Experimentelle Untersuchungen zur proarrhythmischen Wirkung
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Tierärztliche Hochschule Hannover Experimentelle Untersuchungen zur proarrhythmischen Wirkung des KalziumSensitizers Levosimendan sowie möglicher protektiver Therapieoptionen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Anja Kohnke Altenberge Hannover 2017 Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Michael Fehr Klinik für Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover 2. PD Dr. Gerrit Frommeyer Abteilung für Rhythmologie, Department für Kardiologie und Angiologie, Universitätsklinikum Münster 1. Gutachter: 2. Gutachter: Prof. Dr. Michael Fehr Prof. Dr. Manfred Kietzmann Tag der mündlichen Prüfung 03.05.2017 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung............................................................................................................. 1 2 Literaturübersicht (Grundlagen und Ziele der Arbeit) .......................................... 3 2.1 Aufbau und Physiologie der Herzmuskelzelle ............................................... 3 2.2 Elektrische Heterogenität des Ventrikelmyokards ....................................... 10 2.3 Chronische Herzinsuffizienz ........................................................................ 13 2.4 Vorhofflimmern ............................................................................................ 17 2.5 Plötzlicher Herztod ...................................................................................... 23 2.6 Untersuchte Substanzen ............................................................................. 26 2.6.1 Levosimendan....................................................................................... 26 2.6.2 Ranolazin .............................................................................................. 33 2.6.3 Dantrolen .............................................................................................. 35 2.7 3 Hypothese ................................................................................................... 37 Material und Methoden ...................................................................................... 38 3.1 Versuchstiere .............................................................................................. 38 3.2 Die Langendorff-Apparatur .......................................................................... 39 3.2.1 Wärmebad und Perfusionslösung ......................................................... 40 3.2.2 EKG-Ableitung ...................................................................................... 42 3.2.3 Intraventrikuläre Druckmessung ........................................................... 43 3.2.4 Ableitung monophasischer Aktionspotentiale ....................................... 44 3.3 Präparation des Tierkörpers zur Isolation des Herzens ............................... 48 3.4 Substanzen ................................................................................................. 51 3.5 Versuchsprotokolle ...................................................................................... 52 3.5.1 Protokoll Ventrikelversuche .................................................................. 52 3.5.2 3.6 Auswertung ................................................................................................. 57 3.6.1 3.7 4 Protokoll Vorhofversuche ...................................................................... 55 Rhythmusstörungen .............................................................................. 58 Statistik ........................................................................................................ 60 3.7.1 Ventrikelversuche ................................................................................. 60 3.7.2 Vorhofversuche ..................................................................................... 60 Ergebnisse ........................................................................................................ 61 4.1 Untersuchung von Levosimendan auf ventrikulärer Ebene .......................... (Dosis-Wirkungs-Beziehung) ....................................................................... 61 4.1.1 Wirkung von Levosimendan auf die APD90, QT-Zeiten, ........................... Refraktärzeiten (S2+S3) und Dispersion der Repolarisation................. 61 4.1.2 4.2 Arrhythmogenes Potential von Levosimendan ...................................... 64 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin ................... auf ventrikulärer Ebene ............................................................................... 67 4.2.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin ..................... auf die APD90, QT-Zeiten, Refraktärzeiten (S2+S3) ................................. und Dispersion der Repolarisation ........................................................ 67 4.2.2 4.3 Wirkung von Ranolazin auf die Arrhythmogenese ................................ 70 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen ................... auf ventrikulärer Ebene ............................................................................... 71 4.3.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen ...................... auf die APD90, QT-Zeiten, Refraktärzeiten (S2+S3) ................................. und Dispersion der Repolarisation ........................................................ 71 4.3.2 4.4 Wirkung von Dantrolen auf die Arrhythmogenese................................. 75 Untersuchung von Levosimendan auf atrialer Ebene .................................. 77 4.4.1 Wirkung von Levosimendan auf die aAPD90, aAPD70, ............................. aAPD50, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit ........................................... 77 4.4.2 Untersuchung zu Vorhofflimmern - .......................................................... arrhythmogenes Potential von Levosimendan ...................................... 79 4.5 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin ................... auf atrialer Ebene ........................................................................................ 82 4.5.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin ..................... auf die aAPD90, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit ............................... 82 4.5.2 4.6 Wirkung von Ranolazin auf Vorhofflimmern .......................................... 84 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen ................... auf atrialer Ebene ........................................................................................ 86 4.6.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen ...................... auf die aAPD90, aAPD70, aAPD50, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit.... 86 4.6.2 5 Wirkung von Dantrolen auf Vorhofflimmern .......................................... 88 Diskussion ......................................................................................................... 90 5.1 Ventrikuläre Arrhythmogenese und protektive Therapieoptionen ................ 91 5.2 Atriale Arrhythmogenese und protektive Therapieoptionen ......................... 94 5.3 Limitation der Studie .................................................................................. 100 5.4 Ein Ausblick ............................................................................................... 102 6 Zusammenfassung .......................................................................................... 104 7 Summary ......................................................................................................... 106 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 108 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................ 124 Tabellenverzeichnis ................................................................................................ 127 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 128 Danksagung ........................................................................................................... 132 1 1 Einleitung Die Haltung von Haustieren ist in Deutschland sehr gefragt. Besonders Nagetiere, wie das Kaninchen, erfreuen sich besonderer Beliebtheit. Die Haltung dieser kleinen Heimtiere ist sowohl auf dem Land, als auch in Ballungszentren uneingeschränkt möglich. Eine Studie von 2013 schätzt die in deutschen Haushalten lebenden Nagetiere auf 6,1 Millionen, wobei sich der Anteil der Kaninchen auf drei Millionen beläuft [1]. Neben der steigenden Attraktivität hat sich auch die Wertschöpfung gegenüber den Tieren geändert. Während Kaninchen früher nur als Nutz- oder Hobbytiere gehalten wurden, nehmen heutzutage viele Tiere einen festen Platz in der Familie ein. Diese neue emotionale Denkweise stellt Tierärzte vor eine große Herausforderung. Haustierbesitzer äußern immer höhere medizinische Ansprüche und sind bereit, in die medizinische Versorgung und Gesundheit ihrer Tiere zu investieren. Dieser Wandel zeigt sich am deutschen Bruttoinlandsprodukts (BIP). 2013 machte der ökonomische Beitrag der Heimtierhaltung 0,32 % des BIP aus [1]. Neben bekannten Problemen mit Infektionskrankheiten, den Zähnen, dem Magen-Darm- oder Urogenitaltrakt, steigt auch aufgrund des ansteigenden Lebensalters, das Risiko der Tiere an Herzveränderungen und Rhythmusstörungen zu erkranken. Daher muss die kardiale Forschung zur Etablierung neuer medikamentöser oder chirurgischer Methoden weiter vorangetrieben werden. Die Veterinärmedizin orientiert sich hierbei stark an der Humanmedizin. Die kardiale Forschung fortzuführen hat in der Kleintiermedizin als auch in der Humanmedizin eine große Bedeutung. In den letzten Jahren häufiger auftretende, oft lebensgefährliche Arhythmien werden mit dem plötzlichen Herztod in Verbindung gebracht [2]. Die Ursachen sind meist nicht vollständig bekannt, weshalb neben genetischen Prädispositionen auch Medikamente als Auslöser ventrikulärer und atrialer Tachykardien in Frage kommen. Bei den atrialen Tachykardien stellt das Vorhofflimmern ein erhebliches klinisches Problem dar. Das Auftreten dieser Rhythmusstörung steigt im Tierreich [3] und beim Menschen stetig an. Levosimendan, als Medikament zur Behandlung der akut, dekompensierten chronischen Herzinsuffizienz beim Menschen [73], zeigt im klinischen Einsatz ein proarrhythmisches Potential [74]. Anhand des isolierten, Langendorff perfundierten Kaninchenherzens soll das Medikament Levosimendan auf atrialer und 2 ventrikulärer Ebene, hinsichtlich seiner elektrophysiologischen Eigenschaften untersucht werden. Erkenntnisse dieser Arbeit sollen den täglichen Einsatz von Levosimendan erleichtern und das Medikament für die Veterinärmedizin, als mögliche Therapieoption der Herzinsuffizienz, zugänglich machen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind für die Veterinärmedizin und Humanmedizin von Nutzen und wurden als Kooperation zwischen der Kleintierklinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und der Abteilung für Rhythmologie, Department für Kardiologie und Angiologie des Universitätsklinikum Münster angefertigt. Das Kaninchenmodell hat sich etabliert und wird in der humanmedizinischen Forschung seit Jahren erfolgreich zur Erforschung von Herzkrankheiten genutzt [4]. Dadurch hat es sich in unserer Forschungsgruppe durchgesetzt und wurde in vorangegangenen Studien mehrfach verwendet. Das Kaninchenherz eignet sich besonders als Modell für das menschliche Herz. Es bestehen Parallelen hinsichtlich der anatomischen und elektrophysiologischen Struktur. Besonders die Ionenströme der Herzmuskelzelle sind mit denen des Menschen vergleichbar [5]. Am isolierten Kaninchenherz sollen das proarrhythmische Potential von Levosimendan dargestellt und eventuelle medikamentöse Therapieoptionen ausgearbeitet werden. 3 2 Literaturübersicht (Grundlagen und Ziele der Arbeit) 2.1 Aufbau und Physiologie der Herzmuskelzelle Der anatomische Aufbau des Kaninchenherzens unterscheidet sich kaum von dem des Menschen. Das Herz ist ein sich im Thorax befindendes, kegelförmiges Hohlorgan, welches von einer dünnen Haut, dem Perikard, umgeben ist. Es besteht aus zwei Vorhöfen (Atrien) und zwei Hauptkammern (Ventrikeln), die über Klappen und ein Scheidewand voneinander abgegrenzt sind [6]. Das relative Organgewicht eines Kaninchenherzens beträgt in etwa 0,3 % des Körpergewichtes [7]. Das in den Versuchen durchschnittliche Herzgewicht lag bei etwa 12,38 g. Die Besonderheit der Herzmuskelzellen ist die Fähigkeit der spontanen, autonomen Reizbildung. Die autonome Reizbildung erfolgt im Reizbildungs- und Erregungsleitungssystem des Herzens, welches aus kleinen myofibrillenarmen, sarkoplasmareichen, wenig differenzierten Herzmuskelzellen besteht [8]. Hierzu zählen der als Schrittmacher fungierende Sinusknoten (SA-Knoten), der Atrioventrikular-Knoten (AV-Knoten), das His-Bündel, die Tawara-Schenkel und Purkinjefasern. Bei einem Ausfall des Sinusknotens ist der AV-Knoten ebenfalls in der Lage einen Ersatzrhythmus zu erzeugen. Alle Herzmuskelzellen sind über eine Doppelmembran, den sogenannten Glanzstreifen, sowohl mechanisch als auch elektrisch-leitend miteinander verbunden. Der Glanzstreifen besteht aus einer Diphospholipidschicht mit einer Vielzahl eingebauter elektrisch-leitender Ionenkanäle. Durch diese enge Verbindung bilden die Herzmuskelzellen ein funktionelles Synzytium. Das autonom entstehende Aktionspotential breitet sich nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip über die Gesamtheit aller Herzmuskelzellen aus [8,9]. Auf jedes Aktionspotential folgt eine Kontraktion des Herzmuskels. Das Aktionspotential der Herzmuskelzelle löst eine Einzelzuckung mit einer durchschnittlichen Dauer von 200-400 ms aus und verläuft parallel zur Kontraktion [8]. Im Vergleich zu anderen Zellarten, bei denen die Aktionspotentialdauer nur einige Millisekunden andauert, ist die Aktionspotentialdauer der Herzmuskelzelle, von circa 300 ms, sehr lang [10]. Durch die daraus resultierende längere Refraktärzeit, in der keine vorzeitige Kontraktion des Herzmuskels möglich ist, wird das Herz vor einer Tetanie geschützt [8]. Zwischen den Skelettmuskel-, Nerven- und Herz- 4 muskelzellen bestehen neben der Aktionspotentialdauer weitere Unterschiede. Jedoch vereinen alle Zellarten, dass ein ausgelöstes Aktionspotential das Ergebnis zeitlich aufeinander abgestimmter Mechanismen zum Öffnen und Schließen verschiedener Ionenkanäle darstellt [10,11]. Grundsätzlich gilt, dass die Depolarisation durch den Einstrom von Kationen und gleichzeitigen Ausstrom von Anionen ausgelöst wird. Andersherum die Repolarisation durch den Einstrom von Anionen und den Ausstrom von Kationen [12]. Die Selektivität der Ionenkanäle für einzelne Ionen unterscheidet sich jedoch deutlich. Neben Ionenkanälen nehmen transmembrane Ströme durch Kanäle, Ionenpumpen, Ionen-Austausch-Mechanismen, rezeptorgesteuerte Mechanismen und elektrische Widerstände im Bereich der sogenannten gap-junctions Einfluss auf die Form und Dauer der Aktionspotentiale [13]. Zwischen dem Zytoplasma (intrazellulärer Bereich) und dem extrazellulären Raum besteht eine elektrische Potentialdifferenz von etwa -70 mV bis -85 mV. Diese Potentialdifferenz wird als Ruhemembranpotential bezeichnet [14]. Grundlage für das Ruhemembranpotential ist die unterschiedliche Verteilung von Ionen auf beiden Seiten der Membran. Durch einen stetigen Ausstrom von Kaliumionen und einen aktiven Transporter, der Natrium-Kalium-ATPase, werden unterschiedliche intra- und extrazelluläre Ionenkonzentrationen erzeugt. Da Kaliumionen intrazellulär in höheren Konzentrationen vorliegen, kommt es durch das Konzentrationsgefälle zum Übertritt von Kaliumionen in den Extrazellularraum. Zusätzlich werden durch die NatriumKalium-ATPase extrazelluläre Kaliumionen im Austausch mit intrazellulären Natriumionen in die Zelle eingeschleust, um das Konzentrationsgefälle aufrechtzuerhalten. Besonders von Bedeutung ist jedoch das Gleichgewichtspotential von Kalium, da in Ruhe die Permeabilität der Membran für Natriumionen nur etwa 5 % der Permeabilität für Kaliumionen beträgt [14,15]. Dadurch ist zu erklären, dass die Membraninnenseite eine negative und die Membranaußenseite eine positive Ladung aufweist. Durch diesen Zustand strömen Kaliumionen, sowohl dem Konzentrationsgradienten (chemische Triebkraft) folgend aus der Zelle heraus, als auch dem elektrischen Gradienten (elektrische Triebkraft) folgend in die Zelle hinein, bis das Gleichgewichts-potential von -85 mV erreicht wird. Während dieses Zustandes findet keine Netto-ladungsverschiebung statt [12]. 5 Der Ablauf der Reizbildung beginnt im Sinusknoten, in dem es zu einer spontanen Anhebung des Ruhemembranpotentials von -70 mV auf -40 mV kommt und den Reiz in eine Erregung, das Präpotential, umwandelt. Die Erregung breitet sich über bestimmte Muskelbahnen (Tractus) mit einer Geschwindigkeit von 50-150 cm/s über die Vorkammermuskulatur weiter aus und erreicht im Anschluss den AV-Knoten. Die Erregungsgeschwindigkeit im AV-Knoten ist mit fünf Zentimetern pro Sekunde deutlich langsamer. Dieser Zustand sorgt dafür, dass die Vorkammersystole erst nach Beendigung der Kammersystole beginnt. Vom AV-Knoten wird die Erregung an das His-Bündel und von dort aus an die Tawara-Schenkel weitergeleitet. Schlussendlich erreicht die Erregung das Kammermyokard [16]. Das Aktionspotential der Herzmuskelzelle kann nach Keating und Sanguinetti [10] in fünf zeitlich aufeinander folgende Phasen aufgeteilt werden. Bezeichnet werden diese Phasen mit Phase 0-4. Phase 0 (Depolarisation): Die Phase 0 beschreibt die Depolarisation der Herzmuskelzellen. Zur Depolarisation kommt es nach Überschreitung des Schwellenpotentials von -65 mV, aufgrund einer schnellen Aktivierung spannungsgesteuerter Natriumkanäle (INa) [10]. Der Öffnung der Kanäle folgt ein massiver Einstrom von Natriumionen. Noch bevor das Gleichgewichtspotential für Natriumionen von +45 mV erreicht wird, schließen die spannungsabhängigen Natriumkanäle. Dieser Vorgang beginnt ab einer Schwelle von +20 mV [17]. Zeitgleich öffnen sich langsam inaktivierbare, potential- und zeitgesteuerte Kalziumkanäle, welche sich in den L-Typ (long-lasting, ICa-L) und T-Typ (transient, ICa-T) einteilen lassen [16,18]. Der L-Typ ist im weiteren Verlauf des Aktionspotentials von besonderer Bedeutung. Phase 1 (partielle Repolarisation): Während der Phase 1 kommt es zu einer partiellen Repolarisation der Membran [10]. Die Phase 1 kennzeichnet den Übergang vom Peak in die Plateauphase. Durch das frühzeitige Verschließen der Natriumkanäle und einen kurzen Ausstrom von Kaliumionen über den unspezifischen Kationenkanal Ito, kommt es zu einer weiteren Absenkung des Membranpotentials [17]. Bei dem Kationenkanal Ito sind zwei verschiedene Subtypen bekannt, welche zum einen durch Kalzium zum anderen spannungsabhängig und durch bestimmte Neurotransmitter 6 beeinflusst und reguliert werden [17]. Durch die inhomogene Verteilung der ItoKanäle im Ventrikelmyokard, bei dem subendokardial deutlich weniger Kanäle nachgewiesen wurden [17], können bei der Ableitung des endokardialen Aktionspotentials Formunterschiede sichtbar werden [19]. Phase 2 (Plateauphase): An den in Phase 1 ausgelösten Peak schließt sich die für die Herzmuskelzelle signifikante Plateauphase an. Das bei circa null mV konstante und mehr als 100 ms andauernde Plateau [17] wird durch eine Verschiebung verschiedener Ionen verursacht. Durch den Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX), der zu diesem Zeitpunkt seine Förderaktivität umkehrt und anstatt ein Kalziumion gegen drei Natriumionen aus der Zelle auszuschleusen, ein Kalziumion in die Zelle hineinbringt kommt es zu einem deutlichen Einstrom von Kalzium. Der vorhin schon erwähnte Kalziumkanal vom L-Typ unterstützt den Einstrom. Dem steht ein geringer Ausstrom von Kaliumionen gegenüber [10,17]. Durch den Kalziumkanal vom L-Typ (ICa-L) kommt es, neben einem Nettoeinstrom von Kalzium in die Zelle, zusätzlich zu einer Ausschüttung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum, was zur elektromechanischen Kopplung und somit zur Kontraktion des Herzens führt [17]. Der Ausstrom von Kalium findet über den IK-Kanal statt, welcher durch die Depolarisation langsam geöffnet wird und aus einer schnellen (IKr) und langsamen (IKs) Komponente besteht [17]. Dieser Kanal spielt auch für die weiter fortschreitende Repolarisation in Phase 3, eine bedeutende Rolle. In dieser Phase 2 ist das Herz refraktär. Dadurch ist es durch einen erneuten Reiz nicht erregbar. Phase 3 (Repolarisation): Die Repolarisation bezeichnet die Rückkehr zum Ruhemembranpotential und wird durch einen Ausstrom positiv geladener Ionen hervorgerufen. Neben der zeitabhängigen Inaktivierung des Kalzium-Einstroms über den ICa-L kommt es durch den Ausstrom von Kalium zu Ladungsveränderungen [17]. Unter den 18 bei Wirbeltieren bekannten Kaliumströmen [20] spielt der verzögerte Strom IK, mit seinen Subtypen IKr und IKs, eine besonders wichtige Rolle. IKr wird beim Menschen und Kaninchen stärker exprimiert und ist daher noch bedeutender [21,22]. Dieser Ionenstrom (IK) wird auch als Gleichrichterstrom bezeichnet. Charakteristisch hierfür ist eine einwärts gerichtete Gleichrichtung. Die Leitfähigkeit nimmt mit der Membrandepolarisation ab, während die Aktivität im Verlauf der Repolarisation wie- 7 der zunimmt. Aufgrund dieser Eigenschaften beeinflusst die Kanaleinheit vor allem die terminale Phase 3 der Repolarisation [23]. Neben den schon genannten Kanälen öffnet sich ab einer Spannung von -50 mV ein weiterer Kanal (IK1), der auch im Ruhezustand für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials zuständig ist [17]. Aufgrund seiner Bedeutsamkeit wird der Kanal IKr im Folgenden näher betrachtet. Das human ether-a-go-go related gene (hERG) kodiert die Grundlage des Kanals [24]. Genetische Defekte dieser Einheit können unter anderem mit dem Chromosom 7 assoziierten langen QT-Syndrom (LQTS2), sowie weiteren Ausprägungen des langen QT-Syndroms (z.B. LQTS6) des Menschen in Verbindung gebracht werden [23,24]. Neben dem langen QT-Syndrom kann es durch Veränderungen dieses Genes zu ventrikulären Arrhythmien bis hin zum plötzlichen Herztod kommen [23,24]. Zusätzlich zu den genetischen Abweichungen kann es durch den Einsatz von Antiarrhythmika und auch, primär nicht auf das Herz-Kreislauf-System wirkender Medikamente, zu Veränderungen der Repolarisation kommen [25]. Als Beispiel können kardiovaskuläre Medikamente wie Adrenalin, Noradrenalin, Antibiotika wie Erythromycin, Antimykotika wie Fluconazol oder Itraconazol, als auch antiparasitäre Wirkstoffe wie Chinidin genannt werden [26]. Nicht nur kongenitale und medikamentöse Faktoren nehmen Einfluss auf die Herztätigkeit, sondern auch einige Spezies betreffende Besonderheiten spielen eine Rolle. So weiß man, dass die ungleichmäßige Expression und regionale Verteilung repolarisierender Ionenkanäle, wie IKr+Ks innerhalb des Myokards, die Aktionspotentialdauer und die Häufigkeit von Rhythmusstörungen deutlich beeinflusst [27]. Als Beispiel ist die Maus zu nennen, bei der es durch eine geringere Expression von Kalziumkanälen zu einer sehr kurzen Dauer des Aktionspotentials kommt. Im Vergleich zur Maus ist das Aktionspotential des Menschen und Kaninchens, durch die alleine über 100 ms andauernde Plateauphase, deutlich verlängert [17,28]. Neben der Spezies nimmt auch das Geschlecht Einfluss auf die Repolarisation. Weibliche Kaninchen weisen, im Vergleich zum Bock, einen geringeren Anteil von IKr auf, wodurch sie anfälliger für Repolarisationsstörungen sind [29,30]. Phase 4 (Ruhemembranpotential): In dieser Phase kommt es, vor allem durch den erst gegen Ende der Repolarisation permeablen IK1-Kanal, zu einer Rückkehr zum Ruhemembranpotential von -85 mV. Während des Aktionspotentials ist keine Aktivi- 8 tät des IK1 sichtbar. Diese Phase wird als ventrikuläre Relaxation oder Diastole bezeichnet [10]. IK1 unterliegt einer vagalen Modulation und kann durch anorganische Ionen wie Magnesium, Barium oder Cäsium, als auch durch Antiarrhythmika der Klasse III (Sotalol) blockiert werden [17]. Abbildung 1: Aktionspotential Herzmuskelzelle modizifiert nach [12] Die morphologische Erscheinung des Aktionspotentials der Schrittmacherzellen unterscheidet sich deutlich von der des Arbeitsmyokards. Durch das Fehlen von K1Kaliumkanälen und rasch aktivierbaren Natriumkanälen (INa), verläuft die in Phase 0 beginnende Depolarisation flacher. Der Phase 0 dominierende Kanal ist ICa-T, als Auslöser der Depolarisation. Eine initiale Repolarisation in Phase 1 findet nicht statt. Auch das für das Arbeitsmyokard charakteristische Plateau ist, durch das Fehlen des Ito Kanals, nicht ausgeprägt. Das auffällige Präpotential der Schrittmacherzellen wird durch einen nicht selektiven Kationeneinstrom If (funny channel) hervorgerufen. So schließt sich nach dem Präpotential die Phase 0 und darauf folgend die Phase 3 an. Phase 4 und somit die Rückkehr zum Ruhemembranpotential findet ebenfalls über den vorwiegend Natrium fördernden If Kanal statt [16]. 