Aus dem Institut für Klinische und Molekulare Virologie

Aus dem Institut für Klinische und Molekulare Virologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. B. Fleckenstein
Funktionelle Analyse des HIV-1 Rev-Proteins
mit heterlogen Exportsignalen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Jens Lohmaier
aus Erlangen
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. R. Stauber
Koreferent:
Prof. Dr. B. Fleckenstein
Tag der mündlichen Prüfung:
17. Januar 2011
Widmung
Diese Arbeit möchte ich zum Dank meiner
Ehefrau Madeleine Lohmaier widmen
Inhaltsverzeichnis
1.1 Zusammenfassung
Seite
1
1.1.1 Hintergrund und Ziele
1
1.1.2 Methoden
2
1.1.3 Ergebnisse
3
1.1.4 Praktische Schlußfolgerung
4
1.2 Abstract
5
1.2.1 Backround and goals
5
1.2.2 Methods and results
6
1.2.3 Conclusions
6
2 Einleitung
7
2.1 Nukleozytoplasmatischer Transport
7
2.2 Human-Immundefizienz-Virus (HIV)
8
2.3 Das HIV-1 Rev Protein
9
2.4 Einteilung der NES anhand ihrer Kinetik
11
3 Aufgabenstellung und Zielsetzung
14
4 Material
16
4.1 Eukaryonte Zelllinien
16
4.2 Bakterien zur Plasmidvermehrung
17
4.3 Oligonukleotide
17
4.4 Plasmide
18
4.5 Antikörper
20
4.6 Enzymatische Reaktionen
20
4.7 Längenstandard
21
4.8 Reagenziensysteme
21
4.9 Reagenzien und Laborhilfsmittel
21
4.10 Puffer und Lösungen
22
5 Methoden
24
5.1 DNA Methoden
24
5.2 Zellkultur
26
5.3 CAT-Assay
27
5.4 Virusstocks
28
5.5 ß-Galaktosidase-Test
29
5.6 Proteinmethoden
29
6 Ergebnisse
31
6.1 Klonierung von pF143 Rev-KE1b 1-163 und pF143 Rev-PKI
31
6.2 Rev, Rev-E1b 1-163, und Rev-PKI unter dem Fluoreszenzmikroskop
32
6.3 Funktionelle Messung der Rev-NES-GFP Fusionsproteine im CAT-Assay
36
6.4 Konstruktion von pNL4-3 R- Rev-E1b, pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI
38
6.5 Transfektion der rekombinanten HIV-Vollgenom-Plasmide in 293T-Zellen
41
6.6 Infektionsversuch von Jurkats mit NL4-3 R- Rev und NL4-3 Rev-PKI
43
6.7 Elektroporation von Jurkats mit den rekombinanten HIV
44
6.8 Klonierung von pNL4-3 Rev-PKI und pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI
45
6.9 Infektionsversuch mit pNL4-3 Rev-PKI und pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI
48
6.10 ß-Gal Test mit pNL4-3 GFP, pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI, pNL4-3 Rev-PKI
und pNL4-3 R- Rev-PKI
48
7 Diskussion
50
8 Literaturverzeichnis
55
9 Abkürzungsverzeichnis
60
10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
63
11 Danksagung
64
12 Lebenslauf
65
1
1.1 Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele
In eukaryotischen Zellen sind Kern und Zytoplasma durch die Kernmembran
voneinander getrennt. Diese Abgrenzung ermöglichte es eukaryotischen Organismen,
ihre Genexpression wechselnden äußeren Bedingungen anzupassen. Um diese
Möglichkeiten auszuschöpfen, benötigt die Zelle jedoch eine hocheffiziente und
selektive Transportmaschinerie, welche einen effizienten Molekülaustausch über Poren
in
der
Kernmembran
vermittelt.
Diese
Kernporen
sind
hochmolekulare
Proteinkomplexe, welche den spezifischen Transport von Proteinen und Nukleinsäuren
zwischen Zellkern und Zytoplasma gewährleisten. Der Kerntransport von Proteinen
sowie von Protein/RNA-Komplexen wird dabei durch Kern-Import- („nuclear
localization signals“ = NLS) und Kern-Exportsignale („nuclear export signals“ = NES)
gesteuert, welche mit bestimmten Transportrezeptoren, den so genannten Importinen
und Exportinen wechselwirken.
Die zelluläre Transportmaschinerie wird auch von verschiedenen Arten von Viren
genutzt, um effizient replizieren zu können. So besitzt das RNA-Transportprotein Rev
des Humanen Immunodefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) sowohl ein Import- als auch ein
Exportsignal, womit es aktiv zwischen Zellkern und Zytoplasma hin- und herwandern
(„shutteln“) kann. Über seine RNA-Bindungsdomäne kann das Rev Protein un- bzw.
einfach gespleißte HIV-1 mRNA binden und vom Zellkern in das Zytoplasma
transportieren. Nur so kann eine effiziente Herstellung viraler Proteine und damit auch
die Virusreplikation sichergestellt werden.
Die intrinsisch in der Aminosäuresequenz der jeweiligen Proteine kodierten, meist
Leucin-reichen NESe scheinen zudem in der Lage zu sein, unterschiedliche
charakteristische
Transportkinetiken
zu
vermitteln.
Anhand
von
Mikroinjektionsexperimenten mit GFP ("Green Fluorescent Protein")-markierten NESFusionsproteinen konnten NESe dementsprechend kinetisch klassifiziert werden. Das
NES des Proteinkinase-Inhibitor Proteins (PKI) vermittelt beispielsweise einen sehr
schnellen Kernexport, das HIV-1 Rev NES zeigt hingegen eine mittlere ExportGeschwindigkeit und das NES des Adenovirus Typ 5 E1b-55k Proteins vermittelt einen
langsamen Export aus dem Zellkern.
2
Bisher ist jedoch noch nicht verstanden, ob die durch die NESe vermittelten
spezifischen Exportkinetiken die (patho)biologische Aktivität des jeweiligen Proteins zu
beeinflussen vermögen, und ob letztere durch rationale Auswahl geeigneter NESe
moduliert werden kann.
Diese Fragen sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit für das HIV1 Rev-Protein
molekularvirologisch untersucht werden.
1.1.2 Methoden
Zur Visualisierung und Charakterisierung des Transportverhaltens von HIV-1 Rev
Proteinen, welche heterologe NESe enthalten, wurden Vektoren zur Expression von
Rev-(NES)-GFP Fusionproteinen in Säugerzellen mittels rekombinanter DNATechniken erstellt. Diese HIV-1 Rev-GFP Fusionproteine enthielten dabei neben dem
HIV-1 wildtyp-Rev-NES mit einer intermediären Exportaktivität entweder das einen
schnellen Export vermittelnde PKI-NES oder das langsame E1b-NES. Die Kopplung
der HIV-1 Rev-Proteine mit dem autofluoreszierenden GFP erlaubt hierbei, die
intrazelluläre Verteilung und den Transport der Fusionsproteine in lebenden
Säugerzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen.
Die Kompetenz der jeweiligen Rev-Proteine zum Transport viraler RNAs wurde in
einem
CAT
(Chloracetyltransferase)-Repotersystem
gemessen.
Die
die
Rev-
Bindungsstelle-enthaltene CAT-mRNA wird hierbei Rev-abhängig in das Zytoplasma
transportiert und dort in Protein translatiert, so dass die gemessene CAT-Enzymaktivität
ein Maß für den RNA-Transport darstellt.
Um letztendlich den Einfluss der heterologen NESe auf die virale Replikation zu
bestimmen, sollten die Rev-(NES)-Proteine in ein das HIV-1-Vollgenom enthaltendes
cDNA-Expressionskonstrukt integriert werden. Dazu wurde das in der proviralen cDNA
enthaltene Rev Protein durch Mutagenese des NES inaktiviert, und die Rev-(NES)
Varianten in das Rev-defiziente Genom an Stelle des akzessorischen nef-Leserahmens
eingebracht. Nach Transfektion bzw. Elektroporation der proviralen Plasmide in
Säugerzellen erlaubt die Quantifizierung der viralen Partikel somit Rückschlüsse von
der NES-vermittelten Exportkinetik auf die biologische Aktivität der Rev-(NES)Proteine im Kontext pathogener HI-Viren. Die Replikationseffizienz dieser HIVirusmutanten wurde abschliessend durch Infektionsversuche bestimmt.
3
1.1.3 Ergebnisse
Im Rahmen der Arbeit konnten mittels rekombinanter DNA-Techniken erfolgreich
Vektoren zur Expression von Rev-(NES)-GFP Fusionproteinen in Säugerzellen
hergestellt werden. In transienten Expressionstudien konnte die intrazelluläre Verteilung
und
der
Transport
der
Fusionsproteine
in
lebenden
Säugerzellen
mittels
Fluoreszenzmikroskopie verfolgt werden. Es zeigte sich, dass HIV-1 Rev-GFP
Fusionproteine, welche ein NES mit mittlerer (HIV-1 Rev) und langsamer
Exportaktivität (E1b-NES) besitzen, im Nukleus/Nukleolus akkumulieren. Ursächlich
für diese Akkumulation scheint die 5S-ribosomale RNA zu sein, welche mit der Rev
RNA-Bindungsdomäne interagiert und somit die Fusionsproteine im Kern zurückhält.
Löst man diese Strukturen durch Behandlung mit Actinomycin D auf, so kommt es zu
einer Umlagerung der Fusionsproteine in das Zytoplasma. Interessanterweise weißt das
Rev-PKI_NES-GFP Protein, welches ein schnelles NES beinhaltet, a priori eine
zytoplasmatische Lokalisation auf, d.h., der nukleäre Export ist schneller als der
Kernimport. Ursächlich dafür könnte eine höhere Affinität des PKI-NES zum
Exportrezeptor Exportin1/CRM1 sein. Blockiert man hingegen den Kernexport dieses
Fusionsproteins durch Behandlung mit dem Export-Inhibitor Leptomycin B, so
akkumliert Rev-PKI_NES-GFP wiederum im Nukleus/Nukleolus.
Des Weiteren spiegelt sich die kinetische Aktivierung auch in einer verstärkten
biologischen
Aktivität
des
Rev-PKI_NES-GFP
Fusionsproteins
wider.
Transaktivierungsanalysen im CAT-Reportersystem zeigten, dass Rev-(NES)-GFP
Fusionproteine mit einem schnellen NES in der Lage sind, einen schnelleren und
effizienteren Rev-abhängigen Kernexport viraler mRNAs zu vermitteln, was sich
ebenfalls in der signifikant erhöhten Expression viraler Proteine niederschlug. Das
langsame Rev-E1b_NES-GFP Protein war hingegen nicht zur Vermittlung eines Revabhängigen mRNA-Transports in der Lage, was sich wiederum zu einer stark
erniedrigten viralen Proteinproduktion führte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch im
Kontext des proviralen HIV-1 Vollgenoms mittels transienter Expressionsanalysen
erhalten.
Das Replikationsverhalten der unterschiedlichen HIV-1 Virusmutanten konnte im
Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht studiert werden, da selbst das provirale
4
Expressionskonstrukt, welches das Wildtyp Rev-Protein an Stelle des nef-Leserahmens
enthält,
keine
replikationskompetenten
viralen
Partikel
erzeugte.
Dies
ist
möglicherweise auf eine Störung des env-Leserahmens zurückzuführen, welche durch
die Mutagenese des endogenen rev-Leserahmens bei der Generierung Rev-defizienter,
proviraler Expressionsvektoren erzeugt wurde.
1.1.4 Praktische Schlußfolgerung
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass die Exportkinetiken von
NESen in der Lage sind, die biologische Aktivität von Proteinen zu beeinflussen, wobei
eine evolutionäre Feinanpassung von Exportgeschwindigkeit und biologischer Funktion
erfolgt zu sein scheint. Der gezielte Einsatz spezifischer NESe als „kinetische
Werkzeuge“ könnte in gentherapeutischen Anwendung zur Erzeugung eines bestimmten
Phänotyps eingesetzt werden. Ebenso scheint es möglich, komplexe Retro- und
eventuell
auch
DNA-Viren
durch
die
kinetische
Modifikation
essentieller
Transportproteine zu attenuieren und diese so für Impfstrategien verwenden zu können.
5
1.2 Abstract
1.2.1 Backround and goals
In eukaryotic cells, the nucleus and cytoplasm are separated by the nuclear membrane.
Cellular communication strictly depends on regulated nucleocytoplasmic transport
through the nuclear pore complex (NPC), which is controlled by specific signals and
transport factors. Active nuclear import is mediated by short stretches of basic amino
acids, termed nuclear localization signals (NLS), interacting with import receptors, the
so-called importins. The best characterized nuclear export signals (NESs) consist of a
short leucine-rich stretch of amino acids and interact with the export receptor
Exportin1/CRM1.
Importantly, a variety of viruses also depend on the cellular transport machinery in
order to optimize viral replication. This is exemplified during the life cycle of complex
retroviruses, such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The HIV-1
Rev protein harbors a NLS as well as a CRM1-dependent NES, allowing the protein to
shuttle between the nucleus and the cytoplasm. By means of its RNA-binding domain,
Rev exports unspliced and singly spliced viral mRNAs into the cytoplasm, thereby
allowing the efficient production of viral proteins required for efficient viral replication
and pathogenesis.
Various experimental studies, including microinjection of GFP ("Green Fluorescent
Protein")-tagged NES fusion proteins, showed that the export activity of NESs differ
dramatically. Whereas the NES of the protein kinase inhibitor protein (PKI) mediates a
fast export, the HIV-1 Rev NES displays medium activity and the NES of the
adenovirus type 5 E1b-55k protein promotes only slow transport.
