Kapitel 7 Lichtmikroskopie

Kapitel 7: LICHTMIKROSKOPIE
Inhalt:
EINLEITUNG .............................................................................................................................. 77
ABBILDUNG DURCH SPHÄRISCHE LINSEN ...................................................................................... 80
LUPE ........................................................................................................................................ 85
EINFACHES, ZUSAMMENGESETZTES MIKROSKOP ............................................................................. 86
MODERNE MIKROSKOPISCHE VERFAHREN .................................................................................. 104
LITERATUR .............................................................................................................................. 108
LINKS ..................................................................................................................................... 109
Einleitung
Ausbreitung des Lichts
Sofern Beugungs- und Interferenzerscheinungen keine Rolle spielen, kann man die
Ausbreitung des Lichts rein geometrisch darstellen. Ein leuchtender Punkt L wird unmittelbar
gesehen, wenn die von ihm ausgehenden Strahlen ohne Änderung der Richtung in das Auge
fallen. Der Sinneseindruck beruht auf dem Einfall divergierender Strahlen in die Pupille, die
auf der Netzhaut fokussiert werden (Abb. 39).
Abb. 39: Unmittelbares Sehen
Wird der Gegenstand L durch eine Sammellinse als Bild B abgebildet, dann sehen wir den
Gegenstand dort, von wo aus die Strahlen zu divergieren scheinen. Dieses reelle Bild kann
man mit einem Schirm sichtbar machen (Abb. 40).
Abb. 40: Reelles Bild
Betrachtet man den Gegenstand L über einen Spiegel, dann existiert der Divergenzpunkt Bv
nur scheinbar, dieses virtuelle Bild kann nicht mit einem Schirm sichtbar gemacht werden
(Abb. 41).
77
LICHTMIKROSKOPIE
Abb. 41: Virtuelles Bild
Sehwinkel
Um an einem Gegenstand feine Einzelheiten erkennen zu können, muss man nahe an ihn
herangehen. Eng nebeneinander liegende Details sind nur aus der Nähe voneinander zu
unterscheiden, während sie aus größerer Entfernung betrachtet scheinbar miteinander
verschmolzen sind (Beispiel: Text aus 25 cm bzw. 2 m Abstand). Nebeneinander liegende
Punkte, die getrennt wahrgenommen werden, bezeichnet man als aufgelöst. Die Auflösung
wird umso besser, je näher das Objekt vor dem Auge liegt. Je geringer der Abstand zwischen
Gegenstand und Auge ist, desto größer wird der Sehwinkel σ, der also der Auflösung direkt
proportional ist. Den Sehwinkel σ erhält man, wenn man die beiden Enden des beobachteten
Gegenstandes mit der Mitte der Augenpupille verbindet (siehe Abb. 42). Durch die begrenzte
Akkomodationsfähigkeit des menschlichen Auges ist es aber nicht möglich, beliebig feine
Einzelheiten durch immer stärkere Annäherung aufzulösen.
σ1
σ2
Abb. 42: Sehwinkel σ in Abhängigkeit vom
Abstand zwischen Gegenstand und Auge
Bezugssehweite und Auflösung des menschlichen Auges
Zur Entstehung eines scharfen Bildes muss man also eine bestimmte Mindestentfernung
zwischen Gegenstand und Auge einhalten. Diese Mindestentfernung ist aber nicht bei allen
Menschen gleich, sondern hängt von den Eigenschaften der Augen und vom Lebensalter ab.
Bei Kindern und Kurzsichtigen ist sie am kleinsten, nimmt im Laufe des Lebens zu und
78
BIOPHYSIK DER ZELLE
erreicht bei Weitsichtigen ihr Maximum. Daraus ergibt sich eine Vielzahl von
Mindestentfernungen, aus der ein Durchschnittswert ermittelt wurde. In einem Abstand von
25 cm ist die Mehrzahl der Erwachsenen in der Lage, ein Objekt längere Zeit ohne besondere
Anstrengung gerade noch scharf zu sehen. Diese Strecke wurde als kürzeste durchschnittliche
Betrachtungsentfernung festgelegt und wird als konventionelle Sehweite oder
Bezugssehweite bezeichnet. Das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges beträgt bei
Betrachtung des Objektes aus konventioneller Sehweite 0,15 - 0,3 mm, d.h. Einzelheiten, die
0,15 - 0,3 mm auseinanderliegen werden noch aufgelöst. Dies entspricht einem Sehwinkel σ
von 2′ - 4′ (physiologischer Grenzwinkel). Da man aus physiologischen Gründen mit dem
bloßen Auge den Sehwinkel nicht vergrößern kann, benutzt man Glaslinsen zur Steigerung
der Vergrößerung (s.u.).
Brechungsindex
Ein Lichtstrahl, der zunächst in Luft verläuft, ändert beim Eindringen in ein Medium mit
anderem Brechungsindex, z.B. Glas, seine Verlaufsrichtung. Man sagt, er wird `gebrochen`.
Diese Lichtbrechung lässt sich berechnen, wenn man senkrecht zur Glasoberfläche durch den
Punkt, in dem der Strahl ins Glas eindringt, eine Gerade zeichnet. Strahl und Lot bilden dann
einen Winkel (Einfallswinkel in der Luft), der größer ist als der Austrittswinkel im Glas. Für
gleichen Übertritt ist jedem Einfallswinkel ein bestimmter Austrittswinkel zugeordnet, der
Proportionalitätsfaktor n bleibt dabei stets gleich:
sin α
sin β
=
=n
sin α ′ sin β ′
nD = 1,33
α
nD = 1,515
α'
Abb. 43: Brechung in unterschiedlichen Medien
Die dimensionslose Zahl n wird als Brechungsindex oder Brechzahl bezeichnet, ihr Wert
hängt ab von der Art des Stoffes, in den das Licht aus der Luft kommend übertritt und von der
Wellenlänge des Lichtes ( Dispersion, blaue Strahlen werden stärker gebrochen als rote). Will
79
LICHTMIKROSKOPIE
man die Brechungsindizes verschiedener Stoffe miteinander vergleichen, muss man Licht
gleicher Wellenlänge benutzen, im Allgemeinen die gelbe Strahlung von
Natriumdampflampen, deren Farbton mit dem Buchstaben D gekennzeichnet ist (nD ;λD = 580
nm).
Beispiel: nD Wasser = 1,33; nD Luft = 1,00; nD Öl = 1,515
Die Brechungsindizes unterschiedlicher Stoffe sind verschieden, daher muss der
Brechungsindex n durch das Verhältnis der Brechungsindizes der beteiligten Stoffe ersetzt
werden. Wenn beispielsweise ein Lichtstrahl nicht aus der Luft, sondern aus Wasser
kommend in Glas eindringt, lautet die Formel:
n D Glas
sin α
=
sin α ′ n D Wasser
n D Wasser sin α = n D Glas sin α ′
oder allgemein (Snelliussches Brechungsgesetz):
n sin α = n ′ sin α ′
Abbildung durch sphärische Linsen
Die Brechung von Lichtstrahlen an Glas ermöglicht die vergrößernde oder verkleinernde
Abbildung von Gegenständen. Glaslinsen, die entweder als Sammel- oder als
Zerstreuungslinsen geschliffen werden, können einzeln (Lupe = Sammellinse) oder in
Kombination (Mikroskop, Photoapparat) zur Abbildung benutzt werden.
Sphärische Linsen
1. Sammellinsen (sind in der Mitte dicker als am Rand)
2. Zerstreuungslinsen (sind in der Mitte dünner als am Rand)
80
BIOPHYSIK DER ZELLE
Kenngrößen sphärischer Linsen
Mit rein geometrischer Behandlung der Lichtstrahlen lässt sich eine Abbildung durch
Sammellinsen konstruieren, wofür auf der einen Seite der Linse ein Gegenstandsraum und
auf der anderen Seite ein Bildraum definiert werden (Abb. 44).
