Funktionsanalyse von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese
Werbung
Aus dem Institut für Molekulare Gastroenterologische Onkologie der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. S. A. Hahn Funktionsanalyse von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Daria Pakosch aus Hindenburg 2011 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Stephan A. Hahn Koreferent: PD Dr. med. Peter Hoffmann Tag der mündlichen Prüfung: 24. April 2012 Abstract Pakosch Daria Funktionsanalyse von Keratin 23 in Kolonkarzinogenese Problem: Keratine nehmen innerhalb der Karzinogenese eine wichtige Rolle ein, da sie sowohl eine Hilfe in der pathologischen Differenzierung vieler Karzinomerkrankungen sind als auch die Karzinogenese durch Wachstum und Migration der Tumorzellen beeinflussen. Eine vermehrte Expression von Keratin 23 (KRT23) konnte bisher in kolorektalen Adenomen und Karzinomen nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es, eine erste funktionelle Charakterisierung von KRT23 mit Hilfe eines Kolonkarzinomzellmodells durchzuführen. Dadurch sollten Hinweise für dessen Bedeutung in der Kolonkarzinogenese gewonnen werden. Methode: Mit Hilfe eines retroviralen Gentransfers wurde in die aus kolorektalen Mirkoadenomen stammende Zelllinie LT97 ein die Expression von KRT23 supprimierendes shRNA-Konstrukt stabil intergriert. Anschließend wurde die Keratin 23 Suppression mit Hilfe der quantitativen Real Time-PCR validiert. Der Einfluss des KRT23 knock-downs auf das Transkriptom wurde mittels einer globalen Genexpressionsanalyse (Oligo-Array) erfasst. Ferner wurde ein Apoptose-Assay durchgeführt, um Veränderungen in der Apoptoserate durch den KRT23 knock-down zu erfassen. Ergebnis: Durch den retroviralen Gentransfer der KRT23-shRNA-Expressionskassette konnte in der Adenomzelllinie LT97 die KRT23 Expression erfolgreich supprimiert werden. In der anschließenden globalen Genexpressionsanalyse wurde die differentielle Expression von Genen, die u.a. an der Regulation des Zellzyklus, der Zelldifferenzierung und der Apoptose beteiligt sind, identifiziert. Ferner zeigte sich im Apoptose-Assay eine gesteigerte Apoptoserate der Keratin 23 supprimierten Adenomzellen. Diskussion: Eine erhöhte Expression von Keratin 23 ist in kolorektalen Adenomen und Karzinomen nachgewiesen worden, wobei jedoch die genaue Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese weitestgehend unbekannt ist. In dieser Arbeit konnte erfolgreich eine Kolonadenomzelllinie (LT97) mit einer stabilen Suppression der Keratin 23-Expression etabliert werden. Passend zu den Ergebnissen der differentiellen Genexpressionen, die u.a. auf eine KRT23-vermittelte Regulation von Genen der Apoptose-Signalkaskade hindeutete, konnten invitro auch eine erhöhte Apoptoserate der Keratin 23 supprimierten Adenomzellen nachgewiesen werden. Auch wenn die vorliegende Arbeit, die auf eine Modellzelllinie fokussiert war, Daten generieren konnte, die nur eingeschränkt auf andere Kolonkarzinomzellen übertragbar sind, so konnte sie dennoch erste Hinweise erbringen, dass KRT23 u.a. durch Modulation des Zellzykluses, der Proliferation und Apoptoserate an der Kolonkarzinogenese beteiligt sein könnte. In weiterführenden Versuchen könnte zum einen durch in-vitro Versuche wie Proliferations- und Zellzyklus-Assays die Genexpressionsdaten in KRT23 supprimierten LT97 Zellen funktionell validiert werden. Zum anderen sollte durch die Ausdehnung der Versuchsreihen auf weitere Kolonzelllinien, die Frage geklärt werden, ob die bei LT97 Zellen erhobenen Befunde auch auf weitere Zelllinien übertragbar sind, wodurch die Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese besser untermauert werden würde. Meinen lieben Eltern Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ................................................................................1 1.1 Das kolorektale Karzinom ................................................................ 1 1.1.1 Die Adenom-Karzinom-Sequenz ....................................................... 3 1.1.2 Familiäre adenomatöse Polypose ..................................................... 5 1.1.2.1 Adenomatöses Polyposis-coli Gen .................................................... 7 1.2 Keratin bilden Intermediärfilamente ................................................. 7 1.2.1 Keratin 23 .....................................................................................10 1.2.2 Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese .............................................12 1.3 Die Apoptose .................................................................................14 1.3.1 Die Caspasen ................................................................................15 1.4 Signalwege der Zelle ......................................................................16 1.4.1 Der Tumornekrose-Faktor TNF-α und -Rezeptor ..............................16 1.4.2 Der Transkriptionsfaktor NF-κB .......................................................18 1.4.3 Das Protoonkogen c-myc ...............................................................22 1.4.4 Die Bcl-2 Familie ............................................................................24 1.4.4.1 Der anti-apoptotische Faktor Bcl-2 ..................................................26 1.4.4.2 Der anti-apoptotische Faktor Bcl-xL .................................................26 1.4.4.3 Die Bcl-2 Mitglieder regulieren die Apoptose ....................................27 2. Ziel der Arbeit ........................................................................28 3. Methoden...............................................................................29 3.1 Zellbiologische Methoden ...............................................................29 3.1.1 Die Adenomzelllinie LT97 ...............................................................29 3.1.2 Herstellung des speziellen Nährmediums für die Adenomzellen LT97 29 3.1.3 Mediumwechsel .............................................................................31 I 3.1.4 Splitten der Adenomzellen LT97......................................................31 3.1.5 Zellzählung ....................................................................................32 3.1.6 Transfektion der Adenomzelllinie LT97 mittels eines lentiviralen shRNA Vektorsystems ...............................................................................33 3.1.7 Apoptose–Assay: Caspase-Glo® 3/7 Assay......................................35 3.2 Molekularbiologische Methoden ......................................................36 3.2.1 RNA Präparation mit der sauren Phenolmethode ..............................36 3.2.2 Messung der RNA-Konzentration.....................................................37 3.2.3 Herstellung eines Formaldehyd-Agarosegels für die RNA ..................37 3.2.4 DNase-Verdau mit Turbo-DNase .....................................................39 3.2.5 Phenolchloroform-Extraktion ..........................................................39 3.2.6 Natriumacetat-Ethanol-Fällung .......................................................39 3.2.7 cDNA-Synthese..............................................................................40 3.2.8 Quantitative Real Time–PCR ...........................................................41 3.2.9 Herstellung eines Agarosegels zur DNA-Gelelektrophorese ...............44 3.2.10 Globale Genexpressionsanalyse ......................................................45 3.2.10.1 Bioinformatische Auswertung der Array Daten..................................48 4. Ergebnisse .............................................................................50 4.1 Transduktion der Adenomzellen LT97 mit einem lentiviralen shRNA Vektorsystems zur Suppression der Keratin 23-Expression................50 4.2 RNA-Konzentrations- und Qualitätskontrolle ....................................51 4.3 quantitative Real Time-PCR ............................................................52 4.3.1 Keratin 23 Expressionsuntersuchung ...............................................52 4.3.2 Auswertung der DNA-Gelelektrophorese ..........................................55 4.4 Identifikation von KRT23-Zielgenkandidaten mittels der RNA-ArrayTechnologie ..................................................................................58 4.5 Aktivitätserhöhung der Caspasen-3 und -7 ......................................60 II 5. Diskussion .............................................................................62 5.1 Keratin 23 abhängig regulierte Gene ...............................................62 5.2 Keratin 23 reguliert die Expression von TNF-α .................................63 5.3 Keratin 23-abhängige Regulation des Transkriptionsfaktors NF-κB ....64 5.4 Keratin 23 inhibiert die Apoptose über Bcl-2 und Bcl-xL ....................66 5.5 Keratin 23 hat eine proliferationsfördende Wirkung über das Protoonkogen c-myc ......................................................................69 5.6 Keratin 23 reguliert die Apoptose über die Caspasen-3 und -7 ..........70 5.7 Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese ..71 5.8 Bewertung der Ergebnisse und Perspektive für weitere Projekte .......74 6. Zusammenfassung .................................................................76 7. Literaturverzeichnis...............................................................77 8. Anhang ..................................................................................91 8.1 Verwendete Materialien..................................................................91 8.2 Ergebnisse der globalen Genexpressionsanalyse ..............................99 III Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: genetische Veränderungen in der Adenom-Karzinom-Sequenz ... 5 Abbildung 2: struktureller Aufbau eines Keratin-Tetramers ............................ 9 Abbildung 3: Model des Signalweges von TNF-α ..........................................18 Abbildung 4: Aktivierung von NF-κB............................................................20 Abbildung 5: regulierende Funktion von Max auf Transkriptionsebene ..........22 Abbildung 6: struktureller Aufbau der Bcl-2 Familie ......................................24 Abbildung 7: Verlauf einer PCR..................................................................41 Abbildung 8: Pipettierschema für die quantitative Real Time-PCR .................44 Abbildung 9: Berechnung des Impact-Factors (IF) .......................................49 Abbildung 10: GFP-Kontrolle transfizierter 293T-Zellen ..................................50 Abbildung 11: GFP-Kontrolle der transduzierte Adenomzellen LT97 ................51 Abbildung 12: Integritätsprüfung der RNA-Ansätze ........................................52 Abbildung 13: Schmelzkurven der quantitativen RT-PCR ................................54 Abbildung 14: Ratio der Keratin 23-Expression der Adenomzellen LT97 .........55 Abbildung 15: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar PPIA ....................................................................57 Abbildung 16: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar GAPD ...................................................................57 Abbildung 17: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar HPRT1 .................................................................57 Abbildung 18: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar KRT23..................................................................58 Abbildung 19: durchschnittliche Aktivität der Caspasen-3 und -7 ....................61 IV Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Klassifikation der kolorektalen Karzinome ..................................... 2 Tabelle 2: TNM-Klassifikation des kolorektalen Karzinoms ............................. 2 Tabelle 3: FAP und phänotypische Varianten. ............................................... 6 Tabelle 4: Expressionsverhalten von Keratin 23 ...........................................12 Tabelle 5: Auszug einiger Verstärker der Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB .......................................................................................20 Tabelle 6: Auszug einiger Zielgene des Transkriptionsfaktors NF-κB..............21 Tabelle 7: funktionelle Gruppen der Bcl-2 Familie ........................................24 Tabelle 8: Zusätze für das modifizierte Standardmedium .............................30 Tabelle 9: Konzentrationsangaben der speziellen Zusätze ............................30 Tabelle 10: Menge der benötigten Plasmide für die CaCl2-Transfektion der Verpackungszellen 293T .............................................................33 Tabelle 11: Bestandteile des 10-fachen MOPS-Puffers ...................................38 Tabelle 12: Menge der Primermix-Reagenzien für eine einmalige Reaktion in der quantitativen Real Time-PCR ......................................................43 Tabelle 13: verwendete Primer in der quantitativen Real Time-PCR ................43 Tabelle 14: Programm für einen Zyklus in der quantitativen Real Time-PCR ....44 Tabelle 15: Bestandteile des SB-Puffers ........................................................45 Tabelle 16: Mengen eines Master-Mixes für eine einmalige Reaktion ..............47 Tabelle 17: Einstellung des Array-Scanners ...................................................48 Tabelle 18: RNA-Konzentrationen .................................................................52 Tabelle 19: Auszug von Genen mit erhöhter Expression in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen.......................................................59 Tabelle 20: Auszug von Genen mit erniedrigter Expression in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen.......................................................59 V Tabelle 21: Auszug der betroffenen Signalwege bei Suppression der Keratin 23 Expression.................................................................................59 Tabelle 22: Ergebnisse und ermittelter Durchschnittswert d der drei Messungen im Apoptose-Assay ....................................................................60 Tabelle 23: Ergebnisse des t-Testes .............................................................61 VI Abkürzungsverzeichnis A1 Bcl-2 related protein A1 Abb. Abbildung APO-1 Synonym für FAS Bad Bcl2-associated agonist of cell death Bak Bcl2-antogonist/ killer Bax Bcl2-associated X protein Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2 Bcl-xL Bcl2-like 1 Bcl-W Bcl2-like 2 BH Bcl2-homolg Bid BH3 interacting domain death agonist Bik BCL2-interacting killer (apoptosis-inducing) Bim BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) Blk B lymphoid tyrosine kinase Bniip3 BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3-like Bok BCL2-related ovarian killer Boo Bcl2-like 10 bzw. beziehungsweise CD cluster of differentiation CEA karzino-embryonales Antigen c-myc v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog COX-2 Cyclooxygenase-2 DCC Deleted in Colorectal Cancer DMEM Dulbecco’s modified Eagle Medium DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DR3 death receptor 3 DR4 death receptor 4 DR5 death receptor 5 DR6 death receptor 6 EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF epidermal growth factor FADD Fas- associated death domain FAP familiäre Adenomatosis Polyposis FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) FCS fetales Kälberserum Hrk harakiri, BCL2 interacting protein VII IKKα IκB Kinase α IKKβ IκB Kinase β IKKγ IκB Kinase γ IκBKG inhibitor of kappaB kinase gamma JNK c-Jun NH2-terminal kinase kb kilobasen kDa kilo-Dalton Mad mothers against dpp max myc associated factor X Mcl-1 myeloid cell leukemia sequence 1 (Bcl2-related) μg mikrogramm μl mikroliter μM mikroMol mM millimolar mRNA messenger Ribonukleinsäure Mxi max interactor 1 NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphopshat NF-κB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells ng nanogramm Nip3 BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3 nm nanometer NOX1 NADPH Oxidase 1 NOXA NADH Oxidase NR13 BCL2-like 10 (apoptosis facilitator) PARP1 Poly- (ADP-ribose) polymerase PBS Phosphat-gepufferte Saline PCR polymerase chain reaction PGE2 Prostaglandin-E2 PLAD pre-ligand-bindung assembly domain PUMA BCL2 binding component 3 REL v-rel retivuloendotheliosis viral oncogene homolog RIP1 receptor-interacting protein 1 RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rounds per minute SDS Natriumdodecylsulfat shRNA short hairpin ribonucleic acid SODD inhibitor Silencer of DD STAT 3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Tab. Tabelle VIII TAD transcriptional activation domain Tcf-Lef T-cell specific transcription factor / lymphoid enhancer-binding factor TNF-α tumor necrosis factor α TRADD TNF Receptor Associated Death Domain TRAF2 TNF receptor-associated factor 2 TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand u.a. unter anderem p21 CDK-Inhibitor 1 IX 1. Einleitung 1.1 Das kolorektale Karzinom Eine der häufigsten malignen Tumorerkrankungen ist das kolorektale Karzinom (CRC). In Deutschland ist es mit 70.000 Neuerkrankungen (Schmiegel et al., 2008) nach dem Bronchialkarzinom das zweithäufigste Karzinom beim Mann, während es bei der Frau nach Mamma- und Uteruskarzinom an Platz drei steht. (Renz-Polster et al., 2006), weltweit findet sich das kolorektale Karzinm beim Mann an Platz drei, bei der Frau hingegen schon auf Platz 2 (Aiello et al., 2011). Die immer weiter steigende Inzidenz liegt zur Zeit bei 25:10.000 Menschen pro Jahr (Renz-Polster et al., 2006). Über 90 % der Patienten mit einem kolorektalen Karzinom sind über 50 Jahre alt (Rupnarain et al., 2004). Das überwiegend solitär vorkommende kolorektale Karzinom befindet sich zu 60% im Rektum, gefolgt vom Sigma mit 20%, die restlichen 20% verteilen sich auf das übrige Kolon. Zum Zeitpunkt der Diagnose sind ungefähr 25% der kolorektalen Tumore metastasiert, da die ersten klinischen Symptome erst spät auftreten. Die Art der gastrointestinalen Beschwerden ist von der Lokalisation des Tumors abhängig. So verursachen eher proximal gelegene Tumore Symptome wie eine Anämie und okkulte Blutverluste, während distal gelegene Tumore eher zu Veränderungen der Stuhlgewohnheiten und Hämatochezie durch Ulzerationen des Tumors führen. Die Tumore breiten sich vorwiegend in oraler Richtung mit möglicher Infiltration benachbarter Organe aus. Es ist sowohl eine lymphogene als auch eine hämatogene Metastasierung, vor allem in Leber und Lunge, möglich. Histologisch sind die kolorektalen Karzinome in zwei Gruppen zu teilen: zum einen die Gruppe der Adenokarzinome, die ungefähr 95% aller kolorektalen Tumore ausmacht und sich meistens aus primär gutartigen Adenomen entwickelt. Zum anderen eine etwa 5% große Gruppe, welche die Plattenepithelkarzinome, Leyomyosarkome, maligne Karzinoide und maligne Melanome umfasst. Ätiologisch spielen für die Entstehung von kolorektalen Karzinomen sowohl Umweltfaktoren wie Ernährungsgewohnheiten, Nikotin- und Alkoholkonsum als auch genetische 1 Faktoren eine wichtige Rolle (Renz-Polster et al., 2006). Das kolorektale Karzinom kann nach der älteren Dukes-Klassifikation, dem UICC-Stadium oder nach dem TNM-System eingeteilt werden. Tabelle 1: Klassifikation der kolorektalen Karzinome (nach Sobin et al., 2009). Dukes- UICC- TNM-System Klassifikation Stadium 0 Tis N0 A I T1-T2 N0 B II T3-T4 N0 Iia T3 N0 IIb T4a N0 IIc T4b N0 III Tx N1-2 IIIa T1 N2a IIIb T1-T2 N2b oder T2-T3 N2a IIIc T3-T4a N2b oder T4a N2a IV Tx Nx M1 Iva Tx Nx M1a IVb Tx Nx M1b C D Tabelle 2: TNM-Klassifikation des kolorektalen Karzinoms (nach Sobin et al., 2009). T: Primärtumor Tis Carcinoma in situ T0 kein histologischer Nachweis für einen Primärtumor im Resektat T1 Infiltration der Submukosa T2 Infiltration der Muscularis mucosae T3 Infiltration der Subserosa T4a Tumor perforiert das viszerale Peritoneum T4b Direkte Infiltration anderer Organe oder Strukturen Tx Keine histopathologische Aussage über den Primärtumor möglich 2 N: regionäre Lymphknoten N0 Kein Nachweis für die Metastasierung in regionäre Lymphknoten N1a Metastasierung in einem regionären Lymphknoten N1b Metastasierung in zwei bis drei regionäre Lymphknoten N1c Satellitenmetastase in der Subserosa ohne Metastasierung regionärer Lymphknoten N2a Metastasierung in vier bis sechs regionäre Lymphknoten N2b Metastasierung in mindestens sieben regionäre Lymphknoten M: Fernmetastasen M1a Metastasen in einem anderen Organe M1b Metastasen in mehr als einem anderen Organ oder im Peritoneum Nahezu alle Patienten mit einem kolorektalen Karzinom profitieren von einem chirurgischen Eingriff mit der Zielsetzung der radikalen Tumorresektion und Lymphknotenexstirpation. Der Einsatz einer Chemotherapie ist bei Patienten im Stadium Dukes C postoperativ zur Verminderung von Lokalrezidiven möglich. Bei Patienten mit einem Rektumkarzinom der Klassifikation Dukes B oder C kann eine Chemo-Radiatiotherapie die Überlebensrate erhöhen. Die Nachsorgeuntersuchungen sollen alle drei Monate stattfinden und enthalten die Kontrolle des Tumormarkes CEA (karzino-embryonales Antigen), sowie die Untersuchung nach okkulten Blutungen, eine Abdomensonographie und eine Röntgenaufnahme des Thorax. Eine Koloskopie soll drei und sechs Monate nach der operativen Intervention stattfinden, danach ist alle drei Jahre eine Koloskopie im Rahmen der Nachsorge vorgesehen (Renz-Polster, 2006). 1.1.1 Die Adenom-Karzinom-Sequenz Ein kolorektales Adenom (Syn. adenomatöser Polyp) ist ein gutartiger Tumor des Dickdarms mit einem polypösen und epithelialen Aufbau sowie einer Drüsenbildung. Der Großteil der Kolonadenome, ca. 98%, ist jedoch sporadischen Ursprungs und kann nicht mit anderen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden. In gesunder Kolonmukosa findet die 3 Zellteilung im unteren Kryptenbereich statt. Während der Differenzierung wandern die Zellen entlang der Kryptenwand aufwärts, bis sie bei abgeschlossener Differenzierung die Kryptenmündung erreicht haben. Das kolorektale Adenom stammt aus einer einzelnen Drüsenzelle, welche sich in den Krypten des Kolons befindet, somit ist ein kolorektales Adenom eine monoklonale Erscheinung. Die Tumorvorläuferzellen wachsen exophytisch in das Darmlumen vor und verdrängen gleichzeitig die Mukosa zwischen benachbarten Krypten. Die ursprünglich basale Proliferationszone der gesunden Kryptenzellen steigt durch die gesteigerte Proliferation der Tumorvorläuferzellen immer weiter in Richtung Darmlumen. Die Adenom-Karzinom-Sequenz erklärt die Entstehung des kolorektalen Karzinoms durch unterschiedliche intraepitheliale Neoplasie- Vorstufen. Dabei steht am Anfang eine dysplastische Zelle der Krypten als Vorläufer des adenomatösen Polypen, welcher wiederum als Vorläufer des kolorektalen Karzinoms anzusehen ist (Rupnarain et al., 2004). Die Theorie der Adenom-Karzinom-Sequenz wird molekularbiologisch mit dem Tumorprogressionsmodell nach Vogelstein und Fearon erklärt. Hierbei kommt es zur Hyperproliferation einer gesunden Mukosazelle über das Prinzip „loss of heterozygosity“ zur Entstehung eines adenomatösen Polypen mit geringgradiger Dysplasie in Verbindung mit einer inaktivierenden Mutation im APC-Gen oder einer aktivierenden Mutation im β-Catenin-Gen. Über nachfolgende somatische Mutationen im κ-Ras-Onkogen entwickelt sich aus der geringgradigen Dysplasie eine mittelgradige Dysplasie. Diese kann wiederum über Mutationen oder Verluste im Tumor-Suppressor-Gen DCC (Deleted in Colorectal Cancer) zu einem villösen Adenom mit hochgradiger Dysplasie wachsen. Im letzten Schritt führen biallelisch inaktivierende Veränderungen des p53-Tumor-Suppressor-Gens zur Entstehung eines Karzinoms (Fearon and Vogelstein, 1990). 