Verfahren zur qualitativen und quantitaiven RNA

Industrie-Applikationen
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Verfahren zur qualitativen und quantitaiven RNAUntersuchung: LabOnChip®, Microarray und qPCR
Technologien
Susanne Seifert, Katina Bogea und Marcus Neusser
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Die RNA-Analysen durch unterschiedliche Techniken wie
die Mikroarray-Technologie
oder die quantitative Real-Time
PCR-Methodologie haben zunehmend an Bedeutung gewonnen.
Wissenschaftler streben danach, aus den revers transkribierten Genominformationen
der cDNA im Zusammenhang
mit den Erkenntnissen der Proteomanalysen, also der Expression bestimmter Proteinmuster,
Aufschluss über komplexe Zusammenhänge wie Stoffwechselmetabolismen und Genregulation zu erhalten.
Um aber zu relevanten, aussagefähigen Ergebnissen zu gelangen, ist eine Qualitätskontrolle des Ausgangsmaterials, der
RNA, unumgänglich. In der Vergangenheit war dies im Wesentlichen die Kontrolle auf die verhältnismäßige Anwesenheit der
16S und 23S mRNA in Prokaryoten, oder der 18S und der 28S
mRNA in Eukaryoten. Diese
wurden über eine Gelelektophoreseauftrennung im Ethidiumbromidgel dargestellt. Überprüft wurde, ob idealerweise beide Moleküle in einem 2:1 Bandenintensitätsverhältnis vorliegen. Daneben kann in der Anwesenheit von unspezifischem
Fluoreszenzhintergrund auch
ein Indikator für RNA-Degradierungsprozesse gefunden werden.
RNA gehört zu den wenig stabilen Biomolekülen, da sie leicht
und schnell durch ubiquitäre
RNasen abgebaut wird.
RNA-Isolierungstechniken
Dementsprechend sind die zu
verwendenden RNA-Isolierungsmethoden ein wichtiges
Thema geworden.
Grundsätzlich unterscheidet
man RNA-Extraktionsverfahren
mit organischen Lösungsmitteln
von denen mit einer Silikamatrix
unter Hochsalzbedingungen.
Abb. 1: LabOnChip®-Technologien vereinen die Arbeitsstationen eines
kompletten Analyselabors auf geringster Fläche. Die ElektophoreseAuftrennung der Biomoleküle erfolgt in einem Kapillarsystem mit Gelmatrix. Die qualitativen und quantitativen Ergebnisse werden in Form eines
Elektropherogramms dargestellt.
BIOspektrum · 2/05 · 11. Jahrgang
Die Isolierung mit organischen Lösungsmitteln ist empfohlen, wenn es darum geht,
RNA aus fettreichem oder faserhaltigem Zellmaterial wie Gehirn oder Skelettmuskel zu isolieren. Probleme, die mit dieser
Prozedur verbunden sind, sind
vor allem die häufig auftretende Kontamination der RNA mit
Phenol, welches zur Extraktion
der Proteine aus der flüssigen
Phase verwendet wird.
Phenolkontaminationen können zu unerwünschten Effekten
führen, wie der Inhibition von
Transkriptionsreaktionen und
unzureichender Hybridisierung
von im Microarray verwendeten
Detektionssonden. Ein weiterer
Effekt ist die Inhibition von
Amplifikationsvorgängen während der quantitativen Real-Time PCR. Daneben ist die organische Extraktion relativ zeitaufwändig und ergibt oft variierende Ergebnisse. Ein Vorteil
dieses Verfahrens ist allerdings
die Skalierbarkeit, d.h. es kann
unter Verwendung entsprechender Mengenverhältnisse an
Chloroform und Ethanol auch
aus großen Mengen Zellmaterials eine RNA-Isolierung erfolgen.
Die Bindung von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) an eine Silikamatrix ist eine etablierte, leicht durchzuführende Isolierungsmethode. Die Bindung
erfolgt in Anwesenheit eines
Hochsalzpuffers wie Guanidiniumisothiocyanat (GITC). In der
Regel werden vorgefertigte Säulen verwendet, die mit Silikamatrix gefüllt sind und im Kit
mit allen anderen Komponenten
zur RNA-Reinigung garantiert
RNAse-frei zum Anwender gelangen. In den „Aurum Total
RNA Kits“ von Bio-Rad Laboratories ist zudem bereits eine
DNAse I enthalten, mit der genomische DNA direkt auf der
Säule abgebaut werden kann.