9 Abbildung 2: Aktionspotential Schrittmacherzelle modifiziert nach [12] Das atriale Myokard besitzt im Vergleich zum ventrikulären Arbeitsmyokard und den Schrittmacherzellen spezifische Ionenkanäle, die das Aktionspotential beeinflussen. Die initiale Phase 0 des Aktionspotentials wird auch hier durch einen Einstrom von Natrium- und Kalziumionen (INa und ICa-L) hervorgerufen. ICa-L ist der wichtigste Kanal während der weniger stark ausgeprägten Plateauphase [31]. Die Repolarisation in Phase 1 findet durch einen kalziumabhängigen Chlorideinstrom I to2 statt [32]. Das Fortführen der Repolarisation wird durch den spezifischen, ultra-schnellen, verspäteten, gleichgerichteten Kaliumstrom IKur, [33] sowie Ito1 [34] ausgelöst. Beim Menschen zusätzlich durch IKs und IKr [35]. Das Kaliumgleichgewicht wird durch spezifische Ionenkanäle, wie IKAcH, IK1 [36] und IKATP [37] aufrechterhalten. Keinen Unterschied zwischen Ventrikel und Vorhöfen gibt es beim Ruhemembranpotential von -80 mV [31]. 10 Abbildung 3: Atriales Aktionspotential modifiziert nach [12] Durch die vorhanden Parallelen bezüglich physiologischer Mechanismen und pathophysiologischer Veränderungen der Repolarisation zwischen Kaninchen und Mensch ist das Kaninchen als Modell für den Menschen sehr gut geeignet. Die experimentell gewonnenen Erkenntnisse dienen sowohl der Tier- als auch der Humanmedizin. 2.2 Elektrische Heterogenität des Ventrikelmyokards Die Verteilung von Ionenkanälen innerhalb des Myokards hat einen großen Einfluss auf die Herzfunktion. So kann eine inhomogene Ausdehnung repolarisierender Ionenkanäle, gegenüber den homogen verteilten depolarisierenden Ionenkanälen, zu Veränderungen in der Erregungsrückbildung führen [38]. Neben der Verteilung der Ionenkanäle ist die unterschiedliche Ausbreitung von gap-junctions benachbarter Myozyten, sowie die Anwesenheit von Fibroblasten im Myokard ursächlich für die elektrische Heterogenität des Ventrikelmyokards. Das kann wiederum eine uneinheitliche De- und Repolarisation herbeiführen [39]. Antzelevitch et al. [38] konnten innerhalb des Ventrikelmyokards drei elektrophysiologisch und funktionell unterschiedliche Zelltypen nachweisen. Neben endokardialen- und epikardialen Zellen, zeigen mid- 11 myokardiale, sogenannte M-Zellen, deutlichen Einfluss auf die elektrische Heterogenität [27,38,40]. Neben den Übergangzellen machen die M-Zellen circa 30-40 % der Zellpopulation der Ventrikelwand aus [41,42]. Ursprünglich wurden M-Zellen in caninem Herzgewebe nachgewiesen, doch mittlerweile konnte die Existenz auch in Katzen, Kaninchen, Ratten und dem Menschen bestätigt werden [38]. Genau erforscht ist die Lokalisation im linken Ventrikel des caninen Herzens [27]. Hier erstreckt sich das Vorkommen der M-Zellen vom tiefen subendokardialen bis mid-myokardialen Bereich der vorderen und lateralen Seitenwand [27,43,44] sowie im rechtsventrikulären Auswurfgebiet [27]. Neben diesem Bereich kommt diese Art von Zellen auch in Zelllagen endokardialer Strukturen wie Papillarmuskeln, Trabekeln und im intraventrikulären Septum vor [42]. Histologisch sind zwischen allen drei Zelltypen keinerlei Unterschiede sichtbar. Elektrophysiologisch stellen die M-Zellen jedoch einen neuartigen Hybriden zwischen erregungsleitenden Purkinjezellen und Ventrikelzellen dar [38,45]. Bezüglich Dauer und Morphologie des Aktionspotentials weisen MZellen, im Gegensatz zu endo- oder epikardialen Ventrikelzellen, deutliche Differenzen auf. Unterschiede sind vorrangig in Phase 1 und 3 des Aktionspotentials, somit während der Repolarisation, sichtbar. Ein besonderes Charakteristikum für M-Zellen, und auch in epikardialen Zellen vorkommend, ist der in der Morphologie des Aktionspotentials erkennbare „spike“, auch „dome“ und „notch“ genannt, am Übergang der Depolarisation zur partiellen Repolarisation [38]. Diese Konfiguration wird durch den sensitiv auswärts gerichteten Ionenstrom Ito hervorgerufen [38]. Eine Phase 4 wurde bisher in M-Zellen nicht nachgewiesen [43]. Neben der speziellen Morphologie sind M-Zellen auch für die Länge ihres Aktionspotentials berühmt. Bei einer Bradykardie, das heißt ab einer Zykluslänge von 2000 ms kann die Aktionspotentialdauer(APD) über 500 ms erreichen. Bei einer normalen oder gesteigerten Herzfrequenz erkennt man jedoch keinen Unterschiede [40,43,46]. Die verlängerte APD ist über eine ungleiche Exprimierung der für die De- und Repolarisation entscheidenden Ionenkanäle erklärbar. M-Zellen beinhalten deutlich weniger IKs Kanäle, was zu einem verminderten und langsameren Kaliumauswärtsstrom führt und die Repolarisation bedeutend beeinflusst [47]. Im Gegensatz dazu weisen diese Zellen eine erhöhte Aktivität der für die Depolarisation entscheidenden Natrium-Kalzium-Austauscher (INa-Ca) [48] so- 12 wie des Natriumkanals INa auf, was einen größeren, späteren Natriumausstrom zur Folge hat [49]. Neben der unterschiedlichen Verteilung der aufgeführten Kanäle und Austauscher erscheint die Anwesenheit von IKr und IK1 im Ventrikel homogen. Messbare Abweichungen der Repolarisation, damit gemeint die Differenz zwischen dem kürzesten und längsten Aktionspotential, bezeichnet man Dispersion der Repolarisation. Epikardiale Ventrikelzellen repolarisieren früh und kennzeichnen im Elektrokardiogramm (EKG) den Peak der T-Welle. Die Repolarisation der M-Zellen erfolgt zeitlich später. Neben Beendigung der T-Welle determiniert die Repolarisation der MZellen das QT-Intervall. Das entstehende Intervall zwischen TAnfang – TEnde ist ein Index für die transmurale Dispersion der Repolarisation und stellt ein prognostisches Mittel zur Ermittlung des proarrhythmischen Risikos dar [38,50,51]. Ein weiterer prognostischer Marker ist die Schlag zu Schlag Variabilität der Repolarisation (BVR). Diese beschreibt die Variabilität der Repolarisationsdauer und ist somit ein prognostisches Maß für die zeitliche Dispersion [52]. Entwickelt wurde dieser Marker als Alternative oder Ergänzung zur Auswertung der QT-Ausdehnung, sowie für den Nachweis medikamentös induzierter Torsade-de-Pointes (TdP) [52]. Getestet wurde der BVR an narkotisierten Hunden mit einem chronischen AV-Block. Diese Hunde zeigten zu circa 70 Prozent TdP ausgelöst durch Antiarrhythmika der Klasse III [52]. Ergebnisse dieser Studien ergaben das Auftreten medikamentös bedingter TdP, im Zusammenhang mit einem Anstieg der BVR der linken endokardialen MAPDauer. Zudem wurden bei Hunden, die im Laufe der Versuchsdurchführung dem plötzlichen Herztod erlagen, im Vergleich zu Hunden der Kontrollgruppe, höhere BVR-Werte gemessen. Dem hingegen gab es zwischen den Vergleichsgruppen keinerlei Differenzen bezüglich der Länge der QT-Zeiten und der restlichen monophasischen Aktionspotential (MAP) -Dauer [53]. Weitere Studien ergaben, dass der BVR neben der Ermittlung von Risikopatienten, als Bewertungssystem für das proarrhythmische Potential von Medikamenten verwendet werden kann [54]. 13 2.3 Chronische Herzinsuffizienz Die chronische Herzinsuffizienz stellt in industrialisierten Ländern, in denen durch den Fortschritt der Medizin und Technik immer älter werdenden Populationen auftreten, ein weit verbreitetes gesellschaftliches Gesundheitsproblem dar [55]. Der Begriff der chronischen Herzinsuffizienz ist schwer zu definieren. Pathophysiologisch definiert man die chronische Herzinsuffizienz als eine Erkrankung, bei der das Herz nicht in der Lage ist, das Gewebe mit genügend Blut und somit genügend Sauerstoff zu versorgen. Es wird nicht gewährleistet den Gewebestoffwechsel in Ruhe oder unter Belastung sicherzustellen [56]. Klinisch zeigt sich definitionsgemäß das Vorliegen typischer Symptome wie Dyspnoe, Müdigkeit und Flüssigkeitsretentionen, deren ursächliche Grundlage eine kardiale Funktionsstörung darstellt [57]. Hieraus ergibt sich eine geringere körperliche Belastbarkeit, verminderte Lebensqualität und aufgrund der meist ungünstigen Prognose eine verkürzte Lebenserwartung [58]. Die Klassifizierung der Herzinsuffizienz kann nach der New York Heart Association (NYHA) anhand der Leistungsfähigkeit und Symptome der Patienten [59] vorgenommen werden. Eine weitere Einteilung der American Heart Association berücksichtigt die Entstehung und Progredienz der Erkrankung [59]. Die Klassifizierung der NYHA teilt die Patienten in vier Stadien ein. 14 Tabelle 1: NYHA-Klassifizierung bei Herzinsuffizienz nach [60] Stadium I Keine Einschränkung der körperlichen Aktivität Alltägliche körperliche Belastung führt zu keiner inadäquaten Erschöpfung, Luftnot, Rhythmusstörungen oder Angina pectoris Stadium II Leichte Einschränkung der körperlichen Aktivität Keine Beschwerden bei Ruhe Alltägliche körperliche Belastung führt zu einer Erschöpfung, Luftnot, Rhythmusstörungen oder Angina pectoris Stadium III Höhergradige Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit bei gewohnter Tätigkeit Keine Beschwerden in Ruhe Geringe körperliche Belastung führt zu einer Erschöpfung, Luftnot, Rhythmusstörungen oder Angina pectoris Stadium IV Beschwerden bei allen körperlichen Aktivitäten und bei Ruhe Totale Bettlägerigkeit Die chronische Herzinsuffizienz ist eine der bedeutendsten internistischen Erkrankungen Europas. Europaweit sind mehr als zehn Millionen erkrankte Personen registriert. Das entspricht in etwa einer Prävalenz von ein bis zwei Prozent der Gesamtbevölkerung [56,58]. Die Prävalenz und Inzidenz zu erkranken ist sowohl alters- als auch geschlechtsabhängig. In der Altersgruppe der 45-55-jährigen sind weniger als ein Prozent erkrankt. Bereits im Alter von 65-77 steigt die Zahl der Erkrankten auf zwei bis fünf Prozent. Mehr als zehn Prozent der über 80-jährigen erkranken an einer Herzinsuffizienz [55,56]. Männer sind hierbei 1,5 Mal häufiger betroffen als Frauen [61]. Durch die unerlässliche genaue, allgemeine und kardiologische Untersuchung lässt sich die Herzinsuffizienz in Links- oder Rechtsherzinsuffizienz, systolisch oder diastolisch, akut oder chronisch, sowie kompensiert oder dekompensiert einteilen [58]. Die Einteilung ist jedoch nicht immer eindeutig da Mischformen vorkommen, 15 oder sich die Phase im Laufe einer Erkrankung verändert. Die Prognose der Patienten ist meist schlecht. So stirbt bereits die Hälfte der Patienten innerhalb von vier Jahren, wobei die Patienten die nach NYHA in Stadium III und IV eingestuft werden eine noch geringere Lebenserwartung aufweisen [62]. Neben den ursächlichen Veränderungen am Herzen, wie zum Beispiel der myokardialen Dysfunktion die zu einer Herzinsuffizienz führt, spielen Arrhythmien als Komplikation eine große Rolle. Es besteht ein Zusammenhang zwischen einer Herzinsuffizienz und dem Auftreten sowie Schweregrad ventrikulärer Arrhythmien, die bis hin zum plötzlichen Herztod führen können [63]. Der plötzliche Herztod macht in NYHA Klasse I und II circa 50-60 % aller Todesursachen aus, wobei Patienten aus Klasse III und IV mit 20-30 % seltener am plötzlichen Herztod sterben [63]. Herzinsuffiziente Patienten versterben in den meisten Fällen aus zwei Gründen. Gründe hierfür sind ventrikuläre Arrhythmien oder Pumpversagen [64]. Zu den Grundursachen für das Auftreten von Arrhythmien als Begleiterkrankung zählen Ischämie, Fibrose, Hypertrophie, Dyskinesien, Dilatation und Aneurysmen [64]. Die hieraus resultierenden Veränderungen sind atriale- und ventrikuläre Extrasystolen, Vorhofflimmern und ventrikuläre Tachykardien [64]. Die Mechanismen der Arrythmogenese unterscheiden sich jedoch deutlich. So weiß man, dass bei der koronaren Herzkrankheit (KHK) strukturelle Myokardveränderungen in Form einer narbigen Veränderung die Ursache für das Auftreten sogenannter Reentry- Mechanismen sind. Einige Reentry-Tachykardien beruhen auf einem Myokardumbau als Folge eines Myokardinfarktes. Bundle Branch Reentry- Tachykardien, welche ursprünglich vom His-Bündel ausgehen, stellen eine Sonderform dar [64]. Dem entgegen entstehen ventrikuläre Extrasystolen nicht aufgrund von ReentryMechanismen, sondern wahrscheinlich durch eine gesteigerte Automatie und getriggerte Aktivität im Subendokardium [64,65,66]. Die elektrophysiologischen Veränderungen, die bei einer Herzinsuffizienz sichtbar sind, betreffen vorrangig das Myokard. Durch eine Verminderung repolarisierender Kaliumströme kommt es zu einer Verlängerung des myokardialen Aktionspotentials. Nebenbei kommt es zusätzlich zu einer Verschiebung des Ruhepotentials in den negativen Bereich [67]. Die Verminderung der Kaliumströme resultiert vermutlich durch eine Herunterregulation (Downregulation) von Kaliumkanälen [68]. Die Verlängerung des Aktionspotentials erhöht das Risi- 16 ko des Auftretens von Nachdepolarisationen oder Torsade-de-Pointes Tachykardien. Neben der Verlängerung des Aktionspotentials des Myokards wurde an insuffizienten Herzen eine eingeschränkte Kontraktilität und myokardiale Relaxation festgestellt, was wahrscheinlich mit einer gestörten intrazellulären Kalziumhomöostase zusammenhängt [67]. Aufgrund der gestörten Kalziumhomöostase kann eine spontane Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum resultieren, die zu Nachdepolarisationen und getriggerter Aktivität führen kann [68,69,70]. Zur Erzeugung von Nachdepolarisationen ist die Funktionsweise des NCX von besonderer Bedeutung. Während der Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum generiert der NCX einen einwärts gerichteten elektrischen Strom, der die Membran bis zum Schwellenpotential depolarisiert und so bei einer zusätzlichen Ausschüttung von Kalzium, Nachdepolarisationen erzeugen kann [71,72]. Neben den elektrophysiologischen Veränderungen am Ventrikelmyokard spielen körpereigene Kompensationsmechanismen eine Rolle. So kommt es neben einer gesteigerten Aktivität des neuro-humoralen Systems, mit vermehrter Ausschüttung von Noradrenalin, auch zu einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems. Diese Regulationsmechanismen als auch der Einsatz bestimmter Medikamente wie Diuretika, ACE-Hemmer, ß-Blocker oder der Einsatz von Elektrolytlösungen können zu Elektrolytverschiebungen führen. Hypokaliämie oder Hypomagnesiämie beispielsweise stellen ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Arrhythmien dar [64]. Die sofortige Behandlung von Rhythmusstörungen ist neben der Behandlung der Grundursache und symptomatischen Therapie eine wichtige Maßnahme. Das zu untersuchende Medikament Levosimendan wird zur Kurzbehandlung der akut dekompensierten schweren chronischen Herzinsuffizienz eingesetzt, wenn andere Medikamente und Therapien nicht adäquat angeschlagen haben [73]. Levosimendan greift hierbei in den Kaliziumstoffwechsel der Herzmuskelzelle ein, indem es am Troponin C, der Bindungsstelle für Kalzium, die Affinität gegenüber Kalziumionen erhöht. Dies erzeugt einen positiv inotropen Effekt. Hierbei kommt es zu keiner Beeinträchtigung der diastolischen Relaxation und was noch bedeutender ist zu keiner Hyperkalzämie, welche wiederum zu einer myokardialen Dysfunktion, Arrhythmien bis hin zum Zelltod führen könnte [74]. In dieser Dissertation geht es im Besonderen nicht um den 17 Effekt von Levosimendan auf das insuffiziente Herz, sondern um die mit dem Einsatz von Levosimendan klinisch aufgetretenen Nebenwirkungen wie Hypotension, Kopfschmerzen oder Vorhofflimmern [74,75]. Zur Untersuchung bietet sich das Tiermodell an, wobei sich aus Sicht der Praktikabilität das Kaninchenmodell durchgesetzt hat. Das Kaninchenmodell eignet sich zusätzlich, da das nicht veränderte Myokard deutliche Parallelen zum menschlichen Myokard aufweist [4]. 2.4 Vorhofflimmern Vorhofflimmern ist die in der klinischen Praxis am häufigsten auftretende Form der Arrhythmie. Diese Erkrankung betrifft die gesamte Bevölkerung, wobei Kinder seltener betroffen sind [76]. Im Alter steigt das Risiko deutlich an, sodass circa 20 % der über 85-jährigen Patienten an Vorhofflimmern erkranken [77]. Die Arrhythmieinzidenz ist bei Frauen geringer als bei Männern [78]. Die Bestimmung der exakten Inzidenz ist sehr schwierig, da Flimmerereignisse meistens nur kurz und häufig ohne Symptome auftreten [78]. Genauere Daten bringen Studien bei Schrittmacherpatienten oder dauerhafter EKG-Kontrolle, da so eventuell klinisch unerkannte Flimmerepisoden des Vorhofes aufgezeigt werden [78]. Vorhofflimmern erzeugt häufig weitere kardiale Komplikationen und trägt signifikant zur Morbidität und Mortalität einer Population bei [76]. Beim Vorhofflimmern handelt sich um eine sehr komplexe supraventrikuläre Herzrhythmusstörung mit einer hoch frequenten, irregulären Aktivierung der Vorhöfe, welche in einer Verschlechterung der atrialen Kontraktilität (atrial stunning) resultiert [79]. Die grundlegenden pathophysiologischen Mechanismen sind sehr umfangreich. Man unterscheidet verschiedene Formen von Vorhofflimmern. Bei der meist initial auftretenden paroxysmalen Form kommt es zu einer erhöhten Herzfrequenz mit unregelmäßigem Charakter. Die Symptome beginnen plötzlich und sind nur leicht ausgeprägt. Es kommt zur spontanen Selbstlimitierung innerhalb von 24 Stunden bis maximal einer Woche. Elektrophysiologisch bedingen transiente Abweichungen des natürlichen elektrischen Milieus auslösende Triggermechanismen [80,81]. Bei der 18 persistierenden Form besteht ein über eine Woche anhaltender, anormaler Herzrhythmus, welcher, falls keine Selbstlimitation eintritt, durch den Einsatz von Medikamenten oder elektrischer Kardioversion gestoppt wird [79,81]. Die chronische Form stellt die permanente Form dar, bei der kein physiologischer Herzrhythmus mehr hergestellt werden kann. Bei der permanenten Form des Vorhofflimmerns liegen, aufgrund der meist bestehenden strukturellen Veränderungen, konstante elektrophysiologische Bedingungen vor die zur Entstehung von Flimmerepisoden führen [79,80,81]. Die Formen können im Verlauf einer Erkrankung ineinander übergehen und enden ohne Behandlung meist als permanente Rhythmusstörung [81]. Bei der idiopathischen Form von Vorhofflimmern, auch „Lone Atrial Fibrillation“ genannt, sind häufig keine kardiologischen oder nicht kardiologischen Grunderkrankungen bekannt. Idiopathisches Vorhofflimmern tritt in den meisten Fällen familiär gehäuft auf. Elektrophysiologisch können Ionenkanalveränderungen vorliegen. Bekannt ist hierbei das lange QT-Syndrom, das kurze QT-Syndrom oder Brugada-Syndrom [79,82]. Sekundäre Formen hingegen weisen ursächliche Grunderkrankungen auf. Als Risikofaktoren werden die koronare Herzkrankheit, hypertensive Herzerkrankungen, Kardiomyopathien oder ein rheumatisches Klappenvitium genannt [78]. Nicht kardiologische Erkrankungen, wie Hyperthyreose oder vermehrte Aktivität des Sympathikus, können ebenfalls Vorhofflimmern auslösen [83]. Die pathophysiologischen Erkenntnisse sind in den letzten zehn bis 15 Jahren weit fortgeschritten [76]. Vorhofflimmern zählt zu der Gruppe der tachykarden Herzrhythmusstörungen. Pathologische Grundlagen dieser Gruppe sind zum einen eine abnorme Erregungsbildung (abnorme Automatie) und zum anderen eine Störung der Erregungsleitung (Reentry). Letzteres ist bei der Entstehung von Vorhofflimmern von besonderer Bedeutung [83]. Nattel et al. heben die Rolle des „atrial remodeling“, also von Umbauprozessen auf Vorhofebene besonders hervor. Hierbei kommt es zu einer Erzeugung oder Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern dem proarrhythmische Mechanismen, wie ektopische Aktivität (die zumeist im Bereich der Pulmonalvenen lokalisiert ist [84]) oder Reentry-Mechanismen, zugrunde liegen [76]. 19 Abbildung 4: Entstehung von Vorhofflimmern modifiziert nach Nattel [76] Allgemein wird der Wiedereintritt beziehungsweise das Kreisen von Erregungswellen, sogenanntes Reentry oder Rotoren, als Pathomechanismus beschrieben [83]. Synzytiale Gewebeverbände im Vorhofmyokard garantieren eine allseitige Erregungsausbildung über das gesamte Myokard [85]. Strukturelle Störungen der elektrischen Kopplung der synzitialen Zellverbände ermöglichen eine kreisförmige Ausbreitung von Erregungswellen oder anderen Kreisbahnen (Reentry). Dies führt zu einer frequentierten Aktivierung der Vorhöfe [83]. Reentry bewegen sich entweder entlang anatomisch definierter Bahnen mit konstanter Größe und vorgegebener Lücke oder sind funktionell determiniert und somit von der Größe und Lokalisation variabel [86]. Anatomische Kreisbewegungen erkennt man zum Beispiel bei Vorhofflattern (Typ I), wobei Vorhofflimmern durch multiple Reentry-Kreise funktionell determiniert wird [86]. Voraussetzungen für Reentry sind neben einer inhomogenen Erregbarkeit des Vorhofmyokards eine verkürzte atriale Erregungslänge. So führt zum Beispiel die 20 Anisotropie, das heißt der unterschiedliche Kopplungsgrad der längs und quer zur Faserrichtung angeordneten atrialen Myozyten, zu einer Inhomogenität der Erregbarkeit. Verstärkt wird diese Inhomogenität durch fibrotische, strukturelle Veränderungen, welche bei Kardiomyopathien entstehen [83]. Diese strukturellen Remodelingprozesse können zu einer Aktivierung des atrialen Angiotensinsystems beitragen [87]. Ebenso kann, aufgrund des mechano-elektrischen Feedbacks, eine Dilatation der Vorhöfe zu einer räumlich inhomogenen Verlängerung der Refraktärzeit führen [83]. Weiterhin nehmen nervale Veränderungen Einfluss auf die atriale Refraktärzeit. Eine erhöhte Stimulation des Nervus Vagus, ein erhöhter Sympathikustonus und eine Hyperthyreose bedingen einer Verkürzung der Refraktärzeit und somit Verkürzung der Erregungswellenlänge. Dadurch wird wiederrum die Entstehung von Kreiserregungen gefördert [83]. Die im atrialen Myokard sowieso vorherrschende inhomogene Verteilung der vagalen Innervation ist ein weiterer begünstigender Faktor [80]. Weiterer neuro-humoraler Faktor ist die Ausschüttung von Katecholaminen, was neben einer gesteigerten ektopen Reizbildung auch die Entstehung von Nachdepolarisationen begünstigt [80]. Neben den strukturellen Umbauprozessen spielen elektrophysiologische Veränderungen bei der Entstehung von Reentry eine wichtige Rolle. Nach neueren Befunden hat sich herausgestellt, dass eine länger andauernde tachykarde Erregung die elektrische Beschaffenheit des Vorhofmyokards nachhaltig beeinflusst. Diese Veränderungen sind unter dem Begriff „elektrisches Remodeling“ zusammengefasst. Hier inbegriffen sind die Reduktion des transienten KaliumAuswärtsstroms Ito, sowie die Reduktion des langsamen Kalzium-Einwärtsstroms ICaL. [83]. Dem entgegen steht eine Erhöhung der Amplitude und Funktion des einwärts gerichteten Kaliumstroms IK1 [87]. Beides führt zu einer Verkürzung der atrialen Refraktärzeit und der Aktionspotentialdauer [83,87]. Das elektrische Remodeling stellt somit einen Schutzmechanismus der Herzmuskelzelle dar. Die Herzmuskelzelle schütz sich vor einer Kalziumüberladung, die zum Zelltod führen könnte. Diese resultiert aus der frequentierten Vorhoferregung mit einhergehender verkürzter diastolischer Funktion [82]. Man geht davon aus, dass über mehrere Tage anhaltende atriale Flimmerepisoden über das elektrische Remodeling zu einer Verkürzung der atrialen Aktionspotential- 21 dauer und Leitungsgeschwindigkeit führen. Hierdurch verlieren auslösende und erhaltende Faktoren ihre Relevanz. Die Verkürzung der atrialen Aktionspotentialdauer bedingt im weiteren Krankheitsverlauf eine Verminderung der zellulären KaliziumAufnahme. Dies führt zu einer mechanischen Lähmung des Atriums (atrial stunning) und äußert sich als Vorhofdilatation, was wiederum einen neuen Trigger zur Aufrechterhaltung des Vorhofflimmerns darstellt. Das bedeutet, dass nach einem initialen Reiz die Erkrankung durch die eigenständige Produktion von Triggermechanismen weiter fortschreitet und häufig nur durch äußerliche Manipulation terminiert werden kann [79]. Therapeutisch muss die Behandlung der klinischen Symptome, wie Palpitation, Dyspnoe und Schwindel im Vordergrund stehen zur Erhöhung der Lebensqualität. Ebenso muss die Gefahr auftretender thrombembolischer Komplikationen reduziert werden. Grundsätzlich unterscheidet man zwei verschiedene Ansatzpunkte: zum einen die Frequenzkontrolle und zum anderen die Rhythmuskontrolle [79,87]. Ursprünglich verwendete ionenkanalblockierende Antiarrhythmika der Klasse IA (Natriumkanalblocker, wie Chinidin), IC (Natriumkanalblocker, wie Flecainid) und Klasse III (Kaliumkanalblocker, wie Amiodaron) werden in neueren Studien, von nicht ionenkanalblockenden Medikamenten, unterstützt und eventuell abgelöst [87]. Hierzu zählen zum Beispiel ACE-Hemmer und AT-1 Hemmer [87]. Da das elektrische Remodeling durch Veränderung von Ionenkanälen zustande kommt, sind ionenkanalblockierende Medikamente zur Behandlung von Vorhofflimmern bis heute sehr effektiv. Negativ zu beurteilen sind die nicht unerheblichen Auswirkungen der Antiarrhythmika auf die ventrikuläre Repolarisation [88]. So ist bekannt, dass der Einsatz von Natriumkanalblockern bei Patienten mit strukturellen Herzerkrankungen oder koronaren Veränderungen, aufgrund der potentiellen Verkürzung der ventrikulären Leitungszeit, kontraindiziert ist [88]. Ebenso kann der Einsatz von Kaliumkanalhemmern, über eine Ausdehnung der ventrikulären Repolarisation, zum erworbenen langen QT-Syndrom und TdP-Tachykardien führen [88]. Medikamente wie Amiodaron, welche gleichzeitig mehrere Ionenkanäle inhibieren, werden aufgrund ihrer Multiorgan-Toxizität seltener eingesetzt [88]. Neben dem Einsatz nicht antiarrhythmischer Medikamente wie ACEHemmern wird an der Produktion selektiver, atrialer Ionenkanalhemmer geforscht. 