Spektroskopische Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen
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Aerobe photosynthetische Bakterien Spektroskopische Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt von Claudia Schwarze September 2002 Dekan: Prof. Dr. P. Gräber Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. Schulz Referent: Prof. Dr. P. Gräber Koreferent: PD Dr. A. Labahn Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 31. Oktober 2002 Teile der vorliegenden Arbeit bilden den Inhalt der folgenden Publikationen und Tagungsbeiträgen: Publikationen: C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn (2000) Photo-induced cyclic electron transfer involving cytochrome bc1 complex and reaction center in the obligate aerobic phototroph Roseobacter denitrificans. European Journal of Biochemistry 267, 422-433. C. Schwarze, A. Labahn, A. V. Carluccio und G. Venturoli (1998) Evidence for lightinduced cyclic electron transfer in chromatophores of Roseobacter denitrificans. In Photosynthesis: Mechanism and Effects (Garab, G., ed.), Vol. III, pp. 1529-1532. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands Vorträge: A. Labahn, O. Hucke, C. Schwarze und G. Venturoli Struktur und Funktion des photosynthetischen Apparates aerober photosynthetischer Bakterien. 101. Hauptversammlung der Deutschen BunsenGesellschaft für Physikalische Chemie in Potsdam, Deutschland (9. – 11. Mai 2002) C. Schwarze, O. Hucke, S. Herter, G. Drews, G. Venturoli und A. Labahn Die Funktion des Photosyntheseapparates im Bakterium Roseobacter denitrificans. Kolloquium „Bioenergetik der Bakterien“, Mauloff / Taunus, Deutschland (25. - 26. September 2000) D. Zannoni, C. Schwarze, A. Labahn, M. Candela und G. Venturoli Electron transport and energy transduction in membranes from the obligate aerobic (photosynthetic) bacterium Roseobacter denitrificans. 10th International Symposium on Phototrophic Procaryotes, Barcelona, Spanien (26. – 31. August 2000) III C. Schwarze, A. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Q-Cycle model of photo-induced electron transfer in aerobic photosynthetic bacteria from Roseobacter denitrificans. 44th Annual Meeting of the American Biophysical Society, New Orleans, Louisiana, U.S.A. (12. - 16. Februar 2000) Biophysical Journal 78, 24A C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Elektronentransferreaktionen am Cytochrom bc1 Komplex in Roseobacter denitrificans. Veranstaltung des Graduiertenkollegs „Systeme von ungepaarten Elektronen in Chemie, Physik und Biologie“ in Titisee-Neustadt, Deutschland (22. 23. Januar 2000) C. Schwarze, A. V. Carluccio, G. Venturoli und A. Labahn Licht-induzierter zyklischer Elektronentransfer in aeroben Bakterien. Veranstaltung des Graduiertenkollegs „Systeme von ungepaarten Elektronen in Chemie, Physik und Biologie“ in Titisee-Neustadt, Deutschland (30. - 31. Januar 1999) Posterpräsentationen: C. Schwarze, A. Labahn, A. V. Carluccio und G. Venturoli Evidence for light-induced cyclic electron transfer in chromatophores of Roseobacter denitrificans. 11th International Photosynthesis Congress, Budapest, Ungarn (17. - 22. August 1998) O. Hucke, C.Schwarze, N.Gad’on, G. Drews und A. Labahn FTIR difference spectroscopy and structural model of the bacterial reaction center from Roseobacter denitrificans. 11th International Photosynthesis Congress, Budapest, Ungarn (17. - 22. August 1998) IV Zusammenfassung Die Umwandlung von elektromagnetischer Energie des Lichts in chemische Energie läuft im Reaktionszentrum photosynthetischer Bakterien ab. Bei den anaeroben photosynthetischen Bakterien wie z. B. Blastochloris viridis erfolgt die Ausbildung des Photosyntheseapparates und die Photosynthese nur unter Sauerstoffausschluss im Licht. Vor einigen Jahren wurden aerobe, photosynthetische Bakterien entdeckt. Roseobacter denitrificans gehört zu diesen Bakterien, die im Gegensatz zu den anaeroben photosynthetischen Bakterien den Photosyntheseapparat ausschließlich in Gegenwart von Sauerstoff ausbilden und ein lichtinduzierter Elektronentransfer findet nur unter aeroben Bedingungen statt. Die Ursache der Sauerstoffabhängigkeit der Photosynthese bei diesen Organismen ist bislang unverstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Zellen des Bakteriums von Roseobacter denitrificans semiaerob angezogen. Es wurde die Isolation der Reaktionszentren ausgehend von einer Literaturvorschrift optimiert, so dass aus 100 g Zellen 10 mg Reaktionszentren erhalten wurden. Es wurden erstmalig Reaktionszentren mit den Untereinheiten H, M, L und dem Tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit erhalten und es konnte der lichtinduzierte Elektronentransfer P+QA- zu PQA gemessen werden. Weiterhin