anbau der Pflanze artemisia annua erfolgt. Dadurch ist die Versorgung
abhängig von der Wetterlage und der allgemeinen Ernte. Zudem macht Artemisinin nur 1% der
Trockenmasse der Pflanze aus. Des Weiteren erschwert die Fluktuation des Preises den Bauern die
Planung ihres Anbaus. Aus diesen Gründen ist es von essentieller Notwendigkeit, dass eine alternative
Quelle zur Herstellung von Artemsinin gefunden wird, die eine gesicherte Versorgung mit
kostengünstigem Artemsinin darstellt.
2.4
Biosynthese von Artemisinin
Die natürliche Biosynthese von Artemisinin erfolgt dadurch dass Acetyl-CoA zu FarnesylPyrophosphat umgesetzt wird, welches durch die Amorphadiensynthase zu Amorphadien katalysiert
wird. Im nächsten Schritt konkurrieren die Reaktionen von Amorphadien zu Artemisininsäure oder
Dihydroartemisininsäure miteinander. In der Pflanze reagiert Dihydroartemisininsäure unter
Einwirkung von Licht spontan zu Artemisninin (Abb.2).
Abbildung 2: Biosynthese von Artemisinin in A. annua
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Ergebnisse
3.1
Biosynthese in Hefe
Ausarbeitung
In vorangegangenen Arbeiten wurden die Gene, die für die Synthese von Amorphadien in A.annua
verantwortlich sind identifiziert und in S. cerevisae heterolog exprimiert. Dabei liegt eine
konkurrierende Reaktion von Farnesylpyrophosphat zu Ergosterol oder Amorphadien vor. Da
Ergosterol für die Zelle essentiell ist, wurde die Produktion nicht vollständig inhibiert, sondern
lediglich reduziert.
In der neusten Arbeit wurde der durch Methionin reprimierende Promotor für die Squalen Synthase
durch einen CuSO4 reprimierenden Promotor ausgetauscht, da aus Kostengründen der Einsatz von
CuSO4 günstiger ist (Abbildung 3).
Abbildung 3: Biosynthese von Artemisinin in S.cereviae
Die Synthese von Amorphadien zu Artemisinsäure erfolgt über zwei Intermediate. Zunächst wird
Amorphadien durch das Cytochrom CYP71AV1 bei vorhandener Reduktase CPR und CYPB5 zu
Artemisinalkohol. Im nächsten Schritt wird dieser durch die Alkoholdehydrogenase ADH1 zu
Artemisinaldehyd umgesetzt. Im letzten Schritt katalysiert die Artemisininaldehyd Dehydrogenase
Artemisinaldehyd zu Artemisnin (Abbildung 4).
Die
Produktion
von
Artemisinin
erfolgt
halbsynthetisch,
da
zunächst
Artemisininsäure
biotechnologisch hergestellt wird, welches im Anschluss chemisch zu Artemsinin umgesetzt wird.
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Abbildung 4: Biosynthese von Amorphadien zu Artemisininsäure
3.2
Biosynthese von Artemisinsäure in Schüttelkolben
Der Ausgangsstamm Y285 dieser Arbeit liefert einen maximalen Titer von 0,3g/l Artemisininsäure.
Durch den Einsatz des CuSO4 reprimierten Promotors verändert sich dieser Wert nur minimal. Im
nächsten Schritt wurde die CPR1 niedriger exprimiert, was den natürlichen Verhältnissen in A. annua
entspricht, aber im Stamm Y657 einen niedrigeren Titer zur Folge hat. Der Titer wird jedoch im
Stamm Y692 erhöht indem das Cytochrom B5 zusätzlich exprimiert wird. Dieses Cytochrom
interagiert mit CYP71AV1 und steigert dadurch dessen Aktivität. CYP71AV1 ist prinzipiell in der
Lage alle Teilschritte der Katalyse von Amorphadien zu Artemisinsäure zu katalysieren, ist jedoch
nicht sehr leistungsfähig. Durch die zusätzliche heterologe Expression von ALDH1 und ADH1 wird
der Titer von Artemisininsäure auf 0,6 g/l erhöht.
