Veränderungen der Haut durch Sonnenlicht: Beobachtungen in der
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Diplomarbeit Veränderungen der Haut durch Sonnenlicht: Beobachtungen in der Konfokalen Reflektionsmikroskopie eingereicht von Maximilian Rothmund Matrikelnummer 0534447 zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der gesamten Heilkunde (Dr. med. univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt an der Universitätsklinik für Dermatologie und Venerologie unter der Anleitung von Ao. Univ.-Prof. Dr. med. univ. Rainer Hofmann-Wellenhof Graz, 19. Dezember 2011 Diplomarbeit Maximilian Rothmund Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe, und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, 19. Dezember 2011 Maximilian Rothmund I Diplomarbeit Maximilian Rothmund Danksagung An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Ao. Univ. Prof. Dr. Rainer HofmannWellenhof bedanken. Als Erstbetreuer meiner Arbeit stand er mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite, wies mich in die Arbeit mit dem konfokalen Reflektionsmikroskop (RCM) ein und wertete in mühevoller Kleinarbeit rund 30.000 RCM-Bilder mit mir aus. An dieser Stelle möchte ich auch Frau Priv.-Doz.in Dr.in Verena Ahlgrimm-Siess danken, die uns bei der Auswertung der Bilder unterstützt hat, sowie Frau Dr.in Edith Arzberger für ihre Hilfe bei der Erstellung des Ethikantrages und bei allen Fragen rund um das RCM. Weiterhin Frau Isabella Bambach für Ihre Unterstützung bei der Verwendung des Sonnensimulators. Ein großer Dank geht auch an meine Frau, Clara Rothmund, die mich nicht nur während der Diplomarbeit, sondern über das ganze Studium hinweg unterstützt hat. Sie war in fachlichen Fragen immer eine interessierte und engagierte Diskussionpartnerin. Weiterhin danken möchte ich meinen Eltern, die mir diese Ausbildung erst ermöglicht haben. Ich bedanke mich von ganzem Herzen für ihre Unterstützung und hoffe, dass ich sie eines Tages weitergeben kann. Auch meiner Großmutter und Urgroßmutter möchte ich danken. Ohne ihre zusätzliche Unterstützung wäre ein Studium im Ausland nur schwer möglich gewesen. An letzter Stelle möchte ich erwähnen, dass die gesamte Diplomarbeit mit Open Source Software erstellt wurde. Viele Menschen arbeiten in idealistischer Weise daran, Wissen und Information für alle Menschen offen zugänglich zu machen. Dies verdient in meinen Augen Dank und Anerkennung. II Diplomarbeit Maximilian Rothmund Abstract The aim of this study was to observe alterations of the skin, induced by ultraviolet radiation (UVR), using reflectance confocal microscopy (RCM) and to describe the development of these changes. Additionally the findings should be compared to those of histopathological examination of the same area. We exposed a small area in the gluteal region of 10 healthy subjects with a threefold minimal erythema dose and observed the development of the sunburn reaction one, 24, 72 hours and one week after UVR-exposure. The UVR source we used, is emitting the whole bandwith of natural solar radiation. Additionally we obtained a scan of unexposed skin, serving as a reference. Furthermore we performed a punch biopsy of the exposed skin each time, to contrast histopathological examination with RCM. RCM is an in-vivo imaging technique which allows the non-invasive visualization of the human skin at near histopathological quality. The obtained data was interpreted, regarding histological and RCM-based criteria on sunburn reaction. We managed to show all important UVR-induced alterations of the skin in RCM, beginning with an inflammatory reaction (inflammatory cells, vasodilatation, edema), containing the formation of microvesicles, followed by the appearance of apoptotic keratinocytes (sunburn cells) and activated melanocytes and at last, loss of the epidermal structure, in RCM-technique called “honeycomb pattern”. Nearly all of these phenomena could be correlated with histopathological findings, mostly sharing the same time of development. Furthermore, RCM provides a more detailed visualization of inflammatory cell formation and epidermal bloodflow than histopathological examination does. All studies, concerning UVR-induced skin alteration could benefit from using RCM as an evaluation method, as it is able to provide a very detailed picture of these changes. There could be a RCM-based classification of the severity of sunburn, integrating the obtained results and allowing a standardized measurement of the efficacy of UVR-prophylaxis evaluated in RCM. Results concerning the activation of melanocytes should undergo further examination and could then be used in melanoma research. Keywords: reflectance confocal microscopy, RCM, sunburn, skin, uv-induced, sunburn cells, inflammation, in-vivo, non-invasive, melanocytes III Diplomarbeit Maximilian Rothmund Zusammenfassung Das Ziel dieser Studie war es, durch ultraviolette (UV) Strahlung bedingte Veränderungen der Haut in der Konfokalen Reflektionsmikroskopie (RCM) zu erfassen und im Verlauf zu beobachten. Zusätzlich sollten die erhobenen Befunde mit histologischen Schnitten der betroffenen Stelle verglichen und die Vergleichbarkeit bewertet werden. Hierfür wurden 10 gesunde Probanden mit der dreifachen minimalen Erythemdosis in der Glutealregion bestrahlt. Die Bandbreite der verwendeten UV-Quelle umfasste hierbei das gesamte Spektrum der Sonnenstrahlung. Der Verlauf der Veränderungen wurde nach 1, 24, und 72 Stunden, sowie nach einer Woche in der RCM dokumentiert. Als Referenz erfolgte bei jedem Probanden auch eine Aufnahme der unbestrahlten Haut. Die RCM ist eine neuartige, nicht-invasive Untersuchungsmethode, bei der die Haut in nahezu histopathologischer Auflösung in-vivo dargestellt werden kann. Zusätzlich wurde zu jedem Untersuchungszeitpunkt eine Stanzbiopsie zur Anfertigung histologischer Vergleichsschnitte entnommen. Die so gewonnenen Bilder wurden hinsichtlich histologischer und RCM-basierter Kriterien einer Sonnenbrandreaktion ausgewertet. Alle wesentlichen UV-bedingten Veränderungen der Haut konnten in der RCM gezeigt werden. Zu sehen war die Entzündungsreaktion (Entzündungszellen, Vasodilatation, Ödem) einschließlich der Bildung von Mikrovesikeln, das Auftreten von apoptotischen Keratinozyten (sunburn cells), sowie von aktivierten Melanozyten und eine Strukturstörung der Epidermis („loss of honeycomb pattern“). Im Vergleich mit der Histologie konnte gezeigt werden, dass fast alle beschriebenen Phänomene ein histologisches Korrelat hatten und auch im Zeitverlauf übereinstimmten. Darüber hinaus ermöglicht die RCM eine differenziertere Beobachtung der Entzündungszellen, sowie des kapillären Blutflusses als die histologische Untersuchung. Die RCM könnte in Zukunft in allen Untersuchungen Anwendung finden, die mit UV-bedingten Veränderungen der Haut in Zusammenhang stehen, da sie ein sehr detailliertes Bild dieser Veränderungen ermöglicht. Auf Basis der gewonnen Ergebnisse wäre eine Einteilung der Schwere eines Sonnenbrands hinsichtlich der, in der RCM gut erfassbaren, Veränderungen möglich. Diese könnte zum Beispiel in Untersuchungen zur UV-Prophylaxe herangezogen werden. Die Aktivierung von Melanozyten sollte in weiteren Studien intensiver untersucht werden, um die Ergebnisse in die Melanomforschung einfließen zu lassen. Keywors: konfokale Reflektionsmikroskopie, RCM, Sonnenbrand, Haut, Melanozyten, sunburn cells, Entzündung, in-vivo, nicht-invasiv, uv-bedingt IV Diplomarbeit Maximilian Rothmund Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Maligne Tumoren der Haut und UV-Strahlung . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1.2 Veränderungen der Haut duch UV-Strahlung . . . . . . . . . . . . . . 1.3 Veränderungen der Haut duch UV-Strahlung in der RCM . . . . . . . . 1.4 Studiendesign, erwartete Ergebnisse und Fragestellung . . . . . . . . 2 5 6 2 Methoden 2.1 Verwendete Geräte . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Sonnensimulator Oriel 1000 . . . . 2.1.2 Reflectance Confocal Microscopy 2.2 Minimale Erythemdosis . . . . . . . . . . 2.3 Biopsieentnahme und Histologie . . . . . 2.4 Auswahl der Probanden . . . . . . . . . . 2.5 Vorbereitung der Studie . . . . . . . . . . 2.6 Ablauf der Studie . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Ergebnisse 3.1 Stichprobe . . . . . . . . . 3.2 Auswertung der RCM-Bilder 3.2.1 Entzündungszellen . 3.2.2 Ödem . . . . . . . . 3.2.3 Vasodilatation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 9 9 13 14 14 15 15 16 . . . . . 20 20 20 20 22 23 3.2.4 sunburn cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.2.5 Melanozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.2.6 Mikrovesikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.2.7 Schuppung . . . . . . . . . . . . 3.2.8 honeycomb pattern . . . . . . . . 3.2.9 Weitere Beobachtungen . . . . . 3.3 Auswertung der histologischen Schnitte 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 Entzündungszellen sunburn cells . . . Ödem . . . . . . . Vasodilatation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 26 27 29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 30 31 31 3.3.5 Halos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3.6 Stratum corneum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 V Diplomarbeit Maximilian Rothmund Inhaltsverzeichnis 4 Diskussion 33 4.1 Zeitlicher Verlauf der Veränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 4.2 Vergleich mit der Histologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 4.3 Grenzen dieser Studie und Konsequenzen für weiterführende Arbeiten 41 4.4 Ausblick und weitere Verwendungsmöglichkeiten . . . . . . . . . . . . 42 5 Anhang 47 VI Diplomarbeit Maximilian Rothmund Inhaltsverzeichnis Glossar und Abkürzungen Apoptose: der geordnete Zelltod bei irreparabler Schädigung der DNA cm2 : Quadratzentimeter COLIPA: Comité de Liaison des Associations Européenes de l’Industrie de la Parfumerie, des Produits Cosmetiques et de Toilette d: day, Tag FDA: Food and Drug Testing Association h: hour, Stunde honeycomb pattern: homogene, honigwabenartigen Struktur der Epidermis in den RCM-Bildern in-vivo: direkt am lebenden Objekt Interstitium: der Zellzwischenraum MED: minimale Erythem Dosis mJ: Millijoule monochromatisch: einfarbige Lichtstahlung, die nur Licht einer Wellenlänge enthält nm: Nanometer RCM: reflectance confocal microscopy, konfokale Reflektionsmikroskopie s: second, Sekunde SBC: sunburn cell, apoptotischer Keratinozyt SD: standard deviation, Standardabweichung Stratum corneum: Hornschicht der Haut, in der normalerweise keine kernhaltigen Zellen mehr zu finden sind UV: ultraviolett UVA: Licht der Wellenlänge 380–315 nm UVB: Licht der Wellenlänge 315–280 nm w: week, Woche VII Diplomarbeit Maximilian Rothmund Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 2 3 4 5 Inzidenz des malignen Melanoms in Österreich Skizze der Funktionsweise der RCM . . . . . . Vivascope 1500 RCM . . . . . . . . . . . . . . Modell des Cube-Aufnahmemodus . . . . . . . Ablauf der RCM-Untersuchung . . . . . . . . . 6 7 8 UV-Bestrahlung mit dem Sonnensimulator . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Lichttreppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Epidermale Entzündungszellen in der RCM . . . . . . . . . . . . . . . 