wurden die photosynthetischen Membranen für spektroskopische Untersuchungen des blitzinduzierten Elektronentransfers isoliert und die blitzinduzierten Redoxänderungen der Cytochrome des b- und c-Typs in den Membranen unter definierten Redoxbedingungen untersucht. Die Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer konnte durch blitzinduzierte Reduktion von Cytochrom b561 gezeigt werden, die durch Antimycin stimuliert und Myxothiazol gehemmt wurde. Das Cytochrom b561 wurde, nach dem es nach Anregung durch den Blitz reduziert wurde, auch in Abwesenheit von Antimycin langsam reoxidiert. Die Geschwindigkeit der Reduktion des Cytochrom b561 erhöht sich in Gegenwart von Antimycin bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials, was wahrscheinlich auf die fortschreitende Präreduktion des Ubichinon-Pools in der Membran zurückzuführen ist. Die Membran von Roseobacter denitrificans enthält 20 Ubichinon-10 Moleküle pro Reaktionszentrum. Unter optimalen Redoxbedingungen wurden nach Blitzanregung ca. 0,3 Cytochrom b pro Reaktionszentrum reduziert. Darüber hinaus wurde der lichtinduzierte Elektronentransfer von den Cytochromen des c-Typs zum primären Elektronendonator P untersucht. In Abhängigkeit des eingestellten Redoxpotentials vor der Anregung wird der photooxidierte Donator durch eine schnelle Elektronenübertragung von Häm H1 (Em,7 = 290 mV), H2 (Em,7 = 240 mV) oder L1/L2 (Em,7 = 90 mV) der am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c-Untereinheit reduziert. Bei mittleren Redoxpotentialen (Eh = 145 - 195 mV) wird Häm H2 in einer weiteren Elektronentransferreaktion innerhalb von etwa 50 ms vom Cytochrom c551 in einem diffusions-abhängigen Prozess rereduziert. Unter diesen Bedingungen lässt sich auch die Kopplung der Reduktion von Cytochrom b561 mit der Rereduktion von photooxidiertem Häm H2 beobachten, was die Beteiligung des Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer nach dem Q-ZyklusMechanismus anzeigt. Für ein Redoxpotential von Eh = 50 mV wurde kein V Elektronentransfer zu den reduzierten low potential Hämen L1 und L2 beobachtet, so dass der zyklische Elektronentransfer unterbrochen ist. Dies erklärt die Notwendigkeit von Sauerstoff für die Ausbildung des photosynthetischen Apparates in Roseobacter denitrificans, da bei niedrigem Redoxpotential in der Zelle dieser Prozess unterbrochen ist. VI Einleitung Abkürzungen A ∆A APS ATP B BCA BChl BSA c CMC d DEAE DTT E EDTA Eh Em,7 H1, H2 HiPIP I ∆I ICM kAP Absorption Absorptionsdifferenz Ammoniumperoxodisulfat Adenosintriphosphat Bacteriochlorophylle der Antennenkomplexe 2,2’-Bicinchoninsäure Bacteriochlorophyll Rinderserumalbumin Konzentration kritische Mizellenkonzentration optische Schichtdicke Diethylaminoethyl 1,4-Dithiothreitol Extinktion Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz, Dihydrat eingestelltes Redoxpotential Halbstufenpotential bei pH=7,0 Häme mit hohem Halbstufenpotential (high potential Häme) high potential iron-sulfur protein Lichtintensität Differenz der Lichtintensität intracytoplasmatische Membran Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von P+QA- nach PQA kBP Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von P+QAQB- nach PQAQB KD Dissoziationskonstante L1, L2 Häme mit niedrigem Halbstufenpotential (low potential Häme) LDAO N,N-Dimethyl-dodecylamin-N-oxid LH I (oder LHC I) Lichtsammelkomplex I LH II (oder LHC II) Lichtsammelkomplex II Mops 3-Morpholino-propansulfonsäure + NADP Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (oxidiert) NADPH Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (reduziert) OD optische Dichte P primärer Elektronendonator + P primärer Elektronendonator im oxidierten Zustand PAGE Polyacrylamid Gel-Elektrophorese PS I Photosystem I PS II Photosystem II Q Chinon QA primärer Elektronenakzeptor QB sekundärer Elektronenakzeptor Qi Chinon Reduktase katalytischer Bindungsplatz des Cytochrom bc1 Komplexes Dihydrochinon Oxidase katalytischer Bindungsplatz des Qo Cytochrom bc1 Komplexes Qx-Bande Absorptionsbande des primären Donators bei 590 nm Qy-Bande Absorptionsbande des primären Donators bei 860 nm VII Einleitung RC rpm RT SDS SHE t1/2 TEMED Tris Triton X-100 U ∆U UQ UQH2 v/v w/v xg 16S rRNA ε Reaktionszentrum (reaction center) Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Natriumdodecylsulfat Standardwasserstoffelektrode Halbwertzeit N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Tris(hydroxymethyl)aminomethan Alkylphenylpolyethylenglykol Spannung Spannungsdifferenz Ubichinon Dihydroubichinon Volumenverhältnis Gewicht pro Volumen Vielfaches der Erdbeschleunigung 16S ribosomale Ribonukleinsäure molarer dekadischer Extinktionskoeffizient Hinweis: Rhodopseudomonas viridis wurde kürzlich