Von-Willebrand-Faktor (vWF), Faktor-VIII-Spiegel sowie frei und zellulär in Thrombozyten zirkulierende Wachstumsfaktoren der Angiogenese bei Patienten mit Colon-Karzinom in verschiedenen UICC-Stadien Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vorgelegt von Tobias Stützer aus Friedrichroda Als Dissertation genehmigt von der medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 19. September 2013 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Gutachter: Prof. Dr. Robert Zimmermann Gutachter: Prof. Dr. Werner Hohenberger INHALTSÜBERSICHT 1. Zusammenfassung und Summary ____________________ 1 1.1 Zusammenfassung ______________________________________ 1 1.2. Summary______________________________________________ 3 2. Einleitung ________________________________________ 5 2.1 Kolorektales Karzinom _________________________________ 5 2.1.1 Allgemeines _________________________________________ 5 2.1.2 Epidemiologie ________________________________________ 5 2.1.3 Risikofaktoren ________________________________________ 6 2.1.4 Pathogenese _________________________________________ 1 2.1.5 Diagnostik __________________________________________ 12 2.1.6 Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms _____________ 144 2.1.7 Therapie ___________________________________________ 16 2.2 Wachstumsfaktoren ____________________________________ 2.2.1 Vascular-endothelial-growth-factor (VEGF) ________________ 2.2.2 Transforming growth factor beta (TGF-) __________________ 2.2.3 Platelet-derived-growth-factor (PDGF) ____________________ 2.2.4 Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten und Neoangiogenese bei Tumorerkrankungen _________________________________ 19 19 22 23 25 2.3 Thrombozyten _________________________________________ 27 2.4 Gerinnungsfaktoren ____________________________________ 28 2.4.1 Von-Willebrand-Faktor ________________________________ 28 2.4.3 Faktor VIII __________________________________________ 32 2.5 Zielsetzung der Studie __________________________________ 33 3. Material und Methoden ____________________________ 34 3.1. Studiendesign ________________________________________ 34 3.2 Materialgewinnung _____________________________________ 34 3.3 Durchflusszytometrie ___________________________________ 37 3.4 Quantitative Bestimmung der Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF und TGF-β1 mittels ELISA __________________________________ 3.4.1 Vorbereitung der Proben _______________________________ 3.4.2 Testprinzip _________________________________________ 3.4.3 PDGF-AB __________________________________________ 3.4.4 TGF-β1 ____________________________________________ 3.4.5 VEGF _____________________________________________ 42 42 43 44 44 45 3.5 Statistische Auswertung ________________________________ 47 4. Ergebnisse ______________________________________ 48 4.1 Statistische Auswertung ________________________________ 48 4.2 Blutbild_______________________________________________ 48 4.2.1 Erythrozyten ________________________________________ 48 4.2.2 Hämoglobin _________________________________________ 50 4.2.3 Hämatokrit__________________________________________ 51 4.2.4 MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin) ____________________ 52 4.2.5 MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) _______ 53 4.2.6 Leukozyten _________________________________________ 54 4.2.7 Thrombozyten ______________________________________ 555 4.3 Gerinnungsfaktoren ____________________________________ 4.3.1 Ristocetin Co-Faktor __________________________________ 4.3.2 Faktor VIII __________________________________________ 4.3.3 Von-Willebrand-Faktor ________________________________ 56 56 57 58 4.4 Durchflusszytometrie ___________________________________ 59 4.5 ELISAs der Wachstumsfaktoren __________________________ 4.5.1 VEGF _____________________________________________ 4.5.2 PDGF-AB __________________________________________ 4.5.3 TGF-β _____________________________________________ 60 60 62 64 4.6 Tabellarische Zusammenfassung aller Ergebnisse ___________ 67 5. Diskussion ______________________________________ 70 6. Literaturverzeichnis _______________________________ 70 7. Abkürzungsverzeichnis ____________________________ 97 8. Danksagung _____________________________________ 99 9. Lebenslauf _____________________________________ 100 1 1. Zusammenfassung und Summary 1.1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Erhöhte Plasmaspiegel an thrombozytären Wachstumsfaktoren erregten in der Tumorforschung große Aufmerksamkeit. Dabei konnte ein Anstieg bestimmter Faktoren bei einem breiten Spektrum maligner Erkrankungen in zahlreichen Studien verifiziert werden, unter anderem auch bei Patienten mit kolorektalem Karzinom. Hierbei lag der Schwerpunkt, unabhängig vom jeweiligen Tumorstadium, zumeist nur auf einem dieser Faktoren. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Frage wie sich die Konzentrationen an den Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β und dem von-Willebrand-Faktor bei Patienten mit kolorektalem Karzinom in Abhängigkeit vom jeweiligen Tumorstadium verhalten und inwieweit die Ergebnisse Rückschlüsse auf die Tumorlast, das Ansprechen auf die Therapie, die Prognose und die Erkennung eines Rezidivs zulassen. Anhand der Gegenüberstellung einzelner Parameter, bezogen auf das jeweilige UICC-Stadium des Karzinoms, sollen Aussagen über eventuelle stadiencharakteristische Konzentrationsverteilungen getroffen werden können. Material und Methoden Es wurden 47 Vollblutproben von Patienten mit kolorektalem Karzinom gewonnen. Die Proben wurden mit citrate theophylline dipyridamole adenosine (CTAD) mit einem CTAD-zu-Blut Verhältnis von 1:9, mit Natriumcitrat in einem Verhältnis von 1:9 oder mit Ethylendiamintetraacetat (EDTA) mit 1,6 mg EDTA pro ml Blut antikoaguliert. Anschließend wurde ein maschinelles Blutbild erstellt und die Konzentration an CD62 positiven Thrombozyten mit dem Verfahren der Durchflusszytometrie ermittelt. Weiterhin bestimmte man mittels ELISA die Konzentration an frei zirkulierenden thrombozytären Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β, wobei die Proben einerseits ohne vorherige Inkubation andererseits nach Inkubation mit dem Lysepuffer Triton X100, analysiert wurden. Schließlich wurden noch quantitative Messungen des von-Willebrand-Faktors, des Ristocetin-Cofaktors und des Blut- 2 gerinnungsfaktors VIII ausgewertet. Die Patienten ließen sich anhand der UICC-Klassifikation für das kolorektakele Karzinom in vier verschiedene Gruppen einteilen, die im Rahmen der Analyse gegenübergestellt wurden. Ergebnisse und Beobachtungen Mit fortschreitendem Tumorstadium nach der UICC-Klassifikation gingen bei den untersuchten Patienten mit kolorektalen Karzinomen fallende Hämoglobinwerte, steigende Thrombozytenzahlen und leicht steigende Zahlen zirkulierender aktivierter, CD62-positiver Thrombozyten einher. Parallel dazu stiegen die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII und die Konzentration des vonWillebrand-Faktors vom UICC-Stadium 1 bis zum Stadium 4 tendentiell leicht an, wobei die Unterschiede zwischen den Patientengruppen in den 4 Stadien nicht signifikant waren. Auch die Bestimmung der frei zirkulierenden sowie der insgesamt in Vollblutlysaten nachweisbaren Mengen der Zytokine VEGF, PDGF-AB und TGF-ß1 ergab keine klaren Unterschiede, die sich mit fortschreitenden Tumorstadien assiziieren ließen. Schlussfolgerungen In der Zusammenschau aller Ergebnisse können die analysierten Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-ß1 ebensowenig wie die Gerinnungsproteine Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor als zuverlässige Parameter für Screening und Stadieneinteilung bei der Untersuchung von Patienten mit kolorektalem Karzinom eingestuft werden. Lediglich VEGF ließe sich aufgrund seiner mit dem Tumorstadium stetig steigenden Konzentration zur Abschätzung der Tumorlast heranziehen. Wegen der engen Beziehung zur Thrombozytenzahl ist hier aber die technisch viel einfachere Bestimmung der Thrombozytenzahl vorzuziehen. 3 1.2. Summary Background Elevated levels of circulating platelet (PLT)-derived growth factors have attracted much attention in neoplasm research. There was an increase of certain factors in a wide range of malignant diseases, verified in numerous studies, including in patients with colorectal carcinoma. Here the focus was, regardless of the tumor stage, usually only on one of these factors. The focus of this work is the question of how the concentrations of the growth factors VEGF, PDGF-AB and TGF-β and von-Willebrand factor, depending on the particular stage of cancer, act in patients with colorectal cancer, and to what extent the results allow conclusions on the tumor burden, response to therapy, the prognosis and detection of recurrence. Based on the comparison of individual parameters, referred to the respective UICC stage of the cancer, statements about characteristical distributions of concentrations possibly can be made. Study designs and methods There were 47 full blood samples from patients suffering from colorectal carcinoma processed. The samples were coagulated with citrate theophylline adenosine dipyridamole (CTAD) with a CTAD-to-blood ratio of 1:9, with sodium citrate in a ratio of 1:9 or ethylenediaminetetraacetate (EDTA) with 1.6 mg EDTA per ml blood. Subsequently, an automated haemogram and the concentration of CD62 positive platelets were determined by the method of flow cytometry. Furthermore, we investigated the concentration of free circulating platelet growth factors VEGF, PDGF-AB and TGF-β by ELISA. The samples were analyzed without prior incubation and after incubation with the lysis buffer Triton X100. Finally, quantitative measurements of the vonWillebrand factor, ristocetin cofactor, and the blood clotting factor VIII were evaluated. The patients divided in four different groups, based on the UICC classification for the colorectal carcinoma, were compared in the analysis. 4 Results In the examined patients suffering from colorectal carcinoma, advancing tumor stage according to the UICC classification was associated with falling hemoglobin levels, increased platelet counts and slightly higher numbers circulating activated, CD62-positive platelets. In parallel, the activity of coagulation factor VIII and the concentration of von Willebrand factor increased by UICC stage 1 to 4 slightly, but the differences between the groups of patients in the 4 stages were not significant. The determination of the total and the extracellularly circulating amounts of the cytokines VEGF, PDGF-AB and TGF-beta1 showed no clear differences, that could be associated with progressive tumor stages. Conclusions In the synopsis of all results, neither the analyzed growth factors VEGF, PDGF-AB and TGF-ß1 nor the clotting factor VIII or von Willebrand factor could be shown to be reliable parameters for screening ¬ ning ¬ and staging of patients with colorectal cancer. Only VEGF was found to increase with tumor stage and could be suited to estimate the tumor burden. However, because of the close relationship of VEGF levels with the platelet count the technically much simpler determination of the platelet count is preferable. 5 2. Einleitung 2.1 Kolorektales Karzinom 2.1.1 Allgemeines Das kolorektale Karzinom ist eine Erkrankung mit weltweit steigender Inzidenz. In Deutschland erkranken jährlich etwa 70.000 Menschen. Besonders betroffen sind Personen im Alter über 50 [123]. Etwa 60% der kolorektalen Karzinome finden sich im Kolon, 40% sind im Rektum lokalisiert. Per definitionem liegt ein Rektumkarzinom vor, wenn der makroskopisch erkennbare aborale Tumorrand bei starrer Rektosigmoidoskopie 16 cm oder weniger von der Linea anocutanea entfernt ist [42,50,146]. Ob ein Mensch an Darmkrebs erkrankt, hängt von einer Vielzahl verschiedener Faktoren ab. Epidemiologische Studien bestätigen, dass insbesondere der persönliche Lebenswandel entscheidend zur Entwicklung eines kolorektalen Karzinoms beiträgt. Nur etwa 5-10 % sind auf eine genetische Prädisposition zurückzuführen. Das Leitsymptom des kolorektalen Karzinoms sind Blutbeimengungen im Stuhl. Viel häufiger sind zwar Hämorrhoiden der Auslöser solcher Blutungen, jedoch sollte bei jeder festgestellten Blutbeimengung im Stuhl eine bösartige Erkrankung diagnostisch ausgeschlossen werden. Auch rezidivierende Diarrhöen und/oder Obstipationen bei Menschen in der zweiten Lebenshälfte sollten unbedingt abgeklärt werden. Ganz unspezifische Krankheitszeichen sind allgemeine Schwäche und Erschöpfbarkeit, Bauchschmerzen und Gewichtsabnahme [104]. 2.1.2 Epidemiologie Häufigkeit Karzinome des Kolons und des Rektums sind in Gesamt-Europa die häufigste maligne Tumorerkrankung und rangieren in den USA auf Platz vier. In Deutschland ist das kolorektale Karzinom nach dem Prostatakarzinom des Mannes bzw. dem Mammakarzinom der Frau das Tumorleiden mit der jeweils zweithöchsten Inzidenz und ebenfalls der zweithöchsten Mortalitätsrate [124]. Weltweit liegt die Prävalenz in Industrienationen bei etwa 6 %, wobei 6 Australien, Neuseeland und Westeuropa an der Spitze stehen. Die niedrigsten Raten wurden für Afrika (ausgenommen Südafrika) und Zentralasien ermittelt. Jährlich erliegen etwa 608.000 Menschen weltweit dieser Tumorerkrankung. Global betrachtet sind dies 8 % aller tumorbedingten Todesfälle, womit kolorektale Karzinome Rang vier der häufigsten Todesursachen durch Malignome belegen [71]. Diese Daten veranschaulichen die Bedeutung von Präventionsmaßnahmen, der Diagnostik zur Früherkennung und suffizienter Therapiestrategien. Inzidenz Weltweit wird die jährliche Inzidenz auf 1 Million geschätzt. In Deutschland sind die Neuerkrankungsraten bei Frauen und Männern gleich verteilt. Bei beiden Geschlechtern weist Deutschland im EU-Vergleich die höchsten Inzidenzraten auf, während in Griechenland und in Finnland die Zahl der Neuerkrankungen am geringsten ist [124]. Eine Projektion für Deutschland wurde vom Robert-Koch-Institut (RKI) in Zusammenarbeit mit der Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. (GEKID) aufgestellt. Dabei erhöhten sich die Inzidenzen für das kolorektale Karzinom im Jahr 2010 bei Männern auf 39.410 und für Frauen auf 33.620 [52]. Malignome in Kolon und Rektum sind eher Erkrankungen des höheren Lebensalters. Das Durchschnittsalter bei Erstdiagnose des Karzinoms beträgt bei Männern 69 Jahre, bei Frauen 75 Jahre [124]. 2.1.3 Risikofaktoren Übergewicht, Bewegungsmangel und nutritive Faktoren steigern das Risiko, an Darmkrebs zu erkranken. Ballaststoffarme und fettreiche Nahrung mit einem hohen Anteil an rotem (eisenhaltigem) Fleisch und Wurstwaren sowie obst- und gemüsearme Ernährung haben ebenfalls einen negativen Effekt. Zusätzlich werden auch diverse Noxen wie Alkohol und Tabak als risikosteigernd betrachtet [52,104]. Die EPIC-Studie, eine prospektive Kohortenstudie in 10 europäischen Ländern, untersucht seit 1992 unter anderem die Zusammenhänge zwischen Ernährung und Darmkrebsrisiko. In ihr konnte eine Korrelation zwischen dem Auftreten von Tumoren und dem Verzehr von ro- 7 tem Fleisch belegt werden. Auch eine verringerte Ballaststoffzufuhr ging mit einem um 40 % erhöhten Risiko für das Kolonkarzinom einher [17]. Neben den genannten Umweltfaktoren spielt die individuelle genetische Ausstattung eine beachtliche Rolle. So sind Verwandte ersten Grades von Darmkrebspatienten selbst überdurchschnittlich häufig von dem Tumorleiden betroffen, was auf hereditäre Komponenten bei der Pathogenese hinweist. Dies ist bislang noch nicht abschließend aufgeklärt. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, wie zum Beispiel die Colitis ulcerosa, sind mit einer erhöhten Inzidenz an Karzinomen des Kolons und des Rektums assoziiert [104,144] Colitis ulcerosa Die Colitis ulcerosa, übersetzt „geschwürige Dickdarmentzündung“, ruft Entzündungen der Darmschleimhaut hervor. Sie befällt nur den Dickdarm und geht oft mit zahlreichen Läsionen einher. Bei schwerem Verlauf kann es zu einer lebensbedrohlichen Ileussymptomatik kommen. Eine chronische, jahrzehntelange Colitis kann schließlich das Entstehen eines Karzinoms begünstigen, da die Entzündung zu einem enormen Anstieg der Proliferationsrate und des Mitoseindexes von Enterozyten führt [104,144]. Morbus Crohn Bei Morbus Crohn sind die inflammatorischen Herde nicht nur auf den Dickdarm beschränkt, sondern können theoretisch alle Abschnitte des Gastrointestinaltraktes von oral bis anorektal betreffen. Wie bei den meisten Entzündungsprozessen findet sich auch hier eine gesteigerte Proliferationsrate betroffener Zellen, was schließlich die Tumorgenese begünstigen kann [104,144]. Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) Bei dieser Erkrankung kommt es zu einem immensen Befall des Dickdarms mit hunderten sichtbaren Ausstülpungen der Darmschleimhaut in Form von Polypen [104]. Die FAP wird autosomal-dominant vererbt. Ursache ist eine seltene Keimbahnmutation des Tumorsuppressorgens APC (Gen des Ade- 8 nomatous-polyposis-coli-Proteins). Zytogenetische Untersuchungen deckten eine Deletion auf dem Chromosom 5q21 auf [58,67,78,109]. Fast 70 % der sporadisch auftretenden kolorektalen adenomatösen Polypen besitzen eine Mutation im APC-Gen [117]. Dabei führt eine Nonsense-Mutation zu einem fehlerhaften Enzym. Einige dieser Keimbahnmutationen korrelieren mit verschiedenen Phänotypen sowie der Schwere der Krankheit [128]. Alternatives Splicing des 5’-Endes von Exon 1 führt zur Translation verschiedener Enzym-Isoformen, die das Zellwachstum und die Differenzierung regulieren [27]. Es können jedoch auch andere Exons betroffen sein. Zahlreiche Mutationen, besonders in den Regionen der 5’- oder 3’-Enden der Exons des APCGens, führen zu einer verzögerten Progression der Krankheit [147]. Grund ist eine modifizierte Stabilität des Proteins. Die Domänen des APC-Proteins wurden analysiert, seine Funktionwurde aufgeklärt. Gemeinsam mit der Glykogensynthasekinase-3β (GSK-3β) wird zytoplasmatisches β-Catenin phosphoryliert und in den Zellkern transloziert, um schließlich verschiedene Target-Gene transkriptionell zu aktivieren [83,102,148]. β-Catenin ist hauptsächlich an E-Cadherin gebunden, um Zell-Zell-Kontakte durch Adhäsionsverbindungen zu erleichtern [59]. Zu den aktivierbaren Target-Genen gehören unter anderen c-myc und cyclin D1, sowie weiterhin MMP-7, Axin2/conductin [85] und EphB/ephrinB [14]. Cyclin D1 bindet an die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6, wodurch ein Signal zum Durchlaufen der G1-Phase gegeben wird. c-myc ist ein Proto-Onkogen, das die Transkription einer Vielzahl von Genen positiv reguliert [105]. Hereditäres non-polypöses kolorektales Karzinom, Lynch-Syndrom (HNPCC) Das so genannte Lynch-Syndrom folgt einem autosomal-dominanten Erbgang und tritt bevorzugt im Colon ascendens auf. Charakteristisch sind ein früher Krankheitsausbruch und eine circa 80%ige Penetranz. Das LynchSyndrom ist mit einer Reihe anderer Krebserkrankungen, wie etwa dem Uteruskarzinom, Ovarialkarzinom, Mammakarzinom und dem Gallengangskarzinom, assoziiert. Treten zusätzlich Hautläsionen und Hauttumoren auf, liegt ein Muir-Torre-Syndrom vor [128]. Die klinische Einteilung erfolgt anhand zweier Klassifikationssysteme, Amsterdam I und Amsterdam II, wobei letzte- 9 res die extraintestinalen Karzinome mit einbezieht [156,157]. HNPCCPatienten tragen eine Keimbahnmutation in Genen der DNA-MismatchReparatur (MMR). In den Tumoren ist das Wildtyp-MMR-Allel verändert. Somit werden während der DNA-Replikation Fehler in Form von Wiederholungssequenzen generiert [1,45,72]. Die DNA-Mismatch-Reparaturproteine erkennen und korrigieren normalerweise Basenfehlpaarungen und kleinere Insertionen oder Deletionen bis zu 4 pb. Bei Mutation an den Genen für DNA-Mismatch-Reparaturproteine ist diese Mismatchreparatur gestört. Bei der nächsten Replikationsrunde wird die nicht beseitigte entstandene Mutation an die Tochterzellen weitergegeben und ist manifest [79]. Weisen Patienten gewisse, definierte Eigenschaften auf, die sogenannten Amsterdamkriterien, sollte eine genetische Beratung und Diagnostik mit der Frage nach einer familiären Disposition diskutiert werden. Bei bestehendem Risiko erfolgen bereits ab dem 20. Lebensjahr Vorsorgeuntersuchungen. MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP) Das MYH-Gen ist auf dem Chromosom 1p33-34 lokalisiert [79]. Mutationen dieses Gens im Sinne von Missense- oder Nonsense-Mutationen sind pathogenetisch ursächlich für die Ausbildung multipler kolorektaler, adenomatöser Polypen ohne nachweisbare FAP. MAP wird autosomal-rezessiv vererbt [11]. Peutz-Jeghers-Syndrome (PJS) Das Peutz-Jeghers-Syndrom wird auch Hutchinson-Weber-Peutz-Syndrom genannt. Patienten mit dieser autosomal-dominant vererbten gastrointestinalen Polyposis weisen in der Regel zusätzlich charakteristische Pigmentflecken an den Schleimhäuten und der Haut auf. Es kommt bevorzugt im Dünndarm zum Auftreten größerer hamartomatöser Polypen, wobei auch Dickdarm und Magen betroffen sein können. Hamartome sind primär benigne Raumforderungen, zu einem gewissen Prozentsatz jedoch neigen manche dieser Polypen zur malignen Transformation. Klinisch imponiert die Erkrankung durch Darmobstruktion, Ileus, abdominelle Koliken und gastrointestinale Blutungen [128]. Darüber hinaus konnten Giardiello et al. zeigen, dass zwischen dem Peutz-Jeghers-Syndrom und weiteren, allerdings primär bereits meist malignen Tumoren wie dem Magenkarzinom, dem Pankreaskarzinom 10 und Malignomen des weiblichen Geschlechts eine Assoziation besteht [54]. Der für das Peutz-Jeghers-Syndrom verantwortliche Genlocus ist auf dem Chromosom 19p13.3 lokalisiert. Das betroffene Gen ist eine Serin-ThreoninKinase 11 (STK11) oder auch Tumorsuppressorgen LKB-1 [6,64]. Die mit dem Peutz-Jeghers-Syndrom assoziierten Tumoren weisen eine Mutation in LKB-1 auf. Im Mausmodell ist Lkb-/- lethal für den Embryo [13,76]. Lkb+/Mäuse entwickeln die erwarteten Polypen [100]. LKB-1 übernimmt eine wichtige Funktion durch die Regulierung der Zellproliferation und des Wachstums, wahrscheinlich auch durch die Induktion von Apoptose. Eine Überexpression von LKB-1 führte in Zellen zum Zellzyklusarrest in G1 [31,133,153]. Betroffene Patienten haben ein etwa 85%ig erhöhtes Lebenszeitrisiko für Tumorerkrankungen, wobei ein Großteil noch vor dem 60. Lebensjahr seinem Leiden erliegt [104]. Juvenile Polyposis / Juveniles Polyposis-Syndrom (JPS) Während die juvenile Polyposis sporadisch auftritt, wird das familiäre JPSyndrom (FJP) autosomal-dominant vererbt. Die hamartomatösen Darmpolypen treten bereits im Kindesalter auf. Die Inzidenz beträgt etwa 1/100.000 Personen. Selten kommt es zum Übergang in echte adenomatöse Polypen, die mit einem erhöhten Darmkrebsrisiko einhergehen. Es zeigen sich klinisch ähnliche Symptome wie beim Peutz-Jeghers-Syndrom [128]. Keimbahnmutationen im BMPR1A-Gen (bone morphogenic protein receptor 1A), im SMAD4-Gen und im ENG-Gen (Endoglin, Rezeptor für TGF-beta 1) konnten der familiären juvenilen Polyposis zugeordnet werden [69,150]. Dies deutet auf TGF-β als kritischen Faktor bei der Pathogenese des FJP hin. Konditionelle BMPR1A-Inaktivierung in Mäusen verhinderte die normale intestinale Homoöstase [62], während das gezielte Ausschalten von SMAD4 über einen T-Zell-abhängigen Promotor in einer verdickten Mukosa mit Verlust der VilliStruktur resultierte [77]. 2.1.4 Pathogenese Adenome gehen vermutlich aus Stammzellen der Kolonmukosa oder aus adulten Stammzellen hervor. Genetische Prädispositionen sowie karzinoge- 11 ne und cokarzinogene Effekte beeinflussen die Tumorpathogenese. Die Vorgänge bei der Progression vom Adenom zum Karzinom sind auf molekularer Ebene im Prinzip aufgeklärt. Die so genannte Adenom-Karzinom-Sequenz beschreibt die für die Karzinomentstehung entscheidenden Schritte. Die Vorstufe des kolorektalen Karzinoms ist das Adenom der Dickdarmmukosa. Ursache ist eine Hyperproliferation des Mukosaepithels mit progredienter Differenzierung, Strukturveränderungen der Drüsen und in der Regel exophytischem, in das Darmlumen hineinragendem Wachstum (tubulär, villös). Dabei ist nicht ein einzelnes Ereignis auslösend, sondern es bedarf einer Reihe genetischer Ereignisse. Zu Beginn findet eine somatische Mutation statt und/oder es kommt zum Verlust der Heterozygotie auf dem Chromosom 5 des APC-Gens. APC wird inaktiviert. Im weiteren Verlauf kann es zu einer Mutation von k-ras auf Chromosom 12q kommen. Weitere genetische Veränderungen wie eine Mutation im TGF-β-II-Rezeptor und die Inaktivierung der Tumorsuppressorgene DCC, DPC4, SMAD2 führen zu einer Entartung der Zellen. Der Übergang vom späten Adenom in das manifeste Karzinom wird wahrscheinlich erst durch eine weitere Mutation ermöglicht, die den Funktionsverlust von p53 nach sich zieht. Zunächst entsteht aus der physiologischen, gesunden Darmschleimhaut ein tubuläres Adenom. Dies verändert sich weiter durch Verlust der Proliferations- und Differenzierungshemmung. Es entsteht ein adenomatöser Polyp, mit dessen Größe und Durchmesser die Wahrscheinlichkeit der Entartung steigt. Die genannten DNAVeränderungen tragen schließlich zur malignen Transformation bei; es resultiert ein Adenokarzinom [104,144,159]. 12 2.1.5 Diagnostik Klinische Diagnostik und Laboruntersuchungen Digital-rektale und körperliche Untersuchungen Eine Austastung des Mastdarms ist eine einfache Untersuchungsmethode, mit der man Tumoren im unteren Bereich des Darms ertasten kann. Da sich viele Darmtumore aber auch in höher gelegenen Darmabschnitten befinden, ist diese Methode für sich alleine genommen für die Darmkrebsvorsorge nicht ausreichend. Laborparameter Laborparameter erlauben für sich weder den Ausschluss noch den Nachweis von Darmkrebs. Folgende Parameter haben aber im Kontext der weiteren Diagnostik Bedeutung: CEA: carcinoembryonales Antigen, zur ergänzenden Diagnose oder Stadieneinteilung bei kolorektalen Karzinomen LDH 3: Lactatdehydrogenase-Isoenzym, Marker für maligne Tumore AP: Alkalische Phosphatase Isoenzym, erhöht bei ulzerierenden Darmerkrankungen absolute Leukozytenzahl: Vollblutbild, Diffentialblutbild; Hinweis auf Malignome und Metastasen Stuhluntersuchungen (Hämokkulttest) Darmpolypen und Tumoren neigen oft zu Blutungen. Mit dem Hämokkulttest können makroskopisch nicht sichtbare Blutungsereignisse diagnostiziert werden [18]. Allerdings gibt es auch Tumoren, die nur selten bluten oder gar keine Blutungsneigung zeigen, so dass die Sensitivität dieser ScreeningMethode bei nur einmaliger Durchführung für sich allein genommen nicht ausreichend hoch genug ist. Daher ist es wichtig, den Test regelmäßig durchzuführen [104,144]. 13 Bildgebende Verfahren Röntgenkontrastmitteleinlauf Ein wasserlösliches Kontrastmittel wird zur Darstellung der Darmstrukturen rektal appliziert, Veränderungen im Darm und in der Darmwand werden sichtbar. Nachteilig sind jedoch die geringere Sensitivität und die Strahlenbelastung für den Patienten [104,144]. Diese Methode gehört heute nicht mehr zum Standardprogramm der Vorsorgeuntersuchungen. Koloskopie (Dickdarmspiegelung) Die Koloskopie ist besonders zuverlässig bei kleinen Polypen und Veränderungen der Mukosa. Es können direkt Probebiopsien zur histologischen Charakterisierung entnommen und polypöse Raumforderungen reseziert werden. Der jährliche Hämokkulttest kombiniert mit einer Koloskopie alle 10 Jahre verringert das Darmkrebsrisiko um bis zu 90 %. CT-Kolonographie Die sog. virtuelle Koloskopie ist eine nicht-invasive Untersuchungsmethode. Dazu nutzt man die Computertomographie (CT) oder die Magnetresonanztomographie (MRT), um digitale Schnittbilder in eine dreidimensionale Ansicht des Darmes umzuwandeln. Mittels CT erhält man eine bessere Bildauflösung, weshalb diese Methode für die Darmkrebsvorsorge die geeignetere ist. Vor der Untersuchung ist der Darm wie für die klassische Koloskopie vorzubereiten. Das Einleiten von Sauerstoff oder Kohlendioxid führt zu einem leichten Aufblähen, wodurch der Darm entfaltet und eine bessere Beurteilbarkeit erreicht wird. Der Nachteil der Methode liegt in der geringen Sensitivität für flache Polypen und für Polypen mit einer Größe von unter 8 mm [104,144]. Genetische Beratung und Diagnostik Liegt bei Patienten eine familiäre Prädispostion vor, sollte die entsprechende Mutation identifiziert werden, um festzustellen, ob es sich um eine Keimbahnmutation handelt. Für die bereits erwähnten familiär vererbten Krankhei- 14 ten ist meist ab dem 20. Lebensjahr eine individuell intensivierte Vorsorge, durchzuführen. 2.1.6 Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms Die Prognose kolorektaler Karzinome ist in erster Linie abhängig vom Tumorstadium und dem Resektionsausmaß des Tumorgewebes. Dabei korreliert die Letalität mit dem Erkrankungsstadium bei Diagnosestellung [136]. Als Rektumkarzinome werden Tumoren eingestuft, deren aboraler Rand bei der Messung mit dem starren Rektoskop 16 cm oder weniger von der Anokutanlinie entfernt ist [42,146]. Nach der UICC-Klassifikation von 2003 lassen sich Rektumkarzinome entsprechend ihrem Abstand von der Anokutanlinie weiterhin in Karzinome des oberen (12-16 cm), des mittleren (6-12 cm) und des unteren Rektumdrittels (< 6 cm) unterteilen [155] Cuthbert Dukes definierte 1932 eine noch heute gültige Stadieneinteilung. Wird die Darmwand bis einschließlich der Muscularis propria infiltriert und liegt keine Lymphknotenmetastasierung vor, weist der Tumor das Stadium Dukes A mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 95-100 % auf. Erreicht der Tumor die Subserosa, spricht man vom Stadium Dukes B, dessen 5-JahresÜberlebensrate bei 80-85% liegt. Treten regionäre Lymphknotenmetastasen auf, ist Stadium Dukes C mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 50% zu diagnostizieren. Beim Nachweis von Fernmetastasen, entsprechend dem Stadium Dukes D, sinkt die 5-Jahres-Überlebensrate auf 5-15% [39]. Allerdings erfolgt die Einteilung kolorektaler Karzinome inzwischen häufiger anhand der UICC-Klassifikation in der letzten Version von 2009 zusammen mit der TNM-Klassifikation [155]. Tabelle 1 stellt die einzelnen Stadien dar und dient der Veranschaulichung der verschiedenen Klassifikationssysteme: 15 Tabelle 1: Definition und Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms anhand der UICC-, TNM-, und Dukes-Klassifikation [39,155] UICC- Definition T N M Carcinoma in situ Tis N0 M0 T1 N0 M0 T2 N0 M0 Infiltration aller Wandschichten T3 N0 M0 Überschreitung der Darmwand T4 N0 M0 Tx N1-3 M0 C Tx Nx M1 D Dukes Stadium 0 Ia beschränkt auf Mukosa und A Submukosa Ib Infiltration der Muscularis propria II III Regionale Lymphknoten oder Infiltration der Umgebung IV B Fernmetastasen 16 2.1.7 Therapie Anhand der Stadien ergeben sich die weiteren Therapiestrategien. Primäres Ziel ist immer die komplette operative Tumorentfernung (R0) im Sinne einer En-Bloc-Resektion von tumoradhärentem Gewebe zur Vermeidung einer lokalen Tumorzelldissemination [19,65,68]. Daran schließen sich in den UICCStadien I und II engmaschige klinische Verlaufskontrollen der Patienten an, meist unter Bestimmung von Tumormarkern wie CEA oder CA19-9. Diese können Hinweise auf einen erneuten Anstieg der Tumorlast und somit ein Rezidiv geben, sie sind allerdings auch bei anderen pathologischen Prozessen erhöht und somit nicht sehr spezifisch für das kolorektale Karzinom. Nach R0-Resektion im UICC-Stadium III sollte eine adjuvante Chemotherapie angestrebt werden. Konnte lediglich eine R1- oder R2-Resektion erreicht werden, ist eine Nachresektion ratsam. Wenn dies aufgrund der Tumorlokalisation nicht oder nur unter Inkaufnahme gravierender Konsequenzen für den Patienten praktizierbar ist, wird eine palliative Chemotherapie durchgeführt. Im Stadium IV nach UICC besteht die Therapie ebenfalls aus Tumorresektion und einer palliativen Chemotherapie [65]. Resektion Die meisten gutartigen Geschwülste können durch das Koloskop abgetragen werden. Der Polyp wird zunächst mit einer Drahtschlinge fixiert. Ein durch die Schlinge geleiteter elektrischer Strom schneidet den Polypen ab und verschließt die Gefäße. Bestrahlung Bei großen Tumoren wird nach der operativen Entfernung des betroffenen Darmabschnittes eine Bestrahlung durchgeführt. Diese soll eventuell noch vorhandene Krebszellen zerstören. Eine neoadjuvante Bestrahlung kann den Tumor vor der Operation verkleinern und die Resektion erleichtern. 