Proteine in wässriger Lösung
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Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“ Proteine in wässriger Lösung Hydrathülle (fest gebunden) + + - + hydrophober Kern - + hydrophile Oberfläche H-Brücken, ionische Wechselwirkungen H-Brücken, hydrohobe Wechselwirkungen entfaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche exponiert hydrophobe Region gefaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche im Inneren Clustering Nur die Lipidmoleküle an der Seite erzwingen eine höhere Ordnung Dispersion von Lipiden in Wasser jedes Lipid-Molekül zwingt die Wassermoleküle, einen höheren Ordnungszustand einzunehmen Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“ Denaturieren Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Denaturieren von Proteinen entfalten random coil hydrophobe und hydrophile Bereiche exponiert Aggregation über hydrophobe Bereiche Stabilisierung von Monomeren durch Lösungsmittel/ Zusatz von Additiven, die mit hydrophoben Oberflächen energetisch günstige Wechelwirkungen eingehen können hydrophobe Region gefaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche im Inneren Bereich mit einer geordneten Wasserstruktur entfaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche exponiert Aggregation über hydrophobe Bereiche Denaturieren von Proteinen Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche: • • • • Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat wichtige Detergenzien SDS (Natrium-dodecylsulfat) O Na O S O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 O Triton X-100 CH3 HO CH2 CH2 O CH2 CH2 n O CH2 CH2 O CH3 C CH2 C CH3 CH3 CH3 Denaturieren von Proteinen Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche: • • • • Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat Harnstoff, Mercaptoethanol Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“ Denaturieren Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Aussalzen: Konkurrenz von Proteinen und Salzen um Wasser, nicht alle Salze sind gleich gut geeignet (Hofmeister Serie) Einsalzen durch niedrigere Salzkonzentrationen Hofmeister-Serie Klassifizierung von Ionen in der Reihenfolge ihrer Fähigkeit, Proteine auszusalzen (bzw. in Lösung zu halten) Aussalzen SO42- > H2PO4- > CH3COO- > Cl- > Br- > I- > ClO4- > SCNNH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Guanidinium Löslichkeit Destabilisierung der Tertiärstruktur Wirkung von Additiven auf die Hydrathülle von Proteinen Eindringen in die Hydrathülle Wechselwirkung mit Proteinen Aussschluss aus Hydrathülle ungestörte Wechselwirkung zwischen Protein und Hydrathülle Wasser Additiv nach Creighton