unbenannt in Blastochloris viridis. In der vorliegenden Arbeit wurde die neue Nomenklatur verwendet. VIII Einleitung Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung V Abkürzungsverzeichnis VII A. Einleitung A.1. Photosynthese A.2. Oxygene und anoxygene Photosynthese A.2.1. Die Lichtreaktion der Photosynthese A.3. Anoxygene photosynthetische Bakterien A.3.1. Struktur und Funktion der Lichtsammelkomplexe A.3.2. Struktur und Funktion des Reaktionszentrums A.3.3. Elektronentransferreaktionen im bakteriellen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides A.3.4. Struktur und Funktion des Cytochrom bc1 Komplexes in photosynthetischen Bakterien A.3.5. Der lichtinduzierte zyklischer Elektronentransfer als Q-Zyklus A.4. Aerobe photosynthetische Bakterien A.4.1. Habitat, Morphologie und Phylogenese A.4.2. Pigmente A.4.3. Struktur und Funktion der Antennenkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien A.4.4. Struktur und Funktion der Reaktionszentren A.4.5. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans und beteiligte Enzymkomplexe A.5. Motivation und Ziele der Arbeit 1 1 2 3 5 8 10 B. Materialien und Methoden B.1. Materialien B.1.1. Chemikalien B.1.2. Puffer und Lösungen B.1.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans B.1.2.2. Präparation von Membranen und Reaktionszentren B.1.2.3. BCA-Proteinbestimmung B.1.2.4. SDS-PAGE-Gelelektrophorese B.1.2.5. Spektroskopische Untersuchungen B.1.2.5.1. Ubichinonstammlösung B.1.2.5.2. Inhibitorlösung für die QB-Bindungsstelle B.1.2.5.3. Redoxmediatoren, Entkoppler und Inhibitoren für die Messungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans B.2. Methoden B.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans B.2.1.1. Stämme B.2.1.2. Anzucht B.2.1.2.1. Vorkulturen B.2.1.2.2. Hauptkulturen B.2.2. Isolierung und Reinigung der Membranen aus Roseobacter denitrificans B.2.2.1. Waschen der Zellen B.2.2.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen IX 15 17 19 23 25 28 29 31 34 41 43 43 43 45 45 46 49 50 51 52 53 54 55 55 55 55 56 57 59 60 60 Einleitung B.2.2.3. Pufferwechsel B.2.3. Isolierung und Reinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans B.2.3.1. Vorschrift nach K. Takamiya B.2.3.1.1. Waschen der Zellen B.2.3.1.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen B.2.3.1.3. Solubilisierung der Membranproteine B.2.3.1.4. Anionenaustausch-Chromatographie B.2.3.2. Isolation durch Dichtegradientenzentrifugation B.2.3.2.1. Waschen der Zellen B.2.3.2.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen B.2.3.2.3. Solubilisierung der Membranproteine B.2.3.2.4. Dichtegradientenfraktionierung der Membranproteine B.2.3.2.5. Anionenaustausch-Chromatographie B.2.3.3. Modifizierte Vorschrift nach K. Takamiya B.2.3.3.1. Waschen der Zellen B.2.3.3.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen B.2.3.3.3. Solubilisierung der Membranen B.2.3.3.4. Ammoniumsulfat-Fällung B.2.3.3.5. Gelfiltration B.2.3.3.6. Anionenaustausch-Chromatographie B.2.3.3.7. Entsalzung B.2.3.3.8. Aufkonzentrierung B.2.3.3.9. Lagerung der Reaktionszentren B.2.4. Charakterisierung der Proben B.2.4.1. Bacteriochlorophyll-Bestimmung B.2.4.2. Proteinbestimmung mit dem BCA-Proteintest B.2.4.3. SDS-PAGE-Gelelektrophorese B.2.4.3.1. Gießen der Gele B.2.4.3.2. Probenvorbereitung B.2.4.3.3. Elektrophorese B.2.4.3.4. Färbung der Gele mit Coomassie Brilliant Blue B.2.4.3.5. Gel-Dokumentation B.2.4.4. UV-VIS-Absorptionsspektren B.2.5. Transiente Absorptionsspektroskopie B.2.5.1. Messung an isolierten Reaktionszentren B.2.5.1.1. Messanordnung B.2.5.1.2. Probenvorbereitung und Messbedingungen B.2.5.1.3. Absorptionsdifferenzspektroskopie: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten der Ladungsrekombination von P+QA- bzw. P+QB- und des Besetzungsgrades der QAund QB-Bindungsstellen im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans B.2.5.2. Messung an Membranen B.2.5.2.1. Messanordnung B.2.5.2.2. Probenvorbereitung und Messbedingungen B.2.6. Redox-Potentiometrie B.2.7. Bestimmung des Ubichinongehalts in der Membran aus Roseobacter denitrificans X 61 62 62 64 64 65 65 66 67 68 68 69 70 71 73 73 74 76 79 80 81 82 82 83 83 83 84 84 85 85 85 86 86 89 91 91 92 93 97 97 100 102 107 Einleitung C. C.1. C.2. Ergebnisse Anzucht von Roseobacter denitrificans Untersuchungen an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans C.2.1. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans C.2.1.1. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya C.2.1.2. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans durch Dichtegradientenfraktionierung C.2.1.3. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya C.2.2. Isolation und Aufreinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Präparationsvorschrift C.3. Untersuchungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans C.3.1. Isolation der Membranen C.3.2. Transiente optische Spektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans C.3.2.1. Probenvorbehandlung für die transiente optische Spektroskopie C.3.2.2. Differenzspektrum des primären Elektronendonators nach Anregung durch einen Blitz C.3.2.3. Lichtinduzierte Reduktion von Cytochrom b bei hohen Redoxpotentialen C.3.2.4. Kopplung zwischen der Reduktion von Cytochrom b und der Re-Reduktion der Cytochrome des c-Typs nach Anregung durch einen Blitz C.3.2.5. Zeitaufgelöste Spektren der Redoxänderungen von Cytochromen des c-Typs nach Anregung durch einen single turnover Blitz C.3.2.6. Der Einfluss von Viskosität und Ionenstärke auf den Elektronentransfer von Cytochrom c551 zum Häm H2 des Reaktionszentrums C.3.2.7. Orientierung des Reaktionszentrums in der Membran C.3.2.8. Titration der blitzinduzierten Redoxänderungen von Cytochrome des b- und c-Typs C.3.3. Bestimmung des Ubichinongehalts in Membranen aus Roseobacter denitrificans D. D.1. Diskussion Anzucht von Roseobacter denitrificans, Isolation von photosynthetischen Membranen und Reaktionszentren D.1.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans D.1.2. Isolierung der photosynthetischen Membran D.1.3. Isolierung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans D.2. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer (Q-Zyklus) in Roseobacter denitrificans D.2.1. Elektronentransfer von Cytochromen des c-Typs zum primären Donator des Reaktionszentrums D.2.2. Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans XI 109 109 113 113 114 119 119 127 139 139 140 140 142 149 155 167 176 178 184 190 193 193 193 195 197 201 201 207 Einleitung D.2.3. Das Halbstufenpotential des primären Elektronenakzeptors QA im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans D.2.4. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans: Schlussfolgerungen und Ausblick 211 213 Literaturverzeichnis 221 Abbildungsverzeichnis 241 Tabellenverzeichnis 245 Danksagung 247 XII Einleitung A. Einleitung A.1. Die Photosynthese Die primäre Energiequelle für alle Lebewesen auf der Erde ist das Sonnenlicht. Den Prozess der Nutzbarmachung der Energie aus dem Sonnenlicht durch phototrophe Organismen bezeichnet man als Photosynthese. Durch diesen Prozess wird die Sonnenenergie letztlich über die Nahrungskette auch den heterotrophen Organismen (Tiere, Pilze etc.) zugänglich gemacht. Gemessen am Umsatz ist die Photosynthese der quantitativ bedeutendste chemische Prozess, der auf der Erde stattfindet. Schätzungen zufolge werden jährlich mehr als 1010 Tonnen Kohlenstoff durch diesen Prozess fixiert, was einer gespeicherten Energie von 1012 kJ entspricht [1]. Die Photosynthese findet in bestimmten Zellkompartimenten, den Chloroplasten der Algen und höheren Pflanzen sowie in Cyanobakterien und photosynthetischen Bakterien statt. Durch diesen Prozess wird die elektromagnetische Energie des Sonnenlichts in chemisch gebundene Energie umgewandelt. Dabei werden einzelne Lichtquanten durch Lichtsammelkomplexe in der Zellmembran absorbiert und zu den Reaktionszentren weitergeleitet, in denen eine photoinduzierte transmembrane Ladungstrennung stattfindet. Dieser Elektronentransport ist mit einem Protonentransport über die Membran gekoppelt. Es wird also zusätzlich zur transmembranen Ladungstrennung eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen über die Membran aufgebaut. Die so gespeicherte Energie wird anschließend in einer Reihe von lichtunabhängigen Reaktionen (Dunkelreaktion der Photosynthese) in das für alle Lebewesen als zentralen Energieüberträger dienende Adenosintriphosphat (ATP) und in Reduktionsäquivalente umgewandelt. In weiteren Reaktionen werden diese Substanzen für die Synthese chemischer Verbindungen, die die Zelle benötigt (wie z.B. Kohlenhydrate), eingesetzt. 1 Einleitung A.2. Oxygene und anoxygene Photosynthese Man unterteilt die Photosynthese in oxygene und anoxygene Photosynthese. Die oxygene Photosynthese ist charakteristisch für prokaryontische Cyanobakterien, eukaryontische Algen und höhere Pflanzen. Sie findet in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten statt. Die Struktur des Photosyntheseapparates ist sehr komplex und setzt sich im wesentlichen aus zwei durch Elektronenüberträger und Redoxenzyme miteinander gekoppelten größeren Proteinkomplexen, den Photosystemen PSI und PSII, die die Lichtsammelkomplexe und jeweils ein unterschiedliches Reaktionszentrum enthalten, zusammen. Dazu kommen die ATPSynthase und die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase der Dunkelreaktion [1]. Im folgenden sind die Reaktionsgleichungen