4 Gesundes Kolonepithel Mutation im APC- oder β-Catenin-Gen Dysplastisches Epithel Mutation K-ras Adenom Mutation DCC und Inaktivierung p53 Karzinom Abbildung 1: genetische Veränderungen in der Adenom-Karzinom-Sequenz (nach Rupnarain et al., 2004). 1.1.2 Familiäre adenomatöse Polypose Die familiäre adenomatöse Polypose (FAP) ist ein autosomal-dominant vererbtes Polyposis-Syndrom, welches sich durch mehr als 100 adenomatösen Polypen im Kolon, unter Umständen auch im gesamten gastrointestinalen Trakt auszeichnet. Charakteristisch für die Adenom-Karzinom-Sequenz bei der FAP ist eine hereditäre Keimbahnmutation im adenomatosis-Polyposis-coli TumorSuppressor-Gen (APC), das auf dem Chromosom 5 (Locus 5q21) lokalisiert ist. Eine APC-Mutation, welche in 85% aller sporadischen kolorektalen Karzinomen zu finden ist (Seeling et al., 1999), scheint die chromosomale Instabilität der Tumorzellen zu begünstigen (Behrens, 2005). Die Inzidenz der FAP beträgt in den westlichen Industrieländern 1:10.000. Die Patienten mit FAP entwickeln zwischen dem 10. und 30. Lebensjahr mehr als 100 kolorektale Adenome, die distal im gastrointestinalen Trakt häufiger vorkommen als proximal. Es gibt allerdings auch abgeschwächte Erscheinungsformen, die sich durch eine untypische Adenomverteilung mit weitaus weniger Adenomen kennzeichnen. Hierbei sind flache dysplastische Epithelveränderungen, die sog. „flat adenomas“, in der Mukosa zu finden. Adenome im Dünndarm sind gehäuft an 5 der Ampulla Vateri zu beobachten, während im Magen hauptsächlich hyperplastische Polypen, weniger Adenome, nachzuweisen sind. Die Organbeteiligung überschreitet bei der FAP gelegentlich den gastrointestinalen Trakt: so ist am Auge bei ungefähr 70% der Patienten eine kongenitale Hypertrophie des retinalen Pigmentepithels diagnostizierbar. Seltener sind auch Desmoide, Hepatoblastome und Schilddrüsenkarzinome zu vermerken (Kullmann, 2001). Eine genetische Untersuchung betroffener Familienmitglieder erlaubt bei erstgradig gesunden Familienmitgliedern eine prädiktive Diagnostik für den Nachweis eines Anlageträgerstatus. Für Risikopatienten einer FAP ist ein spezielles Vorsorgeprogramm etabliert, das u.a. durch regelmäßige GastroDuodenoskopien und Koloskopien gekennzeichnet ist. Da es sich bei der FAP um eine obligate Präkanzerose handelt, entwickeln sich bei den Patienten aus den meist tubulären Adenomen im Laufe der Zeit invasive Karzinome. Eine prophylaktische Behandlung mittels einer totalen Kolektomie ist heutzutage die Therapie der Wahl, da nur auf diese Weise der sonst unvermeidlichen Karzinomentwicklung entgegen gewirkt werden kann (Seeling et al., 1999). Für die FAP ist eine Geno-Phänotyp-Korrelation bekannt, bei der einige Mutationen mit bestimmten Phänotypen vergesellschaftet sind. Tabelle 3: FAP und phänotypische Varianten (nach Kullmann, 2001). Erkrankung Befall des Gastro- Befall weiterer Organe intestinaltraktes FAP >100 kolorektale Kong. Hypertrophie des retinalen Adenome Pigmentepithels, Astrozytom, Schilddrüsen-Karzinom, Desmoid, Medulloblsatom, Hepatoblastom Attentuierte 5-100 Adenome FAP Gardner- >100 kolorektale Fibrome, Syndrom Adenome Epidermoidzysten Turcot- Wenige Adenome, Medulloblastome Syndrom kolorektales Karzinom 6 Osteome, Desmoide, So sind beispielsweise bei der attenuierten Form der FAP Mutationen am Anfang bzw. Endes des APC-Gens (proximal des Codons 158 oder distal des Codons 1900) nachweisbar, bei welcher ab dem 20. Lebensjahr bis zu 100 Adenome vermehrt im proximalen Anteil des Kolons finden sind (Kullmann, 2001). Ferner können bei der FAP phänotypische Varianten mit Manifestationen außerhalb des gastrointestinalen Traktes beobachtet werden (Renz-Polster et al., 2006). 1.1.2.1 Adenomatöses Polyposis-coli Gen Eine Mutation des APC-Gens führt zu einer chromosomalen Instabilität der Zelle (Behrens, 2005). Durch die Mutation im APC-Gen wird die Proliferation und Differenzierung der intestinalen Zellen gesteigert (Aoki and Taketo, 2007), hierbei kommt es in der betroffenen gastrointestinalen Epithelzelle zu Veränderungen in der Zellreplikation, der Zelladhäsion und –migration. In diesem Fall wird die Zellproliferation gesteigert, indem das veränderte Genprodukt des APC-Gens nun nicht mehr den Abbau des β-Catenins regulieren kann. Dadurch bindet β-Catenin vermehrt an den Tcf-Lef-Zellwachstumsfaktor (Friedrich and Behrmann, 2009) und fördert die Expression von WNT-Zielgenen, wie Cyclin D1, c-myc, CD44 und ephB2 (Schulenburg et al., 2007). Diese Zielgene verstärken wiederum die Zellproliferation (Friedrich and Behrmann, 2009). 1.2 Keratine bilden Intermediärfilamente Keratine gehören zu der Familie der Intermediärfilamente, die neben den Mikrotubuli und den Mikrofilamente für den Zusammenhalt eines Zellverbandes unerlässlich sind (Oshima, 2002). Dabei handelt es sich um zelluläre Phosphoproteine, die an ihren Amino- und Carboxyenden mittels Kinasen der unterschiedlichsten Kaskaden phosphoryliert werden. Die Art der Phosphorylierung ist abhängig von dem vorhandenen Keratintyp und der Zellart und bestimmt die Dynamik der Intermediärfilamente während des Zellzyklus (Fuchs, 1996). Die Gene für die Keratine befinden sich auf den Chromosomen 7 17q21.2 und 12q13.13 (Schweizer et al., 2006). Die großen Untergruppen der Intermediärfilamente bilden die sauren Typ I-Keratine (Keratine 9–23) (Kirfel et al., 2003), welche während der Apoptose von Caspasen gespalten werden (Oshima, 2002) und die neutralen bzw. basischen Typ II–Keratine (Keratine 18) (Kirfel et al., 2003), welche vor allem in den epithelialen Zellen vorhanden sind (Fuchs, 1996). Die Gruppe der Typ III-Keratine enthält Vimentin aus den mesenchymalen Zellen, Desmin in den Z-Scheiben der Muskulatur, Peripherin in den Neuronen und dem glial fibrally acidic protein (GFAP) aus den NeurogliaZellen (Fuchs, 1996). Die Besonderheit der Gruppe III liegt darin, dass sie neben den heteropolymeren auch homopolymere Intermediärfilamente ausbilden können. Zu den Typ IV–Keratinen zählen die Neurofilamente, α– Internexin, Syncollin und Nestin. Die Lamine werden als Typ V–Keratine zusammengefasst (Oshima, 2002). Keratinfilamente sind meistens Heteropolymere bestehend aus einem Typ I-Keratin und einem Typ II-Keratin (Fuchs, 1994). und bestimmen durch ihren spezifischen Aufbau die mechanische Eigenschaft einer Zelle (Yamada et al., 2002). Die Keratinketten besitzen einen Mittelteil mit vier α–helikalen Abschnitten, die durch nichthelikale Spacer voneinder getrennt sind und zum einem von einem Aminoende und zum anderen von einem Carboxyende umrahmt sind (Fuchs, 1994). Der α– helikale Teil ist bei den Isoformen der Keratine sehr ähnlich, während sich die Carboxy- und Aminoenden zwischen den Isoformen deutlich differenzieren. Die α–helikalen Mittelstücke zweier monomerer Keratinketten verflechten sich unter Wechselwirkungen von hydrophoben Aminosäuren zu einem Dimer mit coiledcoil Struktur in paralleler Ausrichtung, d.h. die Carboxyenden beider Monomere befinden sich auf derselben Seite des helikalen Mittelstückes (Theriot et al., 2004). Zwei Dimere formieren sich wiederum zu einem stabilen Tetramer in antiparalleler Weise, was die lösliche Untereinheit der Intermediärfilamente darstellt. Durch diese antiparallele Ausrichtung sehen beide Enden des Tetramers gleich aus. An den Enden können weitere Tetramere binden, indem die Amino- und Carboxygruppen interagieren und somit die Länge des Filaments bestimmen. Ein seitlicher Zusammenschluss von zwei zueinander versetzten Tetrameren wird als Protofilament, welches eine Dicke von 2-3 nm 8 aufweist, bezeichnet. Zwei dieser Protofilamente bilden wiederum durch seitliche Anlagerung zueinander die Protofibrille, mit einem Durchmesser von 4,5 nm. Letztendlich können vier Protofibrillen durch seitliche Interaktionen zur Ausbildung des Intermediärfilaments führen. Das 10 nm dicke Intermediärfilament besteht somit im Querschnitt aus acht Tetrameren, die schraubenartig angeordnet sind (Theriot et al., 2004). NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH NH2 A: Keratin-Monomer B: Keratin-Dimer in paralleler Ausrichtung C: Keratin-Tetramer in anti-paralleler Ausrichtung COOH COOH NH2 COOH NH2 D: Verlängerung des Keratin-Tetramers NH2 COOH NH2 COOH COOH NH2 NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH NH2 NH2 COOH COOH Abbildung 2: struktureller Aufbau eines Keratin-Tetramers (nach Theriot et al., 2004). Die Zellen können verschiedene Keratine exprimieren, die wiederum untereinander ein gemeinsames Netzwerk aufbauen können. Dieses Netzwerk, die Verlängerung und Quervernetzung von mehreren Intermediärfilamenten, ermöglicht die Stabilisierung einer Zelle und den Zusammenschluss des Zellverbandes. Durch Vernetzung von der Kernmembran zur Plasmamembran über Desmosomen und Hemidesmosomen ist die Stabilisierung einer Zelle ermöglicht (Lodish et al., 2001). Mutationen in den Keratinen können Auslöser für einige Erbkrankheiten sein. Tumorzellen verlieren häufig ihr ursprüngliches 9 Aussehen, sodass eine Identifikation ihres Ursprungs nicht mehr durch die Morphologie der Zelle ermöglicht ist. Allerdings bleiben in den Tumorzellen viele Differenzierungsmerkmale der ursprünglichen Zelle vorhanden, so dass man mittels einer immunhistologischen Erkennung spezifischer Intermediärfilamente den Ursprung –mesenchymales, epitheliales oder neuronales Gewebe- der Tumorzelle ermitteln kann (Schweizer et al., 2006). Anfänglich ist in epithelialien Karzinomen eine vermehrte Expression der Keratine 8 und 18 zu beobachten, die sich im Laufe der Zeit auf eine sekundäre Expression weiterer Keratine ausweitet. Hierzu zählen die Keratine 7, 19 und 20, die somit ebenfalls zur Differenzierung des Karzinom- Ausgangsgewebes verwendet werden können (Owens and Lane, 2002). Wachstum und Migration von Tumorzellen sind häufig von Keratinen abhängig, so konnte Chu zeigen, dass eine höhere Expression von Keratinen eine höhere Migrationsrate in Maus-L-Zellen bedeutet (Chu et al. 1993). Ebenfalls führen die Keratine 18 und 19 in retinalen Pigmentepithelzellen zur Aktivierung der Migration (Robey et al., 1992). Im Umkehrschluss hat Caulin feststellen können, dass sowohl in gesunden Zellen als auch in Tumorzellen eine Korrelation zwischen der Unterexpression von Keratin 8 und 18 und einer gesteigerten TNF-induzierten Apoptose herrscht (Caulin et al. 2000). 1.2.1 Keratin 23 Das humane Gen für Keratin 23 befindet sich auf dem Chromosom 17q21.2 und enthält den genetischen Code für das epitheliale Typ I-Keratin K23. Dieses Keratin 23 weist eine Größe von 1,65 kb mRNA, bestehend aus 422 Aminosäuren, auf und hat ein Gewicht von 48,1 kDa. Keratin 23 ist ein mit drei Serinresten phosphoryliertes Protein, welches bei insgesamt 28 Phosphorylierungsstellen 15 Möglichkeiten für eine Serin-Phosphorylierung bietet. Im Vergleich zu anderen bekannten Typ I-Keratinen sind ungefähr 45 % der Aminosäuren identisch, mit einer Ähnlichkeit im α–helikalen Mittelstück von etwa 84% zu den Typ I-Keratinen K12 bis K20. Wenn man die Keratine K12 bis K20 mit dem Keratin 23 vergleicht, so fallen besonderes die abweichenden Anfangs- und Endregion auf: Keratin 23 besitzt keine Wiederholung eines 10 Tetrapeptides bestehend aus Glycerin, Serin, Phenylalanin oder Tyrosin. Gleichzeitig fehlt bei Keratin 23 eine Sequenz eines Heptapeptides am Carboxyende. Keratin 23 besitzt die größte molekulare Ähnlichkeit zu den Keratinen K18 und K20. Im Prozess der Apoptose können die Typ I Keratine mittels Caspasen gespalten werden. So ist es bekannt, dass Keratin 18 erst mit der Caspase-6 in zwei Segmente gespalten wird, welche anschließend durch die Caspasen-3 und –7 weiter zerkleinert werden. Trotz der großen Ähnlichkeit von Keratin 23 zu Keratin 18 besitzt Keratin 23 eine gewisse Resistenz gegenüber der Caspase-3. In Adenokarzinomen des Kolons konnten zwei unterschiedlich große Formen des Keratins 23 nachgewiesen werden: zum einen 55 kDa große Keratine, die sich im Zytosol gruppieren und zum anderen 47 kDa große Keratine, die vorwiegend im Zytoskelett zu finden sind. Man nimmt an, dass diese Isoformen durch einen Spleißvorgang aus einem primären Transkript entstehen (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Rogers et al. konnten zeigen, dass die Expression von Keratin 23 in nicht-verhornenden Epithelzellen der Zunge, Haut, Mamma und Plazenta erhöht ist, während in den Zellen von Kopfhaut, Auge und Niere, Dickdarm, Lunge und Pankreas die Expression erniedrigt ist (Rogers et al., 2004). Vergleicht man Adenokarzinome mit gesunden Zellen des gleichen Organs, so findet man eine Überexpression von Keratin 23 in Karzinomen des Pankreas, Magens, Dünn- und Dickdarms sowie des Rektums (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Im gesunden mehrschichtigen Plattenepithel von Ösophagus und Appendix konnte kein Keratin 23 gefunden werden, hingegen ist Keratin 23 auch in der zellulären Membran von gesunder Magenschleimhaut nachweisbar. Eine Überexpression von Keratin 23 ist vor allem in Mikrosatelliten stabilen Kolonkarzinomen (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007) sowie in Adenokarzinomen Adenomen des Kolons zu beobachten (Sabates-Bellver et al., 2007). 11 und Tabelle 4: Expressionsverhalten von Keratin 23 (Sabates-Bellver et al., 2007, Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). relativ gesteigerte Expression von Keratin 23 Kolorektale Adenomzellen Adenokarzinom des Pankreas Adenokarzinom des Magens Lebermetastasen (Primärkarzinom: Kolon) Lymphknotenmetastasen (Primärkarzinom: Kolon) Keratin 23 wird in Zusammenhang mit der Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose gebracht. Es wird vermutet, dass bei einem zellulären Schaden die Expression von Keratin 23 gesteigert wird. Keratin 23 würde dann direkt oder indirekt verhindern, dass die Zellen in die mitotische Phase übergehen. Dies würde bedeutet, dass Keratin 23 als ein Tumor-Suppressor arbeiten würde. Interessanterweise ist diese Hypothese nicht in Zellen nachzuweisen, die einen Fehler in den Signalwegen der Apoptose haben. Hier kommt es trotz erhöhter Expression von Keratin 23 zur Proliferation der Zelle (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). 1.2.2 Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese Die Entstehung von Krebserkrankungen hat multifaktorielle Ursprünge (Weinberg, 2007). So ist ein Hauptgrund die Veränderung der Expression zellulärer Proteine basierend auf genomischer Instabilität. Diese genomische Instabilität wird bei Kolonkarzinomen in zwei Gruppen unterteilt. Zum einen die kleinere Gruppe, die sich durch instabile Mikrosatelliten (MSI) auszeichnet und zum anderen die größere Gruppe, die zwar stabile Mikrosatelliten (MSS) besitzt, aber auf chromosomaler Ebene instabil ist (CIN) (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Bei Mikrosatelliten handelt es sich um Wiederholungen kurzer, nicht kodierender DNA-Sequenzen, die mehrmals im Genom vorhanden sind. Eine Inaktivierung von Genen, die für das mismatch-repair System verantwortlich sind, führt zur Entstehung der Mikrosatelliten instabilen Zellen (Rupnarain et al., 2004). Auf Grund des Defektes im DNA-mismatch-repair System werden 12 während der Replikation entstandene Fehler nicht mehr erkannt und eine Verkürzung der Mikrosatelliten kann entstehen, was als Mikrosatelliten Instabilität bezeichnet wird. Die Mismatschreparaturdefizienz erhöht ferner die zufällige Mutationsrate in kodierenden Genen, die in Abhängigkeit des betroffenen Gens die Tumorgenese fördern können. Die Differenzierung der kolorektalen Karzinome in Mikrosatelliten instabile (MSI) oder Mikrosatelliten stabile (MSS) Tumore hat therapeutische Auswirkungen: Patienten mit MSI haben prognostisch günstigere Aussichten: zwar ist der Grad des Lymphozytenbefalls höher, aber es werden weniger Metastasen beobachtet. Dies mag daran liegen, dass die sogenannten Neoantigene Mikrosatelliten instabiler Tumorzellen mit dem Immunsystem interagieren. Hier ist das MHC-IMolekül vermindert, was wiederum dazu führt, dass diese Zellen häufiger vom Immunsystem attackiert werden (Weinberg, 2007). Bei der Karzinogenese chromosomal instabiler Zellen ist das Prinzip des „loss of heterozygosity“ von Bedeutung (Rupnarain et al., 2004). Dieses unterstützt den Prozess der biallelischen Inaktivierung von Tumorsuppressor-Genen häufig in Kombination mit einer Punktmutation im gesunden Allel (Kim et al., 2004). BirkenkampDemtroder et al. haben die Expression verschiedener Keratine in Mikrosatelliten stabilen und instabilen Kolonkarzinomen mit gesunder Kolonmukosa mittels Array-Versuchen verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass sieben Keratine im Kolonkarzinom anders exprimiert werden als in gesunder Kolonmukosa: eine Herabregulierung war bei den Keratinen 12, 20 und 24 zu finden, während eine Überexpression der Keratine 6B, 7, 17 und 23 zu beobachten war (BirkenkampDemtroder et al., 2007). Sabates-Bellver et al. konnten im Rahmen eines Arrays eine Überexpression von Keratin 23 in kolorektalen Adenokarzinomen nachweisen (Sabates-Bellver et al., 2007). Auffallend ist, dass die Expression von Keratin 23 in 78% Mikrosatelliten stabilen Kolonkarzinomen erhöht ist, während in der Mehrzahl der Mikrosatelliten instabilen Tumore eine unveränderte Expression von Keratin 23 gegenüber der gesunden Zelle nachweisbar ist. Mittels immunhistochemischen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass Keratin 23 gewöhnlicherweise im Zytoplasma lokalisiert ist, bei einer Überexpression, wie es bei Mikrosatelliten stabilen Zellen 13 zu sehen ist, befindet sich jedoch der Großteil des Keratins 23 im Golgi-Apparat. Da es sich bei Keratin 23 um ein Serin-phosphoryliertes Protein handelt, ist es notwendig, dass zur Phosphorylierung eine bestimmte Konzentration an cAMP – abhängigen Protein Kinasen vom Typ II-β vorhanden ist. Diese Kinase ist sowohl in Mikrosatelliten stabilen als auch instabilen Zellen vermindert nachweisbar, wobei die Konzentration in den Mikrosatelliten stabilen Zellen deutlich unter der in den instabilen Zellen liegt. In Mikrosatelliten stabilen Zellen korreliert eine hohe Expression von Keratin 23 mit einer geringen Expression seiner cAMP –abhängigen Protein Kinase vom Typ II-β. Dies führte zu der Annahme, dass Keratin 23 in den Mikrosatelliten stabilen Zellen nicht ausreichend phosphoryliert werden kann (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Eine gestörte Phosphorylierung der Intermediärfilamente führt in der Regel zur Apoptose der Zelle. Bei Zellen, die hingegen ihren G1-Kontrollpunkt im Zellzyklus verloren haben, können die Veränderungen in der Phosphorylierung zu Chromosomenalterationen führen, was die Bildung von chromosomal instabilen, also Mikrosatelliten stabilen, Zellen zur Folge hat (Izawa and Inagki, 2006). Zusammenfassend kann man sagen, dass eine Überexpression von Keratin 23 in kolorektalen Adenokarzinomen (Sabates-Bellver et al., 2007) und Mikrosatelliten stabilen Kolonkarzinomen (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007) gefunden wurde, was zu der Annahme führt, dass Keratin 23 in Verbindung mit der Kolonkarziongenese steht. 1.3 Die Apoptose Die Apoptose ist als der programmierte Zelltod bekannt und soll den Körper vor einer Proliferation von entarteten Zellen schützen, indem diese Zellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Zwei Wege können die Apoptose einleiten. Zum einen der extrinsische Weg signalisiert durch den TumorNekrose-Faktoren (TNF) mit seinen sogenannten Todesrezeptoren (Green, 2007) und dem Faktor TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) (Kiaris, 2006). Zum anderen der intrinsische mitochondriale Weg, der bei DNA-Schäden oder mangelhaften Lebenskonditionen der Zelle ausgelöst wird und über die 14 Apoptose-fördernden Mitglieder Cytochrom C stimuliert der (Krauss, BCl-2 2008). Familie Beide die Freisetzung von Signalwege haben als letztendliche Folge die Aktivierung der Caspasen (Eilers, 2009). Liegt in einer Zelle eine fehlerhafte Regulation der Apoptose vor, so kann es durch eine Inhibition der Apoptose zu einer unkontrollierten Proliferation der Zelle kommen, was wiederum die Entstehung eines Karzinoms begünstigt (Kuribayashi et al., 2006). 1.3.1 Die Caspasen Die Familie der Caspasen (engl. Cysteine-Containing Aspartate-Specific Proteases) (Weber, 2007) zeichnet sich durch einen Cysteinrest im aktiven Zentrum aus, der Proteine hinter ihren Aspartatresten spaltet und somit inaktivieren kann. Die Caspasen liegen intrazellulär als nicht aktivierte Proenzyme vor und werden in drei unterschiedliche Funktionsgruppen unterteilt. Die erste Gruppe beinhaltet die Initiatorcaspasen mit langen Prodomänen, die Caspasen-2, -8, -9 und -10 (Majerciak et al., 2010), die durch eine Dimerisierung in Gegenwart von Adapterproteinen aktiviert werden und durch autokatalytische Prozesse umgewandelt werden. Die Initiatorcaspasen regulieren schließlich die zweite Gruppe, die Effektorcaspasen, zu welchen die Caspasen-3, -6 und -7 gehören (Eilers, 2009), die eine kurze Prodomäne enthalten (Majerciak et al., 2010). Molekularbiologisch unterschieden sich die diese beiden Gruppe durch die Länge einer N-terminalen Prodomäne, die bei den Initiatorcaspasen ungefähr 90 Aminosäuren enthält, während die Effektorcaspasen maximal 20 Aminosäuren aufweisen. Die dritte Gruppe enthält die Caspasen-1, -4, -5, -11, -12, -13 und -14 und erfüllt Aufgaben in den Entzündungsreaktionen der Zelle (Krauss, 2008). Die Caspasen -1 bis -3 und -6 bis -8 entstehen über alternatives Spleißen aus einem gemeinsamen Transkript (Weber, 2007). Die Aktivierung der Caspasen-3 und -7, die insbesondere für die Regulation der mitochondrial initiierten Apoptose verantwortlich sind (Lakhani et al., 2006), erfolgt mitunter über die Initiatorcaspase-9. Hierbei spaltet die Caspase-9 in der Effektorcaspase ein Aspartat, welches eine α- und eine βUntereinheit voneinander trennt. Diese zwei Untereinheiten bilden anschließend 15 ein Heterodimer mit dem für die Apoptose notwendigen Cystein-haltigen aktiven Zentrum (Krauss, 2008). Während der Apoptose werden sowohl zytoplasmatische und nukleäre Proteine (Korfali et al., 2004) als auch DNA durch die Caspase-3 gespalten. Hingegen ist die Caspase-7 für die Spaltung von Faktoren, die für die Signalkaskade der Apoptose benötigt werden, verantwortlich (Weber, 2007). 