However, it is not yet understood whether the NES-mediated specific export kinetics are
capable to regulate the (patho)biological functions of their respective proteins. Also,
whether NESs can be employed as kinetic tools to rationally modulate the biological
activities of proteins remains to be demonstrated. Hence, these questions should be
addressed by this study.
6
1.2.2 Methods and results
Employing ectopic expression of Rev-(NES)-GFP fusion proteins, harboring
heterologous NESs, their localization and trafficking was studied in living eukaryotic
cells by fluorescence microscopy. These studies showed that Rev-(NES)-GFP fusions
containing the “medium” Rev NES or the “slow” E1b-NES accumulated in the
nucleus/nucleolus. Accumulation appears to be mediated by interaction with 5S rRNA,
as treatment with Actinomycin D dissolved the nucleoli resulting in a cytoplasmic
steady localization of these Rev-(NES)-GFP fusions. Notably, a Rev-(NES)-GFP
fusions containing the “fast” PKI_NES accumulated in the cytoplasm, indicating that
nuclear export is more efficient than import, which may be caused by enhanced affinity
of the PKI_NES to CRM1.
The observed kinetic transport difference was also translated into the biological
activity of the respective Rev-(NES)-GFP fusions. CAT-reporter transactivation assays
demonstrated that the Rev-PKI_NES-GFP displayed a higher Rev-dependent mRNAtransport activity compared to the Rev-Rev_NES-GFP protein, whereas the RevE1b_NES-GFP protein was inactive. Similar results were obtained when the Rev(NES)-GFP proteins were tested in the context of the HIV-1 genome employing
transfection assays. For this purpose, the Rev-(NES)-GFP coding regions were
integrated into the nef region of the proviral cDNA expression cassette, in which the
NES of the endogenous rev was inactivated by mutagenesis. However, infection
experiments indicated that the generated viral particles were non-infectious, which may
be caused by affecting the overlapping env-reading frame during rev NES inactivation
in the proviral cDNA.
1.2.3 Conclusions
The results of this study support the hypothesis that kinetic engineering by using
NESs with different export activities appears to be applicable to modulate the kinetics
as well as the biological activity of regulatory transport proteins. The rational
application of NESs as kinetics tools may thus be used in gene therapeutic strategies to
rationally modify biological effects executed by regulatory proteins. In the context of
complex DNA or RNA viruses, kinetic engineering of viral transport proteins critically
involved in viral replication and/or pathogenesis may be envisaged to attenuate viruses
for novel biomedical applications, such as vaccination strategies.
7
2 Einleitung
2.1 Nukleozytoplasmatischer Transport
Eine Besonderheit von eukaryontischen Zellen ist deren Unterteilung in spezifische
Teilbereiche. Kern und Zytoplasma sind durch die Kernmembran voneinander getrennt.
Die Kommunikation zwischen den Teilbereichen wird durch die Kernporenkomplexe
vermittelt (Görlich et al., 1998; Weis et al., 1998). Die Kernporen sind hochkomplexe
Proteinstrukuren, welche die Diffusion von Proteinen < 60 kD erlauben. Kernimport
und Export größerer Makromoleküle und verschiedener mRNA- Spezies erfordert die
Bildung aktiver Transportkomplexe, welche die Interaktion mit den Nukleoporinen
einschließt.
Abb. 1 Nukleozytoplasmatischer Transport
Der Kerneintritt wird durch Kernlokalisationssignale (NLS) vermittelt. Klassische NLS
sind durch eine Anhäufung basischer Aminosäuren gekennzeichnet (Conti et al., 1998)
und interagieren mit den Importrezeptoren Importin /.
Der Kernexport hingegen wird durch Exportsignale (NES) vermittelt (Görlich et
al.,1998; Hope et al., 1997, Nakielny et al. 1997). Die leucinreichen NES binden
spezifisch an den Exportrezeptor CRM-1 sowie an Exportfaktoren wie eIf-5A und Ran-
8
GTP. (Ullman et al., 1997, Bevec & Hauber, 1997; Bevec et al., 1996; Görlich et al.,
1998). Nach Kernexport in das Cytoplasma kommt es zur Hydrolyse des Ran-GTP zu
RanGDP, vermittelt durch das Ran-GTPase aktivierende Protein. Der Ran-GTP / RanGDP Gradient zwischen Zellkern und Cytoplasma vermittelt die Direktionalität und
Stabilität des Transportkomplexes (Nachury et al., 1999).
2.2 Human-Immundefizienz-Virus (HIV)
HIV-1 und HIV-2 sind Erreger des erworbenen Immundefektsyndroms (acquiredimmune-deficiency-syndrome AIDS). Infolge dieser als globaler Pandemie auftretenden
Immunschwäche treten opportunistische Infektionen auf. Die Erkrankung verläuft
tödlich. Die Übertragung erfolgt durch Blut und Blutprodukte, ungeschützten sexuellen
Kontakt sowie von der Mutter auf das Kind in der Schwangerschaft oder beim Stillen.
Zu Beginn der 80er Jahre kam es vorwiegend bei Homosexuellen zum Auftreten dieser
bis dahin unbekannten Erkrankung (Gottlieb et al., 1981; Masur et al., 1981). Bereits
1983 gelang Luc Montagnier und seiner Arbeitsgruppe am Institut Pasteur in Paris die
Isolierung eines Retro-Virus aus den Lymphozyten eines jungen Homosexuellen mit
den Krankheitszeichen eines Lymphadenopathie-Syndroms (III. AIDS-Stadium)(BarréSinoussi et al.,1983). 1986 wurde das neu entdeckte Virus als Humanes
Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) bezeichnet (Coffin et al., 1986).
Weltweit sind nach Schätzungen der WHO etwa 40 Millionen Menschen von
HIV/AIDS direkt betroffen und im Jahr 2000 kam es zu 5,3 Mio. Neuinfektionen mit
Hauptzuwachs in Südostasien und Osteuropa. In Deutschland leben ca. 40 000 HIVInfizierte.
Das Genom
Das doppelstrangige 9,5 kB große Plusstrang-RNA-Genom wird von langen terminalen
Sequenzwiederholungen (LTRs) flankiert. Sie enthalten Promotoren und EnhancerElemente. Zudem erfolgt als essentieller Schritt der HIV Infektion die Integration in das
Wirtsgenom über die LTRs. Das Pol-Gen enthält die Information für die viralen
Enzyme Protease, Integrase und Reverse Transkriptase. Das Gag-Gen kodiert für die
Kapsid-Proteine p24, 18, p9 und p7, das Env-Gen für die Hüllproteine gp41 und gp120.
Für die Virusreplikation essentiell sind Gene der Regulatorproteine Rev und Tat,
welche den Kernexport von un- bzw. einfachgepleißten mRNA vermitteln. Das HIV-1-
9
Genom beinhaltet zudem noch sogenannte akzessorische Gene wie nef, vif, vpu und
vpr.
Morphologie
Das helikale Kapsid liegt in Form eines stumpfen Kegels vor und besteht aus p24Proteinen. Es beinhaltet neben dem RNA-Genom die Proteine p9 und p7 sowie die
Enzyme Reverse Transkriptase, Protease und Integrase (DeVita et al., 1997). Umgeben
werden die Virionen von einer äußeren Hülle zellulären Ursprungs. In die Hülle
eingelagert ist das Transmembranprotein gp41, an welches nicht kovalent das äußere
Hüllprotein gp120 bindet.
Replikationszyklus
Während der Infektion kommt es zunächst zur Adsorbtion der viralen Partikel durch
Anlagerung des gp120 an CD4-Rezeptoren der Wirtszellmembran. Zur erfolgreichen
Fusion werden zudem noch Korezeptoren benötigt. Die wichtigsten wären
CXCR4/Fusin und CCR5 (Berson et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996;
Feng et al., 1996a, b; Kozak et al., 1997). Der durch diese Interaktion eingeleiteten
Fusion mit der Wirtszelle folgen das Uncoating, die Reverse Transkription des viralen
Genomes und schließlich die Integration in das Wirtsgenom mit der Integrase. Das
entstandene Provirus wird von der zellulären RNA-Polymerase II transkribiert.
Zunächst werden nur mehrfach gespleißte mRNAs nach Transport aus dem Zellkern
translatiert. So entstehen die frühen viralen Proteine Nef, Rev und Tat. Die Proteine Rev
und
Tat
werden
in
den
Zellkern
importiert.
Tat
übernimmt
dort
Transaktivatoreigenschaften.
Über das Transportprotein Rev können dann einfach- und ungespleißte mRNAs zur
Translation der restlichen viralen Proteine in das Zytoplasma exportiert werden. Nach
Spaltung der enstandenen Vorläuferproteine für Kapsid und Hülle durch die Protease
und deren Zusammensetzen neuer Viren an der Zytoplasmamembran, der Wirtszelle
erfolgt die Freisetzung durch Knospung.
2.3 Das HIV-1 Rev Protein
Wie bereits erwähnt ist das Rev Protein von zentraler Bedeutung für die Replikation
von HIV-1. Es wirkt stabilisierend auf virale mRNAs und vermittelt den Export viraler
ca. 9 kb großer, ungespleißter, mRNAs bzw. 4 kg großer einfach gespleißter mRNAs
10
vom Zellkern ins Zytoplasma. Diese Art von posttranskiptioneller Kontrolle ist in allen
Lentiviren wie auch in der HTLV-Familie der Onkoviren, welche ein vergleichbares
Protein, genannt Rex, besitzen (Felber et al., 1997) hochkonserviert.
Im multifunktionalen N-terminalen Bereich des Rev-Proteines findet sich neben
importvermittelnden arginin reichen NLS (nukleäres Lokalisationssignal) eine
Oligomerisierung- sowie eine RNA-Bindungsdomäne, mit welcher die viralen mRNAs
über ihr Rev-responsive Element (RRE) binden (Malim et al., 1989b; Perkins et al.,
1989; Hope et al., 1990a; Olsen et al.; 1990; Böhnlein et al., 1991; Zapp et al.; 1991).
C-terminal befindet sich ein NES (nuklear exit Signal)( Stauber et al., 1995). Im Cterminalen Bereich konnte ein nukleäres Exportsignal (NES) identifiziert werden.
Abb.2
Domänenorganisation des HIV-1 Rev-Proteins über seine beiden Lokalisationssignale
(Abk.: NLS nukleäres Lokalisationssignal, NES nukleäres Exportsignal)
Über seine beiden Lokalisationssignale kann das Rev-Protein sich zwischen Zellkern
und Zytplasma hin und her bewegen. Im Kern interagiert das Rev Protein mit RREs,
spezifische RNA Strukturelemente auf einfach und ungespleißten mRNAs. Hier kommt
es zur Multimerisierung des Rev und zur Interaktion mit dem Exportfaktor CRM-1
(Exportin-1) sowie anderen Kofaktoren wie z.B. eIf-5A oder Ran-GTP. Diese
Wechselwirkungen wirken inhibitorisch auf den Spleißvorgang und führen zum Export
der entsprechender un- bzw einfach gespleißter mRNAs aus dem Zellkern ins
Zytoplasma der Zelle. Auf diese Art und Weise kommt es zur Bildung später viraler
Proteine wie z.B. Env Gag oder Pol und Virusgenom, da einfach gespleißte mRNAs für
die Bildung später viraler Proteine und ungespleißte mRNAs für ein neues Virusgenom
kodieren.
11
Abb. 3 Funktion des HIV-1 Rev-Proteins während der viralen Transskription
Ohne die Funktion von Rev werden die Transkripte entweder vollständig gespleißt oder
durch Nukleasen im Kern degradiert. Verantwortlich dafür sind Instabilitätselemente
(INS) auf den RNAs, welche mit zellulären Destabilisierungsfaktoren interagieren
(Felber et al., 1997; Pavlakis & Stauber, 1998).
2.4 Einteilung der NES anhand ihrer Kinetik
Die relativ kurzen Exportsignale, welche eine leucinreiche Konsensussequenz tragen,
sind sowohl in viralen Proteinen wie z.B. HIV-1 Rev, HTLV-1 Rex, Adenovirus Typ-5
E1B-55K als auch in zellulären Proteinen wie z.B. Proteinkinase Inhibitor (PKI), Tumor
Suppressor Protein p53 zu finden (Dobbelstein et al., 1997,Elfgang et al., 1999;
Ferringo et al., 1999; Hauer et al., 1999; Krätzer et al., 2000; Fischer et al., 1995).
Man kann gut GST-GFP-NES Fusionsporoteine erstellen, diese in Zellkerne injizieren
und so Transportprozesse „live“ unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten. GFP ist
ein unter UV-Licht grün fluoreszierendes Protein. GST wird zum Aufreinigen über
Gluthation–Sepharose benötigt (Rosorius et al., 1999; Heger et al., 2001). Eine
Diffusion dieser Fusionsproteine ist aufgrund ihrer Größe nicht möglich.
12
Im Folgenden sind GST-NLS-GFP Fusionsproteine zu verschiedenen Zeiten nach
Injektion in den Nukleus von Säugerzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop zu sehen.
Es zeigt sich, dass die NES erhebliche Unterschiede bezüglich der für den Kernexport
benötigten Zeit aufweisen.
