ketogenese - Ruhr-Universität Bochum
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63 KETOGENESE A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN KETOGENESE IN ABHÄNGIGKEIT VOM STOFFWECHSELZUSTAND Unter Ketogenese versteht man einen Stoffwechselzustand, bei dem aus Acetyl-CoA Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure in der Leber gebildet und an das Blut abgegeben werden. Diese beiden Säuren werden als Ketonkörper bezeichnet, zu denen außerdem Aceton gezählt wird, das durch spontane Decarboxylierung der Acetessigsäure entsteht. Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure werden über das Blut zu den peripheren Geweben transportiert, wo sie aufgenommen und über den Zitronensäurezyklus oxidiert werden. Die Konzentration der Ketonkörper im Blut beträgt normalerweise 80 - 200 µmol/l. Im Hunger (48 Std.) steigt der Ketonkörperspiegel als Folge erhöhten Abbaus von freien Fettsäuren auf Werte von 600 - 2200 µmol/l an (davon sind 15% Acetessigsäure und 85% ß-Hydroxybuttersäure). Das Gehirn kann - im Gegensatz zum Muskel - seinen Energiebedarf nicht durch Abbau von Fettsäuren decken, es fehlt diesem Organ die "langkettige" 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase. Im Verlauf einer Hungerperiode deckt das Gehirn daher seinen Energiebedarf zu einem immer größer werdenden Anteil aus der Oxidation der Ketonkörper (Abb. 1). Durch erhöhte Ketogenese in diesem Stoffwechselzustand (physiologische Ketose) kann der gesteigerte Bedarf des Gehirns an Ketonkörpern gedeckt werden. Abb. 1 Energiequellen von Muskel und Gehirn in verschiedenen Stoffwechselsituationen Stoffwechselzustand zur Deckung des Energiebedarfs aufgenommene Substanzen Muskel Gehirn Nahrungsresorption aus Magen/Darm Glucose 50% Fettsäure 50% Glucose Hunger Fettsäuren (Ketonkörper) Ketonkörper 40 % Glucose 60 % 64 ROLLE DES CARNITINS, ß-OXIDATION UND HYDROXYMETHYLGLUTARYL-COA-ZYKLUS Im Hunger werden aus Fettgewebe vermehrt Fettsäuren mobilisiert. Fettsäuren werden über das Blut zur Leber transportiert. Die Enzyme der ß-Oxidation der Fettsäuren zu Acetyl-CoA und der Acetessigsäurebildung aus Acetyl-CoA über den Hydroxymethylglutaryl-CoA-Zyklus sind in der Matrix der Mitochondrien lokalisiert. Die Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA durch die Acyl-CoA-Synthetase (Thiokinase) erfolgt an den äußeren Mitochondrienmembranen (Abb. 3). Langkettige Acyl-CoA-Derivate, z.B. Palmityl-CoA, können nur dann in die Matrix der Mitochondrien gelangen, wenn Carnitin (3Hydroxy-4-(trimethylamino)-Buttersäure) als Carrier für Fettsäurereste zur Verfügung steht. Carnitin stimuliert die Oxidation der langkettigen Fettsäuren, da die Aktivität der CarnitinPalmityltransferase (Abb. 2) erhöht wird, die die Übertragung des Acylrestes von Coenzym A auf die OH-Gruppe des Carnitins katalysiert. Abb. 2 Funktion der Carnitin-Palmityltransferase In Mitochondrien gibt es eine "äußere" und eine "innere" Acyltransferase. Die "äußere" Acyltransferase überträgt im Raum zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran Acylreste von Acyl-CoA-Estern auf Carnitin. Die "innere" Acyltransferase katalysiert die umgekehrte Reaktion an der inneren Mitochondrienmembran (Abb. 3). 