17 Chemotherapie Eine Behandlung mit Chemotherapeutika kommt ergänzend zur Operation in Betracht, wenn in entfernten Lymphknoten Tumorzellen nachgewiesen wurden. Auch wenn nicht resektable Metastasen diagnostiziert wurden, ist eine Chemotherapie angezeigt [104]. Regionale Chemotherapie (RTC) Hierbei wird das Chemotherapeutikum über ein Gefäß direkt in den Tumor eingeleitet, sodass körpereigenes gesundes Gewebe größtenteils verschont bleibt. So ist lokal eine bis zu einer Zehnerpotenz höhere Dosis des Wirkstoffes einsetzbar [3]. Monoklonale Antikörper Antikörper sind zentraler Teil der humoralen Immunabwehr. Die Eigenschaft, gezielt spezifische Zellmerkmale zu erkennen, wird auch in der Krebstherapie genutzt. Auf den Oberflächen von Tumorzellen werden nur selten stark veränderte Strukturen präsentiert, die das Immunsystem als Tumorantigene erkennen kann. Der Körper bildet gegen Tumoren meist keine Antikörper aus, oder die Antikörperreaktion ist zu schwach, um einen Tumor am Wachstum zu hindern. Synthetische Antikörper spielen heute auch eine wichtige Rolle, um pathologisch veränderte Signalwege im Stoffwechsel von Malignomen zu blockieren. Von besonderem Interesse ist der Wnt-Signalweg, an dessen Signaltransduktion zahlreiche Proteine beteiligt sind. Wnt ist ein lokaler Mediator, der eine wichtige Funktion bei der Entwicklung verschiedener maligner Zellen übernimmt. Über eine komplexe Signalkaskade führt die Bindung von Wnt an seinen Rezeptor zur Hemmung eines Proteinkomplexes bestehend aus GSK-3β, Axin-1 und dem bereits beschriebenen APC-Protein. β-Catenin wird nicht mehr abgebaut, akkumuliert in der Zelle und Zellkern, wo Zielgene aktiviert werden. Der Firma Novartis ist es gelungen, spezifische Antikörper zu entwickeln, die den Wnt/ β-Catenin-Weg hemmen und somit in der Lage sind, die Tumorgenese zu unterbinden [40]. Der signifikanteste Fortschritt in der Anwendung monoklonaler Antikörper in der Onkologie war die Einführung und Zulassung von Bevacizumab (Avastin®), eines Antikör- 18 pers gegen den auch in dieser Studie näher betrachteten vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF, und von Cetuximab (Erbitux®), eines Antikörpers gegen den epidermalen Wachstumsfaktor EGF. Kombiniert mit einem Standard-Chemotherapieschema führt Bevacizumab zu einer signifikanten Erhöhung der 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit metastasierendem Kolon-, Mamma-, Nieren- und Bronchialkarzinom [63,66,132,165]. Cetuximab, allein eingesetzt oder mit Notfallmedikamenten, kann bei Patienten mit gegenüber Chemotherapie resistenten Tumoren des Kolons und des Rektums eine klinisch bedeutende Anti-Tumor-Response bewirken. Der Einsatz von Radioimmunokonjugaten in der klinischen Phase wird weiterhin diskutiert, da Komplexität und die Toxizität noch nicht vollständig aufgeklärt sind [2]. Nano-Krebstherapie Besonders aussichtsreich ist die nanopartikuläre Drug-Delivery. Ihr Ziel ist die selektive Anreicherung von Wirksubstanzen in erkranktem Gewebe, die Erhöhung der Bioverfügbarkeit, die Verringerung des Wirkstoffabbaus und eine Reduktion bzw. Vermeidung von Nebenwirkungen. Neben zahlreichen Nanosystemen, die als Carrier zur Verfügung stehen, ist die Verwendung von Eisenoxidnanopartikeln besonders nennenswert. Sie sind die Wirkstoffträger und mit konventionellen Bildgebungsverfahren visualisierbar. Magnetische Nanopartikel aus Magnetitteilchen, die stabil in Flüssigkeit gehalten werden, verhalten sich im Magnetfeld wie ein „flüssiger Magnet“. Mit dem Chemotherapeutikum beladen werden sie intraarteriell appliziert. Die Partikel werden im Tumorgewebe mit einem externen Magnetfeld konzentriert. Eine 50-fache Erhöhung der lokalen Konzentration ist somit gegenüber konventioneller Applikationsmethoden möglich [5]. Die Hyperthermie verwendet ebenfalls magnetische Nanopartikel, die im Wechselmagnetfeld zur Schwingung gebracht werden (MagForce Nano-Krebstherapie). Eine lokale Temperaturerhöhung auf bis zu 70°C schädigt die Tumorzellen irreversibel. Gesunde Zellen bleiben bei diesem Prozess verschont. Die Therapie ermöglicht die Behandlung von nahezu allen soliden Tumorarten und wird seit März 2003 in mehreren klinischen Studien an Menschen erprobt. Die Ergebnisse nach über 70 be- 19 handelten Patienten zeigen, dass die Nano-Krebstherapie außerordentlich gut vertragen wird [35]. 2.2 Wachstumsfaktoren Zellwachstum und Zellvermehrung sind essentielle Prozesse des Lebens. Nicht nur während der Embryogenese, sondern kontinuierlich muss der Körper in der Lage sein, auf bestimmte Aufgaben und Anforderungen adäquat zu reagieren. So sind Zelldifferenzierung und Zellproliferation entscheidende Vorgänge im Rahmen der Wundheilung, der Erneuerung von Gewebszellen mit hohem Umsatz, wie zum Beispiel Epithelzellen oder Knochenmarkzellen, und der Synthese extrazellulärer Matrix. Abnorm gesteigerte Proliferation ist für Tumorzellen charakteristisch. Wachstum und Vermehrung unterliegen der Kontrolle einer Vielzahl von Peptidhormonen. Unter dem Begriff Wachstumsfaktoren fasst man diejenigen Substanzen zusammen, die einen positiven Effekt auf Zelldifferenzierung und Zellproliferation haben [30]. Wachstumsfaktoren sind unter anderem in den zytoplasmatischen -Granula der Thrombozyten gespeichert und werden nach Aktivierung der Plättchen durch Exozytose freigesetzt. Dabei können sie sowohl autokrin wirken, also auf die sie freisetzende Zelle selbst, oder benachbarte Zellen auf parakrinem Weg stimulieren. [30,53]. Spezielle Wachstumsfaktorrezeptoren vermitteln nach Bindung ihres spezifischen Substrats über komplexe Signaltransduktionswege Signale an den Nukloelus und den Proteinsyntheseapparat der Zielzelle. So entfalten Wachstumsfaktoren schließlich ihre vielfältigen Effekte auf Chemotaxis, Matrixsynthese, Wundheilung, Zelldifferenzierung und Zellproliferation [30]. 2.2.1 Vascular-endothelial-growth-factor (VEGF) Thrombozyten enthalten verschiedene Wachstumsfaktoren, unter anderen den vascular-endothelial-growth-factor (VEGF), der auch als vascular permeability factor (VPF) [142] oder als Vaskulotropin [115] bezeichnet wurde. VEGF ist ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 24-42 kDa, wobei 20 die Größenvariation durch alternatives Splicing der Exons bedingt ist. Dadurch entstehen Isoformen mit einer verschiedenen Anzahl an enthaltenen Aminosäuren. Es finden sich Derivate mit 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren, wobei die letztgenannten drei Heparin binden können [12]. Es besteht eine strukturelle Verwandtschaft von VEGF und einem anderen Wachstumsfaktor, dem platelet-derived-growth-factor (PDGF): Die Aminosäuresequenz von VEGF setzt sich sowohl aus Primärstrukturen wie auch limitierten Aminosäuresequenzen zusammen, die homolog den Aminosäuresequenzen der A- und B-Kette von PDGF sind. Das Gen für VEGF ist auf dem Chromosom 6p12 lokalisiert. VEGF zählt aufgrund seiner n-ständigen Glykosylierungsstelle zu den Glykopeptiden. Funktionell besteht bei natürlichem humanen VEGF kein Unterschied zu dem von E.coli exprimierten, rekombinantem humanem VEGF. Zwischen humanem natürlichen VEGF und dem VEGF der Ratte beziehungsweise des Rindes wurde eine 84- bis 94prozentige Überstimmung der Basensequenz gefunden. [32,41,106,141,142]. Außer bei den VEGF-exprimierenden Zellen des Endothels konnten auch bei einer limitierten Anzahl anderer Zelltypen VEGF-Rezeptoren nachgewiesen werden, wie zum Beispiel Megakaryozyten, Thrombozyten, Monozyten, hämatopoetischen Stammzellen und ovariellen Tumorzellen. Auch bei anderen Tumoren wie Lungenadenokarzinomen, Blasenkarzinomen und Fibrosarkomen, fand man eine VEGF-Expression [32,41,97,106,141,142]. VEGF wird von Zellen synthetisiert, die an Vaskularisationsvorgängen beteiligt sind. Durch VEGF wird die Gefäßpermeabilität und die Gefäßproliferation reguliert, außerdem hat es Bedeutung im Rahmen von Apoptosevorgängen [126]. In vitro zeichnet sich VEGF durch einen starken mitogenen Effekt auf Endothelzellen aus. In kultivierten Endothelzellen kann VEGF über eine Aktivierung der Phospolipase C eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration induzieren [32,41,106,141,142]. Durch VEGF werden in vivo gleichermaßen Gefäßwachstum und Gefäßpermeabilität gesteigert. Zusätzlich stimuliert VEGF die Endothelzellen, den von 21 Willebrand-Faktor freizusetzen, und regt die Expression von Gewebefaktoren in Monozyten und Endothelzellen an [99]. Es muss also davon ausgegangen werden, dass VEGF bei Entzündungsvorgängen sowie bei physiologischen und pathologischen Angiogeneseprozessen von entscheidender Bedeutung ist. Als einer der stärksten und spezifischsten angiogen wirkenden Faktoren kommt VEGF somit eine Hauptrolle im Rahmen der Wundheilung, der Embryogenese und der Vaskularisation von Tumoren zu [12]. Es sind drei Rezeptoren bekannt, an die sich VEGF anlagern kann, wobei es sich um Tyrosinkinaserezeptoren handelt, zu denen auch die Rezeptoren der PDGF-Familie zählen. Sie werden unterschieden in VEGF-Rezeptor 1 (fmslike Tyrosinkinase-Rezeptor ((Flt-1)), VEGF-Rezeptor 2 (kinase-insertdomain-containing-receptor (KDR)) und den VEGF-Rezeptor 3 (Flt-4) [81]. Wie bereits dargestellt erhöht VEGF unter anderem auch die Gefäßpermeabilität. Eine Hemmung des VEGF-Rezeptors 2 hatte in präklinischen Studien einen günstigen Einfluss auf die Bildung von Aszites, siekonnte dessen Entstehung teilweise verhindern. Im Gegensatz dazu führte eine Aktivierung des VEGF-Rezeptors zu einer Zunahme der Gefäßpermeabilität und einer Steigerung der Migration und Proliferation von Endothelzellen [44]. Das Hauptaugenmerk der Anti-VEGF-Therapie liegt daher auf dem VEGF-Rezeptor 2 [116,126]. Allerdings hat sich sowohl im Tiermodell als auch bei der Anwendung am Menschen gezeigt, dass sich der interstitielle Druck im Tumorgewebe durch Senkung der Gefäßpermeabilität erhöht. Diese veränderten Druckverhältnisse führen zu einer im Verhältnis zu gesundem Gewebe gesteigerten Durchblutung der tumorösen Raumforderungen und somit zu einem negativen Effekt der Anti- VEGF-Therapie [8,61]. Der VEGF-Rezeptor 3 ist aufgrund seiner hohen Dichte auf lymphatischen Endothelzellen vermutlich mit verantwortlich für die Lymphangiogenese und zeigt auch eine enorm gesteigerte Expression in Lymphknotenmetastasen [81]. Es bleibt abzuwarten, ob sich diese Erkenntnisse als Basis für Diagnostik und Therapie verwerten lassen, um beispielsweise einer Progression des Lymphknotenbefalls bei metastasiertem Primärtumor entgegenzuwirken. 22 Die Rolle des VEGF-Rezeptors 1 wurde bislang noch nicht hinreichend geklärt. Es bleibt abzuwarten, dass gezeigt wird, auf welche Weise die Angiogenese durch diesen Rezeptortyp beeinflusst wird. 2.2.2 Transforming growth factor beta (TGF-) Weiterhin enthalten Thrombozyten in den Speichergranula den Transforming growth factor beta (TGF-), welcher zuerst aus transformiertem Gewebe, speziell aus Sarkomen, isoliert werden konnte, und dieser Tatsache seinen Namen verdankt [24]. Es existieren zwei Varianten, TGF- und TGF-. TGF zählt zu der sogenannten TGF--Superfamilie, die als Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren auch die Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) einschließt, von denen man heute mindestens 13 verschiedene Formen kennt [4,34,84,86]. Von den bisher fünf beschriebenen Subtypen des TGF- findet man TGF-1 bis -3 beim Menschen, während TGF-4 bei Hühnern und TGF-5 bei Amphibien nachgewiesen werden können [86]. Das humane TGF- ist ein Dimer mit einem Molekulargewicht von 25 kDa und setzt sich aus über Disulfidbrücken verbundene Untereinheiten von jeweils 112 Aminosäuren zusammen [4,34,84]. TGF-1, ein Homodimer aus zwei 1-Ketten, ist in Thrombozyten, Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten enthalten. TGF-2, ebenfalls ein Homodimer, besteht aus zwei 2Ketten und ist dagegen zusätzlich noch in Knochenextrakten nachweisbar [145]. Die Aminosäuresequenzen von TGF-1 und TGF-2 sind in etwa zu 70 Prozent identisch [7]. TGF-3 wird als Heterodimer aus je einer 1- und einer 2-Kette gebildet. TGF-1 wird aufgrund der besseren Molekülstabilität physiologisch inaktiv als latente Form sezerniert, wobei die Halbwertszeit von latentem TGF- etwa 90 Minuten beträgt, im Vergleich zu einer Halbwertszeit von nur zwei Minuten beim freiem TGF-. Der Freisetzungsmechanismus der latenten Form ist bislang noch nicht vollständig geklärt, die in vivo-Aktivierung wird durch Proteasen wie Plasmin vermittelt [56]. 23 Bei der Thrombozytendegranulation freigesetztes TGF- wirkt auf verschiedenste Gewebe, wobei es im Allgemeinen zur Stimulation von Zellen mesenchymalen Ursprungs und zur Suppression von Zellen ektodermaler Herkunft kommt [86]. Seine Wirkung als Wachstumsfaktor entfaltet TGF- vornehmlich auf parakrinem und autokrinem Weg [16]. Als Zielzellen sind insbesondere Fibroblasten, Markstammzellen und Präosteoblasten zu nennen, die nach Stimulation zur Proliferation angeregt werden und je nach Zelltyp dann vermehrt durch Förderung der Synthese und Hemmung des Abbaus extrazelluläre Matrix bilden. Darüber hinaus sind viele dieser Zellen selbst in der Lage, TGF- mit autokriner und parakriner Wirkung zu sezernieren. Damit wird eine Langzeitwirkung erreicht [28,93,94,95]. TGF- wirkt unter anderem chemotaktisch und mitogen auf Knochenzellen, und vermittelt konzentrationsabhängig eine Proliferationssteigerung oder senkung. Dabei konnten in-vivo-Studien belegen, dass TGF- die Osteoneogenese steigert und durch Osteoklastensuppression dem Knochenabbau entgegenwirkt [9,30,75,114]. Zusätzlich beeinflusst TGF- die Funktionen, das Wachstum und die Differenzierung etlicher an der humoralen und zellulären Abwehr beteiligter Zellen in komplexer Weise [49]. Die physiologischen Effekte werden durch TGF--Rezeptoren (Typ-I und Typ-II) vermittelt, die Serin/Threonin-Kinasen sind. Über mehrere Zwischenschritte durch zytoplasmatische Effektorproteine wird dann mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren die Transkription entsprechender Zielgene aktiviert [37,110,152]. 2.2.3 Platelet-derived-growth-factor (PDGF) Platelet-derived-growth-factor (PDGF) wurde erstmalig 1974 von Ross, Kohler und Lipton beschrieben [81,125,126]. PDGF wird intrathrombozytär in den -Granula gespeichert und nach Aktivierung der Thrombozyten während der Blutgerinnung freigesetzt. Es ließ sich zeigen, dass die aus Thrombozyten sezernierten Substanzen den quantitativ größten Anteil der zirkulierenden Mitogene des Blutes darstellen, und für das Wachstum von Zellen, die via Blut und Serum versorgt werden, essentiell sind [126]. Man konnte PDGF 24 entgegen der ursprünglichen Annahme nicht nur in Thrombozyten, sondern auch in Makrophagen, Endothelzellen, Monozyten, Fibroblasten und in der Knochenmatrix nachweisen [8,61]. Als kationisches Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton ist PDGF bis zu 100° Celsius hitzestabil [36]. PDGF ist ein Dimer aus zwei Aminosäureketten mit den Bezeichnungen A und B, die zu circa 60% eine identische Aminosäuresequenz aufweisen. Kette A setzt sich aus 121 Aminosäuren, Kette B aus 125 Aminosäuren zusammen [8,36]. Es existieren drei bekannte Dimere: PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB. Diese haben unterschiedliche Molekulargewichte. Die biologisch aktivste Form der drei Dimere ist PDGF-BB. PDGF-AB und PDGF-BB wirken systemisch, während PDGF-AA in erster Linie lokale Wirkungen, vor allem im Knochengewebe entfaltet [145]. Die Isoformen des PDGF wirken stark mitogen auf mesenchymale Zellen wie Gliazellen [25,162], glatte Muskelzellen der Arterien [125] und einige andere epitheliale und endotheliale Zellen [21]. Darüber hinaus sind zahlreiche zusätzliche Effekte des PDGF bekannt, wie die Stimulation der Freisetzung von Granula aus neutrophilen Granulozyten und Monozyten [154] und die Stimulation der Phagozytose durch Neutrophile Granulozyten [163]. Die Effekte des PDGF werden über verschiedene Rezeptoren vermittelt. Nach Bindung von PDGF an seinen Rezeptor erfolgt eine Dimerisierung zweier Rezeptor-Tyrosinkinasen und der entstehende Komplex besteht entweder aus zwei -Rezeptoren oder zwei -Rezeptoren oder aus einem /Rezeptorkomplex [96]. Nach Autophosphorylierung und damit Aktivierung der Tyrosinkinase werden verschiedene Signalkaskaden, zum Beispiel die Mitogen-aktivierte-Proteinkinase-Kaskade (MAPK) oder die Phospholipase CyKaskade (PLCy), angestoßen [57]. PDGF beeinflusst nach seiner Freisetzung aus Thrombozyten in einer frischen Wunde unter anderem die Angiogenese, die durch Aussprossen von Endothelzellen zur Bildung neuer Kapillaren gefördert wird [70]. Außerdem werden Makrophagen aktiviert, die ihrerseits wiederum Wachstumsfaktoren 25 sezernieren und somit Bedeutung für die zweite Phase der Wundheilung haben. Weiterhin kennt man inzwischen die noch wenig untersuchten Formen PDGF-C und PDGF-D. Beim Glioblastoma multiforme ist die Erhöhung der Expression von PDGF-A und PDGF-B bereits mehrfach belegt wurden, wobei anderen Studien nach eventuell auch PDGF-C und PDGF-D ihren Beitrag zu dieser Tumorerkrankung leisten [89]. Auch bei malignen Lungen- und Pleuraprozessen und bei anderen soliden Tumoren konnte eine deutliche Erhöhung der Konzentration an PDGF ermittelt werden [44]. 