Abb. 4 Exportkinetiken verschiedener GST-NES-GFP Fusionsproteine nach Mikroinjektion
in die Kerne eukaryoter Zellen (Veros/Affennierrenzellen)
Durch derartige Versuche, bei denen die Geschwindigkeit des Kernexports bestimmt
wird, kann man die unterschiedlichen NES anhand ihrer Kinetik charakterisieren. Einige
Beispiele sind in nachstehender Tabelle zu sehen:
13
Sequenz
Herkunft
Exportzeit
LALKLAGLDIG
Protein Kinase Inhibitor (PKI)
5 - 10 min; schnell
LSAGLYSSLSL
HTLV-1 Rex
10 – 20 min; mittel
LQLPPLELRTL
HIV-1 Rev
15 – 25 min; mittel
LYPELRRILTI
Adenovirus Typ 5 E1B-55K
60 –70 min; langsam
MFRELNEALELK
Tumor Suppressor Protein p53
> 10 h; sehr langsam
Als Ursachen für die erheblichen Unterschiede der Kinetik könnten unterschiedlich
starke Affinitäten zu Exportfaktoren wie z.B. CRM-1 (Heger et al., 2001) oder evtl.
weitere noch unbekannte Interaktionspartner während des Transportprozesses in Frage
kommen. Der genaue Mechanismus konnte bislang noch nicht geklärt werden.
14
3 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Betrachtet man die qualitativ sehr unterschiedlichen NES, so liegt der Gedanke nahe die
NES bzw. NLS verschiedener Proteine miteinander zu kombinieren, um auf diese Art
und Weise andere Eigenschaften zu erzielen.
Bringt man dann z.B. Proteine mit veränderten Transportkinetiken wieder in
komplexere Strukturen, so könnte man mit derart manipulierten Proteinen auch in
größeren Systemen Kinetiken variieren und so „Kinetic engineering“ betreiben.
Erste Versuche zur Manipulation von Transportproteinen sollten am Rev Protein des
HIV-1 durchgeführt werden. Dabei galt es den NES Anteil des Rev durch andere
Sequenzen, die ein NES tragen, zu erstzen. Zuerst sollten die Sequenz von E1B 1-163,
die ein sehr langsames NES trägt, und PKI in gesamter Länge mit einem schnellen NES
das „mittelschnelle“ Rev-NES ersetzten. Als Ergebnis erhält man die Fusionsproteine
Rev-E1b 1-163 und Rev-PKI.
Durch Koppelung mit GFP (Green Fluorescent Protein) und anschließender
Transfektion
der
Expressionsplasmide
in
Säugerzellen
können
die
„Shuttleeigenschaften“ der Rev-NES-GFP Proteine unter Zuhilfenahme von Stoffen,
wie Actinomycin D und Leptomycin B, unter dem UV-Mikroskop analysiert werden.
Ob diese veränderten Revs tatsächlich in der Lage sind mRNA über das RRE vom
Zellkern
ins
Zytoplasma
zu
transportieren,
könnte
man
mit
einem
CAT
(Chloramphenicol-acetyl-transferase) Assay (Schiller et al., 1992) abschätzen. Hier
werden die Rev-NES Expressionsplasmide mit pDM128, einem Reporterkonstrukt,
welches Rev-abhängig CAT Produktion ermöglicht, kotransfiziert.
Sehr interessant ist selbstverständlich die Frage wie sich die Rev-NES Konstrukte im
Kontext ganzer HIV-1 verhalten:
Werden über die Rev-NES Konstrukte auch späte virale Partikel gebildet? Verändert
sich die Geschwindigkeit, mit der virale Partikel gebildet werden, gegenüber dem
Wildtyp Rev? Sind solche Viren, die für ein manipuliertes Rev kodieren,
replikationskompetent?
Um dem Gedanken des „Kinetic engineering“ näher zu kommen, müssten die Rev-NES
Konstrukte in das HIV-1 Genom integriert werden.
Da im Wildtyp HIV-1 die Rev- und Tat-Region übereinander im Leserahmen versetzt
liegen, ist es nicht möglich, das Rev durch eines der Rev-NES Konstrukte zu ersetzen.
15
Ein Ausweg das Problem zu lösen, besteht darin, das Wildtyp Rev selektiv zu
inaktivieren und Rev-NES anstatt dem Nef Protein zu exprimieren.
Um das Wildtyp Rev auszuschalten ist eine Doppelmutation bekannt, bei der das
Startkodon ATG des Rev verändert wird und ein TAA als zusätzliches Stopkodon im
weiteren Verlauf eingesetzt wird. Dabei wird Tat nur in einer Aminosäure verändert,
was aber die Funktion nicht beeinträchtigt. Die Doppelmutation gewährt eine große
Sicherheit gegenüber Rückmutationen zum Ursprungsgenom (Zolotukn et al., 1994;
Nappi et al., 2001).
Exprimiert würden Rev-NES Fusionsproteine anstatt Nef, welches ebenso wie Rev ein
frühes virales Protein darstellt aber nicht essentiell für die Replikation in Zellkultur ist
(Togunaga et al., 1996; Papkalla et al., 2002; Chen et al., 1997).
Rekombinante Viren, die anstatt Nef z.B. GFP oder andere Proteine bilden, sind bereits
bekannt (Page et al., 1997;Lee et al.,1997).
Durch die beschriebene Klonierung hängt die Bildung später viraler Proteine allein von
den integrierten Rev-NES Konstrukten ab. Als Beispiel mit langsamen NES sollte RevE1b 1-163 dienen. Rev-PKI sollte ein Shuttleprotein mit schnellen NES repräsentieren.
Als Referenz mit mittleren NES sollte das Wildtyp Rev an gleicher Stelle fungieren.
Abb. 5 Klonierung rekombinanter HIV mit Rev-Nes Konstrukten
16
4 Material
4.1 Eukaryonte Zelllinien
Alle Zelllinien wurden kultiviert nach Angaben der ATCC (American Tissiue Culture
Collection).
293T
Humane Nierenepithelzelllinie , mit dem Adenovirus Typ 5 transformiert, Exprimieren
SV40 (simian virus 40) large T-Antigen (DuBridge et al., 1987).
Medium:
MEM (Minimum Essential Medium; Gibco BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml LGlutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10%(v/v)
hitzeinaktiviertem FKS (fötales Kälberserum).
HeLa
Humane, epitheliale Zelllinie, die aus einem Zervix-Karzinom isoliert wurde (ATCC
Nr.: CCL-2).
Medium:
MEM (Minimum Essential Medium; Gibco BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml LGlutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10%(v/v)
hitzeinaktiviertem FKS (fötales Kälberserum).
P4-R5-MAGI
Zelllinie, die stabil die humanen Rezeptoren CD4 und CCR5 exprimiert. Enthält ßGalactosidase unter der Kontrolle der HIV-1-LTR (Charneau et al., 1994).
Medium:
DMEM (Dulbecco`s modified Eagle Medium; Gibco BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml
L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10%(v/v)
hitzeinaktiviertem FKS (fötales Kälberserum).
Jurkat
Humane T-Zelllinie, aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie etabliert (Weiss et
al., 1984).
Medium:
17
RPMI-1640 Medium (Gibco/BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml
Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS.
4.2 Bakterien zur Plasmidvermehrung
Escherichia coli XL2-BlueTM
Bakterienstamm zur Plasmidvermehrung:
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacIqZM15 Tn10
(Tetr) Amy Camr] (Bullock et al., 1987) (Stratagene; Heidelberg).
Medien:
LB-Medium: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 8 g/l NaCl, 1 g/l Glukose; Zugabe
von 100 mg/l Ampizillin vor Gebrauch. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2
eingestellt.
LBampAgar: 15 g/l Agar und 100 mg/l Ampicillin in LB-Medium;
SOC-Medium: 20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 2,5 mM NaCl, 10 mM MgCl2,
10 mM MgSO4, 20 mM Glukose.
4.3 Oligonukleotide
Die folgenden Oligonukleotide wurden bei ARK scientific GmbH Biosystems
(Darmstadt Deutschland) bezogen.
Oligonukleotide zur Klonierung
5´RevY
TAT GAA ACA AAT TTT CCT CT
3´Xho Rev
AAA CTC GAG TAC TGT AGG AGA TTC CAC C
3´Nhe E1b 1-163
AAA GCT AGC CCA GTA AGT GGT CAG CTG CTC
TAT
3´Xho E1b 1-163
AAA CTC GAG TTA CCA GTA AGT GGT CAG CTG
5´Bgl E1b
AAA AGA TCT GGA GCG AAG AAA CCC ATC TG
3´Nhe PKI
AAA GCT AGC GCT TTC AGA TTT TGC TGC TTC
TCC
3‘Xho PKI
AAA CTC GAG GCT TTC AGA TTT TGC TGC TTC
5´Bgl PKI
AAA CGA GAT CTC GTC CCA GAT AAG TGC TAA
18
Oligonukleotide zum Sequenzieren
5´Rev Seq
GAT AGT AGG AGG CTT GGT AG
5´gp120 Seq
ATA TGA GGG ACA ATT GGA G
3´gp120 Seq
CAC TCT TCT CTT TGC C
5´Rev Mut Seq
CAT CCA GGA AGT CAG CC
3´Env Seq
CTG GAT ACG GAT ACT
3´Xho Seq
CCT CCT CTT GTG CTT C
5´Blp Seq
GGC TTG GAA AGG AT
4.4 Plasmide
pBC12 ß-Gal
Eukaryontischer Expressionsvektor exprimiert ß-Galaktosidase
pBC12 Rev
Plasmid enthält Wildtyp Rev, Ampicillin-Resistenz (Heger P et al., 1999; Fridell et al.,
1996).
pBC12 RevM9
Plasmid enthält Schnittstelle zum Einklonieren verschiedener NES, AmpicillinResistenz (Heger et al., 1999; Fridell et al., 1996).
pBS
pBluescript (Stratagene Heidelberg). pUC-Derivat mit multipler Klonierungsstelle,
flankiert von den Promotoren der Bakteriophagen T3 und T7.
pc3p53
pc DNA 3.1 dient als Hilfsvektor zur Klonierung rekombinanter HI Viren.
pDCRE1b
Expressionsvektor für Säugerzellen, welcher das Adenovirus Typ 5 E1b-55K-Protein
exprimiert (Dobner et al., 1996).
19
pDM128
Exprimiert Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) in Abhängigkeit von Rev über
das RRE (Hoffmann La Roche Mannheim) (Schiller et al., 1992).
pF143
GFP-Expressions-Vektor mit dem GFP-Gen (Grün-Fluoreszierendes Protein) unter
Kontrolle des CMV-IE-Promotors; Polyadenylierungs-Signal des BGH-Gens (bovine
growth hormone); Selektionsmarker: Neomycin; zur Expression in Bakterien
Ampicillin-Resistenz (Stauber et al., 1998).
pF143 Rev
Expressionsvektor für Rev-GFP unter CMV-IE-Promotor Kontrolle.
pGEX PKI-GFP
Bakterieller Expressionsvektor für das gesamte PKI Protein gekoppelt an GFP. Nach
Induzierung mit Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) kann Protein über einen
GST-Anteil aufgereinigt werden.
pNL4-3
Enthält gesamtes provirales Genom des HIV-1 NL4-3 Klons (Adachi, A., et al., 1986).
pNL4-3 GFP
Dieses provirale Plasmid kodiert für ein Virus bei dem anstelle NEF GFP exprimiert
wird. In Zellkultur ist dieses Virus replikationskompetent (Page et al., 1997;Lee et
al.,1997).
pNL4-3 N-I-GFP
Provirales Plasmid zur Koexpression von Nef und GFP koexprimiert mittels eines IRES
Elements (internen Ribosomen Eintrittsstelle) (Brown et al., 2006).
pNL4-3 R- RRE- S+
Bei diesem Plasmid wurde das Rev Exon2 des Rev Genes durch zwei Mutationen
inaktiviert. Der Transport von mRNAs erfolgt über ein eingefügtes SRV-1 Element
anstelle von RRE (Zolotukn et al., 1994).
20
pVSVG
Plasmid zur Pseudotypisierung z.B. von HI Viren mit dem Glycoprotein des vesikulären
Stomatitis Virus (Aiken et al., 1997)
4.5 Antikörper
Primäre Antikörper
Als primärer Antikörper gegen virale Proteine dient Patientenserum aus der
Diagnostikabteilung Institut für Molekulare Virologie Universität Erlangen. Das Serum
stammt von einem Patienten mit sehr starker Immunreaktion nach HIV Infektion. Es
weist Antikörper gegen sehr viele virale Proteine auf. Besonders gegen Nef weist dieses
Serum eine starke Antigenität auf.
Sekundärer Antikörper
Zur Serum Detektion wurde gegen humanes IgG-gerichteter Human-IgG-HRP (horse
radish Peroxidase) Antikörper der Firma Sigma (München) verwendet.
4.6 Enzymatische Reaktionen
Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen wurden von Gibco/BRL (Eggenstein), New England Biolabs
(Schwalbach, Traunstein) und Fermentas (St. Leon-Rot) bezogen und in den von den
Herstellern empfohlenen Puffersystemen verwendet.