22 9 10 11 12 Diagramm zur Häufigkeitsverteilung der Entzündungszellen Entwicklung des Ödems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vasodilatation in der RCM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . sunburn cells in der RCM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 23 24 25 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Dendritische Melanozyten in der RCM Entwicklung des HCP . . . . . . . . . Entwicklung einer Nekrose . . . . . . Histologische Schnitte . . . . . . . . . Entzündungszellen in der Histologie . sunburn cells in der Histologie . . . . Ödem und Spongiose in der Histologie Vasodilatation in der Histologie . . . . Vergleich RCM und Histologie . . . . . Vergleich RCM und Histologie 2 . . . . Vergleich RCM und Histologie 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 27 28 29 30 30 31 31 36 38 40 VIII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 10 10 11 12 Diplomarbeit Maximilian Rothmund Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 2 3 4 5 Histologische Veränderungen im Zeitverlauf Lichttreppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ablauf der Studie . . . . . . . . . . . . . . . Phänomene in der RCM . . . . . . . . . . . Auswertung der RCM Bilder . . . . . . . . . IX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 13 16 17 21 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Maligne Tumoren der Haut und UV-Strahlung Die menschliche Haut ist täglich der Sonne ausgesetzt, deren ultraviolette (UV) Strahlung in der Haut eine Vielzahl molekularer und biochemischer Prozesse auslöst, die zum Teil zu akut sichtbaren, vor allem aber zu längerfristigen, erst später auftretenden Veränderungen führen. Am offensichtlichsten ist hierbei der Sonnenbrand, als akute entzündliche Reaktion der Haut auf die UV-Strahlen, oder die Bräunung der Haut, als Adaptionsprozess an die Sonneneinstrahlung. Zu den zunächst nicht sichtbaren Effekten gehört auch die Schädigung der DNA, der in der Haut vorkommenden Zellen [1]. Nach Jahren bis Jahrzehnten zeigen sich allerdings auch die Auswirkungen dieses Prozesses sehr deutlich. Angefangen bei der Hautalterung, über Präkanzerosen, wie der aktinischen Keratose und zuletzt auch malignen Tumoren der Haut wie dem malignen Melanom, dem Basalzellkarzinom und dem Plattenepithelkarzinom [2–4]. Vor allem die Inzidenz des malignen Melanoms steigt seit Jahren kontinuierlich an. Betrug diese 1983 in Österreich im Durchschnitt noch 4.8 auf 100000 Personenjahre, so stieg diese Zahl auf ein zwischenzeitliches Hoch von 11.7 im Jahr 2004 und sank im weiteren Verlauf auf 9.1 im Jahr 2008. Trotz dieses leichten Absinkens ist insgesamt ein starker Aufwärtstrend zu beobachten [5, 6] (siehe Abbildung 1). In einer Studie von 2006 konnte außerdem gezeigt werden, dass die Inzidenz in der Steiermark diesen Wert noch erheblich übertrifft. Die Inzidenz in der zwischen 2001 und 2003 durchgeführten Studie ist mit 24.5 pro 100000 Personenjahre angegeben [7]. Diese Zahlen machen deutlich, wie wichtig eine gute Diagnostik und Therapie des malignen Melanoms ist. Vor allem in der Diagnostik gibt es viele neue Ansätze, zu denen auch die Konfokale Reflektionsmikroskopie, bzw. „reflectance confocal microscopy“ (RCM) zählt. Diese ist auch unter dem nicht mehr so geläufigen Terminus „confocal laser scanning microscopy“ bekannt. Mit dieser ist es möglich, die menschliche Haut nicht-invasiv und in-vivo zu mikroskopieren, und so suspekte Hautveränderungen zu untersuchen, ohne dass eine Gewebeentnahme nötig ist. In einem 2009 publizierten Review evaluierten Gerger et al. mehrere Studien, die die Diagnostik melanozytärer Hauttumore mit Hilfe der RCM zum Thema hatten und konnten eine signifikante Verbesserung der Spezifität und Sensibilität im Vergleich mit der momentanen Standarddiagnostik beschreiben [8]. In der Forschung zur Entstehung von malignen Hauttumoren besteht inzwischen Einigkeit darüber, dass neben anderen Faktoren wie Immunsupression oder genetischer Disposition, vor allem auch die UV-Strahlung der Sonne eine entscheidende Rolle spielt. Beim Plattenepithelkarzinom und beim Basaliom geht man von einer 1 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung Abb. 1: Die Inzidenz des Malignes Melanom in Österreich [6] chronischen Schädigung der Haut über mehrere Jahre hinweg aus, welche letztendlich zur malignen Entartung der entsprechenden Zellen führt [2]. Im Falle des malignen Melanoms zeigte sich, dass auch eine intermittierende, starke Sonnenexposition das Risiko der Entstehung fördert. Die Analyse verschiedenster Faktoren wie Hauttyp, Intensität der Sonnenexposition, Wohnort, Verteilung des malignen Melanoms in verschiedenen Regionen des Körpers, sowie der Anzahl der durchschnittlich in der Sonne verbrachten Stunden bzw. der Sonnenbrände, bestätigen einen starken Zusammenhang zwischen der Entstehung von Melanomen und der UV-Strahlung [4]. Die bisher angeführten Erkrankungen zählen alle zu den chronischen UV-Schäden. Im Folgenden soll auf die akute Wirkung der UV-Strahlung auf die menschliche Haut näher eingegangen werden. 1.2 Veränderungen der Haut duch UV-Strahlung Im folgenden Text wird, im Sinne der besseren Lesbarkeit, für Personen beiderlei Geschlechts die maskuline Form benutzt. Ist zum Beispiel von Probanden die Rede, sind ausdrücklich sowohl weibliche als auch männliche Teilnehmer gemeint. In keiner Weise soll damit ein Geschlecht hervorgehoben oder isoliert betrachtet werden. Die Ultaviolettstrahlung ist eine elektromagnetische Strahlung, die zum Spektrum des von der Sonne emittierten Lichts gehört. Die Wellenlänge dieser Strahlung liegt 2 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung zwischen 100 und 400 nm. Ihre Einflüsse auf die menschliche Haut finden sowohl auf biochemischer als auch molekularer Ebene statt. Für diese Studie sind vor allem die Wirkungen interessant, die sich auch histologisch nachweisen lassen. Die primäre lokale Reaktion, die nach intensiver Sonneneinstrahlung zu sehen ist, ist der Sonnenbrand. Das typische klinische Bild mit Rötung, Schwellung, Überwärmung und Schmerzen der betroffenen Region, wird durch eine Entzündungsreaktion hervorgerufen. Als Mediatoren kommen vor allem Histamin, Prostaglandine, Kinine und Cytokine in Frage, welche im erhöhten Maße in der geschädigten Haut nachweisbar sind [9–11]. Die energetischen Photonen des UV-Lichts werden in der Haut über zwei Mechanismen aufgenommen. Zum einen findet eine direkte Absorption der Photonen durch die zellulären Chromophoren der Haut statt. Dies sind Farbstoffe der Zelle, die durch die Absorption in einen höheren energetischen Zustand angeregt werden. Die indirekte Aufnahme erfolgt über den Prozess der Photosensibilisierung. Hierbei werden die Lichtionen durch endogene oder exogene Sensitizer absorbiert und diese Moleküle wiederum in einen energetisch höheren Zustand versetzt. Beide Mechanismen regen durch die Energieaufnahme biochemische Reaktionen im Inneren der Zelle an. Im Rahmen der durch die direkte Absorption bedingten Reaktionen, entstehen vor allem Schäden an den DNA-Basen. Bei der Photosensibilisierung hingegen werden freie Radikale, vor allem Sauerstoffradikale, gebildet, die wiederum die DNA schädigen und auf lange Sicht zur Entstehung von Hauttumoren beitragen [1]. Ist diese Beeinträchtigung so stark, dass die DNA nicht mehr repariert werden kann, geht die Zelle in die Apoptose. Im Falle der Keratinozyten entstehen so, die im histologischen Präparat sichtbaren sunburn cells (SBC) [12]. Im histologischen Präparat zeigen sich sowohl Veränderungen der Epidermis als auch der Dermis. Eine Übersicht über die histologischen Veränderungen im Zeitverlauf gibt Tabelle 1 auf Seite 4. Morphologisch am auffälligsten sind sicher die SBC. Schon 30 Minuten nach der Bestrahlung sind die ersten SBC zu finden, die meisten treten aber 24 Stunden nach der Bestrahlung auf [10, 11]. Bei reiner Schädigung durch UVA-Licht sind in der konventionellen Histologie keine SBC nachweisbar [13]. Weiterhin fällt ein progressiver Verlust von Langerhans-Zellen auf. Dies sind dendritische Immunzellen der Haut, deren Aufgabe vor allem in der Antigenprozessierung und Antigenpräsentation besteht. Bereits nach einer Stunde sind 25 % weniger Langerhans-Zellen in der Epidermis zu finden als im Kontrollpräparat. Der weitere Verlust erfolgt stetig, wobei nach 24 bis 72 Stunden nur noch 10 % der ursprünglichen Anzahl von Langerhans-Zellen vorhanden sind [11, 13]. Weiterhin wird über ein interzelluläres Ödem der Epidermis berichtet, welches über die gesamte Dauer des makroskopisch sichtbaren Ödems erhalten bleibt [10, 11]. 3 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung Tab. 1: Histologische Veränderungen der Haut durch UV - Strahlung im Zeitverlauf Epidermis Hruza 1993 Gilchrest 1981 Gilchrest 1983 SBC Erscheinen Gipfel 30 m k.A. 30 m 24 h keine keine LHZ-Verlust Beginn Peak 1h 24–72 h 1h 24–72 h progressiv k.A. Andere LZ-Infiltrat auffällige MZ Spongiose k.A. k.A. vorhanden 24–72 h 30 m–1 h persistierend k.A. k.A. Beginn Gipfel Ende 30 m 24 h 72 h 30 m 24 h k.A. sofort 24–48 h k.A perivaskuläres Beginn Infiltrat Ende 24 h 72 h 24 h 72 h vorhanden k.A. Vasodilatation Beginn Gipfel Ende k.A. 8h nach 48 h Andere Extravasate vorhanden Melanophagen k.A. Dermis Endothelschwellung vorhanden k.A. vorhanden vorhanden k.A. SBC: sunburncells, LHZ: Langerhans - Zellen, LZ: Lymphozyten, MZ: Melanozyten, k.A.: keine Angabe 4 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung Gilchrest et al. stellten zusätzlich noch ein dezentes lymphozytäres Infiltrat der Epidermis, sowie Veränderungen an Melanozyten fest. Letztere erschienen nach der Bestrahlung vakuolisiert, geschwollen und bleicher als im Vergleich mit unbestrahlter Haut [11]. Die Wirkung in der Dermis manifestiert sich vor allem an den Gefäßen. Es findet sich eine ausgeprägte Vasodilatation, die nach 8 Stunden am stärksten ausgebildet ist, und sich erst nach 48 Stunden wieder zurückbildet. Die Endothelzellen, welche die Gefäße auskleiden, beginnen nach 30 Minuten stark anzuschwellen. Nach 24 bis 48 Stunden ist der Höhepunkt dieser Schwellung erreicht und nach 72 Stunden nimmt dieser Prozess allmählich wieder ab. Perivaskulär finden sich zwischen 24 und 72 Stunden ein Entzündungsinfiltrat und neutrophile Granulozyten sowie Monozyten in der gesamten Dermis. Zum Teil zeigen sich Erythrozytenextravasate sowie ein gehäuftes Auftreten von Melanophagen [10, 11, 13]. 1.3 Veränderungen der Haut duch UV-Strahlung in der RCM Zur Beobachtung UV-bedingter Veränderungen der Haut in der RCM gibt es bereits einige Studien. Im Folgenden sollen die bisherigen Ergebnisse zusammengefasst werden. Eine Vasodilatation und ein beschleunigter kapillarer Blutfluss nach UV-Exposition konnte in allen Studien, die dies untersuchten, nachgewiesen werden. Diese Phänomene traten bei Verwendung von UVA, UVB und einem breiten Strahlungsspektrum auf [14–16]. Zudem konnte diese Veränderung schon nach relativ kurzer Zeit, das heißt sofort nach der Bestrahlung [16], bzw. nach 24 Stunden [14] beobachtet werden. Ebenso zeigte sich, dass diese vaskulären Reaktionen auch schon bei niedrigen UV-Dosen, wie der einfachen minimalen Erythemdosis (MED), hervorgerufen werden [14–16]. Ödeme, als Hinweis auf die Entzündungsreaktion der Haut, zeigten sich sowohl in der Studie von Ulrich et al. von 2009 als auch in der Arbeit von Gambichler et al. von 2006 [14, 15]. Die zeitliche Einordnung weist auf eine stetige Entwicklung in Abhängikeit von der Bestrahlungsdosis hin. Treten bei der Exposition mit der einfachen MED eine Spongiose nach 24 Stunden und Mikrovesikel bei zwei von fünf Probanden erst nach 48 Stunden auf, so bewirkt eine höhere Dosis von 240 mJ/cm2 die Entwicklung von Mikrovesikeln schon nach 24 Stunden, bei ebenfalls vorhandener Spongiose [14]. Die Entwicklung von SBC wird nur in einer Studie erwähnt. Die SBC werden als große Zellen mit dunklem Randsaum und hellem Kern beschrieben. Das erstmalige Auftreten bei Bestrahlung mit der einfachen MED zeigt sich bei zwei von fünf Probanden nach 24 Stunden. Nach 48 Stunden konnten bei vier der fünf Teilneh- 5 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung mern diese Zellen beschrieben werden. Bei Steigerung der UV-Dosis treten die SBC schon nach 24 Stunden gehäuft auf. Eine Angabe zur histologischen Korrelation wird nicht gemacht [14]. Im Hinblick auf die verstärkte Pigmentierung nach Sonneneinstrahlung wird als Befund in der RCM eine verstärkte Helligkeit der Basalschicht beschrieben [15]. In einer Studie an Guinea Schweinen, deren Haut der menschlichen sehr ähnlich ist, wurde die Einlagerung von Melanin durch Keratinozyten beschrieben. Die starke Lichtreflektion dieser Substanz äußerte sich auch hier durch eine verstärkte Helligkeit des RCM Bildes [17]. In einigen Studien wurde die Bildung von dendritischen Melanozyten beobachtet, welche das Melanin über ihre Ausläufer an die Keratinozyten übertrugen. Diese traten frühestens acht Tage nach der Bestrahlung auf [16–18]. Middelkamp et al. beschrieben auch sehr schmale, helle Punkte, denen in die Tiefe zu einem Zellkörper gefolgt werden konnte, und kamen so zu dem Schluss, dass es sich um quer angeschnittene Dendriten handeln müsse [17]. Das Auftreten dieser aktivierten Melanozyten wurde auch histologisch bestätigt [16]. Gambichler et al. untersuchten weiterhin die Dicke der Epidermis nach der Bestrahlung und konnten eine signifikante Verdickung als Resultat der Hyperproliferation der Keratinozyten nachweisen [15, 19]. Im Vergleich zu gesunder Haut, wurde zusätzlich eine Architekturstörung der bestrahlten Haut beschrieben, die sich bei Bestrahlung mit der einfachen MED nach 48 Stunden noch eher diskret äußerte, bei höherer Dosis aber bis zum Verlust des charakteristischen Musters der Epidermis in der RCM, des „honeycomb pattern“ führte [14]. Leider wurden zum Teil in den vorliegenden Studien die Auswertungskriterien nicht angegeben [14], was eine objektive Einordnung der erhobenen Befunde erschwert. 