1.4 Signalwege der Zelle 1.4.1 Der Tumornekrose-Faktor TNF-α und -Rezeptor Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist ein aus 157 Aminosäuren bestehendes Homotrimer, welches hauptsächlich in den Makrophagen synthetisiert wird (Weber, 2007). TNF ist sowohl für die Vermittlung der Apoptose und der inflammatorischen Reaktionen einer Zelle (Krauss, 2008) als auch für das Tumorwachstum, welches in experimentellen Zellmodellen nachgewiesen werden konnte, verantwortlich (Karin, 2006). Der TNF-Rezeptor 1 gehört zu der Gruppe der Todesrezeptoren, zu welcher auch der FAS- Rezeptor (CD95 / APO1) und der TRAIL- Rezeptor (TRAIL-R1, -R2 auch DR4 und DR5 genannt), sowie die Rezeptoren DR3 und DR6 zählen (Green, 2007). Die TNF-Rezeptoren kennzeichnen sich durch homologe extrazelluläre cysteinhaltige Domänen aus, welche durch die pre-ligand-bindung assembly domain (PLAD) zu einem Rezeptor-Trimer zusammengefügt werden (Weber, 2007) und über ihre intrazellulären N-terminalen Endungen interagieren (Krauss, 2008). Bindet nun TNF an die TNF-Rezeptoren 1 oder 2, werden verschiedene Signalwege aktiviert, wobei der TNF-Rezeptor 1 die meisten Signalwege vermittelt. Hierzu gehört die Regulation der Expression von NF-κB (Kirillova et al., 1999) und die Auslösung apoptotischer sowie auch anti-apoptischer Effekte innerhalb der Zelle (Green, 2007). 16 Im sogenannten canonical Signalweg wird durch die Bindung des Liganden der intrazelluläre Inhibitor Silencer of DD (SODD) vom TNF-Rezeptor 1 freigegeben (Krauss, 2008). An die nun freie DD-Bindungsstelle des TNF-Rezeptors 1 adaptiert das Protein TNF Receptor Associated Death Domain (TRADD) als Dimer. An dieses TRADD-Dimer binden verschiedene Proteine wie das receptorinteracting protein 1 (RIP1) und der TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) als Dimere und bilden den Komplex I. TRAF2 kann nun die Aktivierung von NFκB fördern (Green, 2007), indem die IκB-Kinase aktiviert-wird (Weber, 2007). Der Komplex I dissoziiert nach einiger Zeit von dem TNF-Rezeptor 1 und bindet anschließend zwei Proteine Fas-associated Via Death-Domain (FADD). Daraufhin können zwei Procaspasen-8 an FADD binden und somit den Komplex II bilden, welcher zur Aktivierung der Caspase-8 und schließlich auch zur Einleitung der Apoptose führt (Karin, 2006). Die Verknüpfung der beiden Signalwege zeigt, dass in Abhängigkeit von verschiedenen Adapterproteinen eine pro-apoptotische, anti-apoptotische oder anti-inflammatorische Reaktion der Zelle ausgelöst wird (Krauss, 2008). So wird bei einer Bindung von TNF an den TNF-Rezeptor 1 bei schon bestehender Aktivität von NF-κB der Weg der Apoptose über FADD eingeleitet, während bei einer Inaktivität von NF-κB dieses aktiviert wird und NF-κB daraufhin als Transkriptionsfaktor die Apoptose blockiert (Green, 2007) Abhängig vom Zelltyp kann TNF über eine Interaktion mit dem TNF-Rezeptor 1 auch die Nekrose der Zelle einleiten. Dabei wird in einer Signalkaskade über RIP1 und dem Adapterprotein TRAF2 die NADPHOxidase NOX1 aktiviert, welche wiederum freie Sauerstoffradikale produziert. Diese freien Sauerstoffradikale sind essentiell für die weitere Vermittlung, da sie über eine Aktivierung der poly-ADP-ribose-Polymerase 1 (PaRP1) und der cJunN-terminalen Kinase (JNK) zu fehlerhaften Funktionen der Mitochondrien führen und somit die Nekrose einleiten (Eilers, 2009). 17 TNF-α TNF-Rezeptor 1 extrazellulär DD intrazellulär TRADD RIP1 Komplex I TRAF2 FADD NFκB Komplex II Caspase 8 Abbildung 3: Model des Signalweges von TNF-α. Der Ligand TNF-α kann über den Komplex I den Transkriptionsfaktor NF-κB oder weiter über Komplex II die Caspase-8 aktivieren (nach Green, 2007). 1.4.2 Der Transkriptionsfaktor NF-κB Mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB sind sowohl pro- als auch anti-apoptotische Wirkungen, abhängig vom Zelltyp, möglich (Pahl, 1999). In Tumorzellen wird eine Aktivierung von NF-κB mit der Proliferation, der Steigerung des Zellzyklus und der Zellmigration sowie der Inhibition der Apoptose verbunden (Tabruyn, 2008). Eine Unterbrechung des NF-κB Signalweges hat die Einleitung der Apoptose zur Folge (Thomas et al., 2005). Die Familie der NF-κB/Rel-Proteine enthält folgende Proteine: p50 mit dem Vorläufer p105 (nfkb1), p52 mit seinem Vorläufer p100 (nfkb2), RelA (p65), RelB und c-Rel (Demchenko and Kuehl, 2010). Diese Proteine zeichnen sich durch eine gemeinsame N-terminale DNA-bindende Rel homologe Domäne (RHD) aus (Schumm et al., 2006), die als DNA-Bindungsstelle fungiert. Die unterschiedlichen Rel-Mitglieder binden an verschiedene Enhancer zur Initiation der Transkription ihrer Zielgene (Heusch et al., 1999). RelA, RelB und c-Rel besitzen zusätzlich die C-terminale Domäne TAD (transcriptional activation 18 domain), die die Transkription der Zielgene aktiviert (Daigeler et al., 2008). Der Transkriptionsfaktor ist immer als Hetero- oder Homodimer aufgebaut, abhängig von seiner Zusammensetzung werden unterschiedliche DNA- Bindungsstellen genutzt (Kucharczak et al., 2003). Es sind theoretisch 15 Kombinationen des Dimers möglich, da allerdings die Kombinationen RelB/c-Rel und RelB/RelB in vivo nicht zu beobachten sind, sind derzeit nur 13 Möglichkeiten für Dimere in vivo bekannt (Cheong and Levchenko, 2005). Am häufigsten ist in den intestinalen Epithelzellen das Heterodimer p50/RelA nachzuweisen, welches auch als potentestes Heterodimer dieser Familie zählt (Jobin and Sartor, 2000). NF-κB kann über verschiedene Wege aktiviert werden. Die zwei wichtigsten Wege werden im Folgenden erläutert: im klassischen Signalweg (canonical pathway) ist NF-κB im inaktiven Zustand an einen Inhibitor der IκB-Familie im Zytoplasma gebunden (Xiao, 2004). Über eine Signalkaskade von extrazellulären Faktoren wie TNF-α oder IL-1 wird die IκBKinase, bestehend aus den katalytischen Domänen IKK-α und IKK-β sowie der regulatorischen Domäne IKK-γ, aktiviert und kann anschließend den Inhibitor IκB über eine Phosphorylierung für den Abbau durch Proteasen zugänglich machen (Tabruyn and Griffioen, 2008). Über die Proteine Importin α und β kann der freie Transkriptionsfaktor NF-κB nun in den Zellkern diffundieren (Green, 2007), mit Enhancern reagieren und an speziellen DNA-Bindungsstellen durch zusätzliche Bindung einer RNA-Polymerase die Transkription initiieren (Tabruyn and Grffiouen, 2008). 19 TNF-α IκB-Kinase P NFκ P P NFκ NFκ B P IκB NFκ B NFκB NFκB B B Abbildung 4: Aktivierung von NF-κB. TNF-α vermittelt die Aktivierung der IκBKinase, welche wiederum über eine Phosphorylierung des NF-κB Inhibitors IκB, den Transkritpitonsfaktor NF-κB aktiviert (nach Krauss, 2008). Neben diesem klassischen Signalweg ist für die Aktivierung von NF-κB auch ein alternativer Weg (non-canonical pathway) mit der spezifischen Aktivierung des Heterodimers p52/RelB über das Homodimer IKK-α bekannt (Xiao, 2004). Dieser Weg ist vor allem während der B-Zell-Reifung in sekundären lymphatischen Organen nachweisbar (Karin, 2006). Die Aktivierung von NF-κB kann sowohl über körpereigene Mediatoren als auch über physikalischen Stress oder Umweltbedingungen eingeleitet werden (Pahl, 1999). Tabelle 5: Auszug einiger Verstärker der Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB (nach Pahl, 1999). Verstärker der Aktivität von NF-κB Cytokine IL-1 IL-2 IL-12 TNF-α Apoptotische Mediatoren Anti-Fas/ Apo-1 Trail 20 Verstärker der Aktivität von NF-κB Physikalischer Stress UV-A, -B, -C γ-Strahlung Umweltbedingungen Zigarettenrauch NF-κB fördert die Transkription von ungefähr 150 Genen (Pahl, 1999). Die Bindungsstelle für NF-κB ist in den Zielgenen nahezu identisch und enthält die Codierung 5‘-GGGRNNYYCC-3‘ mit G=Guanin, R=Adenin oder Guanin, N=beliebiges Nukleotid, Y=Thymin oder Cytosin und C=Cytosin (Cheong and Levchenko, 2005). Tabelle 6: Auszug einiger Zielgene des Transkriptionsfaktors NF-κB (nach Pahl, 1999). Zielgene von NF-κB Cytokine / Chemokine IL-1α / -1β IL-2 IL-12 TNF-α TNF-β Mediatoren der Apoptose Bcl-xL Fas / Fas-Ligand Transkriptionsfaktoren c-myc c-rel IκBκ NF-κB1 NF-κB2 P53 Diverses Cyclin D1 Keratin K3 Eine Überexpression der Rel-Proteine fördert die Transformation einiger Onkogene (Karin, 2006). Da NF-κB auch die Transkription von seinem Inhibitor 21 IκB fördert, unterliegt es einem negativen Rückkopplungsmechanismus (Pahl, 1999). 1.4.3 Das Protoonkogen c-myc Das auf dem Chromosom 8 (8q24) liegende Gen MYC kodiert für das zelluläre Proto-Onkogen c-myc, welches für die Proliferation der Zelle unentbehrlich ist (Weber, 2007). Innerhalb des Gens befinden sich drei Promoterregionen und in Abhängigkeit von dieser werden unterschiedlich lange Proteine exprimiert: cmyc, das längere Protein p67 Myc oder das kürzere Protein MycS (Gardner et al., 2002). Das Protein c-myc gehört zu der Gruppe der basischen helix-loophelix Transkriptionsfaktoren und bildet mit einem Transkriptionsfaktor der gleichen Gruppe, dem Max-Protein, ein Heterodimer. Nur dieses Heterodimer kann an die Enhancer-Box der Zielgene binden und über eine Interaktion mit dem TATA binding protein die Transkription der Zielgene initiieren (Weber, 2007). In einer gesunden Zelle steht die Förderung der Transkription der DNA im Gleichgewicht zur Repression der Transkription, indem Max sowohl in dem Transkriptionsfaktor Myc-Max als auch in den Repressoren Max-Mad oder MaxMxi-1 Teil des Heterodimers ist (Krauss, 2008). max max max max c-myc mad Mxi-1 Repression der Transkription Aktivierung der Tanskription von Zielgenen Abbildung 5: regulierende Funktion von Max auf Transkriptionsebene (nach Krauss, 2008). In gesunden Zellen wird die Expression von c-myc positiv über NF-κB (Kessler et al., 1992), den eukaryontischen Initiationsfaktors 4F (eIF4F) (Stoneley et al., 22 2000) und andere Wachstumsfaktoren stimuliert. Diese Zunahme bleibt beim Durchlaufen des Zellzyklus konstant und kehrt innerhalb der entstandenen Tochterzellen zum ursprünglich niedrigeren Wert zurück (Gardner et al., 2002). Eine Überexpression von c-myc ist in humanen Karzinomzellen häufig zu beobachten und spielt eine wichtige Rolle in der Karzinogenese (Liu et al., 2008). Dies hat zur Folge, dass sich das Gleichgewicht der Heterodimer-Bildung mit Max zugunsten des Heterodimers Myc-Max verschiebt. Dadurch werden die Zielgene, die für die Proliferation der Zelle, verantwortlich sind, unreguliert exprimiert (Krauss, 2008). Daneben verhindert eine Überexpression von c-myc die Reparatur von Brüchen in der doppelsträngigen DNA, sodass vermehrt chromosomale Brüche, Fusionen und Translokationen auftreten können (Karlsson et al., 2003) und eine genomische Instabilität entstehen kann (Gardner et al., 2002, Dang, 1999). Eine erhöhte Expression von c-myc ist bisher in folgenden Krebserkrankungen bewiesen worden: Leukämie und Karzinome der Mamma, der Lunge, des Magens und des Kolons, Neuroblastome und Glioblastome (Weber, 2007). Jedoch korreliert die Expression von c-myc nicht signifikant mit dem pathologisch-histologischem Grad der Karzinome (Liu et al., 2008). Im Mausversuch konnten Sinn et al. zeigen, dass bei zeitgleicher Überexpression von c-myc und ras die Karzinogenese beschleunigt verläuft (Sinn et al., 1987). Man nimmt an, dass c-myc unter anderem für den Eintritt der Zelle in den Zellzyklus verantwortlich ist, indem es die Expression der Cycline D1, D2 und E induziert (Gardner et al., 2002). Eine unregulierte Expression von c-myc korreliert mit einer erhöhten Expression von Cyclin A und E (Dang, 1999). Es wird vermutet, dass eine Überexpression von c-myc zur Unterdrückung der Kontrollpunkte während des Zellzyklus führt und somit auch eine Fortführung des chromosomalen Schadens ermöglicht. C-myc fördert somit die Karzinogenese, indem es eine unkontrollierte Proliferation bei gleichzeitig gehemmter Differenzierung der Zelle und genomischer Instabilität unterstützt (Karlsson et al., 2003). Neben den proliferations-fördernden Effekten kann cmyc in Interaktion mit den anti-apoptotischen Proteinen Bcl-2 oder Bcl-xL die Tumorentstehung durch eine Blockierung der Apoptose antreiben (Green, 2007). 23 1.4.4 Die Bcl-2 Familie Die Bcl-2 Familie wird in drei funktionelle Gruppen unterteilt, die sich in ihrer Struktur jeweils ähneln: eine anti-apoptotische wirkende Gruppe, eine proapoptotische Gruppe und eine gemischte Gruppe mit Aktivatoren und Derepressoren (Green, 2007). Tabelle 7: funktionelle Gruppen der Bcl-2 Familie (nach Green, 2007; Weber 2007). anti-apoptotische Proteine Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1, A1, Boo (DIVA), NR13 pro-apoptotische Proteine Bax, Bak, Bok/Mtd Aktivatoren & Derepressoren Bid, Bad, Bim, Bmf, Bik, Hrk/DP5, Blk, Nip3, Bnip3/Nix, Puma, Noxa Die Domänen Bcl-2 homolog BH1 bis BH3 sind für die Ausbildung von Homound Heterodimeren verantwortlich, während das N-terminal gelegene BH4, welches nur in der anti-apoptotischen Gruppe vorkommt, die Interaktion mit Apoptose regulierenden Proteinen wie RAF-1 und BAD ermöglicht (Weber, 2007) und die Struktur des Proteins stabilisiert (Carré and Braguer, 2008). Die anti-apoptotische Gruppe besitzt neben den vier Domänen BH1 bis BH4 auch eine zusätzliche C-terminale hydrophobe Struktur zur transmembranen Bindung (Krauss, 2008). anti-apoptotische Proteine Pro-apoptotische Proteine Aktivatoren und Repressoren BH1 BH2 BH3 BH4 transmembrane Domäne Abbildung 6: struktureller Aufbau der Bcl-2 Familie (nach Krauss, 2008). 24 Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 wurde erstmals am chromosomalen Bruchpunkt einer Translokation der Chromosomen 14 und 18 in follikulären BZell-Lymphomen entdeckt (Krauss, 2008). Die Transkription der anti- apoptotischen Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL wird unter anderem durch ErbB2 (Weber, 2007) und dem Transkriptionsfaktors NF-κB gefördert (SchulzeBergkamen et al., 2008; Daigeler et al., 2008). Bcl-2 und Bcl-xL blockieren die Apoptose, indem sie die Freisetzung von Cytochrom c aus der mitochondrialen Membran verhindern (Lomonaco et al., 2009). Ferner wirkt Bcl-2 am Übergang der G1- zur S-Phase im Zellzyklus (Fernandez et al., 2002). Die proapoptotische Gruppe ist durch die Domänen BH1 bis BH3 aufgebaut (Krauss, 2008) und überwiegend im Zytoplasma zu finden (Conus et al., 2000). Die bekanntesten Vertreter der pro-apoptotischen Gruppe - Bax und Bak - sind mitunter für die Signalkaskade der mitochondrialen Apoptose verantwortlich und vermitteln nach einer Ablösung von ihren Inhibitoren Mcl-1 und Bcl-xL (Conus et al., 2000) die Freigabe von Cytochrom c aus dem Mitochondrium. Die Proteine Puma und Bad können ihre pro-apoptotische Funktion durch eine Inhibition der anti-apoptotisch wirkenden Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL ausüben (Lomonaco et al., 2009). Die Gruppe der Aktivatoren und Derepressoren, auch BH3-Proteine genannt, hat im Aufbau nur die Domäne BH3 gemeinsam (Green, 2007). Diesen Proteinen wird eine Funktion in der Modulation der Apoptose, vermittelt durch Zellstress, zugesprochen. Durch eine Bindung an die Domäne BH3 der anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL werden diese Proteine gehemmt und gleichzeitig kann das pro-apoptotische Bax aktiviert werden, um die Apoptose einzuleiten. Die BH3-Proteine stehen selbst unter der Kontrolle verschiedener Regulatoren, damit nicht ein unberechtigter Zelltod ausgelöst wird (Krauss, 2008). Auf der Transkriptionsebene wird die Expression der BclFamilie reguliert. Die Expression der anti-apoptotischen Mitglieder wird über Cytokine (Weber, 2007) und den Transkriptionsfaktor NF-κB positiv beeinflusst. Der Tumor-Suppressor p53 fördert die Expression der pro-apoptotischen Proteine (Lomonaco et al., 2009). 25 1.4.4.1 Der anti-apoptotische Faktor Bcl-2 Die Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL verhindern eine Apoptose der Zelle bei DNASchäden (Lomonaco et al., 2009). Die Proteine Bcl-2 und Bcl-xL stimmen zu etwa 43% in der Aminosäurenstruktur und der C-terminalen hydrophoben Region, die zur Membranbindung dient, überein. Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 ist im Mitochondrium, im endoplasmatischen Retikulum und in der Kernhülle vorzufinden. (Fiebig et al., 2006). Eine Überexpression von Bcl-2 wird mit dem Voranschreiten der Karzinogenese in Verbindung gebracht und wurde u.a. vermehrt in Tumoren der Brust, in hepatozellulären Karzinomen und in follikulären Schilddrüsenkarzinomen nachgewiesen (Poincloux et al., 2009). In kolorektalen Adenomen wurde gegenüber invasiven Tumoren eine höhere Expression von Bcl-2 gemessen (Poincloux et al., 2009). 1.4.4.2 Der anti-apoptotische Faktor Bcl-xL Der Faktor Bcl-xL ist in der Kernhülle, an der Zellmembran, im Mitochondrium und auch im Zytosol lokalisiert (Fiebig et al., 2006). Das Protein Bcl-xL, vom Gen Bcl-x kodiert, kann bei Verankerung in der Mitochondrienmembran durch eine Blockade der intrazellulären Transporter die Permeabilität kontrollieren (Zhang et al., 2008) und den Einstrom von pro-apoptotischen Moleküle verhindern, so dass keine Apoptose mehr eingeleitet werden kann (Weber, 2007). Eine erhöhte Expression von Bcl-xL konnte bisher in vielen Karzinomen nachgewiesen werden. Hierzu gehören Karzinome der Mamma, Ovarien und der Lunge, hepatozelluläre Karzinome und Gliome (Zhang et al., 2008) sowie das Prostata-Karzinom (Weber, 2007). Die Überexpression von Bcl-xL korreliert mit der Tumorprogression, der Prognose und der Resistenz gegenüber einer Chemotherapie (Schulze-Bergkamen et al., 2008). In follikulären Lymphomen konnte die erhöhte Expression von Bcl-xL mit einer Erniedrigung der Apoptoserate in Verbindung gebracht werden (Zhao et al., 2004). Nahezu 60 % der kolorektalen Karzinomen weisen eine Überexpression von Bcl-xL auf (Wacheck et al., 2003), hier korreliert die Expression von Bcl-xL mit dem pathologisch-histologischen Grad der kanzerogenen Zelle, dem Lymphknotenbefall und der Dukes Klassifikation des Tumors. Vor allem die 26 Zusammenhänge zur Dukes Klassifikation und zum pathologischen Histologiebefund lassen darauf schließen, dass Bcl-xL maßgeblich bei der Entwicklung und Invasion der Krebszellen mitwirkt (Zhang et al., 2008). 1.4.4.3 Die Bcl-2 Mitglieder regulieren die Apoptose In den Mitochondrien wird die Apoptose ausgelöst, wenn es zu einem Mangel an Wachstumsfaktoren, zur Aktivierung von den Todesrezeptoren oder zum DNA-Schaden in der Zelle kommt. Über diese Signalwege werden unterschiedliche pro-apoptotische Bcl-Proteine aktiviert, die dann entweder in die Mitochondrien translozieren oder eine Veränderung der äußeren Mitochondrien-Membran bewirken. Beides resultiert in der Freisetzung von Cytochrom c und somit auch in der Aktivierung von Caspasen (Krauss, 2008). Bei einer erniedrigten Expression von Bcl-xL kommt es über eine Erhöhung des Proteins Bax zur Initiation der Apoptose (Zhang et al., 2008). Eine Erhöhung von Bcl-xL führt zur Unterdrückung der Ausschüttung von mitochondrialen Cytochrom C ins Zytosol und hemmt somit die Apoptose (Schoop et al., 2004). Auch eine erhöhte Konzentration von der Casein Kinase II verhindert die Apoptose in Krebszellen, indem es zum einen die Caspase-8 stoppt und zum anderen die NF-κB abhängige Expression von Bcl-xL und c-Flip fördert (Ravi and Bedi, 2002). Ebenso verhindert der Faktor Bcl-2 die Apoptose einer Zelle, indem es die mitochondriale Apoptoseinduktion inhibiert (Zhao et al., 2004). Das Zusammenspiel zwischen c-myc und Bcl-2 ist eines der nachweisbaren Interaktionen in der Karzinogenese (Green, 2007). 27 häufigsten 2. Ziel der Arbeit In der Karzinogenese einiger Krebserkrankungen spielen Keratine eine wichtige Rolle (Schweizer et al., 2006). Publizierte Daten belegen, dass Keratin 23 während der kolorektalen Karzinogenese durch eine erhöhte Expressopn sowohl ini kolorektalen Karzinomen (Rogers et al., 2004) als auch in Adenomen auffallen (Sabates-Bellver et al., 2007). Um die Bedeutung und Funktion von Keratin 23 in der frühen kolorektalen Karzinomentwicklung analysieren zu können, sollte in einem Adenomzellkulturmodell mit der Zelllinie LT97 die Expression von Keratin 23 mittels eines supprimiert lentiviralen werden. shRNA Anschließend Vektorsystems sollte die (pLKO Keratin shKRT23-1506) 23 supprimierte Adenomzelllinie einer golbalen Genexpressionsanalyse unterzogen werden und identifizierte Genexpressionsveränderungen in ausgewählten Signalwegen näher charakterisiert werden. Ziel dieser Analysen ist es mögliche Einflüsse der Keratin 23 Expression auf tumorbiologisch identifizieren. 28 relevante Signalwege zu 3. Methoden 3.1 Zellbiologische Methoden 3.1.1 Die Adenomzelllinie LT97 Die epitheliale Zelllinie LT97 stammt aus kolorektalen Mikroadenomen von Patienten, die unter der familiären adenomatösen Polyposis (FAP) leiden (Schulenburg et al., 2007). Charakteristisch für den früh-malignen Genotyp der Adenomzelllinie LT97 ist das verkürzte APC-Protein. Dieses lässt sich auf eine Mutation beider APC Tumor-Suppressor-Gene zurückführen, die auch als genetischer Defekt bei FAP-Patienten zu finden ist (Richter et al., 2002). Dadurch weist die Adenomzelllinie LT97 einen aktivierten WNT-Signalweg auf (Schulenburg et al., 2007). Zudem hat diese Adenomzelllinie eine Mutation im Ki-ras Onkogen, was ebenfalls in 50% aller kolorektalen Tumore nachzuweisen ist (Richter et al., 2002). Diese Defekte fördern das Wachstum einer Zelle bei gleichzeitiger Verminderung der Apoptose. Mauritz et al. konnten zeigen, dass die Zugabe von PGE2 zur Zellkultur von LT97 zu einer erhöhten Expression von COX-2 führt, was in den meisten Fällen des kolorektalen Karzinoms nachweisbar ist und mittlerweile zu einem Ziel der Chemotherapie wurde (Mauritz et al., 2006). Ebenso führt eine Zugabe von Linolsäure-Hydroperoxid (LOOH) zur vermehrten Synthese von COX-2 (Jurek et al., 2004), was eine Verminderung der Apoptose durch gleichzeitige Förderung der Expression von Bcl-2 bewirkt (Weber, 2007). Auf Grund der genetischen Veränderungen gehört die Adenomzelllinie LT97 zu der Gruppe der chromosomal instabilen, also Mikrosatelliten stabilen, Zellen (Aoki and Taketo, 2007). Somit ist die Adenomzelllinie LT97 geeignet, um im Modell die Auswirkung der Keratin 23 Expression in der frühen Kolonkarzinogenese zu untersuchen. 3.1.2 Herstellung des speziellen Nährmediums für die Adenomzellen LT97 Für die Zellhaltung benötigt die Adenomzelllinie LT97 ein spezielles Nährmedium, da sie zum einen sehr empfindlich ist und zum anderen sehr 29 langsam wächst. Richter et al. haben zeigen können, dass das Wachstum vor allem durch den epidermalen Wachstumsfaktor EGF, Insulin und den hepatozytären Wachstumsfaktor HGF, welcher den größten Wachstumseffekt ausgelöst hat, positiv beeinflusst werden kann. Diese Zugaben ermöglichen es, dass die Zellverteilung innerhalb des Zellzyklus annähernd konstant bleibt (Richter et al., 2002). Ein spezielles Medium, bestehend aus einem modifizierten Standardmedium mit speziellen Zusätzen und einem Fibroblasten konditionierten Medium, wurde für die Adenomzelllinie hergestellt. Für das modifizierte Standardmedium wurde F12-Medium mit 2% fetalem Kälberserum (FCS) und Natrium-Pyruvat, L-Glutamin sowie Penicillin und Streptomycin (siehe Tab.9) versetzt. Tabelle 8: Zusätze für das modifizierte Standardmedium. Die Angaben beziehen sich auf ein Volumen von 500ml F12-Medium. Zusatz Menge (ml) Natrium-Pyruvat (100mM) 5 L-Glutamin (200mM) 6 Penicillin (5.000units/ml) 12 Streptomycin (5.000μg/ml) Zu dem modifizierten Standardmedium wurden anschließend die speziellen Zusätze für die Adenomzellen hinzugefügt (siehe Tab. 10). Tabelle 9: Konzentrationsangaben der speziellen Zusätze. Besondere Zusätze Insulin Konzentration 10μg/ml Natrium-Selenit 5mM Trisidol -L- Thyronin 0,2mM Hydrocortison 1μg/ml Transferrin 2μg/ml EGF 30ng/ml 30 Um das Fibroblasten konditionierte Medium zu gewinnen, wurden Mic307-4 Zellen auf 10 cm Schalen mit DMEM 10% FCS ausgesät und bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Bei einer Zellkonfluenz von nahezu 100% wurde das Medium mit 5ml DMEM 10% FCS sowie 5ml F12 Hams 2%FCS ausgetauscht. Nach zwei weiteren Tagen der Inkubation unter oben genannten Bedingungen wurde das Medium von den Zellen mittels einer Messpipette entnommen und steril filtriert. Die auf den 10 cm Schalen verbliebenen Mic307-4 Zellen wurden erneut mit DMEM 10% FCS und F12 Hams 2% FCS versetzt, um eine zweite sterile Ernte des konditionierten Mediums zu erhalten. Das spezielle Nährmedium für die Adenomzelllinie LT97 bestand schließlich aus einem Gemisch von 2/3 Standardmedium mit speziellen Zusätzen und 1/3 Fibroblasten konditioniertem Medium. 