Auf jeder Seite einer ideal dünnen (symmetrischen) Sammellinse liegt ein Brennpunkt (F und
F') in gleicher Entfernung von der Mittelebene (M) der Linse auf der optischen Achse. Diese
Entfernung entspricht der Brennweite (f = f ') der Linse. Die beiden Hauptebenen H und H'
der Linse sind für ideal dünne Linsen identisch mit der Mittelebene.
Abb. 44: Abbildung durch eine Sammellinse
Geometrisch-optische Betrachtung
Bei Sammellinsen verläuft die Brechung so, dass sich alle parallel zur optischen Achse
einfallenden Lichtstrahlen in einem Punkt, dem Brennpunkt, treffen.
Für ideale, dünne Linsen soll gelten:
81
LICHTMIKROSKOPIE
H = H' = M; n = n'; f = f'; Strahlen werden nur an M gebrochen.
Bei Zerstreuungslinsen sind F und F' vertauscht; die Brennweite erhält ein negatives
Vorzeichen. Vernachlässigt man alle Linsenfehler (s.u.), so besteht zwischen Bildweite b,
Gegenstandsweite g und Brennweite f die Beziehung:
1 1 1
= +
f g b
Woraus sich für die Brennweite ergibt:
f =
gb
g+b
Im Falle dünner Linsen stimmen g und b näherungsweise mit den Abständen von Gegenstand
und Bild von der Mittelebene überein. Berücksichtigt man, dass die Summe g + b = l
(Abstand zwischen Bild und Gegenstand) ist, dann erhält man für dünne Linsen die
Beziehung:
f =
g (l - g )
l
Abb. 45: Abbildung durch eine Zerstreuungslinse
Der Abbildungsmaßstab m dünner Linsen ergibt sich aus dem Quotient von Bildgröße zu
Gegenstandsgröße und ist gleich dem Verhältnis von Bildweite zu Gegenstandsweite:
m=
B b
=
G g
Der Abbildungsmaßstab oder auch Maßstabszahl bezieht sich also auf die Abbildung reeller
Bilder. Die Vergrößerung dagegen hängt von der Sehweite ab: man spricht von x-facher
82
BIOPHYSIK DER ZELLE
Vergrößerung, wenn die Linse als Lupe wirkt (s.u.). Der Kehrwert der Brennweite (1 / f) wird
als Brechkraft der Linse bezeichnet. Die zugehörige Einheit ist die Dioptrie (dptr).
Es gilt: 1dptr = 1m-1. Ein positives Vorzeichen vor der Dioptriezahl deutet auf eine
Sammellinse hin, ein negatives Vorzeichen auf eine Zerstreuungslinse.
Bildkonstruktion
Im Idealfall bewirkt eine Linse, dass alle Strahlen, die von einem Gegenstandspunkt P
ausgehen und durch sie hindurchtreten, sich im zugehörigen Bildpunkt P' schneiden. Aus der
Vielzahl dieser Strahlen greift man die heraus, deren Verlauf leicht zu konstruieren ist.
Parallelstrahl
verläuft von P bis M parallel zur optischen Achse; wird
an M durch F' gebrochen
Brennstrahl
verläuft bis M auf der Geraden PF; nach M ist er parallel
zur optischen Achse
Mittelpunktstrahl geht ungebrochen durch den Mittelpunkt der Linse
Der Schnittpunkt dieser drei Strahlen ist Schnittpunkt aller von P ausgehenden Strahlen und
somit der Bildpunkt P'. Entsteht das Bild in Richtung des abbildenden Lichtes hinter der Linse,
so lässt es sich auf einem Schirm auffangen und wird als reell bezeichnet. Liegt der Bildort vor
der Linse oder in einem Linsensystem, so entstehen sogenannte virtuelle Bilder. Sie lassen sich
nicht auf einem Schirm auffangen. Die Bildweite erhält ein negatives Vorzeichen. Virtuelle
Bilder können einem reell abbildenden System als Gegenstand dienen (z.B. das Auge als reell
abbildendes System macht aus dem virtuellen Bild, das eine Lupe erzeugt, ein reelles Bild auf
der Netzhaut).
Bei zusammengesetzten Linsensystemen erfolgt die grafische Bildkonstruktion sukzessiv. Das
Bild, das von der dem Gegenstand am nächsten stehenden Linse entworfen wird, dient der
nächsten Linse als Gegenstand; es wird als Zwischenbild bezeichnet. Für die
Gesamtbrennweite eines Systems aus 2 dünnen, idealen Linsen gilt:
1 1
1
d
= +
−
f f1 f 2 f1 f 2
d = Abstand der Mittelebene der beiden Linsen
Abbildungen durch Sammellinsen
Sammellinsen sind zur Abbildung von Gegenständen geeignet, wobei die Entfernung
zwischen Gegenstand und Linse wichtig ist. Wenn man für diese Strecke die Brennweite der
83
LICHTMIKROSKOPIE
Linse als Maßeinheit wählt, ergeben sich allgemein gültige Aussagen, wobei drei wichtige Fälle
zu unterscheiden sind.
Abb. 46: Abbildung von Gegenständen durch eine
Sammellinse
Die mit 1, 2 bzw. 3 gekennzeichneten Pfeile stellen die Gegenstände dar, die mit 1', 2' bzw. 3'
bezeichneten Pfeile die zugehörigen Bilder. Liegt der Gegenstand in einem Abstand von mehr
als zwei Brennweiten vor der Linse, wird er verkleinert, seitenverkehrt und reell abgebildet.
Dabei rückt sein Bild immer näher an die hintere Brennebene heran, wenn sich der
Gegenstand selbst weiter von der Linse entfernt. Diese Eigenschaft der Sammellinsen wird bei
Photoapparaten benutzt, um Gegenstände aus relativ großer Distanz seitenverkehrt und
verkleinert auf den Film abzubilden (Pfeil 1).
Ist der Gegenstand in einer Entfernung von mehr als einer und weniger als zwei Brennweiten
vor der Linse angeordnet, entsteht wiederum ein reelles und seitenverkehrtes, jetzt aber
vergrößertes Bild. Diesen Fall finden wir bei Projektoren und photographischen
Vergrößerungsgeräten verwirklicht (Pfeil 2).
Befindet sich der Gegenstand innerhalb der vorderen Brennweite der Linse, entsteht ein
vergrößertes und seitenrichtiges virtuelles Bild. Dazu kommt es, wenn eine Sammellinse als
Lupe benutzt wird (Pfeil 3).
Linsenfehler
Eine Sammellinse bildet Gegenstände in Wirklichkeit nicht so störungsfrei ab, wie es Abb. 46
zeigt, denn die einzelnen Spektralfarben werden verschieden stark abgelenkt (s. Brechung)
und die Lichtbrechung ist in den äußeren Zonen einer Sammellinse stärker als in der Mitte.
Deswegen wird ein Gegenstand von einer einzelnen Linse nicht naturgetreu, sondern mehr
oder weniger verzerrt abgebildet. Man spricht von Linsenfehlern, die zu charakteristischen
Abbildungsfehlern führen.
Sphärische Aberration:
84
achsennahe und achsenferne Parallelstrahlen werden zu
verschiedenen Brennpunkten hin gebrochen.
BIOPHYSIK DER ZELLE
Chromatische Aberration:
blaue Strahlen werden stärker gebrochen und schneiden die
optische Achse eher als rote.
Chromatische
Vergrößerungsdifferenz:
weil blaue Strahlen stärker gebrochen werden, bilden sie
einen Gegenstand kleiner ab als rote.
Astigmatismus:
die Linse ist nicht achsensymmetrisch, sie hat in zwei
zueinander
senkrechten
Richtungen
verschiedene
Brennweiten.
Bildfeldwölbung:
das Bild eines ebenen Gegenstandes liegt nicht auf einer
Ebene, sondern auf einer gewölbten Fläche.
Verzeichnung:
eine quadratische Fläche wird kissen- oder tonnenförmig
abgebildet.
Die Korrektur dieser Linsenfehler gelingt teilweise durch Kombination mehrerer, verschieden
geformter Linsen aus unterschiedlichen Glassorten.