der Photosynthese dargestellt. Lichtreaktion: 12 NADP+ + 12 H2O 12 NADPH + 12 H+ + 6 O2 → 18 ADP + 18 Pi + 18 H+ → 18 ATP + 18 H2O Gleichung A.2.1 Gleichung A.2.2 Dunkelreaktion: 6 CO2 +18 ATP + 12 NADPH + 12 H2O → C6H12O6 + 18 ADP + 18 Pi + 12 NADP+ + 6 H+ Gleichung A.2.3 Nettoreaktion: 6 CO2 + 6 H2O → C6H12O6 + 6 O2 Gleichung A.2.4 Zu den Vertretern der anoxygenen Photosynthese gehören Purpurbakterien, grüne Schwefelbakterien, Heliobakterien und grüne fädige Bakterien. Sie sind strukturell einfacher gebaut. Die Photosynthese findet in der inneren Cytoplasmamembran statt, die oft weitläufige Einstülpungen bildet, die intracytoplasmatische Membran (ICM). Der Photosyntheseapparat ist wesentlich einfacher gebaut und enthält nur einen Typ Reaktionszentrum. 2 Einleitung A.2.1. Die Lichtreaktionen der Photosynthese Die Primärschritte der Photosynthese sind in der oxygenen und anoxygenen Photosynthese prinzipiell ähnlich. Obwohl der oxygene Photosyntheseapparat viel komplexer ist, sind praktisch alle gültigen Prinzipien bei den anoxygenen photosynthetischen Bakterien bereits vorhanden, teilweise in vereinfachter Form. Deshalb spielt bei der Erforschung der Prinzipien der Photosynthese die Untersuchung der anoxygenen photosynthetischen Bakterien eine entscheidende Rolle. An dieser Stelle soll die Lichtreaktion bei den oxygenen Phototrophen kurz beschrieben werden. Die anoxygene Photosynthese wird ausführlicher im nächsten Kapitel beschrieben. Lichtreaktionen bei oxygenen Photosyntheseorganismen Im oxygenen Photosyntheseapparat sind Cyanobakterien, Algen und grüne Pflanzen in der Lage, durch Kopplung von zwei Lichtreaktionen einen Elektronentransfer von H2O auf NADP+ durchzuführen. Die daraus resultierende transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen wird zur Synthese von ATP genutzt. Das sogenannte Z-Schema der Photosynthese ist schematisch in Abbildung A.2.1.1 dargestellt [2]. Im ersten Schritt der oxygenen Photosynthese wird das Licht durch Lichtsammelkomplexe der Photosysteme I und II absorbiert. Im Photosystem I folgt der Lichtabsorption die Übertragung des Photons auf den primären Donator P7001, der hierbei in den ersten angeregten Singulettzustand übergeht. Aus diesem wird ein Elektron über die Elektronenakzeptoren A0 und A1 auf Ferredoxin übertragen. Die Ferredoxin-NADP+-Reduktase katalysiert dann die Reduktion von NADP+ durch Ferredoxin, wobei zwei reduzierte Ferredoxine ein Molekül NADP+ reduzieren. Der oxidierte Donator P700+ wird durch ein reduziertes Plastocyanin wieder reduziert und kann dann erneut ein Photon aufnehmen. Alternativ können die Elektronen im PS I dem zyklischen Elektronenfluss folgen. Hierbei wird das Elektron aus dem angeregten Zustand des P700 bis zum Ferredoxin transportiert und von dort jedoch anstatt auf NADP+ auf den Cytochrom b6f Komplex 1 Bei dieser Bezeichnung steht P für den primären Donator und 700 entspricht der Wellenlänge des Maximums im UV-VIS-Spektrum des primären Donators. 3 Einleitung übertragen. Aus diesem wird dann ein Elektron über ein Plastocyanin zurück auf das P700+ übertragen. Durch diesen zyklischen Elektronenfluss werden ausschließlich Protonen durch den Cytochrom b6f Komplex gepumpt, die eine transmembrane Halbstufenpotential / V elektrochemische Potentialdifferenz erzeugen. PS I PS II Abbildung A.2.1.1: Z-Schema des linearen Elektronentransfers in der oxygenen Photosynthese [2]. Das vom Photosystem II (PS II) gebildete reduzierte Plastochinon (QH2) übergibt Elektronen auf den Cytochrom b6f Komplex (Cyt b6/f). Von dort transportiert reduziertes Plastocyanin (PC) Elektronen zum Photosystem I (PSI), das Ferredoxin (Fd) reduziert. Dieses überträgt sein Elektron über die Ferredoxin-NADP+-Reduktase (Fp) auf NADP+. Der Cytochrom b6f Komplex bildet die Verbindung zwischen den Photosystemen I und II (siehe Text). Die gestrichelten Linien kennzeichnen Elektronentransferreaktionen, die Pfeile die Absorption von Photonen. Im Photosystem II folgt der Lichtabsorption die Übertragung des absorbierten Photons auf den Elektronendonator P680, der daraufhin in den angeregten Zustand übergeht. Aus diesem erfolgt dann ein transmembraner Elektronentransfer über ein Chlorophyll und ein Phäophytin zu einem primären Plastochinon (QA), das reduziert wird. Von dort wird das Elektron auf ein sekundäres Plastochinon (QB) übertragen. Nach Reduktion von P680+ erfolgt ein zweiter lichtinduzierter Elektronentransfer, der zur weiteren Reduktion des zweiten Plastochinons führt, das nach Aufnahme zweier Protonen als Plastohydrochinon aus dem PS II in die Membran diffundiert und durch ein Plastochinon aus dem Membran-Pool ersetzt wird. Das nach Lichtabsorption und darauffolgendem Elektronentransfer im PS II entstandene