Mikrofluidikdesigns und Herstellung von SPR

Mikrofluidikdesigns und Herstellung von SPRMesssystemen und Organ-On-Chip-Systemen
capitalis technology GmbH
Reinhold A. Klapsing
capitalis technology GmbH - Kernkompetenzen

Mikrosystemische Komplettlösungen aus einer Hand
 Entwicklung und Herstellung
 Design
 Simulation
 Rapid Prototyping  Fertigung
 Charakterisierung
 Modular aufgebaute Komplettlösungen
 Mikrosysteme
 Gerätetechnik (Steuerung, Sensorik, Firmware)
 Software
capitalis technology - SPR-Plattform

SPR-Chips und Auslesegerät
Chip
Goldschicht
X
Y
Messflächen
capitalis technology - SPR-Plattform

Breites Anwendungsspektrum
 Frei konfigurierbare Mikrofluidik
 17 Proben mit 3 Messflächen
 1 Probe mit 180 Messflächen
 Automatisiertes 4-Kanal-Probenhandlingsystem
 Ausgewählte Anwendungen:
 RNA-Nachweis, DNA-Nachweis, miRNA-Nachweis
 Aptasensoren
 Protein-Nachweis
 Organ-On-Chip-Systeme
capitalis technology - SPR-Plattform - Funktionalisierung
Nanospotten mit
Inverses Mikrokontaktdrucken
Direktes Mikrokontaktdrucken
Nanoplotter Station
mit 17-Kanalflusszelle
mit μCP Station
Motivation für neue Mikrofluidik-Konzepte
 Anwendungsbeispiele
 Nachweis spezifischer Marker + komplexe Probenvorbereitung
 Charakterisierung von Zell- bzw. Gewebereaktionen
 Herausforderung
 Steigerung der Sensitivität
 Verkürzung der Messzeit
 Reduktion des Probevolumens
 Erhöhung der Reproduzierbarkeit
 Kostensenkung
Grundlagen
 Nachweisreaktion und Detektion an Oberflächen gebunden
 DNA- und Proteinarrays
 Quarzmikrowaagen
 Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Systeme
 Multi-Elektroden-Arrays
 Mikro-Ring-Resonatoren
Grundlagen
 Oberflächengebundene Lab-on-a-Chip-Systeme
 Parabolisches Strömungsprofil
 Nernstsche Diffusionsgrenzschicht  Transportlimitation
> 5 mm
> 50 μm
Ligand (ca. 1 - 100 nm)
x
Detektor
z
y
Grundlagen
 Oberflächengebundene Lab-on-a-Chip-Systeme
 Gleichverteilung der Analytmoleküle im Kanal
 nur Analyten in Ligandkontakt binden  geringes Signal 
Probenschleife
> 5 mm
> 50 μm
Ligand (ca. 1 - 100 nm)
Analyt (ca. 1 - 300 nm)
Analyt-Ligand-Komplex
x
Detektor
z
y
Grundlagen
 Oberflächengebundene Lab-on-a-Chip-Systeme
 Verringerung des Diffusionsweges
 Steigerung der oberflächennahen Analytkonzentration
> 5 mm
> 50 μm
Ligand (ca. 1 - 100 nm)
Analyt (ca. 1 - 300 nm)
Analyt-Ligand-Komplex
x
Detektor
z
y
10
Grundlagen
 Ansatz 1: Materialeigenschaften
 Ansatz 2: Kombination mit Nanopartikeln
Eigenschaft
Polarisierbar
Paramagnetisch
Diamagnetisch
Beispiele

Rinderserumalbumin

Latex-Nanopartikel

Hämoglobin

Magnetit-Nanopartikel

Pyrolytischer Graphit

Latex-Nanopartikel
Verfahren
Dielektrophorese
Magnetophorese
Magnetophorese
Grundlagen
 Dielektrophorese (DEP)
 Magnetophorese (MAP)
 polarisierbare Analyten
F DEP  4  r 3   m  Re{ k CM }   E
 Einflussfaktoren
 magnetisierbare Analyten
2
2
2
3
F MAP    r   0  (  p   m )   H
3
 Einflussfaktoren
 Radius
 Radius
 Gradient
 Gradient
 Clausius-Mossotti-Faktor
 Suszeptibilitätsdifferenz
Ansätze
 Hydraulische Fokussierung
 technische Grenzen bei der Minimierung von Kanalstrukturen
 Ablenkung der Analytlösung zur Sensoroberfläche
Patent - DE 102007012866
Ansätze
 Hydraulische Barriere
 Trennung von Zellkultursegmenten in Test- und Referenzbereich
Patent - DE 102007038777
Ansätze
 Dielektrophoretische Fokussierung polarisierbarer Analyten
 inhomogenes elektrisches Feld, Gradient je nach Richtung der DEP
 Erzeugung von Gradienten > 1017 V²/m³  Interdigitalelektroden
Re(kCM) < 0  Abnahme des Gradienten in Richtung der Messfläche
Patent - DE 102008062620
Ansätze
 Magnetophoretische Fokussierung diamagnetischer Analyten
 inhomogenes magnetisches Feld, Gradient sinkt in Richtung der
Messfläche
 Suszeptibilitätsdifferenz  10-4  Verstärkung durch
paramagnetische Salze
 Erzeugung von Gradienten > 1015 A²/m³  Magnetstapel
Patent - DE 102009055800
Ansätze
 Magnetophoretische Fokussierung paramagnetischer Analyten
 inhomogenes magnetisches Feld, Gradient steigt in Richtung der
Messfläche
 Suszeptibilitätsdifferenz  100
 Erzeugung von Gradienten > 1013 A²/m³  magnetisierbare Elemente
Patent - DE 102009055800
Ansätze
 Magnetophoretische Fokussierung paramagnetischer Analyten
 magnetisierbare Elemente
Modellierung
 Superposition der Teilprozesse Diffusion, Konvektion, Ablenkung und
Analyt-Ligand-Interaktion