Lupe
Das einfachste Instrument zur Vergrößerung des Sehwinkels ist die Lupe. Sie besteht aus einer
Linse (oder einem Linsensystem), deren Brennweite kürzer als die Bezugssehweite ist. Der
Gegenstand muss sich zwischen der Sammellinse und ihrem vorderen Brennpunkt befinden
(Abb. 46 Pfeil 3), das Auge beobachtet in der hinteren Brennebene der Lupe. Damit das Auge
entspannt bleibt, benutzt man die Lupe sinnvollerweise so, dass das Bild im Unendlichen
entsteht. Dazu muss der Gegenstand genau in der vorderen Brennebene der Lupe liegen.
Um die Lupenvergrößerung zu bestimmen, nimmt man an, dass Gegenstand und Bild in
konventioneller Sehweite - also 250 mm vom Auge entfernt - liegen und bildet das Verhältnis
aus den Tangenswerten der beiden Sehwinkel, unter denen Gegenstand und Bild gesehen
werden. Da die Lupe ein virtuelles Bild vom betrachteten Gegenstand entwirft, werden nicht
Strecken, sondern die Sehwinkel miteinander verglichen. Ihr Quotient ist auch dem
Verhältnis von scheinbarer Größe des Bildes B zu Gegenstandsgröße G gleich und heißt
Lupenvergrößerung V:
tan β =
V=
B
250
tan σ =
G
250
tan β B
=
tan σ G
wenn g = f, dann gilt : tan β =
tan β
G/ f
=
tan σ G/ 250
250
⇒V=
f
G
f
⇒
85
LICHTMIKROSKOPIE
Man erhält also die Lupenvergrößerung V, indem man die konventionelle Sehweite durch die
Brennweite der Linse dividiert.
Abb. 47: Sammellinse als Lupe
Einfaches, zusammengesetztes Mikroskop
Ein Mikroskop kann man als Kombination eines Diaprojektors mit einer Lupe beschreiben.
Der Diaprojektor entwirft von einem Diapositiv auf eine transparente Projektionswand ein
vergrößertes, umgekehrtes und seitenverkehrtes Bild. Dieser Teil der Abbildung entspricht der
ersten Vergrößerungsstufe im Mikroskop mit dem Projektionsschirm als Zwischenbildebene
und dem Diapositiv als Präparat. Dieses Bild auf der Projektionswand kann seinerseits noch
vergrößert werden, wenn man das durchscheinende Bild hinter der Projektionswand mit
einer Lupe betrachtet. Diese nochmalige Vergrößerung bezeichnet man als zweite
Vergrößerungsstufe im Mikroskop. Die Aufgabe der Lupe übernimmt im Mikroskop das
Okular. Das Auge entwirft schließlich auf der Netzhaut das endgültige Bild.
86
BIOPHYSIK DER ZELLE
Bauteile des Mikroskops
Abb. 48: Durchlicht-Mikroskop.
Je nach Grad, in dem bestimmte Abbildungsfehler herabgemildert sind, werden die
Mikroskopobjektive in fünf Klassen eingeteilt, die sowohl Trocken- als auch
Immersionsobjektive umfassen.
•
Achromate: Farbfehler Korrektur (rot und blau)
•
Apochromate: Farbfehler Korrektur für 3 Spektralfarben
•
Fluoritobjektive: Farbfehler Korrektur besser als für Achromate, aber schlechter als für
Apochromat
•
Planchromate: Korrektur der Bildfeldwölbung
•
Planapochromate: Korrektur von Bildfeldwölbung und für 3 Spektralfarben
Auf allen Mikroskopobjektiven sind zusätzlich Angaben zu physikalischen Parametern
angebracht. So bedeutet die Gravur
40 / 0.65
170 / 0,17
dass es sich um ein Trockenobjektiv mit der Maßstabszahl (Vergrößerung) M = 40 und der
numerischen Apertur 0.65 handelt. Ferner ist ersichtlich, dass es für eine mechanische
Tubuslänge von 170 mm und für ein Deckglas der Dicke 0,17 mm ausgelegt ist. Die
mechanische Tubuslänge gibt die Entfernung zwischen dem oberen Tubusrand und der
Anschraubfläche des Objektivs an (immer konstant!). Die optische Tubuslänge gibt die
Entfernung zwischen der hinteren Brennebene des Objektivs und der vorderen Brennebene
des Okulars an. Das Deckglas ist rein rechnerisch ein Bestandteil des Objektivs. Bei
Immersionsobjektiven (Abb. 49) wird die Frontlinse und die Präparatoberfläche mit einem
87
LICHTMIKROSKOPIE
Medium verbunden, das einen höheren Brechungsindex als Luft aufweist (Öl, Wasser,
Glyzerin). Dadurch können Lichtstrahlen mit einem größeren Einfallswinkel noch zur
Abbildung
beitragen
(höhere
numerische
Apertur,
dadurch
auch
höheres
Auflösungsvermögen).
Abb. 49: Wirkung einer Ölimmersion
Der Kondensor enthält mehrere Linsensysteme und eine Irisblende (Apertur - oder
Kondensorblende), mit der sein Öffnungswinkel stufenlos reguliert werden kann. Dabei wird
die numerische Apertur des Kondensors so verändert, dass jedes Objektiv die seiner
numerischen Apertur entsprechende Lichtmenge erhält.
Die Leuchtfeldblende begrenzt die Öffnung des Kollektors, welcher aus einem Linsensystem
besteht, das die Lampenwendel in die Ebene der Aperturblende abbildet; eine Linse ist
mattiert, damit die Aperturblendenflächen gleichmäßig ausgeleuchtet sind.
Okulare besorgen die zweite Stufe der mikroskopischen Gesamtvergrößerung. Einfache
Okulare (Huygens-Okulare) bestehen aus zwei Linsen, der Augen- und der Feldlinse. Die
dem Auge zugewandte Linse (Augenlinse) wirkt als eigentliche Lupe, während die Feldlinse
dafür sorgt, dass das gesamte Zwischenbild mit der Augenlinse überschaubar wird. Im Tubus
befindet sich eine Lochblende, in deren Öffnung das vom Objektiv entworfene, reelle,
vergrößerte Zwischenbild liegt (Zwischenbildebene). Der Vergrößerungsfaktor des Okulars
(V: 6x bis max. 20x) ist auf der Okularfassung eingraviert. Die Vergrößerung des Mikroskops
berechnet man nach:
VM = M (Objektiv ) • V (Okular )
Strahlengang
Zum genauen Verständnis des Strahlengangs muss auch die Beleuchtungsoptik
miteinbezogen werden. Würde man einen Projektor ohne diese Optik bauen, so könnte man
weder die Lichtquelle optimal nutzen, noch das Dia gleichmäßig ausleuchten. Das sind aber
gerade die unerlässlichen Voraussetzungen für ein gutes Projektionsbild. Man sammelt daher
das Beleuchtungslicht mit Hilfe einer zwischen Lichtquelle und Dia angeordneten
88
BIOPHYSIK DER ZELLE
Beleuchtungsoptik. Sie hat die Aufgabe, die ganze leuchtende Fläche (oder die Wendel) der
Lichtquelle in das Objektiv hinein abzubilden. Auf diese Weise wird die Lichtquelle voll
genutzt und das Projektionsbild ist trotz der hellen und dunklen Zonen, die für Lichtquellen
charakteristisch sind, optimal hell und gleichmäßig ausgeleuchtet. Die Beleuchtungsoptik
bewirkt nämlich, dass jeder Punkt der Lichtquelle allein bereits das ganze Dia durchstrahlt,
und dass außerdem dieses Licht auch für die Abbildung voll genutzt wird. Bei dieser
optischen Anordnung "Beleuchtungsoptik-Objektiv" greifen zwei Abbildungen ineinander:
die Abbildung des Dias auf dem Projektionsschirm und die Abbildung der Lichtquelle in das
Objektiv. Man spricht deshalb von einem verflochtenen Strahlengang. Jede der beiden
Gruppen konjugierter Ebenen hat also eine eigene Funktion.