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Abbildung 5: Synthese der Sesquiterpene in Schüttelkolben
In den durchgeführten Experimenten wurde beobachtet, dass die Artemisininsäure ausfällt und
dadurch die Viabilität der Zellen reduziert. Durch den Einsatz von Isopropylmyristatöl wurde dieser
Effekt verhindert, da die Artemisininsäure solubilisiert wird. In den Stämmen Y285, Y301, Y657,
Y692 und Y1368 werden vorwiegend die Intermediate extrahiert und dadurch die Gesamtmenge an
Sesquiterpenen erhöht. Da CYP76AV1 nicht leistungsfähig genug ist wird der Titer an
Artemisininsäure nur leicht erhöht. Dennoch ist der Einsatz von Vorteil, da die Zellviabilität erhöht
worden ist.
Abbildung 6: Synthese der Sesquiterpene in Schüttelkolben mit Isopropylmyristatöl
3.3
Biosynthese von Artemisinsäure in Fed-Batch Reaktoren
Durch den Einsatz von Fed-Batch Reaktoren mit Mixed-Feed Prozessen wurde nach 90 Stunden ein
maximaler Titer von 9 g/l an Artemisininsäure detektiert. Wird Isopropylmyristatöl zugesetzt, so
erhöht sich dieser Titer auf 14 g/l. Durch einen Feed-Pulse Prozess mit Ethanol wurde in dieser Arbeit
ein maximaler Titer von 25 g/l erreicht. Der Feed-Puls beruht darauf, dass Ethanol abhängig von der
Sauerstoffkonzentration bzw. des Sauerstoffverbrauchs der Zellen schubweise zugesetzt wird. Ethanol
dient in diesem Prozess als Precursor für Acetyl-CoA.
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Abbildung 6: Synthese der Sesquiterpene in Fed-Batch Reaktoren
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Diskussion
Neben den biotechnologischen Ansätzen wurde auch die chemische Synthese von Artemisinsäure zu
Artemisinin verbessert. Durch den Einsatz von anderen und vor allem kostengünstigeren Substanzen
konnte der Ertrag gesteigert und gleichzeitig die Kosten reduziert werden.
Durch die biotechnologischen Ansatzpunkte konnte ein maximaler Titer von Artemisininsäure von 25
g/l erreicht werden und die Kosten der Produktion reduziert werden. Diese Arbeit beinhaltet
dahingehend den Einsatz von Genetic Engineering, Fermentation und Synthetischer Chemie. Zudem
ist die halb-synthetische Herstellung unabhängig von Wetter- und allgemeinen Erntebedingungen.
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Zusammenfassung
Die in dieser Arbeit postulierte Methode beschreibt einen biotechnologischen Prozess zur Herstellung
von Artemisinin. Dies würde eine Alternative zur bisherigen Gewinnung von Artemisinin aus dem
Einjährigen Beinfuß A. annua darstellen. Aufgrund von wirtschaftlichen Interessen ist dies ein
Forschungsfeld, das es weiter zu untersuchen gilt. Zudem ist die halb-synthetische Herstellung
unabhängig von Wetter- und allgemeinen Erntebedingungen.
Durch den kontinuierlichen Willen die Produktionskosten zu senken, konnte eine alternative Quelle
geschaffen werden, die es vor allem ärmeren Entwicklungsländern ermöglicht die Bevölkerung
weitreichend mit kostengünstigem Artemisinin zu versorgen, um die Verbreitung von Malaria zu
bekämpfen.
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Ausarbeitung
Literatur
High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin
Paddon et al 2013, Nature
Semi-synthetic artemisinin a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development
Paddon et al 2014, Nature
Recent Advances in Artemisinin Production Through Heterologous Expression
Arsenault et al 2010
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