1.4 Studiendesign, erwartete Ergebnisse und Fragestellung Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde das Design dieser Studie auf die Untersuchung UV-bedingter Veränderungen der Haut mittels RCM optimiert. In allen zitierten Studien erfolgte die Bestrahlung am inneren Unterarm. Natürlich ist diese Stelle der Sonne vergleichsweise wenig ausgesetzt; da aber gerade die Veränderungen duch UV-Strahlung Gegenstand dieser Studie sind, bietet es sich an, einen noch weniger exponierten Ort zu wählen. Wir haben daher für diese Studie die Glutealregion gewählt. Zudem wurde die Bestrahlung und Untersuchung im Januar durchgeführt, wodurch zusätzlich von einer insgesamt geringeren Sonnenexposition der Teilnehmer auszugehen ist. Es wurde weiterhin darauf geachtet, dass die Probanden sich vorher nicht intensiver Sonnenstrahlung ausgesetzt haben (z.B. im 6 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung Rahmen eines Urlaubs oder Solariumbesuchs). Als Strahlungsquelle war der Oriel Sonnensimulator in Verwendung, der so ausgestattet ist, dass er das gesamte UV-Spektrum der Sonne emittiert und nicht nur gezielt UVA- oder UVB-Strahlung (siehe auch Kapitel 2.1.1). Wichtig erschien es auch, die Strahlendosis bei allen Probanden vergleichbar hoch zu wählen. Da die Reaktion auf UV-Exposition individuell sehr unterschiedlich ist, ist es erforderlich die Bestrahlungsdosis zu normieren. Zu diesem Zweck wird vor der Bestrahlung die minimale Erythemdosis (MED) bestimmt (siehe Kapitel 2.2). Um eine genügend starke Reaktion hervorzurufen, haben wir uns für die dreifache individuelle MED entschieden. In den oben angeführten Arbeiten wurde zum Teil mit sehr schwachen Dosen gearbeitet, so dass die entsprechenden Reaktionen wenig stark ausgeprägt waren [14], oder aber mit festen Dosen bei allen Probanden [14, 16], was eine Vergleichbarkeit erschwert. Die Anzahl der Beobachtungszeitpunkte wurde erhöht, um so den Verlauf der Veränderungen gut verfolgen zu können. Die Aufnahmen mit dem RCM erfolgen eine Stunde, 24 Stunden, 72 Stunden und eine Woche nach der Bestrahlung. Zusätzlich erfolgt auch eine Aufnahme von der nicht bestrahlten Haut auf der kontralateralen Seite. Die sehr interessante akute Reaktion nach einer Stunde, wurde bisher nur in einer Studie beobachtet. Wir erwarten uns hier die beginnende Entzündungsreaktion darstellen zu können. Vor allem rechnen wir mit einer Dilatation der Hautgefäße. Eventuell sind auch schon ein leichtes Ödem oder Entzündungszellen zu sehen [16]. Die Aufnahme nach 24 Stunden ist schon fast Standard zu nennen. Zu diesem Zeitpunkt vermuten wir das Auftreten von SBC, ein zunehmendes Ödem und beginnende Pigmentierung. Die Entzündung wird sich verstärkt haben, was zu einem vermehrten Auftreten epidermal gelegener Entzündungszellen führen sollte. Nach 72 Stunden soll vor allem der Verlauf des Sonnenbrandes beobachtet werden. Es ist auch schon mit dem Auftreten von Architekturstörungen zu rechnen. Sehr wichtig erscheint uns die letzte Kontrolle nach einer Woche, da erst ab diesem Zeitpunkt dendritische Melanozyten zu sehen waren. Weiterhin erwarten wir eine verstärkte Pigmentierung der Haut. Zusätzlich hat die Studie auch explorativen Charakter, da wir uns von der Optimierung des Studiendesigns eine genauere Erfassung der Veränderungen sowie das Auftreten noch nicht beschriebener Phänomene erwarten. Von allen Zeitpunkten der RCM-Untersuchungen werden außerdem Stanzbiopsien der Läsion angefertigt. Um eine optimale Vergleichbarkeit mit den RCM-Bildern herzustellen, sollen die histologischen Schnitte nicht senkrecht zur Hautoberfläche ausgeführt werden, wie es normalerweise üblich ist, sondern ebenso wie in der RCM, parallel zur Hautoberfläche. Die histologischen Schnitte sollen auf die, in der RCM gefundenen Ergebnisse hin untersucht werden und die Vergleichbarkeit der 7 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 1 Einleitung RCM-Bilder mit der normalen Histologie bestätigt werden. In der Untersuchung von Ulrich et al. wurde auch eine Stanze entnommen, die Ergebnisse der histologischen Auswertung haben aber leider keinen Eingang in die Publikation gefunden [14]. Das Ziel dieser Studie ist es, die Veränderungen der Haut, die durch UV-Strahlung hervorgerufen werden, im Verlauf in der RCM zu beobachten, zu beschreiben und einzuordnen. Zusätzlich sollen die erhobenen Befunde mit histologischen Schnitten der betroffenen Stelle verglichen und die Vergleichbarkeit bewertet werden. 8 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden 2 Methoden 2.1 Verwendete Geräte 2.1.1 Sonnensimulator Oriel 1000 Für die Studie kam der Oriel 1000 Watt UV-Sonnensimulator (Oriel, Darmstadt, Deutschland) zum Einsatz, welcher auch schon in anderen Studien der Klinik für Dermatologie benutzt wurde [20, 21]. Das Gerät bietet ein Lichtspektrum, das dem UV-Spektrum der Sonne sehr ähnlich ist. Das heißt es wird nicht nur gezielt UV-A oder UV-B Licht emittiert, sondern das gesammte UV-Spektrum der Sonne simuliert. Der Simulator ist mit einem dichriotischen Spiegel ausgestattet, der vor allem den Bereich des Lichts von 280–400 nm reflektiert und das sichtbare Licht und das Infrarotlicht stark reduziert. Der nachgeschaltete atmosphärische Dämpfungsfilter (WG320/1 mm) bildet die UV-Kante der Sonne nach. Er ist kombiniert mit dem UG5/1 mm Bandpass-Sperrfilter, der sichtbares Infrarotlicht blockiert. [22] Da die Leistung der UV-Lampe einer gewissen Schwankungsbreite unterliegt, wurde das Gerät vor und während des Betriebs mit einem Breitband-ThermosäulenRadiometer (Dexter Research 2 M mit Quarzfenster) überwacht. Um die Intensität der UV-Lampe zu messen, wurde die Leistung 20 cm entfernt vom Filter, also auf Höhe des Niveaus der Haut bei der späteren Bestrahlung, mit einem Photometer gemessen. Die Bestrahlungszeit wurde an die gemessene Leistung angepasst, um eine normierte resultierende Energie zu erhalten (siehe Tab. 2 auf Seite 13). Output (mW/cm2 ) x Zeit (s) = Energie (mJ). Der Sonnensimulator Oriel 1000 entspricht den FDA- (1999) und den COLIPA (1994)-Richtlinien für Sonnencreme Testung. 2.1.2 Reflectance Confocal Microscopy Die konfokale Reflektionsmikroskopie (RCM) ist eine neuartige Technik, die es im Gegensatz zur herkömmlichen Lichtmikroskopie ermöglicht, die Haut in-vivo zu untersuchen [23]. In-vivo bedeutet hierbei, dass es nicht mehr nötig ist eine Biopsie aus der interessierenden Hautstelle zu entnehmen, sondern dass die Haut direkt „im Lebenden“ untersucht werden kann. Das ist, neben des weitaus angenehmeren Untersuchungsvorganges für den Patienten, vor allem ein großer Vorteil für Verlaufskontrollen, da ein und dieselbe Stelle beliebig oft untersucht werden kann. Weiterhin ist es möglich die Untersuchung in Echtzeit auf dem Bildschirm zu verfolgen. Dadurch können einerseits gewisse Prozesse, wie zum Beispiel der Blutfluss, besser dargestellt werden, auf der anderen Seite wird den Patienten ermöglicht, die Untersuchung zu verfolgen und sich die Sachverhalte vom Arzt anschaulich erklären zu 9 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden lassen. Die Bilderzeugung findet bei der RCM mit Hilfe eines Laserstrahls statt. Die Wellenlänge des verwendeten Lichts beträgt 830 nm und liegt damit nahe am Infrarotbereich [23, 24]. Dabei ist das emittierte Licht monochromatisch und kohärent. Die Leistung dieses Lasers liegt im Bereich von 1 mW bis maximal 20 mW, weshalb keine Gewebeschäden entstehen können [8]. Eine Skizze der Funktionsweise der RCM nach [23] findet sich in Abbildung 2. Abb. 2: Funktionsweise der RCM Abb. 3: Vivascope 1500 Der Lichtstrahl wird über einen Lichtstrahlteiler und die Objektivlinse auf den gewünschten Ort in der Haut fokussiert (schwarze Pfeile in Abb. 2). In der Haut wird das Licht an den Grenzen verschiedener Zellstrukturen mit unterschiedlichem Brechungsindex gestreut und reflektiert. Zu diesen gehören Keratin, die Mitchondrien, die Zellorganellen, Chromatin und Kollagen [24]. Eine besondere Rolle nimmt das Melanin ein, das einen sehr hohen Brechungsindex besitzt. Dadurch wird sehr viel Licht reflektiert, was zu guten Kontrasten führt. Stellen mit hoher Melaninkonzentration erscheinen im RCM-Bild sehr hell [8, 25]. Das reflektierte Licht (graue Pfeile in Abb. 2) wird durch die Objektivlinse auf das sogenannte “pinhole“ fokussiert. Dieses ist eine Lochblende, die verhindert, dass Licht, das von Strukturen außerhalb der Fokusebene reflektiert wird, auf den Detektor auftrifft (graue, gestrichelte Pfeile in Abb. 2). Der Durchmesser der Lochblende ist an den des Lichtstrahls angepasst [23]. Das vom Detektor erkannte, reflektierte Licht, wird an einen angeschlossenen Computer weitergegeben. Anschließend errechnet eine Software aus der Stärke des zurückgeworfenen Lichts und den zugehörigen Koordinaten ein zweidimensionales Graustufenbild von der entsprechenden Ebene. Die Lichtquelle, der beleuchtete Punkt in der Haut und der Detektor sind in optisch kunjugierten Ebenen ausgerichtet. Im RCM enspricht das einer konfokalen Ausrichtung, aus der das Mikroskop auch seinen Namen bezieht. Man sieht, dass 10 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden in der RCM, im Gegensatz zur Lichtmikroskopie, mit reflektiertem Licht gearbeitet wird, anstatt das Objekt zu durchleuchten. Daher ist es auch nicht nötig die interessierende Stelle zu biopsieren. Abb. 4: Modell des Aufnahmemodus Cube in der RCM Das resultierende Bild stellt, in einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixel, einen Bereich der Haut dar, der 500 x 500 µm umfasst. Die Ebene liegt, im Gegensatz zur herkömmlichen Mikroskopie, parallel zur Hautoberfläche. Die axiale Auflösung beträgt hierbei 3–5 µm und entspricht der Schichtdicke eines histologischen Schnittes. Die laterale Auflösung liegt in einem Bereich von 1–2 µm, und entspricht somit der, der herkömmlichen Lichtmikroskopie [8,23,24]. Mit der RCM lassen sich sowohl parallel zur Hautoberfläche, als auch in die Tiefe, Sequenzaufnahmen machen, so dass man eine Ebene mit 8 x 8 Bildern erhält, was einem Bereich von 4 x 4 mm entspricht bzw. ein “Stack“, bei dem in definierten Abständen die Tiefe erhöht wird. Eine Kombination dieser beiden Aufnahmetechniken stellt der “Cube“ dar, bei dem mehrere Ebenen aufgenommen werden, wobei die Eindringtiefe des Lasers in