65 Abb. 3 Aktivierung der Fettsäuren und Transport des Acyl-CoA in die Matrix der Mitochondrien Aktivierte Fettsäuren (Acyl-CoA-Thiolester) werden durch sukzessive Abspaltung von AcetylCoA-Molekülen (ß-Oxidation) abgebaut. Z.B. entstehen aus einem Molekül Palmityl-CoA nach siebenmaligem Durchlauf des ß-Oxidationszyklus acht Moleküle Acetyl-CoA. Aufgrund eines gesteigerten Abbaus von Fettsäuren entsteht vermehrt aktivierte Essigsäure. In der Leber kann aktivierte Essigsäure zu 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) umgesetzt werden, woraus freie Acetessigsäure abgespalten werden kann. Aus zwei Molekülen Acetyl-CoA entsteht Acetoacetyl-CoA (Enzym: Acetoacetyl-CoA-Thiolase). Diese aktivierte Acetessigsäure kondensiert mit einem dritten Molekül Acetyl-CoA zu HMG-CoA (Enzym: HMG-CoA-Synthase). HMG-CoA-Lyase spaltet HMG-CoA in freie Acetessigsäure und Acetyl-CoA. In der Bilanz werden also zwei Moleküle Acetyl-CoA zu einem Molekül Acetessigsäure und zwei Moleküle freiem Coenzym A umgewandelt. Freies Coenzym A steht zur Aktivierung von Fettsäuren zur Verfügung. Bilanz des HMG-CoA-Zyklus: Acetyl-CoA + Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA + CoASH Acetoacetyl-CoA + Acetyl-CoA HMG-CoA + CoASH Hydroxymet hylglutary l CoA Acetessigs äure Acetyl - CoA Acetyl - CoA Acetyl - CoA Acetessigs äure 2 CoASH 66 TRANSPORT DER KETONKÖRPER UND OXIDATION IM PERIPHEREN GEWEBE In der Leber wird Acetessigsäure durch ß-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase zum größten Teil zu ß-Hydroxybuttersäure reduziert: Acetessigsäure + NADH + H+ ß-Hydroxybuttersäure + NAD+ Beide Ketonkörper gelangen in das Blut und so zum peripheren Gewebe (Abb. 4). Abb. 4 Übersicht: Bildung, Transport und Abbau der Ketonkörper Leber Blut FS FS Peripherie Oxidation Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA -Hydroxybuttersäure Acetessigsäure -Hydroxybuttersäure Acetessigsäure -Hydroxybuttersäure Acetessigsäure Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA Im peripheren Gewebe wird ß-Hydroxybuttersäure zu Acetessigsäure reoxidiert und durch die Succinyl-CoA-Acetoacetyltransferase (Thiophorase) zu Acetoacetyl-CoA aktiviert: Succinyl-CoA + Acetessigsäure Succinat + Acetoacetyl-CoA Acetoacetyl-CoA wird durch die C4-spezifische Acetoacetyl-CoA-Thiolase ("kurzkettige" Thiolase) zu Acetyl-CoA gespalten, das über den Citronensäure-Zyklus vollständig oxidiert wird: Acetoacetyl-CoA + CoASH 2 Acetyl-CoA PHYSIOLOGISCHE UND PATHOLOGISCHE KETOSEN Im Hunger ist infolge einer gesteigerten Mobilisation der Fettsäuren aus dem peripheren Fettgewebe der Fettsäurespiegel im Blut erhöht. Daraus folgt ein erhöhter Einstrom der Fettsäuren in die Leber und eine Beschleunigung der ß-Oxidation. Die Aktivität der CarnitinPalmityltransferase ist im Hunger ebenfalls erhöht. Durch eine gesteigerte ß-Oxidation wird vermehrt Acetyl-CoA bereitgestellt, eine Voraussetzung für die erhöhte Ketogeneserate. Einige Aminosäuren können direkt zu Acetessigsäure abgebaut werden. 