dC
   ( DC)  (VK  )C  (VA  )C  kassLC  kdissLC
dt
Diffusion
Konvektion
Ablenkung
 Zielgröße Bindungsquote
C Einlass  C Auslass
Q
 Signal
C Einlass
Analyt-Ligand-Interaktion
Modellierung
 Partikelmodell
Partikel
x
Parabolisches
Strömungsprofil
Ablenkbereich
Kanal
Detektionsbereich S
z
y
 Partikelbewegung  Superposition der Teilprozesse Diffusion, Konvektion
und Ablenkung
dx i  dx D i  v K i ( x i )  dt  v A i ( x i )  dt
Diffusion
Konvektion
Ablenkung
Modellierung
 Partikelmodell
Partikel
x
Ablenkbereich
Parabolisches
Strömungsprofil
Kanal
Detektionsbereich S
z
y
 Analyt-Ligand-Interaktion  Reaktion erster Ordnung
xi  S  nd  nd  1
S  {xi | xS min  x1  xS max ; yS min  x2  yS max }
Ergebnisse
 Hydraulische Fokussierung
 Steigerung der Bindungsquote, Messzeitverlängerung
 Probenschleife erreicht Zielbindungsquote schneller
 Entwurfsrichtlinien
Minimieren

Analytschichthöhe

Länge der Reaktionsfläche
 Hydraulische Barriere
Maximieren

Strömungsgeschwindigkeit
x
y
 Trennung von Zellkultursegmenten in Test- und
Referenzbereich
möglich
Ergebnisse
 Hydraulische Fokussierung
Ergebnisse
 Hydraulische Fokussierung
 Protein A – IgG-Assay
 Probevolumen: 900 μl
x
y

Analytvolumenstrom: 3 μl/s

Puffervolumenstrom: 0 μl/s

Signal: 12 Pixel

Analytvolumenstrom: 1 μl/s

Puffervolumenstrom: 2 μl/s

Signal: 24 Pixel
Ergebnisse
 Dielektrophoretische Fokussierung
 Steigerung der Bindungsquote, keine Messzeitverlängerung
 Entwurfsrichtlinien
 Impedanz des Elektrodensystems an Generator anpassen
Minimieren
Maximieren

Kanalhöhe


Abstand zwischen Elektroden
und Kanal
Gradient des elektrischen
Feldes

Realteil des Clausius-MossottiFaktors

Permittivitätsdifferenz
zwischen Isolation und
Medium
Ergebnisse
 Dielektrophoretische Fokussierung
Ergebnisse
 Dielektrophoretische Fokussierung
Latex-Partikel vom Typ LB3,
INVITROGEN, Durchmesser:
300 nm

Partikelverdünnung: 1:1000
in 5 mmol/l TRIS-HydrochloridPuffer

x

Elektrodenraster: 50 μm

Frequenz: 4 MHz

Spannung: 10 V

Kanalhöhe: 50 μm
Strömungsgeschwindigkeit:
0,8
mm/s
y

Ergebnisse
 Magnetophoretische Fokussierung
 Steigerung der Bindungsquote, keine Messzeitverlängerung
 Entwurfsrichtlinien
Minimieren
Maximieren

Kanalhöhe

Gradient des Magnetfeldes

Abstand zwischen
magnetisierbaren Elementen /
Magnetstapel und Kanal

Suszeptibilitätsdifferenz
zwischen Analyt und Medium
28
Ergebnisse
 Magnetophoretische Fokussierung dia- und paramagnetischer Analyten
Ergebnisse
 Magnetophoretische Fokussierung paramagnetischer Analyten
x

Eisen(II,III)-Oxid-Partikel,
TURBOBEADS, : 30 nm,
Volumensuszeptibilität: 100

Partikelverdünnung: 1:11 in
ddH2O

Abstand zwischen Stahlfolie
und Kanaldecke: 50 μm

Magnetisierung der äußeren
Magnete: 1,4 T

Kanalhöhe: 75 μm

Strömungsgeschwindigkeit:
1,1 mm/s
y
Ergebnisse
 Vergleich dielektrophoretische und magnetophoretische Fokussierung für
optimierte Randbedingungen