Polymerase-Ketten-Reaktion
PWO-DNA-Polymerase
Gibco/BRL,
Taq-DNA-Polymerase
Perkin Elmer (Überlingen)
Nukleotide:
Perkin Elmer (Überlingen)
Sonstige Enzyme
alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
Boehringer (Mannheim)
Trypsin aus Rinderpankreas
Gibco/BRL (Eggenstein)
21
4.7 Längenstandard
"1 kb-Leiter" (Gibco/BRL, Eggenstein)
4.8 Reagenziensysteme
Plasmid MiniPrep
Quiagen
Plasmid MaxiPrep
Quiagen
PCR Purification Kit
Quiagen
CatAssay
Hoffmann La Roche
Mannheim
Takara DNA Ligationskit
Combrex
4.9 Reagenzien und Laborhilfsmittel
Adenosintriphosphat (ATP)
Sigma (München)
Agarose
Gibco/BRL (Eggenstein)
Ammoniumpersulfat (APS)
Sigma (München)
Ampicillin
Bayer (Leverkusen)
ß-Mercaptoethanol (ß-ME)
Sigma (München)
Bromphenolblau
Serva (Heidelberg)
Chloramphenicolrot-B-D-galaktopyranosid (CPRG)
Boehringer (Mannheim)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Fluka (Neu-Ulm)
Dithiothreitol (DTT)
Pharmacia (Freiburg)
Elektroporationsküvetten
PeqLab (Erlangen)
Ethidiumbromid (EtBr)
Sigma (München)
Ethylen-Diamin-Tetraacetat (EDTA)
Sigma (München)
fötales Kälberserum (FKS)
Gibco/BRL(Eggenstein)
Glycerin
Merck (Darmstadt)
Harnstoff
Merck (Darmstadt)
Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES)
Serva (Heidelberg)
H2O2
Merck (Darmstadt)
Isopropanol
Merck (Darmstadt)
L-Glutamin
Gibco/BRL (Eggenstein)
22
Leptomycin B
Sigma (München)
Magermilchpulver
Heirler
Cenovis
GmbH
(Radolfzell)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Serva (Heidelberg)
N, N´-Methylen-Bisacrylamid
Serva (Heidelberg)
N, N, N', N'-Tetramethylendiamin (TEMED)
Serva (Heidelberg)
Nitrocellulosemembran
Polyacrylamid (Fluoreszenz-Sequenzierung)
Biorad (München)
Röntgenfilme
Kodak (Stuttgart)
Triton X-100
Sigma (München)
Tween 20
Roth (Karlsruhe)
Whatman Paper
Whatman (Maidstone)
4.10 Puffer und Lösungen
HBS (Calcium-Phosphat-Transfektion)
2 x HBS (10 x Stock): 8,18% NaCl (w/v); 5,94% HEPES (w/v); 0,2% Na2HPO4 (w/v)
Die Lösung wurde sterilfiltriert und der pH-Wert mit 1 M NaOH auf 7,12 eingestellt. 2
M CaCl2 wurde ebenfalls steril filtriert.
PBS
137 mM NaCl; 7,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM K2HPO4; 1mM CaCl2; 2 mM MgCl2
TAE-Puffer
50 fach: 500 mM Tris, 250 mM Natriumacetat, 50 mM Na2EDTA
Blotpuffer
25mM Tris, 192mM Glycerin, 10% MetOH (v/v)
Running Puffer
1,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v), mit HCl auf pH = 8,8 eingestellt
Stacking Puffer
0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v), mit HCl auf pH = 6,8 eingestellt
23
Lysis-Puffer
Enthalten im CAT-Assay der Fa. Roche
Z-Puffer
1,61% Na2HPO4 (w/v), 0,55% NaH2PO4 (w/v), 0,075% KCl (w/v), 0,025% MgSO4
(w/v)
Working Z-Puffer:
Z-Puffer (siehe oben), 0,08% SDS(10%) (v/v), 0,28% ß-Mercaptoethanol (v/v)
24
5 Methoden
5.1 DNA Methoden
DNA-Amplifikation in E. Coli
Alle
verwendeten
Plasmide
tragen
als
bakteriellen
Selektionsmarker
eine
Ampicillinresistenz. Die Plasmide wurden im Bakterienstamm E. Coli XLII blue
amplifiziert. Die Plasmidisolierung und Präparation erfolgte durch PlasmidPräparationkits der Firma Quiagen im entsprechenden Maßstab.
Restriktionsverdau
Bei
Verdau
von
Reaktionstemperatur,
DNA
mit
Restriktionsendonukleasen
Inkubationszeit,
Enzymmenge
und
wurden
bezüglich
Pufferbedingngen
die
Herstellerangaben strikt eingehalten. Falls der Verdau mit mehreren Enzymen in einem
Ansatz nicht möglich war, wurde die DNA zwischen den einzelnen Reaktionen mit dem
PCR-Purification-Kit von Quiagen aufgereinigt.
Polymerase Kettenreaktion
Bestimmte Schnittstellen für Klonierungen wurden durch PCR-Amplifikation mit der
PWO-Polymerase und spezifischen Primern gewonnen.
Bei der Wahl des Puffers und des Programms für den Thermocycler wurden die
Herstellerangeben berücksichtigt. PCR-Reaktionsprodukte wurden mit dem PCRPurification-Kit von Quiagen aufgereinigt.
Ligation von DNA
Zu Vektor und Insert-DNA im Verhältnis 1:2 wurde die gleiche Menge Takara-Ligase
gegeben. Der Ansatz wurde danach eine Stunde bei 16°C inkubiert.
Transformation in XL2-BlueTM
Nach dem Auftauen der kompetenten Bakterien auf Eis wurden ca. 200 µl von der
Bakteriensuspension zum Ligationansatz gegeben. Nach vorsichtigem auf- und
abpipettieren wurde der Ansatz dann für 30 Minuten auf Eis gestellt. Danach wurde er
25
im Wasserbad für 45 Sekunden auf 42°C erhitzt. Nach weiteren 2 Minuten auf Eis
wurden 500 µl SOC-Medium dazugegeben und der Ansatz ca. 1h bei 37°C inkubiert.
Die Bakteriensuspension wurde danach auf LBamp-Agarplatten ausplattiert.
Herstellung von Plasmidkonstrukten
Die Klonierung von allen im Rahmen dieser Arbeit hergestellter Plasmide erfolgte mit
Hilfe von Restriktionsverdau und PCR-Amplifikation.
Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte per Agarose-Geleletrophorese. Durch
Zugabe von Ethidiumbromid wurden die DNA-Banden bei UV-Licht mit einer
Wellenlänge von 366 nm sichtbar gemacht.
Die Aufreinigung von DNA aus Verdäuen, PCR-Amplifikationen und ausgeschnittenen
Gelbanden erfolgte über den PCR Purification Kit der Firma Quiagen. So konnten dann
einzelne DNA Fragmente miteinander ligiert werden. Um Religationen zu vermeiden
wurden die Vektoren mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Die Ligationsprodukte wurden in E. Coli XL2-BlueTM transformiert. Die
transformierten Bakterien wurden über Nacht auf LBamp-Agarplatten angezüchtet. Am
nächsten Tag wurden dann mehrere Kolonien vom Festmedium in je 5 ml
Flüssigmedium überführt. Am Tag darauf konnten dann Plasmide aus den E. coli
präpariert werden (Mini-Prep der Fa. Quiagen). Die Kontrolle der Klonierung erfolgte
dann über Verdau, PCR oder Sequenzierung.
Von einer passenden Kolonie wurden dann nochmals die Bakterien in ca. 300 ml
Flüssigmedium weitergezüchtetet und größere Mengen Plasmide sauberer aufgereingigt
(Maxi-Prep der Fa. Quiagen). DNA-Konzentrationen wurden photometrisch bei einer
Wellenlänge von 280 m bestimmt.
DNA-Seqenzierung
Die Sequenzanalysen wurden mit dem 373A DNA-Sequenziersystem (Applied
Biosystems, Weiterstadt) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Dem Prinzip der
Sequenzierreaktion liegt die Strangabbruchmethode nach Sanger zugrunde. Es werden
fluoreszenzmarkierte Didesoxy-Nukleotide verwendet, welche im Verlauf einer
Polymerase-Kettenreaktion in die neusynthetisierte DNA eingebaut werden. Sobald die
Taq-Polymerase ein Didesoxy-Nukleotid eingebaut hat, kommt es aufgrund der
fehlenden Hydroxygruppe am Zuckerrest und der dadurch nicht mehr möglichen
26
Neubildung einer Phospho-Diester-Bindung zum Strangabbruch. Da jedes der vier
Didesoxy-Nukleotide mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist, kann
die Sequenzierreaktion in einem Reaktionsgefäß ablaufen. Nach Auftrennung der
Amplifikationsprodukte in einem Sequenziergel werden die an die DidesoxyNukleotide gekoppelten unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe mittels eines Lasers
zur Emission von Licht unterschiedlicher Wellenlänge angeregt, welches durch einen
Detektor gemessen und durch ein Computerprogramm analysiert wird. Die
resultierenden Sequenzen wurden mit dem Programmpaket der „University of
Wisconsin Genetics Computer Group“ ausgewertet.
5.2 Zellkultur
Kultur adhärenter Zellen
Adhärente Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:3 bis 1:10 gesplittet. Nach Absaugen
des Mediums wurden die Zellen mit 1 ml Trypsin vom Boden gelöst. Kultiviert wurden
die Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO2 .
Kultur von Suspensions-Zellen
Die Suspensions-Zellen wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen in RPMI-1640 bei 37°C
und 7% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:5 bis 1:10 gesplittet.
Transfektion
Die Transfektion in 293T-Zellen erfolgte mit der Calcium-Phosphat-Präzipitat Methode.
Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion so ausgesät, dass sie am folgenden Tag
ca. 50 bis 70% konfluent sind. Ein 500 µl Ansatz setzte sich aus 250 µl DNAArbeitslösung und ebensoviel HBS-Puffer zusammen. Die DNA-Menge für den DNAArbeitspuffer lag zwischen 5 und 12 µg. Der DNA-Ansatz wurde mit Bi-H2O auf 219
µl Gesamtmenge aufgefüllt. In diesen Ansatz wurden dann 31 µl CaCl getropft. Der
DNA-Arbeitspuffer mit insgesamt 250 µl Volumen wurde dann zu 250 µl HBS Puffer
getropft. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur trübte die Flüssigkeit
aufgrund des Präzipitats leicht ein. Der gesamte Ansatz wurde dann noch einmal auf
und ab pipettiert und dann direkt auf das Medium der ausgesäten 293T-Zellen getropft.
Am folgenden Tag wurde das Medium gewechselt. Noch einen Tag später konnten dann
die transfizierten Zellen lysiert werden, bzw. Überstand mit viralen Partikeln
abgenommen werden.
27
Um eine optimale Effizienz der Transfektion zu erhalten, sollte die DNA-Menge nicht
zu gering sein. Zum Erreichen der nötigen DNA-Menge kann der DNA-Ansatz mit
Leervektor-DNA (z.B.pBs-Vektor) aufgefüllt werden. Durch Eintropfen der DNAArbeitslösung an einer luftdurchströhmten Pasteurpipette in den HBS-Puffer kann die
Effektivität ebenfalls erhöht werden.
Das Gesamtvolumen kann auch reduziert werden. Alle Anteile müssen aber auch bei
kleineren Volumina im selben Verhältnis zueinander stehen.
Elektroporation
Pro Elektroporationsansatz sind 30 bis 50 µg DNA nötig. Zur Elektroporation von
Jurkats müssen 1x106 Zellen in 800 µl RPMI-Medium ohne Antibiotikum
aufgenommen werden. DNA und Suspensionszellen wurden dann in eine 4 mm
Elektroporationsküvette gegeben. Die Elekroporation wurde dann mit folgenden
Einstellungen gestartet: 250 V, 1500 µF, R=--------Der Küvetteninhalt wurde dann in eine kleine Zellkulturflasche mit 10 ml RPMIMedium, ebenfalls ohne Antibiotikum pipettiert.
Am nächsten Tag konnte dann das antibiotikafreie Medium gegen normales Medium
ersetzt werden.
5.3 CAT-Assay
Bei diesem Test dient CAT (Chloramphenicol-acetyl-transferase) als Reporter für RevAktivität. Die Quantifizierung erfolgte mit einem System von Hoffmann La Roche,
Mannheim. 293T-Zellen wurden am Vortag in 12-Well Zellkulturschalen so ausgesät,
dass sie am folgenden Tag zu 50 bis 60% konfluent waren. Mit der Calcium-PhosphatPräzipitat Methode in einem 125 µl Gesamtansatz, HBS mit eingerechnet, wurden
folgende Expressionsplasmide kotransfiziert:

0,05 µg pBC12 ß-Gal als Tranfektionskontrolle

0,2 µg pDM128, welches CAT(Chloramphenicol-acetyl-transferase) Rev abhängig
exprimiert

die zu untersuchenden Expressionsplasmide mit Rev bzw. Rev-Mutanten

ca. 2,5 µg pBS Leervektor zur Effektivitätssteigerung mittransfiziert werden.
28
Am zweiten Tag nach Transfektion wird das Medium abgesaugt und die Zellen mit dem
Lysispuffer aus dem Kit lysiert und abzentrifugiert. Im Überstand befinden sich unter
anderem die zu quantifizierenden Proteine CAT und ß-Galaktosidase.
Bestimmung der ß-Galaktosidase-Menge:
Die Bestimmung der ß-Galaktosidase-Aktivität erfolgte in 96-Well Flachbodenplatten.
Pro Messung wurden 160 µl Working Z-Puffer und 20µl Überstand aus
abzentrifugiertem Zelllysat in ein Well pipettiert.
Als Substrat wurden dann 20 µl
1,5% Chloramphenicolrot-B-D-galaktopyranosid
(CPRG) Lösung (w/v) dazugegeben. Die ß-Galaktosidase Menge wurde unter
Berücksichtigung des Leerwertes bei 560 m photometrisch bestimmt.
Bei zu schnellem Farbumschlag war evtl. eine Verdünnung des Überstandes nötig.