3.1.3 Mediumwechsel Ein Wechsel des speziellen Nährmediums findet in Abhängigkeit vom Phänotyp der Adenomzelllinie und der Verfärbung des Mediums statt. Hierbei wurde das Medium der Adenomzellen von der 10cm Platte abgesaugt und diese wurden auf den 10cm Schalen einmal mit 2ml PBS gespült. Nachfolgend wurde erneut 10ml des speziellen Nährmediums der Adenomzelllinie LT97 auf den Schalen verteilt und die Zellen wurden wieder im Inkubationsschrank bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. 3.1.4 Splitten der Adenomzellen LT97 Zellen werden gesplittet, wenn ihre Konfluenz auf einer Schale so hoch ist, dass sie in ihrem Wachstum eingeschränkt sind. Das Verfahren der Zellsplittung wird auch genutzt, um Zellen einer Schale auf mehrere Schalen zu verteilen. Beim Splitten sollten die Zellen auf einer Schale mindestens eine Konfluenz von 60% aufweisen, da sonst nach einem Splitten ein Absterben der Zellen aufgrund einer zu geringen Zelldichte möglich ist. Beim Splitten der Adenomzellen LT97 wurde zuerst das spezielle Nährmedium aus der 10cm Schale abgesaugt und die auf der Schale verbliebenen Adenomzellen wurden einmal mit 2ml PBS gespült, welches direkt wieder 31 abgesaugt wurde. Im nächsten Schritt wurden auf die 10 cm Schalen 3 ml PBS mit 5mM EDTA pipettiert und die Adenomzellen wurden für zehn Minuten bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Danach wurden drei Tropfen Trypsin/EDTA hinzugefügt und die Zellen wurden erneut für ungefähr drei Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Lösung auf den Platten mit 7ml Medium (DMEM 10% FCS) resuspendiert und in 50ml Falcon-Tubes überführt. Die Falcons wurden drei Minuten bei 1500rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Im letzten Schritt wurde der Überstand aus den Falcons verworfen und die am Boden des Falcons haftende Zellen wurden mit 10ml des speziellen Nährmediums versetzt und anschließend auf neue 10cm Schalen verteilt. 3.1.5 Zellzählung Um eine gewünschte Konzentration der Adenomzellen auf den Platten verteilen zu können, müssen die Zellen gezählt werden. Zur Zellzählung verwendet man die Neubauer-Zählkammer, welche eine etwa 30mm x 80mm große Glasplatte ist, auf der sich vier quadratische Felder befinden. Jedes quadratische Feld ist noch einmal in 16 Quadrate unterteilt. Während des Splittens der Adenomzellen können diese problemlos gezählt werden. Hierfür wurde das Zellpellet nach dem Zentrifugieren in 10ml speziellem Nährmedium aufgenommen, 25μl wurden in einem Eppendorf Tube mit 475μl Medium gemischt, was eine Verdünnung von 1:20 ergibt. Aus dieser Verdünnung wurden nun 10μl auf die Neubauer-Zählkammer pipettiert. Beim Zählen wurde jedes Viertel der Neubauer-Zählkammer einzeln betrachtet. Es wurden jeweils die Adenomzellen in den 16 kleinen Quadraten sowie Zellen, die sich auf der linken oder unteren Abgrenzung der großen Quadrate befinden, unter dem Lichtmikroskop gezählt. Anschließend wurde der Mittelwert der gezählten Zellen errechnet. Die gezählten Zellen sollten pro Viertel nicht eine Zellzahl von 30 unter- oder eine Zahl von 150 überschreiten, da in diesen Fällen die Zellzählung ungenau wird. 32 3.1.6 Transfektion der Adenomzelllinie LT97 mittels eines lentiviralen shRNA Vektorsystems Um die Expression von Keratin 23 in der Adenomzelllinie zu supprimieren, wurde ein lentivirales shRNA Vektorsystem in die Adenomzellen eingeschleust, welches über das Transgen pLKO shKRT23-1506 die Expression von Keratin 23 reduziert. Hierzu wurde die Adenomzelllinie LT97 in drei Gruppen aufgeteilt: Die erste Gruppe wurde mit dem Transgen pLKO puro LV transduziert, was die Leervektorkotrolle repräsentierte. Die zweite Gruppe wurde mit dem Transgen pLKO shKRT23-1506 transduziert, welches zu einer Suppression der Proteinsynthese von Keratin 23 führt. In der dritten Gruppe wurde das Transgen pRRLUG CPPT pSK GFP (green fluorescent protein) transduziert. Diese dritte Gruppe diente zur Erfolgskontrolle der Transfektion bzw. Transduktion, da erfolgreich GFP-transfizierter bzw. transduzierte Adenomzellen im Fluoreszenzmikroskop grün aufleuchten. Zur Transfektion wurden anfangs auf drei 10cm Schalen jeweils ca. 3 x 106 Verpackungszellen, hier die human embryonic kidney (HEK) 293T-Zellen, mit 10ml des Mediums DMEM mit 10% FCS ausgesät. Die 293T-Zellen wurden über Nacht bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Die anschließende CaCl2-Tranfektion der 293T-Zellen wurde bei einer Zellkonfluenz von 50% durchgeführt. Tabelle 10: Menge der benötigten Plasmide für die CaCl2-Transfektion der Verpackungszellen 293T. Plasmid Menge der Vektor-DNA Hilfsvektor Gagpol pCMV ΔR8.2 12μg Konzentration c = 9,61μg/μl envelope plasmid VSVG pHIT G 6μg Konzentration c = 0,97μg/μl Transgen 12μg pLKO shKRT23-1506 (Konzentration c = 0,622μg/μl) pLKO puro LV (Konzentration c = 1,07μg/μl) pRRLUG CPPT pSK GFP (Konzentration c = 0,81μg/μl) 33 Hierbei wurde für jedes der drei Transgene ein Plasmidansatz hergestellt (siehe Tab. 11). Die drei Plasmidansätze wurden jeweils auf 438μl mit ddH2O und 62μl 2M CaCl2-Lösung aufgefüllt. Langsam wurden 500μl 2-facher HBS-Puffer pro Ansatz zugetropft. Nach Zugabe des HBS-Puffers blieben die Plasmidansätze zehn Minuten bei Raumtemperatur stehen und wurden anschließend in jeweils eine 10cm Schale mit 293T-Zellen gegeben. Die 293T-Zellen gehörten ab diesem Schritt dem Sicherheitsbereich S2 an. Nach einer Inkubationszeit von ungefähr 17 Stunden bei 37°C und 10% CO2 wurde das Medium der transfizierten 293T-Zellen mit 11ml DMEM-Medium mit 10% FCS erneuert. Zur Erfolgskontrolle der Transfektion wurden die GFP-transfizierten 293T-Zellen im Fluoreszenzmikroskop kontrolliert. Auf drei 6cm Schalen wurden jeweils ungefähr 2 x 105 Zielzellen, hier die Adenomzelllinie LT97, mit jeweils 2ml speziellem Nährmedium ausgesät. Von den drei Schalen mit den 293T-Zellen wurde jeweils das Medium mit einer sterilen 20ml Spritze abgenommen. Mittels eines Sterilfilters (Porengröße 0,45μm) wurde der Virusüberstand aus dem abgenommenen Medium in ein 50ml Falcon gefiltert. Alle drei Virusüberstände wurden mit 10μl Polybren (Konzentration c = 4mg/ml) versetzt. Die drei Schalen mit den infizierten 293T-Zellen wurden entsorgt. Von den Zielzellen LT97 wurde das spezielle Nährmedium abgesaugt und die Adenomzellen wurden einmal mit 1ml PBS gespült. Zu jeder 6cm Schale mit den Zielzellen LT97 wurden 2,5ml des sterilen Virusüberstandes hinzugegeben, um das Transgen in die Adenomzellen zu transduzieren. Die Zielzellen waren nun gentechnisch veränderte Organismen (GVO) der Sicherheitsstufe S2. Da die Adenomzellen LT97, bedingt durch die Zugabe des Virusüberstandes, möglichst kurz unter diesen für ihr Wachstum suboptimalen Bedingungen gehalten werden mussten, wurde der Virusüberstand bereits nach 17 Stunden (anstatt 24 Stunden) durch das LT97-Nährmedium ausgetauscht und weiter bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Nach mehrmaligen Mediumaustausch gehörten die transduzierten LT97 Adenomzellen zur Gruppe der Sicherheitsstufe S1 der GVO. Die Transduktionseffizienz wurde jeweils an den Tagen 1 bis 3 im Fluoreszenzmikroskop kontrolliert. 34 3.1.7 Apoptose–Assay: Caspase-Glo® 3/7 Assay Mit Hilfe des Caspase-Glo® 3/7 Assay kann man mittels der LumineszenzMessung die Aktivität der Caspasen-3 und -7 bestimmen, welche als Mitglieder der Cystein-Proteasen wiederum Aufschluss über die Apoptoserate der Zellen geben (Sgorbissa et al., 1999). Der Caspase-Glo® 3/7 Assay enthält ein Licht emittierendes Substrat, welches die Tetrapeptid-Sequenz DEVD besitzt und selektiv mit den Caspasen-3 und -7 reagiert. Die Zugabe des Caspase-Glo® 3/7 Reagenz in eine Zellprobe führt zur Zelllyse, gefolgt von der Freisetzung der Caspasen der Zellen. Die Caspasen-3 und -7 reagieren mit dem Substrat, indem sie zur Abspaltung des Tetrapeptides DEVD führen. Unter Zugabe von Luciferase luminesziert das nun gespaltene Substrat. Mittels des Luminometers kann die Stärke des produzierten Lichts gemessen werden, was wiederum Rückschlüsse auf die Aktivität der Caspasen3 und -7 zulässt, da die gemessene Lumineszenz proportional zur Menge der Capasen-3 und -7 ist. In einer Dreifach-Bestimmung wurden sowohl die Adenomzellen mit dem die Keratin 23 Expression supprimierenden Konstrukt, als auch die Adenomzellen, die den Leervektor pLKO puro LV enthalten, in einer 96-well Platte verteilt. Hierbei wurden die Adenomzellen in einer Konzentration von 1 x 104 Zellen/well in 100μl Medium vorgelegt. Neben den zu kontrollierenden Adenomzellen wurde auch eine negative Kontrolle, die nur das spezielle Nährmedium der Adenomzelllinie LT97 enthielt, in einer DreifachBestimmung vorgelegt. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C und 10% CO 2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde pro well 100μl Caspase-Glo® Reagenz zu den Adenomzellen bzw. zur negativen Kontrolle hinzugefügt. Nach einem Mixen für 30 sec bei 300rpm auf dem Schüttler, wurde die Platte bei Raumtemperatur bis zu 3 Stunden inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde stündlich die Fluoreszenz am Luminometer gemessen, wobei laut Hersteller die Sensitivität nach einer Stunde am höchsten ist. 35 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 RNA Präparation mit der sauren Phenolmethode Die Gewinnung zellulärer RNA wird durch die saure Phenolmethode ermöglicht. Hierbei wurden die zuvor mit pLKO shKRT23-1506 und pLKO puro LV transduzierten Adenomzellen jeweils auf 10cm Schalen kultiviert, bis eine Konfluenz von ungefähr 80% erreicht wurde. Im ersten Schritt fand die Extraktion statt, dabei wurden 2ml Solution D und 14,4μl β-Mercaptoethanol gemischt und zu den Adenomzellen hinzugefügt. Eine Lösung von 500ml Solution D besteht aus 236,3g 4M Guanidiniumthiocyanat, 3,68g 25mM Natrium-Citrat und 2,5g 0,5%-iges Sarcolsyl (N-Lauroyl-Sarcaosin). Das in dieser Lösung enthaltende Guanidiniumthiocyanat lysiert die Zellen, gleichzeitig inaktiviert β-Mercaptoethanol die RNasen, indem die gesamten Proteine durch Auflösung ihrer Disulfidbrücken denaturiert werden (Jurk, 2006). Das lysierte Zellmaterial wurde in ein 15ml Tube überführt, nach diesem Schritt besteht die Möglichkeit das Material bei –80°C zu lagern. Die nun folgenden Arbeitsschritte wurden immer auf Eis durchgeführt. Zu dem lysierten Zellmaterial wurden 200μl 2M Natriumacetat (pH 4) hinzugefügt und gut gemischt. Im nächsten Schritt wurden unter dem Abzug 2ml Phenol (H20 gesättigt) und 400μl Chloroform-Isoamylalkohol in einer Verdünnung von 49:1 zu dem Zellmaterial gegeben und gut vermischt. Der Ansatz wurde anschließend erst für 15 min auf Eis gestellt und dann für 20 min bei 4°C und 3.500rpm zentrifugiert. Danach wurde der Ansatz kurz bei Raumtemperatur stehen gelassen, an dieser Stelle kann man eine Teilung der Lösung in eine wässrige Phase, eine Interphase und eine organische Phase beobachten (Jurek, 2006). Im zweiten Schritt erfolgte die Präzipitation. Hierbei wurde der Überstand in ein neues Tube überführt. Dazu wurden 2ml Isopropanol hinzugefügt und der Ansatz wurde gut gemischt. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei –20°C wurde der Reaktionsansatz wieder für 20 min bei 4°C und 3500rpm zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand restlos verworfen und im Tube verblieb ein Präzipitat. Der dritte Schritt beinhaltete die Repräzipitation. Dabei wurde das Präzipitat in 500μl Solution D gelöst und in ein neues Eppendorf-Tube transferiert. Es folgte 36 eine erneute Zugabe von 2ml Isopropanol. Der Ansatz wurde gut gemischt und wieder nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei –20°C für 10 min bei 4°C und 3.500rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand erneut restlos entfernt wurde, wurde das Präzipitat in 400μl DEPC-H2O gelöst. Anschließend wurden 200μl 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 4ml 100%-iges Ethanol hinzugegeben und der Reaktionsansatz wurde für 10 min bei 4°C und 13.200rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen und es erfolgte ein zweimaliges Waschen des Präzipitates. Hierzu wurden 400μl 70%-iges Ethanol hinzugefügt und der Überstand wurde abgeschüttet. Nach Wiederholung dieses Arbeitsschrittes wurde das Präzipitat in 50μl DEPC-H2O gelöst und für 5 min bei 65°C inkubiert. Nach der Bestimmung der Konzentration der gewonnenen RNA mittels der Messung der Absorption bei 260nm kann die RNA bei –80°C gelagert werden. 3.2.2 Messung der RNA-Konzentration Die Konzentration der RNA erfolgt mittels photometrischer Quantifizierung, die sich auf dem Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren von 260nm stützt. Die aromatischen Ringe der Basen verursachen bei der RNA die Absorption des UVLichtes. Da Quarzküvetten die Absorption des Lichtes nicht beeinflussen, werden diese bei der Messung der Absorption verwendet (Jurk, 2006). Der UVSpectometer wurde unter Einstellung von 260nm mit 150μl DEPC-H2O geeicht. Jeweils 2μl der RNA-Proben wurden mit 148μl DEPC-H2O verdünnt und anschließend wurde anhand des Absortptionswertes die Konzentration der RNA gemessen. 3.2.3 Herstellung eines Formaldehyd-Agarosegels für die RNA Um die Qualität der gewonnenen RNA in der sauren Phenolmethode beurteilen zu können, verwendet man das Verfahren der Gelelektrophorese. Hierbei durchläuft die eingesetzte RNA ein elektrisches Feld und wird ihrem Molekulargewicht nach aufgeteilt. Die Zugabe von Formaldehyd verursacht, dass die Aldehydgruppen mit den Aminogruppen Adenin, Guanin und Cytosin Schiffsche Basen bilden. Dadurch 37 können die Aminogruppen keine Wasserstoffbrücken mehr aufbauen und die Entstehung von Sekundärstrukturen und Aggregaten kann verhindert werden. Durch die Identifizierung der drei ribosomalen Banden, 5S-, 18S- und 28S-RNA, lässt sich auf die Reinheit der gewonnen RNA schließen (Jurk and Engels, 2006). Um ein 1%-iges Agarose-Gel herzustellen, wurde 1g Agarose in 87,5g DEPCH20 aufgekocht und gelöst. Nachdem die Lösung abgekühlt war, wurden 1,5μl 1%-iges Ethidiumbromid zum Nachweis der RNA-Fragmente nach der elektrophoretischen Auftrennung hinzugefügt. Weiterhin wurden 10ml 10-facher MOPS-Puffer zur Lösung gegeben. Tabelle 11: Bestandteile des 10-fachen MOPS-Puffers. Der MOPS-Puffer wird unter Verwendung von Natriumhydroxid lichtgeschützt auf einen Wert von pH 7 eingestellt. Bestandteile des 10-fachen MOPS-Puffer 200mM 3–Morpholino–1–Propansulfonäure 50mM Natriumacetat 10mM EDTA 10M Natriumhydroxid Anschließend wurden unter dem Abzug 2,5ml 37%-iges Formaldehyd zu der Lösung hinzugefügt und das entstandene Gel wurde langsam in die RNAGelapparatur, welche Gelträger und Kämme enthielt, gegossen. Die zu kontrollierenden RNA-Proben wurden auf Eis für die Gelelektrophorese vorbereitet: Es wurden pro Probe 2μg RNA verwendet, die mit DEPC-H2O auf 10μl Volumen aufgefüllt wurden. Beide Lösungen wurden jeweils mit 2,5μl 5fachem RNA-Lade-Puffer versetzt und anschließend für 10 min bei 65°C inkubiert. Das gefertigte Gel wurde in der Laufkammer mit 1-fachem MOPSLaufpuffer überschichtet. Nach dem Befüllen der Geltaschen mit den RNAProben, wurde die RNA bei 120 Volt elektrophoretisch aufgetrennt. Die Auswertung der Gelelektrophorese erfolgte unter UV-Licht in einer speziellen Geldokumentationsapparatur. 38 3.2.4 DNase-Verdau mit Turbo-DNase Zur Entfernung von häufig in RNA-Präparationen enthaltener kontaminierender DNA wird das Verfahren des DNase-Verdaus genutzt. Es wurden 20μg der RNA-Proben mit DEPC-H2O auf ein Volumen von 50μl in einem Eppendorf-Tube aufgefüllt. Zu diesem Ansatz wurden 6μl 10-facher Turbo-DNase Puffer und 4μl Turbo-DNase hinzugefügt. Anschließend wurde das Reaktionsprodukt für 30 min bei 37°C inkubiert. 3.2.5 Phenolchloroform-Extraktion Proteinhaltige Verunreinigungen innerhalb der zuvor gewonnenen RNA-Proben können mit der Phenolchloroform-Extraktion beseitigt werden. Hierbei teilt sich das Reagenz nach einer Zentrifugation in eine obere, wässrige RNA enthaltende Phase, eine Interphase mit denaturierten Proteinen und eine untere organische Phase. Durch die Verwendung von Phenolchloroform können die Proteine denaturiert werden, gleichzeitig stabilisiert Chloroform die Grenze zwischen der wässrigen Phase und der Interphase (Jurk, 2006). Unter dem Abzug wurden die erstellten DNase-Verdauansätze zur Entfernung der DNase auf ein Volumen von 200μl mit DEPC-H2O aufgefüllt und 200μl Phenolchloroform (pH 8) wurden langsam hinzu pipettiert. Die Lösung wurde gut gemischt und für 2 min bei 13.200rpm zentrifugiert. Anschließend wurde die obere, wässrige Phase in ein neues Eppendorf–Tube überführt. 3.2.6 Natriumacetat-Ethanol-Fällung Zur weiteren Konzentrierung und Reinigung der RNA wurde die Methode der Natriumacetat-Ethanol-Fällung gewählt. Dabei formt die RNA ein unlösliches Präzipitat, wenn die monovalenten Kationen in Verbindung mit Ethanol kommen (Jurk, 2006). Zu den nach der Phenolchloroform-Extraktion überführten RNA-Proben wurden 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5-faches Volumen 100%-iges Ethanol hinzugefügt und über Nacht bei –70°C ausgefällt. Im Anschluss wurden die Proben für 20 min bei 4°C und 13.200rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Beim darauf folgenden Waschvorgang des Präzipitates 39 wurden die RNA-Proben mit 150μl 70%-igem Ethanol versetzt und 5 min bei 4°C und 13.200rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand wieder entfernt wurde, wurde der Waschvorgang ein zweites Mal durchgeführt. Das Präzipitat wurde anschließend für 5 min bei geöffnetem Deckel im Eppendorf-Tube Luft getrocknet und in 15μl DEPC-H2O aufgenommen wurde. Hiernach wurde zum einen die Konzentration der RNA-Proben mittels Messung der Absorption bei 260nm bestimmt und zum anderen wurde erneut eine RNA-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Integrität der RNA-Proben nach der durchgeführten Bearbeitung zu kontrollieren. 3.2.7 cDNA-Synthese Bei der cDNA–Synthese wurden pro RNA-Probe zwei Ansätze erstellt, da für die weiteren Abläufe eine Probe mit Zugabe von reverser Transkriptase und eine Probe als negative Kontrolle ohne Zugabe von reverser Transkriptase, die sogenannte –RT Reaktion, benötigt werden. Die zuvor gewonnenen RNA-Proben wurden auf 333ng/μl mit DEPC-H2O vorverdünnt. Pro RNA-Probe wurden im Weiteren jeweils zwei Reaktionsansätze erstellt. Hierbei wurden pro Ansatz zu 6μl RNA-Lösung 1μl Obligo(dT)-Primer (c = 540ng/μl) und 1μl 10mM dNTP-Mix hinzugegeben. Anschließend wurden die Ansätze für 5 min bei 65°C im PCR-Cycler inkubiert, auf Eis gestellt und nacheinander abzentrifugiert. Parallel wurden zwei weitere Lösungen hergestellt, wobei es sich bei der einen Lösung um den Synthese-Mix mit Zugabe von reverser Transkriptase handelte, bei der anderen um die negative Kontrolle ohne Zugabe der reversen Transkriptase. Hierzu wurden jeweils 4μl First Strand Buffer mit 2μl 0,1M DTT gemischt. In den Synthese-Mix wurden 5μl DEPC-H2O und 1μl SuperScript II Reverse Transcriptase hinzugegeben, während zu der negativen Kontrolle lediglich 6μl DEPC-H2O gegeben wurde. Zu den auf Eis gestellten RNA-Ansätzen wurden nun 12μl Synthese-Mix oder 12μl negativer Kontroll-Mix hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt, so dass am Ende jede RNA-Probe sowohl als Synthese-Mix mit reverser Transkriptase als auch als negative Kontrolle ohne reverse Transkriptase vorhanden war. Die Ansätze wurden nun in einem PCR-Cycler für 52 min bei 42°C und im direkten 40 Anschluss für 15 min bei 70°C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Reaktionsansätze mit 1-fachem First Strand Puffer auf ein Volumen von 50μl aufgefüllt und dann mit 18MΩ-H2O in einem Verhältnis von 1:2 verdünnt. 3.2.8 Quantitative Real Time–PCR Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) können Nucleinsäuren amplifiziert werden. Das Prinzip der PCR benötigt einen kurzen Abschnitt doppelsträngiger DNA, an welche nach einer durch Temperaturerhöhung ausgelösten Denaturierung spezifische Primer binden können. Im nächsten Schritt werden die Primer durch eine Polymerase verlängert, so dass erneut Doppelstrang-DNA entsteht. Bei der zyklischen Temperaturerhöhung zerfällt wiederum die neu synthetisierte Doppelstrang-DNA in ihre Einzelstränge und die Bindung der Primer und somit auch der gesamte Prozess der Synthese kann erneut stattfinden. Verwendet man bei einer PCR zwei Primer, von denen einer am sense-Strang, also dem Leitstrang, und einer am antisense-Strang, dem Gegenstrang, bindet, so erhält man nach jedem Zyklus eine Duplikation des zwischen den Primer zu synthetisierenden DNA-Abschnittes. Somit handelt es sich bei der Methode der PCR um eine exponentielle Amplifikation der DNA, wobei zum Ende der Amplifikation eine Plateauphase erreicht wird. Diese Plateauphase resultiert daraus, dass nach einer bestimmten Zeit unter anderen nicht mehr genügende Komponenten für einen weitere exponentielle Vervielfachung zur Verfügung stehen (Kessler, 2006). Plateau-Phase Anzahl der Moleküle Exponentielle Phase Anzahl der Zyklen Abbildung 7: Verlauf einer PCR (nach Kessler, 2006). 41 Die quantitative Bestimmung der synthetisierten Produkte erfolgt über den Einsatz von SYBR Green, einem asymmetrischen Cyanin-Farbstoff. SYBR Green lagert sich nur an doppelsträngige DNA an und kann nur in diesem Zustand Licht emittieren (Lekanne Deprez et al., 2002). Daraufhin kann mittels der Fluoreszenz-Detektion die Menge des angelagerten SYBR Greens und somit auch die Menge der neu-synthetisierten DNA ermittelt werden. Dies beruht auf der Tatsache, dass in der exponentiellen Phase der PCR eine lineare Abhängigkeit zwischen der Intensität der Fluoreszenz und der Menge der synthetisierten DNA vorhanden ist (Kessler, 2006). Aufgrund des exponentiellen Wachstums ist anfangs, in der sogenannten baseline, nur eine minimale Veränderung in der Fluoreszenzintensität zu vermerken. Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität über die baseline initiiert die Messung der amplifizierten DNA. Zusätzlich kann ein individuell festgesetzter Schwellenwert oberhalb der baseline festgelegt werden. Die Zyklusanzahl, die erstmals den oberen Schwellenwert erreicht, wird als threshold cycle (C T) bezeichnet. Um die quantitative Bestimmung zu verbessern, wird bei der PCR ein interner endogener Standard eingesetzt. Bei diesem Standard handelt es sich um die Quantifizierung an den sogenannten housekeeping-Genen. Das Besondere an housekeeping-Genen ist, dass sie optimalerweise in allen Zellen unabhängig von den zellulären Konditionen jederzeit eine gleiche Menge an Produkten exprimieren und somit eine Kalibrierung der PCR–Ergebnisse ermöglichen (Wenner et al., 2003). Bei der quantitativen Real Time-PCR kann die Menge einer spezifischen mRNA bestimmt werden. Für dieses Verfahren ist es allerdings notwendig die spezifische RNA erst in cDNA umzuschreiben, da die verwendete thermostabile Taq-DNA-Polymerase NEB nur an DNA, nicht aber an RNA, binden kann (Kessler, 2006). Die weitere Bearbeitung der zuvor erstellten cDNA-Ansätze wurde auf Eis durgeführt. Im ersten Schritt wurde ein Primermix erstellt. 