Eisen(II,III)-Oxid-Partikel

 = 100

|H|² = -2*1013 A²/m³

Latex-Partikel

kCM = -0,5

|E|² = 3*1017 V²/m³

Latex-Partikel

 = 4*10-4

|H|² = 3*1015 A²/m³
Ergebnisse
 Hydraulische Fokussierung  Steigerung der Bindungsquote, kein Vorteil
gegenüber Probenschleife
 Hydraulische Barriere  robuste Trennung von Test- und Referenzbereich 
Erhöhung der Reproduzierbarkeit
 dielektro- und magnetophoretische Fokussierung  Steigerung der
Bindungsquote / Verkürzung der Messzeit / Reduzierung des Probevolumens
 effektivstes Verfahren: magnetophoretische Fokussierung paramagnetischer
Analyten
 Entwurfsrichtlinien abgeleitet
 Lösungsansätze mit verschiedenen Messsystemen kombinierbar
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Ausgangssituation
 deutliche Zunahme von Allergien in der Bevölkerung
 weltweite Fehlprognose zur allgemeinen
Chemikalientoxizität  REACH Verordnung 
Neubeurteilung aller Substanzen
 verheerenden Fehleinschätzungen von
Arzneimittelrisiken  Schmerzmittel VIOXX,
Antikörper TGN1412
 Übergang zur individuellen Medizin
 Diskussion zu potentiellen Gesundheitsrisiken von
Nanostäuben
 Tierschutz- und Kostengründe sowie gesetzliche
Vorgaben (EU-Richtlinie 2003 / 15 / EG)
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Lösung: Universelle Zell-ChipPlattform
 analog zum Menschen  mehrere
Zellsysteme in einem gemeinsamen
Kreislauf  Charakterisierung von
Wechselwirkungsprozessen
 Bsp.: Stoffwechselprodukte von
Leberzellen vergiften Nervenzellen
(Methanol-Vergiftung)
 Integrierte Mikrosensorik
(Mikroskopie, SPR, RAMAN,
Fotometrie, FluoreszenzSpektrometrie)
 Integrierte Mikroaktorik (Pumpen,
Ventile)
  ADMET Testung
Pumpe
Organoid 1
(Leber)
Organoid 2
(Haut)
Organoid 3
(Darm)
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Universelle Lab-on-a-Chip-Plattform
 basiert auf MicCell-Technologie
 Integration pneumatisch angetriebener Mikropumpen
 Integration optischer und elektrischer Sensorik
 Basis für Multi-Organ-Chip-Plattform der Fa. TissUse
capitalis technology - Bioreaktorsteuerung
Ansteuerung
 μController basierte Steuerung für alle
Funktionen des Multiorganchips
 Funktionen: Pumpenreglung, Temperierung,
Überwachung, PC-Kommunikation
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Mikrofluidik
 Anwendungsspezifische Konfiguration
Peristaltikpumpe
Reservoir
Zellkultursegment
Injektionsport
MOC-Chip Typ C – Doppelkreislauf
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Mikrofluidik
 Video: Vollblut
zirkuliert in MOCSystem
capitalis technology - SPR Plattform
SPR-Messung
 Etablierung einer Adapteroptik und Bestimmung der Nachweisgrenze
 Modellsystem: Nachweis des Soil-Borne Cereal Mosaic Virus (SBCMV) mittels
immobilisierter Antikörpern
 Gleiche Empfindlichkeit wie bei etablierten SPR-Chips
Antikörper-basierter SBCMV-Nachweis
mittels SPR. Dargestellt sind die
referenzierten Messsignalverläufe für
die Injektion unterschiedlicher
SBCMV-Konzentrationen
(0,8 – 92,5 μg/mL in PBS (10 mmoL/L)).
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Automatisierte Handlingsysteme
 Probenhandling von oben
 Online Monitoring von unten
Nanoplotter mit
Doppelbrücke
Oben: Multi-Z-Antrieb
mit Pipetten
MOC
Unten: Z-Antrieb mit optischer Messtechnik
capitalis technology - Sensorkopf
Universeller Sensorkopf
 Ankopplung an unterschiedliche
Automatisierungssysteme
 hochauflösendes Mikroskop mit
Dunkelfeldbeleuchtung und Autofokus
 Mikroskopie, PIV
 Aufnahme für optische Fasern 
Fluoreszenz- und Fluoreszenzlebensdauermessung
 separate, exakte Positionierung
(<5μm) für Mikroskop und Fasersensor
Chip-basiertes Multi-Mikro-Organoid Kultursystem
Particle Imaging Velocimetry
 Geschwindigkeit
 Morphologie
 Video: Erythrozyten
zirkulieren in MOCSystem
Ansprechpartner
Reinhold A. Klapsing
capitalis technology GmbH
Emser Straße 9
10719 Berlin
Tel.:
Fax.:
+49 30 856 00 565
+49 30 856 00 567
Email: [email protected]
WWW: www.capitalis-technology.com