Kationenradikal P680+ ist ein starkes Oxidationsmittel. Es entzieht 4 dem Mangancluster der Einleitung Wasserspaltungsmaschine des PS II ein Elektron und geht dadurch wieder in den Grundzustand über. Nach viermaligem Durchlaufen dieses Vorgangs wird aus zwei Molekülen H2O ein Molekül O2 gebildet. Dabei werden vier Protonen freigesetzt. Das PS I und das PS II sind über den Cytochrom b6f Komplex miteinander gekoppelt. Hier wird das im PS II reduzierte Plastochinon reoxidiert. Die aufgenommenen Elektronen werden auf Plastocyanine übertragen, welche das P700+ des Photosystems I reduzieren. Auch die Elektronenübertragungen im Cytochrom b6f Komplex sind mit einem transmembranen Protonentransfer gekoppelt. Die Gesamtreaktion des PS I, des Cytochrom b6f Komplexes und des PS II ist somit der lichtinduzierte Elektronenfluss von H2O zu NADP+, der der Gewinnung von Reduktionsäquivalenten dient. Die stöchiometrische Gesamtgleichung ergibt sich zu: 2 H2O + 2 NADP+ → 2 NADPH + 2 H+ + O2 Gleichung A.2.1.1 Zusätzlich führt der Elektronentransfer vom H2O zum NADP+ durch den daran gekoppelten transmembranen Protonentransfer zur Erzeugung einer elektrochemischen Potentialdifferenz der Protonen, die nach der chemiosmotischen Theorie von P. Mitchell von der ATP-Synthase zur Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat verwendet wird [3]. A.3. Anoxygene photosynthetische Bakterien Anoxygene Phototrophe besitzen nur ein Photosystem und sind nicht in der Lage, Reduktionsäquivalente selbst zu bilden. Wie in Abbildung A.3.1 dargestellt, katalysiert das Reaktionszentrum einen zyklischen Elektronentransport, an den ein Protonentransport durch die Membran gekoppelt ist. Die Beschreibung der anoxygenen Photosynthese sei hier am Beispiel Rhodobacter sphaeroides, eines der am besten untersuchten Purpurbakterien, vorgenommen. Ergänzend werden die davon abweichenden Eigenschaften bei Rhodopseudomonas viridis (vor kurzem in Blastochloris viridis umbenannt) beschrieben. 5 Einleitung Halbstufenpotential / V RC Abbildung A.3.1: Der zyklische Elektronentransfer in photosynthetischen Purpurbakterien [2]. Die Absorption von zweimal je ein Photon durch den primären Donator (P870) im Reaktionszentrum (RC2) führt nach zweimaligem Durchlaufen der Elektronentransferkette zur Bildung von Ubihydrochinon (QH2), das vom Reaktionszentrum abdissoziiert und zwei Elektronen dem Cytochrom bc1 Komplex (Cyt bc1) übergibt. Die Elektronen werden nacheinander über das lösliche Cytochrom c2 (Cyt c2) zurück zum primären Donator transferiert. Bei der Bildung von Ubihydrochinon (im Reaktionszentrum bzw. an der Qi-Bindungstelle des Cytochrom bc1 Komplexes, siehe Kapitel A.3.5. und Abbildung A.3.5.1) werden Protonen aus dem Cytoplasma aufgenommen, die bei der Oxidation an der Qo-Bindungstelle des Cytochrom bc1 Komplexes in das Periplasma abgegeben werden. Die gestrichelten Linien kennzeichnen den Elektronentransfer und der Pfeil die Absorption von Photonen. Der erste Schritt der bakteriellen Photosynthese ist die Absorption eines Photons durch die Lichtsammelkomplexe. Die Anregungsenergie wird dann auf den primären Elektronendonator des Reaktionszentrums weitergeleitet, welcher in den ersten angeregten Singulettzustand übergeht. Im Reaktionszentrum findet eine Ladungstrennung statt, bei der der primäre Donator oxidiert und das sekundäre Ubichinon reduziert wird. Durch ein lösliches Cytochrom c2 wird der Donator rereduziert und ist somit in der Lage ein weiteres Photon aufzunehmen (in Rhodopseudomonas viridis ist noch ein gebundenes tetrahämes Cytochrom c zwischengeschaltet, siehe Kapitel A.3.3. und A.3.5.). Nach der Absorption eines zweiten Photons wird ein zweites Elektron über die Elektronentransportkette zum sekundären Ubichinon weitergeleitet. Nach Aufnahme zweier Protonen aus dem Cytoplasma verlässt das gebildete Dihydrochinon 2 seine Bindungsstelle im In dieser Arbeit wird das Reaktionszentrum mit RC abgekürzt, wie es in der angelsächsischen Literatur (reaction center) üblich ist. 6 Einleitung Reaktionszentrum und wird durch ein Ubichinon aus dem Chinon-Pool in der Membran ersetzt. Die vom Ubihydrochinon aufgenommenen Elektronen werden über den Cytochrom bc1 Komplex auf ein lösliches Cytochrom c2 übertragen, welches wiederum den oxidierten primären Donator (bzw. das gebundene Cytochrom c) reduziert. Im Gegensatz zum linearen lichtinduzierten Elektronentransfer der pflanzlichen Photosynthese, findet bei den Bakterien ein zyklischer Elektronentransfer statt, der in der Summe zu keiner Redoxreaktion führt, sondern einzig Protonen vom Cytoplasma ins Periplasma pumpt. Dies führt zu einer transmembranen elektrochemischen Potentialdifferenz der Protonen, welche zur Synthese von ATP benutzt wird. Das bei der