einem zuvor definierten Abstand erhöht wird. Man erhält also einen Würfel der entsprechenden 11 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Abb. 5: Die Bilder 1–6 zeigen die wichtigsten Schritte vor der Untersuchung mit dem RCM; entnommen aus [26] Stelle. Eine Darstellung der verschiedenen Aufnahmemodi zeigt Abbildung 4. Die Eindringtiefe des Lasers ist von der Wellenlänge und der Energie des Lichts abhängig. Mit längeren Wellen wird aufgrund der verringerten Streuung die Eindringtiefe höher, allerdings nimmt die Auflösung ab [24]. Mit der standardmäßig verwendeten Wellenlänge von 830 nm und einer Leistung von bis zu 20 mW erreicht man Tiefen von 200–500 µm [8, 24]. Dies entspricht einer Abbildung der Epidermis und der oberflächlichen Dermis. Um die Qualität der Abbildung zu steigern, werden verschiedene Techniken angewandt. Im Objektiv des RCM wird eine Wasserimmersionslinse mit einer dreißigfachen Vergrößerung und einer numerischen Appertur von 0.9 verwendet. Als Medium kommt ein Gel auf Wasserbasis zum Einsatz, das mit einem Brechungsindex von 1.33 dem der Epidermis, mit 1.34, sehr nahe kommt. Dadurch werden sphärische Abbildungsfehler vermieden, welche die Auflösung und den Kontrast verringern [24]. Als weitere Maßnahme wird der Kontakt zwischen Haut und RCM mittels eines Metallringes hergestellt. Eine durchsichtige Plastikschablone mit doppelseitigem Klebeband wird auf den Ring geklebt, die andere Seite haftet an der Haut des Probanden. Die Haut wird zuvor ebenfalls mit einem Immersionsmedium, in diesem Fall Öl, versehen. Auf die Schablone kann nun das Immersionsgel aufgetragen werden. Die Fixierung des Ringes an das RCM erfolgt magnetisch. Nun kann die Haut relativ zum Mikroskop mit Hilfe des aufgeklebten Metallringes verschoben werden. Durch die Verwendung des Metallringes erreicht man eine Verringerung der 12 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Tab. 2: Energie und Bestrahlungszeit der einzelnen Stufen der Lichttreppe Intensität Stufen der Lichttreppe (mW/cm2 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 Energie in (mJ) und Zeit in (m) 1514 2142 3029 4284 6058 8566 5:02 4:57 4:51 4:46 4:40 4:35 4:31 4:26 7:08 7:00 6:52 6:44 6:37 6:29 6:22 6:16 10:05 9:54 9:43 9:31 9:21 9:11 9:01 8:52 14:17 14:00 13:44 13:28 13:13 12:59 12:45 12:32 20:11 19:48 19:25 19:03 18:42 18:16 18:01 17:43 28:33 27:59 27:27 26:56 26:26 25:58 25:29 25:03 Bewegungsartefakte [8, 23]. Vor der eigentlichen Aufnahme mit der RCM, wird ein auflichtmikroskopisches Bild der betreffenden Stelle gemacht. Dieses dient als Übersicht und zur Navigation im Computerprogramm der RCM. Der Ablauf der Schritte vor der Untersuchung mit dem RCM ist in Abbildung 5 dargestellt. 2.2 Minimale Erythemdosis Die MED ist definiert durch jene kumulative UV-Dosis, bei der bei einem Probanden erstmals eine Rötung der Haut, also ein Erythem, auftritt. Die Bestimmung der MED erfolgt mittels Anlegen einer Lichttreppe in der Glutealregion oder am Rücken, da diese Hautareale am wenigsten der natürlichen UV-Strahlung durch die Sonne ausgesetzt sind [21, 27]. Da bei der vorliegenden Studie gerade die Wirkung der UV-Strahlung auf die Haut im Mittelpunkt stand, haben wir uns für die Glutealregion entschieden, bei der dieser Faktor zuverlässiger zutrifft als für die Rückenhaut. Daher werden sowohl die Lichttreppe als auch die darauf folgende Bestrahlung an dieser Stelle durchgeführt. Für die Lichttreppe werden sechs Testfelder in aufsteigender Dosis mit dem Sonnensimulator bestrahlt. Die Testfelder werden durch eine lichtundurchlässige Schablone abgegrenzt und betragen 1 cm im Durchmesser. Der Bereich um die Schablone herum wird mit lichtdichten Tüchern abgedeckt, um eine Bestrahlung der umliegenden Haut zu verhindern, wie in Abbildung 6 zu sehen ist. In Tabelle 2 sind die gewählten Energiestufen der Lichttreppe dargestellt. Wie in der Tabelle ersichtlich, hängt die Bestrahlungszeit der einzelnen Felder von der vorher mit einem Photometer gemessenen Stärke der UV-Lampe des Sonnensimulators ab. Nach 24 Stunden kommt der Proband zur Ablesung. Es wird bestimmt, bei welcher Dosis zum ersten Mal eine Rötung aufgetreten ist. Diese Dosis entspricht der individuellen MED des Probanden. Die Lichtreppe 24 Stunden nach der Bestrahlung 13 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Abb. 6: UV-Bestrahlung mit dem Sonnensimulator Abb. 7: Die Lichttreppe 24 Stunden nach dem Anlegen ist in Abbildung 7 dargestellt, die Dosis, bei der zuerst eine Rötung aufgetreten ist, ist mit einem Pfeil markiert. Sie trat bei diesem Probanden in der vierten Stufe der Lichttreppe auf, die Dosis betrug also 4284 mJ. 2.3 Biopsieentnahme und Histologie Um einen histologischen Vergleich zu erhalten wird zu jedem Zeitpunkt, bei dem eine Untersuchung mit dem RCM durchgeführt wird, auch bei jeweils einem Probanden eine Stanzbiopsie der betroffenen Stelle angefertigt. Die Stanzen werden nach dem standardisierten Vorgehen für Stanzbiopsien gemacht. Zur Betäubung der entsprechenden Stelle wird ein Lokalanästhetikum ohne Zusatz von Adrenalin benutzt, um keine Schädigung der Subcutis hervorzurufen. Der Durchmesser der Stanze wird auf 4 mm festgelegt, da die Schnitte später in Anlehnung an die RCM horizontal, statt wie normalerweise vertikal, geschnitten werden. Bei einem kleineren Durchmesser wäre dadurch die resultierende Schnittfläche zu klein. Die Schnitte werden anschließend im Standardverfahren fixiert und mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung gefärbt. Die durch das Stanzen entstandene Wunde wird mit einer Einzelknopfnaht oder mit Steristrips versorgt und steril verbunden. 2.4 Auswahl der Probanden Für die Studie werden 10 gesunde Probanden gesucht. Um altersbedingte Vorschädigung der Haut duch Sonnenlicht möglichst auszuschließen, wird das Alter der 14 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Probanden auf den Bereich von 19–50 Jahren eingegrenzt. Das Geschlecht spielt in diesem Zusammenhang keine Rolle. Auch der Hauttyp wird nicht als Ausschlusskriterium gewählt, da durch die Standardisierung auf die dreifache MED, die Ergebnisse unabhängig vom Hauttyp vergleichbar sind. Zudem hat der Hauttyp einen relativ geringen Einfluss auf die MED [27, 28]. Auschlusskriterien sind Solariumsbesuch in den letzten acht Wochen, Einnahme von Medikamenten, die die UV-Empfindlichkeit der Haut erhöhen (z.B. Photosensitizer, einige Antibiotika, etc.), bestehende Schwangerschaft und eine bekannte Überempfindlichkeit gegenüber UV-Strahlung. Probanden, bei denen eine Überempfindlichkeit gegen Lokalanästhetika bekannt ist, sind von der Anfertigung einer Stanze ausgeschlossen. Die Rekrutierung der Probanden erfolgt durch direktes, mündliches Ansprechen. 2.5 Vorbereitung der Studie Der gesamte Ablauf der Studie erfolgt nach den ethischen Grundsätzen für die medizinische Forschung am Menschen, der Deklaration von Helsinki. Vor Beginn der Studie werden die formalen Voraussetzungen geklärt. Nach Recherche der aktuellen Literatur zum Thema wird ein Studienprotokoll erstellt, in dem der theoretische Hintergrund, die aktuelle Literatur, die Zielsetzung und der Zweck der Studie, sowie das Studiendesign dargestellt werden. Auch ethische Überlegungen gehen in das Studienprotokoll ein. Weiterhin werden Einverständniserklärungen für die Teilnahme an der Studie, sowie case report forms für die Dokumentation der Studienteilnahme ausgearbeitet. Nach Fertigstellung dieser Unterlagen kann bei der Ethikkomission ein Antrag auf die Beurteilung der Studie gestellt werden, dem die oben genannten Dokumente beigefügt werden. Am 13. Jänner 2010 wurde ein positives Votum der Ethikkomission ausgestellt, woraufhin mit der Studie begonnen werden konnte. Alle hier genannten Formulare, finden sich als Kopie im Anhang der Arbeit. 2.6 Ablauf der Studie Bevor die Probanden an der Studie teilnehmen können, werden Sie ausführlich über den Ablauf der Studie, die Zielsetzung, die Risiken und ihre Rechte und Pflichten aufgeklärt. Die Probanden bestätigen schriftlich ihre Einwilligung zur Teilnahme an der Studie. Jene Teilnehmer, bei denen eine Stanzbiopsie geplant ist, werden auch über diesen Eingriff ausführlich aufgeklärt und unterschreiben eine entsprechende Einwilligung. Weiterhin werden die Teilnehmer darüber informiert, dass sie ihre Teilnahme an der Studie jederzeit, auch ohne Angabe von Gründen, widerrufen können. Eine Übersicht zum Ablauf der Studie gibt Tab. 3. 15 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Tab. 3: Überblick über den Studienablauf Tätigkeit Zeitpunkt Lichttreppe Bestimmung der MED Bestrahlung 3x MED Laserscan gesunde Haut Laserscan Läsion Stanzbiopsie Läsion* d0 X d1 n. 1 h n. 24 h n. 72 h n. 1 w X X X X X X X X X X X * die Stanzbiopsie erfolgt jeweils nur bei einem Probanden pro Zeitpunkt Zu Beginn der Studie (entspricht Tag 0) wird in der linken Glutealregion der Probanden mit dem Sonnensimulator eine Lichttreppe angelegt, um die MED zu bestimmen. Die Ablesung erfolgt wie in Kapitel 2.2 beschrieben, nach 24 Stunden. Im Anschluss an die Ablesung wird auf der kontralateralen Seite ein 1 cm im Durchmesser großer Bereich mit der dreifachen MED bestrahlt, um einen kleinen Sonnenbrand zu induzieren. Auch hier wird die umliegende Haut mit einer Schablone und Tüchern abgedeckt. Eine Stunde nach der Bestrahlung wird die akute Veränderung mit dem RCM festgehalten. Zusätzlich erfolgt ein Laserscan der gesunden Haut um ein Referenzbild des Probanden zu haben. Weitere Aufnahmen erfolgen nach 24 h, 72 h und nach einer Woche. Bei jedem Probanden wird ein Cube mit 10 Schichten erstellt. Jede Schicht umfasst einen Bereich von 4 x 4 mm, der Abstand zwischen den Schichten beträgt 10 µm. Vor jedem Laserscan wird die Läsion auflichtmikroskopisch dokumentiert. Der Mittelpunkt des Cubes wird immer im Zentrum der Läsion gesetzt. Zu jedem der drei Zeitpunkte wird bei jeweils einem der Probanden eine Stanzbiopsie der Region angefertigt. Zusätzlich wird zur besseren Vergleichbarkeit bei einem Probanden eine Stanze aus gesunder Haut entnommen. 2.7 Auswertung Die Auswertung der Bilder erfolgt duch eine Expertengruppe, die die Bilder, nach Patienten und Untersuchungszeitpunkten geordnet, auswertet. Die Gruppe besteht aus drei Personen, die in der Verwendung und Auswertung der RCM-Bilder erfahren sind. Die Kriterien, nach welchen die Auswertung stattfindet, beziehen sich teilweise auf schon durchgeführte Studien mit ähnlicher Fragestellung [15–17]. Andere Merkmale haben sich erst im Verlauf der Betrachtung der Bilder ergeben, da bestimmte Phänomene gehäuft auftraten oder auffällig waren. Folgende Kriterien werden bei der Auswertung der Bilder berücksichtigt und dokumentiert: 16 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden Tab. 4: Nach UV-Bestrahlung auftretende Phänomene in der RCM Entzündungszellen hell leuchtende, mittelgroße Zellen, von den Papillen ausgehend in die Epidermis eingewandert sunburn cells Zellen mit hellem großen Kern und dunklem Hof, apoptotische Keratinozyten Ödem wolkige Überlagerung der CLSM Bilder, in der Tiefe vor allem durch Unschärfe charakterisiert aktivierter Melanozyt große Zellen mit polygonalem Kern und hellen dendritischen Ausläufern Mikrovesikel kreisrunde dunkle Areale, mit Flüssigkeit gefüllt 17 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden 1. Anzahl der epidermalen Entzündungszellen (auf 0.5 x 0.5 mm) • keine: keine sichtbar (0) • wenige: 1–9 Zellen (+) • mittel: 10–19 Zellen (++) • viele: mehr als 20 Zellen (+++) 2. Anzahl der sunburn cells (auf 1 x 1 mm) • apoptotische: stark reflektierender Kern mit dunklem Halo • nekrotische: stark reflektierende Kerne ohne Halo, teilweise in Vesikeln grupiert 3. Ödembildung • keine: kein Ödem sichtbar (0) • leichte: leichtes Ödem sichtbar, Auftreibung der Epidermis, leichte Unschärfe in tiefen Schichten (+) • starke: ausgeprägtes Ödem sichtbar, starke Unschärfe auch schon in höheren Schichten, zum Teil sind Strukturen nicht mehr beurteilbar (++) 4. Vasodilatation • keine: keine Vasodilatation sichtbar (0) • leichte: Gefäßzeichnung verstärkt (+) • starke: ausgeprägte Gefäßzeichnung und sichtbar erweiterte Lumina, im Echtzeitbild verstärkter Blutfluss (++) 5. Anzahl der aktivierten Melanozyten in einer Schicht (4x4 mm) • polygonale Zellen mit dendritischen Ausläufern, stark reflektierend durch den hohen Melaningehalt 6. sonstige Beobachtungen • Schuppung • Mikrovesikelbildung • Blasenbildung • Strukturveränderung des honeycomb pattern bishin zum kompletten Verlust desselben • Andere Beobachtungen 18 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 2 Methoden In Tabelle 4 sind Beispiele sowie morphologische Beschreibungen dieser Strukturen angeführt. Die Beurteilung der verschiedenen Kriterien wird in dem Feld vorgenommen, in dem das zu beobachtende Phänomen am stärksten ausgeprägt ist. Bei Uneinigkeit über Zelltypen, Anzahl oder Ausprägung, wird eine Mehrheitsentscheidung getroffen. Pro Proband werden fünf Cubes mit je zehn Schichten aufgenommen, die wiederum 64 Einzelbilder umfassen, das entspricht insgesamt mehr als 3000 Bildern pro Teilnehmer. Daher werden bei jedem Treffen der Gruppe nur jeweils die Aufnahmen eines bis höchstens zwei Probanden ausgewertet, um Ermüdungserscheinungen zu vermeiden. Die Cubes werden geordnet nach zeitlichem Ablauf und nach der Aufnahmetiefe betrachtet. Zuerst wird das Übersichtsbild der jeweiligen Schicht auf Auffälligkeiten untersucht, danach im Zoom jedes Einzelbild auf Bildschirmgröße nach den oben genannten Kriterien ausgewertet. 