67 Andere Faktoren, von denen man annimmt, dass sie im Hunger in der Leber zu erhöhtem intrazellulären Acetyl-CoA-Spiegel führen, sind verminderte Lipogenese und Hemmung der Endoxidation des Acetyl-CoA (Hemmung der Citratsynthese). Von der Hungerketose (physiologische Ketose) abzugrenzen ist die pathologische Ketose. Dieser Stoffwechselzustand ist ein Symptom des Krankheitsbildes des dekompensierten Diabetes mellitus und ist charakterisiert durch eine stark gesteigerte Ketogenese bei gleichzeitig hohem Blutzuckerspiegel. ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN Fettsäuren, Fette; Fettsäurebiosynthese und -abbau; Triacylglycerinbiosynthese und Lipolyse; Wirkung von Hormonen auf den Stoffwechsel des Fettgewebes; Ketonkörpersynthese und Verwertung; Fettverdauung und -resorption; Blutlipide, Hyperlipoproteinämien; Regulation des Fettstoffwechsels im Hunger; Phosphatide und Phosphatidbiosynthese; Cholesterin und Cholesterinbiosynthese. 68 B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE Isolierte Lebermitochondrien sind zur ß-Oxidation von Fettsäuren zu Acetyl-CoA und nachfolgender Ketonkörperbildung fähig. Der Einfluss folgender Faktoren auf die Ketogeneserate soll untersucht werden: a) Exogen zugesetzte Palmitinsäure; b) Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA; c) Transport des Acyl-CoA in die Matrix der Mitochondrien; d) Aktivität des Citronensäure-Zyklus. Dazu werden die Lebermitochondrien bei 37°C unter Luft inkubiert und nach Reaktionsstopp wird die gebildete Acetessigsäure als Parameter für die Ketogenese in einem Farbtest bestimmt. (Acetessigsäure reagiert mit diazotiertem p-Nitroanilin (p-Nitrophenyldiazoniumchlorid) unter Bildung von N, N-bis-(p-nitrophenyl)-C-acetylformazan). Die Konzentration dieses Farbstoffes ist der Acetessigsäurekonzentration äquivalent. 69 C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL Mitbringliste: Kittel, Taschenrechner KETOGENESE IN ABHÄNGIGKEIT VOM STOFFWECHSELZUSTAND Lösungen (stehen am Arbeitsplatz) 1. Standard-Medium (pH 7.5) 50 mM Saccharose 17,115 g 5 mM MgCl2 · 6 H2O 1,016 g 2 mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,744 g 15 mM KCl 1,118 g 10 mM NaF 0,419 g 50 mM Tris (hydroxymethylaminomethan) 6,05 g Die angegebenen Mengen in ca. 800 ml Wasser lösen, mit konz. HCl am pH-Meter auf pH 7.5 einstellen und ad 1 l auffüllen. (NaF hemmt ein in den Mitochondrien vorhandenes GTP-abhängiges, fettsäureaktivierendes System.) 2. 10 mM Palmitinsäure 128 mg Palmitinsäure in 50 ml Ethanol lösen 3. 0,1 M D, L-Carnitin 988,3 mg D, L-Carnitin-Hydrochlorid in ca. 40ml lösen, mit 1 N KOH auf pH 7.5 bringen und ad 50 ml auffüllen (Messkolben). 4. 0,1 M ATP 551,15 mg Adenosin-5'-triphosphorsäure-Dinatriumsalz in 8ml H2O lösen, mit 1N KOH auf pH 7.5 bringen und auf 10ml auffüllen. 5. 0,1 M L-Malat 6. Trichloressigsäure (TCA) (30%, Gew./Vol.) 7. 0,5% Natriumnitrit (0,5 g/100 ml H2O; täglich neu ansetzen) 8. 0,05% p-Nitroanilin (giftig) (0,05 g in 100 ml (0,05N) HCl-Lösung durch Erhitzen im Wasserbad) 70 9. 0,2 M Na-Acetat: 2,72 g Natriumacetat/100 ml H2O. 10. Mischung des Diazo-Reagenzes: 6 ml 0,5% NaNO2 und 40 ml 0,05% p-Nitroanilin Hierbei tritt infolge Diazotierung des Nitroanilins eine Entfärbung ein. Diese abwarten, dann die Mischung in Eis stellen, 14ml 0,2M Na-Acetat dazugeben und im Eis stehen lassen. Das fertige Diazo-Reagenz wird während des Versuchs vom Assistenten ausgegeben. 11. 1 M Na-Acetat: 13,6g Natriumacetat/100 ml H2O 12. 