Silikabasierende Reinigungsmethoden sind aus vielen Gründen sehr populär. Sie sind sehr
schnell mit Hilfe der Zentrifugation oder Vakuumfiltration
durchzuführen und erlauben
Reinigungen in hohem Durchsatz. Man erhält qualitativ hochwertige RNA sogar aus geringsten Probemengen. Weiterhin
entfällt bei diesem Verfahren die
inzwischen recht kostenaufwändige Entsorgung der organischen
Lösungsmittel Phenol und
Chloroform, und auch der Experimentator ist keiner Toxizität
durch Lösungsmittel ausgesetzt.
Bedingt durch die vorgegebene Füllung der Säulen ist die
Bindekapazität allerdings oft begrenzt. Außerdem können die
Säulen verstopfen, besonders
wenn mit fetthaltigen Proben
oder faserigem Gewebe gearbeitet wird. Um diese Nachteile zu
umgehen, werden inzwischen
auch Reinigungkits angeboten,
die die Vorteile der organischen
Extraktion mit denen der Silikamatrixtechnologie vereinigen.
Der „Aurum Total RNA Fatty
and Fibrous Tissue Kit“ z.B. verwendet für den Probenaufschluss und die RNA-Extraktion
ein
Phenol/GITC-haltiges
Extraktionsreagenz. Die anschließende RNA-Reinigung erfolgt auf Säulen mit der Silikamembrantechnologie. Damit
können bis zu 100 mg schwer zu
bearbeitendes Gewebe eingesetzt und bis zu fünfmal mehr
RNA pro Säule gewonnen werden, da nicht mehr die Gefahr
besteht, dass die Säulen durch
fett- oder faserreiches Lysat verstopfen.
Nach der RNA-Isolierung
kommt die Qualitätskontrolle
Wie eingangs schon erwähnt,
werden die klassischen Verfahren der Gelelektrophorese abgelöst durch neue LabOnChip®Technologien, die eine wesentlich präzisere qualitative und sogar quantitative Aussage über
die gewonnene RNA zulassen.
LabOnChip®-Technologie, wie
sie mit dem „ExperionTM Auto-
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Abb. 2: Übersichtsdiagramm zu den typischen Arbeitsabläufen bei der differenziellen Genexpression mit modernen
Analysetechnologien.
mated Electrophoresis System“
von. Bio-Rad Laboratories realisiert ist, komprimiert die unterschiedlichen Arbeitsbereiche eines ganzen Analyselabors auf einen Chip der Fläche von ca.
1,5 cm2 (siehe Abb. 1). Die parallele Analyse für 1-12 Proben ist
in 30 Minuten abgeschlossen,
und das Resultat wird in Form
eines Elektropherogramms, das
im übrigen auch in einer Geldarstellung gezeigt werden
kann, abgebildet. Daneben erhält der Anwender verlässliche
Hinweise auf mögliche Degradierungsprozesse, die als Grundlage dienen zu entscheiden, welche RNA-Proben für die anschließenden Analysen weiterverwendet werden. Diese Art
der Probenqualifizierung ist zeitund kostensparend, da nicht informative Proben unmittelbar
von weiteren Analysen durch
Microarray oder quantitative Real-Time PCR ausgeschlossen
werden.
Es reduziert sich damit auch
die Überprüfung eventuell unbrauchbarer „Datenberge“ auf
biologische Relevanz mittels
Bioinformatik-Software.
Im Mittelpunkt des „ExperionTM Automated Electrophoresis System“ befinden sich
Kunststoff-Wells, die auf einer
dünnen Glasplatte gebunden
sind. Die Glasplatte ist mit einem Netzwerk aus optimal aufeinander abgestimmten Mikrokanälen versehen, die mit den
Wells verbunden sind. Sobald
diese Mikrokanäle mit einer
Gelmatrix befüllt werden, kön-
nen Protein- /RNA-Proben
durch eine exakte Steuerung
von Spannung und Stromfluss in
den Mikrokanälen aufgetrennt
werden.
Das System führt folgende
Prozesse automatisiert durch:
Probenauftrennung, Probenfärbung, Probendetektion und
automatische Datenanalyse. Die
hohe Detektionssensitivität gestattet es, Gesamt-RNA und
mRNA-Reinheit und Konzentration im Nanogramm-Bereich
quantitativ und im PicogrammBereich qualitativ zu bestimmen.