19 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Stichprobe Die Stichprobe setzte sich aus vier weiblichen und sechs männlichen Probanden zusammen, wobei das durchschnittliche Alter der Probanden bei 23.9 (SD: 1.7) Jahren lag. Der Median der MED der Probanden lag bei 4284 mJ/cm2 . Alle Studienteilnehmer nahmen alle sechs Studientermine zeitgerecht wahr mit Ausnahme derer, bei denen eine Biopsie entnommen wurde. Diese konnten nach der Stanzbiopsie aufgrund der Hautläsion durch die Stanze nicht mehr an den RCM Untersuchungen teilnehmen. Dies betraf pb2, bei dem nach 24 und 72 Stunden keine Aufnahme gemacht wurde, sowie pb8, bei dem nach 72 Stunden und einer Woche keine Untersuchung mit dem RCM stattfand. 3.2 Auswertung der RCM-Bilder Im Folgenden sollen die Ergebnisse der Auswertung der RCM-Bilder dargestellt werden. Es wurden bei zehn Probanden insgesamt 46 Cubes mit dem RCM aufgenommen, insgesamt wurden somit knapp 30000 Bilder ausgewertet. Qualitativ war der größte Teil der Bilder hervorragend; d.h. die Bildqualität war sehr gut, alle erfoderlichen Schichten der Haut waren im Cube erfasst und wichtige Strukturen der Haut waren in den Bildern erkennbar. Bei einigen wenigen Cubes wurde die erste Schnittebene zu hoch angesetzt, so dass die ersten beiden Schichten nicht verwendet werden konnten. Dies stellte aber insofern kein Problem dar, als die relevanten Bereiche der Haut trotzdem im Cube enthalten waren. Im Folgenden wird auf alle untersuchten Phänomene (siehe Kapitel 2.7, S. 16) eingegangen und der jeweilige zeitliche Verlauf beschrieben. Eine Übersicht über die Ergebnisse ist in Tabelle 5 auf Seite 21 zu finden. 3.2.1 Entzündungszellen Zuerst werden die Bilder hinsichtlich der Phänomene der für den Sonnenbrand charakteristischen Entzündungsreaktion untersucht. Die in der RCM sichtbare Trias dieser Reaktion besteht aus in die Epidermis eingewanderten Entzündungszellen, einer Vasodilatation und dem daraus resultierenden Ödem. In der gesunden Haut sind erwartungsgemäß wenige Entzündungszellen zu finden (zur Einteilung der Häufigkeit siehe Kapitel 2.7 , S. 16). Nur bei zwei Probanden (pb8, pb9) treten auch in der gesunden Haut mittelmäßig viele Entzündungszellen auf . Eine Stunde nach der UV-Exposition ist bereits eine leichte Steigerung zu 20 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse Tab. 5: Auswertung der RCM-Bilder in der Übersicht Proband Zeit EZ SBC Ödem VD MV pb1 vorher 1h 24 h 72 h 1w + + ++ ++ + 0 0 11 3 3 0 0 + ++ + 0 + + n.b. n.b. 0 0 0 0 Blasen p2 vorher 1h 1w + 0 0 0 0 1 0 + + 0 + + 0 0 0 p3 vorher 1h 24 h 72 h 1w 0 + ++ ++ + 0 1 2 2 0 0 ++ ++ ++ 0 0 ++ +++ n.b. 0 0 + 0 + 0 p4 vorher 1h 24 h 72 h 1w 0 + ++ ++ 0 0 0 3 4 0 0 + ++ ++ ++ 0/+ + n.b. n.b. n.b. 0 + Blasen 0 0 p5 vorher 1h 24 h 72 h 1w 0 0 +++ +++ ++ 0 3 6 5 0 0 + ++ ++ n.b. 0 0 + n.b. n.b. 0 0 0 + 0 p6 vorher 1h 24 h 72 h 1w + +++ +++ + + 0 0 3 0 0 0 + + ++ + 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0 p7 vorher 1h 24 h 72 h 1w 0 + ++ n.b. ++ 0 1 4 n.b. 0 0 + + ++ + 0 + + n.b. 0 0 0 + 0 0 p8 vorher 1h 24 h ++ ++ +++ 0 1 3 + + ++ 0 + ++ 0 0 0 p9 vorher 1h 24 h 72 h 1w ++ ++ ++ +++ + 0 0 3 2 0 + + + ++ ++ 0 + + n.b. ++ 0 + 0 0 0 pb10 vorher 0 0 0 0 0 1h ++ 1 + + 0 24 h +++ 2 ++ + 0 72 h ++ 1 + 0 0 1w ++ 0 0 + 0 zu den Kriterien der Auswertung siehe Kapitel 2.7 auf Seite 16 EZ: Entzündungszellen, SBC: sunburn cells, VD: Vasodilatation, MV: Mikrovesikel, n.b.: nicht beurteilbar 21 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse Abb. 8: Diffus verteilte Entzündungszellen in der Epidermis Abb. 9: Häufigkeitsverteilung des Auftretens von Entzündungszellen beobachten. Waren vorher noch bei vier Probanden keine Entzündungszellen nachweisbar, so ist dies zu diesem Messzeitpunkt nur noch bei einem Teilnehmer der Fall. In den übrigen Kategorien ist jeweils ein Proband mehr zu verzeichnen. Bei pb6 sind bereits nach einer Stunde viele Entzündungszellen nachweisbar. Der Höhepunkt der Invasion durch Entzündungszellen ist nach 24 Stunden zu sehen. Bei sieben Probanden sind mehr als 20 Entzündungszellen auf 0.5 x 0.5 mm vorhanden, nur bei zwei Teilnehmern bleibt die Anzahl auf einem mittleren Niveau. Nach 72 Stunden beginnt die Entzündungsreaktion abzunehmen, so dass bei nur mehr vier Probanden viele Entzündungszellen zu sehen sind. Der Trend setzt sich zum letzten Untersuchungszeitpunkt hin fort. Nach einer Woche hat sich die Anzahl der Entzündungszellen im Vergleich mit der gesunden Haut nahezu normalisiert. Bei pb5, der insgesamt eine sehr ausgeprägte Reaktion auf die UV-Strahlung zeigte, sind allerdings noch immer mehr als 20 Entzündungszellen nachweisbar. Die Verteilung der Entzündungszellen in der Epidermis ist diffus, es finden sich jedoch immer konzentrierte Ansammlungen dieser Zellen in den Papillen der Dermis. 3.2.2 Ödem Zum Zeitpunkt vor der Bestrahlung ist bei den meisten Teilnehmern kein Ödem der Haut nachweisbar. Nur bei zwei Probanden (pb8, pb9) finden sich Anzeichen eines leichten Ödems. Eine leichte Ödembildung, als Hinweis auf die beginnende Entzündungsreaktion, ist bereits nach einer Stunde bei neun der zehn Teilnehmer nachzuweisen. Im RCM stellt sich dieses als wolkiger, dunkler Schleier dar, in den tieferen Schichten fällt eine verminderte Schärfe der Bilder auf. Mit fortschreitender Zeit verstärkt sich das Ödem und erreicht nach 72 Stunden 22 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse Abb. 10: Die Bilder 1–5 zeigen die Entwicklung des Ödems in der RCM (1: gesund, 2: nach 1 h, 3: nach 24 h, 4: nach 72 h, 5: nach 1 w) den Höhepunkt. Bei sieben von acht untersuchten Probanden (zu diesem Zeitpunkt kann bei zwei Probanden aufgrund der Stanzbiopsie keine Untersuchung mit dem RCM erfolgen) ist hier ein starkes Ödem zu sehen, nur bei Einem ein leichtes. Andere Phänomene werden zum Teil durch die resultierende Unschärfe unbeurteilbar. Eine Woche nach der Bestrahlung liegt noch immer bei sechs von acht der untersuchten Personen ein Ödem in unterschiedlich starker Ausprägung vor. Daraus wird ersichtlich, dass dieses Phänomen zwar rückläufig ist, aber weit mehr als eine Woche braucht, um sich völlig zurückzubilden. 3.2.3 Vasodilatation Die Entstehung des Ödems geht von den Gefäßen der oberflächlichen Dermis aus und ist vor allem durch deren Erweiterung begründet. Aus dieser resultiert eine erhöhte Durchlässigkeit der Gefäßwände. Daher hängt der zeitliche Verlauf dieser beiden Phänomene eng zusammen. Bei ausgeprägtem Ödem ist die Vasodilatation allerdings nur noch schwer oder gar nicht mehr beurteilbar, da das Bild gerade in der Tiefe, in der sich die Gefäße befinden, sehr unscharf wird. In der gesunden Haut fällt bei keinem der Probanden eine deutliche Erweiterung der Gefäße auf. Interindividuell ist die Gefäßzeichnung aber durchaus unterschiedlich und stellt sich bei manchen Teilnehmern deutlicher dar. Schon eine Stunde 23 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse nach der Bestrahlung ist bei acht von zehn Probanden eine Vasodilatation zu sehen. Nach 24 Stunden ist eine weitere leichte Steigerung zu verzeichnen. Bei einem Probanden (pb3) ist die Vasodilatation sehr stark ausgeprägt, bei einem weiteren (pb4) aufgrund des starken Ödems schon nicht mehr beurteilbar. In den Aufnahmen fallen großlumige Gefäße auf, die sich sowohl horizontal als auch in die Tiefe weiter verfolgen lassen. Während der Aufnahmen mit dem Vivascope sieht man Abb. 11: Vasodilatation 1 Stunde nach der Bestrahlung, die weißen Pfeile markieren erweiterte Gefäße im Längsschnitt (links) und Querschnitt (rechts) das Bild in Echtzeit. Dabei fällt in allen Gefäßen, im Vergleich zu den Aufnahmen von unbestrahlter Haut, ein stark vermehrter Blutfluss auf. In der RCM lässt sich die Bewegung der Erythrozyten in den Gefäßen darstellen, wodurch einerseits eine Bewertung der Flusszunahme und andererseits auch ein leichtes Identifizieren von Gefäßen ermöglicht wird. Der weitere Verlauf ist schwer zu bewerten, da bei sieben Probanden durch die ödembedingte Unschärfe keine Aussage getroffen werden kann. Da aber das Ödem direkt von der Vasodilatation abhängig ist, kann auch hinsichtlich der Vasodilatation bei 72 Stunden auf ein Maximum geschlossen werden. Auch nach einer Woche bleiben die Gefäße bei drei Teilnehmern nicht beurteilbar. Bei weiteren drei hat sich die Erweiterung wieder zurückgebildet. Die übrigen Probanden zeigen nach wie vor eine Dilatation der Gefäße. 3.2.4 sunburn cells Neben der Entzündungsreaktion entsteht durch die UV-Strahlung auch direkter Schaden an den Keratinozyten der Haut. Wie im Kapitel 1.2 auf Seite 2 bereits beschrieben, entstehen hierbei die sogenannten sunburn cells (SBC). Sie verhalten sich in 24 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse der Dynamik ihres Auftretens ähnlich wie die Entzündungsreaktion. Vor der Bestrahlung sind bei keinem Probanden SBC zu sehen. Nach einer Stunde ist bereits bei der Hälfte der Teilnehmer mindestens eine SBC auf einer Fläche von 1 x 1 mm nachweisbar. Auch bei den SBC zeigt sich der Höhepunkt des Auftretens nach 24 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt finden sich bei allen Probanden SBC in der Epidermis. Die Anzahl bewegt sich zwischen zwei und elf SBC auf 1 mm2 und beträgt im Mittel 4.11 (SD: 2.85) Zellen pro Proband. Aufgrund des ausgeprägten Ödems ist der Nachweis nach 72 Stunden erheblich schwerer. Bei allen sieben untersuchten Personen, bei denen die Bewertung zu diesem Zeitpunkt möglich ist, findet man SBC. Im Durchschnitt sind dies 2.83 (SD: 1.47), also schon deutlich weniger als nach 24 Stunden. Nach einer Woche sind nur noch bei zwei Teilnehmern SBC nachweisbar. Neben den bekannten SBC, traten bei einigen Probanden auch sehr ähnliche Zellen, allerdings ohne den charakteristischen dunklen Hof, auf. Die Dynamik dieser Zellen war der, der SBC ähnlich, allerdings im Vergleich etwas verzögert. Abb. 12: Mehrere sunburn cells (Pfeile) in einer Aufnahme nach 24 Stunden Abb. 13: Melanozyten (Pfeile) und sehr helle dendritische Strukturen (Sternchen) nach 1 Woche 3.2.5 Melanozyten Neben der Entstehung von SBC finden auch an anderen Zellen UV-vermittelte Veränderungen statt. Melanozyten werden aktiviert und beginnen Melanin zu produzieren, das sie über ihre Dendriten an die Keratinozyten weitergeben. Durch diese Melaninkappen sind die Keratinozyten vor der schädigenden Strahlung geschützt. Die Beurteilung der Anzahl aktivierter Melanozyten stellte sich allerdings als durchwegs schwierig heraus. Denn obwohl sich ab dem dritten Messzeitpunkt, 24 Stunden nach der Bestrahlung, viele dendritenärtige Strukturen zeigen, können die Strukturen sel25 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse ten zu einem Zellkörper verfolgt werden. In dieser Studie werden daher nur jene Zellen zu den aktivierten Melanozyten gezählt, welche durch Zellkörper, Pigmentierung und Dendriten, eindeutig als Melanozyten indentifiziert werden können. Die ersten aktivierten Melanozyten können bereits nach einer Stunde beobachtet werden. Nach 24 Stunden zeigen sich diese Zellen bei zwei der Teilnehmern, nach 72 Stunden hingegen wieder nur bei einem Probanden. Erst nach einer Woche können bei der Hälfte der bestrahlten Personen aktivierte Melanozyten beobachtet werden. Dendritische Strukturen hingegen sind bei fast allen Probanden, ab dem dritten Messzeitpunkt nach 24 Stunden, in steigender Anzahl und Intensität zu sehen, können aber wie oben bereits angeführt oft nicht zu einem Zellkörper zuückverfolgt werden. 