22 Besonders im Fokus stehen die Kanäle IKur, IKAcH und Connexin-40 (CX40) [88]. Eventuelle Kombinationen mehrerer Medikamente zur gleichzeitigen Blockade unterschiedlicher Kanäle (INa, IKur, Ito, IKr) stehen im Fokus der Wissenschaft [88]. Zum heutigen Zeitpunkt sind keine atrial selektiv wirkenden Medikamente auf dem deutschen Markt verfügbar. Nicht ausschließlich atrial selektive Medikamente wie Ranolazin, welches den Natriumkanal INa hemmt, finden in klinischen und experimentellen Studien Anwendung. Auch in dieser Studie soll die Wirkung von Ranolazin auf die mögliche Inhibition durch Levosimendan hervorgerufenen Vorhofflimmerns untersucht werden. Zu den nicht pharmakologischen Behandlungen zählen Katheterablationsverfahren, kardiochirurgische Methoden und elektrotherapeutische Interventionen. Letztere beinhalten die Implantation eines atrialen Defibrillators, was jedoch klinisch keinen Stellenwert hat. Nicht pharmakologische Methoden sind auf dem Vormarsch, da Patienten mit einer Neigung zur chronischen elektrischen Instabilität der Vorhöfe und Vorhofflimmern trotz medikamentöser, antiarrhythmischer Therapie an Rezidiven leiden. Nach etwa einem Jahr treten bei 40-60 % dieser Patienten Rezidive auf [89]. In der Tierwelt ist Vorhofflimmern ebenfalls weit verbreitet. Bei Hunden tritt Vorhofflimmern im Zusammenhang mit der dilatativen Kardiomyopathie auf. Besonders betroffen sind Irische Wolfshunde [90]. Bei Pferden stellt Vorhofflimmern die häufigste Arrhythmie dar. Vorhofflimmern beim Pferd ist eine für den Tierarzt schwer einschätzbare Erkrankung. Häufig erkranken Pferde, die jahrelang im Sport eingesetzt wurden. Bei Routinekontrollen auftretendes Vorhofflimmern muss nicht unbedingt therapiert werden. Berichten die Patientenbesitzer jedoch von einer Leistungsdepression ohne oder mit zusätzlicher Veränderung der Hämodynamik, muss das Vorhofflimmern als ein erheblicher Befund gewertet werden [91]. Zur Behandlung von Vorhofflimmern beim Hund werden vornehmlich Herzglykoside eingesetzt [92]. 23 2.5 Plötzlicher Herztod In unserer heutigen westlichen, industrialisierten Gesellschaft stellt der plötzliche Herztod (PHT), auch sudden cardiac death (SCD) oder Spontantod genannt, ein häufig auftretendes und vorher nicht absehbares Problem dar. Klinisch wird der plötzliche Herztod als natürlicher, unerwarteter Tod kardialer Genese beschrieben, bei dem es innerhalb eines Zeitintervalls von weniger als einer Stunde zwischen Beginn der Symptome und Eintritt des Todes zu einem Herz-Kreislaufstillstand kommt [93,94]. Die genaue Ermittlung statistischer Daten zur Häufigkeit des plötzlichen Herztodes ist sehr schwer, da aufgrund des unvorhersehbaren Eintretens in den meisten Fällen keine Zeugen anwesend sind. Zusätzlich liegt aufgrund der Komplexität der Erkrankung kein einheitliches und somit statistisch vergleichbares Patientenkollektiv vor [93,94]. Daher sollte man bei einem nicht beobachteten, plötzlichen Tod nur dann vom plötzlichen Herztod sprechen, wenn er innerhalb von Sekunden oder höchstens Minuten zum Herz-Kreislauf-Versagen führte und der Tod unmittelbar folgte [95]. Die bekannten epidemiologischen Werte beruhen größtenteils auf Schätzungen. Man geht davon aus, dass europaweit jährlich mehr als 700.000 Menschen dem plötzlichen Herztod erliegen [96]. Auf Deutschland bezogen sind das zwischen 70.000-100.000 Menschen pro Jahr. Im Vergleich dazu erleiden in den USA bereits 450.000 Menschen, die über 35 Jahre alt sind, den SCD, was in etwa die Hälfte aller kardial bedingten Todesfälle beziffert [95,97]. Die Grundursachen oder prädisponierende Faktoren sind dabei häufig nicht eindeutig aufzeigbar, wodurch der SCD als multifaktorielles Geschehen angesehen wird [95]. Die Komplexität der auslösenden Mechanismen erschwert die Identifikation von Hochrisikokollektiven und macht somit eine zeitliche Vorhersagbarkeit für das Eintreten eines SCD fast unmöglich [94]. Das Heimtückische am plötzlichen Herztod ist die Erkenntnis, dass eine Vielzahl an Patienten vor dem Tod klinisch gesund und frei von Symptomen waren [97]. Grundsätzlich werden drei verschiedene kardiologische Veränderungen beschrieben, die als auslösende Faktoren für den SCD gelten. Hierzu zählen die KHK, wozu der Herzinfarkt zählt, Herzmuskelerkrankungen (Kardiomyopathien) und elektrische Herzerkrankungen [96]. Weitere in den USA beschriebene Erkrankungen sind hypertensive Herzerkrankungen, Herzklappenfehler oder Herzinsuffizienzen unbekannter 24 Genese. Bei zehn bis 12 % der verstorbenen Patienten konnte keine kardiale Ursache nachgewiesen werden [95]. Als Hauptursache, mit einer Häufigkeit von 90 %, werden tachykarde Rhythmusstörungen wie ventrikuläre Tachykardien oder Kammerflimmern beschrieben. Bradykarde Rhythmusstörungen (fünf bis zehn Prozent) die bis zur Asystolie führen, spielen hingegen nur eine untergeordnete Rolle [93,95]. Bei einer Vielzahl der verstorbenen Patienten liegen strukturelle und elektrophysiologische Veränderungen des Ventrikels vor, die eine tachykarde Herzrhythmusstörung verursachen. Hierzu gehören vorrangig die KHK oder dilatative Kardiomyopathie [98]. Im chronisch belasteten, hypertrophen oder insuffizienten Herzen kommt es zu einer adaptiven Modellierung des ursprünglich, genetischen Codes, was eine veränderte Funktion von Proteinen zur Folge hat. Durch elektrophysiologische und strukturelle Umbauprozesse (besonders Fibrosen), entsteht ein arrhythmogenes Potential [97]. Diese genetischen Mutationen werden nicht primär als verlängertes Aktionspotential oder QT-Intervall sichtbar. Die komplexe Modifikation repolarisierender Ionenkanäle führt zu einer Verminderung der Repolarisationsreserve. Das bedeutet, dass der zelluläre Puffer zur Abdämpfung schwankender repolarisierender Ströme des Aktionspotentials minimiert wird [97]. Die Repolarisationsreserve gewährleistet eine gewisse elektrophysiologische Stabilität und verhindert nebenbei eine durch äußerere Einflüsse hervorgerufene QT-Verlängerung [99,100]. Nachweislich ist diese Stabilität bei einem Ausfall der für die Repolarisation wichtigen Mechanismen (z.B. Herunterregulation von IKr) nur gegeben, solange keine zusätzlichen Faktoren, wie Mutation von Ionenkanälen, Herzinsuffizienz oder Linksherzhypertrophie vorliegen [99,101]. Neben Patienten mit strukturellen Veränderungen erkranken in fünf bis zehn Prozent der Fälle herzgesunde Menschen, die keine pathologischen Abweichungen am Ventrikel aufweisen. Häufiger sind davon junge Menschen unter 40 Jahren betroffen, auf die im späteren Verlauf näher eingegangen wird [98]. Als Mechanismus für Rhythmusstörungen spielen eine gesteigerte und abnorme Automatie, getriggerte Aktivität sowie kreisende Erregungen, sogenannte Reentry Mechanismen eine Rolle. Kreisenden Erregungen machen hierbei einen Großteil aus [93,94,95]. Laut der MERIT-HF Studie zeigt sich ein Zusammenhang mit dem Schweregrad der klinischen Manifestation der Herzinsuffizienz nach NYHA-Klassifikation und der Art 25 des Todes. So kommt es bei Patienten aus NYHA-Klasse III-IV häufiger zu einem Tod aufgrund von Pumpversagen, während ein großer Anteil der Patienten aus Klasse I und II dem plötzlichen Herztod erliegen [95]. Ähnliche molekulare Mechanismen der Arrhythmogenese finden sich auch bei erworbenen adaptiven und angeborenen arrhythmogenen Erkrankungen wieder. Angeborene arrhythmogene Erkrankungen können durch von Geburt an bestehende genetischen Variationen kardialer Ionenkanäle, Proteinen des kontraktilen Apparates, der intrazellulären Kalziumspeicher oder Zell-Struktur-Proteinen hervorgerufen werden [97]. Von den in der Gesamtheit der Todesfälle selten auftretenden, angeborenen Ursachen für SCD sind vor allem junge Patienten betroffen. Häufig weisen diese Patienten keine, oder nur geringe strukturelle Veränderungen am Ventrikel auf, wodurch man primär elektrische Erkrankungen des Herzens differentialdiagnostisch betrachten muss [97,98]. Zu den elektrischen Herzerkrankungen, die zum plötzlichen Herztod führen können zählen unter anderem das short QT-Syndrom (SQTS), das lange QT-Syndrom (LQTS) oder auch das Brugada-Syndrom [97,98,102]. Diese Erkrankungen ermöglichen Rhythmusstörungen wie Torade de Pointes Tachykardien, welche in Kammerflimmern übergehen können [98]. Als wichtige prognostische Marker zur frühzeitigen Erkennung von Patienten mit erhöhtem Risiko für SCD, haben sich der Schweregrad der Herzinsuffizienz nach NYHA-Klassifizierung und die echokardiographisch bestimmte linksventrikuläre Auswurffraktion von weniger als 30 % als sinnvoll erwiesen [95]. Elektrophysiologische Parameter, wie die QT-Zeit besitzen eine niedrige positive Vorhersagewahrscheinlichkeit, können aber Patienten mit einem niedrigen Risiko für SCD erkennen. Neben den dargestellten Markern und Parametern spielen das Alter und vorangegangene Erkrankungen eine Rolle. So erhöht ein überlebter Myokardinfarkt, durch die Entstehung einer fibrotischen Narbe und somit strukturellen Modellierung des Myokards, das Risiko für einen plötzlichen Herztod [97]. Bezüglich der Therapieoptionen ist eine frühzeitige Defibrillation innerhalb von drei bis fünf Minuten nach Eintreten der ersten Symptome zwingend notwenig, um einer irreversiblen Hirnschädigung oder dem Tod zu entgehen. Während die Langzeit- 26 therapie medikamentöser Therapiestrategien nicht zu einer signifikanten Reduktion des PHT geführt hat, konnte sich die Implantation von Defibrillatoren als Primär- und Sekundärprävention etablieren [95]. 2.6 Untersuchte Substanzen 2.6.1 Levosimendan Der seit Februar 2014 in Deutschland verfügbare Wirkstoff Levosimendan wird unter dem Handelsnamen Simdax® vertrieben. Es handelt sich um einen herzwirksamen Kalzium-Sensitizer, welcher die Selektivität kontraktiler Proteine erhöht. Levosimendan gehört der Gruppe der Pyridazinon-Dinitrile an [103]. Die positiv inotrope Wirkung kommt über die Erhöhung der systolischen Affinität der kontraktilen Filamente, insbesondere von Troponin C, gegenüber Kalziuminonen zustande [74,103]. Levosimendan bindet wie Kalzium an die N-terminale Domäne des Troponin C und führt neben einer Stabilisierung der Konformation zu einer Verlängerung der AktinMyosin-Querbrückendauer [74,103]. Die Bindung am Troponin C löst einen positiv inotropen Effekt aus, ohne Beeinflussung der diastolischen Funktion. Ebenso wird kein zytoplasmatischer Kalziumüberschuss erzeugt, welcher zu einer myokardialen Dysfunktion, Arrhythmien bis hin zum Zelltod führen könnte [74,104]. Die Besonderheit von Levosimendan wird im Vergleich mit anderen Kalzium-Sensitizern deutlich. Normalerweise findet die Bindung der Medikamente an den Troponin C-CalciumKomplex statt und beeinflusst damit sowohl die systolische, als auch diastolische Funktion. Im Kontrast dazu bindet Levosimendan direkt an eine Domäne vom Troponin C. Diese Bindung ist abhängig von der zytoplasmatischen Kalziumkonzentration und während der Diastole, durch eine geringere Kalziumsensitivität und intrazellulären Kalzium-gehalt, niedriger [74,104,105]. Weitere positive Effekte auf die Herztätigkeit sind eine Erhöhung des Herzzeitvolumens und eine Unterstützung der diastolischen Herz-funktion. Durch den lusitropen Effekt, welcher von der Geschwindigkeit des Kalziumtransportes aus dem Zytoplasma abhängt, behält das Myokard seine Fähigkeit zur schnellen und vollständigen Erschlaffung [103]. Der myokardiale Sauerstoffverbrauch bleibt trotz der erhöhten Herzfunktion konstant [103]. Neben dem 27 positiv inotropen Effekt steht die vasodilatatorische Funktion im Vordergrund. Die Aktivierung Adenosintriphosphat (ATP) sensitiver Kaliumkanäle (KATP) an glatten Muskelzellen löst eine generalisierte Vasodilatation aus und führt zu einer Verminderung der links- und rechtsventrikulären Vor- und Nachlast [103]. Kardioprotektive Eigenschaften und eine Reduktion der Stunning-Phänomene kommt über eine Aktivierung ATP abhängiger mitochondraler Kaliumkanäle (KATP) in Kardiomyozyten zustande [103,106]. Des Weiteren aktiviert Levosimendan kalzium- und spannungsabhängige Kaliumkanäle (KCa2+,Kv) [104]. Zudem sind eine simultane Hemmung der Phosphodiesterase und anti-inflammatorische Wirkungen beschrieben [74,103]. Levosimendan wird in vielen Studien als antiarrhythmisch und frequenzneutral dargestellt [74,103], wobei im klinischen Gebrauch Rhythmusstörungen wie Vorhofflimmern aufgetreten sind. Das proarrhythmische Potential von Levosimendan ist zu diskutieren. Zusammenfassend kann die Wirkung von Levosimendan als positiv inotrop, mit Steigerung der myokardialen Kontraktilität und Erhöhung der linksventrikulären, diastolischen Funktion, bei niedrigem Sauerstoffverbrauch und zweifelhaft geringem proarrhythmischem Risiko beschrieben werden [74,103]. Klinische Einsatzgebiete sind die Behandlung der akut, dekompensierten, chronischen Herzinsuffizienz. Bei der akuten Herzinsuffizienz (bei Patienten mit kardialer Ischämie), bei Rechtsherzversagen und kardiogenem oder septischen Schock kommt Levosimendan ebenfalls zum Einsatz. Levosimendan wird hierbei bei Patienten eingesetzt, bei denen andere Medikamente versagen. [103]. Die Applikation findet über eine einmalige Bolusinjektion oder per Infusion über 24 Stunden statt. Bei einer einmaligen Bolusinjektion besteht die dringende Gefahr eines starken und plötzlichen Blutdruckabfalls [103]. Die Halbwertszeit (HWZ) beträgt eine Stunde, wobei der im Darm metabolisierte, aktive Metabolit OR-1896 eine HWZ von 75-80 Stunden aufweist. Das bedeutet, dass aufgrund des aktiven Metaboliten die hämodynamischen Effekte bis zu sieben bis neun Tage nach der Infusion anhalten [103]. Zu den klinisch aufgetretenen Nebenwirkungen zählen Hypotonie, Tachykardie, Kopfschmerzen, Hypokaliämie und Vorhofflimmern [73,107,108,109]. Gegenanzeigen sind hypotensive Patienten, eine eingeschränkte Leber- und Nieren-funktion, Tachykardien oder TdP-Vorkommen [74,104]. 28 Ebenso sollte man Levosimendan nicht mit anderen Phosphodiesterase-III-Hemmern kombinieren, da es eine Hypotonie bei peripherer Vasodilatation auslöst [103]. Eine der wichtigsten zu beantworteten Fragen ist, ob Levosimendan ein proarrhythmisches Potential besitzt. Vorangegangene klinische Studien liefern kontroverse Ergebnisse. 29 Tabelle 2: Übersicht zum bisherigen Erkenntnisstand zu Levosimendan Studie LIDO [110] Teilnehmer 203 Patienten, doppelverblindet, randomisiert RUSSLAN 504 Patienten, [111] doppelverblindet, randomisiert, Parallelgruppen Grunderkrankung der Patienten Herzinsuffizienz mit geringer Auswurfleistung Medikamente Endpunkte Arrhythmogenese Levosimendan vs. Dobutamine Klinische Ausprägung der Erkrankung, hämodynamische Leistungssteigerung, Mortalität 1. Reduktion von Rhythmusstörungen (Extrasystolen, Tachykardien, Bradykardien, Vorhofflimmern, Kammerflimmern) 2. Deutliche Verbesserung der Hämodynamik unter Levosimendan 3. Geringere Mortalität nach 180 Tagen unter Levosimendan Linksherzinsuffinzienz Levosimendan nach vs. einem akuten Myokard- Placebo infarkt 1. Hypotension und myokardiale Ischämie 2. Verschlechterung der Herzinsuffizienz, klinische Ausprägung und Mortalität 1. Häufigeres Auftreten von Ischämie und Hypotension bei hochdosierter Levosimendangabe 30 2. Kein proarrhythmisches Potential, kein signifikantes Risiko für Vorhofflimmern 3. Geringer Mortalität durch Levosimendan PORTLAND [112] 129 Patienten Dekompensierte systolische Herzinsuffizienz Levosimendan Sicherheit und Effektivität bei Behandlung der dekompensierten Herzinsuffizienz 1. Keine Erhöhung der Herzfrequenz 2. Keine supraventrikulären Arrhythmien oder anhaltende ventrikuläre Tachykardien SURVIVE [108] 1.327 Patienten, doppelverblindet, randomisiert Ausgeprägte systolische Herzinsuffizienz Levosimendan vs. Dobutamine Mortalität 1. Levosimendan zeigt eine höhere Inzidenz für das Auftreten von Vorhofflimmern, Kopfschmerzen und Hypokaliämie 2. Keine signifikante Reduktion der Mortalität gegenüber Dobutamine 31 REVIVE I und II [107] REVIVE I mit 100 Patienten Akute dekompensierte REVIVE II mit 600 Patienten, , Herzinsuffizienz doppelverblindet, randomisiert, Parallelgruppen Meta139 Patienten aus fünf Analyse randomisierten, Zangrillo et kontrollierten Studien al. [113] Effekte von Levosimendan auf operative Herzpatienten Levosimendan vs. Placebo Klinische Symptome und Mortalität Höhere Inzidenz für die Entstehung von Vorhofflimmern, ventrikuläre Tachykardien, Hypotension und Kopfschmerzen Levosimendan Postoperative kardiale Troponin Freisetzung 1. Verminderter postoperativer Troponin Peak (Kardioprotektion) 2. Keine Folgen wie Vorhofflimmern, Myokardinfarkt oder erhöhte Mortalität Meta440 Patienten aus Analyse zehn randomisierten, Landoni et kontrollierten Studien al. [114] Patienten nach einer Herzoperation Levosimendan Postoperative Mortalität 1. Signifikante Reduktion postoperativer Mortalität 2. Reduktion von Vorhofflimmern De Hert et al. [115] Klinische Studie mit 60 Patienten Patienten vor und nach Levosimendan einem vs. kardiopulmonalen Milrinone Bypass Schlagvolumen, Vorhofflimmern Geringeres Auftreten von Vorhofflimmern unter Levosimendan 32 Meta729 Patienten aus 17 Studien Analyse Maharaj et al. [116] Patienten nach einer koronaren Revaskularisation Herzoperation Levosimendan vs. Placebo Mortalität, Vorhofflimmern 1. Reduktion von Vorhofflimmern 2. Geringere Mortalität LEAFStudie [117] 61 Patienten Doppelverblindet, randomisiert Patienten mit Levosimendan ST-Hebungsinfarkt und vs. Herzinsuffizienz Placebo Hypotension, Mortalität und Rhythmusstörungen 1. Häufigeres Auftreten von Hypotension während der Infusion von Levosimendan 2. Keine höhere Inzidenz für Vorhofflimmern oder ventrikuläre Arrhythmien 3. Keine höhere Mortalität 33 Das Ziel dieser Arbeit ist es, das proarrhythmische Potential von Levosimendan in experimentellen Untersuchungen am isolierten Kaninchenherzen nachzuweisen, da diese bedeutenden Untersuchungen auf Organebene noch nie durchgeführt wurden. Hiermit wird ein weiterer Grundstein zur Erforschung der Arrhythmogenese von Levosimendan gelegt, wodurch der klinische Einsatz erleichtert wird. Zudem ist es in diesem Modell möglich, die Wirkung von Levosimendan alleine und in Kombination mit anderen antiarrhythmisch wirkenden Substanzen zu vergleichen. Als weiteren Schritt können Vor- und Nachteile bestimmter Medikamentenkombinationen aufgezeigt werden. 2.6.2 Ranolazin Ranolazin ist ein Medikament aus der Gruppe der Piperazinderivate und wird unter dem Handelsnamen Ranexa® vertrieben. Bei Ranolazin handelt es sich um einen sehr gut verträglichen, relativ selektiven Hemmer des späten Natriumstroms (INa,L). Neben der Hemmung des Natriumstroms besitzt Ranolazin weitere vorteilhafte metabolische Eigenschaften und zeigt keinen Effekt auf die Herzfrequenz oder den Blutdruck [118]. In Europa und den USA wird Ranolazin als Medikament der zweiten Wahl zur Behandlung der chronischen, stabilen Angina pectoris eingesetzt [118]. In therapeutischen Dosierungen inhibiert es neben Natriumkanälen auch Kaliumkanäle. Besonders erforscht ist jedoch die Inhibierung des späten, einwärts gerichteten Natriumstroms in ventrikulären Myokardzellen zum Zeitpunkt der Repolarisation [118]. Dieser Mechanismus schützt die Zelle vor einem Kalziumüberschuss und unterbindet die diastolische, kontraktile Dysfunktion [118]. In mehreren, bereits durchgeführten klinischen und experimentellen Studien, zeigt sich ein einheitliches Bild. So konnten Antzelevitch et al. [119] an isolierten, caninen, ventrikulären Myozyten und arteriell perfundierten, linksventrikulären Präparaten die Wirkung von Ranolazin auf Ionenkanäle nachweisen. Der Einsatz von Ranolazin an caninen linksventrikulären Myozyten führte zu einer Inhibition des späten Natriumkanals I Na, des Kaliumkanals IKr und IKs, des späten Kalziumkanals ICa und Peak ICa sowie des INa-Ca Austauschers. Es konnte nur eine geringe oder sogar keine Beeinflussung der Kanäle I to und IK1 nachgewiesen werden [119]. In dieser Studie wird deutlich, dass Ranolazin sowohl einwärts gerich- 34 tete depolarisierende Ströme, als auch auswärts gerichtete repolarisierende Strome hemmt. Die Hemmung von IKr löst eine Verlängerung der Aktionspotentialdauer aus und gleicht die Verkürzung der selbigen durch die Hemmung von I Na und ICa,L aus. Insgesamt differenziert sich Ranolazin deutlich von anderen Medikamenten, die selektiv den Kanal IKr hemmen und als Nebeneffekt zum Beispiel TdP induzieren. Häufig auftretende Nebenwirkungen, wie eine verlängerte Aktionspotentialdauer, getriggerte Aktivität, frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarizations, EAD), erhöhte lokale Dispersion der Repolarisation oder tachykarde Arrhythmien wurden nicht festgestellt. Dem hingegen zeigte der Einsatz von Ranolazin eine Minimierung des Risikos zur Entstehung von EADs und eine Reduktion der transmuralen Dispersion der Repolarisation [119]. In M-Zellen und epikardialen Ventrikelzellen wies Ranolazin, selbst in hohen Konzentrationen, keine Auswirkungen auf das Ruhemembranpotential oder die Aktionspotential-Amplitude auf. Der Nettoeffekt von Ranolazin führt zu einer mäßigen QT-Intervall-Verlängerung [119]. Weitere experimentelle Studien wurden an isolierten atrialen Myozyten [120], caninen, pulmonalen Venenpräparaten [121] und intakten Schweineherzen [122] durchgeführt. Burashnikov et al. [120] schilderten, mit Versuchen an atrialen Myozyten, eine atriale Selektivität zur Blockade nutzungsabhängiger Natriumkanäle, was zu einer Reduktion von Vorhofflimmern führt ohne relevanten oder allenfalls geringfügigen Einfluss auf die Elektrophysiologie des Ventrikels [120]. Vorangegangene Studien mit dem Ganzherz Kaninchenmodell zeigten, dass der alleinige Einsatz von Ranolazin in Kaninchen mit einer induzierten chronischen Herzinsuffizienz zu einer Verminderung von Vorhofflimmern führt [123,124]. Neben einer erhöhten atrialen Erregungsleitungszeit stabilisiert Ranolazin die atriale Repolarisation [123]. In anderen Versuchen erschlossen sich synergistische Effekte bei einem kombinierten Einsatz von Ranolazin und Klasse III Antiarrhythmika [125,126]. So konnte die zu verabreichende Dosis von Amiodaron oder Dronedaron, in Kombination mit Ranolazin reduziert und Nebenwirkungen, wie frühe Nachdepolarisationen und eine Steigerung der Dispersion der Repolarisation vermieden werden [125,126]. 