42 Tabelle 12: Menge der Primermix-Reagenzien für eine einmalige Reaktion in der quantitativen Real Time-PCR. Primermix dd H2O 9,9μl 10-facher TrisAs-Puffer 2,0μl MgCl2 (50 mM) 0,8μl dNTP (10 mM) 0,4μl SYBR Green (1:600 in DMSO) 1,0μl Taq-Polymerase NEB 0,5μl Primer Sense & Antisense (je 10 μM) 0,4μl Anschließend wurde der Primermix mit dem Vortexer gemischt und kurz zentrifugiert. Als Primer wurden zum einen der spezifische Primer KRT23 für das zu untersuchende Gen und zum anderen die Primer PPIA, GAPD und HPRT1 für die housekeeping-Gene verwendet. Tabelle 13: verwendete Primer in der quantitativen Real Time-PCR. Verwendete Primer Sense und Antisense PPIA_for und PPIA_rev_neu GAPD for und GAPD rev HPRT1 for HPRT1 rev KRT23 1625S und KRT23 1748AS Pro well der PCR-Platte wurden zuerst 15μl Primermix vorgelegt. Von den cDNA-Ansätzen wurden jeweils 5μl mit 45μl 18MΩ-H2O verdünnt. Aus dieser Verdünnung wurden 5μl Template pro Well in den vorgelegten Primermix nach einem Pipettierschema hinzugefügt, wobei nach jedem Well eine neue Pipettenspitze verwendet wurde. Bei der sogenannten „no-template control“ (NTC) wurden 5μl 18MΩ-H2O anstatt einer verdünnten cDNA-Probe zum Primermix hinzu pipettiert. 43 KRT23 PPIA GAPD HPRT1 cDNA: pLKO shKRT23-1506 mit reverser Transkriptase cDNA: pLKO puro LV mit reverser Transkriptase cDNA: pLKO shKRT23-1506 ohne reverser Transkriptase cDNA: pLKO puro LV ohne reverser Transkriptase NTC Abbildung 8: Pipettierschema für die quantitative Real Time-PCR. Jeder Ansatz bzw. NTC wurde dreimal pro Primerpaar pipettiert. In der quantitative Real Time-PCR wurde ein gewähltes Programm über 40 Zyklen wiederholt. Tabelle 14: Programm für einen Zyklus in der quantitativen Real Time-PCR. PCR-Programm 94°C 3 min 94°C 30 sec 60°C 30 sec 72°C 30 sec 80°C 5 sec Die Schmelzkurve wurde zwischen 70°C und 94°C aufgenommen. In diesem Bereich wurde in 0,5°C-Intervallen die Temperatur 3 sec lang gehalten und die Fluoreszenz von SYBR Green gemessen. Mit Hilfe der Schmelzkurve wurde die Temperatur, bei der überwiegend spezifisches Produkt als doppelsträngige DNA vorliegt, ermittelt. Diese Temperatur, hier 80°C, wurde in dem folgenden Experimenten zum Auslesen der SYBR-Green Fluoreszenzwertes verwendet. 3.2.9 Herstellung eines Agarosegels zur DNA-Gelelektrophorese. Um die Qualität der quantitativen Real Time-PCR beurteilen zu können, wurden die Reaktionsprodukte aus der PCR-Platte zusätzlich mittels einer Gelelektrophorese untersucht. Die Nucleinsäuren der DNA sind auf Grund der negativ geladenen Phosphatgruppen des Zucker-Phosphat–Rückrates negativ 44 geladen und wandern daher in Richtung Anode. Kennzeichnend für die Gelelektrophorese ist, dass das zu untersuchende Material der Größe nach aufgeteilt werden kann. Die Passagezeit, die benötigt wird, um das elektrische Feld zu durchlaufen hängt zum einem von der Größe der Fragmente ab und zum anderem auch von ihrer Form. So laufen kleinere Fragmente schneller durch das elektrische Feld als die großen Fragmente (Jurk and Engels, 2006). Bei dem hier verwendeten Agarose–Gel wurde die Agarose, ein Polymer aus Galactoseeinheiten, als Hauptbestandteil genutzt. Eine Konzentration von 2% bis 3 % ist ideal geeignet, um kleine DNA-Fragmente zu differenzieren (Jurk and Engels, 2006). Für das 2% -ige Agarose-Gel wurden 2 g Agarose mit 100 g 1-fach SB-Puffer aufgefüllt und aufgekocht. Tabelle 15: Bestandteile des SB-Puffers. Der SB-Puffer wird auf einen Wert von pH 8 eingestellt. Bestandteile des SB-Puffers 5mM Dinatriumtetraboratdecahydrat Anschließend wurden 1,5μl Ethidiumbromid hinzugefügt und das Gel wurde in die Gelapparatur mit den eingebauten Kämmen gegossen. Von den Proben, die in der quantitativen Real Time–PCR amplifiziert wurden, wurden jeweils 5μl mit 5μl 2-fachem Ladepuffer SBxC vermischt und in die Geltaschen eingefüllt. Als DNA-Größenstandard diente die SF–Ladder. 3.2.10 Globale Genexpressionsanalyse Mit Hilfe eines Oligo-Arrays kann man simultan die Expression zahlreicher RNAoder DNA-Produkte innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes quantitativ bestimmen und somit auch Rückschlüsse auf ihre Interaktionen und Regulationen ziehen. Dabei wird aus der primär vorhandenen RNA mittels einer reversen Transkriptase und der Zugabe von Oligo-Nucleotiden eine cDNA erstellt. Diese wird wiederum durch den Einsatz von T7 RNA-Polymerase, Nucleotiden und fluoreszierenden Cyaninen in cRNA umgeschrieben. Die rot oder grün fluoreszierenden Cyanine, die statt des Cytosins in die cRNA 45 eingebaut werden, ermöglichen die Markierung der cRNA. Aufgrund der fluoreszierenden Markierung ist es nun möglich, das Verhältnis der Genexpression von verschiedenen Zellen zu bestimmen (Müller and Röder, 2004). Als Array kam der Whole Genome Oligo Array (4x44Kk, product no. G4412T; Agilent Technologies) zur Anwendung. Die RNA Markierung und Hybridisierung wurden entsprechend dem Two-Color QuickAmpLabelling Protokoll der Firma Agilent Technologies durchgeführt. Hierfür wurden die verschiedenen RNAs der LT97-Adenomzellen nach dem Schritt der Natrium-Ethanol-Fällung weiter verwendet und zu cRNA umgeschrieben. Dabei wurden zu 8,3μl RNA (c = 60ng/μl) 1,2μl des Primers T7 (Oligo dT) hinzugefügt. Anschließend wurden zu den Ansätzen 2μl Spike A Mix oder Spike B Mix in einer Verdünnung von 1:3.200 pipettiert. Die Spike Mixe enthalten eine bekannte Menge einer bestimmten RNA, die am Ende der Hybridisierung nach Analyse der Daten für eine interne Qualitätskontrolle herangezogen werden. Beide Ansätze wurden im PCR-Cycler für 10 min bei 65°C zur Denaturierung der Sekundärstrukturen der RNA inkubiert und danach für 5 min auf Eis gestellt. Nach einer kurzen Zentrifugation wurden zu den Ansätzen 4μl 5-facher First Strand Puffer, 2μl 0,1M DTT und 1μl 10 mM dNTPs hinzugegeben. Die Ansätzen wurden zusätzlich noch mit 1μl der reversen Transkriptase MMLV (Moloney-Mouse-Leukämie-Virus) und 0,5μl RNase Inhibitor ergänzt. Nach einer sich anschließenden Inkubation im Cycler für 2 Stunden bei 40°C und anschließend für 15 min bei 65°C, war die cDNASynthese abgeschlossen. Die cDNA-Ansätze wurden für 5 min auf Eis gestellt und zentrifugiert. Zu den zwei cDNA-Ansätzen wurden nun jeweils 60μl eines Master-Mixes hinzugefügt und die Reaktionsansätze wurden erneut für 2 Stunden bei 40°C im Cycler inkubiert, um die Synthese der cRNA mit integrierten fluoreszierenden Cyaninen abzuschließen. 46 Tabelle 16: Mengen eines Master-Mixes für eine einmalige Reaktion. Lösungen / Substanzen Menge für einen Master-Mix (μl) dd H2O 15,3 4-facher Transkriptionspuffer 20,0 0,1M DTT 6,0 Nucleotid- Mix 8,0 50% PEG 6,4 RNase Inhibitor 0,5 anorganisches 0,6 Pyrophosphatase T7 RNA Polymerase 0,8 Cyanin 3 oder Cyanin 5 2,4 Im nächsten Schritt wurden die neu erstellten cRNA-Ansätze gereinigt. Dabei wurden zu den cRNA-Ansätzen jeweils 20μl dd-H2O, 350μl RLT-Puffer und 250μl Ethanol absolut hinzugefügt und gut gemischt. Der Ansätze wurden nun in Tubes der RNeasy Mini Säule gegeben und für 30 Sekunden bei 4°C und 13.000rpm zentrifugiert. Die RNeasy Säule wurde in neue Tubes überführt und mit 500μl RPE-Puffer aufgefüllt. Danach wurden die Ansätze erneut für 30 sec bei 4°C und 13.000rpm zentrifuigert und der Durchfluss wurde verworfen. Die Zugabe von 500μl RPE-Puffer und die Zentrifugation mit den angegebenen Einstellungen wurde insgesamt zweimal durchgeführt. Anschließend wurden die cRNA-Ansätze in neue 1,5ml Tube der RNeasy Säule gefüllt und 30μl dd H20 wurden direkt auf die RNeasy Filtermembran gegeben. Nach einer einminütigen Wartezeit wurden die Ansätze wieder für 30 Sekunden bei 4°C und 13.000rpm zentrifugiert. Um die cRNA-Konzentration quantitativ bestimmten zu können, wurden 1,5μl der cRNA-Ansätze im NanoDrop ND-1000 UV-VIS Spectrophotometer untersucht. Hierbei muss die cRNA-Menge >825ng betragen und die Aktivität der Cyanine sollte bei >8pmol/μg RNA liegen, damit die Ansätze für die weiteren Vorgänge im Array verwendbar sind. Im Weiteren folgt die Hybridisierung der cRNA. Hierzu wurden jeweils 825ng der beiden cRNA47 Proben in ein gemeinsames Tube überführt und dieses auf ein Volumen von 41,8μl mit dd-H2O aufgefüllt. Anschließend wurden 11μl 10-fach Blocking Agent und 2,2μl 25-facher Fragmentationspuffer zu dem cRNA-Ansatz pipettiert. Eine 30 minütige Inkubation bei 60°C folgte zur Fragmentierung der cRNA, welche durch die Zugabe von 55μl 2-fachem GE Hybridisierungspuffer HI-RPM gestoppt wurde. Der Ansatz wurde bei Zimmertemperatur eine Minute lang mit 13.000rpm zentrifugiert und auf Eis gelegt. Von dem Ansatz wurden 100μl auf die Hybridisierungskammer verteilt. Die Kammer wurde mit einem Deckel verschlossen und der Ansatz konnte für 17 Stunden bei 65°C hybridisiert werden. Abschließend wird empfohlen einen Array mit 0,005%-iges Triton X102 zu waschen, um Artefakte zu reduzieren. Dabei wurde jeweils 2ml 0,005%iges Triton X-102 in die Waschpuffer Nr.1 und Nr.2 gegeben. Nachdem der Deckel von der Kammer genommen wurde, wurde der Array eine Minute lang erst mit dem Waschpuffer Nr.1, dann mit Waschpuffer Nr.2 bei 34°C gereinigt. Unter Verwendung von Acetonitril perlten die Reste der Waschpuffer von der Array-Glasoberfläche ab. Nach den Waschvorgängen wurden die Arrays im Agilent Microarray Scanner G2505B eingelesen. Tabelle 17: Einstellung des Array-Scanners. Scanner-Auflösung 5μm 5 μm scanning mode Single Pass Dye channel Red & Green Green PMT XDR Hi 100% XDR Lo 10% Red PMT XDR Hi 100% XDR Lo 10% 3.2.10.1 Bioinformatische Auswertung der Array Daten Die gescannten Arraydaten wurden mittels der Agilent’s Feature Extraction software 10.7.3.1 (Feature Extraction Protocol GE2_105-Dec08) weiter prozessiert und mit Hilfe des GeneSpringGX11.01 (Agilent Technologies) 48 Quantilen normalisiert. Mögliche differentiell exprimierte Gene mit einem fold change von ≥ 2 wurden durch paarweisen Vergleich der normalisierten Expressionswerte identifiziert. Im nächsten Schritt wurden die ausgewählten Gene mit dem online Softwaretool Pathway Express von Sorin Draghici (http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm) hinsichtlich deren Beteiligung an bekannten Signalwegen untersucht. (Doninger et al., 2003, Draghici et al., 2007). Als Ergebnis dieses Analysetools wurden die identifizierten differentiell exprimierten biostatistischer Gene Signalwegen Verfahren ein zugeordnet sogenannter und Impact mittels Factor komplexer für die nachgewiesenen Signalwege berechnet. Der Impact factor soll helfen die signifikantesten Pathways, die von Genexpressionsveränderungen aufgrund des KRT23 knock-downs betroffen wurden, herauszufiltern. Abbildung 9: Berechnung des Impact-Factors (IF). Signalweg P, gegebener Signalweg p, pertubation factor PF, Genmenge g, normalisierte Expression eines Genes E, Anzahl der differenziert regulierten Gene N (nach Draghici et al., 2007). 49 4. Ergebnisse 4.1 Transduktion der Adenomzellen LT97 mit einem lentiviralen shRNA Vektorsystems zur Suppression der Keratin 23-Expression Eine Gruppe der zur Transfektion benötigten 293T-Zellen (HEK) wurde mit dem Kontroll-Vektorsystem pRRLUG CPPT pSK GFP (green fluorescent protein) transfiziert. Die erfolgreiche transiente Transfektion wurde im Fluoreszenzmikroskop dokumentiert (Abb. 9). A B Abbildung 10: GFP-Kontrolle transfizierter 293T-Zellen. Verwendung von Weißlicht (A) und UV-Licht (B) (Belichtungszeit 50ms; 10fach vergrößert). Um den Erfolg der anschließenden lentiviralen Transduktion belegen zu können, wurden LT97-Adenomzellen mit dem Kontroll-Vektorsystem pRRLUG CPPT pSK GFP (green fluorescent protein) infiziert und erneut fluoreszenzmikroskopisch überprüft. Die Abbildungen 9 und 10 belegen, dass sowohl die Bedingungen der transienten Transfektion der Virus-Produzentenlinie 293T eine effektive Transfektion dieser Zellen ermöglichten, als auch dass die generierten Viruspartikel erfolgreich die Zielzelllinie LT97 zu transduzieren vermögen. Die geschätzte Transfektionseffizienz der 293T-Zellen lag nahe 100%, die der Virustransduktion der Zielzelllinie LT97 bei ca. 80%. Parallel zu diesen Kontrollansätzen wurden die LT97-Adenomzellen sowohl mit dem Vektorsystem pLKO puro LV als auch dem Vektorsystem pLKO shKRT23-1506 transduziert. 50 A B C Abbildung 11: GFP-Kontrolle der transduzierte Adenomzellen LT97. Verwendung von Weißlicht (linke Spalte) und UV-Licht (rechte Spalte) (A: Belichtungszeit 200ms; B: Belichtungszeit 500ms; C:Belichtungszeit 700ms; jeweils 10fach vergrößert). 4.2 RNA-Konzentrations- und Qualitätskontrolle Für die nachfolgenden Analysen wurde aus den stabilen, transgenen Linien LT97 pLKO puro LV und LT97 pLKO shKRT23-1506 die RNA isoliert und diese einer Qualitätskontrolle unterzogen. Durch die Messung der Absorption bei 260nm konnte die Konzentration der gewonnen RNA aus den Adenomzellen LT97 pLKO shKRT23-1506 und LT97 pLKO puro LV bestimmt werden (Tab. 18). 51 Tabelle 18: RNA-Konzentrationen. LT97 pLKO LT97 pLKO shKRT23-1506 puro LV 3,3202μg/μ 2,6219μg/μl c(RNA) nach saurer Phenolmethode Damit man die Qualität der gewonnen RNA beurteilen und insbesondere RNAse bedingte Degradation der Proben ausschließen kann, wurden die RNA-Ansätze mit dem Verfahren der Gelelektrophorese auf einem 1%-igem Agarose-Gel evaluiert. Es konnten die drei ribosomalen Banden 5S-, 18S- und 28S-RNA klar abgegrenzt werden, was eindeutig für die Reinheit der RNA-Ansätze spricht (Jurk and Engels, 2006). Diese Kontrollen wurden sowohl nach dem Verfahren der sauren Phenolmethode als auch dem DNase-Verdau mit Turbo DNase durchgeführt. Abbildung 12: Integritätsprüfung der RNA-Ansätze. 4.3 quantitative Real Time-PCR 4.3.1 Keratin 23 Expressionsuntersuchung Die quantitative Real Time-PCR ist die sensitivste Methode, um eine Genexpression quantitativ zu bestimmen (Liu and Saint, 2002). Die Amplifikation einer Probe wird in vier Abschnitte unterteilt: eine anfängliche Grundlinie, eine geometrische Phase mit anschließender linearer Phase und abschließend eine Plateau-Phase. Wichtige Kontrollen in der quantitativen Real 52 Time-PCR sind: zum einen die sogenannte „no-template control“ (NTC), bei der eine Amplifikation auf eine DNA-Verunreinigung im Reaktionsmix hinweist. Zum anderen wird eine „no amplification control“ (NAC), die keine reverse Transkriptase enthält, eingesetzt, die DNA-Verunreinigungen nachweisen hilft, die mit der RNA-Isolation koprezipitiert werden. Die Cycle Treshold (CT-Wert) zeigt die Anzahl der Amplifikationszyklen an, die für das Erreichen einer bestimmten Fluoreszenzintensität werden (Shipley, 2005). Hierbei sollte eine Treshold gewählt werden, die eine deutliche Abgrenzung zum HintergrundSignal ermöglicht und der innerhalb der exponentiellen Phase der Amplifikation liegt (Bustin, 2000). Eine Ableitung der sogenannten Schmelzkurve zeigt in Abhängigkeit der PCR-Produktlänge und –Sequenz (im Idealfall wird nur ein spezifisches PCR-Produkt generiert) unterschiedliche Schmelzkurvenverläufen. Die Stabilität der DNA-Doppelhelix ist von der Basenpaarung abhängig. Eine Doppelhelix mit einem hohen Anteil an ungepaarten Basen bedeutet Instabilität und führt zu einer Denaturierung bei niedrigeren Temperaturen. Dieser Schmelzpunkt wird dabei als der Punkt definiert, bei dem 50% der vorhandenen DNA denaturiert sind (Graw, 2010). Die abgeleiteten Schmelzkurven zeigen sowohl für die in der Keratin 23-Expression supprimierten Zellen als auch für die Kontrollgruppe einen Schmelzpunkt bei ungefähr 85°C. Dieser hohe Schmelzpunkt bedeutet, dass die in der Real Time-PCR gebildete DNA eine hohe Stabilität und somit eine korrekte Basenpaarung aufweist. Der Anstieg der Schmelzkurve bei ca. 77°C deutet auf eine vermehrte Bildung von unspezifischen Primerdimeren, die sich bei steigender Temperatur wieder denaturieren. 53 LV shKRT shKRT LV Abbildung 13: Schmelzkurven der quantitativen RT-PCR. Zu sehen sind die Schmelzkurven der Keratin 23 supprimierten (shKRT) Adenomzellen LT97 und der Leervektor (LV) transduzierten Kontrollzellen. Temperature in °C. Da die cDNA nur die Gene enthält, die zuvor als mRNA vorlagen, werden bei einer quantitativen Real Time-PCR nur Gene bestimmt, die in einer Zelle tatsächlich auch transkribiert wurden und somit für die Translation zur Verfügung stehen (Kessler, 2006). Der quantitative Real Time-PCR Kurvenverlauf der Adenomzellen, die mit dem supprimierenden Vektorsystem pLKO shKRT23-1506 transduziert wurden, zeigt, dass die Amplifikation von Keratin 23 später den CT-Wert erreicht als in der unveränderten Kontrollgruppe. Dies deutet auf eine erfolgreiche Suppression der Keratin 23-Expression auf Transkriptionsebene, da als Ausgangsmaterial die RNA der Adenomzellen verwendet worden ist. Bei der quantitativen Real Time-PCR werden neben dem Zielgen üblicherweise, um insbesondere technische Fehler in der quantitativen Real Time-PCR zu kontrollieren, die Expression endogener unregulierter Gene (sogenannte houesekeeping-Gene) bestimmt. Die Ergebnisse einer oder mehrerer housekeeping-Gen-Expressionsmessungen sogenannten Normierungsverfahren mit den werden Ergebnissen in der einem Zielgene berechnet. Diese Normierung ist möglich, da angenommen wird, dass die ausgewählten housekeeping-Gene in 54 ihrer Expression nicht von der experimentellen Manipulation bzw. durch die Expression des Transgens der Zielzelle beeinflusst werden. (Bustin, 2000). Nach der Normierung mit den housekeeping-Genen PPIA und GAPD konnte eine relative Abnahme der KRT23 Expression durch die shKRT23-1506 Vektorexpression um das Neunfache festgestellt werden. Dies bedeutet, dass die relative Expression von Keratin 23 in den Adenomzellen, die mit dem Vektorsystem pLKO shKRT23-1506 transduziert wurden, um 89% verringert wurde und somit der gewünschte Effekt -eine Suppression der Keratin 23 Expression- erzielt werden konnte. Anhand dieser Ergebnisse kann man die Transduktion der Adenomzelllinie LT97 mit dem lentiviralen Vektorsystem pLKO shKRT23-1506 als erfolgreich betrachten. 1,2 1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,11 0 LT97 pLKO shKRT23-1506 LT97 pLKO puro LV Abbildung 14: Ratio der Keratin 23-Expression der Adenomzellen LT97. 4.3.2 Auswertung der DNA-Gelelektrophorese Zusätzlich zur Auswertung der quantitativen Real Time-PCR mittels der Herstellereigenen Software wurden die PCR-Reaktionsprodukte der quantitativen Real Time-PCR mittels einer DNA-Gelelektrophorese untersucht, um auszuschließen, dass Nebenprodukte in der PCR entstanden sind, die in der Schmelzkurve nicht nachweisbar waren. Dabei spricht eine einzelne Bande für einen hohe Spezifität der quantitativen Real Time-PCR, da in diesem Fall nur eine bestimmte DNA amplifiziert wurde (Shipley, 2005). Banden, die innerhalb 55 der „no-template control“ (NTC) oder der „no-amplification control“ (NAC) zu sehen sind, sprechen in der Regel für eine Verunreinigung der Proben oder für sogenannte Primerdimere. Abb. 12 und Abb. 13 zeigen, dass sowohl die quantitative Real Time-PCR für PPIA als auch GAPD ein spezifisches Produkt mit dem erwarteten Molekulargewicht genierte, (die Spur 3 in Abb. 12 ist vermutlich durch einen Pipettierfehler ausgefallen), als auch die Kontrollreaktion entsprechend den Erwartungen kein spezifisches DNA-Produkt zeigen, mit Ausnahme von Spur 12. In dieser Spur sieht man ein sehr schwaches spezifisches als auch niedermolekular unspezifisches Produkt, was auf eine zufällige geringe DNA-Kontamination oder einen Primerdimer hindeuten könnte. In der durchgeführten DNA-Gelelektrophorese sind in den Proben, die mit den Primerpaaren PPIA und GAPD versetzt wurden, keine Banden in der NTC oder NAC zu sehen. Die Reaktionsgemische, die sowohl einen Primer, die reverse Transkriptase als auch die Probe enthalten, zeigen deutlich nur eine Bande in der Gelelektrophorese. Dies spricht hier eindeutig für den Erfolg der quantitativen Real Time-PCR und erlaubt die Verwendung der Ergebnisse, die unter den Primerpaaren PPIA und GAPD ermittelt wurden, zur Normierung der Werte für die Proben, die mit dem Primer KRT23 versetzt wurden. Das dritte housekeeping-Gen, HPRT1, das potentiell ebenfalls für die Normierung eingesetzt werden sollte, zeigte (Abb. 14) jedoch in der Mehrzahl der Kontrollreaktionen eine deutliche, wenn auch schwache Bande in erwarteter Höhe, wie auch niedermolekulare Banden, die wahrscheinlich auf Primerdimere hinweisen. Aufgrund dieses Befundes wurde HPRT1 nicht für die Normalisierung eingesetzt. 56 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abbildung 15: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar PPIA (1-3 LT97 pLKO shKRT23-1506 + RT; 4-6 LT97 pLKO puro LV + RT; 7-9 NAC LT97 pLKO shKRT23-1506; 10-12 NAC LT97 pLKO puro LV; 13-15 NTC). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abbildung 16: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar GAPD (1-3 LT97 pLKO shKRT23-1506 + RT; 4-6 LT97 pLKO puro LV + RT; 7-9 NAC LT97 pLKO shKRT23-1506; 10-12 NAC LT97 pLKO puro LV; 13-15 NTC). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abbildung 17: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar HPRT1 (1-3 LT97 pLKO shKRT23-1506 + RT; 4-6 LT97 pLKO puro LV + RT; 7-9 NAC LT97 pLKO shKRT23-1506; 10-12 NAC LT97 pLKO puro LV; 13-15 NTC). Die KRT23 spezifische quantitative Real Time-PCR zeigte in allen Ansätzen die erwartete hochmolekulare Bande bei gleichzeitigem Fehlen dieser Bande in den 57 Negativkontrollen, so dass von einer spezifischen quantitativen Real Time-PCR ausgegangen werden kann (Abb. 15). Abb. 15 zeigt jedoch auch, dass die KRT23 quantitative Real Time-PCR Bedingungen zusätzlich die Herstellung eines niedermolekularen PCR-Produktes (wahrscheinlich Primerdimere) ermöglichen. Aufgrund der Molekulargrößendifferenz zwischen der Primerdimere und dem spezifischen Produkt gelingt es jedoch wegen der relativ hohen Temperaturen, bei der die Fluoreszenz gemessen wird, das Signal des spezifischen Produktes vom unspezifischen Signal zu trennen. Daher kann dieser Ansatz für die geplanten KRT23 funktionellen Untersuchungen verwendet werden. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abbildung 18: Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte der qRT-PCR mit dem Primerpaar KRT23 (1-3 LT97 pLKO shKRT23-1506 + RT; 4-6 LT97 pLKO puro LV + RT; 7-9 NAC LT97 pLKO shKRT23-1506; 10-12 NAC LT97 pLKO puro LV; 13-15 NTC). 4.4 Identifikation von KRT23-Zielgenkandidaten mittels der RNA-Array-Technologie Die bioinformatische Auswertung der Daten des Oligo-Arrays identifizierte differentiell exprimierte Gene und Signalwege (siehe Anhang A12 bis A14), die signifikant von der veränderten Genexpression betroffen sind. Hierbei zeigte sich unter anderem eine erniedrigte Expression von Genen, die für Tumorwachstum und Transkription mitverantwortlich sind oder die eine antiapoptotische Funktion in der Zelle besitzen. Eine erhöhte Expression konnte z.B. an den Apoptose beteiligten Caspase-Genen nachgewiesen werden. 