Wir betrachten zunächst den Beleuchtungsstrahlengang (Abb. 50). Dicht hinter der Lichtquelle
befindet sich der Kollektor, welcher meist mit der Lichtquelle zu einer Leuchte vereinigt ist.
Der Kollektor bildet die Lichtquelle in die vordere Brennebene des Kondensors ab. In dieser
Ebene liegt auch die Aperturblende. Die Lichtquelle wird dann weiter durch Kondensor und
Objektiv in dessen hintere Brennebene und schließlich in die Austrittspupille des Okulars
abgebildet. Hier befindet sich die Augenpupille des Beobachters. Diese drei Ebenen bezeichnet
man als optisch konjugiert, weil jede ein optisches Bild der vorhergehenden ist.
Das zweite System optisch konjugierter Ebenen erkennt man im Abbildungsstrahlengang
(Abb. 50). Die Leuchtfeldblende begrenzt die Öffnung des Kollektors. Diese Blende wird
durch den Kondensor ins Präparat abgebildet. Das Objektiv erzeugt in der Zwischenebene ein
vergrößertes Bild des Präparates und der Leuchtfeldblende, das durch das Okular nochmals
vergrößert betrachtet wird. Das dritte Bild der Leuchtfeldblende und das des Präparates
entstehen auf der Netzhaut des Auges. Wir haben damit zwei Gruppen von optisch
konjugierten Ebenen, die regelmäßig abwechselnd einander folgen. Man spricht daher von
einem
verflochtenen
Strahlengang.
In diesem Strahlengang müssen auch die Blenden richtig eingestellt sein. Mit der
Aperturblende wird das Bild der Lichtquelle abgeblendet, so dass die von den Objektpunkten
ausgehenden Strahlenkegel breiter oder schlanker werden, was sich auf den Kontrast des
Präparates auswirkt. Die Leuchtfeldblende verändert den Strahlenquerschnitt in der
Objektebene. Sie ist stets nur so weit zu öffnen, dass nicht mehr als das Objektfeld
ausgeleuchtet wird.
89
LICHTMIKROSKOPIE
Abb. 50: Verflochtener Strahlengang
Wellenoptik, Auflösung und numerische Apertur
Bisher ist der Strahlengang im Mikroskop nach geometrischen Gesetzen konstruiert worden.
Die Wellennatur des Lichtes blieb bei dieser Betrachtungsweise unberücksichtigt. Da paralleles
Licht, welches eine feine Öffnung passiert, sich hinter dieser Öffnung nicht mehr geradlinig
ausbreitet, sondern gebeugt wird, muss dies auch für mikroskopische Objekte gelten, die aus
sehr feinen Strukturen mit kleinen Öffnungen bestehen. Legt man ein Gitter (z.B.
Objektmikrometer) auf den Objekttisch, fokussiert darauf und schließt die Aperturblende,
dann sieht man nach Herausnehmen des Okulars in der hinteren Brennebene des Objektivs in
der Mitte als helles Zentralbild das Bild der Aperturblende, links und rechts davon erkennt
man eine Reihe lichtschwächerer und farbig gesäumter, sich teilweise überdeckender
Nebenbilder. Nimmt man das Gitter aus dem Strahlengang, dann verschwinden die
Nebenbilder, während das Zentralbild bleibt. Dieses zentrale Hauptbild ist also nach
geometrischen Gesetzen entstanden, während die Nebenbilder auf Beugung des Lichtes am
Gitter zurückzuführen sind. Die Intensitätsverteilung des gebeugten Lichtes und damit die
Lage der einzelnen Beugungsbilder ist durch Interferenz bedingt.
Abb. 51 zeigt die Beugung in der Aufsicht. Es sind Wellenfronten und die
Ausbreitungsrichtungen gezeichnet. Die ebene Wellenfront des Beleuchtungslichtes trifft auf
einen Gitterspalt, der das Erregungszentrum von Elementarwellen (Beugung) ist. Interferenz
dieser Elementarwellen mit gleicher Phase führt zu Verstärkung (Maxima 0., 1., 2. Ordnung
90
BIOPHYSIK DER ZELLE
usw.). Das übrige Gebiet bleibt dunkel, weil sich die Elementarwellen dort durch Interferenz
auslöschen.
Abb. 51: Beugung am Spalt
Aus der wellenoptischen Betrachtung ergibt sich unmittelbar die quantitative Beziehung für
das Auflösungsvermögen eines Objektivs. Ein Auflösungsvermögen von 1 mm bedeutet, dass
zwei punktförmige Teilchen im Abstand von 1 mm mit diesem Objektiv gerade noch getrennt
wahrgenommen werden können.
Abb. 52 zeigt einen Ausschnitt des Gitters sowie das 0. und 1. Interferenzmaximum, d ist der
Abstand von Gitterspalt zu Gitterspalt. Die Punkte A und B sind in gleicher
Schwingungsphase, weil mit kohärentem parallelem Licht beleuchtet wurde. C und B sind
ebenfalls in Phase, weil AC = λ ist. Bei C liegt ein rechter Winkel, da die Wellenfront AC
senkrecht zum gebeugten Bündel verläuft. Daraus ergibt sich für das Bündel 1. Ordnung:
sin α =
λ
d
Zur Auflösung des Gitters muss das Objektiv also mindestens das abgebeugte Bündel 1.
Ordnung noch aufnehmen, damit in der Zwischenbildebene ein Bild durch Interferenz
entstehen kann. Entscheidend hierfür ist die numerische Apertur des Objektivs, die definiert
ist durch:
•
A = sin a für Trockenobjektive
•
A = n × sin a für Immersionen, n = Brechungsindex
Hierbei ist a der größte Winkel, den ein Strahl mit der optischen Achse bilden kann, um vom
Objektiv gerade noch aufgenommen zu werden. Demnach löst ein Trockenobjektiv ein Gitter
mit dem Spaltabstand d noch auf, wenn seine Apertur A = sin a mindestens die Größe λ / d
hat. Als Formel ausgedrückt :
91
LICHTMIKROSKOPIE
A=
λ
d
Diese Formel, sie gilt auch für Immersionen, stellt eine gute Näherung des
Auflösungsvermögens bei ausschließlich senkrechter Beleuchtung dar. Die Größe d kann hier
auch interpretiert werden als Abstand zweier benachbarter Objektpunkte, die gerade noch
getrennt zu erkennen sind. In der Praxis arbeitet man jedoch nie mit senkrechter Beleuchtung,
also parallelem Licht, und außerdem ist die Beleuchtungsapertur meist kleiner als die
Objektivapertur. In diesem Fall gilt:
d=
λ
A Obj. + A Bel.
Diese Formel sollte man als Faustregel nehmen. Sie gilt für Objekte mit üblichem Kontrast und
setzt normale Farbkontrastempfindlichkeit des Auges voraus.
Bei allen Formeln wurden weiterhin auch einwandfrei korrigierte Objektive vorausgesetzt.
Bildfehler würden das Auflösungsvermögen natürlich beeinträchtigen.
Die numerische Apertur ist aber auch maßgebend für die Lichtstärke und damit die
Bildhelligkeit eines Objektivs. Die Bildhelligkeit verändert sich nämlich unter sonst
gleichbleibenden Bedingungen proportional mit dem Quadrat der Apertur. Blendet man z.B.
die Apertur eines Objektivs auf etwa 70% ab, so sinkt die Bildhelligkeit auf die Hälfte. Dabei
vergrößert sich zwar die Schärfentiefe, gleichzeitig erscheinen jedoch Beugungssäume an allen
Bilddetails, was das Auflösungsvermögen beeinträchtigt.
Abb. 52: Bildentstehung durch Beugung
Förderliche Vergrößerung
Um eine Objektstruktur, z.B. zwei Punkte, im Mikroskop aufzulösen, d.h. sie auch als zwei
Punkte zu sehen, genügt es nicht, nur ein Objektiv entsprechender numerischer Apertur zu
verwenden. Das Bild dieser Objektstruktur muss dem Auge auch unter einem hinreichend
92
BIOPHYSIK DER ZELLE
großen Winkel dargeboten werden. Dieser Winkel muss im Minimum etwas größer als das
Auflösungsvermögen des Auges selbst sein. Man muss also vorher ermitteln, wie weit zwei
Punkte in der Bezugssehweite von 250 mm voneinander entfernt sein dürfen, um vom bloßen
Auge aufgelöst zu werden. Bei guter Beleuchtung und entsprechendem Kontrast erhält man
als Abstand hierfür ca. 0.15 mm; das entspricht einem Winkel von 2′ .