Die CAT Menge im Überstand wurde mit dem ELISA von Hoffmann La Roche
gemessen. Es wurde dabei abzentrifugiertes Zelllysat, 1/50 verdünnt, in die ELISA
Flachbodenplatten gegeben werden. Die CAT Menge konnte dann photometrisch bei
einer Wellenlänge von 405 bis 490 m ermittelt werden.
Durch die Multiplikation des ß-Galaktosidase Kehrwertes mit dem CAT-Wert wurden
kleinere Unterschiede in der Transfektioneffizienz ausgeglichen. Die angeglichen CATWerte ermöglichen einen Vergleich der Rev Aktivitäten.
5.4 Virusstocks
Die
Herstellung
von
Virus-Stocks
erfolgte
mit
der
Calcium-Phosphat
Präzipitationsmethode in 293T-Zellen, ausgesät in 6-Well Platten. Es wurden 10 µg
DNA in einem 500 µl Ansatz pro Well transfiziert.
Der Medienwechsel erfolgte am nächsten Tag. Am übernächsten Tag wurde der
Überstand abgenommen, durch einen 0,45 µm Filter filtriert, aliquotiert und bei -80 °C
eingefroren.
Die quantitative Messung des Kapsidproteins p24 und damit auch der Virusmenge in
µg wurde von der Diagnostikabteilung in unserem Hause übernommen.
Als sofortige Transfektionkontrolle kann eine kleine Menge, z.B. 100 g, Plasmide mit
ß-Galaktosidase mittransfiziert werden. Lyse und ß-Galaktosidase-Bestimmung
entsprechen der Transfektionkontrolle beim CAT-Assay.
29
5.5 ß-Galaktosidase-Test
Am Vortag wurden P4-R5-MAGI Zellen 20 bis 40% in konfluent 48-Well
Flachbodenplatten ausgesät. Nach Medienwechsel wurden dann die Zellen mit 20 bis
200 µl Überstand aus oben beschriebenem Transfektionansatz für Virusstocks infiziert.
Am übernächsten Tag wurden die Zellen lysiert und das Lysat wurde abzentrifugiert.
Die ß-Galaktosidase, Tat-abhängig gebildet, wurde wie im CAT-Assay über CPRG
(Chloramphenicolrot-B-D-galaktopyranosid) quantifiziert.
5.6 Proteinmethoden
Polyacrylamidgel
Proteine wurden elektrophoretisch mit Polyacrylamidgele nach Molekulargewicht
aufgetrennt. Die Gele wurden in
Minigelkammern gegossen. Das achtprozentige
Laufgel und das Ladegel setzen sich folgendermaßen zusammen:
Laufgel:
Ladegel:
H2O
4,6 ml
3.4 ml
Running Puffer
2,6 ml
-
Glycerin 50%
0,2 ml
-
Stacking Puffer
-
1,4 ml
Acrylamid
2,6 ml
0,5 ml
TEMED
15 µl
24 µl
10 % APS
40 µl
24 µl
Westernblot
Proteine aus Zelllysaten wurden durch Polyacrylamidgele nach Molekulargewicht
eletrophoretisch aufgetrennt.
Vor dem Blotten der Proteine im PAA-Gel wurde dieses 5 Minuten in Blotpuffer
äquilibriert.
Der Blot erfolgte bei 0,05 A mit diesem Aufbau von unten nach oben.

3 Lagen Whatmanpapier

Nitrocellulosefilter

PAA-Gel
30

3 Lagen Whatmanpapier
Nach einer Stunde blotten konnten dann die unspezifischen Bindungsstellen am Filter in
PBS mit 0,4% Tween 20 (v/v) und 5% Magermilchpulver (w/v) über Nacht abgesättigt
werden.
Die Milchpulverlösung wurde am nächsten Tag mit PBS vom NC-Filter gewaschen.
Danach erfolgte 1 Stunde lang die Bindung des ersten Antikörpers in PBS mit 0,05%
Tween 20 (v/v) und 5% Magermilchpulver (w/v) gelöst.
Die ungebundenen Antikörper wurden dann durch drei mal zehn Minuten Waschen mit
PBS / 0,05% Tween (v/v) entfernt.
Daraufhin erfolgte die Detektion des Primärantikörpers durch den Sekundärantikörper.
Der Sekundärantikörper wurde ebenfalls in PBS mit 0,05% Tween 20 (v/v) und 5%
Magermilchpulver (w/v) gelöst. Die Inkubationszeit betrug eine Stunde.
Das Entfernen des zweiten Antikörper erfolgte zwei Mal mit der gleichen Lösung wie
für den ersten Antikörper für je zehn Minuten. Dann wurde noch einmal zehn Minuten
mit PBS gewaschen.
Die Antikörperkomplexe wurden mit der Chemolumineszenzreaktion nachgewiesen.
Der Filter musste eine Minute in 50 ml Lösung A, 15,5 µl 30% H2O2 und 500 µl
Lösung B in der Dunkelkammer inkubieren. Nach Abstreifen des NC-Filters auf
Whatmanpapier konnten Filme durch auflegen des Filters, eingelegt in einen
Folienschlauch, belichtet werden.
31
6 Ergebnisse
6.1 Klonierung von pF143 Rev-KE1b 1-163 und pF143 Rev-PKI
pF143 Rev-E1b 1-163
Bei dieser Klonierung wurde der Nuclear-Exit-Signal (NES) tragende hintere Abschnitt
des HIV-Rev durch E1b 1-163 ersetzt. Als Grundlage für E1b 1-163 diente dabei das
Plasmid pDCRE1b, es trägt die gesamte E1b-Sequenz. E1b 1-163 wurde mit den
Primern 5´BglII E1b und 3´Xho E1b 1-163 amplifiziert und danach mit BglII und Xho
verdaut. Im Plasmid pBC12 RevM9 wurde dann das Rev-NES durch E1b 1-163 über
jene beiden Restriktionsendonukleasen ersetzt. Wir haben dadurch das Plasmid pBC12
Rev-E1b 1-163 erhalten. Im nächsten Schritt wurde das gesamte Rev-E1b 1-163 mit den
Primern 5´RevY und 3´Nhe E1b 1-163 aus pBC12 Rev E1b 1-163 amplifiziert und
beide Enden mit NheI verdaut. Dieses Fragment wurde dann über NheI in pF143
kloniert. Dabei musste besonders die Orientierung des Inserts beachtet werden. Durch
Dephosphorylierung des Vektors wurden Religationen vermieden. Um sich von der
Richtigkeit dieser Klonierung zu überzeugen, wurde das erhaltene Plasmid mit den
Primern 5´RevY und 3´Nhe E1b 1-163 sequenziert.
pF143 Rev-PKI
Die Klonierung von pF143 Rev-PKI erfolgte analog zu der von pF143 Rev-E1b 1-163.
Mit den Primern 5´BglII PKI und 3´XhoI wurde die gesamte PKI-Sequenz aus pGEX
PKI-GFP amplifiziert. Dann wurde das PCR-Fragment mit BglII und XhoI verdaut und
in pBC12 RevM9 kloniert. Über PCR mit 5´RevY und 3´Nhe PKI wurde Rev-PKI aus
dem erhaltenen pBC12 Rev-PKI gewonnen. Nach Verdau mit NheI wurde dieses
Fragment in die NheI-Schnittstelle des pF143 kloniert. Das Endprodukt pF143 Rev-PKI
wurde zur Kontrolle mit den Primern 5´RevY und 3´Nhe PKI sequenziert.
32
Abb6. Plasmidkarte über pF143 Rev-E1b 1-163 und pF143 Rev-PKI
6.2
Rev,
Rev-E1b
1-163,
und
Rev-PKI
unter
dem
Fluoreszenzmikroskop
Es wurden HeLa-Zellen in Zellkulturschälchen so ausgesät, dass sie am folgenden Tag
10 bis 20% konfluent waren. Diese wurden mit 3µg Plasmid-DNA nach der CalciumPhosphat-Präzipitat Methode in einem 96µl Gesamtansatz (inklusive HBS) transfiziert
und vier Stunden später mit MEM-Medium gewaschen. Am Tag darauf war die grüne
Fluoreszenz des GFP bei vielen Zellen deutlich unter dem Fluoreszenzmikroskop zu
sehen. Es wurden mit den transfizierten Zellkulturen folgende Beobachtungen und
Versuche gemacht:
pF143 Rev
Am Tag nach der Transfektion von pF143 Rev war zu erkennen, dass das Rev-GFP
Fusionsprotein im Zellkern der transfizieten Zellen nukleolär lokalisierte (Abb. 7).
33
Abb. 7 pF143 Rev nach Transfektion in HeLa
Ursache dafür sind Strukturen im Nukleolus, welche Ähnlichkeiten zum RRE
aufweisen. (Stauber et al., 1995). Durch Behandlung mit Actinomycin D, welches die
Bindung an diese Strukturen blockiert, kam es nach zwei Stunden zur Verlagerung in
das Cytoplasma. Akkumulationen am Nukleolus waren nicht mehr zu sehen (Abb. 8).
Abb. 8 pF143 Rev nach Transfektion in HeLa und
zwei Stunden nach Actinomycin D-Behandlung
Es handelt sich um einen Transport, da der Zellkern im zweiten Bild deutlich weniger
GFP ausweist als das Cytoplasma. Eine Diffusion kann hier ebenfalls ausgeschlossen
werden, da das Rev-GFP Protein zu groß für einen Diffusionsvorgang ist.
34
pF143 Rev-E1b 1-163
Auch das Rev-E1b-GFP Protein lokalisierte am Tag nach der Transfektion am
Nukleolus (Abb. 9).
Abb. 9 pF143 Rev-E1b 1-163 nach Transfektion in
Hela
Um die nukleolären Strukturen, an denen Rev-E1b-GFP bindet zu blockieren, wurde
auch hier Actinomycin D zur Zellkultur gegeben.
Abb. 10 pF143 Rev-E1b 1-163 nach Transfektion in
HeLa und vier Stunden Behandlung mit
Actinomycin D
35
Bei den mit pF143 Rev E1b 1-163 transfizierten Zellen war nach Actinomycin DBehandlung eine deutlich langsamere Verschiebung des Fusionsproteins in das
Zytoplasma zu sehen. Hier war die Verschiebung erst nach mehr als vier Stunden
erfolgt (Abb. 10). Ursache dafür könnte das schwächere NES auf der E1b 1-163
Sequenz sein, welche für das Rev-NES eingesetzt wurde. Die überwiegende, wenn auch
langsamere, Verlagerung des GFP markierten Rev-E1b 1-163 vom Zellkern in das
Zytoplasma nach Ablösung vom Nukleus deutet ebenfalls auf einen Kernexport hin.
pF143 Rev-PKI
Nach Transfektion von pF143 Rev-PKI in HeLa-Zellen zeigte sich nach Inkubation
über Nacht ein gänzlich anderes Bild unter dem Floureszenzmikroskop als bei den
anderen beiden GFP-Fusionsproteinen. Das Rev-PKI-GFP-Fusionsprotein reichert sich
ausschließlich im Zytoplasma an. Im Gegensatz zu Rev und Rev-E1b 1-163 ist eine
Anhäufung auch an einzelnen Stellen nicht erkennbar, sondern die Fluoreszenz ist
gleichmäßig im Zytoplasma verteilt (Abb. 11).
Abb. 11 pF143 Rev-PKI nach Trasfektion in HeLa
Die Lokalisation des Proteins deutet darauf hin, dass durch das wesentlich stärkere PKINES die Adhäsion der Rev-RNA-Bindungsdomäne an den Nukleolus überwunden wird.
Wenn man dann den Export stoppt oder bremst, müsste sich das Protein wieder im
Zellkern an den nukleolären Punkten aufhalten. Durch Zugabe von 2µl Leptomycin B
ins Medium wird im nächsten Versuch der Export inhibiert. Schon nach weniger als
einer Stunde hat sich die Fluoreszens an den Nukleolus verschoben und das Zytoplasma
war frei von GFP (Abb.12).
36
Abb. 12 pF143 Rev-PKI nach Transfektion in
HeLa und eine Stunde nach
Leptomycin B-Behandlung
Alle drei Versuche weisen darauf hin, dass es auch für die, im Gegensatz zu HIV-1 Rev,
relativ großen Fusionsproteine Rev-E1b-GFP und Rev-PKI-GFP möglich ist zu
shutteln.
Es lässt sich außerdem folgern, dass sich bei den Rev-NES-GFP Fusionsproteinen ein
Flussgleichgewicht zwischen Export- und Importsignalen einstellt. Abhängig davon ist
die Lokalistation der Rev-NES-GFP Fusionsproteine. Des weiteren wird die Lage dieser
Proteine noch durch weitere Strukturen, an denen diese anheften, beeinflusst.
6.3 Funktionelle Messung der Rev-NES-GFP Fusionsproteine
im CAT-Assay
Allein die fluoreszenzmikroskopischen Analysen zur Lokalisation der Rev-NES-GFP
Fusionsproteine in HeLa Zellen und deren Kompetenz innerhalb der Zelle zu wandern,
geben noch keine Hinweise auf deren biologische Aktivität. Um zu untersuchen, ob
diese Fusionsproteine tatsächlich in der Lage sind, wie das HIV-1 Rev, mRNA über die
Bindung von RRE–Elementen vom Zellkern ins Zytoplasma zu transportieren, wurde
die Aktivität aller drei Fusionsproteine mit ihren unterschiedlichen Exportsignalen mit
Hilfe des CAT Reportersystemes analysiert.