Photophosphorylierung erzeugte ATP wird dann bei den Stoffwechselprozessen eingesetzt. Da Purpurbakterien nicht in der Lage sind, NADP+ direkt im photoinduzierten Elektronentransfer zu reduzieren, müssen sie zur Reduktion von NADP+ unter Aufwand von ATP externe Elektronendonatoren (wie H2S, S, S2O32-, H2 und auch viele organische Verbindungen) verwenden. In den folgenden Kapiteln wird auf die Struktur und Funktion der Proteinkomplexe der Lichtreaktionen näher eingegangen. Gegenstand neuester Untersuchungen ist die supramolekulare Anordnung der an der Lichtreaktion der Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe, da diese für die Funktion des photosynthetischen Apparates von Bedeutung sind [4, 5]. In Rhodobacter sphaeroides liegen die Komplexe in der Membran im stöchiometrischen Verhältnis von 1 Cytochrom bc1 Komplex auf 2 Reaktionszentren und von ca. 24 Bacteriochlorophyllmolekülen pro Reaktionszentrum vor, wobei ein Lichtsammelkomplex LH I und ca. 9 Lichtsammelkomplexe LH II auf ein Reaktionszentrum kommen. 7 Einleitung A.3.1. Struktur und Funktion der Lichtsammelkomplexe Die Funktion der Lichtsammelkomplexe (auch Antennenkomplexe genannt) besteht darin, Lichtquanten zu absorbieren und die Anregungsenergie möglichst effizient innerhalb von 10-10 s mittels Resonanzenergietransfer (nach dem FörsterMechanismus [6]) dem aufnahmebereiten Reaktionszentrum zu übergeben. Antennenkomplexe existieren bezüglich ihrer Struktur, ihrer Polypeptidzusammensetzung und ihrer Chromophoren (Bacteriochlorophylle und Carotenoide) in viel größerer Vielfalt als die untereinander recht ähnlichen Reaktionszentren. Infolgedessen können Antennenkomplexe Licht verschiedener Wellenlänge absorbieren und dem Reaktionszentrum weiterleiten, so dass sie die Bakterien befähigen, die spektrale Verteilung des zur Verfügung stehenden Lichtes möglichst optimal zur Photosynthese auszunutzen und so die Anpassung an die Umweltbedingungen zu optimieren. Die Effizienz der Energieübertragung von den Antennenkomplexen auf das Reaktionszentrum wird durch den hohen Organisationsgrad ihrer Anordnung in der Membran gewährleistet [7]. Purpurbakterien haben ein relativ einfaches System mit in der Regel zwei Typen von 3 Lichtsammelkomplexen, LH I und LH II [8]. LH I umgibt das Reaktionszentrum und bildet mit ihm einen Kernkomplex [9-11]. Dieser wird von einem weiteren Antennenkomplex LH II umgeben, in einer Stöchiometrie, die von den Wachstumsbedingungen abhängen kann. Die Lichtsammelkomplexe werden nach dem Absorptionsmaximum der Bacteriochlorophylle spezifiziert. In Purpurbakterien sind B875, B880 und B890 die Bacteriochlorophylle des LH I und B800-B820 sowie B800-B850 die Bacteriochlorophylle des LH II4. In Rhodobacter sphaeroides absorbiert LH II bei 800 nm und 850 nm, LH I bei 875 nm, und die absorbierte Energie wird dem Energiegefälle folgend von LH II über LH I auf den primären Donator des Reaktionszentrums übertragen. Die Lichtsammelkomplexe bestehen aus zwei Typen von Polypeptidketten α und β von jeweils ca. 50 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von jeweils ca. 6 kDa. Beide Polypeptide haben jeweils eine hydrophobe Domäne, die eine α-Helix formt und die Membran durchspannt, und eine 3 Lichtsammelkomplexe werden mit LH oder LHC (von light-harvesting complex) abgekürzt. In dieser Arbeit wird die Abkürzung LH verwendet. 4 Bei der Bezeichnung der Bacteriochlorophylle steht B für Bacteriochlorophyll und die Zahl entspricht der Wellenlänge des Maximums (bzw. der Maxima) im langwelligen Bereich des UV-VISAbsorptionspektrums. 8 Einleitung hydrophile C-terminale und N-terminale Domäne [12]. Sie bilden im Verhältnis 1:1 jeweils eine Untereinheit, die im Gegensatz zu den Lichtsammelkomplexen in Pflanzen große Ansammlungen von bis zu 9 Untereinheiten bilden [13, 14]. Für den Lichtsammelkomplex LH II von Rhodopseudomonas acidophila [15] und von Rhodospirillum molischianum [16] konnte die dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung aufgeklärt werden. Danach besteht dieser aus Ringen von jeweils neun bzw. acht Untereinheiten. Für LH I konnte die dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung bisher nicht aufgeklärt werden. Dennoch zeigen Untersuchungen an zweidimensionalen Kristallen, dass LH I einen großen Ring um das Reaktionszentrum bildet [10, 11, 17]. Abbildung A.3.1.1 zeigt eine schematische Darstellung der Anordnung der Lichtsammelkomplexe und des Reaktionszentrums in der Membran nach einer Modellrechnung [18]. Abbildung A.3.1.1: Anordnung der Lichtsammelkomplexe LH I und LH II und des Reaktionszentrums in Rhodobacter sphaeroides in einer Modellrechnung nach H. Xiche et al. [18] mit Blick auf die Membran, in der die Proteinkomplexe eingebettet sind. Bei