3.2.6 Mikrovesikel Im Vergleich zu den vorher angeführten Phänomenen ist die Bildung von Mikrovesikeln bei den einzelnen Probanden sehr unterschiedlich. Die ersten Mikrovesikel können bei drei Teilnehmern bereits nach einer Stunde beobachtet werden. Im weiteren Verlauf entwickeln noch drei weitere Probanden Mikrovesikel. Bis auf zwei Ausnahmen sind diese aber jeweils nur zu einem Untersuchungszeitpunkt zu sehen. Sie entwicken sich folglich rasch zurück. Bei einem der Probanden gehen die Mikrovesikel nach 24 Stunden in Blasen über, die aber makroskopisch nicht zu sehen sind. Bei einem weiteren Teilnehmer kann man nach einer Woche eine fragliche Blasenbildung beobachten. 3.2.7 Schuppung Als weitere Folge der UV-Schädigung entwickelt sich bei sieben von neun untersuchten Teilnehmern nach spätestens einer Woche eine verstärkte Schuppung des Stratum corneum. Bei jeweils einem Probanden tritt diese Schuppung auch schon nach 24 bzw. 72 Stunden auf. 3.2.8 honeycomb pattern Das für die RCM-Aufnahmen sehr charakteristische honeycomb pattern der Haut, verändert sich nach der Bestrahlung mit dem Sonnensimulator sehr stark. Bei fast allen Probanden zeigt sich spätestens 72 Stunden nach der Bestrahlung eine starke Vergröberung dieses symmetrischen Netzes. Bei zwei Teilnehmern ist sogar ein völliger Verlust dieser Struktur zu sehen (pb1, pb5), ein als „loss of honeycomb pattern“ bekanntes Phänomen. Interessanterweise zeigt sich bei Proband 9 das Phä- 26 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse nomen, dass ein in gesunder Haut unregelmäßiges honeycomb pattern nach der UV-Bestrahlung eher regelmäßiger wurde. Abb. 14: Die Bilder 1–5 zeigen die Entwicklung des honeycomb pattern in der RCM (1: gesund, 2: nach 1 h, 3: nach 24 h, 4: nach 72 h, 5: nach 1 w) 3.2.9 Weitere Beobachtungen Neben diesen strukturiert erfassten Veränderungen der Haut durch UV-Strahlung, konnten auch einige weitere Phänomene beschrieben werden. Bei einem der Probanden (pb4), bei dem schon nach 24 Stunden Mikrovesikel auftraten, die sich nach 72 Stunden zu Blasen entwickelt hatten, konnten einen Tag nach der Bestahlung auch flächige Nekrosen beobachtet werden. Nach einer Woche wirkte es an einigen Stellen so, als würde sich die Epidermis von der Dermis abheben. Bei einem anderen Teilnehmer (pb5), bei dem ebenso nach 24 Stunden eine Massennekrose beobachtet werden konnte, trat ein völliger Verlust des HCP ein. Statt dieses symmetrischen Musters, war eine von Nekrosen, Mikrovesikeln und Blasen durchsetzte Epidermis zu finden. Die Entwicklung dieses imposanten Bildes ist in Abbildung 15 dargestellt. Zuletzt konnte bei einigen Probanden auch eine Verbreiterung der Hautspalten festgestellt werden. Besonders eindrucksvoll ist dieses Phänomen bei pb7 zu sehen. Dieser zeigt weiterhin auch eine ausgeprägte Parakeratose, das heißt es sind Zellkerne im Stratum corneum der Haut zu finden. 27 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse Abb. 15: Die Bilder 1–5 zeigen die Entwicklung einer ausgeprägten Nekrose in der RCM (1: gesund, 2: nach 1 h, 3: nach 24 h, 4: nach 72 h ist die Epidermis von nekrotischen Zellen, EZ und Mikrovesikeln durchsetzt, 5: nach 1 w scheint die Epidermis fibrotisch und narbig verändert) 28 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse 3.3 Auswertung der histologischen Schnitte Im Folgenden sollen die Ergebnisse der Auswertung der histologischen Schnitte beschrieben werden. Es liegen von vier Probanden histologische Präparate vor. Eines von gesunder Haut und jeweils eines 24 Stunden, 72 Stunden und eine Woche nach der Bestrahlung mit der dreifachen MED. Abb. 16: Histologische Querschnitte der unbestrahlten Haut in der Übersicht (links) und Vergrößerung (rechts). Zu sehen ist die Dermis (Sternchen), die Epidermis (E), dermale Papillen in der Junktionszone (weiße Pfeile) und das Stratum corneum (schwarze Pfeile). Die histologische Aufbereitung, die mit Querschnitten parallel zur Hautoberfläche erfolgen sollte, stellte sich als relativ kompliziert dar, weshalb nicht alle Schnitte zur Auswertung geeignet waren. Mehrfach sind die relevanten Schichten in den Schnitten nicht getroffen. Ursächlich dafür ist, dass die Epidermis, welche die Oberfläche der Haut und damit auch der Stanze darstellt, nur zwischen 30–50 µm dick ist. Diese Schicht ist deshalb beim Schneiden sehr schwer zu treffen. Gut getroffen hingegen sind in den meisten Präparaten die Junktionszone, sowie die Subcutis. Die Subcutis ist aber in der RCM aufgrund der schlechten Auslösung in der Tiefe nicht gut beurteilbar und somit für den Vergleich uninteressant. Im Randbereich der Schnitte auf Höhe der Dermis und der dermalen Papillen, sind ebenfalls das Stratum granulosum, sowie das Stratum corneum erfasst, da die Biopsie sich nach dem Stanzen konzentrisch kontrahiert, wodurch eine Wölbung auftritt. Ein Beispiel für die Schnittebenen aus gesunder Haut ist in Abbildung 16 zu sehen. In den Präparaten der Stanzen, die eine Stunde und 72 Stunden nach der UV-Bestrahlung entnommen wurden, ist keine der wichtigen Schichten getroffen, weshalb sie für die Auswertung nicht verwendet werden können. 29 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse 3.3.1 Entzündungszellen Im Präparat der gesunden Haut fallen erwartungsgemäß keine Entzündungszellen auf. Nach 24 Stunden zeigt sich bereits das Bild einer ausgeprägten Entzündungsreaktion mit vielen, vor allem in den Papillen lokalisierten, perivaskulären Infiltraten. In der Epidermis selber finden sich nur wenige Entzündungszellen, allerdings sind am Rand der dermalen Papillen immer wieder Entzündungszellen im Migrationsprozess beobachtbar, wie in Abbildung 17 dargestellt. Nach einer Woche sind in der Epidermis wiederum keine Entzündungszellen mehr zu sehen, perivaskulär hingegen persistiert das Entzündungsinfiltrat. Im Vergleich zum Bild nach 24 Stunden ist bereits ein Rückgang zu verzeichnen, man kann aber eine Restentzündung über den Zeitraum von einer Woche hinaus annehmen. Abb. 17: Perivaskuläre Infiltrate (Sternchen) und migrierende Entzündungszellen (Pfeile) Abb. 18: Mehrere sunburn cells (Pfeile) im histologischen Präparat nach 24 Stunden 3.3.2 sunburn cells In der unbestrahlten Haut sind keine sunburn cells (SBC) zu sehen, allerdings einige wenige nekrotisch erscheinende Zellen. Im Präparat der nach 24 Stunden entnommenen Stanze zeigen sich gehäuft ödematös geschwollene, blasse Keratinozyten und volumenreduzierte Zellen mit pyknotischem Kern. Beide Formen sind mit dem Bild der SBC in verschiedenen Stadien vereinbar. Allerdings könnte die sehr ausgeprägte Schwellung einiger Zellen auch ein Hinweis auf nekrotische Prozesse sein, da bei der Apoptose normalerweise kein so ausgeprägtes zelluläres Ödem auftritt. Ebenso finden sich Zellen mit pyknotischem Kern und ödematösem Randsaum, die dem klassischen Bild der SBC entsprechen. Vor allem letzteres Phänomen ist auch 30 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse noch nach einer Woche sichtbar, wobei zu diesem Zeitpunkt die SBC eher nahe am Stratum corneum zum Liegen kommen, was im zeitlichen Verlauf allerdings nicht ungewöhnlich erscheint. Die SBC im histologischen Präparat sind in Abbildung 18 dargestellt. 3.3.3 Ödem Ein entzündlich bedingtes Ödem des Gewebes ist nach 24 Stunden deutlich zu sehen. Die Zellzwischenräume erscheinen im Vergleich zum Bild der gesunden Haut vergrößert und das gesamte Bild wirkt aufgelockert, was man mit dem Begriff Spongiose beschreiben kann. Außerdem kann man eine Veränderung der Hautstruktur beobachten. Während man vor der UV-Bestrahlung eine sehr gleichmäßige Anordnung der Zellen sieht, wirkt die sonnengeschädigte Haut inhomogener und strukturloser. Abb. 19: Spongiose (Kreis) als Zeichen des Ödems und mehrere Halos (Pfeile) Abb. 20: Mehrere dilatierte papilläre Gefäße (Pfeile) im histologischen Schnitt 3.3.4 Vasodilatation Parallel zum Auftreten des Ödems kann in der Histologie nach 24 Stunden eine ausgeprägte Vasodilatation beobachtet werden, die nach einer Woche noch deutlicher erscheint. Sie persistiert also über diesen Zeitraum hinaus. Im Vergleich zur gesunden Haut entsteht außerdem der Eindruck, als sei neben der Erweiterung der Gefäße auch eine Vermehrung der papillären Blutgefäße zu beobachten. Wahrscheinlich ist dies aber dadurch bedingt, dass auch sehr kleine Gefäße, welche in der gesunden Haut nur schwer zu sehen sind, durch die Dilatation nun deutlicher im- 31 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 3 Ergebnisse ponieren. Einen histologischen Schnitt, in dem mehrere erweiterte Gefäße zu sehen sind, zeigt Abbildung 20. 3.3.5 Halos Nach 24 Stunden zeigen sich im histologischen Bild viele pyknotische Zellkerne mit ausgedehntem Halo-Phänomen (siehe Abbildung 19). Außerdem sind auch Halos ohne innenliegenden Zellkern zu sehen. Hierbei handelt es sich sehr wahrscheinlich um präparationsbedingte Artefakte. Der pyknotische Zellkern wurde im Rahmen der histologischen Präparation herausgelöst, so dass nur der Halo zurückgeblieben ist. Nach einer Woche zeigt sich dieses Phänomen nicht mehr. 3.3.6 Stratum corneum Zuletzt sollen noch einige Beobachtungen zum Verhalten des Stratum corneum dargestellt werden. Nachdem diese Schicht in den Bildern der gesunden Haut ganz normal erscheint, kann man nach 24 Stunden eine Verbreiterung der Hornschicht feststellen. In den Präparaten nach einer Woche zeigen sich partielle Ablösungen der Hornschicht im Sinne einer Schuppung, bei insgesamt sehr schmal wirkendem Stratum corneum. Weiterhin sieht man auch sehr deutlich eine Parakeratose, es finden sich mehrere Zellkerne im normalerweise kernlosen Stratum corneum. Die genaue Beurteilung des Stratum corneum ist allerdings aufgrund der Schnittführung und der Artefakte bei der Präparation eher schwierig. Die Schuppung und die Parakeratose ist in Abbildung 23 d auf Seite 40 dargestellt. 32 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion 4 Diskussion Das Ziel dieser Studie war es, den Verlauf der Reaktion der Haut auf die UV-Bestrahlung mit Hilfe der RCM zu beobachten, zu beschreiben und einzuordnen. Weiterhin sollten im Vergleich mit histologischen Schnitten der jeweiligen Messzeitpunkte Übereinstimmungen und Differenzen der Methoden beschrieben und interpretiert werden. Im Folgenden werden die Ergebnisse der RCM-Untersuchungen kurz zusammengefasst und dann mit denen der histologischen Untersuchungen verglichen. Danach sollen die Grenzen dieser Studie diskutiert werden und ein Ausblick auf die weiteren Verwendungsmöglichkeiten der gewonnenen Ergebnisse gegeben werden. 