Neben pBS, pBC12 ß-Gal, und pDM128 wurden je 10 g und 100 g Plasmid-DNA
der zu untersuchenden Revs mit der Calcium-Phosphat-Präzipitat-Methode transfiziert.
Es wurde jeweils aus drei Ansätzen gemittelt. Weitere Versuche mit anderen DNAKonzentrationen erbrachten analoge Ergebnisse.
37
3,500
2,986
3,000
relative
CAT Menge
2,500
2,294
1,880
2,000
1,634
1,500
1,000
0,500
0,103
0,081
0,071
0,000
1
0,
1
-E
K
-P
I0
µg
,1
1µ
g
3
16
1-
,0
µg
B
I0
t
er
w
er
Le
ev
ev
3
16
1-
µg
01
0,
K
-P
ev
R
ev
R
R
R
ev
R
1B
-E
ev
R
1
0,
µg
µg
01
0,
Abb.13 Darstellung der CAT Menge relativ zur ß-Gal Menge Rev-NES-GFP Fusionsproteine
Nach Angleichung der Werte mit der Tranfektionskontrolle ß-Gal, zeigte sich, dass die
Rev Aktivität mit der transfizierten DNA-Menge konzentrationsabhängig zunahm.
Dieses stellt dar, dass der RNA-Export durch Rev-NES-GFP Fusionsproteine über
Kernporen in diesem Versuch nicht im absoluten Sättigungsbereich abläuft. Würde der
Versuch unter Sättigung des Transportes erfolgen, wären keine Aussagen über die
Aktivität der Fusionsproteine möglich.
Im CAT-Assay zeigten sich dann aber auch noch zwei unerwartete Ergebnisse. Zum
einen überraschte die recht geringe Aktivitätssteigerung von Rev-PKI-GFP gegenüber
HIV-1 Rev. Aufgrund der deutlich unterschiedlichen Bilder im Fluoreszenzmikroskop
war eigentlich eine wesentlich höhere Aktivität des Rev-PKI-GFP zu erwarten.
Zum anderen konnte, wenn überhaupt nur eine minimale Aktivität beim Rev-E1b 1163- GFP Fusionsprotein festgestellt werden. Eine deutliche Aussage, ob in diesem
Falle Rev E1b 1-163 schwache Transporteigenschaften für den mRNA-Transport
aufweist oder nicht, kann mittels CAT-Assay nicht gemacht werden. Hier lag das
38
Problem bei der recht hohen Basalaktivität des Reporterkonstrukts pDM128.
Aktivitäten die ungefähr um den Faktor zwanzig kleiner sind als die des HIV-1 Rev
gehen sozusagen in der Basalaktivität des Leerwertes unter. Auch Transfektionen mit
noch mehr Rev-E1b 1-163 Plasmid-DNA im CAT-Assay haben keine klaren Ergebnisse
bezüglich der Transportaktivität von Rev-E1b 1-63 erbracht.
Im Anschluss sollten die im Rahmen dieser Aktivitätsuntersuchungen erhaltenen
Ergebnisse, auch im Kontext vollständiger HIV-Genome, mittels rekombinanter Viren
verifiziert werden.
6.4 Konstruktion von pNL4-3 R- Rev-E1b, pNL4-3 R- Rev und
pNL4-3 R- Rev-PKI
Konstruktion von pNL4-3 RAls Ausgangsplasmid zur Klonierung rekombinanter HIV wurde das provirale Plasmid
pN4-3 verwendet. Als erstes wurde die Rev-Funktion im Wildtyp pNL4-3 inaktiviert.
Dabei hilfreich war das Plasmid pNL4-3 R- RRE- S+. Dieses Plasmid kodiert für ein
Virus, welches Rev defizient ist und Rev / RRE unabhängig repliziert.
Über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und NheI wird das inaktive Rev2 Exon aus
diesem Plasmid geschnitten. Das funktionsfähige Rev2 im pNL4-3 wurde durch das
inaktive Rev2 Exon über diese Schnittstellen ersetzt. Folglich kann aus dem erhaltenen
Plasmid pNL4-3 R- kein Rev Protein mehr gebildet werden. Das erhaltene Plasmid
pNL4-3 R- mit dem Primer 5´Rev Seq Mut sequenziert.
39
Abb. 14 Plasmidkarte pNL4-3 R-
Klonierung von pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 , pNL4-3 R- Rev und
pNL4-3 R- Rev-PKI
Um die verschiedenen Revs als frühes virales Protein zu exprimieren wurde HIV-1 Nef
durch diese ersetzt. Nef ist nicht essentiell für die Replikation in Zellkultur. Es gehört
zu den sogenannten aksessorischen Proteinen.
Als Klonierungsgrundlage dient das Vollgenom-Plasmid pNL4-3 GFP143, welches
GFP anstatt Nef exprimiert. Diese GFP-Expression-Kassette wurde über BamHI und
XhoI in den Vektor pc3p53 kloniert. Der Vektor pc3p53 dient hier lediglich als
Hilfsvektor. Produkt dieser Klonierung war das Plasmid pc3p53 GFP. Alle Revs
wurden mit folgenden Templates und Primern für die Klonierung in den oben
genannten Hilfsvektor amplifiziert:
5‘Primer
3`Primer
Template
Rev-E1b 1-163
5´RevY
3´Xho E1B 1-163
pBC12 Rev-E1b 1-163
Rev
5´RevY
3`Xho Rev
pBC12 Rev
Rev-PKI
5´RevY
3´Xho PKI
pBC12 Rev-PKI
40
Alle drei per PWO-PCR erhaltenen Fragmente wurden mit NheI und XhoI verdaut.
Über diese Schnittstellen wurde dann das GFP in pc3p53 durch rev, Rev-E1b 1-163 und
pF143 Rev-PKI ersetzt. Ergebnis dieser Klonierung waren pc3p53 Rev, pc3p53 RevE1b 1-163 und pc3p53 Rev-PKI. Diese drei Plasmide wurden als nächstes mit BlpI und
XhoI verdaut. Dadurch wurden die Rev-Varianten samt Klonierungskassette aus dem
Hilfsvektor ausgeschnitten. Mit den gleichen Enzymen wurde NEF aus pNL4-3 Rausgeschnitten und durch die Revs in ihrer Kassette ersetzt. Das Ergebnis waren pNL43 R- Rev-E1b 1-163 , pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI. Diese proviralen
Plasmide kodieren für NEF defiziente HI-Viren, bei denen die Expression später viraler
Partikel allein von Rev-E1b 1-163, Wildtyp-Rev bzw. Rev-PKI in der NEF-Region
abhängt.
Als Problematisch bei der Klonierung der langen Plasmide war, dass die Plasmide bei
der Vermehrung in E.Coli manchmal rekombinierten. So fehlten teilweise große und
durchaus essentielle Plasmidstücke. Solche Rekombinationen wurden durch Inkubation
der E.Coli bei nur 33°C vermieden. Um die Richtigkeit der Klonierung zu überprüfen
wurde der Bereich vom Rev Exon 2 über das ENV bis hin zum 5´LTR mit den Primern
5´Rev Seq, 5´gp120 Seq, 3´gp120 Seq, 5´Rev Mut Seq, 3´Env Seq, 3´Xho Seq, 5´Blp
Seq einer eingehenden Sequenzanalyse unterzogen.
41
Abb. 15 Übersicht zur Klonierungstrategie von pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 , pNL4-3 R- Rev und
pNL4-3 Rev-PKI
6.5 Transfektion der rekombinanten HIV-Vollgenom-Plasmide in
293T-Zellen
Um zu zeigen dass die Inaktivierung des Wildtyp Rev erfolgreich war und dass auch
funktionstüchtige Transportproteine anstatt NEF gebildet werden, wurden die proviralen
Plasmide pNL4-3 R-, pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 , pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-
42
PKI in 293T Zellen transfiziert. Es wurde der gleiche Ansatz wie zum Anfertigen von
Virusstocks verwendet. Bei den Ansätzen wurde die Menge an viralen p24 KapsidProtein gemessen. Um auch hier kleine Unterschiede in der Transfektionseffizienz
auszugleichen, wurde pBC12 ß-Gal mittransfiziert. Die p24-Titer wurden mit dem ßGal Kehrwert in Relation gesetzt.
Die Transfektion von pNL4-3 R- zeigte, dass die Ausschaltung von Wildtyp-Rev
erfolgreich war. Der p24 Titer im Überstand des Ansatzes war negativ. Es war kein
Unterschied im p24-Wert zur Negativkontrolle, bei der 10 µg pBS transfiziert wurden,
zu sehen. Über die ß-Galaktosidasewerte wurde sichergestellt, dass die Transfektion
erfolgreich war. Kotransfektionen von pNL4-3 R- und pF143 Rev führten zu positiven
Titern.
Die Produktion viraler Partikel verhielt sich bei den Klonen pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163,
pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 Rev-PKI folgendermaßen (Abb.16):
pNL4-3 R- Rev-E1b
1-163
197
pNL4-3 R- Rev
208000
pNL4-3 R- Rev-PKI
768000
10
100
1000
10000
100000
1000000
p24 Titer
Abb.16 p24 Titer der rekombinanten Viren nach Transfektion in 293T in Relation
zur Transfektionskontrolle( logarithmische Darstellung)
Die erhaltenen Werte wurden aus je zwei Ansätzen gemittelt. Analoge Ergebnisse
zeigten sich auch bei unterschiedlicher Menge an transfizierter DNA.
43
Diese Transfektionen zeigten, im Gegensatz zum CAT-Assay, eindeutig, dass Rev-E1b
im Kontext ganzer HIV Transporteigenschaften für virale mRNA aufweist. Der Titer
des pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 war zwar ungefähr um den Faktor tausend geringer als
der des pNL4-2 R- Rev, aber diese schwachen Werte konnten im sehr sensitiven p24
ELISA gut gemessen werden. Nach der Transfektion von pNL4-3 R- konnten im
unverdünnten Zustand des Überstandes keine positiven Werte gemessen werden. Im
Gegensatz dazu musste der Überstand von pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 noch 1/10
verdünnt werden, um in den messbaren Bereich des ELISA zu gelangen. Deshalb kann
man hier zweifelsfrei von einer schwachen Rev-Aktivität des Rev-E1b 1-163 ausgehen.
Die Proben aus den Überständen von pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI mussten
1/1000 verdünnt werden.
Wenn man die anderen beiden Klone betrachtet, so ist zu erkennen, dass im pNL4-3
Rev-PKI Ansatz ein um ca. 3,7-fach erhöhter Titer an p24, im Vergleich zu pNL4-3 RRev vorliegt. Wenn man hier das CAT-Assay Ergebnis mit der p24 Menge vergleicht
konnte man vermuten, dass kleinere Unterschiede im CAT-Assay große Differenzen bei
der Produktion später viraler Proteine nach sich ziehen.
6.6 Infektionsversuch von Jurkats mit NL4-3 R- Rev und NL4-3
Rev-PKI
Als Nächstes wurden dann jeweils 1x106 Jurkats in 3 ml Medium über Nacht mit
Virusstocks der Klone NL4-3 R- Rev , NL4-3 R- Rev-PKI und NL4-3, als
Positivkontrolle infiziert. Alle drei Ansätze enthielten die gleiche Menge an viralen
Partikeln bezogen auf den p24 Wert.
Am nächsten Tag wurden die infizierten Zellen abzentrifugiert und in 10 ml frischem
Medium resuspendiert. Die Zellen wurden dann für vier weitere Tage inkubiert. Direkt
nach dem Medienwechsel und am vierten Tag wurden Proben aus den einzelnen
Kulturen genommen und der p24 Titer in der Diagnostikabteilung ermittelt.
Das Wildtyp-Virus NL4-3 replizierte erwartungsgemäß in diesen vier Tagen stark. Der
p24 Wert des vierten Tages war um ein Vielfaches höher als der sehr kleine
Ausgangswert unmittelbar nach Medienwechsel.
Der Infektionsversuch mit den beiden Klonen NL4-3 R- Rev und NL4-3 R- Rev-PKI
war nicht erfolgreich. Es wurde kaum mehr p24 am vierten Tag als am ersten Tag
gemessen.
44
6.7 Elektroporation von Jurkats mit den rekombinanten HIV
Um die Probleme bei der Infektion der Jurkats besser überblicken zu können, wurden
Jurkats direkt mit den proviralen Plasmiden eletroporiert und für längere Zeit inkubiert.
In Abständen von drei Tagen wurden Proben aus den Kulturen entnommen.
Die erste Entnahme erfolgte am Tag nach Medienwechsel, also am zweiten Tag nach
Eletroporation. Nach jeder der Probenentnahme wurden 4 ml RPMI Medium durch
frisches ersetzt.
400
350
300
p24 Ag pg/ml
250
pNL4-3 R- Rev-PKI
pNL4-3 R- Rev
200
pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163
pNL4-3 R-
150
100
50
0
0
2
4
6
8
Abb. 17 p24 nach Elektroporation der Jurkats; t=0 entspricht Zeitpunkt des Medienwechsels
Auch nach Elektroporation von Jurkats werden bei allen drei proviralen Plasmiden
virale Partikel gebildet. Wie nach der Transfektion in 293T-Zellen hatte auch Rev-E1b
1-163 die mit Abstand die geringste Aktivität bezüglich der Produktion von späten
viralen Partikeln. Es ist mit dem sensitiven ELISA eine geringe Menge p24
detektierbar, wobei im Falle des pNL4-3 R- nichts gemessen wurde. Das Maximum
viraler Partikel in der NL4-3 R- Rev-E1b 1-163 Kultur wurde am vierten Tag gemessen.