35 In dieser Studie soll nachgewiesen werden, ob durch den gemeinsamen Einsatz von Levosimendan und Ranolazin das als Nebenwirkung von Levosimendan auftretende Vorhofflimmern reduziert oder gegebenenfalls vollständig unterdrückt werden kann. 2.6.3 Dantrolen Bei Dantrolen (Dantamacrin®) handelt es sich um einen Wirkstoff aus der Gruppe der peripheren Muskelrelaxantien. Anders als andere Muskelrelaxantien beeinflusst Dantrolen nicht die neuromuskuläre Endplatte sondern greift in den Kalziumstoffwechsel des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) des Skelettmuskels ein [127]. Das Haupteinsatzgebiet ist die Behandlung der malignen Hyperthermie. Die maligne Hyperthermie ist eine Erkrankung der Skelettmuskulatur und wird bei Menschen, Pferden, Hunden und Schweinen beschrieben. Besonders häufig tritt die Erkrankung bei Schweinen auf und ist in der Veterinärmedizin unter dem Begriff „porcines Stresssyndrom“ bekannt. Der Erkrankung liegt eine angeborene Mutation des Ryanodinrezeptors zugrunde, bei dem es sich um den größten Kalziumkanal des sarkoplasmatischen Retikulums der Skelettmuskulatur handelt [127,128]. Klinisch zeigen sich spastische, generalisierte Kontraktionen der Skelettmuskulatur, die bis zum Tod führen können. Ausgelöst wird das Syndrom durch Inhalationsnarkotika wie Halothan oder Isofluran, depolarisierende Muskelrelaxantien wie Suxamethonium, Serotoninantagonisten oder vorrangig Stress. Über den mutierten Ryanodinrezeptor kommt es zu einer erhöhten Kalziumausschüttung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, was eine generalisierte Kontraktion der Skelettmuskulatur bewirkt. Durch die generalisierte Kontraktion erhöht sich der Stoffwechsel der Myozyten. Als Folge entsteht eine Hyperthermie, der Kohlendioxidpartialdruck (pCO2) steigt an, Laktat wird vermehrt gebildet, wodurch der pH-Wert absinkt. Ohne Behandlung kommt es im weiteren Verlauf zum Tod durch Herzversagen. Das Herzversagen entsteht aufgrund des nicht kompensierbaren Sauerstoffverbrauches und der hohen Kalziumwerte [127]. Dantrolen greift genau an diesem Rezeptor an. Über eine direkte oder indirekte Bindung wird der Rezeptor inhibiert. Das führt zu einer Herabsetzung der intrazellulären Kalziumkonzentration [128]. Verbreitet wurde diese Genmutation über Schweine der Rasse Pietrain. Im Jahre 1960 lag die Mortalität bedingt durch die ma- 36 ligne Hyperthermie noch bei circa 80 %. Durch züchterische Selektion bei Schweinen konnte die Mortalität auf unter zehn Prozent reduziert werden [128]. Weitere Behandlungsgebiete sind spastische Zustände, Querschnittslähmung, Kinderlähmung, neuroleptic malignand syndrome (NMS), Rhabdomyolyse beim Pferd, multiple Sklerose oder auch die Behandlung der Ectasy-Intoxikation [127,128]. Kontraindikationen bestehen bei gleichzeitigem Auftreten von Leberschäden oder Myokardinsuffizienz [127]. Die Anwendung von Dantrolen ist aufgrund seines hohen pH-Wertes streng intravenös. Zudem ist es nur schwer wasserlöslich und nach Herstellung mit Natriumhydroxid (NaOH) und Mannitol nicht lange stabil. Aufgrund seiner aufwendigen und lang andauernden Bereitstellung ist Dantrolen nicht als Notfallmedikament geeignet, jedoch die einzige Therapiemöglichkeit der malignen Hyperthermie [127]. Neben den Ryanodinrezeptoren in der Skelettmuskulatur befinden sich ebenfalls gleichnamige Rezeptoren im Herzen. RyR2 ist der größte Kalziumkanal im sarkoplasmatischen Retikulum des Herzens. Dieser Kanal besteht aus vier porenbildenden Untereinheiten und beinhaltet zudem viele verschieden Proteine, die wiederum für die Regulierung von Kanälen zuständig sind. Eine weitere Regulierung findet über die S-Nitrosylation, Oxidation und Phosphorylierung statt. Verantwortlich ist der RyR2 für die Stimulus-Kontraktions-Kopplung, bei dem ein elektrischer Impuls zur Depolarisation eine Kontraktion des Herzens auslöst. Hierbei korrelieren die Stärke der Kalziumausschüttung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum und die Ausprägung der Kalzium-Amplitude mit der Stärke der systolischen Kontraktion. Physiologisch kommt es zu einem Kalziumeinstrom über Kalziumkanale vom L-Typ (ICa-L), wodurch zusätzlich über den RyR2 Kalzium aus dem SR freigesetzt wird. Der Kalziumeinstrom initiiert über aktivierte Myofilamente die Kontraktion. Die diastolische Relaxation tritt ein, sobald Kalzium durch den SERCA2a Kanal zurück in das SR transportiert wird und aus den Myozyten durch den NCX1 Kalziumionen ausgeschleust werden. Genau wie an der Skelettmuskulatur kann es im RyR2 Rezeptor zu Mutationen kommen. Diese Mutationen, verursacht durch eine veränderte Phosphorylierung, begünstigen eine Leckage im SR. Die vermehrt freigesetzten Kalziumionen bedingen Umbauprozesse im Myokard und beeinflussen die Kontraktilität. Spontane Kalziumfreisetzungen aus dem SR provozieren späte Nachdepolarisationen und eine gesteigerte Aktivität, was 37 jeweils auslösende Faktoren für Kammer- oder Vorhofflimmern darstellen [129]. Fraglich ist, ob der Einsatz von Dantrolen am Herzen das Auftreten dieser kardialen Rhythmusstörungen vermindern kann. 2.7 Hypothese In dieser Dissertation soll anhand von experimentellen Untersuchungen am isolierten Langendorff-Perfundierten Kaninchenherzen die Wirkungsweise und das proarrhythmische Potential vom Kalzium-Sensitizer Levosimendan untersucht werden. Klinische Studien zum arrythmogenen Potential von Levosimendan weisen kontroverse Ergebnisse auf. Experimentelle Studien sind bis zum heutigen Tag nur selten durchgeführt worden. Weiterhin soll die Art der auftretenden Rhythmusstörung klassifiziert werden. Entsteht, wie in den klinischen Studien beschrieben, Vorhofflimmern oder können andere ventrikuläre Rhythmusstörungen durch Levosimendan induziert werden. Des Weiteren soll untersucht werden, ob es bei einer kombinierten Gabe antiarryhtmischer Medikamente wie Ranolazin und Dantrolen möglich ist, eventuell auftretende Rhythmusstörungen zu terminieren. 38 3 Material und Methoden 3.1 Versuchstiere Bei den für die Versuche verwendeten Tieren handelt es sich ausschließlich um gesunde Kaninchen der Rasse „weiße Neuseeländer“. Die Unterbringung der Tiere erfolgte in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) des Universitätsklinikums Münster, Albert-Schweizer-Weg 1, Gebäude A8, 48149 Münster. Die Tiere wurden in Räumen mit einer durchschnittlichen Temperatur von 20° Grad und einer Luftfeuchtigkeit von 60 % gehalten. Die Haltungsform entsprach einer Kleingruppenhaltung von maximal acht Kaninchen, auf mit Stroh ausgelegtem Boden. Von diesen Kleingruppen befanden sich maximal drei gefüllte Abteile, somit vierundzwanzig Kaninchen in einem Raum. Die Fütterung mit Heu und pelettiertem Futter, frischem Trinkwasser, sowie die Pflege der Tiere wurden von ausgebildetem Fachpersonal des ZTE durchgeführt. Der Gesundheitszustand der Tiere wurde regelmäßig sowie vor jedem Versuch von einem Tierarzt kontrolliert. Eine Genehmigung zur Verwendung und Tötung der Tiere zu Versuchszwecken wurde am 21.08.1998 unter dem Aktenzeichen A43/96 von der Bezirksregierung Münster ausgestellt. Ausschließlich weibliche Kaninchen mit einem durchschnittlichen Gewicht von 3,5 Kilogramm wurden verwendet. Die Geschlechtsspezifizierung ist darauf zurückzuführen, dass das Geschlecht einen deutlichen Einfluss auf die Elektrophysiologie des Herzens zeigt. So ist bekannt, dass Frauen im Vergleich zu Männern über eine deutlich höherer Ruheherzfrequenz, sowie ein verlängertes QT-Intervall verfügen [130]. Zudem zeigte sich, dass Frauen weniger an Vorhofflimmern erkranken und seltener einen plötzlichen Herztod sterben [130]. Als weitere Besonderheit ist zu beachten, dass Männer und Frauen unterschiedlich auf Medikamente ansprechen. So konnte bewiesen werden, dass Frauen im Vergleich zum Mann eine geringere Repolarisationsreserve besitzen und dadurch ein erhöhtes Risiko für medikamentenbedingte Torsade-dePointes Tachykardien besteht [131]. 39 3.2 Die Langendorff-Apparatur Zur Untersuchung des isolierten Kaninchenherzens wurde die nach dem Physiologen Oscar Langendorff (1853-1908) benannte Langendorff-Apparatur verwendet. Hergestellt wurde die genutzte Apparatur durch die Firma Hugo Sachs (Hugo Sachs Elektronik, March, Deutschland). Mit dieser Apparatur war es möglich, dass aus dem Tierkörper isolierte Kaninchenherz, unter Nachempfindung der natürlichen Ausgangsbedingungen, hinsichtlich seiner Elektrophysiologie zu untersuchen. Die LangendorffApparatur bestand aus einem Wärmebad, einer Perfusionskanüle, einer darüber befindlichen beheizten Gasfalle, einem über Gummischläuche verbundenen Wärmetauscher, einer Wärmepumpe, einer Kreiselpumpe und über Dreiwegehähne zugeschaltete Perfusoren. Um die Untersuchung durchführen zu können war eine intakte Myokardfunktion notwendig. Hierzu wurde das Herz an der Perfusionskanüle fixiert und retrograd perfundiert. Durch die retrograde Perfusion schließt sich die Aortenklappe. Dadurch durchströmt das Perfusat, wie in der Diastole, die Koronararterien und versorgt das Myokard. Der Abfluss fand über die vorher eröffnete Arteria pulmonalis sowie die Vorhöfe statt. Die elektrophysiologischen Messungen wurden mit Hilfe von EKG Aufzeichnung sowie Ableitung acht monophasischer Aktionspotentiale (MAP) durchgeführt. Die gesamte Versuchsdurchführung fand unter stetiger Kontrolle der standardisierten Bedingungen wie Koronarperfusion, Temperatur, Perfusionsdruck und Zusammensetzung der Perfusionslösung statt. 40 Abbildung 5: Darstellung und Beschriftung der Langendorff-Anlage 3.2.1 Wärmebad und Perfusionslösung Zu Beginn eines jeden Versuches wurde die Langendorff-Apparatur vorbereitet und eine frische Perfusionslösung hergestellt. Als Blutersatz wurde die kristalloide, transparente Krebs-Henseleit-Lösung verwendet. Diese Perfusionslösung versorgte das Herz während des Versuches mit allen wichtigen Elektrolyten und Energie. Zudem wurde die Lösung mit Carbogen, einem Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und fünf Prozent Kohlendioxyd, versetzt. Um die Krebs-Henseleit-Lösung zu erstellen, wurden alle benötigten Inhaltstoffe mit einer elektrischen Waage (Kern P/B, 300 g d=0,001g, Kern & Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) abgewogen und anschließend in zehn Litern deionisiertem Wasser gelöst. Durch die Filtration der Lösung mit Faltenfiltern (Watman™, 595 ½, GE Healthcare Life sience, Freiburg, Deutschland) wurde einer eventuellen Thrombosierung von Herzgefäßen durch nicht gelöste Kristalle vorge- 41 beugt. Von der Krebs-Henseleit-Lösung wurden zwei verschiedene Zusammensetzungen benötigt, die sich in der Konzentration des Kaliumgehaltes unterschieden. Die Standardlösung enthielt einen Kaliumgehalt von 5,8 mmol/l, die reduzierte Lösung von 1,5 mmol/l. Der reduzierte Kaliumgehalt induzierte eine Hypokaliämie und bewirkte Effekte an der Herzmuskelzelle. Die Perfusionslösung wurde vor Beginn des Versuches in das Wärmebad eingefüllt. Das Wärmebad wurde ebenfalls durch die Firma Hugo Sachs hergestellt. Bei dem Wärmebad handelte es sich um ein massives Glasgefäß, welches mit doppelwandigen Seitenwänden ausgestattet war. Die Seitenwände durchströmte, von der Wasserpumpe angetrieben, dauerhaft auf 37°C Grad angewärmtes destilliertes Wasser. Das zu Beginn eingefüllte Perfusat wurde dadurch indirekt erhitzt. Eine weitere Besonderheit des Wärmebades war der integrierte Abfluss, über den nicht mehr benötigte und verbrauchte Lösung in einen Ablauf abfließen konnte. Tabelle 3: Zusammensetzung Krebs-Henseleit-Lösung Substanzen Konzentration (mmol/l) NaCl NaHCO3 118,00 24,88 Glukose x H2O 5,55 Na-Pyruvat 2,00 CaCl2 x 2H2O 1,8 KH2PO4 1,18 MgSO4 x 7H2O 0,83 KCL(5,8 mmol) 4,7 KCL(1,5 mmol) 0,33 42 Zur weiteren Vorbereitung der Langendorff-Apparatur wurde die Kreiselpumpe (Ecoline VC MS-CA8/6, Ismatec®, Ismatec SA, Glattbrugg-Zürich, Schweiz) eingeschaltet und die Apparatur von Luft befreit. Die Kreiselpumpe sorgte für einen konstanten Fluss der Perfusionslösung von 52 ml/Minute. Die Flussrate wurde vor jedem Versuch mittels eines Messzylinders kontrolliert und bei Abweichungen manuell korrigiert. Von der Kreiselpumpe angetrieben durchströmte das Perfusat den Wärmetauscher, in dem die Flüssigkeit aufgrund des Gegenstromprinzips, auf 37° Grad erwärmt wurde. Bevor die Lösung das Herz erreichte wurden eventuell anfallende größere Mengen von Luft von der vorgeschalteten Gasfalle abgefangen, um eine Luftembolie des Myokards zu vermeiden. Nach Kontrolle der Flussrate, der Temperatur und nach Einstellung der angeschlossenen Geräte konnte die Präparation zur Isolation des Herzens beginnen. 3.2.2 EKG-Ableitung Während des gesamten Versuchsablaufs wurde ein Elektrokardiogramm (EKG) abgeleitet. Verwendung fand eine von der Firma Hugo Sachs entwickelte Elektrodenplattform mit Elektroden einer Vier-Pol-Ableitung aus Silber/Silberchlorid. Die Elektroden waren durch eine aus Kautschuk bestehende Halterung sowie über ein Kugellager mit der Plattform verbunden. Während des Versuches verweilte die Plattform im Wasserbad. Die Elektroden waren um das Herz herum angeordnet. Es bestand kein direkter Kontakt zwischen Herz und Elektroden. Die besondere Position der Elektroden ermöglichte die Extremitätenableitung nach Einthoven und Goldberger sowie sechs Brustwandableitungen außerhalb des Kaninchenkörpers. Die Übertragung der Signale erfolgte durch die Messung elektrischer Strömungen. Die gemessenen Strömungen wurden durch einen Standardverstärker mit 0,1-300 Hertz (Hz) Filter potenziert und von einer Elektrophysiologieanlage der Firma Bard (Lab system Recording and Analysis for Elektrophysiologie, C.R Bard, Inc. 1989-1996, Lowell, USA) aufgezeichnet. 43 Abbildung 6: Beispielhafte Darstellung der EKG-Ableitung (Ventrikel) 3.2.3 Intraventrikuläre Druckmessung Zur intraventrikulären Druckmessung wurde ein Latexballon verwendet, welcher über eine Glaskanüle mit einem geschlossenen System verbunden war. Der Latexballon wurde nach Fixation des Herzens über das linke Atrium in den linken Ventrikel vorgeschoben und mit Flüssigkeit befüllt. Die Glaskanüle wurde mit drei Klebestreifen (Leukoplast®, BNS medical GmbH, Hamburg, Deutschland) an der Perfusionskanüle befestigt. Über den während des Versuchs im Ventrikel verweilenden Ballon konnte der Druck im linken Ventrikel erfasst werden. Die Messung erfolgte über einen im Ballon integrierten Druckaufnehmer. Die Aufzeichnung der entstandenen Druckkurve erfolgte ebenfalls über die Elektrophysiologienanlage der Firma Bard. Als positiven Nebeneffekt verlieh der an der Perfusionskanüle fixierte Ballon dem Herzen zusätzliche Stabilität. Die intraventrikuläre Druckmessung fand nur während der Ventrikelversuche Anwendung, da die vollständige Erhaltung der Vorhöfe bei der Ableitung der Vorhofsignale von großer Bedeutung war. 44 3.2.4 Ableitung monophasischer Aktionspotentiale Neben der Aufzeichnung des EKGs und der intraventrikulären Druckmessung kam die Aufzeichnung endo- und epikardialer monophasischer Aktionspotentiale (MAPs) zum Einsatz. Insgesamt sieben epikardiale, steuerbare Katheter wurden kreisförmig um das Herz angelegt. Die flexiblen Katheter wurden von einer Metallhülle geschützt und über eine Feder an der Langendorff-Apparatur befestigt. Die Positionierung der Katheter erfolgte senkrecht zum Herzen, sodass der Katheter der natürlichen Bewegung des Herzens, ohne Erzeugung von Druck, folgte. Die exakte Position der Katheter war genau definiert. Vier Katheter wurden linksseitig angebracht, drei Katheter auf der rechten Seite und ein Katheter endokardial. Der endokardiale Katheter besaß keine Schutzhülle und konnte durch seine Flexibilität unter leichtem Druck neben dem Latexballon im linken Ventrikel platziert werden. In den meisten Fällen war die Feinjustierung der Katheter zur Einstellung der Signale ausreichend. In seltenen Fällen kam es zu einer abweichenden Form der Signale, häufig ausgelöst durch eine lokale Myokardischämie. Dies führte zu einem notwendigen Positionswechsel der Katheter. Das Hauptaugenmerk der Katheterableitung lag auf der Erfassung der Dauer und des Verlaufes von Depolarisation und Repolarisation sowie auf der Darstellung regionaler Unterschiede [132,133]. Die Stimulation des Herzens mittels eines externen Stimulators (Universal Programmable Stimulator, UHS 20, Biotronik, Berlin, Deutschland) wurde ebenfalls über einen rechtsventrikulär platzierten Katheter ausgeführt. Zur Auswertung der Daten wurden die Signale gefiltert und mit einem 0,1-300 Hz-Filter verstärkt sowie über das Bardsystem aufgezeichnet. Über dieses System erfolgte die anschließende Weiterverarbeitung, Digitalisierung und Speicherung der Daten. 45 Abbildung 7: Standardisierte Position der MAP-Katheter Tabelle 4: Erläuterung zur Positionierung der MAP-Katheter Rechtsventrikuläre MAP-Katheter Linksventrikuläre MAP-Katheter MAP2= epikardial in der Mitte MAP1= epikardial an der Herzbasis MAP3= epikardial apikal MAP5= epikardial in der Mitte MAP4= epikardial an der Herzbasis MAP6= Variable Positionierung MAP7= epikardial in der Mitte MAP8= endokardial im linken Ventrikel 46 Abbildung 8: Beispielhafte Darstellung der monophasischen Aktionspotentiale (ventrikulär) Zur Untersuchung der Vorhofableitungen wurden keine flexiblen Katheter mit Metallgehäuse verwendet, sondern spezielle von der Physiologie des Universitätsklinikums Münster angefertigte Klammern. In jeden Klammerschenkel waren integrierte Katheter eingebaut, sodass pro Vorhof zwei Aktionspotentiale abgeleitet wurden. Die Klammern wurden auf Höhe der Herzohren auf die Vorhöfe aufgesetzt. Zur Überprüfung der Ventrikelaktivität wurden zwei MAPs, wie oben beschrieben, angelegt. Die Stimulation der Atrien erfolgte über die äußerliche Platzierung des im Ventrikelversuchs verwendeten flexiblen endokardialen Katheters, mittig zwischen den Klammern. Zur Stimulation wurde ein spezieller Stimulator der Firma Medtronic (Medtronic® 5325 Programmable Stimulator, Indianapolis, USA) verwendet. Die Aufzeichnung und Weiterverarbeitung der Daten erfolgte wie im Ventrikelversuch beschrieben. 47 Abbildung 9: Standardisierte Position der atrialen Klemmen Abbildung 10: Beispielhafte Darstellung der monophasischen Aktionspotentiale (atrial) 48 3.3 Präparation des Tierkörpers zur Isolation des Herzens Zu Beginn des Versuches wurde nach Anlegen der Schutzkleidung, eines Kittels, Handschuhen und Mundschutz sowie Bedeckung der Straßenschuhe mittels Plastiküberziehern ein Kaninchen aus der Tierhaltung ausgewählt und in den Versuchsraum überführt. Aus der verdunkelten Transportbox wurde das Kaninchen direkt in eine Fixationsvorrichtung gesetzt, in der es in natürlich gehockter Haltung, jedoch mit Fixation im Nackenbereich verweilte. Im nächsten Schritt wurde das Ohr des Kaninchens vorbereitet. Hierzu wurden die Haare am Lateralrand der Pinna entfernt, um freie Sicht auf die Vena auricularis superficialis zu erlangen. Nach Desinfektion mit 70 %igem Alkohol konnte die Injektion der Prämedikation beginnen. Alle verwendeten Medikamente und Utensilien wurden vor der Durchführung bereits vorbereitet und platziert. Zur Prämedikation wurde mit einem Butterfly (Butterfly 50, Venofix A®, 25 G, Braun, Melsungen, Deutschland) die von der Hilfsperson angestaute laterale Ohrrandvene punktiert und darüber 1 ml Heparin-Natrium (1000IU/Kg Körpergewicht, Heparin-Natrium-25000-ratiopharm®, 25000 I.E pro 5 ml, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) injiziert. Dieser Schritt war erforderlich, um eine intrakardiale Thrombenbildung zu reduzieren. Nach Injektion des Heparins erfolgte eine Spülung der Vene mit 0,5 ml isotonischer Natriumchloridlösung 0,9 % (NaCl, Isotonische NatriumchloridLösung 0,9 %, Braun, Melsungen, Deutschland). Im nächsten Schritt erfolgte die Anästhesie des Tieres. Hierzu wurden 5 ml Thiopental (Thiopental-Inresa 0,5 g, Wirkstoff: Thiopental-Natrium, Inresa, Freiburg, Deutschland) langsam injiziert und unter Beobachtung und Beurteilung der peripheren Muskelrelaxation, des Cornealreflexes, des Bewusstseinsverlustes und der Atmung die Narkosetiefe bestimmt. Zum Abschluss der Medikation wurde erneut mit 0,5 ml NaCl gespült. Das narkotisierte Tier wurde von der Assistenzperson aus der Fixationseinrichtung befreit und an den Hintergliedmaßen mit dem Kopf Richtung Boden zeigend fixiert. Durch einen mit einem Skalpell durchgeführten Kehlschnitt, unter Eröffnung beider Carotiden wurde der Tod des Kaninchens durch Blutverlust herbeigeführt. Im Anschluss erfolgte die Präparation zur Isolierung des Kaninchenherzens. Hierzu wurde das Tier in Rückenlage auf einer aus Plastik bestehende Präparationsschale drapiert. Nach Befeuchtung des Fells mit 70 %igem Alkohol wurde unter Spannung der Bauchdecke die Peritoneal- 49 höhle mit einem Schnitt caudal des Processus xiphoideus eröffnet. Für diesen Schritt wurde eine haushaltsübliche Geflügelschere verwendet. Nach Schaffung eines Zugangs zur Bauchhöhle wurde die Schnittführung entlang des Rippenbogens nach lateral erweitert, um einen Zugang zum Zwerchfell zu erlangen. Das Zwerchfell wurde mit einer chirurgischen Pinzette erfasst und unter Verwendung einer Metzenbaumschere vom Rippenbogen gelöst. Durch Trennung der Rippen am Übergang vom knöchernen Anteil zum Rippenknorpel und Präparation sowie Verlagerung des Sternums nach cranial erlangte man einen Blick auf das häufig noch schlagende Herz. Im letzten Schritt der Präparation wurde der Thorax durch die Assistenzperson angehoben. Unter Verwendung zweier anatomischer Pinzetten wurde das Perikard einerseits fixiert und gleichzeitig durch Zug eröffnet. Nach vollständiger Resektion des Perikards wurde die Sicht auf den Aortenbogen freigegeben. Mit einer anatomischen Pinzette wurde die Aorta ascendens fixiert und herznah abgetrennt. Es war wichtig einen ausreichenden Stumpf zu belassen, um die Fixation der Aorta an der Perfusionskanüle zu vereinfachen. Mit dem Skalpell wurde das Herz an der Trachea orientiert nach caudal weiter abpräpariert, wodurch bewusst sowohl herznahe Lungengefäße als auch die Vena cava superior durchtrennt wurden. Das nun isolierte Herz wurde umgehend in ein zuvor vorbereitetes Becherglas, mit vorgewärmter Krebs-Henseleit-Lösung überführt und so schnell wie möglich an der Perfusionskanüle der vorbereiteten Langendorff-Apparatur fixiert. Die Fixation erfolgte nach Durchtrennung des Pulmonalarterienstammes mittels eines Vicryfadens (Vicryl™ 3,5 metric, Ethicon®, Norderstedt, Deutschland) und chirurgischen Knotens. Durch die Durchtrennung des Pulmonalarterienstammes war die retrograde Perfusion des Herzens möglich, da über die Aorta ankommende Flüssigkeit nach Passage des Myokards über den Truncus pulmonalis abfließen konnte. Ab diesem Zeitpunkt bestand eine, dem natürlichen Blutfluss nachempfundene, dauerhafte Perfusion des Herzens mit auf 37° Grad angewärmter Krebs-Henseleit-Lösung. Unter Rotation der Druckschraube der Langendorff-Apparatur wurde der Druck der Perfusionskanüle auf 90100 mmHg erhöht, was dem natürlichen Aortendruck in vivo entspricht. Im weiteren Verlauf wurde zur Platzierung des Druckballons das linke Atrium mit einer anatomischen Pinzette erfasst und mit der Metzenbaumschere eröffnet. Über diesen Zugang 50 war es möglich den Ballonkatheter, unter Schonung der Mitralklappe, in den linken Vorhof vorzuschieben. Zur Stabilisierung wurde die am Ballon befindliche Glaskanüle mit Klebestreifen (Leukoplast®, BNS medical GmbH, Hamburg, Deutschland) an der Perfusionskanüle befestigt. Nach Platzierung der EKG-Plattform fand die Überführung des Herzens vom Becherglas in das vorgewärmte Wasserbad statt. Der für die Durchführung der Versuche benötigte mechanische AV-Block wurde im darauffolgenden Schritt herbeigeführt. Dazu wurde an beiden Atrien ein Zugang geschaffen, über den mit den Schenkeln einer Arterienklemme Druck auf die AV-Region des Kammerseptums ausgeübt wurde. Die Kompression wurde solange fortgeführt, bis unter EKG-Kontrolle ein langsamer Ersatzrhythmus erschien. Durch anhaltende Kompression des AV-Knotens von mindestens 60 Sekunden entstand ein dauerhafter AV-Block. Mit der Platzierung und Feinjustierung der MAP-Katheter an den bereits dargestellten und definierten Positionen wurde erst begonnen, sobald der Ersatzrhythmus über einige Minuten stabil war. Anschließend erfolgte die Platzierung des endokardialen Katheters neben dem Druckballon im linken Ventrikel. Unterschiede in der Präparation zwischen Ventrikelversuchen und Vorhofversuchen, zeigten sich erst nach Fixation des Herzens an der Perfusionskanüle und Überführung vom Becherglas ins Wasserbad. Bei den Vorhofversuchen wurden weder ein intraventrikulärer Druckballon, endokardialer Katheter, noch die Erstellung eines mechanischen AV-Blocks benötigt. Das Herz wurde lediglich mit dem Vicrylfaden an der Perfusionskanüle fixiert und die EKG-Plattform angeschlossen. Die Ableitungsklemmen und der flexible Stimulationskatheter wurden von außen an den Vorhöfen angebracht und zwei ventrikulare MAP-Katheter platziert. Mit diesem Schritt waren die Versuchsvorbereitungen der Vorhofversuche abgeschlossen. 