Zur Größenbestimmung verwenden die RNA- Analyse Kits
einen kleinen internen Molekulargewichtsmarker.
In den RNA Untersuchungen
ist in der Regel die MicroarrayTechnik der Real-Time PCR
vorangestellt, denn sie bietet die
Möglichkeit, aus einem großen
Genpool, wie z.B. dem humanen
Genom, die wenigen regulierten
Gene ausfindig zu machen, die
im Zusammenhang mit einer beobachtbaren biologischen Veränderung Bedeutung haben.
Bio-Rad Laboratories bietet hier
alle erforderlichen Hardwarevoraussetzungen:
Microarray
Die VersArray Microarray Linie
umfasst je einen Spotter für
Low- oder High-ThroughputApplikationen, „VersArray Spot
Writer Compact“ und „VersArray Spot Writer Pro“. Die „VersArray Reader“ gibt es ebenfalls
in zwei Varianten mit minimal
3 µM oder 5 µM Auflösung.
Quantitative Real-Time PCR
Für die anschließende quantitative Real-Time PCR steht neben dem „MyiQTM Single Color
Detection System“ noch das
„iCycler iQTM Multicolor Detection System“ zur Verfügung,
indem bis zu vier Gentargets
über unterschiedlich markierte
Fluoreszenzhybridisierungssonden quantitativ in einem großen
dynamischen Detektionsbereich
erfasst werden.
In beiden Detektionsplattformen werden CCD-Kameras für
die Datenaufnahme verwendet.
Bei der Microarray-Technologie
handelt es sich jedoch um eine
Endpunktmessung, die mit dem
Bild aus einer Gelanalyse von
amplifizierten PCR-Produkte
vergleichbar ist. Im Gegensatz
zur Real-Time PCR erfolgt also
keine dynamische, sondern eine
Fixpunktdetektion. Die CCDKamera in der Real-Time PCRTechnik zeichnet die Fluoreszenzsignale aller entstehenden
PCR-Produkte dagegen kontinuierlich auf, beginnend mit
dem ersten PCR-Zyklus bis zum
Abschluss der Reaktion nach
z.B. 40 Zyklen. Dabei wird die
Expositionszeit der CCD-Kamera immer so gesteuert, dass
selbst schwache Fluoreszenzsignale erfasst werden. Die Produktbildung wird soweit verfolgt, bis die so genannte PCRPlateauphase erreicht ist, in der
keine lineare Produktzunahme
mehr zu beobachten ist. Die
Quantifizierung für alle Proben
erfolgt dann über die etablierte
CT-Wert-Berechnung. Dieser
„Cycle of Threshold“ (CT) beschreibt den Zeitpunkt, zu dem
eine Probe einen definierten
Fluoreszenzschwellenwert überschreitet. Eine valide Quantifizierung erfolgt immer im linearen Fluoreszenzanstieg. Um die
Amplifikation unterschiedlicher
PCR-Produkte in einer Reaktion miteinander vergleichen zu
können, haben die Reaktionen
idealerweise identische Produktbildungseffizienzen. Die
Produktbildungseffizienz liegt
bei 100 %, wenn in jedem PCRZyklus eine Verdopplung der
vorliegenden DNA-Zielstränge
erfolgt. Sind die Effizienzen von
quantitativ miteinander zu vergleichenden Genen unterschiedlich, helfen Delta CTWert-Algorithmen, z.B. „PfafflAlgorithmus“.
Zur schnellen Datenverarbeitung bietet Bio-Rad Laboratories den Anwendern der Systeme iCycler iQTM und MyiQTM
ein zusätzliches Tool, mit dem
automatisiert die n-fache Regulation von Kandidatengenen im
Vergleich zu nicht regulierten
House-Keeping-Genen berechnet wird.
Es ist damit zu rechnen, dass
in der Zukunft in allen vorgestellten Bereichen zunehmend
Standardisierungen erfolgen
werden. Erste Bemühungen in
diese Richtung sind die durch
die MGED-Gruppe definierte
MIAME(minimal information
about a microarray experiment)Vorgaben. Der zukünftige Trend
liegt in einer weiteren Miniaturisierung und Automatisierung
der vorgestellten Techniken.
Korrespondenzadresse:
Dr. Susanne Seifert
Dr. Katina Bogea
Dr. Marcus Neusser
Bio-Rad Laboratories GmbH
Heidemannstr. 164
D-80939 München
[email protected]
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