2.2.4 Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten und Neoangiogenese bei Tumorerkrankungen Thrombozytäre Wachstumsfaktoren, die im Blut in geringen Mengen frei zirkulieren, überwiegend aber intrazellulär in den zytoplasmatischen α-Granula der Plättchen vorkommen, haben reges Interesse verschiedenster medizinischer Fachrichtungen geweckt. In vivo unterliegen Zelldifferenzierung und Zellproliferation der gefäßneubildenden Zellen einer empfindlichen Regulation durch proangiogene und antiangiogene Wachstumsfaktoren. Es besteht ein kausaler Zusammenhang zwischen einer Störung dieses System und der Inzidenz zahlreicher Krankheitsbilder. So lassen sich etwa bei dialysepflichtigen Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz teils signifikant erhöhte Serumspiegel der thrombozytären Wachstumsfaktoren PDGF-AB und VEGF nachweisen, die zur Entstehung schwerer arteriosklerotischer Komplikationen bei Dialysepatienten beitragen sollen [22]. Auch bei anderen benignen Erkrankungen werden erhöhte Serum- oder Plasmakonzentrationen dieser Wachstumsfaktoren gefunden. Darüber hinaus kann eine pathologische Regulation dieses Systems entscheidenden Einfluss auf die Inzidenz, die Progression und die Metastasierung maligner Tumoren nehmen, und so zu einem ungünstigen Verlauf mit schlechter Prognose beitragen [26]. Mit einsetzender Größenprogredienz eines Primärtumors oder einer Metastase kann eine suffiziente nutritive Versorgung nicht mehr mit der bestehenden Gefäßversorgug ausreichend gewährleistet werden, sodass solide maligne Raumforderungen ab einer Größe 26 von 2 mm der Angioneogenese bedürfen [46]. An ihr sind zahlreiche Komponenten beteiligt, die sich in zelluläre Elemente, wie Thrombozyten und Endothelzellen, und in plasmatische Faktoren, wie thrombozytäre Wachstumsfaktoren, einordnen lassen [26]. Dass die tumorinitiierte Angiogenese rasch zu einer überdurchschnittlich gesteigerten Gefäßneubildung und somit zu einer teils erheblichen hämorrhagischen Diathese führt, lässt sich anhand von Gewebeuntersuchungen und Gegenüberstellung mit tumorfreiem Probematerial belegen [46,47]. Erfüllen Thrombozyten im Rahmen der Chemotaxis, der Matrixsynthese, der Wundheilung, der Zelldifferenzierung und Zellproliferation wichtige physiologische Funktionen [20,53], so muss man doch auch die Beteiligung der Plättchen an pathologischen Prozessen kritisch betrachten. In umfangreichen klinisch-experimentellen Studien konnte die Schlüsselrolle von Thrombozyten und Endothelzellen im Hinblick auf die Angioneogenese und die Metastasierungstendenz belegt werden [20,26,108]. In tierexperimentellen Forschungsarbeiten ließ sich reproduzierbar darstellen, dass die Proliferation von Tumorgewebe und die Metastasenabsiedlung durch eine artifiziell induzierte massive Thrombozytopenie ausbleibt, wobei dieser Effekt durch Thrombozytentransfusion reversibel ist [108,111]. Insgesamt unterliegen die tumorassoziierten Neovaskularisationvorgänge neben der Stimulation durch Wachstumsfaktoren noch diversen Einflüssen, es handelt sich folglich um ein multifaktorielles Geschehen. Indem sie über spezifische Adhäsine mit den Plättchen kommunizieren und dadurch eine Degranulation und somit eine Freisetzung der in den α-Granula gespeicherten Wachstumsfaktoren provozieren, vermögen es Malignomzellen spezifisch und aktiv mit Thrombozyten zu interagieren. Diese Fähigkeit des Tumorgewebes ist essentiell für die Sicherstellung der Nutrition durch Vaskularisation, weiterhin auch für die weitere Proliferation und anschließende Metastasierungsvorgänge [73]. 27 2.3 Thrombozyten Aufbau und Funktion Thrombozyten sind die kleinsten zellulären Bestandteile des Blutes. Sie entstammen der myeloischen Zellreihe und stellen kernlose Fragmente der Megakaryozyten dar. Durch Abschnürung von den Megakaryozyten werden sie in den Blutkreislauf abgegeben. Die Lebensdauer der Thrombozyten beträgt circa 8-10 Tage, anschließend werden sie in der Milz und der Leber durch Makrophagen abgebaut. Inaktive Thrombozyten haben die Form einer bikonvexen Scheibe mit einem Durchmesser von ca. 2,5 µm. Durch ein zytoplasmatisch zirkulär ausgespanntes Mikrotubuligerüst kommt zum einen die äußere Form zustande, zum anderen wird das Zytoplasma dadurch in ein peripheres, organellenfreies sogenanntes Hyalomer und ein zentrales, organellenreiches sogenanntes Granulomer unterteilt. Auch die Speichergranula, die viele verschiedene Substanzen, wie zum Beispiel die Wachstumfaktoren VEGF, PDGF und TGF- enthalten, finden sich im Bereich des Granulomers [81,103,125,126]. Thrombozyten sind sehr bedeutsam für die Blutgerinnung, die Gefäßreparatur, die Wundheilung und bei Entzündungsprozessen [103,170]. Die Thrombozytenaktivierung erfolgt durch verschiedene Stimuli, wie beispielsweise Adenosindiphosphat (ADP), Calciumionen, Adrenalin, Serotonin und Thrombin. Zudem werden die Plättchen durch Kontakt mit an Verletzungsstellen freiliegenden kollagenen Fasern aktiviert. Daraufhin werden die in den Granula gespeicherten Inhaltstoffe sezerniert. Gleichzeitig findet eine Konformationsänderung statt. Durch die Ausbildung von Pseudopodien können sich Thrombozyten über Rezeptoren auf der Plasmamembran an Gewebe anheften und mit anderen Plättchen quer vernetzen [103]. Ihre Kontraktilität wird den Thrombozyten durch ein ausgeprägtes Aktinnetz in Verbindung mit Myosin verliehen [38,88,91]. Darüber hinaus werden spezifische Rezeptorantigene durch Exozytose an die Zelloberfläche transloziert. Zu diesen spezifischen Rezeptorantigenen zählt unter anderen das p-Selectin (= GMP = CD62), welches 28 die Adhäsion von Thrombozyten an Bestandteilen der Zellmembran und die Adhäsion der Thrombozyten untereinander vermittelt [33,121,171]. Zur Aufrechterhaltung der Hämostase bedarf es unter anderem einer ausreichenden Anzahl funktionstüchtiger Thrombozyten. Daher sind Thrombozytopenien ab einem gewissen Schweregrad therapiebedürftig [160]. Thrombozytopenien resultieren zum Beispiel aus Umsatzstörungen mit verkürzter Lebenszeit der Plättchen im Rahmen von akuten und chronischen Autoimmunthrombozytopenien, medikamentös induzierten Thrombozytopenien und Thrombozytopenien bei Infektionskrankheiten sowie bei septischen Zuständen. Für thrombozytäre Bildungsstörungen ist die verminderte Plättchenproduktion im Knochenmark charakteristisch. Dabei wird das Knochenmark und damit die physiologische Blutbildung durch leukämische Infiltrate, generalisierte Lymphome oder metastasierte Malignome verdrängt. Der Einsatz von Zytostatika oder Radiotherapie trägt ebenso konzentrationsoder dosisabhängig zur Reduktion der Hämatopoese bei [160]. 2.4 Gerinnungsfaktoren 2.4.1 Von-Willebrand-Faktor Der von-Willebrand-Faktor wurde von dem finnischen Arzt Erik Adolf (1870– 1949) von-Willebrand entdeckt. Zusammen mit dem Leipziger Hämatologen Rudolf Jürgens (1898–1961) führte er umfangreiche genetische Untersuchungen bei einer Familie durch, die von einem erblichen Blutungsleiden betroffen war. Diese familiäre Blutungsneigung ließ sich keiner der bis dato bekannten Hämophilieformen zuordnen. Hierauf begründet sich die in Deutschland noch gängige Bezeichnung von-Willebrand-Jürgens-Syndrom, das die häufigste hereditäre Form einer hämorrhagischen Diathese darstellt. Die Prävalenz wird auf 800/100.000 Personen geschätzt, wobei nur 12,5/100.000 Personen signifikante Symptome aufweisen. Ein schweres von-WillebrandJürgens-Syndrom ist sehr selten und betrifft <0,3/100.000 Personen. Erworbene Formen sind beschrieben, treten jedoch nur sporadisch auf. Männer 29 und Frauen sind etwa gleich häufig betroffen [139]. Man unterteilt die Erkrankung in drei Typen: Bei dem mit einem Anteil von 60-80 % der Fälle vorherrschenden Typ 1 liegt ein quantitativer Mangel des Willebrand-Faktors mit erniedrigter Plasmakonzentration vor. Die Symptomatik zeigt bei den meisten Betroffenen einen milden klinischen Verlauf. Auffällig werden viele Patienten erst im Rahmen langanhaltender Blutungen und Nachblutungen nach operativen Eingriffen, durch Ausbildung großflächiger Hämatome oder durch gehäufte Menorrhagien bei weiblichen Erkrankten. Der Vererbungsmodus ist autosomaldominant mit variabler Penetranz [138]. Vom Typ 2 des von-Willebrand-Jürgens-Syndroms sind etwa 15-20 % der Patienten betroffen. Hier spielen qualitative Defekte der von-WillebrandFaktor-Multimere die zentrale Rolle. Mehrere Unterformen werden gegeneinander abgegrenzt. Bei Typ 2A fehlen die großen von-Willebrand-FaktorMultimere, wodurch in erster Linie die primäre Hämostase beeinträchtigt wird. Typ 2B zeichnet sich durch eine erhöhte Affinität für Glykoprotein-Ib aus und umfasst Phänotypen mit Verlust großer Multimere, aber auch solche mit völlig regelrechten Multimerenmustern. Bei Typ 2M stellen thrombozytenabhängige funktionelle Defekte des von-Willebrand-Faktors trotz nachweisbarer großer Multimere den Pathomechanismus dar. Der Typ 2N wird durch eine gestörte Interaktion des Faktor VIII mit dem von-Willebrand-Faktor hervorgerufen, wodurch keine Bindung der beiden möglich ist. Alle genannten Unterformen folgen einem autosomal-dominantem Erbgang [138,139]. Der Typ 3 des von-Willebrand-Syndroms ist die klinisch am schwersten verlaufende Form, allerdings auch die seltenste. Es lassen sich molekulargenetisch homozygote oder compound-heterozygote Mutationen des vWF-Gens nachweisen, die zu völligem Fehlen oder zu einer starken Konzentrationsabnahme des von-Willebrand-Faktors führen. Typ 3 wird autosomal-rezessiv vererbt [138,139]. Der von-Willebrand-Faktor ist ein multimeres Glykoprotein, das aus einer unterschiedlichen Anzahl gleicher Untereinheiten gebildet wird. Bei dem primären Translationsprodukt handelt es sich um ein Prä-Pro-Peptid aus 2813 30 Aminosäuren, welches durch posttranslationale Modifikation in Multimere umgewandelt wird. Das Molekulargewicht beträgt abhängig von der Anzahl der Untereinheiten 500 bis 20.000 kDa. Für die primäre Hämostase haben Moleküle mit einem relativ hohen Molekulargewicht zentrale Bedeutung, während kleinere multimere Einheiten eher durch ihre Interaktion mit dem Gerinnungsfaktor VIII, den sie als eine Art Trägerprotein vor frühzeitiger Proteolyse schützen, an der sekundären Hämostase beteiligt sind [13,139,140]. Die quantitative Bestimmung des von-Willebrand-Faktors im Plasma erfolgt immunologisch, wobei die Menge als von-Willebrand-Faktor-Antigen (vWF- Ag) in Einheiten pro dl (E/dl) angegeben wird und 100 IE/dl definitionsgemäß 100% entsprechen. Allerdings lassen sich anhand dieses Messwertes lediglich Aussagen über die Konzentration des von-Willebrand-Faktors im Plasma treffen, nicht aber über dessen Funktionstüchtigkeit und biologische Verfügbarkeit. Der von-Willebrand-Faktor wird von Megakaryozyten und Endolthelzellen synthetisiert, aus denen er entweder kontinuierlich oder auf einen adäquaten Reiz hin, zum Beispiel durch Thrombin, Epinephrin oder Adenosindiphosphat, freigesetzt wird. Die Plasmakonzentration beträgt durchschnittlich 10 mg/l bei einer Halbwertszeit von etwa 5-9 Stunden. Im Blut wird vWF durch die Metalloproteinase ADAMTS13 (VWF-Cleaving-Protease) schnell abgebaut. ADAMTS13 zerlegt progressiv die Multimere in immer kleinere Multimere. Durch verschiedene Bindungsdomänen ist der von-WillebrandFaktor in der Lage, mit diversen Substanzen zu interagieren. So existiert eine Bindungsdomäne für Matrixproteine, eine für thrombozytäre Glykoproteine (GPIb, GPIIb/IIIa) und eine für den Faktor VIII [13,139,140]. Wie bereits dargestellt erfüllt der von-Willebrand-Faktor bei der primären Hämostase wichtige Aufgaben. Auch im Rahmen der sekundären Hämostase ist der von-Willebrand-Faktor bedeutsam: er geht mit dem Gerinnungsfaktor VIII des intrinsischen Gerinnungssystems eine Bindung ein und schützt diesen so vor vorzeitiger Proteolyse. Ohne die Anwesenheit des vonWillebrand-Faktors reduziert sich die Halbwertszeit des Faktor VIII im Plasma von circa 13 bis 15 Stunden auf lediglich zwei bis drei Stunden [13,139,140]. 31 Weiterhin zeigen Untersuchungen, dass der von-Willebrand-Faktor im Rahmen diverser maligner Erkrankungen, wie dem Prostatakarzinom, dem Ovarialkarzinom oder dem kolorektalen Karzinom, enorm gesteigerte Plasmakonzentrationen aufweist, die wiederum mit dem Ausmaß der Tumorprogression korrelieren und sich als prognostisch ungünstig erwiesen haben [166]. So konnte in einer Studie von Shu Wang et al. eine signifikante Prognoseverschlechterung bei Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom bei gleichzeitig massiv erhöhten von-Willebrand-Faktor-Plasmakonzentrationen aufgedeckt werden [161]. Auch an der Entstehung von Metastasen ist der von-Willebrand-Faktor beteiligt. Die Interaktion von Tumorzellen mit Thrombozyten wird durch den von-Willebrand-Faktor als eine Art Vermittlermolekül unterstützt. Das Immunsystem erkennt die mit den Thrombozyten interagierenden metastasierten Zellen so nur unzureichend als Antigene, wodurch diese sich wesentlich effektiver subendothelial anheften können [101]. Ferner beobachtet man erhöhte Konzentrationen des von-Willebrand-Faktors auch bei Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Diabetes mellitus, Hepatopathien und akuten Infektionen, möglicherweise als Ausdruck einer gesteigerten Angiogenese oder einer Akuten-Phase-Reaktion aufgrund vaskulärer Pathologien. 2.4.2 Ristocetin-Cofaktor Ristocetin (vWF:RCo) ist ein dem Vancomycin verwandtes Antibiotikum, welches an der Plättchenagglutination beteiligt ist. Es ist in der Lage, die Bindung des von-Willebrand-Faktors an den Glykoprotein GP-1b- Komplex der aktivierten Thrombozyten zu vermitteln, und stellt somit ein indirektes Maß für die Affinität der entsprechenden von-Willebrand-Faktor-Bindungsregion für GP-1b dar. Oftmals findet sich beim von-Willebrand-Syndrom eine herabgesetzte Affinität und ein Mangel an vWF, ausgenommen beim Typ 2b, bei dem die absoluten Konzentrationen an vWF-AG und Ristocetin-Cofaktor erhöht sind, und nur der Quotient vWF:RCo / vWF-Ag für die Diagnosestellung wegweisend sein kann. Versetzt man Blutproben erkrankter Patienten mit 32 Ristocetin-Cofaktor, findet keine oder nur eine geringe Agglutination statt, was photometrisch verifiziert werden kann [48,129,130,149]. 2.4.3 Faktor VIII Der Faktor VIII (Antihämophiles Globulin A) ist Teil des intrinsischen Blutgerinnungssystems und wird in Leberzellen synthetisiert. Er gehört zu den Glykoproteinen, das Molekulargewicht beträgt 280kDa, wobei er sich aus einer etwa 200 kDa messenden schweren, und einer ungefähr 80 kDa messenden, leichten Kette zusammensetzt. Bei der Hämophilie A ist die Faktor VIIIGerinnungsaktivität vermindert, Betroffene leiden an hämorrhagischer Diathese. Das Gen für Faktor VIII ist auf dem langen Arm des X-Chromosoms lokalisiert, wobei diverse Mutationen als Ursache der Blutungsneigung identifiziert wurden. Aus diesem Grund kommt es in der Regel nur bei männlichen Mutationsträgern zur Ausbildung klinisch manifester Symptome, wie Gelenkoder Weichteileinblutungen. Weibliche heterozygote Genträger kompensieren den Defekt über ihr zweites X-Chromosom, fungieren aber als Konduktorinnen der X-chromosomal-rezessiven Erbkrankheit, die mit einer Inzidenz von 1:5000 (männliche Neugeborene) den häufigsten Defekt der sekundären Hämostase darstellt. Wie bereits dargestellt wird der Faktor VIII durch eine nicht-kovalente Bindung an den von-Willebrand-Faktor stabilisiert. Die Konzentration im Plasma beträgt etwa 0,1 mg/l, kann aber bei fehlendem vonWillebrand-Faktor aufgrund der dann drastisch verkürzten Halbwertszeit wesentlich geringere Werte annehmen. Therapeutisch substituiert man den fehlenden Faktor, wobei neben den modernen, aktuell noch sehr kostenaufwendigen rekombinanten Faktorenprodukten nach wie vor Präparate aus Spenderplasma oder tierische Faktorenkonzentrate zum Einsatz kommen [23,139,140]. 33 2.5 Zielsetzung der Studie Die Interaktion von Tumorzellen und Endothelzellen mit thrombozytären Zytokinen, aber auch mit dem Gerinnungsfaktor VIII und dem von-WillebrandFaktor betrifft auch das kolorektale Karzinom. Diese Faktoren sind in Studien aber bisher nur einzeln, nicht jedoch in Kombination bei denselben Patienten untersucht worden. Auch ist unklar, ob die genannten Parameter einen Wert für die Stadieneinteilung und die Prognose haben. Vorangegangene Untersuchungen aus der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung zur Thematik „Wachstumsfaktoren der Angiogenese mit Einfluss auf Wund- und Knochenheilung in den Alpha-Granula humaner Thrombozyten“ zeigten die Bedeutung der wohlüberlegten Auswahl des Probenmaterials [167-169]. In vivo frei zirkulierende Zytokine, die in vivo überwiegend intrazellulär in Thrombozyten gespeichert vorliegen, müssen in Plasma gemessen werden, das mit CTAD antikoaguliert wurde, das als einziges Antikoagulans in vitro jede Thrombozytenaktivierung blockiert [169]. Geht es aber darum, die Gesamtmege zirkulierender Zytokine zu bestimmen, muss die Messung aus einem mittels einem Detergens hergestellten Lysat erfolgen [167]. In vielen vorliegenden Untersuchungen zu so genannten zirkulierenden Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten bei Tumoren wurde auf diese präanalytischen Gesichtspunkte nicht ausreichend geachtet, so dass ein großer Teil der vorhandenen Literatur von sehr zweifelhaftem Wert ist. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung aller genannten einzelnen Laborwerte, der Thrombozytenzahl, der Konzentration und Aktivität des von-Willebrand-Faktors, der Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII sowie der frei und der intrazellulär zirkulierenden Mengen der Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-ß bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen bei Erstdiagnose und der Bezug der Ergebnisse auf das Tumorstadium der Patienten. Ziel der Untersuchung war die Klärung der bisher offenen Frage, ob einzelne oder mehrere der untersuchten Parameter beim kolorektalen Karzinom von prognostischem Wert sein könnten. 34 3. Material und Methoden 3.1. Studiendesign Die für diese Studie benötigten Proben wurden in der Chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen von 47 Patienten, die an einem erstmalig diagnostiziertem, nicht anbehandeltem kolorektalen Karzinom erkrankt waren, präoperativ bei der stationären Aufnahme gewonnen. Ein Teil der Proben wurde direkt bearbeitet, ein anderer Teil zunächst bei einer Temperatur von -70°C konserviert. Die Patienten ließen sich anhand der UICCKlassifikation für das kolorektale Karzinom in vier verschiedene Gruppen einteilen. Der Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg hatte das Studienprotokoll vorgelegt bekommen und befürwortet. 3.2 Materialgewinnung Von jedem Spender wurden Vollblutproben mit drei verschiedenen Antikoagulantien gewonnen. Die Vollblutproben wurden mit citrate theophylline dipyridamole adenosine (CTAD) mit einem CTAD-zu-Blut Verhältnis von 1:9, mit Natriumcitrat in einem Verhältnis von 1:9 oder mit Ethylendiamintetraacetat (EDTA) mit 1,6 mg EDTA pro ml Blut antikoaguliert. 47 Blutproben, die mit CTAD (Citrat-Theophyllin-Adenosin-Dipyridamol), Natrium-Citrat bzw. EDTA (Ethylendiamintetraacetat) antikoaguliert waren, wurden von Patienten mit kolorektalem Karzinom entnommen und analysiert. Dabei diente das Probenmaterial aus dem EDTA-Röhrchen der Erstellung eines kleinen Blutbildes, wobei für diese Studie folgende Werte relevant waren: Thrombozytenzahl (*10^3/µl), Erythrozytenzahl (*10^6/µl), Leukozytenzahl (*10^3/µl), Hämoglobinwert (in g/dl), Hämatokrit, mittlerer Hämoglobingehalt eines einzelnen Erythrozyten (MCH in pg/Zelle), mittlere HämoglobinKonzentration eines einzelnen Erythrozyten (MCHC in g/dl). Die Werte wurden mit Hilfe eines Blutbildautomaten (K1000, Sysmex, TOA Medicals, Kobe, Japan) erhoben, dessen Messprinzip auf einer Widerstandserhöhung bei einer so genannten Impendanzmessung, auch als Coulter-Prinzip bezeich- 35 net, basiert. Hierbei wird Blut durch eine kapilläre Öffnung eines gläsernen Körpers angesaugt, dessen Öffnung zwischen zwei Elektroden liegt, an die eine bestimmte Spannung angelegt wird. Man misst bei jedem Zelldurchtritt eine Erniedrigung der Leitfähigkeit zwischen den Elektroden, wobei größere Zellen wie Leukozyten eine höhere Leitfähigkeitsänderung als kleinere Zellen wie Thrombozyten bewirken. Die einzelnen Impulse werden elektronisch verstärkt, nach der Größe geordnet und quantitativ erfasst. Jede Zellart ist durch definierte Schwellenwerte charakterisiert und kann so unterschieden und gezählt werden. Der Inhalt eines der CTAD-Röhrchen wurde zur Bestimmung der Konzentration an CD62 positiven Thrombozyten mittels des Verfahrens der Durchflusszytometrie herangezogen. Diese Messung erfolgte unmittelbar nach der Blutentnahme. Zusätzlich wurde eine weitere CTAD-Probe zur quantitativen Bestimmung der frei im Blut zirkulierenden, aus Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β direkt nach der Entnahme bearbeitet und für spätere serielle Auswertungen mit Hilfe eines ELISAs bei einer Temperatur von -70°C konserviert. Für quantitative Messungen des Gehalts an von-Willebrand-Faktor, Blutgerinnungsfaktor VIII und Ristocetin-Cofaktor diente Probenmaterial, welches mittels eines Röhrchens gewonnen wurde, das mit Natrium-Citrat versetzt war. Die entsprechenden Werte wurden nach Blutentnahme im Gerinnungslabor der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen ermittelt. Um die Gesamtmenge der intra- und extrazellulär zirkulierenden Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β bestimmen zu können, verwendete man ein weiteres Natrium-Citrat-Röhrchen zur Probengewinnung. Diese Probe wurde anschließend mit dem Lysepuffer Triton X-100 inkubiert, um so die gewünschten Faktoren durch Zelllyse aus den Thrombozyten freisetzen zu können. Im Anschluss konservierte man dieses Probenmaterial zunächst bei einer Temperatur von -70°C, um später die Werte mittels ELISA in Serie erheben zu können. Einen Überblick über Methoden, Laboruntersuchungen und Probenmaterial gewährt Tabelle 3. 36 Tabelle 2: Schematische Darstellung analysierter Parameter mit jeweils angewandter Labormethode, sowie erforderliches Ausgangsmaterial Parameter Probenmaterial Labormethode Blutbild EDTA-Blut Blutbildautomat 1 EDTA-Röhrchen 3,5 ml Von-Willebrand-Faktor Ristocetin-Cofaktor Faktor VIII Citrat-Blut Gerinnungslabor 1 Natrium-Citratröhrchen 5 ml CTAD-Blut CD62-positive Thrombozyten 1 CTAD-Röhrchen 10 ml Durchflusszytometrie Analyse am Entnahmetag CTAD-Blut Wachstumsfaktoren 1 CTAD-Röhrchen 10 ml VEGF, PDGF-AB und TGF-β zentrifugieren (3000 rpm) -frei zirkulierend- Überstand in 1 ml Portionen wegfrie- ELISA ren bei < -70°C Wachstumsfaktoren Citrat-Blut VEGF, PDGF-AB und TGF-β 1 Natrium-Citratröhrchen 5 ml -Gesamtmenge- 1 ml versetzen mit 9 ml 0,5%iger intra-/extrazellulär zirkulierend Triton X-100-Lösung ELISA Aliquots konservieren bei < -70°C 37 3.3 Durchflusszytometrie In den Neunzehnhundertsechziger und -siebziger Jahren entwickelten mehrere Arbeitsgruppen das Verfahren der Durchflusszytometrie (Flow Cytometrie) [118,137]. Dabei werden gleichzeitig verschiedene physikalische und chemische Eigenschaften von Zellen gemessen, wobei aufgrund der hohen Messgeschwindigkeit eine enorm hohe Anzahl von Zellen erfasst werden kann. Während des Messvorgangs wird das als Zellsuspension vorliegende Material durch eine Messzelle, den sog. Durchflusshemmer, gepumpt, wobei die Zellen meist durch die Energie eines Argonlasers mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt werden [118]. Die angeregten Zellen geben die Energie wieder in Form von Fluoreszenz ab, die registriert und ausgewertet wird. Eine fluoreszierende Verbindung kann nur in einem bestimmten Frequenzbereich, dem sogenannten Exzitationsspektrum angeregt werden. Bei Rückkehr und Erreichen des Grundniveaus wird ein Photon emittiert. Da Energie während dieses Vorgangs in Form von Wärme verlorenen geht, ist das gebildete Licht, das Emissionsspektrum, energieärmer und folglich langwelliger im Vergleich zur Anregungsenergie. Durch die charakteristischen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen ist auch die entstehende charakteristische Fluoreszenz, anhand derer die Zellen differenziert werden können, für die jeweilige Zellart bedingt [118]. Da es durch die hohe Messgeschwindigkeit möglich ist, mehrere tausend Zellen zu erfassen, resultiert eine hohe statistische Präzision und Empfindlichkeit für dieses Verfahren. Des Weiteren kommen fluoreszierende Moleküle, sog. Fluorochrome, zum Einsatz, die es ermöglichen, einerseits die gewünschten Zellen, in dieser Studie Thrombozyten, hinsichtlich ihrer äußeren Merkmale wie Größe, und der inneren Eigenschaften wie Granularität und Lysosomenausstattung zu analysieren, andererseits auch Antigene auf der Zelloberfläche zu markieren [Raffael A]. Dabei sind die Fluorochrome an Sonden gekoppelt, um so gewisse Zelleigenschaften zu detektieren und sichtbar zu machen. Als Sonden dienen meist monoklonale Antikörper, die gegen definierte Epitope der Zellen binden. Die auf diese Weise markierte Zellsuspension wird anschließend in 38 das Zentrum einer Küvette gepumpt. Dieser Prozess der hydrodynamischen Fokussierung ermöglicht die Erfassung einzelner Zellen durch den Lichtstrahl [118]. Es kommt zur Streuung des Lichts, diese Streuung wird über Signalwandler und Signalverstärker registriert und lässt Rückschlüsse über die Beschaffenheit der Zellen zu. Als Forward Scatter (FSc) bezeichnet man das in Richtung des einfallenden Strahls gebrochene Licht. Es gibt Auskunft über die Querschnittsfläche und somit die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSc) einen Refraktionsindex darstellt, mit dem Aussagen zu äußerer Form, Membranfaltung und Granularität der jeweiligen Zellen getroffen werden können, die so voneinander differenziert werden können [118,137]. Für die Analyse nicht relevante Zellen und Zelltrümmer werden durch Setzen definierter Auswertefenster, so genannter Gates, ausgeschlossen. Spezielle Fragestellungen können es erfordern, Fenster über mehrere Parameter zu setzen. Mittels immunologischer Kontrollen wird überprüft, ob die die Fenster korrekt gesetzt wurden [118]. Die an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelten Antikörper nutzt man zur Erfassung verschiedener Parameter, wobei geräteabhängig bis zu vier Farbstoffe detektiert werden. Bei einem Argon Laser sind dies in erster Linie Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und R-Phycoerythrin (PE). FITC absorbiert Licht bei 488 nm (blau) und emittiert es bei 520 nm (grün), PE absorbiert bei 488 nm (blau) und 565 nm (grün) und emittiert bei 578 nm (orange). Bei PEmarkierten Antikörpern ist die Fluoreszenzintensität aufgrund der Quanteneffizienz höher, was bedeutet, dass der Quotient aus absorbierter zu emittierter Energie bei PE höher als bei FITC ist [118]. Dem thrombozytären membranständigen Glykoproteinkomplex GP IIb/IIIa kann neben anderen Funktionen eine entscheidende Rolle für die hämostatische Funktion der Thrombozyten zugeschrieben werden. GP IIb/IIIa, auch als CD41-Rezeptor bezeichnet, ist der Rezeptor für Fibrinogen und den von-Willebrand-Faktor und vermittelt so die Plättchenaggregation [122]. CD41 findet sich fast ausschließlich auf der Thrombozytenoberfläche und dient dadurch der Identifikation dieser Zellen. Darüber hinaus lassen sich 39 Aussagen über die Aggregabilität von Thrombozyten treffen. Wir verwendeten Antikörper gegen CD41, die mit FITC markiert waren (CD41FITC, Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, NJ, USA). Ein weiterer relevanter Thrombozytenmarker ist das CD62. Dieses Antigen wird als P-Selectin oder GMP-140 bezeichnet und gehört wie das E-Selectin (CD62 E) und das L-Selectin zu der Familie der Selectine. Dabei handelt es sich um ein Glykomembranprotein, das man in den α-Granula nicht aktivierter Thrombozyten findet, und welches bei Aktivierung und Exozytose dieser Speichergranula schließlich membranständig wird. Somit eignet sich die CD62-Expression als Maß für die Thrombozytenaktivierung [10,43,90,127,143]. Wir verwendeten Antikörper gegen CD62, die mit PE markiert waren (CD62-PE, Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, NJ, USA). Daneben wurden als Negativkontrolle auch Kontrollantikörper zur Isotypenkontrolle eingesetzt. Die Isotypenkontrolle dient dem Nachweis einer unspezifischen Bindung von Antikörpern auf der Zelloberfläche, allerdings gibt sie über eine unspezifische Assoziation der Antikörper mit den Zielzellen nur bedingt Aufschluss. Man definiert eine Obergrenze von 1-5% der Zellen, die in dem Untersuchungsmaterial mit dem Antikörper reagieren. In dieser Studie wurde als Kontrollantikörper IgG1-PE (γ1 PE, Becton Dickinson, San Jose, USA) verwendet. Im Durchflusszytometer wurden FSc, SSc und Fluoreszenzen gemessen, wobei Standardgeräte in der Regel mindetsens zwei Fluoreszenzen, FITC und PE, detektieren. Mittels einer Software, welche zwei Parameter gegeneinander in logarhythmischem Maßstab graphisch abbildet, erfolgt die Auswertung (dot plot). Tabelle 3: Schema einer Dot-Plot-Auswertung durchflusszytometischer Daten X-Achse SSc * Y-Achse FSc † * SSc = Side Scatter † FSc = Forward Scatter 40 Die Messergebnisse werden im Listenformat (list mode) aufgenommen. Eine Zelle nach der anderen wird erfasst und mehrere unabhängige Zelleigenschaften werden gespeichert, was den Vorteil bietet, dass wiederholte Datenauswertungen nach verschiedenen Kriterien möglich sind. Tabelle 2 fasst zusammen wie man die Daten graphisch darstellen kann, zum Beispiel anhand eines Zweiparameter-Punktehistogramms (dot plot), wo jeder Punkt eine Zelle mit beiden Eigenschaften darstellt [118]. Tabelle 4: Datenkombinationen zur Berechnung von Histogrammen 1. Zelle 2. Zelle FSc † SSc * FSc † SSc * FSc † CD41 FSc † CD41 FSc † CD62 FSc † CD62 CD41 CD62 CD41 CD62 * SSc = Side Scatter † FSc = Forward Scatter Durchführung Das Ausgangsmaterial für die Durchflusszytometrie wurde unter Verwendung eines CTAD-Blutröhrchens gewonnen. Zunächst wurde die Probe bei 3000 U/min für zehn Minuten zentrifugiert, um ein plättchenreiches Plasma (PRP) zu gewinnen (Zentrifuge: Hettich Zentrifugen Rotina 48S). Anschließend wurde die Thrombozytenzahl mittels des Sysmex-Zellcounter K1000 bestimmt. Falls das hergestellte Plasma noch andere Zellbestandteile enthielt, wurde zwei Minuten lang bei 3000 U/min nachzentrifugiert und erneut die Thrombozytenzahl gemessen. In einem Reagenzröhrchen (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) wurde dann ein Thrombozytenkonzentrat mit einer Zellzahl von 10.000 Plättchen pro Mikroliter hergestellt (Röhrchen TE), die angewandte Formel hierfür lautet: 41 Der Volumenanteil der Probe (x) wurde mit PBS auf 1000 l aufgestockt (y: Volumenanteil an PBS). PBS (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) steht für phosphate buffered solution und ist eine phosphatgepufferte Lösung, die kein Calcium und Magnesium enthält. Im nächsten Schritt wurden zwei Ansätze in zwei weitere Reagenzröhrchen pipettiert: Ein Kontrollansatz (Thrombozytenkontrolle = TK) und ein Ansatz mit CD62-markierten Antikörpern (Thrombozyten + Antikörper = TA). In jedes Röhrchen wurden 5 l des Antikörpers CD41-FITC gegeben. Dem Röhrchen TA wurden dann 5l des Antikörpers CD62-PE hinzugefügt. In das Röhrchen TK pipettierten wir 5l des Kontrollantikörpers IgG1-PE, der zuvor in einem separaten Röhrchen (TV) mit PBS 1:10 verdünnt wurde. Zuletzt wurde beiden Ansätzen 180l PBS und 320l des hergestellten Thrombozytenkonzentrats TE zugegeben. Tabelle 5: Pipettierschema zur Durchflusszytometrie Röhrchen Röhrchen Röhrchen Röhrchen TE TV TK TA Thrombozyten- Kontrollantikörper lgG-PE in Verdünnung 1:10 Thrombozyten- Thrombozyten + Antikörper einstellung 1000 µl (PRP+PBS) 10.000 Thrombozyten/µl 45 µl PBS 5 µl lgG-PE Kontrolle 5 µl CD 41-FITC 5 µl CD 41-FITC 5 µl lgG1-PE 5 µl CD62-PE 180 µl PBS 180 µl PBS 320 µl TE 320 µl TE 42 Nach sorgfältigem Durchmischen wurden beide Ansätze 30 Minuten im Dunkeln bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach fanden die Messungen mittels Duchflusszytometer (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, USA) statt. Dabei wurden 10.000 Thrombozyten erfasst. Die Daten wurden mit Hilfe der Software Cell Quest ausgewertet, wobei die Ergebnisse CD62-positiver Zellen als Prozentsatz aller Zellen ausgedrückt wurden. 3.4 Quantitative Bestimmung der Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF und TGF-β1 mittels ELISA 3.4.1 Vorbereitung der Proben Für die Bestimmung von PDGF-AB, TGF-ß und VEGF im Plasma wurden jeweils 2,7 ml Venenblut in zwei CTAD-Röhrchen entnommen. Nach 15 Minuten wurden die CTAD-Röhrchen zentrifugiert (10 Minuten, 3000 U/min) und aus dem mittleren Drittel des Plasmaüberstandes 500 µl Plasma entnommen, welches bis zur weiteren Bearbeitung und Messung bei –70C eingefroren wurde. CTAD-Röhrchen enthalten eine gepufferte Citratlösung mit den Zusätzen Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol. CTAD stabilisiert die Thrombozyten und verhindert die Freisetzung von Plättchenfaktoren in das Plasma. Theophyllin und Dipyridamol inhibieren die Aktivität der cAMP- Phosphodiesterase, Adenosin stimuliert die membranständige Adenylatcyclase. Daraus ergibt sich eine weitestgehende Reduktion der Plättchenaktivierbarkeit in CTAD-Blut [92]. Der Inhalt eines der beiden Citrat-Röhrchen (Citratpufferlösung bindet Kalziumionen und antikoaguliert somit Blutproben) wurde mit einem Lysepuffer vermischt. Dabei wurde 1ml Vollblut mit 9 ml Triton-X100 zusammenpipettiert und nach vollständiger Lyse für die kommenden Auswertungen bei einer Temperatur von -70°C konserviert. Nach erfolgter Lyse lassen sich Rückschlüsse auf die intrazelluläre Konzentration der in den Thrombozyten gespeicherten Wachstumsfaktoren ziehen. Bildet man die Differenz aus frei 43 zirkulierenden Wachstumsfaktoren und der Konzentration des Lysats, erhält man die intrazelluläre, thrombozytäre Wachstumsfaktorenkonzentration. 