51 3.4 Substanzen In den Versuchsreihen wurden drei verschiedene Substanzen verwendet. Die zu untersuchende Hauptsubstanz Levosimendan lag als gelbe Reinsubstanz (Levosimendan, L5545-50MG, ≥98 % (HPLC), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) in kristalliner Form vor. Es wurde eine Konzentrationslösung von 2 µmol/l hergestellt. Hierzu wurde die benötigte Menge Levosimendan mit einer elektrischen Waage (300 g, d=0,001g, Kern & Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) abgewogen und anschließend in 100 ml Flüssigkeit, bestehend aus 30 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, >99,5 % zur Synthese, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) und 70 ml deionisierten Wasser gelöst. Für die einzelnen Versuchsreihen wurden ausgehend von dieser angefertigten Lösung verschiedene Konzentrationen verwendet. Für die ventrikulären Dosisfindungsversuche wurden Konzentrationen von 0,5 µmol/l, 1 µmol/l und 2 µmol/l untersucht. Für die atrialen Dosisfindungsversuche wurden deutlich geringere Konzentrationen von 0,25 µmol/l und 0,5 µmol/l eingesetzt. Als besonders aussagekräftig zeigten sich die Konzentrationen von 1 µmol/l (ventrikulär) und 0,5 µmol/l (atrial), sodass diese Konzentrationen für die folgenden Versuchsreihen eingesetzt wurden. Zusätzlich zu Levosimendan wurde Ranolazin verwendet. Ranolazin (Ranolazin dihydrochloride, R6152-500MG, ≥98 % (HPLC), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) lag als weiße, pulverförmige Reinsubstanz vor. Zur Herstellung einer Lösung, mit einer Konzentration von 10 µmol/l, wurde die abgewogene Menge Ranolazin in 50 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die zuletzt verwendete Substanz Dantrolen wurde in einer Konzentration von 20 µmol/l angesetzt. Dantrolen lag ebenfalls als gelbe, pulverförmige Reinsubstanz (Dantrolene sodium salt, D9175250MG, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) vor. Nach Lösung des Pulvers mit fünf bis zehn Milliliter DMSO wurde langsam 90 ml deionisiertes Wasser hinzugegeben. Ranolazin und Dantrolen wurden für beide Versuchsformen verwendet. Die für jeden Versuch frisch angefertigten Substanzen wurden in Spritzen abgefüllt und über einen externen Perfusor (Perfusor® secura, Braun, Melsungen, Deutschland) dem Versuch zugeführt. 52 3.5 Versuchsprotokolle 3.5.1 Protokoll Ventrikelversuche Ausgangsbedingungen (Standardprotokoll) Eine der wichtigsten Vorbereitungen war der durch die Ablation des AV-Knotens hervorgerufene Ersatzrhythmus. Dieser Ersatzrhythmus war deutlich langsamer als der Sinusrhythmus. Durch die Herstellung eines AV-Blocks konnte die Stimulation des Herzens über einen MAP-Katheter stattfinden. Sobald der Ersatzrhythmus von mindestens 900 ms über einige Minuten stabil blieb und das Herz der Stimulation folgte, konnte mit der Aufzeichnung begonnen werden. Jeder Versuch begann mit der einminütigen Aufzeichnung des Ersatzrhythmus zur Erstellung einer Baseline. Das Herz wurde zu diesem Zeitpunkt nicht stimuliert. Anschließend wurde das Herz, ohne Zugabe von Substanzen, in sieben verschiedenen Frequenzstufen stimuliert. Die Zykluslängen wurden nach einer Minute schrittweise von 900 ms auf 300 ms reduziert. Hierzu wurde die Zykluslänge absteigend um 100 ms verkürzt. Von den aufgezeichneten Signalen wurden die letzten 16 monophasischen Aktionspotentiale ausgeschnitten, gespeichert und ausgewertet. Die Einhaltung einer Aufnahmezeit von einer Minute war von Bedeutung, da sich die MAP-Signale nach jeder Änderung der Zykluslänge zunächst stabilisieren mussten. Nach Stimulation der siebten Frequenz schlug das Herz wieder in seinem Ersatzrhythmus. Im nächsten Schritt wurde die Refraktärzeit (S2) bestimmt. Hierzu wurde erneut in den bekannten sieben Frequenzstufen (900 ms-300 ms) stimuliert. Anders als in dem vorangegangenen Versuchsteil wurde nach jedem siebten Schlag zur Erzeugung eines Zusatzimpulses ein vorprogrammierter Stimulus abgegeben. Der Abstand zwischen den beiden Doppelimpulsen wurde anfangs auf 200 ms eingestellt und automatisch nach sieben Schlägen und dem darauf folgenden Doppelimpuls um zehn Millisekunden reduziert. Dieser Prozess wurde solange fortgeführt bis auf den Doppelimpuls kein Aktionspotential mehr folgte. Das Ausbleiben des Doppelimpulses zeigte, dass der zusätzliche Impuls in der Refraktärphase lag. Nach einer kurzen Erholungsphase des Herzens im Ersatzrhythmus wurde eine zweite Refraktärperiode (S3) bestimmt. Hierzu wurde 53 anstatt eines, wie oben beschriebenen Doppelimpulses, ein dritter zusätzlicher Impuls ausgesandt. Aufgezeichnet wurde auch in diesem Fall die Frequenz, bei der auf den dritten Stimulus kein Aktionspotential mehr ausgelöst werden konnte. Nach einer kurzen Erholungsphase wurde das Herz dreimal hintereinander hochfrequent stimuliert. Über den Zeitraum von zehn bis 15 Sekunden, beziehungsweise über eine Bildschirmlänge, wurde das Herz mittels eines Bursts (High Rate (HR)) mit einer maximalen Frequenz stimuliert. Es diente der Provokation von Rhythmusstörungen. Solange keine Rhythmusstörungen auftraten, wurde dieser Prozess nach einer Minute wiederholt. Falls nach der hochfrequenten Stimulation ventrikuläre Tachykardien oder Kammerflimmern auftraten und sich nicht selbst limitierten, mussten die Arrhythmien durch Defibrillation terminiert werden. Eine folgende Stimualtionspause von fünf Minuten sorgte für eine Regeneration des Herzens. Im weiteren Verlauf des Versuches wurde das Perfusat über einen Zeitraum von fünf Minuten verändert. Anstatt die bislang eingesetzte normolakämische Koch-Henseleit-Lösung mit 5,8 mmol/l zu verwenden ließ man die zuvor vorbereitete hypokalämische Lösung mit 1,5 mmol/l einlaufen. Der niedrige Kaliumgehalt der Lösung sorgte häufig für eine Tachykardie und stellte ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Torsades-de-Pointes Tachykardien und frühen Nachdepolarisationen dar. Auftretende Veränderungen wurden im Versuchsprotokoll notiert und bei der Auswertung berücksichtigt. Gemäß dem Protokoll wurde das Herz zur Regeneration erneut über fünf Minuten mit der normokaliämen Koch-Henseleit-Lösung perfundiert. Dieses Protokoll wurde pro Versuchsreihe, unter Einsatz von verschiedenen Substanzen, wiederholt. Levosimendan Ausgangsbedingungen Frequenztreppe Ref raktärzeiten 10 Min HR1-3 K1,5 K5,8 mmol mmol 3-15 Min 5 Min 5 Min Frequenztreppe Ref raktärzeiten Einlauf zeit 15 Min 10 Min Ranolazin/Dantrolen HR1-3 K1,5 K5,8 mmol mmol 3-15 Min 5 Min 5 Min Frequenztreppe Ref raktärzeiten Einlauf zeit 15 Min 10 Min HR1-3 K1,5 K5,8 mmol mmol 3-15 Min 5 Min 5 Min QT-Zeiten APD Datensicherung Vorbereitungen circa 30 Minuten Abbildung 11: Zeitstrahl zum Ablauf der Ventrikelversuche 54 Dosis-Wirkungs-Beziehung Die erste Versuchsreihe fand unter alleiniger Verwendung von Levosimendan zur Ermittlung der Dosis-Wirkungs-Beziehung statt. Levosimendan wurde in drei verschiedenen Konzentrationen eingesetzt. Nach Durchführung des Experimentes gemäß dem Protokoll ohne Zugabe von Substanzen wurde Levosimendan über einen externen Perfusor der Lösung zugesetzt. Beginnend mit einer Einlaufzeit von 15 Minuten ohne Stimulation des Herzens wurde Levosimendan mit einer Konzentration von 0,5 µmol/l dem Perfusat dauerhaft zugesetzt und das oben beschrieben Experiment durchgeführt. Daraufhin folgten Levosimendan-Konzentrationen von 1 µmol/l und 2 µmol/l. Nach Durchführung und Auswertung der gesamten Versuchsreihe wurde die Konzentration für die weiteren Versuche ausgewählt, unter der die aussagekräftigsten, proarrythmischen Effekte zu erkennen waren. Protokoll A Die in den ersten Experimenten ermittelten Dosis-Wirkungs-Beziehungen stellten die Grundlagen für die weiteren Versuchsreihen dar. In den weiteren Versuchen sollten durch den zusätzlichen Einsatz verschiedener Substanzen die ermittelten proarrythmischen Effekte weiter charakterisiert und eventuelle protektive Wirkungen dargestellt werden. Der Durchführung des Experiments, wie unter den Ausgangsbedingungen beschrieben, folgte die 15 minütige Infusion von Levosimendan in einer Konzentration von 1 µmol/l. Ab diesem Zeitpunkt bestand eine dauerhafte Zugabe von Levosimendan zum Perfusat. Nach Beendigung der experimentellen Untersuchung wurde mit Hilfe eines zweiten Perfusors zusätzlich Ranolazin in einer Konzentration von 10 µmol/l infundiert. Nach einer Infusionsdauer von 15 Minuten wurde das gleiche Versuchsprotokoll durchgeführt. In diesem Versuchsteil befanden sich gleichzeitig zwei Substanzen in der Perfusionslösung. 55 Protokoll B Für die dritte Versuchsreihe wurde, wie in Protokoll A beschrieben, zuerst Levosimendan (1 µmol/l) verwendet. Als zweite zugesetzte Substanz wurde Dantrolen (20 µmol/l) eingesetzt. Der Ablauf der Versuche entsprach, wie in jeder Versuchsreihe, dem unter Ausgangsbedingungen erörterten Versuchsprotokoll. 3.5.2 Protokoll Vorhofversuche Ausgangsbedingungen Das Versuchsprotokoll der Vorhofversuche unterscheidet sich deutlich von dem der Ventrikelversuche. Ein großer Unterschied war der nicht benötigte AV-Block zur Erstellung eines Ersatzrhythmus. Das Herz schlug während des gesamten Versuches in seinem natürlichen Sinusrhythmus. Nach Platzierung der vier in den Klammern integrierten MAP-Elektroden, der zwei ventrikulären Katheter und des flexiblen Stimulationskatheters, konnte die Aufzeichnung des Versuches beginnen. Zu Beginn des Versuches wurde der Sinusrhythmus aufgezeichnet und die Stimulationsschwelle des Herzens bestimmt. Zur Bestimmung der Stimulationsschwelle wurde der Stimulator eingeschaltet und auf Stimulation eingestellt. Die Stimulationsstärke in Milliampere (mA) wurde von 0 mA beginnend schrittweise erhöht, bis das Herz der Stimulation folgte und die Impulse regelmäßige Kontraktionen auslösten. Mit der Frequenz der Stimulationsschwelle wurden die ersten Versuchsteile durchgeführt. Als erstes wurde das Herz ohne Zugabe von Substanzen in drei Frequenzstufen stimuliert. Begonnen mit 350 ms wurde nach circa einer Minute die Frequenz auf 250 ms und daraufhin auf 150 ms reduziert. Wie bei den Ventrikelversuchen war die Einhaltung einer Aufnahmezeit von einer Minute zur Stabilisation der MAP-Signale von Bedeutung. Die Bestimmung der Refraktärzeit (S2) wurde nur unter der Frequenzstufe von 250 ms durchgeführt. Wie vorangegangen beschrieben wurde nach jedem siebten Schlag ein zusätzlicher Stimulus zur Erzeugung eines Zusatzimpulses abgegeben. Der Abstand zwischen den beiden Doppelimpulsen wurde anfangs auf 150 ms eingestellt und manuell nach sieben Schlägen und dem darauf folgenden Doppelim- 56 puls um zehn Millisekunden reduziert. Ebenfalls wurde die Frequenz notiert, bei der auf den zusätzlichen Impuls kein Aktionspotential mehr folgte. Eine Bestimmung der Refraktärzeit (S3) war in diesem Protokoll nicht vorgesehen. Im weiteren Versuchsverlauf wurde das Herz jeweils zehn Mal über einen Zeitraum von einer Sekunde mit einer maximalen Frequenz von 50 Hz stimuliert und dieser Prozess insgesamt drei Mal wiederholt. Die ersten zehn Bursts wurden mit der Stromstärke der Stimulationsschwelle durchgeführt. Für die zweiten Bursts wurde die Stromstärke der Stimulationsschwelle verdoppelt. Die letzen zehn Bursts wurden bei maximaler Stromstärke stimuliert. Im Anschluss fand die 15 Minütige Einlaufzeit der Substanzen statt. Ausgangsbedingungen Levosimendan Stimulationsschwelle Frequenztreppe Ref raktärzeit 3x10 Burst 5 Min 3-15 Min Stimulationsschwelle Frequenztreppe Ref raktärzeit Einlauf zeit 15 Min 5 Min Ranolazin/Dantrolen Stimulationsschwelle Frequenztreppe Ref raktärzeit 3x10 Burst Einlauf zeit 3-15 Min 15 Min 5 Min 3x10 Burst 3-15 Min aAPD Datensicherung Vorbereitungen circa 30 Minuten Abbildung 12: Zeitstrahl zum Ablauf der Vorhofversuche Weitere Protokolle Auch bei den Vorhofversuchen wurden zu Beginn Versuche zur Ermittlung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung auf Vorhofebene durchgeführt. Hierbei wurden ebenfalls verschiedene Konzentrationen von Levosimendan verwendet. Die untersuchten Konzentrationen von 0,25 µmol/l und 0,5 µmol/l waren deutlich niedriger als bei den Ventrikelversuchen. Für die weiteren Versuchsreihen wurde eine LevosimendanKonzentration von 0,5 µmol/l eingesetzt. Die zusätzlich infundierten Substanzen waren in diesen Versuchen gleicherweise Ranolazin (10 µmol/l) und Dantrolen (20 µmol/l). 57 3.6 Auswertung Repolarisationszeiten und QT-Messung Während des gesamten Versuches wurden die acht monophasischen Aktionspotentiale und die EKG-Ableitung über die Bard-Anlage aufgezeichnet. Von den aufgezeichneten Signalen wurden pro Frequenztreppe die letzten 16 Aktionspotentiale markiert und auf einem externen Speicher abgelegt. Die daraus gewonnenen Daten konnten durch das von Prof. M Franz und Kollegen (Washington USA) entwickelte LabVIEW-Programm in Exceltabellen konvertiert werden. Gemessen wurde die Aktionspotentialdauer (APD50, APD70 und APD90) von jedem der 16 ausgeschnittenen Aktionspotentiale. Für die weitere Auswertung wurde nur die APD90 betrachtet. Als APD50, beziehungsweise APD70 oder APD90, bezeichnet man die Länge des Aktionspotentials vom steilsten Anstieg der Depolarisation bis zu einer Repolarisation von 50 %, 70 % oder 90 %. Zur weiteren Auswertung gehörte die Errechnung der Mittelwerte, der minimalen (APDmin) und maximalen (APDmax) Werte sowie der entsprechenden Standardabweichung. Aus der Differenz der APDmax und APDmin konnte die Dispersion der Repolarisation kalkuliert werden. Als Dispersion der Repolarisation bezeichnet man die Differenz zwischen dem längsten und kürzesten aufzeichneten MAP. Die Auswertung der Vorhofversuche wurde mit der gleichen Software durchgeführt, jedoch wurden hierbei nur die Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Zur weiteren Verarbeitung wurden neben der APD90 auch die APD70, APD50 und die Überleitungszeit analysiert. Die Leitungszeit ist ein Maß für die Leitungsgeschwindigkeit. Zur Ermittlung der Leitungszeit wurde die Zeit vom Aussenden eines Stimulus bis zum Erreichen der MAP-Elektrode beider Vorhöfe gemessen, voneinander subtrahiert und gemittelt. So konnten Laufzeitunterschiede zwischen den Vorhöfen aufgezeigt werden. 58 Abbildung 13: Ablauf der Repolarisation (eigene Darstellung) Über die Aufzeichnung der EKG-Ableitung konnten nach Beendigung eines Versuches die QT-Zeiten jeder einzelnen Zykluslänge manuell ausgemessen werden. Die erfassten Werte wurden zusätzlich in eine Exceltabelle überführt und die Mittelwerte bestimmt. Diese Methode war bei den Vorhofversuchen nicht von Bedeutung. 3.6.1 Rhythmusstörungen Während der gesamten Versuchsdauer wurden auftretende Rhythmusstörungen sowohl quantitativ als auch qualitativ aufgezeichnet. Besonders während der fünfminütigen hypokalämischen Periode und der hochfrequenten Stimulation (Burst) des Herzens traten Rhythmusstörungen auf. Ein besonderes Augenmerk wurde auf Vorhofflimmern und ventrikuläre Tachykardien gelegt. Auftretende Rhythmusstörungen wurden quantifiziert, gekennzeichnet und im Laborbuch notiert. Die quantitative Erfassung von Flimmerepisoden während der Vorhofversuche fand ebenfalls manuell statt. Hierbei wurden anhaltende Flimmerepisoden mit einer Dauer von über einer Sekunde, von nicht-andauernden Flimmerepisoden unter einer Sekunde abgegrenzt und im Laborbuch notiert. 59 Falls die auftretenden Rhythmusstörungen nicht selbstlimitierend beendet wurden, musste der Defibrillator die Flimmerepisode determinieren. Jede Defibrillation wurde manuell im Laborbuch vermerkt. Abbildung 14: Atrialer Burst ohne (oben) und mit (unten) Flimmerepisode 60 3.7 Statistik 3.7.1 Ventrikelversuche Die während der Versuche gewonnenen Daten wurden in einem Computerprogramm (Microsoft Excel) tabellarisch aufgearbeitet und erste Korrekturen vorgenommen. Im nächsten Schritt wurden die erhobenen und korrigierten Daten mit dem statistischen Programm SPSS (IBM SPSS Statistics 20, Inc. Chicago, USA) ausgewertet. Zu Beginn wurden Tests auf Normalverteilung durchgeführt und sowohl Mittelwerte als auch Standardabweichungen errechnet. Nicht-parametrische Variablen wie die QTZeit, die Aktionspotentialdauer (APD90), sowie die Refraktärzeiten wurden mittels des Wilcoxon-Test hinsichtlich ihrer Signifikanz getestet. Das Auftreten von Rhythmusstörungen, wie ventrikuläre Tachykardien oder Kammerflimmern, wurden mit dem ChiQuadrat und dem Fischer-Test analysiert. Ein Wert von p< 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. 3.7.2 Vorhofversuche Die in den Versuchen gewonnenen Daten wurden, wie bei den Ventrikelversuchen, in einem Computerprogramm (Microsoft Excel) tabellarisch aufbereitet und korrigiert. Im weiteren Schritt wurden die Daten mit dem statistischen Programm SPSS (IBM SPSS Statistiks 20, Inc. Chicago, USA) ausgewertet. Es wurden auch hier als erstes Tests auf Normalverteilung durchgeführt, sowie deskriptive Statistiken wie Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Mittels des Wilcoxon-Test wurde die Überprüfung der Signifikanz nicht-parametrischer Variablen durchgeführt. Die zu testenden Variablen waren die atriale Aktionspotentialdauer (aAPD90), die effektive Repolarisationszeit und die Leitungszeit. Das Auftreten von Flimmerepisoden wurde mit dem Fischer- und Chi-Quadrat-Test quantifiziert. Ein Wert von p< 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. 61 4 Ergebnisse 4.1 Untersuchung von Levosimendan auf ventrikulärer Ebene (Dosis-Wirkungs-Beziehung) 4.1.1 Wirkung von Levosimendan auf die APD90, QT-Zeiten, Refraktärzeiten (S2+S3) und Dispersion der Repolarisation In der ersten Versuchsreihe wurden 12 Kaninchenherzen unter ausschließlicher Verwendung des Kalzium-Sensitizers Levosimendan untersucht. Diese Versuche dienten der Ermittlung der elektrophysiologischen Eigenschaften und des proarrhythmischen Potentials von Levosimendan. Ebenso diente diese Versuchsreihe der Ermittlung der für die weiteren Versuche genutzten Konzentration von Levosimendan. Levosimendan führte, statistisch signifikant (p<0.001), zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer (APD90). Diese Verkürzung wurde in allen Konzentrationen sichtbar. Im Vergleich zu der unter Ausgangsbedingungen gemessen mittleren APD90 von 125±18 ms, zeigten die mittleren APD90 unter 0,5 µmol/l Levosimendan 114±23 ms, unter 1 µmol/l 114±14 ms, bis hin zu 105±15 ms unter 2 µmol/l, eine deutliche Verkürzung auf (Abb. 15). Die QT-Zeiten verkürzten sich im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen ebenfalls statistisch signifikant. Unter Ausgangsbedingungen betrug die mittlere QT-Zeit 253±68 ms, unter Levosimendan 0,5 µmol/l hingegen nur 225±64 ms (p<0.001). Mit ansteigenden Konzentrationen wurde die Verkürzung ebenfalls deutlich. Die QT-Zeit bei 1 µmol/l lag bei 177±64 ms (p<0.001) und bei 2 µmol/l bei 220±64 ms (Abb. 16). Betrachtet man die Refraktärzeit S2 wurden auch hier signifikante Unterschiede sichtbar (Abb. 17). Unter 0,5 µmol/l kam es zu einer signifikanten (p<0.019) Verminderung der mittleren Refraktärzeit von 158±30 ms auf 144±22 ms. Dieser Trend setzte sich unter den ansteigenden Konzentrationen weiter fort. 1 µmol/l wies einen Wert von 139±19 ms (p<0.042) und 2 µmol/l einen Wert von 131±14 ms (p<0.001) auf. Bei der mittleren Refraktärzeit S3 ergaben sich lediglich signifikante Unterschiede im Vergleich der Konzentrationen 1 µmol/l und 2 µmol/l. Hier führte die Gabe von 62 1 µmol/l Levosimendan zu einem Wert von 147±27 ms, 2 µmol/l resultierte in einem Wert von 156±30 ms (Abb. 18). Bei Betrachtung der Dispersion der Repolarisation zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der ansteigenden Konzentration von Levosimendan und den Ausgangsbedingungen. Für die weiteren ventrikulären Versuchsreihen wurde eine Levosimendan- konzentration von 1 µmol/l verwendet. Aktionspotentialdauer (APD90) APD90 (ms) 130 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan 1µM Levosimendan 2µM 80 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 900 Abbildung 15: Mittlere Aktionspotentialdauer unter alleiniger Verwendung von Levosimendan 63 QT-Zeiten QT-Intervall (ms) 300 250 Baseline Levosmendan 0,5µM Levosimendan 1µM 200 Levosimendan 2µM 150 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 900 Abbildung 16: Mittlere QT-Zeiten unter alleiniger Verwendung von Levosimendan Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 200 150 p<0.019 p<0.042 p<0.001 100 50 0 Baseline Levosimendan Levosimendan 0,5µM 1µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 2µM Abbildung 17: Mittlere Refraktärzeit S2 unter alleiniger Verwendung von Levosimendan 64 Mittlere Refraktärzeit S3 Refraktärzeit (ms) 200 150 100 50 0 Baseline Levosimendan Levosimendan 0,5µM 1µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 2µM Abbildung 18: Mittlere Refraktärzeit S3 unter alleiniger Verwendung von Levosimendan 4.1.2 Arrhythmogenes Potential von Levosimendan Die 12 Kaninchenherzen wurden während der Versuchsdurchführung auch hinsichtlich des proarrhythmischen Potentials von Levosimendan untersucht. Ventrikuläre Tachykardien bis hin zum Kammerflimmern wurden registriert und bezüglich ihrer Quantität und Dauer kategorisiert. Elektrische Herzerkrankungen, wie das SQTS oder LQTS wurden nicht sichtbar. Es traten lediglich ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern auf. Im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen, bei dem insgesamt fünf Herzen Arrhythmien zeigten, steigerte sich die Zahl der betroffenen Herzen unter 0,5 µmol/l Levosimendan auf sechs und unter 1 µmol/l auf acht. Unter 2 µmol/l Levosimendan zeigten 100 % der Herzen Rhythmusstörungen (Abb. 20). Am häufigsten zeigte sich Kammerflimmern, welches vor allem bei der Einlaufzeit der Medikamente, der Bestimmung der Refraktärzeiten und bei den Bursts sichtbar wurde (Abb. 21). Die unter den Ausgangsbedingungen und 0,5 µmol/l aufgetretenen neun registrierten Flimmerepisoden steigerten sich unter 1 µmol/l Levosimendan auf 23. Unter 2 µmol/l traten 11 Flimmerepisoden auf (Abb. 19). Ähnlich verhielten sich auch die ventrikulären Tachykardien die mit einer gesteigerten Häufigkeit unter Verwen- 65 dung der Kalium-reduzierten Perfusionslösung und bei der Bestimmung der Refraktärzeiten deutlich wurden. Diese erhöhten sich unter 0,5 µmol/l Levosimendan von zwei auf fünf und erreichten damit ihren Höhepunkt. Die Anzahl der Tachykardien fiel im weiteren Versuchsverlauf auf drei unter 1 µmol/l Levosimendan und schließlich auf eine unter 2 µmol/l (Abb. 19). In dieser Versuchsreihe wurde deutlich, dass Levosimendan in steigenden Konzentrationen einen Einfluss auf den Ventrikel nimmt und auf ventrikulärer Ebene ein proarrhythmisches Potential besitzt, da sowohl die Anzahl der betroffenen Herzen als auch die Gesamtzahl an Flimmerepisoden zugenommen hat. Ventrikuläre Rhythmusstörungen Gesamtzahl an Rhythmusstörungen 30 25 20 15 10 5 0 Baseline Levosimendan Levosimendan 0,5µM 1µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 2µM Abbildung 19: Gesamtzahl an ventrikulären Rhythmusstörungen unter Levosimendan 66 Induzierbare Herzen Induzierbare Herzen (%) 100 80 60 40 20 0 Baseline Levosimendan Levosimendan 0,5µM 1µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 2µM Abbildung 20: Gesamtzahl induzierbarer Herzen unter Levosimendan Abbildung 21: Beispielhafte Darstellung von Kammerflimmern unter Levosimendan 67 4.2 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin auf ventrikulärer Ebene 4.2.