Die Auflösungsgrenze des Auges und das wellenoptisch hergeleitete Auflösungsvermögen
eines Objektivs lassen sich miteinander verknüpfen. Sind zwei Punkte mit dem Abstand d
gerade an der Grenze des Auflösungsvermögens des Objektivs, so gilt bei gleicher Objektivund Beleuchtungsapertur:
d=
λ
2A
Dieser Abstand muss nun so viele Male vergrößert werden, bis die Punkte dem Auge
mindestens unter der Distanz von 0,15 mm (entsprechend 2′ ) erscheinen. Also gilt:
V
λ
2A
= 0.15 mm
V=
2 A 0.15 mm
λ
Für λ = 550 nm = 0,00055 mm ergibt sich:
A 0.3 mm
0.00055 mm
V = 500 A
V=
Bsp.: 500 × 0,45 (Apertur eines 25 × Objektivs) = 225 fach
•
25 × Objektiv + 10 × Okular −> 250 fach
•
25 × Objektiv + 8 × Okular −> 200 fach (zu wenig)
Diese Überlegungen gelten für Objekte mit mittlerem Kontrast. Bei hohem Kontrast kann man
durch entsprechend höhere Vergrößerung die beiden Punkte auch noch auflösen, wenn sie
näher beieinander liegen. Hierzu muss vorausgeschickt werden, dass grundsätzlich jeder
Punkt des Objektes infolge der Wellennatur des Lichtes als Beugungsscheibchen abgebildet
wird. Je näher nun zwei Punkte beieinander liegen, desto mehr überlappen sich die
Beugungsscheibchen. Bei hohem Kontrast heben sich die Beugungsscheibchen vom Umfeld
natürlich besser ab. Das Auge kann dann die Einschnürung an den beiden
Überlappungsstellen besser erkennen und dementsprechend besser auflösen.
Die Erfahrung hat gezeigt, dass man die Gesamtvergrößerung bei solchen Objekten etwa bis
1000 A steigern kann. Bei Vergrößerungen über 1000 A erscheinen die Bilder in der Regel nur
93
LICHTMIKROSKOPIE
noch unscharf. Der Bereich von 500 A und 1000 A wird nutzbare oder förderliche
Vergrößerung genannt. Schwächere Vergrößerungen als 500 A geben brilliantere Bilder, aber
das Auflösungsvermögen des Objektivs wird dabei nicht voll genutzt.
Leere Vergrößerung
Eine Nachvergrößerung des Zwischenbildes wird durch das Okular vorgenommen. Es muss
dafür sorgen, dass auch die feinsten, vom Objektiv eben noch aufgelösten Strukturen
mindestens unter einem Sehwinkel von 2′ erscheinen. Zu starke Okularvergrößerungen sind
aber ebenso schädlich, weil sie zu unscharfen Konturen und zu einem schlechten Bildkontrast
führen. Man spricht von leeren Vergrößerungen, da keine weiteren Einzelheiten mehr
aufgelöst werden.
Köhlersche Beleuchtung
Wie bereits oben beschrieben, wird bei richtiger Beleuchtung die Lichtquelle in die hintere
Brennebene des Objektivs abgebildet. Mit dieser Methode kann allein diejenige Fläche im
Präparat ausgeleuchtet werden, welche die Mikroskopoptik gerade überblickt. Dadurch
werden Überstrahlungen vermieden und Feinstrukturen fallen besser auf. Um diese
sogenannte Köhlersche Beleuchtung einstellen zu können, benötigt man eine
Mikroskopleuchte mit Irisblende (Leuchtfeldblende) und einen in der Höhe verstellbaren
Kondensor. Bei der Einstellung geht man wie folgt vor:
Abb. 53
Präparat zunächst ohne Rücksichtnahme auf die Qualität der Beleuchtung mit
einem 16x Objektiv oder stärker scharf einstellen.
94
BIOPHYSIK DER ZELLE
Abb. 54
Leuchtfeldblende schließen; falls vorhanden Hilfslinse ausklappen
Abb. 55
Kondensor heben und senken, bis das Bild der Leuchtfeldblende im sonst dunklen
Gesichtsfeld scharf umgrenzt ist (Blendenlamellen). Das tritt gewöhnlich dann
ein, wenn der Kondensor ziemlich hoch steht.
Abb. 56
Bild der Leuchtfeldblende durch Zentrieren des Kondensors in die Mitte des Gesichtsfeldes
bringen.
Hilfslinse wieder einklappen, Punkt 3 wiederholen und Bild der Leuchtfeldblende
durch Zentrieren der Hilfslinse in die Mitte des Gesichtsfeldes bringen.
Abb. 57
Leuchtfeldblende soweit öffnen, bis die Blendenlamellen gerade am Rande des
Gesichtsfeldes verschwinden.
95
LICHTMIKROSKOPIE
Abb. 58
Abb. 59
Okular aus dem Tubus nehmen und Kondensorblende so weit schließen, bis nur
noch 3 / 4 der sichtbaren Objektivöffnung ausgeleuchtet sind.
Abb. 60
Abb. 61
Dunkelfeldmikroskopie
Beim Dunkelfeldverfahren sorgt man dafür, dass kein direktes Mikroskopierlicht ins Objektiv
eindringt, sondern an ihm vorbeistrahlt. Dazu ist ein spezieller Kondensor, der sog.
Dunkelfeldkondensor notwendig. Das Gesichtsfeld bleibt dann selbst bei eingeschalteter
Lampe dunkel. Bringt man aber auf den Objekttisch ein Präparat, so wird das Licht von
diesem nach allen Seiten gestreut. Ein Teil des Streulichtes gelangt ins Objektiv, so dass das
Präparat hell auf dunklem Untergrund erscheint. Die Dunkelfeldmethode ist besonders für
die Darstellung aller Arten von Linienstrukturen geeignet, z.B. Kanten, Risse und Geißeln.
96
BIOPHYSIK DER ZELLE
Abb.
62:
Dunkelfeld
Beugung
im
Phasenkontrastmikroskopie
Dieses Verfahren erlaubt das Betrachten von ungefärbten Strukturen, die im Hellfeld nahezu
unsichtbar sind. Man unterscheidet in der Mikroskopie Amplituden- und Phasenobjekte. Bei
den ersteren wird die Amplitude der Lichtstrahlen beim Durchstrahlen eines Präparates durch
Absorption verringert, wodurch ein wahrnehmbarer Kontrast zu den Lichtstrahlen entsteht,
die nicht durch das Präparat gegangen sind. Bei dünnen biologischen Objekten wird jedoch
kein Licht absorbiert, dafür ist die optische Weglänge in den Präparaten unterschiedlich. Das
aus dem Präparat austretende Licht ist daher gegenüber dem Vergleichslicht um etwa 90 o
phasenverschoben. Man nennt diese Präparate daher Phasenobjekte.
Für Phasenverschiebungen besitzen wir jedoch weder im menschlichen Auge noch in der
photographischen Platte einen geeigneten Empfänger. Beide registrieren nur Unterschiede
der Intensität und der Wellenlänge, also Abstufungen in Helligkeit und Farbe, jedoch nicht
Wellenzüge mit unterschiedlicher Phase.
Ein Teil des Mikroskopierlichtes verläuft geradlinig durch das Objekt und bildet das
Hauptmaximum ("direktes Licht"). Der Rest des Mikroskopierlichtes wird bei
Amplitudenpräparaten durch Beugung am Präparat in neue Richtungen abgelenkt und bildet
die Nebenmaxima (= gebeugtes Licht). Das Zwischenbild kommt durch Interferenz des
Hauptmaximums mit dem gebeugten Licht zustande. Bei Amplitudenpräparaten ist das
gebeugte Licht gegenüber dem direkten Licht in der Zwischenbildebene um 180 o
phasenverschoben, was zu guten Interferenzbedingungen führt.