58 Tabelle 19: Auszug von Genen mit erhöhter Expression in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen. Gen fold change Caspase 3 2,71 Caspase 6 1,72 Caspase 7 1,43 Tabelle 20: Auszug von Genen mit erniedrigter Expression in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen. Durch die differentielle Gen fold change TNF-α 0,55 TRADD 0,72 NF-κB2 0,45 RelA 0,58 c-myc 0,7 Bcl-xL 0,46 Bcl-2 0,1 Genexpressionsanalyse konnten insgesamt 91 Signalwege ermittelt werde. Mittels Auswertung der Genexpressionsdaten in Pathway Express wurden betroffene Signalwege identifiziert (Tab. 21). Tabelle 21: Auszug der betroffenen Signalwege bei Suppression der Keratin 23 Expression. Rang Signalweg 1 Leukocyte transendothelial migration 2 Cell adhesion molecules (CAMs) 3 Antigen processing and presentation 4 Phosphatidylinositol signaling system 5 Adherens junction 6 Cell cycle 7 Proteasome 59 Rang Signalweg 8 PPAR signaling pathway 9 Ribosome 10 Biosynthesis of unsaturated fatty acids 26 Apoptosis 4.5 Aktivitätserhöhung der Caspasen-3 und -7 Die bioinformatische Auswertung des Oligo-Arrays zeigte eine erhöhte Expression der an der Apoptose beteiligten Caspasen-3, -6 und-7. Um die Aktivität dieser Caspasen beurteilen zu können, wurde anschließend ein Apoptose-Assay durchgeführt. Hierbei wurde die Aktivität der Caspasen-3 und 7 sowohl in den Adenomzellen, die sich durch eine Suppression der Expression von Keratin 23 auszeichneten, als auch in den in ihrem Expressionsverhalten unveränderten Adenomzellen gemessen. Eine erhöhte Aktivität der Caspasen gibt Hinweise auf die Apoptoserate einer Zelle (Sgorbissa et al., 1999). Die Aktivität der Caspasen wurde durch die Messung der Lumineszenz ermittelt, da in den Reaktionsgemischen die Caspasen aus den lysierten Zellen mit dem Tetrapeptid DEVD reagierten und unter Zugabe von Luciferase lumineszierten. Insgesamt wurde dreimal, jeweils im Abstand von einer Stunde, die Lumineszenz der Proben ermittelt. Tabelle 22: Ergebnisse und ermittelter Durchschnittswert d der drei Messungen im Apoptose-Assay. Ergebnisse 1.Messung LT97 pLKO shKRT23-1506 LT97 pLKO puro LV 2.Messung LT97 pLKO shKRT23-1506 LT97 pLKO puro LV 3.Messung LT97 pLKO shKRT23-1506 LT97 pLKO puro LV 60 d 2529 2214 2305 2349,33 2072 1933 2031 2012 2260 2055 2099 2138 1928 1819 1925 1890,67 2028 1901 1898 1942,33 1735 1708 1792 1745 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Abbildung 19: durchschnittliche Aktivität der Caspasen-3 und -7. Im Vergleich ist in den Adenomzellen LT97 pLKO shKRT23-1506 eine höhere Aktivität der Caspasen-3 und -7 nachweisbar. Mittels eines Zweistichproben-t-Testes kann man einen Unterschied zwischen empirisch ermittelten Durchschnittswerten aus zwei differentiellen Gruppen analysieren und beurteilen, ob die Differenz der Durchschnittswerte zufällig oder signifikant ist. Die in Tabelle 22 dargestellten Lumineszenzwerte aus je drei Parallelmessungen wurden in einem paarweisen Vergleich LT97 pLKO shKRT23-1506 und LT97 pLKO puro LV für die drei unterschiedlichen Messreihen im t-Test untersucht. Dabei war in allen drei Messwerten der Unterschied in den Lumineszenzwerten und somit auch in der Caspase-Aktivität zwischen den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen (LT97 pLKO shKRT231506) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (LT97 pLKO puro LV) statistisch signifikant (Signifikanzniveau p<0,05). Tabelle 23: Ergebnisse des t-Testes. t-Wert p-Wert 1.Messung 3,29 0,015 2.Messung 3,44 0,013 3.Messung 3,98 0,008 In den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen konnte somit eine erhöhte Apoptoserate nachgewiesen werden. 61 5. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde in einem Zellkulturmodellsystem die Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese analysiert. Um Keratin 23-abhängige Vorgänge in der Zelle ermitteln zu können, wurde zuerst eine Suppression der Keratin 23-Expression durch den Einsatz eines lentiviralen shRNA Vektorsystems in der Modell-Adenomzelllinie LT97 hervorgerufen. Im Rahmen einer quantitativen Real Time-PCR konnte die Suppression von Keratin 23 in den Adenomzellen auf Transkriptionsebene bestätigt werden, so dass eine globale Genexpressionsanalyse und in-vitro Versuche im Anschluss durchgeführt werden konnten. 5.1 Keratin 23 abhängig regulierte Gene Eine Überexpression von Keratin 23 ist bereits in diversen Karzinomen wie Zunge, Haut, Mamma und Plazenta gezeigt worden. (Sabates-Bellver et al., 2007). Auch in den Mikrosatelliten stabilen sporadischen Adenokarzinomen des Kolons sowie in kolorektalen Adenomen ist eine Überexpression des Keratins 23 nachgewiesen worden (Rogers et al., 2004, Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Birkenkamp-Demtroder et al. nehmen an, dass ein zellulärer DNASchaden die Expression von Keratin 23 bereits in der Adenomentwicklung fördert und Keratin 23 den Übergang in die mitotische Phase verhindert. Da aber in Mikrosatelliten stabilen Karzinomen genomische Fehler vorliegen und Keratin 23 gleichzeitig auch überexprimiert wird, schließt man daraus, dass Keratin 23 hier keine ausreichende Apoptose induzierende Funktion hat (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Im Rahmen des Array-Versuches gaben die ermittelten differentiellen Genexpressionen Hinweise auf die Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese. Die Ergebnisse des Mirco-Arrays zeigten unter den gewählten Parametern mittels Pathway Express, dass Gene wie TNF-α, NF-κB und c-myc, die für Prozesse wie Proliferation und Migration (Tabruyn, 2008, Karlsson et al., 2003) verantwortlich sind, deutlich in ihrer Expression im Knock62 down Experiment vermindert sind. Daneben war eine verminderte Expression der anti-apoptotische wirkenden Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL zu sehen. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass diese proliferationsfördernden und antiapoptotisch wirkenden Gene bei einer Überexpression von Keratin 23 in Adenomzellen vermehrt exprimiert werden würden. Dadurch würde die Karzinogenese in Adenomzellen begünstigt werden, was wiederum ein Indiz dafür wäre, dass Keratin 23 die Karzinogenese unterstützt. 5.2 Keratin 23 reguliert die Expression von TNF-α Der Tumor-Nekrose-Faktor TNF-α ist ein essentieller Bestandteil in der Vermittlung der Apoptose (Krauss, 2008), der inflammatorischen Reaktionen und der Immunantwort einer Zelle (Zhao et al., 2011) als auch in der humanen Karzinogenese (Karin, 2006). Ob TNF-α eine pro-apoptotische oder antiapoptotische Wirkung auf die Zelle hat, ist von den interagierenden Adapterproteinen abhängig (Krauss, 2008). In der vorliegenden Arbeit wurde der proliferationsfördernde und gleichzeitig auch Apoptose inhibierende Weg über eine Aktivierung von NF-κB näher betrachtet. In einem von TNF initiierten Signalweg wird der Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert (Beg et al., 1995). Dies führt schließlich zu einer NF-κB-abhängigen, indirekt auch TNF-abhängigen, Expression von c-myc, Interleukin-6 und STAT3 (Kirillova et al., 1999) sowie von Bcl-xL (Schulze-Bergkamen et al., 2008) als auch Bcl-2 (Daigeler et al., 2008). Ist NF-κB durch seinen Inhibitor blockiert, wechselt der TNF-induzierte Signalweg die Richtung von Zellwachstum und Proliferation hin zur Apoptose (Kirillova et al., 1999). Die Ergebnisse des Oligo-Arrays zeigten für die Keratin 23 supprimierten Adenomzellen einen erniedrigten fold change von 0,55 für TNF-α. Im weiteren Verlauf des TNF-Signalweges zeigte auch die Untereinheit TRADD im Komplex I (siehe Abb.3) einen erniedrigten fold change, während die zwei Untereinheiten RIP1 und TRAFF2 unverändert in ihrer Expression waren. Der TNF-induzierte Signalweg kann zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB führen (Chen et al., 1999, Bouwmeester et al., 2004). Bei einer erniedrigten Expression von TNF-α und TRADD sinkt auch die 63 Expression von IκBKG, einer regulatorischen Untereinheit des Inhibitors der IκB-Kinase, welche für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB benötigt wird (Tabruyn and Griffioen, 2008). Dieses Zusammenspiel zeigte sich in unseren Ergebnissen durch eine geringere Expression von IκBKG mit einem fold change von 0,59. Auch die TNF-abhängige Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB (Chen et al., 1999, Bouwmeester et al., 2004) zeigte sich in den Ergebnissen des Arrays mit einer erniedrigten Expression von NF-κB bei einer verminderten Expression von TNF-α. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass in Adenomzellen, die sich unter anderem durch einen erhöhten Gehalt an Keratin 23 auszeichnen, mit einer erhöhten Expression von TNF-α zu rechnen ist. Im weiteren Verlauf würde dies andeuten, dass die Expression und Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB in Adenomzellen mit Überexpression von Keratin 23 erhöht sein würde. Eine Überexpression von NF-κB ist in vielen Karzinomerkrankungen bekannt (Viatour et al., 2003) und resultiert in der Expression zahlreicher anti-apoptotischer Gene (Karin, 2006). Dies ist ein Indiz dafür, dass Keratin 23 über einen TNF-α gesteuerten Signalweg und einer darauf folgenden Karzinogenese Aktivierung einnimmt, von indem NF-κB es die eine wichtige Apoptose Rolle hemmt in der und die Zellproliferation fördert (Tabruyn and Griffioen, 2008). 5.3 Keratin 23-abhängige Regulation von NF-κB Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist in der Karzinogenese ein wichtiger Spieler, da er zum einen die Expression vieler anti-apoptotischer Gene unterstützt (Karin, 2006) und zum anderen die Proliferation und die Zellmigration fördert (Tabruyn and Griffioen, 2008). Daher ist es nicht verwunderlich, dass in vielen humanen Karzinomen eine erhöhte Aktivität von NF-κB nachgewiesen werden konnte (Xiao, 2004). In dem vorliegenden Knock-down Experiment konnte eine KRT23abhängige erniedrigte Expression des Transkriptionsfaktors NF-κB, welcher als Dimer aus Mitgliedern der Familie der NF-κB/Rel-Proteine aufgebaut wird, ermittelt werden. 64 Im Zusammenhang mit dem Knock-down Experiment würde eine erniedrigte Expression einzelner Bestandteile des Transkriptionsfaktor NF-κB auf eine Zunahme dieser Expression bei gesteigerter Keratin 23-Expression, wie sie in kolorektalen Adenomen nachgewiesen worden ist (Sabates-Bellver et al., 2007), hinweisen. Eine vermehrte Expression von NF-κB ist in Mukosazellen kolorektaler Neoplasien (Rupnarain et al., 2004) als auch in verschiedenen Krebserkrankungen bereits bekannt (Viatour et al., 2003). Schumm et al. haben zeigen können, dass die für die Zellproliferation mitverantwortliche Untereinheit NF-κB2 (p52/p100) in vielen Karzinomen exprimiert wird (Schumm et al., 2006). In dem durchgeführten Oligo-Array zeigte sich vor allem für NF-κB2 einen erniedrigten fold change von 0,45. Dies bedeutet, dass wir hier ausgehend von einer Keratin 23-abhängigen Expression in kolorektalen Adenomen eine zunehmende Expression für NF-κB2 erwarten würden, was im Einklang mit den Beobachtungen von Schumm et al. stehen würde. NF-κB2 besteht aus den Untereinheiten p52, welche als Transkriptionsfaktor der RelFamilie fungiert, und aus p100, welcher der zytoplasmatische Inhibitor selektiver NF-κB/Rel Komplexe ist (Heusch et al., 1999). Viatour et al. haben in Studien zeigen können, dass eine Überexpression der Bestandteile p52/p100 des Transkriptionsfaktors NF-κB mit einer erhöhten Expression des antiapoptotisch wirkenden Bcl-2 korreliert. Die Promoterregion von Bcl-2 enthält eine κB-Bindungsstelle, welche hauptsächlich mit p50- und p52-Homodimeren interagiert. Daher lässt sich schließen, dass Bcl-2 ein Zielgen von NF-κB ist (Viatour et al., 2003). Somit wird durch eine erhöhte Expression von NF-κB2 die Apoptose durch Steigerung des anti-apoptotischen Faktors Bcl-2 reduziert und folglich das Risiko für eine Entstehung einer Krebserkrankung erhöht bzw. die schon bestehende Karzinogenese kann nicht gestoppt werden. Über den TNF-α vermittelten Signalweg verhindert eine Aktivierung der Komponente RelA in Fibroblasten, Makrophagen und T-Zellen die Apoptose (Sheehy and Schlissel, 1999) ebenfalls durch die Expression der anti-apoptotischen Gene Bcl-2 und Bcl-xL (Daigeler et al., 2008). Auch hier zeigte sich im Array-Versuch eine verminderte Expression von RelA mit einer fold change von 0,58. Dies bedeutet, dass man in Adenomzellen mit Überexpression von Keratin 23 (Sabates-Bellver 65 et al., 2007) mit einer vermehrte Expression von RelA rechnen könnte und somit anti-apoptotische Gene ebenfalls vermehrte exprimiert werden könnten. Eine Aktivierung von NF-κB durch seine Aktivatoren oder direkt durch eine Überexpression von RelA oder c-Rel führt zur Resistenz der Zelle gegenüber einer durch TNF-α, FasL oder TRAIL induzierten Apoptose (Bernard et al., 2002). Die Apoptoseresistenz ist eine bekannte Eigenschaft einer Krebszelle und unterstreicht die Behauptung, dass RelA vermehrt in Adenomzellen mit Keratin 23-Überexpression vorhanden sein müsste. Daneben ist der Transkriptionsfaktor NF-κB auch für die Expression von CDKN1A, einem Inhibitor des Zellzyklus in G1, verantwortlich (Tabruyn and Griffioen, 2008). Auch dieses Zusammenspiel zeigte sich in den Ergebnissen des ArrayVersuches: so war bei einer verminderten Expression von NF-κB auch eine geminderte Expression von CDKN1A mit einem fold change von 0,5 zu sehen. Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist ein wichtiger Spieler in der Progression der Karzinomentwicklung, indem er die Transkription anti-apoptotisch wirkender Gene wie Bcl-2, c-Flip und XIAP fördert (Thomas et al., 2005) und die Zellmigration sowie die Proliferation unterstützt (Tabruyn and Griffioen, 2008). In vielen Karzinomen konnte bisher einen erhöhte Aktivität oder Überexpression von NF-κB belegt werden (Xiao, 2004). Es konnte innerhalb des Knock-down Experimentes unter Suppression der Keratin 23-Expression eine niedrigere Expression der Untereinheiten NF-κB2 und RelA des Transkriptionsfaktors NF-κB gemessen werden. Bei einer Überexpression von Keratin 23, wie sie in Adenomzellen häufig vorzufinden ist (Sabates-Bellver et al., 2007), würde man eine erhöhte Expression von NF-κB2 und RelA erwarten. Somit würde Keratin 23 durch die Regulation der Transkription von NF-κB2 und RelA die Karzinogenese unterstützen, indem es die Apoptose hemmen und die Proliferation anregen würde. 5.4 Keratin 23 inhibiert die Apoptose über Bcl-2 und Bcl-xL Das Verhältnis von anti-apoptotisch wirkenden Bcl-Mitgliedern wie Bcl-2 und Bcl-xL zu pro-apoptotischen wirkenden Bcl-Teilnehmern, insbesondere Bax, ist 66 ausschlaggebend für die Karzinogenese (Fernandez et al., 2002). Eine Überexpression der anti-apoptotisch wirkenden Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL ist in vielen Karzinomen belegt worden (Zhang et al., 2008, Weber, 2007, Zhao et al., 2004). Die Mehrheit der kolorektalen Karzinome zeigt eine Überexpression von Bcl-xL (Wacheck et al., 2003), sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene (Schulze-Bergkamen et al., 2008). Hier korreliert die Höhe der Expression mit der Histopathologie und der Progression der Krebserkrankung (Zhang et al., 2008). Es konnte eine erhöhte Expression von Bcl-2 in kolorektalen Karzinomen und Adenomen gezeigt werden (Rupnarain et al., 2004), wobei das Ausmaß der Expression nicht mit dem histopathologischen Befund korreliert (Zhao et al., 2005). Der Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert die Expression von Bcl-xL (Schulze-Bergkamen et al., 2008) und Bcl-2 (Daigeler et al., 2008). durch Bindung an die κB-Bindungsstelle im Promoter. Gleichzeitig wird die Expression des apoptotisch wirkenden Faktors Bax durch NF-κB herunter reguliert (Viatour et al., 2003). Da in der vorliegenden Arbeit eine verringerte Expression von NFκB ermittelt wurde, ist es nicht verwunderlich, dass auch Bcl-xL und Bcl-2 erniedrigte Werte für den fold change aufweisen. Jedoch blieb der proapoptotisch wirkende Faktor Bax mit einer fold change von 0 in seiner Expression unverändert. In Studien ist bereits gezeigt worden, dass der Transkriptionsfaktor NF-κB eine anti-apoptotische Funktion über die gesteigerte Expression von Bcl-2-Homologen und Bcl-xL in verschieden Zelltypen ausübt (Pahl, 1999). Dieses Zusammenspiel zeigt sich auch in der vorliegenden Arbeit: NF-κB2 zeigte eine fold change von 0,46 auf, das Zielgene Bcl-xL hatte eine annähernd gleiche fold change von 0,45, während das Zielgen Bcl-2 eine fold change von 0,1 aufweist. Eine Korrelation der Expression von Bcl-2 und NF-κB ist bisher in Mammakarzinomen und in der chronisch-lymphatischen Leukämie (CLL) nachgewiesen worden (Viatour et al., 2003). In vielen Karzinomen ist eine Überexpression von Bcl-2 und Bcl-xL vorzufinden (Fernandez et al., 2002). Poincloux et al. vermuten in der Kolonkarzinogenese eine frühe und häufig gesteigerte Aktivität von Bcl-2 (Poincloux et al., 2009). Zum jetzigen Zeitpunkt geht man davon aus, dass Zellen mit erheblichen DNA-Schäden eine Überexpression des anti-apoptotischen Bcl-xL benötigen, um der Apoptose 67 entgehen zu können (Lomonaco et al., 2009), folglich wird die Entwicklung entarteter Zellen unterstützt. Auch die Entwicklung von Metastasen ist mit der Expression von Bcl-2 und Bcl-xL verknüpft: Fernandez et al. konnten in Studien zeigen, dass der Verlust der Apoptose in Krebszellen mit einer Entstehung von Metastasen verbunden ist und die Überexpression des anti-apoptotischen Faktors einem Überleben der Krebszellen in der Blutbahn dienen. Vor allem am Mammakarzinom konnte gezeigt werden, dass bei einer Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL die Wahrscheinlichkeit für Metastasen drastisch erhöht ist. In Studien konnte weiterhin festgestellt werden, dass Metastasen zwar schnell ein weiteres Organ infiltrieren können, aber ihre dortige Progression von den physiologischen Gegebenheiten abhängig ist. Hier schützt die Überexpression anti-apoptotisch wirksamer Proteine die Metastasen vor einem Zelluntergang solange bis die Konditionen zum Metastasenwachstum ideal sind (Fernandez et al., 2002). Den Studien von Viatour et al. nach erwartet man bei einer geringeren Expression des Transkriptionsfaktors NF-κB auch eine höhere Expression des Apoptose fördernden Faktors Bax (Viatour et al., 2003). In dieser Versuchsreihe war keine Veränderung der Expressionsrate von Bax zu vernehmen, was daraufhin deutet, dass die Transkription von Bax von einer anderen Seite weiterhin negativ beeinflusst wird oder dass die Erhöhung der Expression so gering ist, dass sie bei den gewählten Parametern keine nennenswerte Veränderung in der Expressionsrate aufweist. Innerhalb dieses Knock-down Experimentes zeigte sich eine erniedrigte Expression der antiapoptotisch arbeitenden Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL. Dieses Ergebnis liegt im Einklang mit der gemessen geringeren Expression des Transkriptionsfaktors NFκB, der für die Expression der anti-apoptotischen Gene verantwortlich gemacht wird (Pahl, 1999). Bei einer Überexpression von Keratin 23, wie es in manchen Karzinomen (Zhang et al., 2008) und in kolorektalen Adenomen vorzufinden ist (Sabates-Bellver et al., 2007), würde man durch eine Überexpression von NF-κB mit einer gesteigerten Expression von Bcl-2 und Bcl-xL rechnen. Somit könnte letztendlich durch eine initiale Überexpression von Keratin 23 die Apoptose der Zelle verhindert werden und die Karzinogenese Zellschaden gefördert werden. 68 bei vorbestehendem 5.5 Keratin 23 hat eine proliferationsfördernde Wirkung über das Protoonkogen c-myc Das Proto-Onkogen c-myc, welches zahlreiche Gene im Bereich des Zellwachstum und der Zellproliferation kontrolliert, (Krauss, 2008) ist für die Proliferation der Zelle unentbehrlich (Weber, 2007) und kann im Rahmen von fehlerhaften oder ungenügenden DNA-Reparaturmechanismen eine genomische Instabilität durch Genamplifikation hervorrufen (Gardner et al., 2002). In vielen humanen Karzinomen ist eine erhöhte Expression von c-myc nachgewiesen worden (Lin et al., 2010). In der vorliegenden Arbeit konnte eine geringere Expression von c-myc mit einer fold change von 0,7 gemessen werden. Unter Berücksichtigung des Knock-down Experimentes würde man bei einer in Adenomzellen vorhandenen Überexpression von Keratin 23 (Sabates-Bellver et al., 2007) über den NF-κB-Weg auch eine Überexpression von c-myc erwarten. Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist auch für die Regulation der Expression von cmyc verantwortlich (Chen et al., 1999, Tabruyn and Griffioen, 2008), speziell das Heterodimer p50/RelA initiiert hier die Transkription (La Rosa et al., 1994). In Fibroblasten, T- und B-Zell-Lymphomen kann durch eine Aktivierung des Faktors NF-κB die Transkription von c-myc gesteigert werden (Kirillova et al., 1999). Dieses Zusammenspiel zeigte sich auch in den Ergebnissen des ArrayVersuches: bei einer erniedrigten Expression von NF-κB ist die Expression von c-myc ebenfalls gemindert. Dies bedeutet, dass man im Umkehrschluss mit einer Erhöhung der Expression von c-myc durch eine gesteigerte Expression von NF-κB rechnen könnte. Diese Überlegung würde im Einklang mit bereits bekannten Überexpressionen von c-myc in Krebszellen stehen (Rupnarain et al., 2004). So findet sich in 90% der gynäkologischen Tumoren, 80% der Mammakarzinome, 70% der Kolonkarzinome sowie in 50% der hepatozellulären Karzinome eine Überexpression von c-myc (Gardner et al., 2002), was neben der NF-κB Aktivität auch auf eine erhöhte Aktivität von β-Catenin zurückzuführen ist (Gardner et al., 2002, Rupnarain et al., 2004). Die Karzinom fördernde Wirkung von c-myc findet sich auch in anderen Studien. So konnte gezeigt werden, dass c-myc induzierte DNA-Schäden die Mitose überstehen, in der G2-Phase des Zellzyklus nicht mehr repariert werden und somit eine 69 chromosomale Instabilität der Zelle, wie sie in Krebszellen vorhanden ist, begünstigt wird. Die Schädigung der DNA und die daraus resultierende genomische Instabilität wird zum einen durch eine von c-myc fehlerhaft regulierte Replikation mit DNA-Doppelbrüchen (Menssen et al., 2007) und zum anderen durch eine c-myc-abhängige Produktion reaktiver Sauerstoffradikale in den Mitochondrien begründet (Gardner et al., 2002). Unter Berücksichtigung des Knock-down Experimentes würde man somit bei einer erhöhten Expression von Keratin 23 in Adenomzellen durch die erhöhte Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB auch eine erhöhte Expression von cmyc erwarten. Damit würde Keratin 23 über die Wirkung von c-myc die Zellproliferation begünstigen und folglich auch eine Karzinogenese bestärken. 5.6 Keratin 23 reguliert die Apoptose über die Caspasen-3 und -7 Caspasen sind unersetzliche Bestandteile der Apoptose. Die Caspasen-3 und -7, deren Aktivität in dem durchgeführten Apoptose-Assay ermittelt wurde, sind zum einen für die Spaltung der DNA (Weber, 2007), der zytoplasmatischen und nukleären Proteine (Korfali et al., 2004) als auch für die Aktivierung von Apoptose begünstigenden Faktoren verantwortlich (Weber, 2007). In dem Apoptose-Assay präsentierte sich eine erhöhte Aktivität der Caspasen-3 und -7 in den Adenomzellen, die sich durch eine supprimierte Expression von Keratin 23 auszeichneten, was wiederum auf eine erhöhte Apoptoserate bei diesen Adenomzellen schließen lässt. Die anti-apoptotischen Faktoren Bcl-2 und Bcl-xL verhindern die Freisetzung von Cytochrom c. Somit wird die nachfolgende Aktivierung der Procaspase 9 verhindert, die somit wiederum die Procaspasen3, -6 und -7 über ein aktiviertes Apoptosom nicht aktivieren kann (Weinberg, 2007). Dieses Zusammenspiel zeigt sich auch in den Ergebnissen von ApoptoseAssay und Micro-Array: In den Keratin 23 supprimierten Zellen ein Abfall der Bcl-2- und Bcl-xL- Expression, der mit einer erhöhten Aktivität der Caspasen-3 und -7 bei gleichzeitiger Überexpression der Caspasen-3 und -7 einherging. Wenn man im Umkehrschluss davon ausgeht, dass kolorektale Adenomzellen 70 für gewöhnlich eine Überexpression von Keratin 23 aufweisen (Sabates-Bellver et al., 2007), so wäre die erhöhte Apoptoserate in den Keratin 23 supprimierten Zellen ein Hinweis dafür, dass bei einer Überexpression von Keratin 23 die Apoptoserate reduziert wäre. Eine Apoptosereduktion ist ein Charakteristikum der Karzinome (Weinberg, 2007) und würde hier Keratin 23 eine wichtige Rolle in der Karzinogenese zusprechen, indem Keratin 23 Signalwege einleitet, die die Apoptose durch Verminderung der Aktivität der Caspasen-3 und -7 unterdrücken. 