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin auf die APD90, QT-Zeiten, Refraktärzeiten (S2+S3) und Dispersion der Repolarisation In dieser Versuchsreihe wurden 13 Herzen verwendet, um den kombinierten Einsatz von Levosimendan und Ranolazin zu untersuchen. Die in den Dosis-Wirkungs-Versuchen signifikante Verkürzung der Aktionspotentialdauer, bis zur 90 %igen Repolarisation, wurde in dieser Versuchsreihe bestätigt. Im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen (Baseline) mit einer mittleren Aktionspotentialdauer von 153±21 ms wies die Kombination aus Levosimendan und Ranolazin mit 91±64 ms ebenfalls eine hoch signifikante (p<0.001) Verkürzung der APD90 auf. Vergleicht man Levosimendan mit einer mittleren Aktionspotentialdauer von 125±28 ms und die Kombination von Levosimendan und Ranolazin wird deutlich, dass die mittlere Aktionspotential trotz Zusatz von Ranolazin weiter absinkt (p<0.036) (Abb. 22). Bei der Auswertung der QT-Zeiten wurde wiederum unter Levosimendan eine Verminderung sichtbar (Abb. 23). Der gemeinsame Einsatz der Medikamente (276±89 ms) führte zu keiner signifikanten Abweichung (p<0.098) von den Ausgangsbedingungen (261±32 ms). Besonders deutlich wurde der Unterschied zwischen der alleinigen Gabe von Levosimendan und unter Zusatz von Ranolazin. Die durch Levosimendan hervorgerufene Verkürzung der QT-Zeit von 223±30 ms konnte durch Ranolazin (276±89 ms) auf Höhe des Ausgangsniveaus angehoben werden. Wie in den Monoversuchen zeigte Levosimendan eine signifikante (p<0.001) Verkürzung der mittleren Refraktärzeit S2. Die Werte fielen von 181±42 ms auf 142±20 ms. Unter der zusätzlichen Verwendung von Ranolazin stiegen die Werte auf 176±26 ms signifikant (p<0.004) an (Abb. 24). Bei der Refraktärzeit S3 zeigte sich ein ähnliches Bild. Hier wurde ebenfalls eine signifikante Verkürzung (p<0.001), von 159±28 ms auf 140±29 ms, unter Levosimendan sichtbar. Weitere signifikante Unterschiede (p<0.022) wurden zwischen Levosimendan ausschließlich (140±29 ms) und mit Ranolazin (167±23 ms) erkennbar. Die mittlere Refraktärzeit S3 näherte sich unter dem 68 Einsatz von Levosimendan und Ranolazin den Ausgangsbedingungen an. Hier wurden keine signifikanten Unterschiede aufgezeigt (Abb. 25). Die Abweichungen der Dispersion der Repolarisation waren auch in dieser Reihe nicht signifikant. Aktionspotentialdauer (APD90) APD90 (ms) 180 Baseline Levosimendan 1µM 130 Levosimendan + Ranolazin 10µM 80 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 Abbildung 22: Mittlere Aktionspotentialdauer - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 69 QT-Zeiten QT-Intervall (ms) 300 250 Baseline Levosimendan 1µM 200 Levosimendan + Ranolazin 10µM 150 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 Abbildung 23: Mittlere QT-Zeiten - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 200 150 p<0.001 p<0.004 100 50 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 24: Mittlere Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 70 Mittlere Refraktärzeit S3 Refraktärzeit (ms) 200 150 p<0.001 p<0.022 100 50 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 25: Mittlere Refraktärzeit S3 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 4.2.2 Wirkung von Ranolazin auf die Arrhythmogenese Die Wirkung von Ranolazin auf ventrikulärer Ebene wurde in diesen Versuchen besonders deutlich. Ranolazin zeigte keinen signifikanten Einfluss auf das proarrhythmische Potential von Levosimendan. Ranolazin war nicht in der Lage, die entstehenden ventrikulären Rhythmusstörungen, wie Tachykardien oder Kammerflimmern, zu unterdrücken. Anders als erwartet führte die Kombination aus Ranolazin und Levosimendan zu einer Steigerung der Anzahl an Rhythmusstörungen. Sowohl unter den Ausgangsbedingungen, als auch unter der alleinigen Verwendung von Levosimendan und der Medikamentenkombination wiesen neun Herzen Rhythmusstörungen auf. Während ohne Medikamente insgesamt vier ventrikuläre Tachykardien und 32 Kammerflimmerepisoden auftraten, konnte der Einsatz von Levosimendan die Anzahl auf 13 Tachykardien beziehungsweise 40 Flimmerepisoden steigern. Die durch die Verwendung von Ranolazin erwünschte Reduktion der Flimmerepisoden konnte so nicht dargestellt werden. Unter Levosimendan und Ranolazin wurden 17 ventrikuläre Tachykardien und 51 Flimmerepisoden registriert (Abb. 26). Das war eine deutliche Steigerung im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen, als auch zur 71 ausschließlichen Infusion von Levosimendan. Wie auch in den Dosis-FindungsVersuchen sind außer ventrikulären Tachykardien und Kammerflimmern keine weiteren Arrhythmien sichtbar geworden. Ranolazin eignet sich lauf dieser Versuchsreihe nicht um ventrikuläre Rhythmusstörungen zu unterdrücken. Spannend ist, ob Ranolazin auf atrialer Ebene eine gegensätzliche Wirkung erzielen kann. Ventrikuläre Rhythmusstörungen 80 Gesamtzahl an Rhythmusstörungen 70 60 50 40 30 20 10 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 26: Gesamtzahl an ventrikulären Rhythmusstörungen - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 4.3 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen auf ventrikulärer Ebene 4.3.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen auf die APD90, QT-Zeiten, Refraktärzeiten (S2+S3) und Dispersion der Repolarisation Wie erwartet wurde auch in dieser Versuchsreihe eine hoch signifikante (p<0.001) Verkürzung der mittleren Aktionspotentialdauer (APD90) unter Levosimendan ermittelt. Auffällig war auch die signifikante Verkürzung der APD90 unter der Infusion von 72 Levosimendan mit Dantrolen. Im Vergleich zu den Ausgangswerten (170±28 ms) kam es unter Levosimendan zu einer Verkürzung auf 145±22 ms und unter der Medikamentenkombination zu einem weiteren Abfall auf 137±17 ms (Abb. 27). Ausgehend von den Ausgangsbedingungen mit einer mittleren QT-Zeit von 327±117 ms führte der alleinige Einsatz von Levosimendan (260±101 ms), als auch die Verwendung der kombinierten Medikamente (231±23 ms), zu einer hoch signifikanten (p<0.001) Verminderung des Zeitintervalls (Abb. 28). Bezüglich der mittleren Refraktärzeiten S2 und S3 wurde ein einheitliches Bild sichtbar. Sowohl Levosimendan alleine, als auch Levosimendan kombiniert mit Dantrolen, erzeugten eine Verkürzung der mittleren Refraktärzeit S2 (Abb. 30). Ausgehend von einer Länge von 190±47 ms, fiel der Wert unter Levosimendan auf 155±31 ms und schließlich auf 140±19 ms ab. Bei der mittleren Refraktärzeit S3 verminderte sich die Länge unter Ausgangsbedingungen von 192±52 ms unter Levosimendan auf 139±35 ms. Vergleicht man die Ausgangsbedingungen mit der kombinierten Gabe von Levosimendan und Dantrolen, kam es zu einem signifikanten (p<0.002) Abfall der Refraktärzeit auf 144±25 ms (Abb. 31). Dem hingegen steht ein Anstieg der mittleren Refraktärzeit S3 bei der Betrachtung der Länge unter alleinigem Einsatz von Levosimendan und dem Zusatz von Dantrolen. Anders als in den vorangegangenen Versuchen führte der Einsatz von Dantrolen zu einer Veränderung der intraventrikulären, sowie linksepi- und endokardialen Dispersion der Repolarisation. Im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen führte die Verwendung von Dantrolen zu einer signifikanten (p<0.003) Verlängerung der Dispersion, von 53±16 ms auf 65±28 ms. Auch im Bezug auf die alleinige Verwendung von Levosimendan mit einem Wert von 54±26 ms, war das eine signifikante Steigerung (p<0.048) (Abb. 29). 73 Aktionspotentialdauer (APD90) APD90 (ms) 250 200 Baseline Levosimendan 1µM 150 Levosiemndan + Dantrolen 20µM 100 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 900 Abbildung 27: Mittlere Aktionspotentialdauer - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen QT-Zeiten 400 QT-Intervall (ms) 350 Baseline 300 Levosimendan 1µM 250 Levosimendan + Dantrolen 20µM 200 150 300 400 500 600 700 Frequenz (ms) 800 900 Abbildung 28: Mittlere QT-Zeiten - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 74 Dispersion der Repolarisation Dispersion der Repolarisation (ms) 100 90 80 70 60 50 40 p<0.048 p<0.003 30 20 10 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 29: Dispersion der Repolarisation - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 250 200 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 30: Mittlere Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 75 Mittlere Refraktärzeit S3 Refraktärzeit (ms) 250 200 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 31: Mittlere Refraktärzeit S3 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 4.3.2 Wirkung von Dantrolen auf die Arrhythmogenese Die vermutete antiarrhythmische Wirkung von Dantrolen wurde in dieser Studie nicht bestätigt. Aufgrund der Infusion von Dantrolen konnte die Anzahl flimmernder Herzen reduziert werden, doch zeigte Dantrolen keinen signifikanten Einfluss auf die Häufigkeit entstehender Rhythmusstörungen. Anders als in den vorangegangen Versuchen kam es unter der alleinigen Verwendung von Levosimendan zu keinem Anstieg von Kammerflimmern. Unter Ausgangsbedingungen wiesen zehn der 12 untersuchten Herzen Kammerflimmerepisoden auf. Unter 1 µmol/l Levosimendan hingegen waren nur noch neun Herzen betroffen und durch die Zugabe von Dantrolen wurde nur bei der Hälfte der verwendeten Herzen Flimmerepisoden registriert. Die Anzahl der registrierten Flimmerepisoden fiel von anfänglich 58, auf 42 und stieg schlussendlich auf 43 an (Abb. 32). Im Gegensatz zum Kammerflimmern provozierte Levosimendan ventrikuläre Tachykardien. Die Häufigkeit verdreifachte sich durch die Zugabe von Levosimendan zum Perfusat (drei→neun). Die Anzahl an Tachykardien wurde durch den Zusatz von Dantrolen, auf lediglich zwei, sichtbar reduziert. Genau wie in den 76 vorangegangenen Versuchen entstanden auch bei der Verwendung von Dantrolen, außer ventrikulären Tachykardien und Kammerflimmern, keine anderen Arrhythmien. Durch diese Versuche wird ebenfalls deutlich, dass Dantrolen, auf ventrikulärer Ebene, keine ausgesprochene antiarrhythmische Wirkung besitzt, da im Vergleich zum Einsatz von Levosimendan keine signifikanten Unterschiede sichtbar wurden. Ventrikuläre Rhythmusstörungen 80 Gesamtzahl an Rhythmusstörungen 70 60 50 40 30 20 10 0 Baseline Levosimendan 1µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 32: Gesamtzahl an ventrikulären Rhythmusstörungen - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 77 4.4 Untersuchung von Levosimendan auf atrialer Ebene 4.4.1 Wirkung von Levosimendan auf die aAPD90, aAPD70, aAPD50, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit Neben den vorangegangenen Ventrikelversuchen wurden drei Versuchsreihen auf atrialer Ebene durchgeführt. Im besonderen Fokus stand das Auftreten von Rhythmusstörungen insbesondere von Vorhofflimmern. Zur Untersuchung der aufgestellten Hypothese und Ermittlung der weiter verwendeten Dosis von Levosimendan wurden 13 Herzen eingesetzt. Die Aktionspotentialdauer aAPD90 verkürzte sich im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen mit 127±42 ms, unter einer Konzentration von 0,25 µmol/l Levosimendan mit 104±36 ms, signifikant (p<0.001). Die Länge des Aktionspotentials verkürzte sich bei einer Konzentration von 0,5 µmol/l Levosimendan ebenfalls auf 113±32 ms (p<0.062) (Abb. 33). Dieser Zustand wurde auch bei der Aktionspotentialdauer bis zur 50 %igen Repolarisation (aAPD50) sichtbar. Die aAPD70 wies sowohl bei einer Konzentration von 0,25 µmol/l, als auch bei 0,5 µmol/l, eine signifikante Verminderung der Aktionspotentialdauer auf. Die Werte fielen im Bezug auf die Baseline (93±32 ms), auf 75±29 ms (p<0.001) bei einer Konzentration von 0,25 µmol/l Levosimendan und stiegen wieder leicht an unter 0,5 µmol/l, mit einer Länge von 81±33 ms (p<0.05). Die bei einer Frequenz von 250 ms ermittelte mittlere Refraktärzeit S2 zeigte bei ansteigenden Levosimendan-Konzentrationen eine signifikante Verminderung. Die unter Ausgangsbedingungen gemessene Länge von 104±22 ms, verkürzte sich unter 0,25 µmol/l auf 87±30 ms (p<0.043) und sank unter 0,5 µmol/l, auf 76±27 ms (p<0.034) weiter ab. Keine signifikanten Differenzen wurden zwischen 0,25 µmol/l Levosimendan und 0,5 µmol/l Levosimendan sichtbar (p<0.234) (Abb. 34). Bei der Leitungszeit lagen alle berechneten Werte auf einem Niveau und wiesen keine signifikanten Unterschiede auf. 78 Aktionspotentialdauer (aAPD90) aAPD90 (ms) 130 Baseline Levosimendan 0,25µM Levosimendan 0,5µM 80 150 250 Frequenz (ms) 350 Abbildung 33: Mittlere atriale Aktionspotentialdauer unter alleiniger Verwendung von Levosimendan Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 150 100 p<0.043 p<0.234 50 0 Baseline Levosimendan 0,25µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 0,5µM Abbildung 34: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 unter alleiniger Verwendung von Levosimendan 79 4.4.2 Untersuchung zu Vorhofflimmern - arrhythmogenes Potential von Levosimendan Das proarrhythmische Potential von Levosimendan wurde in dieser Versuchsreihe besonders deutlich. Unter Ausgangsbedingungen zeigten 12 der 13 untersuchten Kaninchenherzen insgesamt 73 Flimmerepisoden (Abb. 35). Von diesen 12 Herzen dauerte bei lediglich vier Herzen die Flimmerepisode über 1000 ms an. Insgesamt traten acht Flimmerepisoden über 1000 ms auf (Abb. 36). Mit dem Einsatz von Levosimendan 0,25 µmol/l änderte sich dieser Zustand. Insgesamt traten bei 11 Organen, 115 Flimmerepisoden auf (Abb. 35), welche bei acht Herzen insgesamt 15 Mal über 1000 ms andauerten (Abb. 36). Bei einer Konzentration von 0,5 µmol/l Levosimendan waren die auftretenden Flimmerepisoden noch häufiger und länger andauernd. Insgesamt flimmerten 12 Herzen 127 Mal (Abb. 35). Bei neun Herzen dauerte die Flimmerepisode 26 Mal über 1000 ms an (Abb. 36). Besonders häufig trat Vorhofflimmern nach der schnell aufeinander folgenden, hochfrequenten Stimulation (Burst), oder während der Bestimmung der Refraktärzeit S2 auf (Abb. 37). In einigen Fällen konnte das Flimmern erst durch Defibrillation terminiert werden. In zwei Versuchen, unter der Konzentration von 0,5 µmol/l Levosimendan, musste die Durchführung abgebrochen werden, da die Flimmerepisoden selbst nach mehrmaliger Defibrillation nicht gestoppt werden konnten. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für die weiteren Vorhofversuche eine Levosimendan-Konzentration von 0,5 µmol/l eingesetzt. 80 Vorhofflimmern Gesamtzahl Flimmerepisoden 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 0,25µM Levosimendan 0,5µM Konzentrationen (µM) Abbildung 35: Gesamtzahl an Vorhofflimmern unter alleiniger Verwendung von Levosimendan Vorhofflimmern Flimmerepisoden >1000ms 30 25 20 15 10 5 0 Baseline Levosimendan 0,25µM Konzentrationen (µM) Levosimendan 0,5µM Abbildung 36: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms unter alleiniger Verwendung von Levosimendan 81 Abbildung 37: Unter Levosimendan auftretendes lang anhaltendes Vorhofflimmern - Vergleich monophasische Aktionspotentiale (oben) und EKG (unten) 82 4.5 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin auf atrialer Ebene 4.5.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Ranolazin auf die aAPD90, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit In der zweiten Vorhofreihe, bestehend aus 12 Herzen, wurde die kombinierte Gabe von Levosimendan und Ranolazin untersucht. Wie unter der Infusion von 0,5 µmol/l Levosimendan erwartet, kam es zu einer Verkürzung der mittleren Aktionspotentialdauer (aAPD90), jedoch wurde auch in dieser Versuchsreihe das Signifikanzniveau nicht erreicht. Vergleicht man die Kombination der Medikamente mit den Ausgangsbedingungen, so wurde eine signifikante Erhöhung der Länge des Aktionspotentials, über das basale Niveau hinaus, deutlich. Die Dauer fiel von 96±15 ms, unter Levosimendan auf 89±17 ms und stieg im weiteren Versuchsverlauf auf 110±22 ms signifikant (p<0.001) an (Abb. 38). Bezüglich der Refraktärzeit S2 wurde unter Levosimendan und Ranolazin eine signifikante (p<0.028) Verlängerung der mittleren Refraktärzeit deutlich (Abb. 39). Die gemessenen Längen steigerten sich über das basale Niveau hinaus. Die unter den Ausgangbedingungen gemessene mittlere Refraktärzeit lag bei 89±24 ms und verlängerte sich unter der Medikation auf 116 ms. Es wurden keine Unterschiede im Hinblick auf die Leitungszeit erkannt. 83 Aktionspotentialdauer (aAPD90) aAPD90 (ms) 130 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Ranolazin 10µM 80 150 250 Frequenz (ms) 350 Abbildung 38: Mittlere atriale Aktionspotentialdauer - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 150 100 p<0.028 50 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 39: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 84 4.5.2 Wirkung von Ranolazin auf Vorhofflimmern Ranolazin zeigte deutlichen Einfluss auf atriale Rhythmusstörungen. Ranolazin war in der Lage das von Levosimendan hervorgerufene Vorhofflimmern zu unterdrücken. Unter Ausgangsbedingungen wurden bei allen 12 Herzen insgesamt 81 Flimmerepisoden ermittelt (Abb. 40). Lediglich fünf Herzen wiesen, insgesamt 15 über eine Sekunde andauernde, Rhythmusstörungen auf (Abb. 41). Die Infusion von Levosimendan erzeugte bei 11 Herzen insgesamt 132 Flimmerepisoden (Abb. 40). Bei neun Organen hielt das Vorhofflimmern über 1000 ms an. Es wurden 27 Flimmerepisoden über eine Sekunde registriert (Abb. 41). Die Verwendung von Ranolazin reduzierte neben den insgesamt sichtbaren Ereignissen von Vorhofflimmern auch die Anzahl der betroffenen Herzen. Die insgesamt 81 Flimmerepisoden verteilten sich auf neun Kaninchenherzen (Abb. 40). Acht Herzen zeigten 22 Mal über 1000 ms andauerndes Vorhofflimmern (Abb. 41). In dieser Reihe wird deutlich, dass Ranolazin die Häufigkeit des Auftretens von Vorhofflimmern, im Gegensatz zu den ventrikulären Rhythmusstörungen, reduzieren kann. Die Dauer der trotzdem entstehenden Flimmerepisoden wird jedoch wenig beeinflusst. Durch den Einsatz von Ranolazin ist es nicht möglich Vorhofflimmern vollständig zu unterdrücken, doch die proarrhythmische Wirkung von Levosimendan wird aufgehoben. 85 Vorhofflimmern Gesamtzahl Flimmerepisoden 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 40: Gesamtzahl an Vorhofflimmern - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin Vorhofflimmern Flimmerepisoden >1000ms 30 25 20 15 10 5 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Ranolazin 10µM Konzentrationen (µM) Abbildung 41: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin 86 4.6 Untersuchung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen auf atrialer Ebene 4.6.1 Wirkung von Levosimendan in Kombination mit Dantrolen auf die aAPD90, aAPD70, aAPD50, Refraktärzeit S2 und Leitungszeit Die letzte atriale Versuchsreihe umfasste 12 Herzen und wurde mit dem peripheren Muskelrelaxans Dantrolen durchgeführt. Die Zugabe von Levosimendan führt wie erwartet in allen 12 untersuchten Kaninchenherzen, zu einer signifikanten Verkürzung der atrialen Aktionspotentialdauer (aAPD90). Anders als erwartet zeigte sich unter Levosimendan und Dantrolen eine weitere, hoch signifikante (p<0.001) Absenkung der Länge des Aktionspotentials, im Vergleich zu den unter Ausgangsbedingungen ermittelten Werten. Die mittlere Dauer des Aktionspotentials lag unter Ausgangsbedingungen bei 120±24 ms und sank unter der Infusion von Levosimendan und Dantrolen auf 103 ms ab. Zwischen der alleinigen Zugabe von Levosimendan (107 ms±15 ms) und der Medikamentenkombination wurden keine signifikanten Unterschiede sichtbar (Abb. 42). Betrachtete man die aAPD70 und aAPD50 wurde zwischen allen berechneten Werten signifikante Differenzen aufgezeigt. Dantrolen sorgte für eine signifikante Verkürzung der atrialen Aktionspotentialdauer. Dem hingegen stand eine geringe Verkürzung der Refraktärzeit S2. Der unter Levosimendan signifikant (p<0.012) abfallende Wert (82 ms) stabilisierte sich während der Infusion von Dantrolen (94 ms), konnte jedoch nicht das Ausgangsniveau (103 ms) erreichen (Abb. 43). Anders als in den vorangegangenen Versuchsreihen führte Dantrolen, im Vergleich zur alleinigen Infusion von Levosimendan, zu einer Verlängerung (29 ms) der atrialen Leitungszeit. Unter Levosimendan wurde die Leitungszeit von 27±19 ms auf 26±10 ms reduziert. Der Einfluss von Dantrolen führte zu einer Erhöhung der Leitungszeit über das basale Niveau hinaus. 87 Aktionspotentialdauer (aAPD90) aAPD90 (ms) 130 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Dantrolen 20µM 80 150 250 Frequenz (ms) 350 Abbildung 42: MIttlere atriale Aktionspotentialdauer – Vergleich Levosimendan versus trolen Dan- Mittlere Refraktärzeit S2 Refraktärzeit (ms) 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 43: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 88 4.6.2 Wirkung von Dantrolen auf Vorhofflimmern Die Zugabe von Levosimendan zum Perfusat führte zu einer Steigerung der Gesamtanzahl und der Dauer von auftretenden Flimmerepisoden im Vergleich zur Ausgangssituation. Unter Levosimendan als auch unter Ausgangsbedingungen zeigten alle 12 Herzen Vorhofflimmern. Insgesamt steigerte sich mit dem Einsatz von Levosimendan das Auftreten von Vorhofflimmern von 120 auf 178 Flimmerepisoden (Abb. 44). Bei 11 Herzen dauerten die registrierten 39 Flimmerepisoden über 1000 ms an (Abb. 45). Nach der Infusion von Dantrolen änderten sich das Erscheinen und die Dauer von Vorhofflimmern kaum (Abb. 44 und Abb. 45). Bei jedem der in der Versuchsreihe verwendeten Herzen trat unter Dantrolen Vorhofflimmern auf. Insgesamt reduzierte sich die Gesamtzahl der Flimmerepisoden auf 131 (Abb. 44). Dantrolen lag damit trotzdem deutlich über dem Ausgangsniveau. Auch die Dauer des Vorhofflimmerns konnte dadurch nicht beeinflusst werden. Es wurden identisch viele Herzen mit ähnlich lang andauernden (>1000 ms) Flimmerepisoden registriert, wie unter der alleinigen Verwendung von Levosimendan. Diese Vorhofreihe zeigt, dass es durch den Einsatz von Dantrolen nicht möglich ist, die Häufigkeit und Dauer von Vorhofflimmern zu beeinflussen oder unterdrücken. 