5 N HCl 13. Mitochondriensuspension Alle unter I aufgeführten Reagenzien stehen fertig vorbereitet am Arbeitsplatz. Auf jeden Fall werden das Diazo-Reagenz, das Medium, HCl und der Essigsäureethylester mit der 5ml Kolbenhubpipette (grün) pipettiert. 71 HERSTELLUNG DER REAKTIONSANSÄTZE 1. In sieben 50 ml Erlenmeyerkolben werden folgende Reagenzien pipettiert (6 Reaktionsansätze und ein Null-Referenzansatz): PIPETTIERPLAN: Erlenmeyerkolben Nr. 1 2 3 4 5 6 Null- Ref. ml Medium (pH 7.5) 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 ml Palmitinsäure 0,05 - 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 ml ATP 0,05 0,05 - 0,05 0,05 0,05 0,05 ml D,L-Carnitin 0,05 0,05 0,05 - 0,05 0,05 0,05 ml L-Malat (0,1 M) - - - - 0,05 - - ml L-Malat (0,02 M) - - - - - 0,05 - ml Wasser 0,35 0,40 0,40 0,40 0,30 0,30 0,35 ml Lebermitochondrien 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 - Achtung: Die Mitochondriensuspension soll vor der Verteilung in die einzelnen Reaktionsansätze kurz geschwenkt werden (vorsichtig über Kopf drehen). Die Mitochondrien werden als letztes in die Erlenmeyerkolben gegeben (Reaktionsstart). Nach Beschickung der einzelnen Reaktionsansätze werden diese mit Parafilm verschlossen, mit der jeweiligen Gruppennummer beschriftet, in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmt und 60 Min. unter Schütteln inkubiert. 2. Während der Inkubation sollen folgende Arbeiten durchgeführt werden: Es werden 8 x 2 Eppendorfgefäße (2ml Plastikzentrifugenröhrchen mit Schnappdeckel) beschriftet: Je ein Paar für die Reaktionsansätze 1-6, ein Paar für die Null-Referenz (NR) und das letzte Paar für einen Reagenzienleerwert (RL). Jedes Röhrchen wird mit 0,1 ml 30% TCA beschickt. 3. Behandlung der Reaktionsansätze 72 Die Bildung der Acetessigsäure wird nach 60 Min. in den einzelnen Reaktionsansätzen durch Zugabe von Trichloressigsäure gestoppt (TCA-Fällung). - Von den Ansätzen 1 - 6 wird je 1ml aus den Erlenmeyerkolben in die beiden vorbereiteten Eppendorfgefäße zu der TCA gegeben (Doppelbestimmung Beschriftung mit 1, 1a, 2, 2a, 3, 3a ….) und diese dann sofort auf Eis gestellt (sonst besteht die Gefahr der spontanen, (Decarboxylierung der Acetessigsäure). - In den Erlenmeyererkolben des Null-Referenzansatzes wird 1 ml Mitochondriensuspension pipettiert, gemischt und sofort je 1ml in die beiden Eppendorfgefäße zu der TCA gegeben (Weiterbehandlung wie Ansätze 1 - 6). - In die beiden Eppendorfgefäße des Reagenzienleerwerts (Eigenfärbung des Farbreagenzes) kommen zu der TCA je 1 ml Medium (Weiterbehandlung wie Ansätze 1 6). Die Proben bleiben (zur Fällung des Proteins im Ansatz) 10 Min. auf Eis stehen. Die gestoppten Reaktionsansätze - alle in Eppendorfgefäßen - werden dann 5 Min. in der Tischzentrifuge zentrifugiert. In den Überständen wird die gebildete Menge an Acetessigsäure bestimmt. Dazu werden 500µl jeweils in die vorbereiteten und beschrifteten Reagenzgläser (Farbtest unter 4.) überführt. 4. Bestimmung der Acetessigsäure durch einen Farbtest - 16 Ansätze (je zwei Reagenzgläser für Proben 1 - 6, die Null-Referenz und den Reagenzienleerwert) 1 M Na-Acetat 0,5 ml Überstand der jeweiligen 0,5 ml Probe nach der TCA-Fällung Diazo-Reagenz (Handschuhe!) 