4.1 Zeitlicher Verlauf der Veränderungen Wie auch in anderen Arbeiten schon beschrieben wurde [14–16], konnte eine Vasodilatation in der RCM eindeutig nachgewiesen werden. Bereits nach einer Stunde zeigte sich bei fast allen Probanden eine Erweiterung der Hautgefäße, die sich nach 24 Stunden noch ausgeprägter darstellte. Im weiteren Verlauf wurde die Beurteilung durch das sich bereits bildende Ödem stark erschwert und blieb selbst nach einer Woche bei einigen Teilnehmern noch schwierig. Ansonsten zeigte sich nach sieben Tagen ein heterogenes Bild. Zum Teil hatten die Gefäße schon wieder einen normalen Durchmesser angenommen, bei anderen Probanden stellten sich die Gefäße nach wie vor erweitert dar. Ein verstärkter Blutfluss ließ sich vor allem während den Aufnahmen mit dem RCM darstellen, bei denen man das Bild auch in Echtzeit betrachten konnte. Die Ausbildung des Ödems war zeitlich verzögert zur Vasodilatation festzustellen, wie es auch dem Pathomechanismus entspricht. Durch die Erweiterung der Gefäße vergrößern sich die interzellulären Zwischenräume und Blutplasma kann aus den Gefäßen ins Interstitium austreten. Nach einer Stunde konnte man nur ein leichtes Ödem beobachten, welches sich aber mit der Zeit verstärkte und nach 72 Stunden den Höhepunkt erreichte. In der Folgeuntersuchung nach einer Woche zeigte sich das Ödem rückläufig, aber immer noch deutlich ausgeprägt, was darauf hinweist, dass die Rückbildungszeit den Zeitraum einer Woche sicher überschreitet. In Verbindung mit dem Ödem entwickelten sich auch Mikrovesikel, die aber interindividuell sehr unterschiedlich ausgeprägt waren. Oft war dieses Phänomen nur zu einem Untersuchungszeitpunkt zu sehen, woraus hervorgeht, dass sich die Mikrovesikel sehr schnell aus- und auch wieder zurückgebildet haben. Hierzu ist anzufügen, dass makroskopisch und auch auflichtmikroskopisch zu keinem Zeitpunkt eine Bläschenbildung zu beobachten war. Dieses Phänomen ließ sich nur in der RCM zeigen. Bisher nicht beschrieben war das Auftreten von Entzündungszellen als Mediato- 33 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion ren der oben genannten Veränderungen. Durch das Ausschütten proinflammatorischer Mediatoren wird die Entzündungsreaktion mit Vasodilatation und Ödem initiiert und aufrechterhalten. Die Invasion der Epidermis durch diese Zellen begann ebenfalls schon nach einer Stunde und erreichte ihren Höhepunkt nach 24 Stunden. Die Verteilung der Zellen in der Epidermis war diffus, es zeigten sich jedoch immer konzentrierte Anhäufungen dieser Zellen rund um die papillären Blutgefäße. Die Invasion der Entzündungszellen ging von den Gefäßen aus. Von dort migrierten die Entzündungszellen dann in die Epidermis, in der die entzündlichen Reaktionen stattfinden. Nach 72 Stunden zeigten sich die Infiltrate bereits rückläufig, und sind nach einer Woche in den meisten Fällen nicht mehr sichtbar. Bei einem Probanden mit sehr hellem Hauttyp und insgesamt äußerst ausgeprägter Reaktion auf die UVBestrahlung fand sich nach sieben Tagen nach wie vor eine sehr hohe Dichte von Entzündungszellen in den RCM-Bildern. Die Dynamik des Auftretens von sunburn cells (SBC) ist der der Entzündungszellen recht ähnlich. Sie wurde bereits in den Vorstudien als dosisabhängig beschrieben [14], was bestätigt werden konnte. In dieser Studie wurde mit der dreifachen MED gearbeitet, die in den meisten Fällen höher lag, als die in den genannten Publikationen verwendete Dosis. Erste SBC zeigten sich in Folge bereits nach einer Stunde. Die meisten SBC zeigten sich nach 24 Stunden, im weiteren Verlauf war die Zahl wieder abnehmend. Neben den bereits bekannten SBC konnten weitere Zellen beobachten werden, die stark vergrößerte Zellkerne aufwiesen, denen allerdings der dunkle Randsaum der SBC fehlte. Es könnte sich hierbei um nekrotische Keratinozyten handeln, d.h. Zellen, bei denen die Schädigung entweder zu groß war oder zu schnell eingetreten ist, um noch einen geregelten Zelltod auszulösen. Die Beurteilung des Auftretens von aktivierten Melanozyten stellte sich als schwierig heraus. Insgesamt wurden relativ wenige dieser Zellen gefunden. Erst nach einer Woche konnten bei der Hälfte aller Probanden Melanozyten gesehen werden. Es wäre aber durchaus ein vermehrtes Auftreten aktivierter Melanozyten zu erwarten gewesen, da die durch diese Zellen vermittelte Pigmentierung deutlich sichtbar war und Melanin in der RCM ja auch ein starker Kontrastgeber ist. Allerdings fanden sich bei allen Untersuchungen nach der Bestrahlung sehr helle, dendritische Strukturen, die im Zeitverlauf sowohl in der Zahl als auch in der Intensität anstiegen. In anderen Publikationen wurden diese Strukturen als dendritische Melanozyten beschrieben, von denen nur die Dendriten zu sehen sind [18, 29]. Allerdings konnten die dendritischen Strukturen in den Cubes nur selten zu einem Zellkörper zurückverfolgt werden. Eventuell könnte hier eine Echtzeituntersuchung mit dem RCM bessere Ergebnisse liefern als die nachträgliche Auswertung der Cubes (siehe auch Kapitel 4.3). Ebenfalls nachvollziehen ließ sich der Verlust des honeycomb pattern [14], wel- 34 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion ches bei manchen Probanden äußerst eindrucksvoll imponierte. Interessanterweise wurde bei pb9 die Struktur der Haut nach der UV-Bestrahlung, im Vergleich zur unbestrahlten Haut eher regelmäßiger. Bei allen anderen Probanden wurde die Hautstruktur hingegen im Verlauf unregelmäßiger. Beim selben Probanden fanden sich zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden weniger Entzündungszellen in der Epidermis, als in der unbestrahlten Haut. Eine Erklärung dafür wäre, dass bei diesem Teilnehmer eine Neigung zu atopischer Dermatitis bekannt ist. Die in der RCM untersuchte Stelle war aber klinisch unauffällig. Bei einer atopischen Dermatitis liegt eine autoimmunlogisch vermittelte Entzündung der Haut vor. Durch die Immunsupression in Folge der UV-Bestrahlung ließe sich also eine Besserung einer immunologischen Dermatitis erklären. Eine weitere Beobachtung, die gemacht wurde, war die Schuppung des Stratum corneums, die nach einer Woche fast durchgängig auftrat, was so auch zu erwarten war. Bei einem Probanden zeigte sich weiterhin eine ausgeprägte Parakeratose. Diese erklärt sich durch die starke Wachstumsstimulation der Keratinozyten, welche Folge der Zellschädigung und der apoptotischen Prozesse in der Epidermis ist. Duch das von der Basallamina ausgehende, schnelle Wachstum, werden kernhaltige Keratinozyten in das Stratum corneum gedrückt, bevor sie zu Hornzellen differenzieren können. Es ließen sich also alle wesentlichen Prozesse der UV-bedingten Veränderungen der Haut in der RCM darstellen und im Verlauf verfolgen. Im Folgenden sollen diese mit den Ergebnissen der Histologie verglichen werden. 4.2 Vergleich mit der Histologie Eine weitere Fragestellung der Studie war, inwieweit sich die in der RCM beobachtbaren Phänomene auch in der konventionellen Histologie zeigen. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden deshalb die Schnittebenen der histologischen Präparate analog zu den Schnittebenen in der RCM gewählt. In den Abbildungen 21 a+b sieht man eine Gegenüberstellung der beiden Darstellungsmethoden. Auf der linken Seite ist ein Übersichtsbild des RCM gezeigt, auf der rechten Seite sieht man eine Übersichtsvergrößerung des histologischen Schnitts. In beiden Bildern wurde ein Schnitt auf Höhe der Junktionszone angestrebt, was natürlich in der RCM besser gelingt als in der konventionellen Histologie. Da sich die Ränder der Stanze nach dem Biopsieren zusammenziehen, kommt es zu einer Wölbung des Präparats. Daher sind im histologischen Schnittbild außen das Stratum corneum und in der Mitte schon die Dermis zu sehen. Der interessante Bereich liegt dazwischen, wo vor Beginn des Stratum spinosums die Papillen der Dermis sichtbar werden. Wie auf den Bildern zu sehen, konnte in den Schnittbildern eine gute Vergleichbarkeit der beiden Methoden 35 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion erreicht werden. Im Folgenden soll auf die einzelnen Phänomene im Rahmen der Reaktion auf die UV-Bestrahlung eingegangen werden und die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der beiden Verfahren diskutiert werden. Abb. 21a Abb. 21b Abb. 21c Abb. 21d a: Junktionszone der unbestrahlten Haut in der RCM b: Dieselbe Schicht im histologischen Schnitt c+d: Vasodilatation in der RCM (links) und in der Histologie (rechts), die Pfeile markieren jeweils dilatierte Blutgefäße Abb. 21: Die Aufnahmen der RCM (links) und der Histologie (rechts) im Vergleich Das Ödem und die Vasodilatation waren in der Histologie ebenso gut nachzuweisen wie im RCM. Nach 24 Stunden zeigte sich auch in der Histologie eine deutliche Erweiterung der Gefäße. Zum Teil erschienen sie auch vermehrt, was sich mit den Beobachtungen in der RCM deckt. Während der weitere Verlauf der Vasodilatation aufgrund des ausgeprägten Ödems in der RCM schwer zu verfolgen war, ließ sich in der Histologie bestätigen, dass auch nach einer Woche noch eine starke 36 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion Erweiterung der Gefäße vorlag (siehe Abbildungen 21 c+d). Der in der Echtzeituntersuchung mit der RCM darstellbare verstärkte Blutfluss, der mit der Vasodilatation einhergeht, war in den histologischen Präparaten natürlich nicht darstellbar. Während sich in der RCM das Ödem durch eine wolkige Verschleierung bemerkbar machte, welche die Beurteilbarkeit der Bilder vor allem in den tieferen Schichten stark einschränkte, zeigte es sich in der konventionellen Histologie durch eine spongiöse Auflockerung des Gewebes. Diese Auflockerung ist durch die vergrößerten Zellzwischenräume im Rahmen des Ödems bedingt. Ob diese Spongiose für den in der RCM beobachtbaren Verlust des honeycomb patterns verantwortlich war, lässt sich nicht klar beantworten. Zumindest scheint die Spongiose in der Histologie der Strukturstörung des honeycomb pattern vorauszugehen, da diese schon nach 24 Stunden auftritt, der Strukturverlust in den RCM-Bildern in der Regel aber erst nach 72 Stunden zu sehen war. In der RCM konnte nach 24 Stunden die Bildung von Mikrovesikeln beobachtet werden. Auch in der Histologie zeigten sich zu einem ähnlichen Zeitpunkt Strukturen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit das histologische Korrelat zu den Mikrovesikeln darstellen. Beide Strukturen sind in den Abbildungen 22 a+b gegenübergestellt. In der Histologie handelt es sich um ein sogenanntes Halo-Phänomen, das beim Untergang von Keratinozyten auftritt. In manchen dieser Halos ließen sich noch Zellkerne oder Zelldedritus darstellen, in anderen waren die Kernreste durch die Präparation herausgewaschen. Die Mikrovesikel in der RCM hingegen imponierten flüssigkeitsgefüllt. Der gemeinsame Zeitpunkt des Auftretens und die morphologische Ähnlichkeit legen nahe, dass es sich um dasselbe Phänomen handelt, die Mikrovesikel in der RCM also in Folge der Apoptose oder Nekrose von Keratinozyten auftreten. Nach einer Woche waren diese Strukturen dann in der Histologie nicht mehr zu sehen. Das könnte einerseits daran liegen, dass sie in der Stanzbiopsie nicht getroffen sind. Andererseits zeigte der Proband, bei dem die betreffende Stanze angefertigt wurde, auch insgesamt eine sehr milde Sonnebrandreaktion mit nur wenigen Mikrovesikeln in der RCM. Bezüglich der Entzündungszellinvasion ist zu sagen, dass sich diese in der RCM besser darstellen lässt als in der Histologie. Zwar ließen sich mit beiden Verfahren schon kurze Zeit nach der Bestrahlung mit künstlichem Sonnenlicht Entzündungszellen nachweisen, allerdings war die Verteilung relativ unterschiedlich. In der RCM waren die Entzündungszellen perivaskulär sehr dicht konzentriert, verteilten sich aber auch diffus über die Epidermis. In den histologischen Schnitten hingegen blieb das Entzündungsinfiltrat vorwiegend auf den perivaskulären Bereich in den dermalen