89 Vorhofflimmern Gesamtzahl Flimmerepisoden 200 150 100 50 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 44: Gesamtzahl an Vorhofflimmern - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen Vorhofflimmern Flimmerepisoden >1000ms 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Baseline Levosimendan 0,5µM Levosimendan + Dantrolen 20µM Konzentrationen (µM) Abbildung 45: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen 90 5 Diskussion In dieser Arbeit wurde das proarrhythmische Potential von Levosimendan auf ventrikulärer und atrialer Ebene untersucht. Obwohl Levosimendan seit einiger Zeit zugelassen und im klinischen Alltag zur Behandlung der akut dekompensierten, chronischen Herzinsuffizienz eingesetzt wird, wurden bisher keine elektrophysiologischen Untersuchungen zur potentiell proarrhythmischen Wirkung durchgeführt. Zur Untersuchung wurde ein In-vitro-Versuch am isolierten Kaninchenherzen verwendet. Die Ermittlung der Daten fand mit Hilfe der Langen-dorff-Apparatur statt, die über den gesamten Versuchszeitraum eine konstante Versorgung der Herzen sicherstellte. Es wurden ausschließlich Organe gesunder Tiere ohne Hinweise auf Herz-KreislaufErkrankungen eingesetzt. Es war von Vorteil, das Organ im Ganzen zu betrachten, da für die komplexe Entstehungsweise von Herzrhythmusstörungen mehrerer Faktoren notwendig waren. Die auf ventrikulärer Ebene zu analysierenden Faktoren waren die Aktionspotentialdauer, die QT-Zeit, die Dispersion der Repolarisation sowie das Auftreten von Arrhythmien. Durch den Einsatz von Levosimendan wurde eine signifikante Verkürzung der Aktionspotentialdauer, des durchschnittlichen QT-Intervalls und der mittleren Refraktärzeiten S2 und S3 deutlich. Auf atrialer Ebene zeigte sich ebenfalls eine Verkürzung der aAPD und der Refraktärzeit S2. In beiden Versuchsformen fielen häufig auftretende ventrikuläre und atriale Rhythmusstörungen ins Auge. Das in den klinischen Studien als Nebenwirkung beschriebene Vorhofflimmern konnte im Besonderen nachgewiesen werden. Durch die zusätzliche Gabe von Ranolazin oder Dantrolen war es nur eingeschränkt möglich die entstehenden Rhythmusstörungen zu unterbinden. In dieser Studie wird deutlich aufgrund der proarrhythmischen Nebenwirkungen, den klinischen Einsatz von Levosimendan, zu überdenken. Es sollten weitere Untersuchungen mit Levosimendan auf molekularer Ebene sowie zur Entdeckung protektiver Therapieoptionen durchgeführt werden. Die hier aufgezeigte elektrophysiologische Wirkungsweise auf Organebene kann als Grundlage für die weitere Forschung verwendet werden. Ziel ist es, den klinischen Einsatz von Levosimendan zu erleichtern und Nebenwirkungen zu reduzieren, um das Medikament in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin zu etablieren. 91 5.1 Ventrikuläre Arrhythmogenese und protektive Therapieoptionen Levosimendan wird aufgrund seiner vielfältigen positiven Effekte zur Behandlung der akuten dekompensierten chronischen Herzinsuffizienz eingesetzt. Neben dem positiv inotropen Effekt ohne Erhöhung des myokardialen Sauerstoffbedarfs [74,103] steht die vasodilatatorische Funktion im Vordergrund [103]. Insgesamt führt Levosimendan am insuffizienten Herzen zu einer Steigerung der myokardialen Kontraktilität, der Erhöhung der diastolischen Funktion und zu einer Senkung der Vor- und Nachlast [103]. Diese beschriebene Wirkungsweise weist nicht auf ein potentielles proarrhythmisches Potential hin. Viele vorangegangene Studien weisen eine proarrhythmische Wirkung ab. Die LIDO-Studie von 2002 [110] zeigte unter Levosimendan, im Vergleich zu Dobutamin, eine deutliche Reduktion von Rhythmusstörungen und eine geringere Mortalität auf. Die Reduktion von Rhythmusstörungen wurde von der RUSSLAN Studie aus 2002 [111], der Portland Studie aus 2007 [112], der LIDO Studie aus 2002 [110] und anderen Meta-Analysen [113,114,116] bestätigt. Jedoch haben unterschiedliche klinische Studien atriale und ventrikuläre Arrhythmieepisoden beobachtet [107,108]. In der Studie von Packer et al. wurden lebensgefährliche Arrhythmien mit der Infusion von Levosimendan in Verbindung gebracht. Weiterhin zeigte sich eine erhöhte Mortalität [107]. Diese experimentell durchgeführte Arbeit liefert die potentiellen elektrophysiologischen Grundlagen für die entstandenen Arrhythmien. Die dargestellten Versuche zeigen zum ersten Mal proarrhythmische Effekte am isolierten Kaninchenherzen. Der Einsatz von Levosimendan führt dosisabhängig zu einer hoch signifikanten (p<0.05) Verkürzung der Repolarisation. Inbegriffen ist eine Verkürzung der Aktionspotentialdauer, des QT-Intervalls und der effektiven Refraktärzeit. Diese sichtbare Repolarisationsverkürzung erklärt das proarrhythmische Potential. Zur Untersuchung des proarrhythmischen Potentials wurden Provokationsversuche durchgeführt. Die eingesetzten Herzen wurden absichtlich hochfrequent stimuliert. Das angewendete Stiumulationsprotokoll wird ebenfalls zur klinischen Festlegung der Risikoeinstufung beim plötzlichen Herztod verwendet. Des Weiteren fanden ähnliche Protokolle Anwendung bei den MADITStudien zur Risikoabschätzung von Patienten nach überstandenem Myokardinfarkt 92 [134,135]. Zudem wurde ein gleichwertiges Stimulationsprotokoll bei Patienten mit idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie [136] eingesetzt. Die programmierte ventrikuläre Stimulation stellt somit einen häufig verwendeten Marker zur Risikobeurteilung dar [137]. Die in dieser experimentellen Studie gesammelten Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass Levosimendan eine proarrhythmische Wirkung besitzt [137]. Da Levosimendan zur Behandlung der akut dekompensierten chronischen Herzinsuffizienz eingesetzt wird ist diese Repolarisationsstörung von besonderer Bedeutung. Herzinsuffiziente Patienten versterben in der Regel aus zwei verschiedenen Gründen: Einerseits aufgrund eines Pumpversagens oder andererseits durch ventrikuläre, tachykarde Arrhythmien [64]. Ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern sind zudem die Hauptursache vom plötzlichen Herztod [93,95]. Das ermittelte proarrhythmische Potential von Levosimendan stellt somit die Verwendung von Levosimendan, am chronisch insuffizienten Herzen, in Frage. Neben einer Verschlechterung der Herzinsuffizienz durch Arrhythmien steigt das Risiko, dem plötzlichen Herztod zu erliegen. Aufgrund der unter Levosimendan sichtbaren Verkürzung der Aktionspotentialdauer, der Refraktärzeiten sowie des QT-Intervalls sind neben ventrikulären Tachykardien keine weiteren Rhythmusstörungen aufgetreten. Die ventrikulären Tachykardien stehen nicht im Zusammenhang mit anderen Repolarisationsstörungen. Für die Entstehung von Nachdepolarisationen, dem langen QT-Syndrom oder TdP-Tachykardien sind andere elektrophysiologische Pathomechanismen nötig, auf die Levosimendan keinen Einfluss nimmt. Am wahrscheinlichsten wäre das Auftreten von späten Nachdepolarisationen (delayed afterdepolarizations, DAD). Späte Nachdepolarisationen werden durch einen Kalziumüberschuss in der Herzmuskelzelle hervorgerufen. Der Kalziumüberschuss führt zur Aktivierung unspezifischer Kationenkanäle. Das bewirkt die Generierung eines depolarisierenden Einwärtsstroms [83]. Levosimendan führt jedoch zu keinem Anstieg der zytoplasmatischen Kalziumkonzentration [74,104]. Diese Aussage konnte in der vorliegenden Studie ebenfalls bestätigt werden, da unter Levosimendan keine DADs sichtbar wurden. Grundsätzlich besitzt die Verlängerung der Refraktärzeit eine antiarrhythmische Wirkung. Genau dieser Mechanismen bedienen sich manche Antiarrhythmika. Diese 93 Substanzen zählen zu Antiarrhythmika der Klasse I [138] und Klasse III [139,140]. Ebenso machen sich Multi-Kanal-Inhibitoren wie Ranolazin [141] eine Verlängerung des QT-Intervalls und der Refraktärzeit zu Nutze. Die antiarrhythmischen Effekte von Ranolazin wurde in dieser Studie experimentell untersucht. Ranolazin führt in ventrikulären Myozyten zu einer Inhibierung des späten, einwärts gerichteten Natriumkanals INa, zum Zeitpunkt der Repolarisation [118]. Zudem führt Ranolazin zu einer Hemmung des Kaliumkanals IKr, ohne Nebenwirkungen wie eine verlängerte Aktionspotentialdauer, eine getriggerte Aktivität oder EADs zu provozieren [119]. Durch die Beeinflussung der genannten Ionenkanäle bewirkt Ranolazin eine Verlängerung des QT-Intervalls [119]. Die erhoffte antiarrhythmische Wirkung von Ranolazin konnte auf ventrikulärer Ebene nicht nachgewiesen werden. Die Aktionspotentialdauer ist, wie erwartet, unter Ranolazin weiter abgesunken. Positiv zu vermerken war, dass die unter Levosimendan verminderte QT-Zeit durch Ranolazin auf das Ausgangsniveau signifikant angehoben werden konnte. Weiterhin kam es unter Ranolazin zu einer deutlichen Verlängerung der Refraktärzeit. Die beschriebenen antiarrhythmischen Mechanismen der QT-Intervallverlängerung und Erhöhung der Refraktärzeit waren sichtbar, konnten jedoch das Auftreten von ventrikulären Rhythmusstörungen nicht verhindern. Weder die Gesamtzahl der flimmernden Herzen wurde reduziert, noch die Anzahl an Flimmerepisoden vermindert. Ursache hierfür kann die atriale Selektivität von Ranolazin sein. Burashnikov et al. [120] beschrieben eine Selektivität zur Blockade nutzungsabhängiger atrialer Natriumkanäle. Diese Blockade konnte experimentell das Auftreten von Vorhofflimmern reduzieren, ohne die Elektrophysiologie des Ventrikels zu beeinflussen. In weiteren experimentellen Studien wurde eine atriale antiarrhythmische Potenz von Ranolazin nachgewiesen [123,124]. Aufgrund der ventrikulär unbefriedigenden antiarrhythmischen Wirkung von Ranolazin in Bezug auf Levosimendan- vermittelte Arrhythmien wurden Versuche auf Vorhofebene durchgeführt, um das eventuell selektive antiarrhythmische Potential von Ranolazin zu untersuchen und darzustellen. Ergebnis dieser Studie ist, dass der kombinierte Einsatz von Ranolazin und Levosimendan bei ventrikulären Rhythmusstörungen, als mögliche protektive Therapieoption, nicht zu empfehlen ist. 94 Als weitere Therapieoption wurde die Kombination aus Levosimendan und Dantrolen untersucht. Dantrolen wird als Medikament zur Behandlung der malignen Hyperthermie und spastischen Zustände eingesetzt und ist auch in der Tiermedizin eingesetzt [127,128]. Dantrolen beeinflusst den Kalziumstoffwechsel der Skelettmuskulatur, indem es den Ryanodinrezeptor des sarkoplasmatischen Retikulums hemmt [127,128]. Die Hemmung führt zu einer Herabsetzung der intrazellulären Kalziumkonzentration [128]. In der durchgeführten Versuchsreihe konnten weder die Aktionspotentialdauer, die Refraktärzeit noch das QT-Intervall durch Dantrolen gesteigert werden. Die QT-Zeit fiel unter Dantrolen signifikant ab. Auch die Refraktärzeit stabilisierte sich unter Dantrolen nicht, sondern wurde weiter vermindert. Über den RyR2 werden Kalziumionen freigesetzt. Ein erhöhter Kalziumgehalt bedingt Umbauprozesse im Myokard und nimmt Einfluss auf die Kontraktilität. Zudem besteht das Risiko für späte Nachdepolarisationen und eine gesteigerte Aktivität, was wiederum Kammer- und Vorhofflimmern zur Folge hat [129]. Hinsichtlich der Arrhythmogenese erzielte der Einsatz von Dantrolen in dieser Arbeit jedoch geringe Erfolge. Die Gesamtzahl der flimmernden Herzen reduzierte sich unter Dantrolen von neun auf sechs. Die Anzahl an Flimmerepisoden blieb unter Dantrolen, im Vergleich zu Levosimendan, konstant. Lediglich das Auftreten von ventrikulären Tachykardien konnte durch Dantrolen sichtbar minimiert werden. Ergebnis ist auch hier ein nicht zu empfehlender Einsatz von Dantrolen und Levosimendan, zur Minimierung ventrikulärer Arrhythmien. 5.2 Atriale Arrhythmogenese und protektive Therapieoptionen Vorhofflimmern stellt sowohl in der Humanmedizin als auch Veterinärmedizin [91,92] eine der am häufigsten klinisch auftretenden Arrhythmien dar. Die Wahrscheinlichkeit zu erkranken steigt mit zunehmendem Alter signifikant an [77]. Frauen sind hierbei seltener betroffen als Männer [78]. Zur Risikogruppe gehören sowohl herzgesunde Menschen, als auch Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz, bei denen Vorhofflimmern aufgrund struktureller Umbauprozesse (Remodeling) entsteht. Beim Vorhofflimmern handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, bei dem die Grundur- 95 sache nicht immer bekannt ist. Neben kardiologischen Ursachen spielen endokrine und nervale Veränderungen, wie eine vermehrte Aktivierung des Sympathikus, des Nervus Vagus oder eine Hyperthyreose eine Rolle [83]. Wie bei fast jeder Erkrankungen gibt es beim Vorhofflimmern auch eine idiopathische Form, bei der keine sichtbare Grunderkrankung vorliegt [79,82]. Hier vermutet man, aufgrund der familiären Häufung, eine genetische Komponente. Elektrophysiologisch steht beim Vorhofflimmern die Entstehung von wiedereintretenden Kreisbewegungen, sogenannten Rotoren oder Reentry im Vordergrund. 1962 stellte Gordon Moe [142] die multi wavelet Hypothese auf. Er beschrieb über 30 zeitgleich zirkulierende Erregungsfronten, welche sich über den gesamten Vorhof ausbreiteten. Diese aufgestellte Theorie wurde 1985 von Allessie et al. [143] bestätigt. Allessie et al. konnten nachweisen, dass zu Erhaltung und Stabilisierung der Arrhythmie mindestens vier bis sechs Erregungsfronten vorliegen. Lewis et al. [144] stellten heraus, dass eine Erregungsfront dabei nur bestehen kann solange sie auf erregbares, nicht refraktäres Myokard trifft. Ein entscheidender Faktor für die Entstehung von Reentry ist die Wellenlänge der Rotoren. Die Wellenlänge beschreibt ein Produkt aus der effektiven atrialen Refraktärzeit und der Ausbreitungsgeschwindigkeit (Leitungsgeschwindigkeit) [145,146]. Das führt dazu, dass eine verlängerte atriale Leitungszeit oder verkürzte Refraktärzeit, das Risiko für Reentry erhöht [147]. Ebenso findet die Aufrechterhaltung von Reentry über eine inhomogene atriale Erregung und verkürzte Refraktärzeit statt [148]. Bisher publizierte klinische Studien weisen bezüglich des atrialen arrhythmogenen Potentials von Levosimendan ebenfalls kontroverse Ergebnisse auf. Einige Studien beschrieben, im Vergleich zu Dobutamin oder Placebo, eine unter Levosimendan höhere Inzidenz von Vorhofflimmern [107,108]. Bisher gibt es diesbezüglich keine elektrophysiologischen Untersuchung auf atrialer Ebene. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse legen einen Grundstein zur Erforschung der proarrhythmischen Wirkung von Levosimendan auf ventrikulärer, aber vor allem auf atrialer Ebene. Levosimendan führt konzentrationsabhängig zu einer signifikanten Verkürzung der atrialen Repolarisation. Neben einer Verminderung der Aktionspotentialdauer (aAPD90) kommt es zu einer signifikanten Reduktion der atrialen effektiven Refraktär- 96 zeit. Die Leitungszeit und somit die Leitungsgeschwindigkeit wird durch Levosimendan nicht beeinflusst. Levosimendan weist ein eindeutiges proarrhythmisches Potential auf. Unter zunehmenden Levosimendan-Konzentrationen stieg auch die Gesamtzahl der flimmernden Herzen an. Des Weiteren wurden signifikant häufiger auftretende und länger andauernde Episoden von Vorhofflimmern beobachtet. Von besonderem Interesse waren die über 1000 ms andauernden Flimmerepisoden. Unter Levosimendan war es zeitweise kaum möglich das Vorhofflimmern durch Defibrillation zu terminieren. Besonders während der hochfrequenten Stimulation und der Bestimmung der Refraktärzeit traten lang andauernde Flimmerereignisse auf. Die proarrhythmischen Effekte von Levosimendan erklären sich über die verkürzte Aktionspotentialdauer und verminderte effektive Refraktärzeit. Wie vorangegangen beschrieben ist die Wellenlänge ein entscheidender Faktor zur Entstehung von Vorhofflimmern. Levosimendan beeinflusst die Wellenlänge. Aufgrund der verminderten Refraktärzeit sinkt die Wellenlänge und erhöht die Anzahl möglicher im Vorhof vorkommenden Rotoren. Somit stellt Levosimendan einen Trigger zur Entstehung und vor allem zur Stabilisierung und Aufrechterhaltung von Reentry-Kreisen dar. Die nicht ausreichende Terminierung durch Defibrillation beschreibt die von Levosimendan hervorgerufene hohe Stabilität der Arrhythmie. Übertragen auf das Konzept von Nattel et al. [76] bezeichnet die hochfrequente Stimulation das Substrat und Levosimendan den Trigger zur Entstehung von Reentry. Ebenso während der Bestimmung der Refraktärzeit auftretende Flimmerepisoden sind auf den zusätzlichen ektopischen Stimulus zurückzuführen. Neben der verminderten Refraktärzeit führt Levosimendan zu einer verkürzten Aktionspotentialdauer. Das verkürzte Aktionspotential führt zu einer schnelleren Erregbarkeit der Herzmuskelzelle und kann die Entstehung von Vorhofflimmern weiter fördern, insbesondere wenn zusätzlich die Refraktärzeit reduziert ist. Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine der kardiologischen Erkrankungen dar, die Vorhofflimmern bedingen kann. Die dilatative Kardiomyopathie ist auch in der Veterinärmedizin eine häufige Erkrankung. Vor allem großwüchsige Hunderassen wie Boxer, Dobermänner, Airdale Terrier, Doggen, Rottweiler, Neufundländer und Irische Wolfshunde sind häufig betroffen. Bei vielen dieser Rassen besteht eine 97 genetische Prädisposition [149]. Die DCM führt, hervorgerufen durch eine Herzmuskelschwäche, zu einem Verlust der myokardialen Kontraktionskraft und verminderten Pumpleistung. Daraus folgt eine Volumenüberlastung und Dilatation der Ventrikel, die sich im Lauf der Erkrankung auch auf die Vorhöfe ausbreitet. Das erhöht sowohl die Vor- als auch die Nachlast des Herzens. Zusätzliche lebensgefährliche Arrhythmien können bis zum SCD führen [93]. Klinisch manifestiert sich die Erkrankung meist sehr spät, wenn körpereigene Rekompensationsmechanismen nicht mehr ausreichen. Bei routinemäßig untersuchten prädispositionierten Hunderassen wurden vor Beginn klinischer Symptome bereits Veränderungen im EKG sichtbar. Dobermänner, Doggen und Boxer wiesen vermehrt ventrikuläre Arrhythmien auf [150]. Irische Wolfshunde zeigten Episoden von Vorhofflimmern [90]. Vorhofflimmern entsteht wahrscheinlich aufgrund mehrerer Mechanismen. Beispielsweise kommt es zu einem strukturellen Umbau des Myokards. Das strukturelle Remodeling bedingt eine inhomogene Erregbarkeit des Myokards [83]. Medikamentös wird die DCM mit einer Kombination aus verschiedenen Medikamenten behandelt. Am Wichtigsten sind positiv inotrope Substanzen, die die Kontraktionskraft erhöhen, Diuretika zur Behandlung der Volumenüberladung und Antiarrhythmika [150]. Levosimendan würde sich als Medikament zur Behandlung der DCM eignen, wird jedoch in der Veterinärmedizin noch nicht eingesetzt. Die positiv inotrope Wirkung könnte die Kontraktionskraft erhöhen und die vasodilatatorische Funktion würde zur Senkung der Vor- und Nachlast beitragen. Zur Minderung der Volumenbelastung müssten zusätzlich Diuretika eingesetzt werden. Aufgrund des proarrhythmischen Potentials müsste auch die Kombination von Levosimendan und Antiarrhythmika in Betracht gezogen werden. In dieser Studie wurde bereits die unbefriedigende anti-arrhythmische Wirkung von Ranolazin, zur Verminderung ventrikulärer Rhythmusstörungen, aufgezeigt. Die in bereits publizierten Studien beschriebene atriale Selektivität von Ranolazin, zur Verminderung von Vorhofflimmern, konnte in dieser Studie bedingt nachgewiesen werden [120,123,124]. Elektrophysiologisch führte Ranolazin zu einer signifikanten Verlängerung der atrialen Aktionspotentialdauer und Refraktärzeit. Sowohl die aAPD als auch Refraktärzeit wurde über das, unter den Ausgangsbedingungen ermittelte Niveau, angehoben. Auf die Leitungszeit zeigte Ranolazin keinen Effekt. Ranolazin 98 führte, durch die Verlängerung der Refraktärzeit, zu einer Verlängerung der Wellenlänge und war somit in der Lage sowohl die Anzahl der flimmernden Herzen als auch die Gesamtzahl an Flimmerepisoden zu reduzieren. Mit Verlängerung der Refraktärzeit vergrößert sich die Wellenlänge der Rotoren, was die Anzahl an Reentry-Kreisen reduziert. Hierdurch wird die Entstehung von Vorhofflimmern gehemmt und die Aufrechterhaltung unterbrochen. Auch die signifikante Verlängerung der Aktionspotentialdauer führte zu einer Verminderung von Vorhofflimmern, da das Herz langsamer erregbar und zudem länger refraktär war. Ranolazin besitzt auf atrialer Ebene ein deutlich höheres antiarrhythmisches Potential, kann jedoch das auftretende Vorhofflimmern nicht vollständig unterbinden. Unter Ranolazin in Kombination mit Levosimendan wurden gleich viele Flimmerepisoden, wie ohne Medikamenteneinfluss beobachtet. Ranolazin kann somit die proarrhythmische Wirkung von Levosimendan unterdrücken. Da Levosimendan und Ranolazin die gegensätzlichen elektrophysiologischen Mechanismen zugrunde liegen, besitzt das proarrhythmische Potential von Levosimendan sowie die selektiv atriale antiarrhythmische Wirkung von Ranolazin die gleiche Potenz. Auffällig war auch in dieser Versuchsreihe die unter Levosimendan lang anhaltende Dauer des Vorhofflimmerns, die durch Ranolazin nicht beeinflusst wurde. Es scheint, als wäre Levosimendan ein wichtiger Trigger zur Stabilisierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern. In dieser Arbeit wird deutlich, dass Ranolazin auf atrialer Ebene ein höheres antiarrhythmisches Potential beisitzt. Als Antiarrhythmikum zum gemeinsamen Einsatz mit Levosimendan ist es aufgrund der Ergebnisse dieser Studie nur bedingt einsetzbar, da ventrikuläre Rhythmusstörungen und auch das Vorhofflimmern nicht vollständig unterdrückt werden konnten. Es sollten weitere Versuche mit einem größeren Probenumfang zur kumulativen Gabe von Levosimendan und Ranolazin auf atrialer Ebene durchgeführt werden. Wie auch auf ventrikulärer Ebene wurde Dantrolen als potentiell antiarrhythmisches Medikament zur kumulativen Applikation mit Levosimendan am Vorhof getestet. In dieser Arbeit ist Dantrolen nicht in der Lage das durch Levosimendan verstärkt hervorgerufene Vorhofflimmern zu terminieren. Elektrophysiologische Grundlagen stellen die unter Dantrolen weiter verkürzte Aktionspotentialdauer und gering verlängerte Refraktärzeit dar. Die Infusion von Dantrolen führte weiterhin zu einer Verlängerung 99 der Leitungszeit. Geht man auf das Modell der Rotoren zur Entstehung von Vorhofflimmern ein, besitzt Dantrolen ein fast proarrhythmisches Potential. Die Verlängerung der Leitungszeit bedeutet eine Verminderung der Leitungsgeschwindigkeit. Die reduzierte Leitungsgeschwindigkeit führt zu einer Verminderung der Wellenlänge. Dies ermöglicht eine höhere Anzahl an Rotoren im Vorhof, was Vorhofflimmern auslösen kann. Dem steht eine, überproportional zu Leitungsgeschwindigkeit, verlängerte Refraktärzeit entgegen. Dantrolen führt, im Vergleich zu Levosimendan, insgesamt zu einer Reduktion der Flimmerepisoden. Unter Dantrolen entstehen jedoch mehr Arrhythmien als ohne Medikation. Die Verlängerung der Refraktärzeit ist nicht potent genug die verlängerte Leitungszeit auszugleichen und zudem die Wellenläng der Rotoren ausreichend zu vergrößern, um Vorhofflimmern zu verhindern. Dantrolen eignet sich daher nicht als Antiarrhythmikum zur kumulativen Applikation mit Levosimendan. Das proarrhythmische Potential von Levosimendan wurde in dieser Arbeit erfolgreich dargestellt. Die gewonnenen Ergebnisse sind aufgrund der anatomischen und elektrophysiologischen Parallelen zwischen dem Kaninchen und Menschen in Teilen auf das menschliche Herz übertragbar. Diese Studie soll die Menschen für die Risiken im Umgang und klinischen Einsatz mit Levosimendan sensibilisieren. Um Levosimendan auch in der Veterinärmedizin zu etablieren, sollten weitere Versuchsreihen z.B. an Hunden mit DCM und Pferden durchgeführt werden. Mögliche Therapieoptionen, wie der Einsatz von Ranolazin oder Dantrolen, wurden aufgezeigt, sind aber noch nicht ausgeschöpft. Das Mittel der Wahl zur Behandlung der unter Levosimendan auftretenden ventrikulären und atrialen Rhythmusstörungen ist noch nicht aufgezeigt, da weder Ranolazin noch Dantrolen die gewünschten Ergebnisse erzielen konnten. 