5.7 Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese zu analysieren. Man nimmt an, dass Keratin 23 eine Rolle in der Karzinogenese spielt, da eine Überexpression von Keratin 23 in kolorektalen Adenomen (Sabates-Bellver et al., 2007) und auch Karzinomen nachgewiesen wurde (Rogers et al., 2004). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Keratin 23 vermehrt bei DNA-Schäden exprimiert wird, um dann den Zellzyklus über verschiedene Signalwege zu stoppen (BirkenkampDemtroder et al., 2007). Allerdings ist in Mikrosatelliten stabilen Karzinomen, die einen DNA-Schaden und eine erhöhte Expression von Keratin 23 aufweisen, die Inhibition des Zellzyklus zu Gunsten der Proliferation zur Unterstützung der Karzinogenese nicht mehr möglich (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007). Dies lässt vermuten, dass Keratin 23 entweder in Mikrosatelliten stabilen Zellen keine ausreichende Induktion der Apoptose veranlassen kann oder sogar proliferationsfördernde Wirkungen hat und auf diesen Wegen ein wichtiger Spieler in der Karzinogenese ist. In der vorliegenden Arbeit konnten wir Veränderungen in der Expression von verschiedenen Genen der Proliferation, Migration und der anti-apoptotischen Regulation unter Expressionssuppression von Keratin 23 in der Adenomzelllinie LT97 nachweisen. Diese differentiellen Genexpressionen geben Hinweise auf die Funktion und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarziongenese. 71 So konnte zum einen eine verringerte Expression des Tumor-Nekrose-Faktors TNF-α ermittelt werden. Dies bedeutet unter Berücksichtigung der Expression von Keratin 23, dass in Zellen mit erhöhter Expression von Keratin 23 auch eine erhöhte Expression von TNF-α zu erwarten wäre. Weiter konnte innerhalb der Signalkaskaden von TNF-α auch eine erniedrigte Expression des Transkriptionsfaktors NF-κB ermittelt werden. Auch hier würde man im Umkehrschluss mit einer erhöhten Expression von NF-κB bei einer Überexpression von Keratin 23 rechnen. Eine vermehrte Expression von NF-κB ist in vielen humanen Karzinomen nachgewiesen worden (Xiao, 2004) und unterstützt unsere Behauptung der vermehrten Expression von NF-κB aufgrund einer Überexpression von Keratin 23. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese, da NF-κB für die Expression einiger anti-apoptotischer Gene (Karin, 2006), für die Proliferation und die Zellmigration verantwortlich ist (Tabruyn and Griffioen, 2008). Ferner wurde auch bei Genen, deren Expression abhängig vom NF-κB Status ist, eine geringere Genexpression beobachtet, was das Zusammenspiel von NF-κB mit seinen Zielgenen betont. So ist zum einen die Expression der anti-apoptotisch wirkenden Faktoren Bcl-xL und Bcl-2 (Pahl, 1999), sowie die Expression des Proto-Onkogens c-myc im Knock-down Experiment herab reguliert (Tabruyn and Griffioen, 2008). Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass in Adenomzellen (Sabates-Bellver et al., 2007) und Mikrosatelliten stabilen Kolonkarzinomen mit einer Überexpression von Keratin 23 (Birkenkamp-Demtroder et al., 2007) auch eine erhöhte Expression von Bcl-xL, Bcl-2 und c-myc zu erwarten wäre. Neben der häufigen Überexpression von Bcl-xL und Bcl-2 in humanen Karzinomen (Zhao et al., 2004) ist auch eine gesteigerte Expression von Bcl-2 vor allem in kolorektalen Adenomen und Karzinomen gezeigt worden (Rupnarain et al., 2004). Auch dies unterstützt unsere Hypothese unter Berücksichtigung des Knock-down Experimentes, in denen wir eine erhöhte Expression von Bcl-xL und Bcl-2 in Adenomzellen mit einer Überexpression von Keratin 23 erwarten würden. Durch diesen Mechanismus würde Keratin 23 über die Funktion von Bcl-xL und Bcl-2 die Apoptose einer Zelle hemmen und folglich die Karzinogenese unterstützen. Auch die Expression des Proto-Onkogens c-myc 72 liegt innerhalb des Knock-down Experimentes im Einklang mit der Expression von NF-κB. Im Umkehrschluss würden wir hier bei einer Überexpression von Keratin 23 ebenfalls eine erhöhte Expression von c-myc erwarten. Eine Überexpression von c-myc in humanen Karzinomen ist schon vielfach bewiesen worden (Ryan and Birnie, 1996, Lin et al., 2010). Das Proto-Onkogen c-myc ist für viele Schritte in der Zellproliferation verantwortlich (Weber, 2007) und kann eine chromosomale Instabilität, die zur Entstehung von Karzinomen beitragen kann, begünstigen (Menssen et al., 2007). Dies würde bedeuten, dass durch die vermehrte Expression von c-myc, die bei einer Überexpression von Keratin 23 zu erwarten wäre, die Karzinogenese initial auf Grund der Überexpression von Keratin 23 begünstigt werden würde, indem die Adenomzellen eine verstärkte Proliferation erleben würden. Auch die Ergebnisse des Apoptose-Assay geben Indizien für eine Rolle von Keratin 23 in der Karzinogenese. So war in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen eine erhöhte Apoptoserate aufgrund einer gesteigerten Aktivität der Caspase-3 und -7 festzustellen. Diese erhöhte Aktivität lässt sich in Zusammenhang mit der erniedrigten Expression von Bcl-2 und Bcl-xL bringen, die über eine Vermittlung von Cytochrom c als Inhibitoren der Caspasen-3 und 7 gelten (Weinberg, 2007). Auch hier würde man Keratin 23 eine Funktion in der Karzinogenese zusprechen, da man wieder im Umkehrschluss in Adenomzellen mit einer Überexpression von Keratin 23 eine erniedrigte Apoptoserate durch gesteigerte Expression von Bcl-2 und Bcl-xL erwarten würde. Es ist bekannt, dass Faktoren wie TNF-α (Karin, 2006), NF-κB (Xiao, 2004) und die Zielgene Bcl-2, Bcl-xL (Zhang et al., 2008) und c-myc (Ryan and Birnie, 1996) in Karzinomen vermehrt exprimiert werden. In unserem Knockdown Experiment konnten wir eine verminderte Expression dieser Faktoren bei einer initialen Suppression der Expression von Keratin 23 finden. Dies ist ein Indiz dafür, dass die Expression von TNF-α, dem TNF-α-abhängigen Faktor NFκB und dadurch auch die Expression weiterer Zielgene wie Bcl-2 und Bcl-xL sowie nachfolgend der Caspasen-3 und-7 unter anderem von dem Status der Keratin 23 Expression abhängig sein könnten. Über die zellulären Wirkungen dieser Faktoren würde Keratin 23 sowohl die Proliferation einer Zelle 73 begünstigen als auch die Apoptose hemmen. Folglich würde Keratin 23 die Karzinogenese in Adenomzellen begünstigen. 5.8 Bewertung der Ergebnisse und Perspektive für weitere Projekte In der vorliegenden Arbeit wurde an einem Kolonadenomzelllinien-Modell die mögliche Funktionen und Bedeutung von Keratin 23 in der Kolonkarzinogenese untersucht. Der Genexpression durchgeführte für die Array-Versuch Karzinogenese und zeigte vor eine allem differenzielle die Apoptose beeinträchtigende Gene wie TNF-α, NF-κB und Bcl-2, Bcl-xL sowie c-myc. Die Ergebnisse im Array-Versuch veranlassten uns die Apoptoserate der Keratin 23 supprimierten Zellen in einem Apoptose-Assay zu überprüfen. Die Zusammenhänge der Ergebnisse aus Micro-Array und Apoptose-Assay deuten auf eine Keratin 23-abhängige Genregulation, die in den Keratin 23 supprimierten Zellen zu einer erhöhten Apoptose führt. Unsere Ergebnisse geben erste Hinweise auf eine Funktionsrichtung von Keratin 23, die durch eine differenzierte Genregulation von anti-apoptotischen und proliferationsfördernden Faktoren ausgeübt wird. Um eine bessere statistische Aussagekraft der Ergebnisse zu erlangen, sollten sowohl die Micro-Array Untersuchung als auch der Apoptose-Assay in mindestens drei biologischen Repilkaten der LT97 Linie durchführt werden. Für zukünftige Projekte wäre denkbar, die Suppression von Keratin 23 in unterschiedlichen Kolonkarzinomzelllinien parallel durchzuführen, um z.B. mittels quantitativer Real Time-PCR die Frage zu klären, ob die beobachteten Keratin 23 Zielgene Zelllinien-spezifisch reguliert werden oder ob sie vielmehr Zelllinien- übergreifend in Kolonkarzinomzellen Keratin 23-abhängig reguliert werden. Weiterhin könnte man im Rahmen von in-vitro Versuchen wie ProliferationsAssay und Zell-Zyklus-Assay die Keratin 23 abhängigen Veränderungen der Zelllinien untersuchen. So dienen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit als erste Schritte in der Funktionsanalyse von Keratin 23 innerhalb der 74 Kolonkarziongenese und erlauben eine erste Richtung der Auswirkungen einer Keratin 23-Überexpression in der Kolonkarzinogenese anzugeben. 75 6. Zusammenfassung Keratine haben für die Karzinogenese eine große Bedeutung, da sie zum einen zur Differenzierung des Ursprungs vieler Karzinomerkrankungen genutzt werden können (Schweizer et al., 2006) und zum anderen häufig das Wachstum und die Migration von Tumorzellen beeinflussen (Chu et al., 1993). Eine Überexpression von Keratin 23 konnte bisher sowohl in diversen Karzinomen (Rogers et al., 2004) als auch in kolorektalen Adenomen (Sabates-Bellver et al., 2007) und Karzinomen nachgewiesen werden (Rogers et al., 2004). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bedeutung von Keratin 23 innerhalb der Kolonkarzinogenese zu ermitteln. Hierzu wurden mittels retroviralen Gentransfers mit dem shRNA Vektorsystem pLKO shKRT23-1506 die KRT23 Expression in der Adenomzelllinie LT97 stabil supprimiert. Die KRT23Suppression wurde mittels quantitativer Real Timer-PCR bestätigt. Mit Hilfe der globalen Genexpressionsanalyse fand sich in KRT23-supprimierten Zellen gegenüber den Kontrollzellen eine differenzielle Genregulation für Gene, die z.B. die Proliferation (hier NF-κB und c-myc) oder die Apoptose (hier Bcl-2 und und Bcl-xL) modulieren. Ein Apoptose Assay konnte ferner funktionell die gesteigerte Apoptoserate in den KRT23-supprimierten Zellen belegen. Die erzielten Ergebnisse weisen somit darauf hin, dass die gesteigerte KRT23 Expression, die in der Kolonkarzinomprogression beobachtet wurde, zum einen durch Veränderungen im NF-κB-abhängigen Signalweg die Tumorzellproliferation unterstützt und zum anderen die Apoptoserate (Bcl-2, Bcl-xL) reduziert, was indirekt wiederum dem Tumorwachstum zugutekommt. Einschränkend muss gesagt werden, dass die vorliegenden Befunde an einer Zelllinie erhoben wurden, so dass weitere Untersuchungen notwendig sind, damit die Rolle von KRT23 in der Kontrolle der Zellproliferation Kolonkarzinom abschließend beurteilt werden kann. 76 und Apoptoserate beim 7. Literaturverzeichnis Aiello, M., Vella, N., Cannavò, C., Scalisi, A., Spandidos, D. A., Toffoli, G., Buonadonna, A., Libra, M. and Stivala F. (2011). Role of genetic polymorphisms and mutations in colorectal cancer therapy (Review). Molecular medicine reports 4 (2), 203-208 Anderson, G. R., Stoler, D. L. and Bartos, J. D. (2005). Mutagenesis, Malignancy and Genome Instability. in Meyers, R. A. (Hrsg.). Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine Band 9. Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 1-18 Aoki, K. and Taketo, M. M. (2007). Adenomatous polyposis coli (APC): a multifunctional tumor suppressor gene. Journal of Cell Science 120, 3327-3335 Beg, A. A., Sha, W. C., Bronson, R. T. and Baltimore, D. (1995). Constitutive NF-κB activation, enhanced granulopoiesis, and neonatal lethality in IκBαdeficienmt mice. Genes & Development 9, 2736-2746 Behrens, J. (2005). The role of the WNT signaling pathway in colorectal tumorigenesis. Biochemical Society Transactions 33, 672-675 Bernard, D., Monte, D., Vandenbunder, B. and Abbadie, C. (2002). The c-Rel transcription factor can both induce and inhibit apoptosis in the same cells via the upregulation of MnSOD. Oncogene 21, 4392-4402 Birkenkamp-Demtroder, K., Mansilla, F., Sørensen, F. B., Kruhøffer, M., Cabezón, T., Christensen, L. L., Aaltonen, L. A., Verspaget, H. W. and Ørntoft, T. F. (2007). Phosphoprotein Keratin 23 accumulates in MSS but not MSI colon cancers in vivo and impacts viability and proliferation in vitro. Molecular Oncology 1 (2), 181-95 77 Bouwmeester, T., Bauch, A., Ruffner, H., Angrand, P. O., Bergamini, G., Croughton, K., Cruciat, C., Eberhard, D., Gagneur, J., Ghidelli, S., Hopf, C., Huhse, B., Mangano, R., Michon, A. M., Schirle, M., Schlehl, J., Schwab, M., Stein, A. M., Bauer, A., Casari, G., Drewes, G., Gravin, A. C., Jackson, D. B., Joberty, G., Neubauer, G., Rick, J., Kuster, B. and Superti-Furga, G. (2004). A physical and functional map of the human TNF-a/NF-KB siganl transduction. Nature Cell Biology 6 (2), 97-105 Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25, 169-193 Carré, M. and Braguer, D. (2008). Microtubule Damaging Agents and Apoptosis. in Fojo, A. T. (Hrsg.). The Role of Microtubules in Cell biology, Neurobiology, and Oncology. Humana Press, Totowa, 479-518 Caulin, C., Ware, C. F., Magin, T. M. amd Oshima, R. G. (2000). Keratindependent, Epithelial Resistance to Tumor Necrosis Factor-induced Apoptosis. The Journal of Cell Biology 149, 17-22 Chen, F., Castranova, V., Shi, X. and Demers, L. M. (1999). New Insights into the Role of Nuclear Factor NF-kB, a Ubiquitous Transcription Factor in the Initiation of Disease. Clinical Chemistry 45 (1), 7-17 Cheong, R. and Levchenko, A. (2005). Transcription Factor NF-κB: Function, Structure, Regulation Pathways, and Applications. in Meyers, R. A. (Hrsg.). Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine Band 14. Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 437-471 78 Chu, Y. W., Runyan, R. B., Oshima, R. G. and Hendrix, M. J. C. (1993). Expression of complete keratin filaments in mouse L cells augments cell migration and invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 4261-4265 Conus, S., Kaufmann, T., Fellay, I., Otter, I., Rossé, T. and Borner, C. (2000). Bcl-2 is a monomeric protein: prevention of homodimerization by structural constraints. The European Molecular Biology Organization Journal 19 (7), 1534-1544 Daigeler, A., Brenzel, C., Bulut, D., Geiler, A., Hilgert, C., Lehnhardt, M., Steinau, H. U., Flier, A., Steinstraesser, L., Klein-Hitpass, L., Mittelkötter, U., Uhl, W. and Chromik, A. M. (2008). TRAIL and Taurolidine induce apoptosis and decrease proliferation in human fibrosarcoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 27 (1), 82 Dang, C. V. (1999). c-Myc Target Genes Involved in Cell Growth, Apoptosis, and Metbolism. Molecular and cellular biology 19 (1), 1-11 Demchenko, Y. N. and Kuehl, W. M. (2010). A critical role of NF-κB pathway in multiple myeloma. Oncotarget 1 (1), 59-68 Doninger, S. W., Salomonis, N., Dahlquist, K. D., Vranzian, K., Lawlor, S. C. and Conklin, B. R. (2003). MAPPFinder: using Gene Ontology and GenMAPP to create a global gene-expression profile from microarray data. Genome Biology 4 (1), R7 Draghici, S., Khatri, P., Tarca, A. L., Amin, K., Done, A., Voichita, C., Georgescu, C. and Romero, R. (2007). A systems biology approach for pathway level analysis. Genome Research 17, 1537-45 79 Eilers, M. (2009). Zellzyklus und Zelltod. in Schartl, M., Gessler, M. and von Eckardstein, A. (Hrsg.). Biochemie und Molekularbiologie des Menschen. Urban & Fischer, München, 671-685 Fearon, E. and Vogelstein, B. (1990). A genetic model for colorectal carcinoma. Cell 61, 10199-10204 Fernandez, Y., Gu, B. Martínez, A., Torregrosa, A. and Sierra, A. (2002). Inhibtion of apoptoses in human breat cancer cells: role in tumor progression to the metastatic state. International Journal of Cancer 101, 317-326 Fiebig, A. A., Zhu, W., Hollerbach, C., Leber, B. and Andrews, D. W. (2006). Bcl-XL is qualitatively different from and ten times more effective than Bcl-2 when expressed in a breast cancer cell line. BMC Cancer 6, 213 Friedrich, K. H. and Behrmann, I. (2009). Zelluläre Signalprozesse. in Schartl, M., Gessler, M. and von Eckardstein, A. (Hrsg.). Biochemie und Molekularbiologie des Menschen. Urban & Fischer, München, 631-685 Fuchs, E. (1994). Intermediate Filaments and Disease: Mutations that Cripple Cell Strength. The Journal of Cell Biology 125 (3), 511-516 Fuchs, E. (1996). The Cytoskeleton and Disease: Genetic Disorders of Intermediate Filaments. Annual Review of Genetics 30, 197-231 Gardner, L. B., Lee, L. A. and Dang, C. V. (2002). c-myc Protooncogene. in Bertino, J. R. (Hrsg.). Encyclopedia of Cancer. Academic Press, London Oxford Boston New York and San Diego, 555-561 80 Graw, J. (2010). Genetik. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Green, D. R. (2007). Apoptosis. in Lewin, B., Cassimeris, L., Lingappa, V. R. and Plopper, G. (Hrsg.). Cells. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, 533-559 Heusch, M., Lin, L., Geleziunas, R. and Greene, W. C. (1999). The generation of nfkb2 p52: mechanism and efficiency. Oncogene 18, 6201-6208 Izawa, I. and Inagki, M. (2006). Regulators mechanisms and functions of intermediate filaments: a study using site- and phosphorylation state-specific antibodies. Cancer Sciense 97, 167-174 Jobin, C. and Sartor, R. B. (2000). The Ikappa B/NF-kappa B system: a key determinant of mucosal inflammation and protection. American Journal of Physiology Cell Physiology 278, 451-462 Jurek, D., Udilova, A., Jozkowicz, A., Nohl, H., Marian, B. and Schulte-Hermann, R. (2004). Dietry lipid hydroperoxides induce expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human colorectal tumor cells. The FASEB journal 19 (1), 97-99 Jurk, M. (2006). Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren. in Lottspeich, F. and Engels, J. W. (Hrsg.). Bioanalytik. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag, München, 634-651 Jurk, M. and Engels, J. W. (2006). Aufarbeitung von Nucleinsäuren. in Lottspeich, F. and Engels, J. W. (Hrsg.). Bioanalytik. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag, München, 653-681 81 Karin, M. (2006). Nuclear factor-κB in cancer development and progression. Nature 441, 431-436 Karlsson, A., Ded-Basu, D., Cherry, A. Turner, S., Ford, J. and Flesher, D. W. (2003). Defective double-strand DNA break repair and chromosomal translocations by MYC overexpression. PNAS 100 (17), 9974-9979 Kessler, C. (2006). Polymerasekettenreaktion. in Lottspeich, F. and Engels, J. W. (Hrsg.). Bioanalytik. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag, München, 743-775 Kessler, D. J., Duyao, M. P., Spicer, D. B. and Soneshein, G. E. (1992). NF-κBlike Factors Mediate Interleukin 1 Induction c-myc Gene Transcription in Fibroblasts. The Journal of Experimental Medicine 176, 787-792 Kiaris, H. (2006). The Cell's Life and Death: Cell cycle. Senescence and Apoptosis. in Kiaris, H. (Hrsg.). Understanding Carcinogenesis. Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 5-13 Kim, H., Nam, S. W., Rhee, H., Li, L. S., Khang, H. J., Koh, K. H., Kim, N. K., Song, J., Liu, E. T. and Kim, H. (2004). Different gene expression profiles between microsatellite instability-high and microsatellite stable colorectal carcinomas. Oncogene 23, 6218-6225 Kirfel, J., Magin, T. M. and Reichelt, J. (2003). Keratins: a structural scaffold with emerging functions. Cellular and molecular life sciences 60, 56-71 Kirillova, I., Chaisson, M. and Fausto, N. (1999). Tumor Necrosis Factor Induces DNA Replication in Hepatic Cells through Nuclear Factor κB Activation. Cell Growth & Differentiation 10, 819-828 82 Korfali, N., Ruchaud, S., Loegering, D., Bernard, D., Dingwall, C., Kaufmann, S. H. and Earnshaw, W. C. (2004). Caspase-7 Gene Disruption Reveals an Involvement of the Enzyme during the Early Stages of Apoptosis. The Journal of biological chemistry 279, 1030-1039 Krauss, G. (2008). Biochemistry of Signal Transduction and Regualtion. Wiley-VCH Verlag, Weinheim Kucharczak, J., Simmons, M. J., Fan, Y. and Gélinas, C. (2003). To be, or not to be: NF-KB is the answer-role of Rel/NF-KB in the regulation of apoptosis. Oncogene 22, 8961-8982 Kullmann, F. (2001). Familiäre Formen des kolorektalen Karzinoms - Gentik, Klinik und Diagnostik. in Schölmerich, J., Schmiegel, W. (Hrsg.). Leitfaden kolorektales Karzinom Prophylaxe, Diagnsotik, Therapie. Uni-Med Verlag, Bremen, 40-50 Kuribayashi, K., Mayes, P. A. and El-Deiry, W. S. (2006). What are Caspases 3 and 7 Doing Upstream of the Mitochonria?. Cancer Biology & Therapy 5 (7), 763-765 La Rosa, F., Pierce, J. W. and Soneshein, G. E. (1994). Differential Regulation of the c-myc Oncogene Promoter by the NF-KB Rel Family of Transcription Factors. Molecular and cellular biology 14 (2), 1039-1044 Lakhani, S. A., Masud, A., Kuida, K., Porter, G. A. Jr., Booth, C. J., Mehal, W. Z., Inayat, I. and Flavell, R. A. (2006). Caspases 3 and 7: key mediators of mitochondrial cell death. Science 311, 847-851 Lekanne Deprez, R. H., Fijnvandraat, A. C. Ruijter, J. M. and Moorman, A. F. M. (2002). Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain 83 reaction using SYBR green I depends on cDNA synthesis conditions. Analytical Biochemistry 307, 63-69 Lin, C.-P., Liu, C.-R., Lee, C.-N., Chan, T.-S. and Liu H. E. (2010). Targeting cMyc as a novel approach for hepatocellular carcinoma. World journal of hepatology 2 (1), 16-20 Liu, G.-Y., Luo, Q., Xiong, B., Pan, C., Yin, P., Liao, H.-F., Zhuang, W.-C. and Gao, H.-Z. (2008). Tissue array for Tp53, C-myc, CCND1 gene over-expression in different tumors. World Journal of Gastroenterology 14 (47), 7199-7207 Liu, W. and Saint, D. A. (2002). Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. Biochemical and Biophysical Research Communication 294, 347-353 Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D. and Darnell, J. (2001). Molekulare Zellbiologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Lomonaco, S. L., Xu, X. S. and Wang, G. (2009). The Role of Bcl-x(L) Protein in Nucleotide Excision Repair-Facilitated Cell Protection Against Cisplatin-Induced Apoptosis. DNA and Cell Biology 28 (6), 285-294 Majerciak, V., Kruhlak, M., Dagur, P. K., McCoy Jr, J. P. and Zheng, Z.-M. (2010). Caspase-7 cleavage of Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus ORF57 confers a cellular function against viral lytic gene expression. The Journal of biological chemistry 285 (15), 11297-11307 Mauritz, I., Wetsermayer, S., Marian, B., Erlach, N., Grusch, M. and Holzmann, K. (2006). Prostaglandine E2 stimulates progression-related gene expression in early colorectal adenoma cells. British Journal of Cancer 94, 1718-1725 84 Menssen, A., Epanchintsev, A., Lodygin, D., Rezaei, N., Jung, P., Verdoodt, B., Diebold, J. and Hermeking, H. (2007). c-Myc delays prometaphase by direct transactivation of MAD2 und BubR1. Cell Cycle 6 (3), 339-352 Müller, H.-J. and Röder, T. (2004). Der Experimentator Microarrays. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag, München Oshima, R. G. (2002). Apoptosis and keratin intermediate filaments. Cell Death and Differentiation 9, 486-492 Owens, D. W. and Lane, E. B. (2003). The quest for the fundtion of simple epithelial keratins. Bioessays 25 (8), 748-758 Pahl, H. L. (1999). Activators and target genes of Rel/NF-KB transcriptions factors. Oncogene 18, 6853-6866 Papalampros, A. E., Petrou, A. S., Mantonakis, E. I., Evangelou, K. I., Giannopoulos, L. A., Marinos, G. G. and Giannopoulos, A. L. (2011). Coexistence of a colon carcinoma with two distinct renal cell carcinomas: a case report. Journal of medical case reports 5 (1), 134 Poincloux, L., Durando, X., Seitz, J. F., Thivat, E., Bardou, V.