Papillen beschränkt. Zwar zeigten sich auch hier einzelne Entzündungszellen in der Epidermis, diese waren aber zahlenmäßig im Vergleich mit den RCM-Bildern er- 37 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion Abb. 22a Abb. 22b Abb. 22c Abb. 22d a: Wolkiges Ödem (Stern) und Mikrovesikel (weiße Pfeile) in der RCM b: Spongiose als Zeichen des Ödems, Halos (schwarze Pfeile) und perivaskuläres Infiltrat (Stern) in der Histologie c: Perivaskuläre Entzündungsinfiltrate (Stern) und Entzündungszellen in der Epidermis (Pfeile) in der RCM d: Perivaskuläres Infiltrat (Stern) und migrierende Entzündungszellen am Papillenrand (Pfeil) Abb. 22: Die Aufnahmen der RCM (links) und der Histologie (rechts) im Vergleich 38 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion heblich weniger. Die Verteilung der Entzündungszellen in beiden Methoden ist in den Abbildungen 22 c+d im Vergleich dargestellt. Begründet werden könnte dieser Unterschied dadurch, dass sich die Entzündungszellen in der RCM sehr gut darstellen lassen, da sie das emittierte Licht stark reflektieren und daher regelrecht leuchten. Die gute Sichtbarkeit könnte ein Grund dafür sein, dass die Entzündungszellen in der RCM so zahlreich imponieren. Interessanterweise zeigte sich aber in den histologischen Bildern eine deutliche Persistenz der perivaskulären Infiltrate, auch eine Woche nach der UV-Bestrahlung, die so in der RCM nicht aufschien. Wahrscheinlich sah man in der Histologie die Endphase der entzündlichen Reaktion mit vereinzelt noch migrierenden Entzündungszellen, welche in der RCM vom noch immer deutlich ausgeprägten Ödem überlagert wurden. Die sunburn cells waren mit beiden Methoden gut darstellbar, und glichen sich auch im zeitlichen Verlauf ihres Auftretens (Abbildung 23 a+b). Ebenso zeigten sich in beiden Verfahren Zellen, die eher den Verdacht auf nekrotische Vorgänge nahelegen. Die vereinzelten nekrotischen Zellen in der Stanze der gesunden Haut können dadurch erklärt werden, dass die Biopsie direkt an der Grenze zur bestrahlten Haut entnommen wurde. Es ist somit sehr wahrscheinlich, dass sich auch in den angrenzenden Gebieten die Wirkung der UV-Strahlen bemerkbar gemacht hat und zu einer Zellschädigung geführt hat. Die in der Histologie fragliche Parakeratose konnte man in den RCM-Bildern sehr schön nachweisen. Auch die nach einer Woche im histologischen Präparat sichtbare Schuppung bestätigte sich in den RCM-Bildern. Abbildung 23 zeigt eine Gegenüberstellung dieser Phänomene in der RCM und in der Histologie. Um in der Histologie Melanozyten sicher nachzuweisen ist eine Spezialfärbung nötig, auf die aufgrund der wenigen verwertbaren Schnitte verzichtet werden musste. Der Nachweis einer Veränderung dieser Zellen in der Histologie ist bereits geführt worden [11], weshalb davon ausgegangen werden kann, dass sich die Melanozyten auch im histologischen Bild zeigen. Insgesamt kann also gesagt werden, dass die RCM eine sehr gute Methode zur Beobachtung der Veränderungen der Haut durch UV-Bestrahlung ist. Alle wesentlichen, in der Histologie beschriebenen, Phänomene konnten erfasst werden. Darüber hinaus war eine differenziertere Beobachtung der Entzündungszellen sowie des kapillären Blutflusses möglich. Die aktivierten bzw. veränderten Melanozyten lassen sich mittels Spezialfärbungen in der Histologie besser darstellen. Der größte Vorteil der RCM liegt allerdings darin begründet, dass bei ein und demselben Probanden die gleiche Stelle mehrfach untersucht werden kann, und somit der individuelle Verlauf einer einzelnen Testperson nachvollzogen werden kann. Dies war mit der konventionellen Stanzbiopsie natürlich nicht möglich, was auch 39 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion Abb. 23a Abb. 23b Abb. 23c Abb. 23d a: sunburn cells in der RCM (weiße Pfeile) b: sunburn cells in der Histologie (schwarze Pfeile) c: Parakeratose in der RCM, die weißen Pfeile zeigen auf die kernhaltigen Keratinozyten d: Parakeratose und Schuppung (schwarzer Stern) des Straum corneum im histologischen Bild; Zellkerne im Stratum corneum (schwarze Pfeile) Abb. 23: Die Aufnahmen der RCM (links) und der Histologie (rechts) im Vergleich 40 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion den Nachteil birgt, dass die histologischen Bilder zu den verschiedenen Zeitpunkten dieser Studie von verschiedenen Probanden stammen. Da allerdings jeder Mensch unterschiedlich auf die UV-Exposition reagiert, ist die Vergleichbarkeit der histologischen Schnitte erschwert. Die Wiederholbarkeit der Untersuchung, in Verbindung mit der nicht-invasiven Untersuchungstechnik der RCM, zeigt ganz klar die Vorteile der konfokalen Reflektionsmikroskopie gegenüber der konventionellen Histologie bei der Darstellung UVbedingter Veränderungen der Haut. 4.3 Grenzen dieser Studie und Konsequenzen für weiterführende Arbeiten Im Laufe der Untersuchung fiel auf, dass die Probanden trotz der Normierung der Bestrahlungsdosis auf die dreifache MED makroskopisch sehr unterschiedliche Lokalreaktionen zeigen. Das Erythem der Haut, als Reaktion auf die UV-Exposition, deckte eine Bandbreite von diskret bis sehr ausgeprägt ab. Mit entsprechend individueller Ausprägung fielen in Folge auch die mikroskopischen Veränderungen aus. Während bei manchen Probanden die Entzündungsreaktion relativ leicht ausfiel, zeigten andere Teilnehmer massive Entzündungsinfiltrate und Massennekrosen von Keratinozyten. Ebenso verhielt es sich mit der Strukturschädigung der Haut, die bis zum kompletten Verlust des honeycomb patterns reichen konnte. Es ist bekannt, dass die individuelle Reaktion der Haut auf Sonneneinstrahlung sehr unterschiedlich sein kann. Es könnte deshalb in zukünftigen Arbeiten sinnvoll sein, die Lichttreppe zur Bestimmung der MED in feinere Abstufungen zu gliedern, um einen genaueren Wert für die mittlere Erythemdosis, und somit für die individuelle UV-Verträglichkeit zu bekommen. Eine Verfeinerung der Abstufung von sechs auf zwölf Stufen wäre durchaus praktikabel und nicht mit wesentlichem Mehraufwand verbunden. Zur genaueren Beobachtung der Melanozyten ist zu überlegen, ob diese nicht in folgenden Studien direkt in Echtzeit am RCM erfolgen sollte. Somit würde sich die Möglichkeit ergeben, dendritische Strukturen in feinen Abstufungen in die Tiefe zu verfolgen, um die Zellkörper der Melanozyten darzustellen. Nachdem sich diese Zellen außerdem generell eher spät zeigen, könnte über eine weitere Untersuchung, zehn Tage oder zwei Wochen nach der Bestrahlung, nachgedacht werden. Zu berücksichtigen ist allerdings, dass dies für die Probanden mit einem weiteren Termin verbunden ist, was eventuell die Teilnahmebereitschaft senken könnte. Seit kurzer Zeit gibt es auch die Möglichkeit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, bei der vor der Untersuchung eine intradermale Injektion von Indocyanin-Grün erfolgt. Dieses wirkt als floureszierendes Kontrastmittel und erlaubt so eine kontrastiertere Darstellung der verschiedenen Strukturen und Zellen in der RCM [30]. 41 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion Somit lassen sich vielleicht auch dendritische Melanozyten besser darstellen und beobachten. Optimiert werden könnten vor allem auch die histologischen Vergleichsbilder. Es sollte bei weiteren Studien noch genauer darauf geachtet werden, dass die relevanten Schichten in den Schnitten auch getroffen werden. Eventuell könnte man noch etwas größere Stanzen anfertigen, um beim Schneiden genauer arbeiten zu können. Hilfreich wären sicher auch Spezialfärbungen zur Darstellung der Melanozyten. 4.4 Ausblick und weitere Verwendungsmöglichkeiten Wie gezeigt wurde, können mit der konfokalen Reflektionsmikroskopie UV-bedingte Veränderungen der Haut sehr gut erfasst und auch im Verlauf genau beobachtet werden. Gerade die Echtzeitaufnahmen liefern detaillierte Information über den vermehrten Blutfluss in den betreffenden Arealen. Mögliche, zukünftige Anwendungsgebiete könnten also alle Bereiche umfassen, in denen eine durch ultraviolette Strahlung bedingte Schädigung oder Veränderung der Haut erfasst, oder im Verlauf beobachtet werden soll. Dies trifft zum Beispiel auf das Gebiet der Prophylaxe UVbedingter Schädigungen der Haut zu. Im Rahmen von Sonnencreme-Testungen oder auch Studien zu neuen Verfahren der UV-Prophylaxe, in denen auch makroskopisch nicht sichtbare Phänomene untersucht werden sollen, könnte in Zukunft die RCM gute Dienste leisten. Sie würde es ermöglichen, die Veränderungen auf zellulärer Ebene im Verlauf zu beurteilen und auf Unterschiede zwischen geschützter und ungeschützter Haut zu untersuchen. Eine erste Untersuchung zu diesem Thema hat bereits stattgefunden [14]. In der Studie von Ulrich et al. wurde angeregt, eine Einteilung der Schwere eines Sonnenbrands auf der Basis reflektionsmikroskopischer Merkmale einzuführen [14]. Als Marker wurden das Auftreten von Mikrovesikeln und von sunburn cells vorgeschlagen. Da sich aber auch das Auftreten von Entzündungszellen und die Veränderungen des honeycomb pattern gut in der RCM darstellen lassen, sollten diese beiden Merkmale in eine entsprechende Klassifikation miteinfließen. Als Grundlage zur Abschätzung der Schwere könnten somit folgende Marker dienen: • Anzahl der Entzündungszellen • Auftreten von Mikrovesikeln, Ausprägung des Ödems • Anzahl der sunburn cells • Veränderung oder Verlust des honeycomb pattern 42 Diplomarbeit Maximilian Rothmund 4 Diskussion Diese könnten auch dazu herangezogen werden, prophylaktische und therapeutische Maßnahmen zu bewerten. In der mit Sonnencreme behandelten Haut, traten im Gegensatz zur ungeschützten Haut z. B. keine Mikrovesikel auf [14]. Neue Methoden der UV-Prophylaxe könnten so relativ genau mit dem bewährten Konzept des topischen Schutzes durch Sonnencremes verglichen werden. Es muss in diesem Zusammenhang auch immer wieder betont werden, wie wertvoll die Möglichkeit der Verlaufskontrolle ist, welche durch die nicht-invasive Untersuchungstechnik erst möglich wird. Nachdem bei einem der Probanden, der Atopiker ist, ein Rückgang der entzündlichen Reaktion der Haut beobachtet werden konnte, wäre auch auf diesem Gebiet eine Anwendung der RCM zur Objektivierung von Therapieerfolgen durch Pharmaka oder Lichttherapie denkbar. Die Beurteilung der Aktivierung von Melanozyten konnte leider in dieser Studie nicht gezeigt werden. Es sollte noch einmal eine Untersuchung mit Fokussierung auf diese Zellen angestrebt werden, um genauere Beobachtungen zu ermöglichen. Hierbei sollte auch an die erweiterten Möglichkeiten der neu eingeführten konfokalen Fluoreszenzmikroskopie gedacht werden. In Zukunft könnten diese Daten dazu dienen, aktivierte dendritische Melanozyten von malignen dendritischen Melanozyten, wie sie in malignen Melanomen vorkommen, zu unterscheiden. Den Patienten könnten so belastende und schmerzhafte Operationen erspart werden. Im Verlauf könnte die Läsion kontrolliert werden und hinsichtlich einer Veränderung der dendritischen Zellen reevaluiert werden. Als Resümee lässt sich konstatieren, dass die RCM eine sehr gute und sensitive Methode zur Erfassung UV-bedingter Veränderungen der Haut ist. Die großen Vorteile der Untersuchungsmethode liegen weiterhin in ihrem nicht-invasiven Charakter, der auch mehrfache Untersuchungen derselben Stelle und somit eine Verlaufsbeobachtung möglich macht. 43 Diplomarbeit Maximilian Rothmund Literatur Literatur [1] Svobodova A, Walterova D, Vostalova J. Ultraviolet light induced alteration to the skin. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2006 Jul;150:25–38. [2] Leiter U, Garbe C. Epidemiology of melanoma and nonmelanoma skin cancer– the role of sunlight. Adv Exp Med Biol. 2008;624:89–103. [3] Armstrong BK, Kricker A, English DR. Sun exposure and skin cancer. Australas J Dermatol. 1997 Jun;38 Suppl 1:1–6. [4] Armstrong BK, Kricker A. 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