3,0 ml UNTER DEM ABZUG ARBEITEN! - Die Ansätze werden gemischt und 10 Min. bei 37 °C im Wasserbad geschüttelt. Der Rest des Überstandes wird im Eisbad aufbewahrt. - Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 5M HCl gestoppt; anschließend wird der gebildete Farbstoff mit 2,5 ml Essigsäureäthylester (Vorsicht, feuergefährlich!) ausgeschüttelt (hierbei wird der Farbstoff aus der wässrigen in die obere organische 73 Phase extrahiert): Dazu werden die zwei Phasen in den Ansätzen mit einer Plastikpasteurpipette durch Aufsaugen und Ausspülen gründlich vermischt, bis die wässrige Phase völlig entfärbt ist. Nach Trennung der beiden Phasen (ca. 1 Min.) wird ein Teil des den Farbstoff enthaltenden Essigsäureethylesters (obere Phase) vorsichtig mit einer Pasteurpipette in eine Küvette überführt und die Extinktion bei 420nm gemessen. Eichung des Photometers gegen den Reagenzienleerwert. Für die Eichung und alle Messungen wird immer dieselbe Küvette verwendet. Die Ansätze werden nach ihrer Färbung sortiert und beginnend mit der schwächsten Färbung gemessen. Jede Probe wird doppelbestimmt. 74 D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION Es soll berechnet werden, wie viel µmol Acetessigsäure von den Mitochondrien aus 1g Leber gebildet werden (µmol · h-1 · g Leber-1). : Extinktionskoeffizient des N, N’-bis-(p-Nitrophenyl)-C-acetyl-formazan ist 420 = 21,4 · 103 (l · mol-1 · cm-1) Die Extinktion des Reagenzienleerwerts wird gleich Null gesetzt (Eichung mit diesem Wert, somit wird hier die Eigenfärbung des Diazo-Reagenzes berücksichtigt). Mit Hilfe der NullReferenz lässt sich abschätzen, wie viel endogenes Acetoacetat (oder andere Substanzen, die mit dem Diazo-Reagenz umsetzbar sind) in den Reaktionsansätzen vorhanden war. Die Menge Acetessigsäure, die in 1h von den Mitochondrien aus 1g Leber gebildet wurde, berechnet sich wie folgt: Konzentration in der Küvette Verdünnungs faktor der TCA-Fällung eingesetzte Lebermenge V VTCA VReakt K Mito 1 μmol nk atal E 420 bzw. VEss Fäll VFäll VFarbt VMito t g h mg d Aktivität Farbstoffgesamt- Anteil des Reaktions- Normiemenge im Essig- ansatzes, der letztlich rungsfaktor säureäthylester im Farbtest eingesetzt auf 1h und wurde 1g Leber gebildete Gesamtmenge im Reaktionsansatz E420 : Extinktion des Messwertes (um den Leerwert korrigiert) d : Schichtdicke der Messküvette = 1 cm VEss : Volumen des zur Extraktion eingesetzten Essigsäureäthylesters VFäll : Volumen, das aus dem Reaktionsansatz in die TCA-Fällung eingesetzt wurde VTCA : Volumen der TCA in der TCA-Fällung VFarbtt : Volumen, das aus der TCA-Fällung in den Farbtest eingesetzt wurde (Tab. 2) VReakt : Volumen des Reaktionsansatzes (Tab. 1) VMito : Volumen der eingesetzten Mitochondriensuspension 75 KMito : "Verdünnungsfaktor" der Mitochondrien: Mitochondrien aus 5 g Leber wurden in 75 ml aufgenommen: K t : Mito 75 ml 5g Bezugsgröße Zeit (1h) Aus den für alle Ansätze konstanten Werten kann durch Einsetzen in die Formel ein Faktor berechnet werden. Man beachte, dass in l · mol-1 · cm-1 angegeben ist, die Volumina aber in ml und der resultierende Wert in µmol berechnet werden soll! 𝑬𝟒𝟐𝟎 µ𝒎𝒐𝒍 ⌋ 𝒙 𝟐𝟓, 𝟕 = ⌊ 𝒕 [𝒉] 𝒈𝒙𝒉 76 MESSWERTE UND BERECHNUNGEN: Reagenzglasnummer 1 1a 2 2a 3 3a 4 4a 5 5a 6 6a 7 7a 8 8a 420nm Mol/(g*h)