-J., Giovannini, M.H., Parriaux, D., Barriere, N., Giovanni, M., Delpero, J.-R. and Monges, G. (2009). Loss of Bcl-2 expression in colon cancer: Aprognostic factor for recurrence in stage II colon cancer. Surgical Oncology 18, 357-365 Ravi, R. and Bedi, A. (2002). Sensitization of tumor cells to Apo2 ligand/TRAILinduced apoptosis by inhibition of casein kinase II. Cancer Research 62, 41804185 85 Renz-Polster, H. (2006). Kolorektales Karzinom. in Renz-Polster, H., Krautzig, S., Braun, J. (Hrsg.) Basislehrbuch Innere Medizin. Urban & Fischer, München Jena, 590-594 Richter, M., Jurek, D., Kaserer, K., Wurzer, G., Karner-Hanusch, J. and Marian, B. (2002). Cells obtained from colorectal microadenomas mirror early premalignant growth patterns in vitro. European Hournal of Cancer 38, 19371945 Robey, H. L., Hiscott, P. S. and Grierson, I. (1992). Cytokeratins and retinal epithelial cell behaviour. The Journal of Cell Science 102, 329-340 Rogers, M. A., Winter, H., Langbein, L., Bleiler, R. and Schweizer, J. (2004). The human type I keratin gene family: characterization of new hair follicle specific members and evaluation of the chromosome 17q21.2 gene domain. Differentiation 72 (9-10), 527-40 Rupnarain, C., Dlamini, Z., Naicker, S. and Bhoola, K. (2004). Colon cancer: genomics and apoptotic events. Biological Chemistry 385, 449-464 Ryan, K. M. and Birnie, G. D. (1996). Myc oncogenes: the enigmatic family. Biochemical Journal 314, 713-721 Sabates-Bellver, J., Van der Flier, L. G., de Palo, M., Cattaneo, E., Maake, C., Rehrauer, H., Laczko, E., Kurowski, M. A., Bujnicki, J. M., Menigatti, M., Luz, J., Ranalli, T. V., Gomes, V., Pastorelli, A., Faggiani, R., Anti, M., Jiricny, J., Clevers, H. and Marra, G. (2007). Transcriptome Profile of Human Colorectal Adenomas. Molecular Cancer Research 5 (12), 1263-1275 Schmiegel, W., Pox, C., Reinacher-Schick, A., Adler, G., Fleig, W., Fölsch, U. R., Frühmorgen, P., Graeven, U., Hohenberger, W., Holstege, A., Junginger, T., Kopp, I., Kühlbacher, T., Porschen, R., Propping, P., Riemann, J.-F., Rödel, C., 86 Sauer, R., Sauerbruch, T., Schmitt, W., Schmoll, H.-J., Zeitz, M. and Selbmann, H. -K. (2008). S3-Leitlinie „Kolorektales Karzinom“ Ergebnisse evidenzbasierter Konsensuskonferenzen am 6./7. Februar 2004 und am 8./9. Juni 2007 (für die Themenkomplexe IV, VI und VII) S3-Guideline „Colorectal Cancer“ 2004/2008. Zeitschrift für Gastronenterologie 46, 1-73 Schoop, R. A. L., Kooistra, K., Baatenburg de Jong, R. J. and Noteborn, M. H. M. (2004). Bcl-xL inhibits p53- but not apoptin-induced apoptosis in head and neck squamous cell carcinoma cell line. International Journal of Cancer 109, 38-42 Schulenburg, A., Cech, P., Herbacek, I., Marian, B., Wrba, F., Valent, P. and Ulrich-Pur, H. (2007). CD44-positive colorectal adenoma cells express the potential stem cell markers musashi antigen (msi1) and ephrin B2 receptor (EphB2). Journal of Pathology 213, 152-160 Schulze-Bergkamen, H., Ehrenberg, R., Hickmann, l., Vick, B., Urbanik, T., Schimanski, C. C., Berger, M. R., Schad, A., Weber, A., Heeger, S., Galle, P. R. and Moehler, M. (2008). Bcl-xL and Myeloid cell leukaemia-1 contribute to apoptosis resistance of colorectal cancer cells. World Journal of Gastroenterology 14 (24), 3829-3840 Schumm, K., Rocha, A., Caamano, J. and Parkins, N. D. (2006). Regulation of p53 tumour suppressor target gene expression by the p52 NF-κB subunit. The European Molecular Biology Organization Journal 25 (20), 4820-4832 Schweizer, J., Bowden, P. E., Coulombe, P. A., Langbein, L., Lane, E. B., Magin, T. M., Maltais, L., Omary, M. B., Parry, D. A. D., Rogers, M. A. and Wright, M. W. (2006). New consensus nomenclature for mammalian keratins. The Journal of Cell Biology 174 (2), 168-174 87 Seeling, J., Miller, J. R., GIl, R., Moon, R. T., Ehite, R. and Virshuo, D. M. (1999). Regulation of b-catenin sihnaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science 383, 2089-2091 Sgorbissa, A., Benetti, R., Marzinotto, S., Schneider, C. and Brancolini, C. (1999). Caspase-3 and Caspase-7 but not caspase-6 cleave Gas2 in vitro: implications for microfilament reorganization during apoptosis. Journal of Cell Signs 112, 4475-4482 Sheehy, A. M. and Schlissel, M. S. (1999). Overexpression of RelA Causes G1 Arrest and Apoptosis in a Pro-B Cell Line. The Journal of biological chemistry 274 (13), 8708-8716 Shipley, G. L. (2005). Real-Time Quantitative PCR: Theory and Practice. in Meyers, R. A. (Hrsg.). Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine Band 11. Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 481-523 Sinn, E., Muller, W., Pattengale, P., Tepler, I., Wallace, R. and Leder, P. (1987). Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: Synergistic action of oncogenes in vivo. Cell 49 (4), 465-475 Sobin, L., Gospodarowicz, M. and Wittekind, C. (2009). TNM Classification of Malignant Tumours Seventh Edition. Wiley-Blackwell, Weinheim Stoneley, M., Chapell, S. A., Jopling, C. L., Dickens, M., MacFarlane, M. and Willis, A. E. (2000). c-Myc Protein Synthesis Is Initiated from the Internal Ribosome Entry Segment during Apoptosis. Molecular and cellular biology 20 (4), 1162-1169 88 Tabruyn, S. and Griffioen, A. W. (2008). NF-κB: a new player in angiostatic therapy. Angiogenesis 11, 101-106 Theriot, J., Amos, L., Cooper, J., Fuchs, E., Gertler, F., Goldstein, L., Howard, J., Machesky, L., McNally, F., Mitchison, T., Solomon, F. and Waterman-Storer, C. (2004). Das Cytoskelett. in Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. (Hrsg.). Molekularbiologie der Zelle. Wiley-Vch Verlag, Weinheim, 1055-1140 Thomas, R. K., Sos, M. L., Zander, T., Mani, O., Popov, A., Berenbrinker, D., Smola-Hess, S., Schultze, J. L. and Wolf J. (2005). Inhibtion of Nuclear Translocation of Nuclear-κB Despite Lack of Functional IκBα Protein Overcomes Multiple Defects in Apoptosis Signaling in Human B-Cell Malignancies. Clincal Cancer Research 11 (22), 8186-8194 Viatour, P., Bentires-Alj, M., Chariot, A., Deregowski, V., de Leval, L., Merville, M.-P. and Bours, V. (2003). NF-κB2/p100 induces Bcl-2 expression. Leukemia 17, 1349-1356 Wacheck, V., Selzer, E., Guünsberg, P., Lucas, T.,Meyer, H.,Thallinger, C., Monia, B. P. and Jansen, B. (2003). Bcl-xL antisense oligonucleotides radiosensitise colon cancer cells. British Journal of Cancer 89, 1352-1357 Weber, G. F. (2007). Molecular Mechanisms of Cancer. Springer, Dordrecht Weinberg, R. A. (2007). The biology of cancer. Garland Sciene Taylor & Francis Group, New York Wenner, C., Lorkowski, S. and Cullen, P. (2003). Housekeeping genes, internal and external standards. 89 in Lorkowski, S., Cullen, P. (Hrsg.). Analysing Gene Expression. Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 63-65 Xiao, W. (2004). Advances in NF-κB Signaling Transduction and Transcription. Cellular & Molecular Immunology 1 (6), 425-435 Yamada, S., Wirtz, D. and Coulombe, P. A. (2002). Pairwise Assembly Determines the Intrinsic Potential for Self-Organization and Mechanical Properties of Keratin Filaments. Molecular Biology of the Cell 13, 382-391 Zhang, Y.-L., Pang, L.-Q., Wu, Y., Wang, X.-Y., Wang, C.-Q. and Fan, F. (2008). Significance of Bcl-xL in human colon carcinoma. World Journal of Gastroenterology 14 (19), 3069-3073 Zhao, W.-L., Daneshpouy, M. E., Mounier, N., Brière, J., Leboeuf, C., Plassa, L.F., Turpin, E., Cayuela, J.-M., Ameisen, J.-C., Gisselbrecht, C. and Janin, A. (2004). Prognostic significance of bcl-xL gene expression and apoptotic cell counts in follicular lymphoma. blood 103, 695-697 Zhao, D.-P., Ding, X.-W., Peng, J.-P., Zheng, Y.-X. and Zhang, S.-Z. (2005). Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorecatal carcinoma. Journal of Zhejiang University Science B 6 (12), 1163-1169 Zhao, X., Sun, X., Gao, F., Luo, J. and Sun, Z. (2011). Effects of ulinastatin and docataxel on breast tumor growth and expression of IL-6, IL-8, and TNF-α. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 30, 22 90 8. Anhang 8.1 Verwendete Materialien Tabelle A 1: Chemikalien. Chemikalie Hersteller 3-Morpholino-1-Propansulfonsäure AppliChem Agarose Roth Ammoniumsulfat Merck Bromphenolblau Merck Calciumchlorid Invitrogen Chloroform J. T. Baker DEPC-H2O Roth DMEM Invitrogen Dinatriumhydrogenphosphat J. T. Baker dNTPs Promega Dithiothreitol (DTT) Invitrogen EDTA Sigma-Aldrich EGF Sigma-Aldrich Ethanol absolut Sigma-Aldrich Ethidiumbromid Fluka F12 Hams Invitrogen FCS Invitrogen Ficoll® 400 Invitrogen Formaldehyd J. T. Baker Formamid J. T. Baker Glycerin Roth Guanidiniumthiocyanat Roth HEPES Roth Hydrocortison Sigma-Aldrich Insulin Sigma-Aldrich Isopropanol J. T. Baker 91 Chemikalie Hersteller Kaliumchlorid Roth L-Glutamin Invitrogen Magnesiumchlorid Invitrogen Natriumacetat Merck Natriumchlorid Sigma-Aldrich Natriumcitrat Roth Natriumhydroxid J. T. Baker Natrium-Selenit Sigma-Aldrich Natrium-Pyruvat Invitrogen Oligo-(dT)-Primer Qiagen PBS Invitrogen Penicillin Invitrogen Phenol Roth Polybren Sigma-Aldrich Sarcosyl (N-Lauroyl-Sarcaosin) Sigma-Aldrich SDS Biomol Streptomycin Invitrogen SYBR Green I BioWittaker Nucleic Acid Gel Staining Invitrogen Transferrin Sigma-Aldrich Trisidol-L-Thyronin Sigma-Aldrich Trypsin / EDTA Invitrogen Tween® 20 Acros Organics Xylencyanol Merck β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 92 Tabelle A 2: Lösungen und Puffer. Lösung / Puffer Konzentration Komponente DMEM-Medium 865 μM Natriumpyruvat 2 mM L-Glutamin 100 U/mL Penicillin 100 μM Streptomycin 10% (w/v) FCS DNA-Probepuffer 15% (w/v) Ficoll® 400 für SB (5x) 50 mM EDTA 0,1% (w/v) SDS 0,004% (w/v) Xylencyanol 0,004% (w/v) Bromphenolblau (in 1xSB-Puffer) dNTP-Mix 10 mM dATP 10 mM dCTP 10 mM dGTP 10 mM dTTP Ethanol 70% (w/v) Ethidiumbromid 1% (w/v) HBS (2x) 0,28 M Natriumclorid 0,05 M HEPES (ph = 7,1) 1,5 mM Dinatriumhydrogenphos phat Magnesiumchlord 10 mM MOPS-Puffer (10x) 200 mM 3–Morpholino–1– Propansulfonäure 50 mM Natriumacetat 10 mM EDTA 10 M Natriumhydroxid Natriumacetat (pH 4) 2M Natriumacetat (pH 5,2) 3M 93 Lösung / Puffer Konzentration Komponente PBS 137 mM Natriumchlorid 2,7 mM Kaliumchlorid 8 mM Dinatriumhydrogenphos phat 2 mM Kaliumdihydrogenphosp hat RNA-Probenpuffer SB-Puffer 4 mM EDTA 0,9 mM (v/v) Formaldehyd 20% (v/v) Glycerin 30,1% (v/v) Formamid 4x MOPS 5 mM Dinatriumtetraboratdec ahydrat (pH 8) Solution D TrisAs-Puffer (10x) Trypsin-EDTA 4M Guanidiniumthiocyanat 25 mM Natriumcitrat-Dihydrat 0,5% (v/v) Sarcosyl 750 mM Tris-HCl (pH 8,8) 200 mM Ammoniumsulfat 0,1% Tween® 20 0,25% Trypsin 1 mM EDTAx4Na Turbo-DNase-Puffer (10x) 400 mM Tris-HCl (pH 7,9) 10 mM Calciumchlorid 60 mM Magnesiumchlorid 100 mM Natriumchlord 94 Tabelle A 3: Zelllinien. Zelllinie Beschreibung LT97 Epithelialie Adenomzelllinie Mic307-4 Fibroblasten (HEK) 293T Embryonales Nierenepithel isoliert Tabelle A 4: Plasmide. Plasmid Beschreibung VSVG pHIT G Hilfsvektor bei der Pseudotypisierung von lentiviralen Partikeln1 pCMV ΔR8.2 Hilfsvektor für die Produktion lentiviraler Partikel1 pLKO shKRT 23-1506 Keratin 23 suppremierender Vektor2 pLKO puro LV Leervektor2 pRRLUG CPPT pSK GFP GFP-Expressionsvektor1 Tabelle A 5: Primer. Primer Meß- Primer- Sequenz (5’-3’) temperatur Effizienz PPIA for PPIA rev GAPB for GAPB rev HPRT1 for HPRT1 rev KRT23 1625S KRT23 748AS 1 2 81-82 °C 1,797 80 °C 1,927 78-19 °C 1,9 80-82 °C 1,956 CAAATGCTGGACCCAACACA CTTGCTGGTCTTGCCATTCC TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG TGACACTGGCAAAACAATGCA GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT GAACTGGAGCGGCAGAACA TTGATTCTTCCCGTGTCCCTT Freundlicherweise von Klaus Überla, Medizinische Virologie, Ruhr-Universität-Bochum zu Verfügung gestellt eigene Herstellung 95 Tabelle A 6: Enzyme. Enzym SuperScript Aktivität II Hersteller reverse 200 U / μl Invitrogen Transcriptase Taq-Polymerase 5 U / μl New England Biolabs Turbo-Dnase 2 U / μl Ambion Tabelle A 7: Molekulargewichtstandarde für DNA. Marker Hersteller Smart Ladder SF Eurogentec Tabelle A 8: Komplettsets. Set Hersteller Caspase-Glo® 3/7Assay Promega Array Agilent Technologies Tabelle A 9: Geräte. Artikel Hersteller Analysewaagen BL 1500 S Sartorius BP 121 S Sartorius Cycler CFD-3220 Opticon 2 Detector MJ Research Mastercycler® Eppendorf Gelelektrophorese-Apparaturen PerfectBlue Mini L peqLab Protean 2 Mini Bio-Rad Mikroskop BX51 Olympus Mikroskop CK30 Olympus 96 Artikel Hersteller TSC SP2 Leica Photometer Nanodrop® Spectrophotometer ND- peqLab 1000 Pipetten Research® 1000μl, 200μl, 20μl, 10μl Eppendorf Schüttler Inkubationsschüttler HT Infors AG Kreisschüttler 3005 GFL Thermomixer KTM 100 RP HLC Biotech Vortex-Genie® 2 G-560E Scientific Industries Zentrifugen Heraeus Multifuge 3S-R Thermo Scientific Vortex-Genie® 2 G-560E Scientific Industries Tischzentrifuge 5415 D Eppendorf Tischzentrifuge 5415 R Eppendorf Diverses Heizblock HB 110 Uniequip Neubauer-Zählkammer Roth Sterilbank HeraSafe HS12 Kendro Laboratory Products UV-Transluminator TFP-M/WL T Vilbert Lourmat Wasserbad 1008 GFL Tabelle A 10: Verbauchsmaterial. Artikel Hersteller 96well-ThermoQuick PCR-Plattem Typ Greiner Bio-One 2 CellStar Einmalpipettem 2ml, 5ml, 10ml, 20ml Greiner Bio-One CellStar Gewebekulturschalen CellStar Greiner Bio-One 97 Artikel Hersteller Küvetten 10x4x45mm Sarstedt Thermo-Fast PCR-Platten peqLab Nicht aufgeführte Verbrauchsmaterialen entsprachen dem Laborstandard. Tabelle A 11: Computerprogramme. Programm Hersteller Agilent GeneSpring GX Agilent Technologies mit Verknüpfung zu Gene Ontology Confocal Software Version 2.5 build Leica 1227 EndNote Thomson ResearchSoft Microsoft Office 2004 bzw. 7 Microsoft ND-1000, Version 3.5.2 peqLab Opticon Monitor, Version 2.02.24 MJ Research 98 8.2 Ergebnisse der globalen Genexpressionsanalyse Tabelle A 12: Auszug der Ergebnisse aus dem Oligo Array vor der weiteren Analyse der Daten. GeneName Ratio(REDLT97pLKOshKRT23 /GreenLT97pLKO_LV) BAX 8,04E-01 BAX 8,67E-01 BAX 8,67E-01 BAX 8,80E-01 BAX 8,83E-01 BAX 8,84E-01 BAX 8,87E-01 BAX 8,91E-01 BAX 8,92E-01 BAX 8,93E-01 BAX 8,94E-01 BAX 9,01E-01 BCL10 7,90E-01 BCL11A 7,76E-01 BCL11A 1,17E+00 BCL11A 1,24E+00 BCL11B 1,00E+00 BCL11B 1,23E+00 BCL2 1,01E-01 BCL2 8,21E-01 BCL2 8,62E-01 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,00E+00 BCL2 1,28E+00 BCL2 1,30E+00 BCL2A1 8,35E-01 BCL2A1 1,00E+00 BCL2L1 4,57E-01 BCL2L1 4,71E-01 BCL2L1 4,72E-01 BCL2L1 4,76E-01 BCL2L1 4,81E-01 BCL2L1 4,85E-01 BCL2L1 4,96E-01 BCL2L1 5,04E-01 BCL2L1 5,07E-01 BCL2L1 5,25E-01 BCL2L10 9,36E-01 BCL2L11 8,78E-01 BCL2L11 8,86E-01 BCL2L11 1,29E+00 BCL2L11 1,54E+00 BCL2L12 1,01E+00 BCL2L13 8,34E-01 BCL2L13 1,10E+00 BCL2L14 9,25E-01 BCL2L14 1,28E+00 BCL2L2 7,95E-01 BCL3 7,10E-01 99 GeneName Ratio(REDLT97pLKOshKRT23 /GreenLT97pLKO_LV BCL6 8,70E-01 BCL6B 9,07E-01 BCL6B 1,00E+00 BCL7A 9,75E-01 BCL7A 9,92E-01 BCL7B 7,45E-01 BCL7B 7,59E-01 BCL7C 6,50E-01 BCL9 7,76E-01 BCL9L 7,21E-01 CASP1 3,68E-01 CASP10 8,86E-01 CASP10 8,95E-01 CASP10 1,23E+00 CASP12 5,08E-01 CASP14 6,93E-01 CASP2 7,83E-01 CASP2 8,57E-01 CASP2 1,15E+00 CASP3 2,71E+00 CASP3 2,75E+00 CASP3 2,76E+00 CASP3 2,76E+00 CASP3 2,81E+00 CASP3 2,82E+00 CASP3 2,83E+00 CASP3 2,88E+00 CASP3 2,90E+00 CASP3 2,91E+00 CASP4 1,41E+00 CASP5 1,18E+00 CASP6 1,72E+00 CASP7 1,43E+00 CASP8 8,08E-01 CASP8 9,79E-01 CASP8 9,94E-01 CASP8 1,00E+00 CASP8 1,00E+00 CASP8 1,01E+00 CASP8 1,01E+00 CASP8 1,01E+00 CASP8 1,01E+00 CASP8 1,04E+00 CASP8 1,04E+00 CASP8AP2 3,82E+00 CASP9 6,27E-01 CASP9 7,21E-01 MYC 7,04E-01 MYC 1,36E+00 MYC 1,41E+00 MYC 1,42E+00 MYC 1,42E+00 MYC 1,42E+00 MYC 1,43E+00 GeneName Ratio(REDLT97pLKOshKRT23 /GreenLT97pLKO_LV GeneName Ratio(REDLT97pLKOshKRT23 /GreenLT97pLKO_LV MYC 1,44E+00 TNFRSF13B 1,00E+00 MYC 1,44E+00 TNFRSF13C 6,88E-01 MYC 1,44E+00 TNFRSF14 6,85E-01 MYC 1,44E+00 TNFRSF17 1,52E+00 MYC 1,44E+00 TNFRSF18 7,22E-01 NFKB1 9,90E-01 TNFRSF19 1,00E+00 NFKB1 9,91E-01 TNFRSF19 1,00E+00 NFKB1 9,96E-01 TNFRSF19L 7,53E-01 NFKB1 1,01E+00 TNFRSF19L 8,65E-01 NFKB1 1,01E+00 TNFRSF1A 5,22E-01 NFKB1 1,01E+00 TNFRSF1A 5,64E-01 NFKB1 1,02E+00 TNFRSF1A 5,73E-01 NFKB1 1,03E+00 TNFRSF1A 5,81E-01 NFKB1 1,03E+00 TNFRSF1A 5,84E-01 NFKB1 1,05E+00 TNFRSF1A 5,90E-01 NFKB2 4,50E-01 TNFRSF1A 5,91E-01 NFKB2 4,63E-01 TNFRSF1A 5,95E-01 NFKB2 4,77E-01 TNFRSF1A 6,08E-01 NFKB2 4,85E-01 TNFRSF1A 6,16E-01 NFKB2 4,85E-01 TNFRSF1A 7,28E-01 NFKB2 4,93E-01 TNFRSF1B 8,08E-01 NFKB2 4,95E-01 TNFRSF21 7,43E-01 NFKB2 4,95E-01 TNFRSF21 7,63E-01 NFKB2 4,96E-01 TNFRSF25 1,02E+00 NFKB2 5,20E-01 TNFRSF4 7,26E-01 REL 1,71E+00 TNFRSF6B 1,09E+00 RELA 5,78E-01 TNFRSF8 8,08E-01 RELA 5,95E-01 TNFRSF9 1,00E+00 RELA 6,01E-01 TNFSF10 2,05E+00 RELA 6,02E-01 TNFSF10 2,11E+00 RELA 6,03E-01 TNFSF10 2,18E+00 RELA 6,03E-01 TNFSF10 2,20E+00 RELA 6,05E-01 TNFSF10 2,29E+00 RELA 6,07E-01 TNFSF10 2,31E+00 RELA 6,24E-01 TNFSF10 2,31E+00 RELB TNFRSF10 A 5,73E-01 TNFSF10 2,32E+00 TNFSF10 2,34E+00 TNFSF10 2,40E+00 TNFSF11 6,47E-01 TNFSF12 2,98E-01 TNFRSF10B 8,39E-01 7,86E-01 TNFRSF10B 1,08E+00 TNFRSF10C TNFRSF10 D TNFRSF11 A 1,01E+00 TNFRSF11B TNFSF13 5,13E-01 TNFSF13B 1,08E+00 1,52E+00 TNFSF14 8,34E-01 1,32E+00 TNFSF15 8,00E-01 TNFRSF11B 1,40E+00 TNFSF15 1,56E+00 TNFRSF11B 1,64E+00 TNFSF18 1,00E+00 TNFRSF11B 1,73E+00 TNFSF4 1,00E+00 TNFRSF11B 1,74E+00 TNFSF5IP1 1,30E+00 TNFRSF11B 1,75E+00 TNFSF5IP1 1,38E+00 TNFRSF11B 1,89E+00 TNFSF7 5,55E-01 TNFRSF11B 1,89E+00 TNFSF8 1,66E+00 TNFRSF11B 1,92E+00 TNFSF9 5,77E-01 TNFRSF11B TNFRSF12 A 1,92E+00 TNFSF9 5,82E-01 5,10E-01 TRADD 7,16E-01 8,74E-01 100 Tabelle A 13: Auszug der veränderten Signalwege bei Suppression der Keratin 23 Expression nach Auswertung der Array Daten mittels Pathway-Express rank pathway Impact factor genes in pathway input genes in pathway pathway genes on chip Input Gene Pathway gene p-value corrected p-value gamma pvalue corrected gamma pvalue 1 Leukocyte transendothelial migration 210,807 119 8 113 0,388 0,93194024 0,9319402 5,94E-90 5,94E-90 2 Cell adhesion molecules (CAMs) 59,467 134 12 127 0,582 0,73253499 0,732535 9,02E-25 9,02E-25 71 0,437 0,36043683 0,3604368 1,32E-16 1,32E-16 10 76 0,485 0,30534424 0,3053442 5,64E-15 5,64E-15 4 75 0,194 0,96831117 0,9683112 3,29E-04 3,29E-04 111 1,213 2,79E-04 2,79E-04 9,15E-04 9,15E-04 ICAM1, CD276, HLA-C, HLA-DRB1, ICAM2 3 Antigen processing and presentation 40,281 89 9 TAPBP, NFYA NFYB, NFYC, HSPA5, HSPA8 4 Phosphatidylinositol signaling system 36,432 76 Pten, PIK3CA, Calm1, Calm 2 5 Adherens junction 10,458 78 Pten, Calm1, Calm 2, IMPA1, IMPA2, PIK3CA 6 Cell cycle 9,332 118 25 e2f2, e2f3, RB1, RBL1, RBL2, TGFB1, TP53 7 Proteasome 8,527 48 13 44 0,631 5,53E-04 5,53E-04 0,0018868 0,0018868 8 PPAR signaling pathway 6,5 70 15 68 0,728 0,00536306 0,0053631 0,0112758 0,0112758 9 Ribosome 6,297 101 17 80 0,825 0,00472778 0,0047278 0,0134398 0,0134398 10 Biosynthesis of unsaturated fatty acids 6,072 22 7 22 0,34 0,00676303 0,006763 0,016312 0,016312 26 Apoptosis 3,623 89 4 88 0,194 0,98904502 0,989045 0,1234454 0,1234454 NFkB2, Bcl2L1, TNF, RelA, Bad, IKBKG, Caspase 9, FADD, TRADD, Caspase 7, TNFSF10, Caspase 3 101 Tabelle A 14: Auszug von Genen mit veränderter Expression in den Keratin 23 supprimierten Adenomzellen mittels Pathway Express von Sorin Draghici Phosphatidylinositol signaling system Adherens junction Antigen processing and presentation Cell cycle Apoptosis Genname Pertubation fold change PTEN phosphatase and tensin homolog (mutated in multiple advanced cancers 46,8175 0,62 CALM1 calmodulin 1 (phosphorylase kinase, delta) 9,1079 1,46 CALM2 calmodulin 2 (phosphorylase kinase, delta) 10,2679 2,62 PIK3CA phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide 12,1409 2,87 CALM1 calmodulin 1 (phosphorylase kinase, delta) 9,1079 1,46 CALM2 calmodulin 2 (phosphorylase kinase, delta) 10,2679 2,62 IMPA1 inositol(myo)-1(or 4)-monophosphatase 1 20,6103 2,24 IMPA2 inositol(myo)-1(or 4)-monophosphatase 2 19,8703 1,5 PIK3CA phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide 12,1409 2,87 PTEN phosphatase and tensin homolog 46,8175 0,62 TAPBP TAP binding protein (tapasin) 0,56 0,56 NFYC nuclear transcription factor Y, gamma 0,7871 0,7 NFYA nuclear transcription factor Y, alpha 0,8071 0,72 HSPA5 heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa) 1,34 1,34 NFYB nuclear transcription factor Y, beta 1,5571 1,47 HSPA8 heat shock 70kDa protein 8 1,63 1,63 TGFB1 transforming growth factor, beta 1 0,32 0,32 E2F2 E2F transcription factor 2 0,65 0,65 E2F3 E2F transcription factor 3 1,69 1,69 RB1 retinoblastoma 1 (including osteosarcoma) 4,445 2,17 RBL1 retinoblastoma-like 1 (p107) 1,65 1,65 RBL2 retinoblastoma-like 2 (p130) 1,34 1,34 TP53 tumor protein p53 6,0321 0,54 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 0,2717 0,1000 NFKB2 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 2 0,45 0,4500 BCL2L1 BCL2-like 1 0,6317 0,4600 TNF tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) 0,55 0,5500 RELA v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, nuclear factor 0,58 0,5800 IKBKG inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase gamma 2,1942 0,5900 TRADD TNFRSF1A-associated via death domain 0,72 0,7200 CASP7 caspase 7, apoptosis-related cysteine peptidase 2,8181 1,4300 FADD Fas (TNFRSF6)-associated via death domain 4,52 0,6900 FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 1,78 1,7800 TNFSF10 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 2,05 2,0500 CASP3 caspase 3, apoptosis-related cysteine peptidase 6,3581 2,7100 BAD BCL2-antagonist of cell death -4,1991 0,5900 CASP9 caspase 9, apoptosis-related cysteine peptidase 3,0921 0,6300 102 Danksagung An dieser Stelle möchte ich allen herzlich danken, die mich bei meinem Studium der Humanmedizin und den Arbeiten an meiner Promotion unterstützt haben. An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Stephan Hahn für die freundliche Aufnahme in sein Team, die Überlassung des Themas und die einzigartige Betreuung besonders bedanken. Ein ebenso großer Dank geht an das Team: Dr. Abdelouahid Maghnouj, der mir allzeit in jeder kniffligen Laborsituation geduldig geholfen hat und mir immer zur Seite stand. Britta Redeker, die mich in die Geheimnisse der PCR eingeführt hat, Matthias Becker, der mir den richtigen Umgang mit den Zellen beigebracht hat sowie Rene Jackstadt, der mir bei den ersten Schritten im Labor zu Seite stand. Mein Dank gilt auch meiner Familie, vor allem meinen Eltern, die mich unentwegt in jeder Situation des Studiums und der Promotionsarbeit unterstützt haben. Lebenslauf Persönliche Angaben Name Daria Pakosch Geburtsdatum 11. November 1984 Geburtsort Hindenburg / Oberschlesien Staatsangehörigkeit deutsch Beruflicher Werdegang seit Februar 2011 chirurgische Weiterbildungsassistentin im Gefäßzentrum Rudolfplatz Dres. Streminski Müller Schule und Studium Dezember 2010 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung seit Oktober 2010 Studium der Zahnmedizin an der Universität zu Köln Oktober 2009 – September 2010 Stipendiatin der Ruhr-Universität Bochum Oktober 2006 – September 2010 Studium der klinischen Medizin an der RuhrUniversität Bochum August 2006 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Oktober 2004 – September 2006 Studium der vorklinischen Medizin an der Ruhr-Universität Bochum August 1995 – Juni 2004 Städtisches Friedrich-Bährens-Gymnasium September 1991 – Juni 1995 Albert-Schweitzer-Schule, Grundschule der Stadt Schwerte