100 5.3 Limitation der Studie Das Kaninchenherz eignet sich grundsätzlich sehr gut als Modell für das menschliche Herz. Hinsichtlich seiner Anatomie und Elektrophysiologie bestehen nur wenige Unterschiede. Das Aktionspotential des Kaninchens ähnelt dem des Menschen und weist ebenfalls, das in Phase 2 auftretende über 100 ms andauernde, Plateau auf. Andere Spezies wie die Maus verfügen über keine ausgeprägte Plateauphase [17,28]. Auch die Ionenströme der Herzmuskelzelle sind mit denen des Menschen vergleichbar [5]. Unterschiede werden hinsichtlich der myokardialen Verteilung und Expression von Ionenkanälen deutlich. Im menschlichen Myokard spielen die Ionenkanäle IKr+Ks eine wichtige Rolle im Bezug auf die Repolarisation. Im Kaninchenmyokard werden deutlich weniger IKs Kanäle exprimiert. Dadurch wird beim Kaninchen die Repolarisation hauptsächlich durch IKr beeinflusst [151]. Des Weiteren ist zu beachten, dass ausschließlich weibliche Kaninchen verwendet wurden. Das weibliche Geschlecht nimmt deutlichen Einfluss auf die Repolarisation. In der Tiermedizin bilden weibliche Kaninchen weniger IKr Ionenkanäle aus, was Repolarisationsstörungen begünstigt und die Tiere anfälliger für kardiologische Erkrankungen macht [29,30]. In der Humanmedizin hingegen sind Männer anfälliger für bestimmte Herzerkrankungen. Im Schnitt erkranken deutlich mehr Männer im Gegensatz zu Frauen an der chronischen Herzinsuffizienz [61]. Eine geringere Inzidenz für Frauen zeigt sich auch beim Vorhofflimmern [78]. Weitere limitierende Faktoren sind die ausschließliche Verwendung junger und gesunder Tiere, ohne kardiologische Veränderungen. Mit steigendem Lebensalter steigt auch das Risiko für kardiologische Erkrankungen. Mehr als zehn Prozent der über 80-jährigen erkranken an der chronischen Herzinsuffizienz [55,60]. Beim Vorhofflimmern sind die Zahlen ähnlich. Hier sind mehr als 20 % der über 80-jährigen betroffen [77]. Strukturelle Umbauprozesse innerhalb des Myokards sind Triggermechanismen zur Entstehung neuer Rhythmusstörungen. Ob Levosimendan im chronisch insuffizienten Herzen eine ähnlich proarrhythmische Wirkungsweise aufweist, wurde in dieser Studie nicht untersucht. Aussagen diesbezüglich können nicht getroffen werden. Die Größe des Kaninchenherzens ermöglichte die Platzierung acht monophasischer Aktionspotentiale, wovon lediglich ein MAP-Katheter endokardial lokalisiert war. Auf- 101 grund der reduzierten Platzverhältnisse und geringen endokardialen Ableitung ist die transmurale Dispersion kritisch zu bewerten. Die genaue Platzierung der MAPKatherter wurde manuell vorgenommen, was ein großes Fehlerpotential verursacht. Da die Platzierung ausschließlich von mir selbst vorgenommen wurde, ist das Fehlerpotential minimiert. Gleiches gilt für die manuelle Messung der QT-Intervalle zum Ende der Versuche. Die verwendeten Substanzen lagen in getrockneter Form vor und wurden vor jedem Versuch in der entsprechenden Konzentration hergestellt. Eventuelle Abweichungen beim Wiegeprozess und Verluste während des Herstellungsvorganges können nicht ausgeschlossen werden. Verluste wurden auf ein Minimum reduziert, um die Versuchsbedingungen so stabil wie möglich zu halten. Im Ganzherzmodell können Aussagen zur Aktionspotentialdauer, der Refraktärzeiten, der QT-Intervalle sowie der quantitativen und qualitativen Bestimmung von Arrhythmien getroffen werden. Molekulargenetische Mechanismen stehen nicht im Fokus der Untersuchung. Dies sollte Bestandteil weiterer experimenteller Versuche auf Zellebene sein. Zu beachten ist, dass die Ergebnisse unter Verwendung von Ranolazin und Dantrolen nur in Kombination mit Levosimendan zu interpretieren sind. Aufgrund der kumulativen Infusion sind keine Aussagen über die alleinige Wirkung von Ranolazin oder Dantrolen möglich. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der eingeschränkte Probenumfang pro Versuchsreihe. Je größer die untersuchte Probenanzahl, desto aussagekräftiger ist die statistische Auswertung. Es wurde darauf geachtet, pro Versuchsreihe mindestens zehn statistisch auswertbare Versuche zu erfassen. In dieser Studie wurde eine durchschnittliche Anzahl von 12 Kaninchen pro Versuchsreihe verwendet. 102 5.4 Ein Ausblick Diese Arbeit legt den Grundstein für weitere Versuche zur Arrhythmogenese von Levosimendan. Ein signifikant proarrhythmisches Potential konnte in dieser experimentellen Studie erfolgreich nachgewiesen werden. Besonders Vorhofflimmern wurde provoziert. Die Ergebnisse entstanden durch elektrophysiologische Untersuchungen auf Organebene. Genaue Studien zu den grundlegenden molekularen Pathomechanismen sollten folgen. Die Untersuchung von Levosimendan wurde ausschließlich an gesunden Kaninchenherzen durchgeführt. Interessant wäre, ob die ermittelten Ergebnisse auch an chronisch insuffizienten Herzpatienten bestätigt werden können. Die chronische Herzinsuffizienz bezeichnet das klinische Einsatzgebiet von Levosimendan und die gewonnenen Resultate sind nicht ohne weitere Untersuchungen übertragbar. Die Untersuchung eventueller protektiver Therapieoptionen war wenig befriedigend. Dantrolen eignet sich in diesem Modell nicht als Antiarrhythmikum. Ranolazin bewirkt hauptsächlich auf atrialer Ebene eine zufriedenstellende antiarrhythmische Wirkung. Eine Verlängerung des QT-Intervalls sowie der Refraktärzeit wurden auch in der vorliegenden Studie als protektive Mechanismen, zur Minimierung von Rhythmusstörungen, nachgewiesen. Weitere Studien mit Antiarrhythmika der Klasse I und III, welche sich diesen Mechanismen bedienen, sollten durchgeführt werden. Ebenso wären Versuche zu Ranolazin und anderen Multi-Kanal-Inhibitoren, mit einem größeren Probenumfang, denkbar. Neben dem kardiologischen Einsatzgebiet wird an der Verwendung von Levosimendan in neuen medizinischen Sektoren geforscht. Die Charité in Berlin führt derzeit, in Kooperation mit anderen Unikliniken, wie zum Beispiel der medizinischen Hoch-schule Hannover (MHH), Studien zur Anwendung von Levosimendan bei Patienten mit Amyothropher Lateralsklerose (ALS) durch. ALS ist eine nicht heilbare degenerative Erkrankung des motorischen Nervensystems. Im klinischen Verlauf der ALS kommt es zu verschieden Symptomen, die mit Veränderungen der Muskulatur einhergehen. Die Atemmuskulatur ist dabei besonders betroffen. Neben spastischen Lähmungen kommt es zu Paresen und Muskelatrophie. In vorangegangen Medikamentenstudien der Charité (LEVALS-Studie) wurde an einer kleinen Patientengruppe 103 die Verträglichkeit von Levosimendan nachgewiesen. Es zeigten sich positive Effekte auf die Atemmuskulatur. Levosimendan führt, über die Aktivierung des Troponin C, zu einer Leistungssteigerung der Muskulatur. Der positive Effekt auf die Muskelarbeit wird von der antiinflammatorischen Wirkung von Levosimendan unterstützt. Man erhofft sich, dass dadurch bei ALS vorkommende Proteinaggregationen vermieden werden. Die laufende Studie vergleicht an ALS Patienten den Einsatz von Levosimendan versus Placebo. Abschließende Ergebnisse werden Ende 2017 erwartet [152]. Die Ergebnisse sind aufgrund der anatomischen und elektrophysiologischen kardialen Gemeinsamkeiten zwischen dem Menschen und dem Kaninchen auf die Humanmedizin übertragbar. Diese Arbeit soll auch für die Veterinärmedizin einen Beitrag leisten. Die gewonnenen Ergebnisse können in der Kleintiermedizin genutzt werden. Das Kaninchen rückt immer weiter in den Fokus der Kleintiermedizin. Aufgrund des steigenden Altersdurchschnitts werden bei Kaninchen häufiger kardiologische Erkrankungen diagnostiziert. Bisher sind nur wenige Medikamente für den Einsatz beim Kaninchen und anderen Nagetieren zugelassen. Levosimendan könnte, nach weiteren Studien zu möglichen antiarrhythmischen Therapieoptionen, in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Ein denkbares Einsatzgebiet könnte zudem die Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie beim Hund darstellen. Die positiv inotropen und zusätzlich vasodilatatorischen Effekte von Levosimendan stehen bei der Behandlung der DCM im Vordergrund. Zum unbedenklichen Einsatz bei Hunden sollten Versuche sowohl an gesunden als auch insuffizienten caninen Herzen erfolgen. 104 6 Zusammenfassung Kohnke Anja: Experimentelle Untersuchung zur proarrhythmischen Wirkung des KalziumSensitizers Levosimendan sowie möglicher protektiver Therapieoptionen Hintergrund und Zielsetzung: Vorhofflimmern stellt sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin eine der klinisch am häufigsten auftretenden Rhythmusstörungen dar. Levosimendan als Medikament zur Behandlung der akut dekompensierten chronischen Herzinsuffizient wird in klinischen humanmedizinischen Studien mit der Entstehung von Rhythmusstörungen und vorrangig Vorhofflimmern in Verbindung gebracht. Zum Nachweis des proarrhythmischen Potentials fehlen bisher grundlegende elektrophysiologische Studien. Ziel dieser Arbeit ist, die proarrhythmische Wirkung von Levosimendan auf ventrikulärer und atrialer Ebene aufzuzeigen und ursächliche elektrophysiologische Mechanismen darzustellen. Des Weiteren soll der zusätzliche Einsatz von potentiell antiarrhythmischen Substanzen wie Ranolazin oder Dantrolen eventuelle protektive Therapieoptionen zur Verminderung der Rhythmusstörungen darlegen. Methoden und Ergebnisse: Ventrikelversuche Zur Untersuchung wurden weibliche, herzgesunde Kaninchen der Rasse weiße Neuseeländer verwendet. Nach der Entnahme der Herzen fand eine, den physiologischen Bedingungen nachempfundene, retrograde Perfusion der Organe durch die Langendorff-Apparatur statt. Über acht epi- und endokardial platzierte MAP-Katheter konnten ventrikuläre, monophasische Aktionspotentiale abgleitet und später ausgewertet werden. Nach Herstellung eines AV-Blockes fand eine Stimulation in absteigenden Zykluslängen von 900 ms bis 300 ms statt. Ausgewertet wurden die APD90, die Refraktärzeit, das QT-Intervall sowie die Dispersion der Repolarisation. Die Infu- 105 sion von Levosimendan (1 µmol/l) führte zu einer signifikanten Verkürzung der Aktionspotentialdauer, der Refraktärzeit und des QT-Intervalls. Häufig auftretende Rhythmusstörungen wie ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern konnten über den kumulativen Einsatz von Ranolazin nur bedingt, durch Dantrolen gar nicht minimiert werden. Vorhofversuche Die atrialen Katheter wurden mittels Klammern auf Höhe der Vorhöfe platziert. Die Stimulation erfolgte bei einer Zykluslänge von 350 ms, 250 ms und 150 ms. Die Infusion von Levosimendan (0,5 µmol/l) führte zu einer signifikanten Verkürzung der aAPD90 und der Refraktärzeit. Zudem steigerte Levosimendan das Auftreten von Vorhofflimmern deutlich. Das Vorhofflimmern konnte häufig nur durch Defibrillation terminiert werden. Dantrolen konnte auch auf Vorhofebene die entstehenden Rhythmusstörungen nicht minimieren. Ranolazin zeigte eine atrial selektive antiarrhythmische Wirkung. Schlussfolgerung Levosimendan provoziert sowohl auf ventrikulärer als auch auf atrialer Ebene Rhythmusstörungen wie ventrikuläre Tachykardien, Vorhof- und Kammerflimmern. Die proarrhythmische Wirkung von Levosimendan konnte in dieser Arbeit eindeutig aufgezeigt werden und basiert elektrophysiologisch auf einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer, der Refraktärzeit und des QT-Intervalls. Dantrolen konnte als mögliche protektive Therapieoption ausgeschlossen werden. Ranolazin hingegen eignet sich aufgrund der atrialen Selektivität zur Reduktion von Vorhofflimmern, jedoch nicht von ventrikulären Arrhythmien. 106 7 Summary Kohnke, Anja Experimental analysis of the proarrhythmic effect of the calcium sensitizer levosimendan as well as protective treatment options Background and objectives: In human medicine as well as in veterinary medicine atrial fibrillation is the most frequent arrhythmia seen in clinical practice. Levosimendan which is administered for the treatment of acute decompensated severe chronic heart failure is often linked with rhythm disturbances, mainly atrial fibrillation in clinical studies. Basic electrophysiological studies on potential proarrhythmic mechanismare not available yet. The aim of the present study is to demonstrate the atrial and ventricular pro-arrhythmic side-effects of levosimendan and the underlying fundamental electrophysiological mechanisms. Furthermore protective treatment options shall be exposed by using potential anti- arrhythmic drugs like ranolazine or dantrolene. Methods and results: Ventricular experiments Hearts of healthy female New Zealand-rabbits were used for the examination. After isolating the heart it was retrograde perfused by use of a Langendorff apparatus to mimic natural conditions. With the help of eight MAP pacing catheters which were positioned epi- and endocardial, ventricular monophasic action potentials could be identified and analyzed. The mechanic induction of an atrioventricular block was followed by the stimulation of the heart in decreasing cycle lengths between 900ms and 300ms. Action potential duration, effective refractory period, QT interval and dispersion of repolarization were analyzed. The infusion of levosimendan (1 µmol/l) resulted in a significant decrease of action potential duration, decrease of the effective refractory period and reduction of the QT interval. Often appearing arrhythmias such as 107 ventricular tachycardia and ventricular fibrillation, could partly be limited by ranolazine but not by dantrolene. Atrial experiments The atrial experimental set up was similar to the ventricular experiment. The monophasic action potential catheters were placed on the atria with the help of clips. The heart was stimulated in cycle lengths of 350 ms, 250 ms and 150 ms. The infusion of levosimendan (0,5 µmol/l) resulted in a significant decrease of atrial action potential duration and reduction of the effective refractory period. Furthermore the appearance of atrial fibrillation was increased by levosimendan. In many cases the induced atrial fibrillation could only be terminated by multiple external defibrillations. Atrial arrhythmia could not be minimized by dantrolene either. Ranolazine showed an atrial selective antiarrhythmic effect. Conclusion: Different types of arrhythmias were provoked by levosimendan. In this study the pro arrhythmic effects of levosimendan could be pointed out. These are based on the fundamental electrophysiological mechanisms which are the abbreviation of action potential duration, effective refractory period and QT interval. Dantrolene could be eliminated as a possible protective treatment option. Ranolazine presented an atrial selectivity and could be used to terminate atrial fibrillation. However did not reduce ventricular arrhythmias. 108 Literaturverzeichnis [1] Heimtierstudie „Wirtschaftsfaktor Heimtierhaltung“, Zur wirtschaftlichen Bedeutung der Heimtierhaltung in Deutschland, Seite 1, (www. economics.uni- goettingen.de/Ohr), Prof. Dr. Renate Ohr, November 2014, Universität Göttingen (www. uni-goettingen.de) [2] Zipes DP, Wellens HJJ.: Sudden cardiac death. Circulation 1998; 98: 2334-51. [3] Westling J, Westling W, Pyle RL: Epidemiology of atrial fibrillation in the dog. Intern J Appl Res Vet Med 2008; 6(3): 151-154. [4] Hasenfuss G.: Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 1998; 39(1): 60-76. [5] Eckardt L, Haverkamp W, Borggrefe M, Breithardt G: Experimental models of torsade de pointes. Cardiovasc Res. 1998; 39: 178-193. [6] König HE, Ruberte J, Liebich H-G: Kammersystem des Herzens. In: König HE Liebich H-G. 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Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 68 Abbildung 23: Mittlere QT-Zeiten - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 69 Abbildung 24: Mittlere Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 69 Abbildung 25: Mittlere Refraktärzeit S3 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 70 Abbildung 26: Gesamtzahl an ventrikulären Rhythmusstörungen Vergleich Levosimendan versus Ranolazin .............................................................. 71 Abbildung 27: Mittlere Aktionspotentialdauer - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 73 Abbildung 28: Mittlere QT-Zeiten - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 73 Abbildung 29: Dispersion der Repolarisation - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 74 Abbildung 30: Mittlere Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 74 Abbildung 31: Mittlere Refraktärzeit S3 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 75 Abbildung 32: Gesamtzahl an ventrikulären Rhythmusstörungen Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .............................................................. 76 Abbildung 33: Mittlere atriale Aktionspotentialdauer unter alleiniger Verwendung von Levosimendan ................................................................................................... 78 Abbildung 34: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 unter alleiniger Verwendung von Levosimendan ................................................................................................... 78 Abbildung 35: Gesamtzahl an Vorhofflimmern unter alleiniger Verwendung von Levosimendan ................................................................................................... 80 Abbildung 36: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms unter alleiniger Verwendung von Levosimendan ................................................................................................... 80 126 Abbildung 37: Unter Levosimendan auftretendes lang anhaltendes Vorhofflimmern Vergleich monophasische Aktionspotentiale (oben) und EKG (unten) ..................... 81 Abbildung 38: Mittlere atriale Aktionspotentialdauer - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin ...................................................................................................... 83 Abbildung 39: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 83 Abbildung 40: Gesamtzahl an Vorhofflimmern - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin.................................................................................................................. 85 Abbildung 41: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms - Vergleich Levosimendan versus Ranolazin ...................................................................................................... 85 Abbildung 42: MIttlere atriale Aktionspotentialdauer – Vergleich Levosimendan versus Dantrolen ...................................................................................................... 87 Abbildung 43: Mittlere atriale Refraktärzeit S2 - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 87 Abbildung 44: Gesamtzahl an Vorhofflimmern - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen .................................................................................................................. 89 Abbildung 45: Anzahl an Vorhofflimmern >1000 ms - Vergleich Levosimendan versus Dantrolen ...................................................................................................... 89 127 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: NYHA-Klassifizierung bei Herzinsuffizienz nach [60] 14 Tabelle 2: Übersicht zum bisherigen Erkenntnisstand zu Levosimendan 29 Tabelle 3: Zusammensetzung Krebs-Henseleit-Lösung 41 Tabelle 4: Erläuterung zur Positionierung der MAP-Katheter 45 128 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ALS Amyothrophe Lateralsklerose aAPD atriale Aktionspotentialdauer APD Aktionspotentialdauer APD50,70,90 APD bis zur Repolarisation von 50 %,70 %,90 % ATP Adenosintriphosphat AV-Knoten Atrioventrikular Knoten AV-Block Blockade des Atrioventrikularknotens AV-Region Sitz des Atrioventrikular Knotens BIP Bruttoinlandsprodukt BVR beat to beat Variabilität der Repolarisationsdauer bzw. Beziehungsweise C Celsius CaCl2 Calciumchlorid cm/s Zentimeter pro Sekunde CX40 Connexion 40 DAD delayed afterdepolarizations DCM dilataive Kardiomyopathie DMSO Dimethylsulfoxid EAD early afterdepolarizations et al. et alii EKG Elektrokardiogramm g Gramm 129 HERG Human-ether-a-go-go-related gene Hg Quecksilber HPLC Hochleistungschromatographie HR High Rate Hrsg. Herausgeber HWZ Halbwertszeit Hz Hertz H20 Wasser ICa-L Kalziumstrom durch Kanäle vom L-Typ ICa-T Kalziumstrom durch Kanäle vom T-Typ ICa(Cl) kalziumaktivierte Chloridkanäle I.E. Internationale Einheiten If Funny Channel IK einwärtsgerichteter Kaliumstrom IKr schnelle Komponente des Kaliumstroms (rapid) IKs langsame Komponente des Kaliumstroms (slow) IK1 Strom zur Aufrechterhaltung des Membranpotentials IKACH spezifischer Ionenkanäl IKATP spezifischer Ionenkanal IKur Kaliumstrom INa Natriumstrom Ito transienter Auswärtsstrom Ito2 Chloridstrom JNL Jervell und Lange-Nielsen 130 KCL Kaliumchlorid Kg Kilogramm KHK koronare Herzkrankheit KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat L Liter L-Typ long lasting Typ LQTS langes QT-Syndrom mA Milliampere MAP monophasiches Aktionspotential max Maximum mg Milligramm MgSO4 Magnesiumsulfat Min Minute min Minimum ml Milliliter mm Millimeter mmHg Millimeter Quecksilbersäule mmol Millimol mmol/l Millimol pro Liter ms Millisekunde mV Millivolt M-Zellen midmyokardiale Zellen Na Natrium NaCl isotonische Natriumchlorid-Lösung 131 NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat NaOH Natriumhydroxyd NCX Natrium-Kalzium-Austauscher NMS Neuroleptic malignand Syndrom NYHA New York Heart Association pCO2 Kohlendioxydpartialdruck pH-Wert negativ dekadischer Logarithmus der HCO3 Ionenkonzentration PTH Plötzlicher Herztod RyR2 Kalziumkanal im sarkoplasmatischen Retikulum des Herzens SCD sudden cardiac death SR sarkoplasmatisches Retikulum SQTS kurzes QT-Syndrom TdP Torsade-de-Pointes u.a. und andere µM mikromolar µmol/l Mikromol pro Liter % Prozent vs. versus ZTE Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung 132 Danksagung Zuerst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Lars Eckardt für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe und für die Möglichkeit zur Promotion am Universitätsklinikum in Münster bedanken. Ein weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. med. vet. Fehr als veterinärmedizinischer Betreuer dieser Dissertation. Besonders für die kompetente und unmittelbare Beantwortung von fachlichen und bürokratischen Fragestellungen stand Herr Prof. Fehr jederzeit zur Verfügung. Die Zusammenarbeit zwischen der Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover und des Universitätsklinikums Münster verlief ohne Probleme. Der größte Dank geht an meinen Betreuer Priv.-Doz. Dr. Gerrit Frommeyer für die Bereitstellung meines Themas und die freundliche Zusammenarbeit. Zur schnellen und umfassenden Unterstützung zur Erarbeitung von Problemlösungen und mit seinem außergewöhnlichen Engagement stand Herr Frommeyer jederzeit an meiner Seite. Bedanken möchte ich mich auch bei der gesamten AG, im Besonderen bei Julius Krawczyk zur Einarbeitung im Labor. Ein weiterer Dank geht an meine Kollegin Dr. med. vet Magdalena Sterneberg für die Vermittlung dieser Dissertation und die freundschaftliche Unterstützung bei jeglichen Fragestellungen. Meiner Arbeitgeberin Dr. med. vet Wilma Lindhaus möchte ich für den beruflichen Einstieg und die gleichzeitige Unterstützung zur Anfertigung dieser Dissertation danken. Ganz herzlich möchte ich mich auch bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken die mich in jeder Lebenssituation unterstützten und immer die richtigen aufmunternden und motivierenden Worte fanden. Ein ganz spezieller Dank geht an meinen Freund, der während dieser Zeit viel zurückstecken musste, mich mit seinem technischen Verständnis und kritischen Blick auf die Dissertation unterstützt und mir neue Kraft gegeben hat.