3.4.2 Testprinzip Für die Bestimmung der Konzentration der Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF und TGF-β1 wurden ELISAs (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) durchgeführt. ELISAs basieren auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, mit der man Antigene, Moleküle, die ein bestimmtes Antigen tragen, oder Antikörper nachweisen kann. Bei der quantitativen Sandwich-Technik zum Nachweis von Antigenen auf Wachstumsfaktoren sind in den Vertiefungen („wells“) einer Mikrotiterplatte Antikörper gegen bestimmte Epitope der jeweiligen Wachstumsfaktoren gebunden. Enthält die anschließend zugegebene Thrombozytenlösung nun entsprechende Wachstumsfaktoren, binden diese mit ihren Epitopen an die an die Gefäßwand fixierten Antikörper. An die Inkubationszeit schließt sich ein Waschvorgang an. In der Folge wird der Ansatz zum Nachweis des Antigen-Antikörperkomplexes mit einem weiteren enzymkonjugiertem Antikörper (Konjugat) versetzt, der gegen ein weiteres Epitop der gebundenen Substanz gerichtet ist. Dieser zusätzliche Antikörper ist an seinem konstanten Ende, dem Fc-Teil, direkt mit einem Enzym gekoppelt. Nach erneuter Inkubationszeit werden ungebundene Bestandteile wiederholt ausgewaschen. Durch Zugabe einer Substratlösung, die von dem gekoppelten Enzym umgesetzt wird, findet nun eine Farbreaktion statt, deren Intensität proportional zu der Menge an gebundenen Wachstumsfaktoren ist. Diese Reaktion wird nach einem definierten Zeitraum mittels einer Stop-Lösung beendet. Daran schließt sich die photometrische Auswertung mit Ermittlung der Extinktionswerte an, die, dank eingesetzter Standardlösungen mit bekannter Antigenkonzentration, die Berechnung einer Standardkalibrationskurve erlaubt. Die in dieser Studie verwendeten ELISAs zur Bestimmung von PDGF, TGFß1 und VEGF wurden mittels Quantikine-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), die als Solid Phase ELISAs in der Sandwich-EnzymeImmuno-Assay-Technik angeboten werden, durchgeführt. Sämtliche Proben wurden vor der Bearbeitung bei Raumtemperatur aufgetaut. 44 3.4.3 PDGF-AB Zu Beginn wurde eine Verdünnungsreihe aus Standard und dem vom Hersteller vorgegebenen Diluent (RD1X) angesetzt. Die Ausgangslösung entspricht dem höchstkonzentrierten Standard mit 2.000 pg/ml, das gemischt wird aus 100 µl eines Standards mit 20.000 pg/ml und 900 µl Diluent. Um die verbleibenden Verdünnungen mit den absteigenden Konzentrationen 1.000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml und 31,2 pg/ml zu erhalten, wurden zu jeweils 500 µl Diluent anschließend 500 µl des nächsthöheren Standards pipettiert. Das Diluent selbst diente als Nullstandard (0 pg/ml). Nun wurden in jedes Well der Mikrotiterplatte 100 µl Assay Diluent RD1X pipettiert, danach folgten 100 µl der 50fach verdünnten Proben (10 µl Probe und 490 µl Diluent). Die Standard- und Serumproben wurden jeweils im doppelten Ansatz pipettiert. Nach dreistündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde viermal gründlich mit 400 µl Spülpuffer gewaschen. Von dem in diesem Fall mit dem Enzym Peroxidase gekoppelten polyklonalen Antikörper gegen PDGF-AB wurden 200 µl zugefügt. Nach erneuter Inkubationzeit von einer Stunde schlossen sich fünf sorgfältige Waschvorgänge an. Sodann gab man dem Ansatz 200 µl Substrat zu, das sich aus zwei Lösungen (Color Reagent A und B), die Wasserstoffperoxid und stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidin) enthalten, zusammensetzt. Die folgende 30-minütige Inkubationszeit erfolgte im Dunkeln. Daraufhin wurden je 50 µl Stopplösung, in diesem Fall Schwefelsäure (2N), auf die Testfelder aufgetragen. Die photometrische Messung und Auswertung erfolgte anhand eines ELISA-Readers bei 450 nm Wellenlänge, die Software (Dynex TMS2.22, Dynex, Denkendorf) rechnete die Konzentration in pg/ml mit Hilfe einer Standardkurve aus [60]. 3.4.4 TGF-β1 Vor der Durchführung des ELISA musste das latente TGF-β1 zunächst mit Hilfe zweier Lösungen in die immunreaktive Form überführt werden. Dazu werden 100 µl der Probenlösung mit 100 µl eines Gemisches von 2,5 N Essigsäure und 10 M Harnstoff aktiviert. Nach zehnminütiger Ínkubationsphase bei Raumtemperatur wurde die Probe mit 100 µl 2,7 N Natronlauge (NaOH) 45 und 1 M Hydroxyethylpiperazin-N`-2-Ethansulfonsäure (HEPES) neutralisiert und daraufhin mit dem Diluent 10fach verdünnt (50 µl aktivierte Probe und 450 µl Diluent). Analog zum Assay für PDGF-AB wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt. 500 µl des Standards mit 2.000 pg/ml wurden mit 500 µl Diluent (RD1-73) gemischt, wobei eine Konzentration von 1.000 pg/m erreicht wurde. Die verbleibenden Verdünnungen erfolgten entsprechend. Das Diluent diente als Nullstandard (0 pg/ml). Nun wurden 200 µl Standard, Kontrolle oder aktivierte Probe in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Im Anschluss daran wurden nach dreistündiger Inkubationszeit und dreimaligem Waschen 200 µl des konjugierten polyklonalen Antikörpers zugegeben. Wiederum eineinhalb Stunden später und nach neuerlichem dreimaligem Waschen wurden 200 µl des bereits beim PDGF-AB-ELISA verwendeten Substrats hinzugegeben, dessen Reaktion nach 20 min Inkubieren im Dunkeln mit 50 µl der Stop-Lösung (2N Schwefelsäure) beendet wurde. Die Messung fand analog zum PDGF-AB–ELISA statt, wobei die Ergebnisse noch mit dem Verdünnungsfaktor 30 zu multiplizieren waren. 3.4.5 VEGF Die bereits ausführlich im Rahmen der schon beschriebenen ELISAs dargestellte Verdünnungsreihe wurde auch bei dem VEGF-ELISA hergestellt. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden zunächst 100 µl Assay Diluent RD1W pipettiert, dem 100 µl Standard, Kontrolle oder Probe hinzugefügt wurden. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden und dreimaligem Waschen wurde in jede Vertiefung 200 µl des peroxidase-konjugierten Antikörpers gegeben, darauf folgte eine Inkubationszeit von zwei Stunden und ein erneuter dreimaliger Waschvorgang. Weiterhin erfolgte die Zugabe des bereits erwähnten Substrats und nach 25 Minuten wurden auch diesem Ansatz 50 µl der Stoplösung zugesetzt. Die Messung und Auswertung wurden analog den ELISAs zu PDGF-AB und TGF-β gehandhabt. 46 Tabelle 6: Tabellarische Darstellung des Versuchsablaufs der verschiedenen Wachstumsfaktor-ELISAs PDGF-AB VEGF TGF-ß Probe / Standard zugeben Probe/ Standard zugeben Probe/Standard zugeben 2 h inkubieren 3x waschen 2 h inkubieren 3x waschen 3 h inkubieren 3x waschen Konjugat zugeben Konjugat zugeben Konjugat zugeben 2h inkubieren 3x waschen 2h inkubieren 3x waschen 1,5h inkubieren 3x waschen Substrat zugeben Substrat zugeben Substrat zugeben 20 min. inkubieren 25 min. inkubieren 20 min. inkubieren Stoplösung zugeben Stoplösung zugeben Stoplösung zugeben Messvorgang Messvorgang Messvorgang 47 Statistische Auswertung Die erfassten Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Office Excell 2010 für Windows bearbeitet und anschließend mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows Version 11.5.1 (SPSS, Chicaco, Illinois, USA) ausgewertet. Die Ergebnisse wurden auf Normalverteilung überprüft. Hierbei wurden der Lilliefors- und der Shapiro-Wilks-Test verwendet. Falls keine Normalverteilung vorlag, wurde eine statistische Auswertung mit nichtparametrischen Methoden durchgeführt. Lag eine Normalverteilung vor, wurde, falls geeignet, der T-Test für gepaarte oder ungepaarte Daten verwendet. Die Korrelation zwischen zwei Variablen wurde mit dem PearsonTest überprüft. Als Signifikanzniveau wurde p<0,05 festgelegt. Im Rahmen der Auswertung wurden verschiedene Parameter in Abhängigkeit von dem jeweiligen UICC-Stadium des kolorektalen Karzinoms betrachtet. Dabei wurden sämtliche Tumorstadien auf signifikante Unterschiede untereinander verglichen, um Aussagen über stadiencharakteristische Auffälligkeiten treffen zu können. 48 4. Ergebnisse 4.1 Tumorstadien der Patienten Die für diese Studie benötigten Proben wurden an der Chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen von 47 Patienten gewonnen, die an einem erstmalig diagnostizierten, noch nicht anbehandelten kolorektalen Karzinom erkrankt waren. Die Proben wurden präoperativ bei der stationären Aufnahme entnommen. Bei den Patienten lag folgende Verteilung der Tumorstadien nach UICC-Klassifikation vor: Tabelle 7: Anzahl der Patienten und Stadienverteilung nach UICC UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Summe 15 12 9 11 47 Patientenzahl 4.2 Blutbild Bei der Blutbildanalyse werden im Folgenden die Erythrozytenzahl, der Hämoglobingehalt, der Hämatokrit, die Leukozytenzahl und die Thrombozytenzahl näher betrachtet. 4.2.1 Erythrozyten Hinsichtlich der Erythrozytenkonzentration zeigen sich zwischen den einzelnen Stadien der Tumorerkrankung keine signifikanten Unterschiede. Zwar sinkt die Zahl der roten Blutkörperchen zunächst im Stadium 2, pendelt sich jedoch im weiteren Verlauf auf ein relativ konstantes Niveau ein. 49 Tabelle 8: Erythrozytenkonzentrationen im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 UICC 3 Erythrozyten 4,77±0,41 4,35±0,73 4,43±0,49 [*106/µl] UICC 4 n = 47 4,43±0,68 4,52±0,59 Erythrozyten [*10^6 /µl]; UICC 1 ; 4,77 Erythrozyten [*10^6 /µl]; n = 47; 4,52 Erythrozyten [*10^6 /µl]; UICC 2 ; 4,35 Erythrozyten [*10^6 /µl]; UICC 3 ; 4,43 n = 47 Erythrozyten UICC 1 [*10^6 /µl]; UICC 2 UICC 4 ; 4,43 UICC 3 UICC 4 Abbildung 1: Graphische Darstellung der mittleren Erythrozytenkonzentration in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 50 4.2.2 Hämoglobin Der Hämoglobingehalt zeigt sich bei Patienten im Stadium 2 nach UICC bereits signifikant zu Gruppe 1 erniedrigt. Stadium 3 imponiert im Weiteren durch einen passageren, allerdings nicht signifikanten Hb-Anstieg. Charakteristisch für Stadium 4 ist der zu Stadium 1 deutlich signifikante Abfall des roten Blutfarbstoffes. Tabelle 9: Hämoglobinkonzentrationen im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 Hämoglobin 14,31±1,9 12,44±2,58 13,46±2,22 11,51±2,24 13,02±2,42 [g/dl] § § *‡ § = signifikant vs. UICC 1 * = signifikant vs. UICC 2 ‡ = signifikant vs. UICC 4 Hämoglobin Hämoglobin Hämoglobin Hämoglobin [g/dl]; n = 47; [g/dl]; UICC 1[g/dl]; ; UICC 2[g/dl]; ; ; UICC 3 Hämoglobin 13,02 14,31 13,46 [g/dl]; UICC 4 ; 12,44 11,51 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 2: Graphische Darstellung der mittleren Hämoglobinkonzentration in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 51 4.2.3 Hämatokrit Der Hämatokrit korreliert eng mit dem Hb-Gehalt. Auch dieser Wert fällt beim Vergleich von UICC 1 zu UICC 4 eindeutig ab. Es kommt im Stadium 3, analog dem Verlauf beim Hämoglobin, wieder zu einer kurzfristigen Stabilisierung und somit Erhöhung des Hämatokrits. In UICC 4 findet sich schließlich eine insgesamt ganz klare signifikante Hämatokriterniedrigung. Tabelle 10: Hämatokrit im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 Hämatokrit 41,34±5,18 37,38±7,38 37,8±6,33 36,01±5,79 38,4±6,32 [%] ‡ § ‡ = signifikant vs. UICC 4 § = signifikant vs. UICC 1 Hämatokrit [%]; UICC 1 ; 41,34 Hämatokrit Hämatokrit [%]; n = 47; Hämatokrit[%]; UICC 3 ; 38,4 [%]; UICC 2 ; 37,8 37,38 Hämatokrit [%]; UICC 4 ; 36,01 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 3: Graphische Darstellung der mittleren Hämatokritkonzentration in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 52 4.2.4 MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin) Wie zu erwarten korreliert auch der mittlere korpuskuläre Hämoglobingehalt mit der Hämoglobinkonzentration und dem Hämatokrit. Es zeigt sich ein stadienübergreifend analoger Verlauf mit primärem Abfall in Stadium 2 und sekundärem vorübergehendem Anstieg in Stadium 3. Letztlich resultiert eine Erniedrigung des MCH mit deutliche Signifikanz Tabelle 11 : MCH-Konzentrationen im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 MCH [pg] UICC 2 29,95±2,76 28,4±2,91 ‡ UICC 3 UICC 4 n = 47 30,39±3,43 26,19±3,59 28,76±3,43 ‡ †§ § = signifikant vs. UICC 1 † = signifikant vs. UICC 3 ‡ = signifikant vs. UICC 4 MCH [pg]; n = 45; 28,76 MCH [pg]; UICC 1 ; 29,95 MCH [pg]; UICC 3 ; 30,39 MCH [pg]; UICC 2 ; 28,4 n = 45 UICC 1 MCH UICC 2 [pg]; UICC 4 ; UICC 3 26,19 UICC 4 Abbildung 4: Graphische Darstellung der mittleren MCH-Verteilung in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 53 4.2.5 MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) Bezüglich der mittleren Hämoglobinkonzentration pro Erythrozyt lässt sich eine dem MCH und dem Hämatokrit analoge Korrelationstendenz mit dem Hämoglobinverlauf aufdecken. So findet man in UICC 2 und UICC 4 gegenüber UICC 1 signifikant abgefallene MCHC-Konzentrationen. Bei UICC 3 Patienten kann man wiederum keine Signifikanz bezüglich der passager erhöhten MCHC-Konzentration verbuchen. Tabelle 12: MCHC-Konzentrationen im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung MCHC [g/dl] UICC 1 UICC 2 UICC 3 34,58±0,91 33,38±1,32 33,79±1,21 *‡ § § = signifikant vs. UICC 1 UICC 4 32,71±2,09 33,69±1,54 § * = signifikant vs. UICC 2 ‡ = signifikant vs. UICC 4 MCHC [g/dl]; UICC 1 ; 34,58 MCHC [g/dl]; n = 45; 33,69 MCHC [g/dl]; UICC 2 ; 33,38 MCHC [g/dl]; UICC 3 ; 33,79 n = 45 UICC 1 MCHC UICC 2 [g/dl]; UICC 4 ; UICC 3 32,71 UICC 4 Abbildung 5: Graphische Darstellung der mittleren MCHC-Verteilung in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) n = 47 54 4.2.6 Leukozyten Im Hinblick auf die Leukozytenzahl zeigen sich keine signifikanten Veränderungen zwischen den einzelnen Tumorstadien. Nachdem die Zahl zunächst abfällt, kann man allerdings anschließend eine stetige Zunahme der Leukozyten ausmachen. Tabelle 13: Leukozytenkonzentrationen im jeweiligen vom UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 Leukozyten [*103/µl] Leukozyten [*10^3/µl]; n = 47; 7,83 8,09±2,3 UICC 2 UICC 3 UICC 4 7,03±2,31 7,81±1,07 8,37±3,72 7,83±2,52 Leukozyten [*10^3/µl]; UICC 1 ; 8,09 Leukozyten [*10^3/µl]; UICC 3 ; 7,81 Leukozyten [*10^3/µl]; UICC 4 ; 8,37 n = 47 Leukozyten [*10^3/µl]; UICC 2 ; 7,03 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 6: Graphische Darstellung der mittleren Leukozytenverteilung in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47 n = 47 55 4.2.7 Thrombozyten Mit zunehmendem Tumorstadium erhöht sich auch die Menge an Plättchen kontinuierlich, wobei sich ein signifikanter Anstieg in IUCC 4 gegenüber UICC 1 herauskristallisiert. Tabelle 14: Thrombozytenkonzentrationen im jeweiligen vom UICCStadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung Thrombozyten [*103/µl] UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 N = 47 289,2 ± 79,14 ‡ 296,4 ± 84,66 319,44 ± 163,47 417,09 ± 183,27 § 326,77 ± 135,02 ‡ = signifikant vs. UICC 4 § = signifikant vs. UICC 1 Thrombozyten Thrombozyten Thrombozyten [*10^3/µl]; [*10^3/µl]; n = Thrombozyten [*10^3/µl]; UICC 3 ; 47; 326,77 UICC 2 ; 319,44 [*10^3/µl]; 296,42 UICC 1 ; 289,2 Thrombozyten [*10^3/µl]; UICC 4 ; 417,09 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 7: Graphische Darstellung der mittleren Verteilung an Thrombozyten in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 56 4.3 Gerinnungsfaktoren 4.3.1 Ristocetin Co-Faktor Bezüglich der Konzentration des Ristocetin Co-Faktors lassen sich zwischen den unterschiedlichen Tumorstadien keinerlei Signifikanzen ermitteln. Es ist lediglich ein stetiger Anstieg bis Stadium 3 zu verzeichnen, UICC 4 ist aber eher durch eine deutliche regrediente Verlaufstendenz gekennzeichnet. Tabelle 15: Konzentrationen an Ristocetin Co-Faktor im jeweiligen UICCStadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung Ristocetin Co-Faktor [%] [Norm>60] UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 103,47 ± 33,58 104 ± 14,75 125,11 ± 62,69 106,91 ± 22,93 108,55 ± 35,51 Ristocetin Co- Ristocetin Co- Ristocetin Co- Ristocetin Co- Ristocetin CoFaktor [ % > Faktor [ % > Faktor [%> [ % > Faktor [ % > Faktor 60]; n = 47; 60]; UICC 3 ; 60]; UICC 4 ; 60]; UICC 1 ; 60]; UICC 2 ; 108,55 125,11 106,91 104 103,47 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 8: Graphische Darstellung der mittleren Ristocetin CoFaktor-Konzentration in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 57 4.3.2 Faktor VIII Betrachtet man die prozentualen Werte des Gerinnungsfaktors Faktor VIII zeigen sich stadienabhängig