45
Bei den anderen beiden Klonen lag das Maximum am ersten Tag. Ursache hierfür
könnte ein geringerer Zelltod aufgrund der geringen Expression viraler Proteine sein.
Wie nach der Transfektion in 293T Zellen sind mehr als doppelt so viele virale Proteine
in der NL4-3 R- Rev-PKI Kultur als in der Kultur von NL4-3 R- Rev. Eindeutig zu
sehen ist ein Abbruch in der Viruslast schon nach dem ersten Tag (Abb.17). Da nach
jeder Probenentnahme 40% des Mediums ausgetauscht wurden und auch die
Virusmengen nach dem ersten Tag um knapp die Hälfte abnahmen, lässt sich folgern,
dass nach dem ersten Tag die erfolgreich elektroporierten Zellen abgestorben sind und
dass keine Replikation in diesen Kulturen stattgefunden hat. Auszunehmen ist hier die
NL4-3 Rev-E1b 1-163 Kultur, hier fand der Zelltod anscheinend wegen der geringeren
Expression später statt.
Bei der Durchführung analoger Versuche mit dem Wildtyp pNL4-3 oder dem GFP
markierten pNL43 GFP, sah man ein steiles Wachstum über die ersten Tage hinweg.
Das Wachstum dauerte so lange an, bis nahezu alle Jurkats abgestorben waren. Dann
war auch bei diesen beiden Klonen unter dem Mikroskop ein zytopathischer Effekt bei
vielen Zellen zu sehen. Bei den anderen Klonen war kaum ein Unterschied zu nicht
transfizierten Zellen auszumachen.
6.8 Klonierung von pNL4-3 Rev-PKI und pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI
Um die Ursache für das Nicht-Replizieren der Klone pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163, pNL43 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI zu ergründen wurden noch zwei weitere
rekombinante HIV kloniert. Als Transportprotein wurde in den folgenden Klonen nur
noch Rev-PKI benutzt.
pNL4-3 Rev-PKI
Dieser HIV-Klon, basierend auf pNL4-3, enthält in der NEF Region dieselbe Kassette
mit Rev-PKI wie pNL4-3 R- Rev-PKI. Einkloniert wurde sie über BlpI und XhoI. Der
Klon pNL4-3 Rev-PKI trägt jedoch nicht die Rev- Mutation im Rev Exon 2. Die RevPKI Kassette im NEF ist bei den beiden HI-Viren, pNL4-3 R- Rev-PKI und pNL4-3
Rev-PKI
identisch.
Das
Plasmid
pNL4-3
Rev-PKI
trägt
folglich
zwei
Transportproteine; erstens das Wildtyp Rev und zweitens Rev-PKI anstatt NEF.
Sollten die Mutationen im Rev Exon2 entgegen der Aussage mehrerer Publikationen
doch die Funktion von Tat beeinträchtigen, so ist bei pNL4-3 Rev-PKI eine bessere
Replikation zu erwarten als bei pNL4-3 R- Rev-PKI.
46
Außerdem wurde durch das Einklonieren von Rev-PKI über BlpI und XhoI keine
Schnittstelle im Envelope verwendet. Sollten also bei der Klonierung von pNL4-3 RRev-E1b 1-163, pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI trotz sorgfältiger
Sequenzierung Mutationen im Envelope entstanden sein, so müsste pNL4-3 Rev-PKI
ebenfalls replizieren.
Bei Fehlern in der Rev-PKI Kassette würden sowohl pNL4-3 R- Rev-PKI als auch
pNL4-3 Rev-PKI nicht replizieren.
pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI
Damit die Auswirkungen des nicht vorhandenen Nef der Klone besser untersucht
werden konnten, wurde ein provirales Plasmid kloniert, bei dem Nef und Rev-PKI über
ein IRES Element zugleich exprimiert werden. Als Ausgangsplasmid diente pNL4-3 NI-GFP, bei dem Nef und GFP über das IHRES-Element gekoppelt, gemeinsam gebildet
werden. Über die Schnittstellen HpaI und XbaI wurde Nef, das IHRES-Element, GFP
und der 3´LTR in einem Stück aus diesem Plasmid ausgeschnitten und über die gleichen
Schnittstellen in den Hilfsvektor pc3p53 subkloniert. Im erhaltenen Konstrukt pc3p53
N-I-GFP-LTR wurde dann GFP-LTR mit NheI und XbaI ausgeschnitten. GFP samt
3´LTR wurde dann durch Rev-PKI-LTR über vorherige Schnittstellen ersetzt. Ergebnis
hieraus war pc3p53 N-I-Rev-PKI-LTR. Der Abschnitt welcher Nef, das IRES-Element,
Rev-PKI und 3´LTR enthält, wurde wieder über HpaI und XbaI zurückkloniert in ein
Rev defizientes HIV Plasmid. Es entstand das provirale Plasmid pNL4-3 R- N-I-RevPKI.
47
Abb. 18 Plasmidkarte pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI
Nach Transfektion in 293T Zellen lieferte pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI fast gleich viele
virale Partikel wie pNL4-3 R- Rev-PKI. Dies war der Beweis dafür, dass auch
funktionsfähiges Rev-PKI nach der Koppelung über das IRES Element an NEF gebildet
wird.
Um die Expression von NEF zu überprüfen wurde NEF im Zellysat nach Transfektion
von pNL4-3, pNL4-3 GFP, pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI und pNL4-3 R- Rev-PKI in 293T
mittels Westernblot detektiert. Als primärer Anitkörper diente Patientenserum, welches
speziell auf NEF Antigenität hin getestet wurde.
48
Abb.19 Westernblot
zur Nef Detektion
Im Westernblot waren keine 27 kDa Banden bei den Klonen zu sehen, bei denen NEF
durch Rev-PKI bzw GFP ersetzt wurden. Bei Klonen NL4-3 und NL43 R- N-I-RevPKI
wurde eine NEF Bande detektiert. Die Transfektion und der Westernblot von pNL43 RN-I-RevPKI bewiesen, daß die Expression von Rev-PKI und NEF verbunden über IRES
funktioniert.
6.9 Infektionsversuch mit pNL4-3 Rev-PKI und pNL4-3 R- N-IRev-PKI
Es wurden Jurkats mit Überständen aus Transfektionen mit pNL4-3 Rev-PKI und
pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI infiziert. In den Kulturen konnte über mehrere Tage hinweg
kein steigender p24 Titer gemessen werden. Auch Veränderungen an Parametern wie
z.B. Menge der viralen Partikel, Zellzahl und auch Infektionsversuche mit anderen CD4 positiven Zelllinien zeigten kein Replizieren der Klone. Der als Positivkontrolle
mitgeführte NL4-3 replizierte in allen Ansätzen.
6.10 ß-Gal Test mit pNL4-3 GFP, pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI, pNL4-3
Rev-PKI und pNL4-3 R- Rev-PKI
Der ß-Gal Test mit den Klonen pNL4-3 GFP, pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI, pNL4-3 RevPKI und pNL4-3 R- Rev-PKI soll Hinweise darauf geben ob, das Envelope vollständig
ist und ob die Viren integrationsfähige RNA tragen.
49
Es wurden P4-R5-MAGI Zellen der gleichen Menge an viralen Partikeln infiziert.
Außerdem wurden noch provirale Plasmide mit pVSVG kotransfiziert. So entstanden
im Überstand pseudotypisierte HI-Viren. Damit wurden ebenfalls P4-R5-MAGI Zellen
infiziert. Als Positivkontrolle wurde pNL4-3 GFP verwendet.
4,50
4,00
4,00
3,98
4,00
3,81
3,71
3,50
Infektiosität
3,00
2,50
2,00
1,50
1,13
1,00
0,68
0,50
0,25
0,17
0,17
0,00
t
er
w
er
Le
KI
I
KI
-P
ev
R
K
-P
ev
-R
R
-P
ev
R
FP
-I-N
R
G
mit VSVG
-3
L4
pN
-3
L4
pN
-3
L4
pN
-3
L4
pN
ohne VSVG
Abb. 20 ß-Gal Test zur Infektiositätsmessung
Im ß-Gal Test zeigte sich dass NL4-3 R- Rev PKI kaum infektiös ist. NL4-3 Rev-PKI
und NL4-3 R- N-I-Rev-PKI liegen zwar etwas höher als NL 4-3 R- Rev-PKI, aber die
Infektiosität ist gegenüber NL4-3 GFP immer noch stark verringert. Die höheren ß-GalWerte von NL4-3 Rev-PKI und NL4-3 R- N-I-Rev-PKI lassen sich eventuell auf das
Nef-Protein bzw. die fehlende Tat Mutation zurückführen.
Die pseudotypisierten Klone erreichten alle etwa gleich hohe Werte in diesem Test. Ist
das Envelope intakt und kann die virale RNA in das Wirtsgenom integrieren, so sind
sind die Werte mit und ohne VSVG gleich hoch, wie es bei der Positivkontrolle der Fall
war. Die gute Infektiosität der pseudotypisierten Viren im Gegensatz zu den nicht
pseudotypisierten lässt auf einen Defekt im Envelope bei funktionierender Integration
ins Wirtgenom schließen.
50
7 Diskussion
Die Betrachtung der Fusionsproteine Rev –GFP, Rev/E1B-GFP und Rev/PKI-GFP
unter dem Fluoreszenzmikroskop deutet auf ein Zusammenspiel von NES, NLS und
Rev bindenden Strukturen im Zellkern (Stauber et al., 1995, Leo Luznik et al., 1995,
Fornerod et al., 1997) hin.
Bei Vorhandensein eines relativ langsamen NES z.B. E1B oder Rev überwiegen die
Rev bindenden Faktoren, so dass es zu einer Akkumulation der Fusionsproteine im
Kern kommt. Erst unter Zugabe von Actinomycin D, welches die nukleolären Rev
bindenden Strukturen blockiert (Stauber et al., 1995, Kalland et al., 1994, Meyer et
Malim, 1994 Richard et al., 1994), ist eine Verschiebung der „langsamen“
Fusionsproteine in das Zytoplasma zu erkennen. Dass die Migration von Rev/E1B-GFP
wesentlich länger dauert und bei genauer Betrachtung unvollständiger vonstatten geht
als bei Rev-GFP, deckt sich mit den Ergebnissen aus der Veröffentlichung von Rosorios
et al., 1999 und Heger et al., 2001, welche eine dreifach längere Migrationszeit in das
Zytoplasma des Proteines E1B-GFP nach Mikroinjektion in den Zellkern beschreiben.
Der
limitierende
Berücksichtigung
Faktor
oben
für
die
genannter
„Shuttlegeschwindigkeit“
Ergebnisse
bei
den
scheint
beiden
unter
langsamen
Tranportproteinen das NES zu sein. Erst unter Ausschaltung Rev bindender Faktoren,
welche den Export zu bremsen scheinen, überwiegen die Exportfaktoren.
Eine einfache Diffusion der Rev-GFP Konstrukte ist aufgrund der Molkekülgröße von
GFP ausgeschlossen (Stauber et al., 1999).
Bei Betrachtung der Lokalisation von Rev/PKI-GFP nach Transfektion ist von einem
Übergewicht
des
schnelleren
Exportes
auszugehen.
Das
Exportsignal
weist
anscheinend stärkere Affinität zu Transportkomplexen mit z.B. CRM –1 auf, als an die
Rev bindenden Faktoren im Zellkern. Der limitierende Faktor des Rev/PKI Shuttlings
ist hier letztendlich der Kernimport.
Unter Gabe von Leptomycin B, welches mit u.a. den Exportfaktor CRM-1 besetzt, wird
die Bindung von Rev/PKI-GFP an Exportkomplexe verhindert (Claudia Elfgang et al.,
1999). Es kommt folglich zu einer Hemmung des Exportes. Rev/PKI-GFP häuft sich bei
gemindertem Export ebenso wie die beiden langsameren Transportproteine im Kern an.
Eine Manipulation der Shuttle–Geschwindigkeit ist durch einen Austausch der
Exportsignale
möglich.
Ob
tatsächlich
daraus
auch
eine
veränderte
51
Transportgeschwindigkeit für mRNAs resultiert, sollte durch die Tests mittels CATAssay geprüft werden.
Vergleichen kann man den Austausch der Exportsignale gut mit dem Tausch des
Motors eines Omnibusses. Der Omnibus kann so mit stärkerem Motor wesentlich
schneller fahren. Ob jedoch noch genügend Fahrgäste auf den beschleunigten Bus
aufspringen und mitfahren können ist fraglich. Ähnlich verhält es sich mit der Bindung
der mRNAs an das RRE des Rev.
Im CAT- Assay zeigt sich dass Rev- Proteine mit veränderten Exportsignalen auch
Auswirkungen auf den RNA Transport in das Zytoplasma haben.
Für Rev-PKI ergibt zwar eine deutlich höhere CAT-Menge als mit Rev. Jedoch fällt der
Unterschied nicht so stark aus wie der Vergleich der Exportgeschwindigkeiten in der
Veröffentlichung von Rosorius et al., 1999 und Heger et al., 2001. Hier wird die
Migrationszeit von GFP gekoppelten Exportsignalen vom Zellkern in das Zytoplasma
beschrieben. PKI(NES)-GFP verlässt das Zytoplasma ca. doppelt so schnell wie Rev
(NES)-GFP. Eine zu hohe Transfektionsrate in die exprimierenden Zellen wurde mit
entsprechenden Verdünnungen ausgeschlossen.
Unter Berücksichtigung des CAT-Assays scheint bei Rev/PKI-GFP die Anbindung von
RNA erschwert zu sein so dass nur eine mäßige aber signifikante CAT-Erhöhung
eintritt.