97
LICHTMIKROSKOPIE
Anders liegen die Verhältnisse bei Phasenobjekten: hier kommt es nur zu geringen
Phasenverschiebungen, die aber durch Eingriffe in den Strahlengang des Mikroskops zu
einem Amplitudenbild umgewandelt werden können. Man muss also das primäre
Beugungsbild (es enthält die gesamte Information über das Objekt) eines Phasenpräparates so
ändern, dass es einen Amplitudenkontrast liefert. Das gebeugte Licht läuft nur mit einer
Verzögerung von einer viertel Wellenlänge hinter dem Hauptmaximum her, daher wird das
Licht des Hauptmaximums zusätzlich so beeinflusst, dass eine Gesamtphasenverschiebung
um 180 o resultiert.
Beim negativen Phasenkontrast (Bildstrukturen heller als der Untergrund) wird das Licht des
Hauptmaximums so stark gebremst, dass das gebeugte Licht den Phasenvorsprung des
Hauptmaximums gerade einholen kann. Als Bremse wirkt ein Medium von höherem
Brechungsindex. Bei positivem Phasenkontrast muss das Hauptmaximum so beschleunigt
werden, dass es schließlich mit einer halben Wellenlänge (180 o ) vor dem gebeugten Licht
hereilt. In der Praxis wird es aber um 270 o gebremst, so dass im Endeffekt die Phasen der
Wellenzüge von Hauptmaximum und gebeugtem Licht um 180 o verschoben sind (Abb. 63).
Bei positivem wie negativem Phasenkontrast ist also eine strikte Trennung zwischen Hauptund Nebenmaxima erforderlich. Dies wird durch eine Ringblende im Kondensor erreicht, so
dass das Hauptmaximum ringförmige Gestalt annimmt, in der hinteren Brennebene des
Objektivs auf einen entsprechenden Phasenring trifft und dort um den gewünschten Betrag
in der Phase verschoben wird (Abb. 64).
Ein Phasenkontrastmikroskop besitzt daher einen mit Ringblende versehenen Kondensor, der
sich in der Höhe verstellen lässt und Objektive, die einen Phasenring enthalten
(Kennzeichnung: Objektiv Ph).
Abb. 63: Bildentstehung durch Interferenz für
Amplitudenobjekt (a.) und Phasenobjekt (b. und c.)
98
BIOPHYSIK DER ZELLE
Abb. 64: a) Aufbau des Phasenkontrastmikroskops b) Phasenkontrastaufnahme einer Zelle.
Einstellen des Phasenkontrastmikroskops
Präparat im Hellfeld scharf einstellen.
Köhlern; mit Phasenkontrastobjektiv und Phasenkondensor die Punkte 1 - 6
durchführen (siehe Abschnitt Köhlersche Beleuchtung) .
Am Kondensor die zum Objektiv passende Ringblende einschalten (Objektiv: Ph 2;
Kondensor: 2). Okular gegen das Einstellfernrohr austauschen und auf
Phasenring und Ringblende fokussieren.
Ringblende im Kondensor so zentrieren, dass das helle Ringbild mit dem dunklen
Phasenring zur Deckung gebracht wird.
Einstellfernrohr wieder gegen das Okular austauschen.
99
LICHTMIKROSKOPIE
Abb. 65: Köhlern bei Phasenkontrast
Polarisationsmikroskopie
Bei einem Polarisationsmikroskop befindet sich unter dem Kondensor ein Polarisationsfilter,
der Polarisator. Über dem Objekt - meist zwischen Objektiv und Okular - ist ein weiteres
Polarisationsfilter - der Analysator - angebracht. Mit Hilfe des Polarisators wird linear
polarisiertes Licht erzeugt, mit dem man das Präparat beleuchtet. Polarisationsmikroskope
werden zur Untersuchung von doppelbrechenden Strukturen (Kristalle) verwendet.
Interferenzmikroskopie
Auch hier werden die Phasendifferenzen, die ein Phasenobjekt verursacht, durch Interferenz
in Amplitudenunterschiede umgewandelt. Da zur Interferenz stets zwei Wellenfronten
gehören, wird bei einem Interferenzmikroskop durch optische Bauelemente ein Teil des
einfallenden Lichtes vor dem Durchdringen des Objektes abgespalten und hinter dem Objekt
der vom Objekt deformierten "Objektwellenfront" wieder hinzugefügt. Man unterscheidet
vier Grundtypen von Interferenzmikroskopen:
3. Verfahren mit unbeeinflusster Vergleichswellenfront
4. Verfahren mit totaler Verdopplung
5. Differenzieller Interferenzkontrast (DIK)
6. Vielstrahl-Interferenzverfahren
100
BIOPHYSIK DER ZELLE
Für die Betrachtung von Zellen und Gewebe wird meist mit dem DIK-Verfahren nach
Nomarski abgebildet (Abb. 66). Dazu wird das Beleuchtungslicht durch einen Polarisator
linear polarisiert und durch ein Wollastonprisma in zwei Teilwellen aufgespalten. Diese laufen
um etwa 1 / 2 Winkelminute auseinander und stehen mit ihrer Schwingungsrichtung
senkrecht aufeinander. Als Spezialfall der Interferenzmikroskopie durchlaufen beide
Wellenfronten das (Phasen-) Objekt, in dem sie eine unterschiedliche Phasenverschiebung
erfahren. Nach dem Durchtritt durch das Objektiv werden beide Strahlen durch ein zweites
Wollastonprisma zu einem gemeinsamen Strahl vereinigt und durch den Analysator in eine
gemeinsame Schwingungsebene gebracht. Dadurch sind sie interferenzfähig geworden und
erzeugen ein Interferenzkontrast-Bild des Objekts. In der Objektebene haben die beiden
Teilwellen nur einen sehr geringen Abstand voneinander, daher entsteht ein Gangunterschied
in der Phase nur an Kanten eines ebenen Objektdetails. Gegenüberliegende Kanten der
einzelnen Objektdetails können unterschiedliche Saumeffekte erhalten, so dass plastische
Abbildungseffekte zustande kommen.
Abb. 66: a) Interferenzkontrastprinzip
Interferenzkontrast
nach
Nomarski
b)
Seeigelei
im
differentiellen
Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes. Das ausgestrahlte
Fluoreszenzlicht hat dabei eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte Licht (Stokessche
Regel). Man schickt also in eine Substanz eine relativ energiereiche Strahlung hinein, von
deren Energie ein gewisser (kleiner) Teil in der Substanz selbst absorbiert bzw. umgewandelt
wird (z.B. Wärme). Die nicht absorbierte Strahlungsenergie (welche den weitaus größeren Teil
ausmacht) wird "ungenutzt" von der Substanz wieder abgestrahlt oder "emittiert". Man sagt zu
diesem Vorgang: die Substanz "fluoresziert". Da diese Fluoreszenzstrahlung energieärmer ist
als die Anregungsstrahlung, besitzt sie auch eine größere Wellenlänge als diese. Wenn die
101
LICHTMIKROSKOPIE
Einstrahlung (Anregung) im nahen UV-Bereich erfolgt, so kann eine Substanz dadurch
sichtbar gemacht werden.
Voraussetzung für die Fluoreszenzmikroskopie ist also das Vorhandensein einer Substanz, die
sich zur Fluoreszenz anregen lässt. Es gibt Substanzen (z.B. Chlorophyll in Blättern, aber auch
einige Öle, Wachse u.a.m.) die natürlicherweise fluoreszieren, sie zeigen "Primärfluoreszenz".