nach UICC-Klassifikation keine nennenswerten Veränderungen. Zwar erhöht sich der Gehalt an Faktor VIII stets im Folgestadium, dies allerdings nicht in signifikantem Maße. Tabelle 16: Konzentrationen an Faktor VIII im jeweiligen UICC Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung Faktor VIII [%] [Norm 70-150] Faktor VIII [% 70-150]; n = 47; 154,6 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 140,13 ± 58,56 151,25 ± 40,74 160,33 ± 46,49 173,27 ± 58,67 154,6 ± 52,21 Faktor VIII [% 70-150]; UICC 3 ; 160,33 Faktor VIII [% 70-150]; UICC 4 ; 173,27 Faktor VIII [% 70-150]; UICC 1 ; 140,13 Faktor VIII [% 70-150]; UICC 2 ; 151,25 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 9: Graphische Darstellung der mittleren Faktor VIIIKonzentration in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 58 4.3.3 Von-Willebrand-Faktor Auch der Gehalt an von-Willebrand-Faktor ist in den diversen Tumorstadien nicht signifikant verändert. Mit zunehmendem UICC-Stadium fällt allenfalls eine progrediente Steigerung der Werte auf. Tabelle 17: Konzentrationen an von-Willebrand-Faktor im jeweiligen UICCStadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung von-WillebrandFaktor [%] [Norm >60] von WillebrandFaktor [% > 60]; n = 47; 169,74 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 160,13 ± 70,86 166,25 ± 51,43 178,89 ± 40,47 179,18 ± 56,73 169,74 ± 56,71 von WillebrandFaktor [% > 60]; UICC 1 ; 160,13 von WillebrandFaktor [% > 60]; UICC 2 ; 166,25 von von WillebrandWillebrandFaktor [% > Faktor [% > 60]; UICC 3 ; 60]; UICC 4 ; 178,89 179,18 n = 47 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 10: Graphische Darstellung der mittleren Konzentration an von-Willebrand-Faktor in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) (Mittelwert) 59 4.4 Durchflusszytometrie CD62 positive Thrombozyten Hinsichtlich der prozentualen Verteilung an CD62 positiven Thrombozyten zeichnen sich stadienabhängig keinerlei Signifikanzen ab, wobei die Werte insgesamt kontinuierlich ansteigen. Tabelle 18: Konzentrationen CD62 positiver Thrombozyten im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 CD62 positive Thrombozyten [%] UICC 2 UICC 3 0,97±0,79 1,31±1,02 1,51±1,34 CD62 positive Thrombozyten [% Gated UR]; CD62 positive n = 46; 1,4 Thrombozyten [% Gated UR]; UICC 1 ; 0,97 CD62 positive Thrombozyten [% Gated UR]; UICC 2 ; 1,31 UICC 4 n = 47 2,07±3,6 1,4±1,88 CD62 positive Thrombozyten CD62 positive [% Gated UR]; Thrombozyten UICC 4 ; 2,07 [% Gated UR]; n = 46 UICC 3 ; 1,51 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 11: Graphische Darstellung der mittleren Konzentration an CD62 positiven Thrombozyten in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 60 4.5 ELISAs der Wachstumsfaktoren 4.5.1 VEGF Der VEGF-Gehalt nimmt sowohl in frei zirkulierender Form im CTAD Plasma als auch nach Inkubation mit dem Lysepuffer Triton X100 von Stadium zu Stadium kontinuierlich, wenn auch nicht in signifikantem Maß, zu. Tabelle 19: VEGF-Konzentrationen im CTAD Plasma und im Triton X100Lysat im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 VEGF CTAD [pg/ml] 15,42 ± 10,5 18,5 ± 9,84 21,76 ± 19,35 24,12 ± 27,61 19,3 ± 16,93 VEGF Lysat [pg/ml] 441,68 ± 256,27 398,03 ± 162,83 380,68 ± 231,92 549,24 ± 521,44 443,09 ± 311,47 600 500 400 VEGF CTAD [pg/ml] 300 VEGF Lysat [pg/ml] 200 100 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 12: Graphische Darstellung der mittleren VEGF-Verteilung im CTAD Plasma und im Triton X100-Lysat in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 61 Auch bezogen auf 105 Thrombozyten zeigen sich die Werte für VEGF zwischen den unterschiedlichen Gruppen keine signifikanten Veränderungen. Es lässt sich eine diskrete Tendenz in Richtung VEGF-Erniedrigung ausmachen. Tabelle 20: VEGF Konzentrationen pro 10e5 Thrombozyten (T) in [pg ], im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 VEGF/105 T 0,15±0,09 0,14±0,05 [pg] UICC 3 UICC 4 N = 47 0,11±0,05 0,13±0,11 0,14±0,07 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 VEGF pro 10e5 T [pg] 0,06 0,04 0,02 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 13: Graphische Darstellung der mittleren Verteilung an VEGF pro 10e5 Thrombozyten (T) in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 62 4.5.2 PDGF-AB In Bezug auf den PDGF-AB-Gehalt imponiert zunächst eine massive, allerdings nicht signifikante Erniedrigung im Stadium 2 gegenüber Stadium 1. Die Werte hierbei und in den Folgestadien weisen sowohl im CTAD-Plasma, als auch Triton-Lysat einen fast korrespondierenden Verlauf auf. So steigen die Konzentrationen anschließend in den Stadien 3 und 4 kontinuierlich an, im Triton-Lysat darüber hinaus sogar in signifikantem Maße. Tabelle 21: PDGF-AB-Konzentrationen im CTAD Plasma und im Triton X100-Lysat im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 n = 47 PDGF-AB CTAD [pg/ml] 764,86 ± 725,56 463,89 ± 281,74 594,06 ± 816,22 651,09 ± 515,12 628,96 ± 601,39 PDGF-AB Lysat [pg/ml] 23439,64 ± 24272,88 12021,21 ± 5623,02 ‡ 14859,79 ± 11235,96 21404,75 ± 18471,22 ± 16002,85 * = signifikant vs. UICC 2 8995,65 * ‡ = signifikant vs. UICC 4 63 600 500 400 VEGF CTAD [pg/ml] 300 VEGF Lysat [pg/ml] 200 100 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 14: Graphische Darstellung der mittleren Verteilung an PDGF-AB im CTAD Plasma und im Triton X100-Lysat in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) Bezogen auf 105 Thrombozyten lässt sich eine ähnliche Tendenz herausfiltern. Primär findet man in UICC 2, verglichen mit UICC 1, einen relativ starken, nicht signifikanten PDGF-AB-Abfall, während die Werte bei fortgeschrittener Erkrankung bis UICC 4 wieder deutlich, wenn auch nicht signifikant, zunehmen. Tabelle 22: PDGF-AB-Konzentrationen pro 10e5 Thrombozyten (T) in [pg ], im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 PDGF-AB/105T [pg] UICC 2 UICC 3 UICC 4 8,11±8,14 4,13±1,61 4,16±2,19 5,61±2,81 n = 47 5,79±5,22 64 9 8 7 6 5 PDGF-AB pro 10e5 T [pg] 4 3 2 1 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 15: Graphische Darstellung der mittleren PDGF-AB- Verteilung pro 10e5 Thrombozyten (T) in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 4.5.3 TGF-β Die Werte an frei zirkulierendem und durch Lyse freigesetztem TGF-β verhalten sich korrespondierend. So sinkt die Konzentration zunächst im Stadium 2 jeweils ab, in Stadium 3 lässt sich jeweils ein Anstieg ausmachen. In Stadium 4 zeigt sich ein erneuter Konzentrationsabfall. Im TGF-β-Lysat sind die genannten Veränderungen darüberhinaus ab Stadium 2 als signifikant zu werten. Zusammenfassend kommt es also zu einer deutlichen Konzentrationserniedrigung an TGF-β. Tabelle 23: TGF-β-Konzentrationen im CTAD Plasma und im Triton X100Lysat im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung TGF-β CTAD [pg/ml] UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 N = 47 20,92 ± 19,95 15,11 ± 5,44 20,74 ± 21,3 17,34 ± 10,51 18,47 ± 15,32 65 TGF-β Lysat [pg/ml] 1730,2 ± 522,69 ‡ 1525,25 ± 401,44 † 2168,42 ± 912,39 ‡ * 1187,15 ± 367,1 † § 1632,77 ± 625,22 § = signifikant vs. UICC 1 * = signifikant vs. UICC 2 † = signifikant vs. UICC 3 ‡ = signifikant vs. UICC 4 2500 2000 1500 TGF-β CTAD [pg/ml] TGF-β Lysat [pg/ml] 1000 500 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 16: Graphische Darstellung der mittleren TGF-β-Verteilung im CTAD Plasma und im Triton X100-Lysat in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) Hinsichtlich des TGF-β-Gehalts bezogen auf 105 Plättchen zeichnet sich zunächst ein dem CTAD Plasma- und Lysatwerten analoger Verlauf aus Abfall in UICC 2 und nachfolgendem Anstieg in UICC 3 ab. Bei Patienten mit UICCStadium 4 lässt sich dann schließlich eine jeweils gegenüber allen anderen Stadien klar signifikante Erniedrigung der TGF-β-Konzentration nachweisen. 66 Tabelle 24: TGF-β-Konzentration pro 10e5 Thrombozyten (T) in [pg] im jeweiligen UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv(n=47), angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung UICC 1 TGF-β / 105 T [pg] UICC 2 UICC 3 0,64±0,24 ‡ 0,55±0,22 ‡ 0,72±0,46 ‡ UICC 4 N = 47 0,35±0,23 *†§ 0,57±0,3 § = signifikant vs. UICC 1 * = signifikant vs. UICC 2 † = signifikant vs. UICC 3 ‡ = signifikant vs. UICC 4 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 TGF-β pro 10e5 T [pg] 0,3 0,2 0,1 0 n = 45 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 Abbildung 17: Graphische Darstellung der mittleren Verteilung an TGF-β pro 10e5 Thrombozyten (T) in den einzelnen Tumorstadien nach UICC und im Gesamtkollektiv (n=47) 67 4.6. Tabellarische Darstellung aller Ergebnisse Tabelle 25: Mittelwerte der analysierten Parameter ± einfacher Standardabweichung mit Signifikanzdarstellung bezogen auf das jeweilige UICC-Stadium und im Gesamtkollektiv (n=47) UICC 1 UICC 2 UICC3 UICC 4 (n=47) Erythrozyten [*106/µl] 4,77 ± 0,41 4,35 ± 0,73 4,43 ± 0,49 4,43 ± 0,68 4,52 ± 0,59 Leukozyten [*103/µl] 8,09 ± 2,3 7,03 ± 2,31 7,81 ± 1,07 8,37 ± 3,72 7,83 ± 2,52 Hb [g/dl] 14,31 ± 1,9 *‡ 12,44 ± 2,58 § 13,46 ± 2,22 11,51 ± 2,24 § 13,02 ± 2,42 Hkt [%] 41,34 ± 5,18 ‡ 37,38 ± 7,38 37,8 ± 6,33 36,01 ± 5,79 § 38,4 ± 6,32 Thrombozyten [*103/µl] 289,2 ± 79,14 ‡ 296,42 ± 84,66 319,44 ± 163,47 417,09 ± 183,27 § 326,77 ± 135,02 MCH [pg/Zelle] 29,95 ± 2,76 ‡ 28,4 ± 2,91 30,39 ± 3,43 ‡ 26,19 ± 3,59 †§ 28,76 ± 3,43 MCHC [g/dl] 34,58 ± 0,91 *‡ 33,38 ± 1,32 § 33,79 ± 1,21 32,71 ± 2,09 § 33,69 ± 1,54 103,47 ± 33,58 104 ± 14,75 125,11± 62,69 106,91 ± 22,93 108,55 ± 35,51 Ristocetin Co-Faktor [%] 68 UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4 (n=47) Faktor VIII [%] 140,13 ± 58,56 151,25 ± 40,74 160,33 ± 46,49 173,27 ± 58,67 154,6 ± 52,21 vWF [%] 160,13 ± 70,86 166,25 ± 51,43 178,89 ± 40,47 179,18 ± 56,73 169,74 ± 56,71 0,97 ± 0,79 1,31 ± 1,02 1,51 ± 1,34 2,07 ± 3,6 1,4 ± 1,88 VEGF CTAD ǁ [pg/ml] 15,42 ± 10,5 18,5 ± 9,84 21,76 ± 19,35 24,12 ± 27,61 19,3 ± 16,93 PDGF CTAD ǁ [pg/ml] 764,86 ± 725,56 463,89 ± 281,74 594,06 ± 816,22 651,09 ± 515,12 628,96 ± 601,39 TGF-ß CTAD ǁ [pg/ml] 20,92 ± 19,95 15,11 ± 5,44 20,74 ± 21,3 17,34 ± 10,51 18,47 ± 15,32 VEGF Lysat ¶ [pg/ml] 441,68 ± 256,27 398,03 ± 162,83 380,68 ± 231,92 549,24 ± 521,44 443,09 ± 311,47 PDGF Lysat ¶ [pg/ml] 23439,64 ± 24272,88 12021,21 ± 5623,02 14859,79 ± 11235,96 CD62 (+) Thrombozyten [%] UICC 1 ‡ UICC 2 21404,75 ± 8995,65 18471,22 ± 16002,85 * UICC 3 UICC 4 (n=47) 69 TGF-ß Lysat ¶ [pg/ml] 1730,2 ± 522,69 ‡ 1525,25 ± 401,44 † 2168,42 ± 912,39 ‡* 1187,15 ± 367,1 †§ 1632,77 ± 625,22 VEGF / 105T ** [pg] 0,15 ± 0,09 0,14 ± 0,05 0,11 ± 0,05 0,13 ± 0,11 0,14 ± 0,07 PDGF / 105T ** [pg] 8,11 ± 8,14 4,13 ± 1,61 4,16 ± 2,19 5,61 ± 2,81 5,79 ± 5,22 TGF-ß / 105T ** [pg] 0,64 ± 0,24 ‡ 0,55 ± 0,22 ‡ 0,72 ± 0,46 ‡ 0,35 ± 0,23 *†§ 0,57 ± 0,3 § = signifikant vs. UICC 1 * = signifikant vs. UICC 2 † = signifikant vs. UICC 3 ‡ = signifikant vs. UICC 4 ǁ = Konzentration an jeweils frei zirkulierendem Wachstumsfaktor im CTAD Plasma ¶ = Konzentration des jeweiligen Wachstumsfaktors im Triton-Lysat ** = Konzentration des jeweiligen Wachstumsfaktors bezogen auf 105 Thrombozyten 70 5. Diskussion Thrombozyten interagieren mit einer Vielzahl zirkulierender und ortsständiger Mediatoren und nehmen im Rahmen der Hämostase, der Wundheilung, der Geweberegeneration und der Angiogenese wichtige Funktionen wahr. Sie sind in der Lage, diverse Modulatoren und aktive Verbindungen zu sezernieren, die in spezifischen Organellen gespeichert werden. Die α-Granula der Thrombozyten enthalten auch die Wachstumsfaktoren VEGF, TGF-β und PDGF-AB, die in dieser Studie näher betrachtet wurden, und unter anderem auch bei der Thrombozytenaggregation via Exozytose freigesetzt werden. Diese Wachstumsfaktoren stimulieren sowohl die Proliferation von Fibroblasten und/oder glatten Muskelzellen als auch die Reifung von Vorläuferzellen zu funktionsfähigen reifen Zellen [120]. Die Messung von zirkulierendem VEGF hat bei einem breiten Spektrum maligner Erkrankungen einen diagnostischen und prognostischen Stellenwert. So korreliert eine gesteigerte VEGF-Expression mit einem erhöhten Vaskularisationsgrad sowie einer schlechteren Prognose bei Brust-, Magen- und Blasen-Karzinomen [12]. VEGF ist ein bedeutender Faktor bei physiologischer und pathologischer Angiogenese im Rahmen der Wundheilung, der Embryogenese und des Wachstums allgemein [80]. Auch bei der Progression und Metastasierung von Tumoren ist die Angiogenese entscheidend, da ohne adäquate Nutrition eine Tumorgröße von 1-2 mm nicht überschritten werden kann [87]. Umso bemerkenswerter ist, dass bei Krebspatienten erhöhte VEGF-Spiegel und ein gesteigerter VEGF-Gehalt der Thrombozyten gefunden wurden [12,51]. Neben VEGF wird auch PDGF-AB bei zahlreichen Tumorentitäten vermehrt exprimiert. Thrombozytäre Wachstumsfaktoren bei malignen Erkrankungen, unter anderem auch dem kolorektalen Karzinom, sind wegen dieser Zusammenhänge Gegenstand intensiver Forschung. Da jedoch kontrovers über das am besten geeignete Medium zur Messung dieser Wachstumsfaktoren diskutiert wird, muss man sich zunächst näher mit dieser Frage auseinandersetzen. Manche Autoren plädieren für die Messung von Wachstumsfaktoren im Serum, da deren Konzentration in Serum höher sei als in Plasma, sowohl bei Krebspatienten als auch in Kontrollgruppen, 71 denn Wachstumsfaktoren werden aus aktivierten Plättchen während des Gerinnungsprozesses freigesetzt [29,119,131,158]. Dagegen gelangen andere Autoren zum dem Schluss, dass die In-vitro-Freisetzung dieser Faktoren während des Gerinnungsprozesses eine präanalytische Fehlerquelle sei, und empfehlen nur Plasma zur Messung zirkulierender Wachstumsfaktoren [12,74]. Während die Frage, ob Serum oder Plasma zur Messung zu bevorzugen sei, in der Literatur schon intensiv diskutiert wurde, fand die Frage, welches Plasma sich gegebenenfalls am besten eigne, viel weniger Beachtung [82]. Um reproduzierbare Aussagen über die in vivo extrazellulär zirkulierende Menge an Wachstumsfaktoren treffen zu können, muss die Gerinnung und die Aktivierung der Thrombozyten in der Probe weitestgehend unterbunden werden. Jelkmann et al. hielten die Verwendung der Antikoagulantien EDTA und Citrat für äquivalent, obwohl die Plättchen in mit diesen Antikoagulantien versetztem Blut aktivierbar bleiben [74,113]. Andere Autoren sehen nur CTAD als geeignetes Antikoagulans, CTAD-Plasma also als das beste Material zur Messung des VEGF-Gehalts. So beschrieben unter anderem Neufeld et al. bei der Verwendung von CTAD als Antikoagulans die effektivste Blockierung der In-vitro-Aktivierung von Plättchen [107,164]. Zimmermann et al. widmeten sich dieser Fragestellung genauer und konnten zeigen, dass CTAD-Plasma die In-vitro-Freisetzung von Wachstumsfaktoren, im Gegensatz zu allen anderen bisher genutzten Medien, nahezu komplett blockiert [169]. Deshalb wird für Messungen zirkulierender Wachstumsfaktoren mit dem Ziel, nur die in vivo freigesetzten Moleküle zu erfassen, ausschließlich die Verwendung von CTAD-Plasma empfohlen. EDTA-Plasma sollte demnach für die Messung zirkulierender thrombozytärer Wachstumsfaktoren keinesfalls verwendet werden [169]. Zur Bestimmung des Gesamtgehalts löslicher und zellulärer Wachstumsfaktoren empfiehlt sich, die Analyse nach Zelllyse der Plättchen durchzuführen. In der Literatur wird am häufigsten die Lyse von Thrombozyten mittels mehrerer Zyklen von Einfrieren und Auftauen beschrieben. Zimmermann et al. zeigten jedoch, dass die Lyse mit dem Lysepuffer Triton X-100 noch deutlich mehr Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten freisetzt [167]. Möglicherweise 72 verbleiben beim Einfrieren und Auftauen viele intrazelluläre Moleküle in Mikrovesikeln, die beim Einfrieren und Auftauen nicht platzen. Das Detergens Triton X-100 löst dagegen alle Membranen zuverlässig auf und bringt alle Moleküle, die intrazellulär sind, in Lösung. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Frage, wie sich die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β bei Patienten mit kolorektalem Karzinom in Abhängigkeit vom jeweiligen Tumorstadium verhalten, und inwieweit die Ergebnisse Rückschlüsse auf die Tumorlast, die Prognose und die Erkennung von Metastasen zulassen. Daneben wurden weitere Parameter wie die Erythrozyten-, Leukozyten- und Thrombozytenzahl, die Hämoglobinkonzentration, der Hämatokrit, das MCV, das MCHC, sowie die Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren Faktor VIII, von-Willebrand-Faktor und Ristocetin-Cofaktor untersucht. Ziel war es, signifikante Korrelationen herauszufiltern und eine mögliche Eignung bestimmter Parameter zur eventuell künftigen Etablierung im Rahmen von Screeningtests zur Rezidiv- und/oder Metastasenfrüherkennung bei Patienten mit kolorektalem Karzinom festzustellen. Es wurden daher Blutproben von insgesamt 47 Patienten bei Diagnosestellung eines kolorektalen Karzinoms in unterschiedlichen Stadien nach der UICC-Klassifikation auf oben genannte Parameter untersucht. Die Durchflusszytometrie ist geeignet, die Menge bereits spontan in vivo aktivierter Plättchen zu bestimmen [98,127]. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass antigenpositive Plättchen eventuell nur sehr wenig Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren, was durch eine unvollständige Degranulation zu erklären ist. Es kann also nicht zwischen einer leichten und einer starken Aktivierung mit unvollständiger bzw. vollständiger Degranulation der α-Granula unterschieden werden. Bei den hier untersuchten Patienten mit kolorektalen Karzinomen fällt eine zwar nicht signifikant, aber dennoch von Stadium zu Stadium kontinuierlich steigende Expression an CD62-positiven Plättchen auf, die auch mit der zunehmenden absoluten Thrombozytenzahl korreliert. Hinsichtlich der Parameter des kleinen Blutbildes lassen sich Veränderungen der Hämoglobinkonzentration, des Hämatokrits, der Erythrozytenzahl, des MCH- und des MCHC-Wertes feststellen. Dabei kommt es vom UICC- 73 Stadium 1 bis zum Stadium 4 zu einem signifikanten Abfall der Werte im Sinne einer zunehmenden hypochromen Anämie bei fortgeschritteneren Tumorstadien. Da entgegengesetzt dazu die Thrombozytenzahl in signifikantem Maße ansteigt und es zudem zu einer kontinuierlichen Erhöhung der Leukozytenzahl kommt, könnte eine reduzierte Erythropoese zugunsten einer gesteigerten Megakaryo- und Leukozytopoese angenommen werden. Der ursächliche Mechanismus dürfte darin zu suchen sein, dass Eisenmangelanämie im Rahmen von intestinalen Tumorblutungen bei den betroffenenen Patienten zu erhöhten Erythropoietinspiegeln führen dürfte. Erythropoietin wiederum stimuliert nicht nur die Erythropoese, sondern auch die Thrombopoese. Des Weiteren findet sich in fortgeschritteneren Tumorstadien eine Leukozytose als Zeichen einer Akute-Phase-Reaktion. Auch Leukozyten enthalten Wachstumsfaktoren, die man in Thrombozyten finden kann. So beeinflusst beispielsweise das Ausmaß der Kontamination von Plättchenkonzentraten mit Leukozyten die Messungen thrombozytärer Wachstumsfaktoren erheblich [167,168]. Dies ist bei der Interpretation der Werte zirkulierender Wachstumsfaktoren zu bedenken. Die Ergebnisse bezüglich der Gerinnungsfaktoren weisen bei keinem der untersuchten Proteine signifikante Veränderungen in Abhängigkeit vom Tumorstadium auf. Es bleibt aber festzuhalten, dass die Konzentrationen an von-Willebrand-Faktor mit fortschreitendem UICC-Stadium tendenziell ansteigen. Diese Tatsache ist nicht verwunderlich, da die stadienabhängig zunehmenden VEGF-Werte, die Endothelzellen zur Freisetzung des vonWillebrand-Faktors stimulieren und die Expression von Gewebefaktoren in Monozyten und Endothelzellen anregen [99]. In allen 4 Tumorstadien lagen die gemessenen vWF-Werte deutlich über 100 % dem Durchschnittswert von Blutproben von gesunden Kontrollpersonen. Dieser Befund stimmt mit den Ergebnissen einer kürzlich publizierten Arbeit überein: Wang et al. beschrieben ebenfalls gegenüber Kontrollpersonen erhöhte vWF-Werte bei fortgeschrittenen Stadien des kolorektalen Karzinoms, ohne signifikante Differenzen zwischen den Tumorstadien Dukes A, B und C zu finden [161]. Diese Autoren zogen aus ihren Daten dennoch den Schluss, die vWF-Spiegel bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen könnten prognostisch ausssagekräftig sein. Diese Schlusssfolgerung wurde schon in einem Editorial zur Publikation 74 bezweifelt [55], und unsere Daten bestätigen, dass sich diese Schlussfolgerung nicht ziehen lässt. Auch die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII nimmt stadienabhängig tendenziell zu. Dies ist durch das erhöhte Vorhandensein des von-WillebrandFaktors erklärbar, denn dieser geht mit dem Faktor VIII des intrinsischen Gerinnungssystems eine Bindung ein und schützt letzteren so vor vorzeitiger Proteolyse [23,139,140]. Die Aktivität des vWF ausgedrückt als RistocetinCoFaktor steigt von UICC-Stadium 1 bis 3, wogegen in den Stadien 1 und 4 etwa gleich hohr Aktivitäten gemessen wurden. Hohe Werte des vWF und des Faktor VIII könnten das Anwachsen von Metastasen begünstigen, sodass man unter Umständen eine medikamentöse Senkung als supportive Therapiemaßnahme diskutieren kann [151]. Auch andere Autoren beschrieben erhöhte Faktor-VIII-Aktivitäten bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen im Vergleich zu gesunden Vergleichspersonen [15]. Wie auch für den vWF gilt für den Faktor VIII folgendes: Die mittleren Faktor-VIII-Aktivitäten liegen in allen 4 Tumorstadien deutlich über 100 %, dem Durchschnittswert von Blutproben von gesunden Kontrollpersonen, ohne dass sich signifikante Unterschiede zwischen den Tumorstadien zeigen. Damit hat auch die Bestimmung der Faktor-VIII-Aktivität im Einzelfall keine prognostische Aussagekraft [135]. Außerdem untersuchten wir die Blutproben von Patienten mit neu diagnostizierten colorektalen Karzinomen jeweils auf ihren Gehalt an den Wachstumsfaktoren VEGF, PDGF-AB und TGF-β mittels ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Dabei ließen sich einige interessante Beobachtungen machen. Die Konzentration des außerhalb von Thrombozyten frei im Plasma zirkulierenden VEGF nahm in unserer Patientengruppe vom UICC Stadium 1 bis zum Stadium 4 kontinuierlich zu. Nach Inkubation mit dem Lysepuffer Triton X100 fanden sich in den Lysaten ebenfalls im Stadium 4 die höchsten Werte, während die Konzentrationen des VEGF in den Lysaten von Patienten in den Stadien 2 und 3 geringfügig und nicht signifikant niedriger lagen als im Stadium 1. Bezogen auf 105 Thrombozyten ließ sich allerdings überhaupt keine klare Tendenz feststellen. Alle Stadienvergleiche zu VEGF-Konzentrationen 75 in CTAD-Plasma und in den Triton-X-100-Lysaten ergaben keine signifikanten Unterschiede. Der Befund vergleichsweise höherer VEGF-Mengen in den Lysaten von Patienten im UICC-Stadium 4 spiegelt lediglich die höhere Thrombozytenzahl bei diesen Patienten wider. Rahbari et al. beschrieben bei 107 Patienten mit kolorektalen Karzinomen eine negative Korrelation zwischen UICC-Stadium und zirkulierenden VEGFSpiegeln, wobei diese Autoren Serumspiegel maßen und keine Angaben zu den Thrombozytenzahlen ihrer Patienten machten [119]. Peterson et al. berichteten erhöhte VEGF-Konzentrationen in Thrombozyten von Patienten mit colorektalen Karzinomen im Vergleich zu gesunden Probanden, wobei diese Autoren Lysate aus Thrombozytenpellets aus plättchenreichem Plasma der Patienten und der Kontrollpersonen untersuchten [112]. In dieser Arbeit werden die gemessenen VEGF-Konzentrationen auf je 106 Thrombozyten bezogen, obwohl überhaupt keine Angaben zur Thrombozytenzählung und zur Zellzahleinstellung bei der Pelletgewinnung gemacht werden. Interessanterweise ist die Angabe eines Medianwerts von 1,3 pg VEGF pro 10 6 Thrombozyten bei Peterson et al. und der Befund von 0,14 ± 0,07 pg VEGF pro 105 Thrombozyten in der hier vorliegenden Arbeit dennoch sehr ähnlich. Hedge et al. schließlich publizierten jüngst, dass die VEGF-A-Spiegel in Citratplasma prädiktiv für die Prognose von Patienten mit kolorektalen Tumoren, Lungeenkrebs bzww. Nierenkrebs aus drei prospektiven Bevacizumab-Studien gewesen seien, nicht aber prädiktiv für das Ansprechen auf Bevacizumab [63]. Auch in dieser Arbeit erfolgt kein Bezug der Messergebnisse auf die Thrombozytenzahlen der Patienten. Der Vergleich unserer Daten und dieser drei aktuellen Studien zeigt sehr plastisch, dass schon der Terminus des zirkulierenden VEGF völlig unterschiedlich gebraucht wird und dass die Schlussfolgerungen vieler Studien einer kritischen Betrachtung nicht standhalten. Tatsächlich fehlt es an Belegen für eine eigenständige, von der Thrombozytenzahl unabhängige prognostische Bedeutung von frei, aber auch von intrazellulär zirkulierendem VEGF. 76 Im Hinblick auf PDGF-AB findet sich stadienabhängig ein etwas anderer Konzentrationsverlauf. So sind sowohl die Werte des frei zirkulierenden, im CTAD-Plasma gemessenen PDGF-AB als auch die Konzentrationen des PDGF-AB im Triton-Lysat in den UICC-Stadien 2 und 3 deutlich niedriger als in den Stadien 1 und 4, wenngleich die Unterschiede nicht signifikant sind bis auf den Vergleich zwischen den PDGF-AB-Werten in Lysaten in den UICCStadien 2 und 4. Analog dazu verhält sich die PDGF-AB-Konzentration bezogen auf 105 Thrombozyten. Interessant ist auch hierbei der Vergleich unserer Messergebnisse mit denen von Peterson et al. [112]. Wieder ist die Angabe eines Medianwerts von 34,1 pg PDGF pro 106 Thrombozyten bei Peterson et al. und der Befund von 5,79 ± 5,22 pg PDGF-AB pro 105 Thrombozyten in der hier vorliegenden Arbeit durchaus gut vergleichbar. PDGF-AB beeinflusst nach seiner Freisetzung aus Thrombozyten unter anderem die Angiogenese, die durch Aussprossen von Endothelzellen zur Bildung neuer Kapillaren gefördert wird [70]. Nach unseren Daten könnte PDGF-AB nach Anwachsen des Primärtumors zunächst eine untergeordnete Rolle für die Tumorgenese zu spielen und möglicherweise erst bei weit vorangeschrittener Erkrankung und damit verbundenen eventuellen Metastasierungprozessen eine zunehmende Bedeutung erlangen. Ausgehend vom UICC-Stadium 1 fällt die Konzentration an frei zirkulierendem und durch Lyse freigesetztem TGF-β im Stadium 2 zunächst ab. Im Stadium 3 zeigt sich dann wiederum ein relativ starker Anstieg, der im Lysat sogar als signifikant zu werten ist. Anschließend lässt sich im Stadium 4 eine deutliche Konzentrationserniedrigung ausmachen, die im Lysat, verglichen mit Stadium 1 und 3, erneut signifikant ist. Ein analoger Verlauf aus Abfall in UICC 2 und nachfolgendem Anstieg in UICC 3 findet sich auch hinsichtlich der TGF-β-Konzentration bezogen auf 105 Thrombozyten. Bei Patienten mit UICC-Stadium 4 findet man schließlich einen gegenüber allen anderen Stadien signifikant erniedrigten Wert für TGF-β. Da die Thrombozytenkonzentration parallel mit fortschreitendem Tumorstadium signifikant ansteigt, enthalten die einzelnen Plättchen folglich im Stadium 4 wesentlich weniger TGF-β als in frühen Erkrankungsstadien. Diese Ergebnisse geben Anlass zu der Annahme, dass TGF-β für die Progression kolorektaler Karzinome stadienabhängig von variabler Wichtigkeit ist, denn freigesetztes TGF-β 77 vermag konzentrationsabhängig zu einer Proliferationssteigerung oder senkung zu führen [9,30,75,114] und entfaltet seine Wirkung auf verschiedenste Gewebe, wobei es allgemein Zellen mesenchymalen Ursprungs positiv und Zellen ektodermaler Herkunft negativ stimuliert [86]. Die Expression von TGF-β wird also möglicherweise je nach Tumorstadium den jeweiligen Bedürfnissen angepasst. Bei weit vorangeschrittener Erkrankung scheint TGF-β an Bedeutung zu verlieren und fällt stark ab. Daneben reguliert TGF- β auch die Funktion, das Wachstum und die Differenzierung etlicher an der humoralen und zellulären Abwehr beteiligter Zellen [49]. Von niedrigen TGF-β-Spiegeln und einer damit eventuell reduzierten immunologischen Antwort könnte der Tumor folglich noch zusätzlich profitieren. Bei der Interpretation der Konzentrationen der Zytokine PDGF-AB und TGFß ist zusätzlich zum bisher Gesagten noch zu bedenken, dass diese Zytokine nicht nur in Thrombozyten vorkommen, sondern auch in Leukozyten [167,168]. Die im Gegensatz zu dem der Thrombozytenzahl folgenden stadienabhängigen Konzentrationsverlauf von VEGF in Lysaten nicht so eindeutigen Konzentrationsverläufe von PDGF-AB und TGF-ß in den Lysaten können teilweise durch die unterschiedlichen Leukozytenzahlen der Patienten in den 4 UICC-Stadien mitbedingt sein. All diese Beobachtungen deuten hinsichtlich der untersuchten Wachstumsfaktoren eine relativ hohe Plastizität thrombozytärer Reorganisationsvorgänge in unterschiedlichen Erkrankungsstadien an. Während die insgesamt erniedrigten Werte für PDGF-AB und TGF-ß in Lysaten im Spätstadium UICC 4 aus einer geringeren Beladung der einzelnen Thrombozyten mit diesen Zytokinen resultieren könnten, erklärt sich die stadienabhängig kontinuierliche Zunahme von VEGF in Lysaten letztlich durch den signifikanten Konzentrationsanstieg der Plättchen. Vergleicht man schließlich die UICCStadien 1 und 4, kann man die Aussage treffen, dass ein weit fortgeschrittenes Erkrankungsstadium sowohl mit einer signifikanten Erhöhung an aktivierten, CD62-positiven Thrombozyten, als auch mit einer Konzentrationssteigerung der untersuchten Gerinnungsfaktoren und an VEGF einhergeht. Desweiteren korreliert ein spätes Tumorstadium beim kolorektalen Karzinom mit erniedrigten PDGF-AB- und TGF-ß-Spiegeln. 78 In der Zusammenschau aller Ergebnisse können die analysierten Wachstumsfaktoren insgesamt nicht als zuverlässige Parameter für Screeningverfahren bei der Untersuchung von Patienten mit kolorektalem Karzinom eingestuft werden. Lediglich VEGF ließe sich aufgrund seiner mit dem Tumorstadium stetig steigenden Konzentration zur Abschätzung der Tumorlast heranziehen. Weiterhin könnten während der Therapie zunächst stagnierende oder gar rückläufige VEGF-Werte bei einem erneuten Anstieg Hinweise auf eine eventuelle Rezidiv- oder Metastasenbildung liefern, und somit die Notwendigkeit einer Therapieintensivierung anzeigen. Wegen der engen Beziehung zur Thrombozytenzahl ist hier aber die technisch viel einfachere Bestimmung der Thrombozytenzahl vorzuziehen. Zunehmende Thrombozytose ist ein bekannter Befund bei fortgeschrittenen Tumorerkrankungen. Auch die mit voranschreitender Erkrankung kontinuierlich signifikant fallenden Werte des Hämoglobin, des Hämatokrits, des MCH und des MCHC können nur bedingt zuverlässige Rückschlüsse auf die Tumorlast ermöglichen, eigen sich aber für eine grobe Einschätzung der Situation, da sie tumorassoziierte Anämie und Eisenmangel anzeigen. Im Krankheitsverlauf steigende Gerinnungsfaktorkonzentrationen können auf eine florierende Tumorprogression oder auch Metastasenbildung hinweisen, und sollten somit ebenfalls nicht außer Acht gelassen werden. Allerdings beeinflussen sowohl die ABO-Blutgruppe und das Alter als auch verschiedene Begleitkrankheiten wie Diabetes mellitus, koronare Herzkrankheit, Lebererkrankungen und Infektionen die Aktivitäten des von-Willebrand-Faktor und des mit ihm assoziierten Faktor VIII [55,134,135]. Daher sind auch diese beiden Faktoren nicht ausreichend verlässlich direkt mit dem Tumorstadium kolorektaler Karzinome assoziierbar. 79 6. Literaturverzeichnis 1. 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Danksagung Dank gilt allen, die Anteil an der Dissertation haben. Herrn Prof. Dr. Eckstein danke ich, dass ich die Arbeit in seiner Abteilung durchführen durfte. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Zimmermann für die Bereitstellung des Themas und für seine stets freundliche, hilfsbereite und gewinnbringende Unterstützung. Des Weiteren möchte ich allen Ärzten und dem Laborpersonal der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikum Erlangen für eine angenehme Atmosphäre sowie jederzeit tatkräftige und kompetente Unterstützung beim experimentellen Teil der Arbeit danken. 100 9. Lebenslauf Persönliche Daten Name: Tobias Stützer Geburtsdatum (Ort) 09.02.1981 (Friedrichroda) Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Wohnort: 90478 Nürnberg Schulische Ausbildung 09.1992-07.1997 Gymnasium Senefelder Schule Treuchtlingen 09.1997-07.1999 Werner von Siemens Gymnasium Weißenburg/Bay. 06.2001 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife am Gymnasium Wiesentheid Hochschulstudium 10.2003-03.2006 Medizinstudium am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf der Universität Hamburg 03.2006 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 04.2006-04.2010 Medizinstudium an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg 04.2010 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 101 Praktisches Jahr 02.2009-06.2009 Allgemein- und Viszeralchirurgie Prof. Dr. med. Stephan Coerper Chirurgische Klinik, Krankenhaus Martha-Maria Nürnberg 06.2009-09.2009 Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie Prof. Dr. med. Heinrich Iro Hals-Nasen-Ohrenklinik, Kopf- und Halschirurgie Universitätsklinikum Erlangen 09.2009-01.2010 Innere Medizin – Nephrologie Prof. Dr. med. Bernd Schulze Medizinische Klinik 4, Klinikum Nürnberg Berufstätigkeit 15.09.2010 Weiterbildungsassistent im Fach der Hals-NasenOhrenheilkunde Prof. Dr. med. Heinrich Iro Hals-Nasen-Ohrenklinik, Kopf- und Halschirurgie Universitätsklinikum Erlangen Waldstraße 1 90154 Erlangen