Im Gegensatz dazu ist im CAT-Assay keine Aktivität bezüglich des mRNA Transportes
für
Rev/E1B-GFP
nachweisbar.
Ein
„Untergehen“
von
einer
schwachen
Transportaktivität im Leerwert des Assays ist nicht auszuschließen.
Nach Klonierung der rekombinanten HI-Viren wurden Plasmide in 293 T–Zellen
transfiziert. Die Transfektion mit pNL4-3 R- ergab keine viralen Partikel ebenso wie
z.B. bei Zolotukhin et al., 1994 im Überstand. Kotranfektion mit Expressionvektor mit
Rev ergibt virale Partikel.
Danach erfolgte die Transfektion mit den rekombinanten Plasmiden pNL4-3 R- RevE1b 1-163 , pNL4-3 R- Rev und pNL4-3 R- Rev-PKI. Nach Transfektion der 293 TZellen mit den Plasmiden für oben genannte rekombinante HI-Viren sind im Überstand
für pNL4-3 R- Rev-PKI fast vier Mal so viele virale Proteine messbar. Auch das E1b
NES im Kontext kompletter proviraler Plasmide hat in diesem sehr sensitiven Versuch
eine geringe Aktivität. Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich nach Elektroporation von
Jurkats.
52
Es lässt sich folgern, dass der CAT-Assay zur Einschätzung der Aktivität von
Tranportproteinen insbesondere mit hoher Aktivität gut geeignet ist. Eine Einschätzung
von
Shuttleproteinen
mit
schwacher
Aktivität
ist
jedoch
aufgrund
der
„Hintergrundaktivität“ nicht möglich.
Einen zusätzlichen Einfluß auf die Proteinproduktion scheinen auch das Vorhandensein
von Spleißvorgängen und längeren mRNA Fragmenten zu haben. Im Zusammenhang
mit kompletten viralen Plasmiden ist es hier möglich die Proteinexpression um den
Faktor 5000 zu variieren, vergleicht man pNL4-3 R- Rev-E1b 1-163 und pNL4-3 RRev-PKI.
Ein Replizieren der rekombinanten HI Viren konnte nicht erreicht werden. Des
Weiteren waren die Überstände wie der ß-Gal Test zeigt nicht infektiös.
Als Ursache für das nicht Infizieren und Replizieren kommen prinzipiell folgende
Möglichkeiten in Frage.
1.) Die Mutation des Rev- beeinflusst die Funktion von Tat, was im Widerspruch zu
Zolotukhin et al., 1994, steht.
2.) Durch das Fehlen des Nef ist die Aktivität der Viren so stark herabgesetzt, dass
keine Replikation möglich ist. Dagegen spricht jedoch ein infektiöses pNL4-3,
welches GFP anstatt Nef exprimiert.
3.) Durch die Klonierung der Rev-Varianten wurde das Genom zu lang, so dass es nicht
vollständig im Kapsid transportiert wird und so der nächste Replikationszyklus nicht
möglich ist.
Zur Gegenprobe ob die Mutation zum Rev- einen Einfluss auf die Funkfähigkeit des Tat
hat, wurde das Plasmid pNL4-3 Rev PKI kloniert. Auch dieses zeigte nach Transfektion
virale Partikel im Überstand. Eine Infektion weiterer Zellreihen ist trotz vollständigem
Tat-Genom nicht erfolgt. Gegen die These des nicht funktionsfähigen Tat spricht auch
der positive ß-Gal-Test aller pseudotypisierten Klone.
Um gleichzeitig Nef und ein verändertes Rev, z.B. Rev- PKI im Kontext des gesamten
Virusgenoms zu exprimieren wurde das Konstrukt pNL4-3 R- N-I-Rev-PKI kloniert.
Auch dieses zeigt sich im ß-Gal Test nur minimal infektiös. Bei diesem Klon scheint
53
ein weiteres Problem die Länge des Genomes zu sein. Es ist fraglich in wie weit dies im
gebildeten Kapsid integrierbar ist.
Die Pseudotypisierung der rekombinanten HI Viren und nachfolgender Infektion im ßGal Test weisen auf einen Defekt des Kapsides der Klone hin.
Als weitere Ursache für das Fehlen der Replikation der rekombinanten Viren ist wie
schon oben diskutiert, die Überlänge des Genomes möglich. Dem widersprechend ist
jedoch das Funktionieren des NL4-3 GFP (Page et al., 1997;Lee et al.,1997).welcher
sogar ein längeres Genom als z.B. pNL4-3 R- Rev-PKI besitzt.
Ursächlich für das schlechte Infektionsverhalten der rekombinanten Viren könnte auch
der Einfluss auf das Spleißen durch die veränderten Transportproteine sein. Durch die
veränderte Transportkinetik könnte ein Missverhältnis zwischen essentiellen Proteinen,
welche aus mehrfach gespleißten mRNA bzw. nicht oder einfach gespleißten mRNA
hervorgehen, entstehen.
Diese Arbeit zeigt zum einen, dass es durch Transfektion GFP markierter
Transportproteine und anschließender Betrachtung unter dem Fluorezzenzmikroskop
sowie mit entsprechenender Zugabe von Hemmstoffen schnell eine orientierende
Aussage zur Migrationsgeschwindigkeit und auch zur Lokalisation getroffen werden
kann. Eine Beurteilung zur tatsächlichen Funktion ist jedoch nicht möglich.
Um das Funktionsverhalten zu konkretisieren kann der CAT-Assay verwendet werden.
Es zeigt sich jedoch, dass sehr schwache Aktivitäten nicht berücksichtigt werden. Ein
zuverlässiges Arbeiten des Assays scheint nur in einer gewissen Aktivitäts–Bandbreite
möglich.
Des Weiteren scheinen geringe Aktivitätsabweichungen im CAT-Assay ungleich höhere
Unterschiede im Kontext ganzer Plasmiden nach sich zu ziehen. Das zeigt die um den
Faktor 5000 höhere Menge an exprimierten Proteinen nach Transfektion von pNL4-3 RRev-E1b 1-163 bzw. pNL4-3 R- Rev-PKI.
Diese Arbeit hat nicht nur Möglichkeiten zur Aktivitätserfassung von Transportsignalen
bzw. Tranportproteinen dargestellt. Sie gibt auch einen Ausblick wie z.B. die
Expression bestimmter Proteine in zukünftiger Gentherapie reguliert werden kann. Im
54
Hinblick auf
das „Feintuning“ bei der Entwicklung therapeutischer Vektoren sind
derartige Ansätze nicht unerheblich.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist, dass es so möglich sein könnte, attenuierte
Impfviren herzustellen.
Auch eine Aktivitätssteigerung mit hoher Proteinexpression könnte bei AIDS hilfreich
sein, um eine apparente Immunantwort zu stimulieren. Bereits infizierte Patienten
könnten so z.B. während der apathogenen Phase „nachgeimpft“ werden, um länger
beschwerdefrei zu leben. Solch ein Impfstoff könnte so z.B. für die dritte Welt relativ
kostengünstig produziert und vertrieben werden, auch wenn er kein perfektes
klassisches HIV-Vakzin darstellt.
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9 Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AIDS
Acquired Immunedeficency Syndrom
APS
Ammoniumpersulfat
ATP
Adenosin Triphosphat
ca.
circa
ß-Gal
ß-Galaktosidase
ß-ME
ß-Mercatptoenthanol
CAT
Chloracetyltransferase
CRM1
chromosome region maintenance 1
CMV
Cytomegalievirus
CPRG
Chloramphenicolrot-B-D-galaktopyranosid
CO2
Kohlendioxid
DMEM
Dulbeccos´s modified Eagle medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylen-Diamin-Tetraacetat
eIF-5A
eukaryoter Initiationsfaktor 5A
et al.
et alii
EtBr
Ethidiumbromid
evtl.
eventuell
FKS
fötales Kälberserum
g
Gramm
GFP
Green Fluorescent Protein
°C
Grad Celsius
GST
Glutathion-S-Transferase
GTP
Guanosin-5´-triphosphat
61
HEPES
Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure
HIV
Humanes Immundefizienz Virus
HRP
Horse Radish Peroxidase
HTLV
Humanes T-Zell Leukämie Virus
IRES
Internal Ribosome Binding Site
kb
Kilobasen
kD
Kilodalton
k
kilo
INS
Instabilitätselemente
l
Liter
LB
Luria-Bertani
LTR
Long Terminal Region
m
milli (10-3)
M
Molar
MEM
Modified Eagle medium
mRNA
messenger ribonucleic acid
NaCl
Natriumchlorid
NES
Nukleares Exit Signal
NLS
Nukleares Lokalisations Signal
pH
Negativer dekadischer Logarithmus der
Protonenkonzentration
PKI
Proteinkinase Inhibitor
PCR
Polymerasekettenreaktion
Rev
regulator of expression of virion
RNA
Ribonukleinsäure
RRE
Rev-responsive Element
SDS
Natriumdodecylsulfat
TAE
Tris-Acetat-EDTA Puffer
TEMED
Tetramethylendiamin
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
μ
mikro (10-6)
(v/v)
Volumen pro Volumen
(v/w)
Volumen pro Masse
UV
ultraviolett
62
WHO
World Health Organizantion
z.B.
zum Beispiel
Aminosäuren Einbuchstaben Code
Alanin
A
Valin
V
Arginin
R
Leuzin
L
Asparaginsäure
D
Methionin
M
Glutamin
Q
Prolin
P
Glycin
G
Threonin
T
Isoleuzin
I
Glutaminsäure
E
Lysin
K
Histidin
H
Phenylalanin
F
Asparagin
N
Serin
S
Cystein
C
Tyrosin
Y
Tryptophan
W
63
10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
Heger P, Lohmaier J, Schneider G, Schweimer K, Stauber R. (2001)
Qualitative highly divergent nuclear export signals can regulate export by the
competition for transport cofactors in vivo. Traffic. 2:544-55.
Nach Mikroinjektion in den Zellkern zeigen unterschiedliche GFP markierte,
leucinreiche, Exportsignale stark unterschiedliche Kinetiken bei der Migration in das
Cytoplasma. Eine Einteilung anhand ihrer Migrationsgeschwindigkeit ist so möglich.
Starke Exportsignale weisen eine höhere Affinität zu CRM1 auf. Stärkere Exportsignale
inhibieren die Funktion schwächerer.
Rev-GFP Fusionproteinen lagern nukleolär an. Fusionsproteine aus Rev-GFP und
einem PKI-NES lokalisieren hingegen im Cytoplasma.
Nach Behandlung mit
Leptomycin B, welches den Kernexport hemmt, akkumuliert das Fusionprotein RevGFP mit PKI-NES nukleolär.
64
11 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Fleckenstein danke ich für die Durchführung meiner Promotionsarbeit
am Institut für Klinische und Molekulare Virologie der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg.
Für die hervorragende Betreuung meiner Promotionsarbeit danke ich Herrn Prof. Dr.
Stauber. Gerne denke ich an diesen Abschnitt meines Studiums zurück.
Frau Grit Schneider danke ich ebenfalls für die stets freundliche, tatkräftige
Unterstützung. Bei vielen praktischen Fragestellungen war sie mir eine große Hilfe.
Auch meiner Kollegin Tanja Dosch mit ihrer Freundlichkeit und ihrem Teamgeist
danke ich sehr.
Für die gute Zusammenarbeit und Unterstützung danke ich dem Labor Hauber und
Kirchhoff. Besonderer Dank gilt hier Frau Dr. Shirley Knauer für die vielen guten
Ratschläge und kleinen Tipps.
Dank gilt der Unterstützung dieser Arbeit durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft,
die Johannes und Frieda Marohn-Stiftung und die Wilhelm-Sander-Stiftung.
65
12 Lebenslauf
Name:
Jens Leonhard Lohmaier
Geburtstag,
Geburtsort:
2. Juni1975 in Erlangen, Deutschland
Familienstand:
verheiratet
Schulbildung:
1982 - 1986
Grundschule
1986 - 1995
Gymnasium in Herzogenaurach – Abitur,
Abschluß 1,6
Zivildienst:
1995 - 1996
„Aurachwerkstatt”, Behindertenwerkstatt
in Herzogenaurach
Studium:
WS 1996 bis
22.Mai 2003
Humanmedizin an der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg,
Abschluß 2,3 „gut” am 22.5.2003
Promotionsarbeit:
1999 bis 2003
Experimentelle Arbeit am Institut für Klinische und
Molekulare Virologie in Erlangen:
„Funktionelle Analyse des HIV-1 Rev-Proteins
mit heterologen Exportsignalen.“
66
Praktisches Jahr:
22. April bis 9. August 2002
Kantonsspital Münsterlingen (CH), Chirurgie
12. August bis 29. November 2002
Univeristätsklinik Erlangen, Innere Medizin
2. Dezember 2002 bis 21. März 2003
Kantonsspital Aarau (CH), Orthopädie
Arzt im Praktikum:
1. Juni 2003 bis 30. September 2004
Orthopädie und Wirbelsäulenchirurgie
Bathildis Krankenhaus Bad Pyrmont
Assistenzarzt:
1. Oktober 2004 bis 31. Mai 2006
Orthopädie und Wirbelsäulenchirurgie
Bathildis Krankenhaus Bad Pyrmont
ab 1. Juni 2006
Franziskushospital Bielefeld Ausbildung zum
Facharzt für Orthopädie und Unfallchirurgie
26.Juni 2010
Facharzt Orthopädie und Unfallchirurgie