Leider besitzen aber gerade diejenigen Objekte, die in der Mikroskopie untersucht werden
(Zellen, Gewebe, Zellkulturen usw.) außer einem allgemeinen weiß-blauen Leuchten des
ganzen Präparates (unspezifische Eigen- oder Autofluoreszenz, die besonders bei UV- und
Violettanregung auftritt und, da unspezifisch, eher stört als nützt), keine "typische" natürliche
Fluoreszenz. Will man bestimmte Objektstrukturen hervorheben, muss man eine spezifische
Fluoreszenz induzieren, welche an die Teile gekoppelt ist, die man analysieren möchte. Dies
geschieht mittels der sogenannten Fluorochrome (chroma = Farbe). Diese Farbstoffe werden
genauso appliziert wie dies für histologische Färbeverfahren üblich ist. Sie lagern sich dabei
entsprechend ihrer chemischen Eigenschaften und ihrer färberischen Charakteristik in ganz
bestimmten Objektbereichen ein und lassen andere ungefärbt. Der ganze Vorgang wird
"Fluorochromieren" genannt; die so erhaltene Fluoreszenz nennt man "Sekundärfluoreszenz".
Fluorochrome sind bereits in ganz geringen Konzentrationen wirksam; in der normalen
Durchlicht-Mikroskopie erscheinen deshalb fluorochromierte Präparate praktisch farblos.
Trotzdem leuchten diese Präparate hell auf, wenn sie mit dem Licht einer geeigneten
Wellenlänge "angeregt" werden.
Während man früher nur ganz wenige Fluorochrome benutzte (Acridinorange), gibt es
inzwischen eine reiche Auswahl mit verbesserten oder ganz neuen Spezifitäten (wobei man
inzwischen festgestellt hat, dass einige in der Histologie längst bekannte Farbstoffe gleichzeitig
sehr brauchbare Fluorochrome sein können, wenn man sie mit dem Licht geeigneter
Wellenlängen anregt).
Apparative Voraussetzungen:
102
•
Lichtquelle:
Die Lichtquelle muss genügend Strahlung derjenigen Wellenlängen liefern, welche die
gewünschte Fluoreszenz anregen. In der Regel wird dies eine QuecksilberHöchstdrucklampe sein, aber auch Halogenlampen und Laser werden dafür
eingesetzt.
•
Erregerfilter:
Der Anregungsfilter, auch Erreger- oder Excitationsfilter genannt, darf nur die
Strahlung durchlassen, die für das benützte Verfahren brauchbar bzw. notwendig ist
und muss die Wellenlängen der von der Lichtquelle ausgehenden Strahlung
zurückhalten, die nicht zur Anregung beitragen (sollen).
•
Sperrfilter:
Da überschüssiges, im Objekt nicht absorbiertes Erregerlicht die FluoreszenzBeobachtung stören würde, muss es mit einem Sperrfilter am Eintritt in die Okulare
gehindert werden. Sperrfilter werden in der modernen Fluoreszenzmikroskopie auch
BIOPHYSIK DER ZELLE
benutzt, um bestimmte Spektralbereiche aus der Fluoreszenz-Emission herauszufiltern.
•
Präparat:
Das Präparat muss in der Regel fluorochromiert worden sein.
Prinzipiell unterscheidet man drei Fluoreszenz-Techniken:
1. Durchlicht-Hellfelderregung
2. Durchlicht-Dunkelfelderregung
3. Auflicht-Hellfelderregung
a
b
Abb. 67: a) Strahlengang bei Auflichterregung. b) Auflichfluoreszenzbild einer mit Fluoreszeindiazetat
gefärbten Zellkultur.
Bei der Auflichterregung (Abb. 67) wird das Erregerlicht durch das Mikroskopobjektiv auf das
Präparat geschickt. Das Objektiv dient somit gleichzeitig als Kondensor. Dabei wird das Licht
mit Hilfe eines dichromatischen Teilerspiegels (auch Farbteiler genannt) in den Strahlengang
gelenkt. Dieser Teilerspiegel sorgt für eine saubere Trennung zwischen Anregungs- und
Fluoreszenzstrahlung: die Anregungsstrahlung wird ungeschwächt in das Präparat gelenkt,
die nach der Stokesschen Regel längerwellige Fluoreszenzstrahlung des Präparats geht durch
den Strahlenteiler durch. Bei der Auflichtfluoreszenz trifft die Erregungsstrahlung auf die
Präparatoberseite. Hier entsteht also auch die stärkste Fluoreszenz. Dies ist besonders bei
dickeren Objekten von Vorteil. Durch die hohe Intensität der Erregungsstrahlung kommt es
aber oft zum schnellen "Verblassen" der Fluoreszenz.
103
LICHTMIKROSKOPIE
Moderne Mikroskopische Verfahren
Mikroskopie mit Video- und Bildverarbeitung
Neue Methoden in der Mikroskopie vereinigen die Anwendung von hochauflösender
Videotechnik mit Bildverarbeitungssystemen und ermöglichen neben verbesserten
qualitativen auch quantitative Beschreibungen des untersuchten Objekts. Viele
Beschränkungen
und
Nachteile
(Kontrast,
Auflösungsvermögen,
Schärfentiefe,
dreidimensionale Darstellung) lassen sich durch die Verwendung elektronischer Systeme
weitgehend kompensieren oder völlig vermeiden. Dies gilt insbesondere für die durch
Bildspeicherung
ermöglichten
Kontraststeigerungen,
die
für
die
meisten
Mikroskopieverfahren beschrieben sind:
Confokale Lichtmikroskopie (CLM)
Bei der konventionellen Lichtmikroskopie wird durch Einstrahlungen von außerhalb des
Fokus liegenden Strukturen der Bildkontrast gemindert. Deshalb müssen hinreichend dünne
Schnitte vom Präparat angefertigt werden; Oberflächenstrukturen, schwache Kontraste
ungefärbter oder nahezu homogen gefärbter Präparate sowie schwache Fluoreszenz sind
trotzdem nur schwer zu erfassen. Um diese abzubilden, dienen Verfahren, die den
Tiefenkontrast erhöhen.
Im Confokalen Laser-Scan-Mikroskop wird ein aufgeweiteter Laserstrahl nach dem Passieren
einer Scannoptik mit dem Objektiv auf das Objekt fokussiert. Mit dem so erzeugten Lichtfleck
wird das Objekt Punkt für Punkt abgerastert. Das reflektierte, gestreute oder FluoreszenzLicht wird über Objektiv, Tubuslinse und Scanner mit einem Strahlteiler in die Blende des
Detektors abgebildet und von einem Detektor registriert. Die Punkt für Punkt ermittelten
Fotomultipliersignale werden über einen Videoverstärker und einen digitalen Bildspeicher auf
einem Monitor abgebildet. Das Bild kann in Helligkeit und Kontrast elektronisch kontrolliert
und stufenlos vergrößert werden. Die hohe Empfindlichkeit der Fotodetektoren ermöglicht
ein Arbeiten bei geringen Lichtintensitäten. Licht von Punkten aus Nichtfokusebenen kann
nur in geringem Maß die Blende passieren, es wird daher wirksam unterdrückt.
104
BIOPHYSIK DER ZELLE
Abb. 68: Schema eines Confokalen Laser-Scan
Mikroskops
Korrespondierende Löcher ermöglichen punktförmige Beleuchtung und Detektion des
reflektierten Lichts. Das Tandem-Scanning Reflektionslicht-Mikroskop benutzt ein
symmetrisches Muster gepaarter Löcher, das präzise auf gegenüberliegenden Seiten einer
rotierenden Scheibe in der Zwischenbildebene angebracht ist.
Video-Enhanced Contrast Differential Interference Contrast (VECDIC)
Video-Enhanced Contrast Polarisation (VECPOL)
Video-Intensified Fluorescence (VIF)
Hochempfindliche Videosensoren erhöhen bei diesen Verfahren den Bildkontrast, wobei
gleichzeitig geringste Lichtintensitäten erfasst und verarbeitet werden. Dazu wird das
mikroskopische Zwischenbild stark vergrößert auf dem Bildempfänger der Videokamera
abgebildet. Der Kontrast des TV-Bildes wird zunächst analog verstärkt, dann von einem
Computer in 512 x 512 Bildpunkte (Pixel), die zwischen Weiß und Schwarz 256 Graustufen
annehmen können, zerlegt und abgespeichert. Wenn man das scharf eingestellte Bild durch
Defokussieren des Mikroskops vom Monitor verschwinden lässt, empfängt die Kamera nur
noch den unsauberen Bilduntergrund und die durch Linsenfehler verursachten Bildfehler.
105
LICHTMIKROSKOPIE
Beide subtrahiert der Computer Punkt für Punkt vom ersten, dem Gesamtbild. Der Kontrast
des gereinigten Bildes wird elektronisch verstärkt, dabei werden Details sichtbar, die wegen
eines hohen Streulichtanteils normalerweise nicht erkennbar wären. Weitere Korrekturen und
Bildverarbeitung sind möglich.
Für die Fluoreszenzmikroskopie (VIF) ist von Vorteil, dass mit geringeren Konzentrationen
der oftmals toxischen Fluorochrome gearbeitet werden kann. Zudem wird durch niedrigere
Anregungsenergien das Ausbleichen der Farbstoffe reduziert, ebenso Bestrahlungsschäden bei
lebenden Organismen. Damit ist es möglich, intrazelluläre Ionenkonzentrationen oder
Membranpotentiale, die eine Änderung der Fluoreszenzintensität und/oder Wellenlänge
bewirken, in lebenden Zellen zu beobachten und innerhalb kürzester Zeit quantitativ
auszuwerten.
Ultraschallmikroskop (SAM = Scanning Acoustic Microscope)
Das Ultraschallmikroskop ist bei dicken (bis 200 µ m ) Präparaten mit schwachem Kontrast von
Vorteil. Bei verbesserter Auflösung können Kontraste registriert werden, die im
konventionellen Lichtmikroskop nicht oder nur unzureichend zu beobachten sind. Außerdem
ist die Untersuchung unfixierter Proben in Wasser möglich.
Abb. 69: Schema eines Ultraschallmikroskops
106
BIOPHYSIK DER ZELLE
Als Schall werden Schwingungen der Luft oder anderer gasförmiger, flüssiger oder fester
Medien bezeichnet. Es handelt sich um Longitudinalwellen, d.h. die Moleküle oder Atome
schwingen in Ausbreitungsrichtung um eine mittlere Achse. Derartige Schwingungen mit
Frequenzen zwischen 20 kHz und 10 × 1015 Hz werden Ultraschall genannt.
Ultraschallkameras werden bei 10 MHz verwendet. Zur Bildentstehung führt die
unterschiedlich starke Reflexion am Objekt. Ultraschallmikroskope = akustische Mikroskope
benutzen Schall im GHz-Bereich. Dabei werden Wellenlängen erreicht, die denen des
sichtbaren Lichts entsprechen. (Die menschliche Stimme erzeugt Wellen im Meterbereich.)
Die Bildentstehung entspricht im Prinzip der eines Auflichtmikroskops: sie beruht ebenfalls
auf Brechung, Beugung, Reflexion und Streuung von Wellen beim Übergang in Medien mit
unterschiedlichen Brechungsindices bzw. Schallimpedanzen. Schall wird allerdings
grundsätzlich stärker gebrochen als Licht. Man kann deshalb "Linsen" mit geringerer
Brennweite benutzen, wodurch kaum Abbildungsfehler auftreten.
Akustische Linsen sind Fokussierelemente, die aus einer konkaven Saphirfläche bestehen, die
an Wasser (=Kopplungsmedium) angrenzt. Ultraschallwellen erzeugt und registriert man mit
Hilfe einer piezoelektrischen Schicht auf der ebenen Rückseite des Saphirs. Diese Schicht
besteht aus vielen kleinen Kristallen, die im elektrischen Wechselfeld ihre Ausdehnung
ändern und somit elektrische in mechanische Schwingungen umwandeln. Letztere
durchqueren den Saphir und werden von der Linse zu einer Kugelwelle verformt. Das Objekt
wird so platziert, dass es in deren Brennpunkt liegt. Zeile um Zeile erfolgt das Abtasten der
Probe mit dem gebündelten Schallstrahl.
Die reflektierten Wellen beinhalten Informationen über Inhomogenitäten bezüglich der
mechanischen Eigenschaften des Objekts (Elastizitäts-, Viskositäts- und Dichteunterschiede).
Sie werden über die akustische Linse wieder in ebene Wellen umgewandelt und als
elektronische Signale registriert, welche nach Verstärkung auf einem Monitor ein Bild
erzeugen. Durch Bildverarbeitung (Falschfarbendarstellung, Kontrasterhöhung) kann das Bild
moduliert werden.
Rastersonden-Mikroskopie
Wird Materie nicht mit Licht sondern mit atomaren Spitzen feinster Sonden abgerastert, dann
können mechanischen oder elektrischen Eigenschaften der Oberfläche dargestellt werden.
Von Gerd Binnig und Heinrich Rohrer wurde 1982 das Rastertunnelmikroskop beschrieben
für das sie 1986 den Physik-Nobelpreis verliehen bekamen (gemeinsam mit Ernst Ruska für
seine Erfindung des Elektronenmikroskops 1931). Eine zwischen Probe und Spitze angelegte
Spannung bewirkte den Fluss eines Tunnelstromes zwischen zwei sich nicht berührenden
Metallen. Es ist so möglich, die Probe ohne mechanischen Kontakt abzurastern und doch,
aufgrund der exponentiellen Abstandsabhängigkeit des Tunnelstromes, Informationen über
die Oberflächenstruktur der Probe bis hin zu atomarer Auflösung zu erhalten. Hierfür kann
107
LICHTMIKROSKOPIE
entweder die Änderung des Tunnelstroms direkt oder die zur Konstantregelung des Stromes
notwendige Entfernungsänderung ausgewertet werden. Man erhält im Endeffekt die
Darstellung einer Fläche konstanter Tunnelwahrscheinlichkeit, die bei einheitlichem Material
als weitgehend identisch mit der Topographie der Oberfläche angesehen werden.
Dieses neue Prinzip der Abbildung hat sich sehr rasch durchgesetzt und ist auch auf andere
Sonden übertragen worden. Durch den Kontakt mit Oberflächenstrukturen entstehen Kräfte,
die beispielsweise von einer Siliziumspitze auf einen Federbalken übertragen werden. Die
Auslenkung des Balkens kann auf unterschiedliche Weise aufgezeichnet werden, wobei die
optische mit einem Laser als Lichtzeiger weit verbreitet ist.
Ein Laserstrahl wird von der Balkenrückseite wie von einem Spiegel reflektiert und auf einen
positionsempfindlichen Photodetektor projiziert. Eine Auslenkung des Balkens resultiert dann
in einer messbaren Verschiebung des Laserstrahls auf dem Detektor. Mit der
Lichtzeigermethode können vertikale Auslenkungen der Spitze mit Nanometer Genauigkeit
gemessen werden. Zum Erzeugen von Bildern der Oberflächenstruktur bewegt ein
piezoelektrischer Scanner die Probe im Rasterverfahren unter der Spitze hin und her, wobei
die Auflagekraft der Spitze mit Hilfe eines Regelkreises konstant gehalten wird. Ein Computer
erzeugt auf einem Bildschirm ein reliefartiges Abbild der Probenoberfläche.
Abb. 70: Gap Junction im Rasterkraftmikroskop.
Entnommen aus Jan Hoh's Labor im Department
of Physiology at the Johns Hopkins University
School of Medicine in Baltimore, Maryland.
Literatur
1. Gerlach, D.
Das Lichtmikroskop,
108
BIOPHYSIK DER ZELLE
Thieme Verlag, Stuttgart, 1985
2. Göke, G.
Moderne Methoden in der Lichtmikroskopie
Kosmos-Wissenschaft, Franckh'sche Verlagsbuchhandlung Stuttgart, 1988
3. Michel, K.
Die Grundzüge d. Theorie d. Mikroskops
Wiss. Verlag GmbH Stuttgart, 1981
4. Zeiss- und Leitz-Broschüren zu Mikroskop und Mikroskopverfahren
Links
•
Molecular Expressions Microscopy Primer
•
Microscopy & Imaging Resources on the WWW
•
Microworld Internet Guide to Microscopy
109