den Lichtsammelkomplexen befinden sich die β-Apoproteine auf der Außenseite der Ringe (helle Helices relativ zur Senkrechten der Membranebene geneigt), die αApoproteine im Inneren der Ringe (dunkle Helices senkrecht zur Membranebene). Die Struktur des Reaktionszentrums in atomarer Auflösung ist bekannt (siehe Text und Abbildung A.3.2.1). Die relative Lage der Bacteriochlorophylle und der Carotinoide ist eingezeichnet. Die Bacteriochlorophylle der Lichtsammelkomplexe und des Reaktionszentrums sind coplanar angeordnet, so dass ein Energietransfer von den Lichtsammelkomplexen zum Reaktionszentrum erfolgen kann. 9 Einleitung A.3.2. Struktur und Funktion des Reaktionszentrums Die photoinduzierte schnelle Ladungstrennung findet in den Reaktionszentren der anoxygenen Bakterien statt. Die Gesamtheit der photosynthetischen Reaktionszentren lässt sich in zwei Gruppen unterteilen, die entsprechend ihrer Ähnlichkeit zu den Photosystemen I und II der oxygenen Photosynthese als Typ I und II klassifiziert werden [19]. Die Reaktionszentren des Typs I enthalten als terminale Elektronenakzeptoren Eisen-Schwefel-Cluster. Zu dieser Gruppe gehören die Reaktionszentren aus grünen Schwefelbakterien und Heliobakterien. Als terminale Elektronenakzeptoren der Reaktionszentren des Typs II fungieren hingegen Chinone. Zu den Reaktionszentren dieses Typs zählen die Reaktionszentren der Purpurbakterien und der grünen fädigen Bakterien. Im folgenden Abschnitt wird das Reaktionszentrum der Purpurbakterien Rhodobacter sphaeroides und Blastochloris viridis besprochen. Das Reaktionszentrum ist ein integraler Membranproteinkomplex. Obwohl seine Existenz schon in den 30er Jahren postuliert wurde [20, 21], gelang es erst um 1970, das Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides (Wildtyp) und aus Rhodobacter sphaeroides R-26 in der aktiven Form zu isolieren [22-24]. Die Aminosäuresequenz wurde Anfang der 80iger Jahre bestimmt [25-27], und schließlich konnte die Röntgenstruktur mit nahezu atomarer Auflösung aufgeklärt werden. Das bakterielle Reaktionszentrum aus Blastochloris viridis war das erste Membranprotein, dass kristallisiert und dessen dreidimensionale Struktur mit atomarer Auflösung aufgeklärt werden konnte, wofür H. Michel, R. Huber und J. Deisenhofer 1988 den Nobelpreis für Chemie erhielten [28, 29]. Kurze Zeit später wurde die dreidimensionale Struktur des bakteriellen Reaktionszentrums von Rhodobacter sphaeroides aufgeklärt [3033]. 10 Einleitung P QB QA Abbildung A.3.2.1: Die Struktur des photosynthetischen Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides in atomarer Auflösung [34]. Dargestellt sind die drei Untereinheiten L (dunkel, rechts), M (hell, links), die vollständig in der Membran (als Strichzeichnung dargestellt) eingebettet sind, und H (hell, unten), die über eine Helix mit dem LM-Komplex verbunden ist und in das Cytoplasma hereinragt. Eingezeichnet sind die symmetrisch angeordneten Cofaktoren. Das Bacteriochlorophylldimer befindet sich auf der periplasmatischen und die zwei Ubichinone auf der cytoplasmatischen Seite. Die Struktur der Reaktionszentren aus Blastochloris viridis und Rhodobacter sphaeroides ist ähnlich. Im Folgenden wird zunächst auf die Struktur des Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides eingegangen, die in Abbildung A.3.2.1 dargestellt ist. Das Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides ist ein integrales Membranprotein mit einer Molmasse von 96000 Da. Es besteht aus drei Proteinuntereinheiten L, M, H [32]. Der gesamte Proteinkomplex enthält elf transmembrane Helices, davon fünf in der L-, fünf in der M- und eine in der HUntereinheit. L und M sind Strukturhomologe und liegen im engen Kontakt zueinander, so dass man von einem zylindrischen LM-Komplex spricht. Die Lichtabsorption und Ladungstrennung erfolgt über Cofaktoren, die in der Proteinmatrix eingebettet liegen (vgl. auch Abbildung A.3.2.3): ein Dimer aus zwei Bacteriochlorophyllen (P), zwei weitere Bacteriochlorophyllmonomere (BA und BB), zwei Bacteriophäophytine (φA und φB), zwei Ubichinone (QA und QB) sowie ein „highspin“ Fe2+-Kation. Die Cofaktoren bilden die Elektronentransportkette und sind in einer nahezu perfekten zweizähligen Symmetrie angeordnet, die sich in der 11 Einleitung Symmetrie des LM-Komplexes widerspiegelt [35]. Im nativen Reaktionszentrum ist nur der A-Zweig photosynthetisch aktiv, der weitgehend in der L-Untereinheit liegt, während der in der M-Untereinheit gelegene B-Zweig photosynthetisch inaktiv ist. Die H-Untereinheit hat eine globuläre Struktur, die ins Cytoplasma hineinragt, und über eine α-Helix mit dem LM-Komplex verbunden ist. Sie ist wahrscheinlich für die Stabilisierung der Reaktionszentrenstruktur von Bedeutung. Eine weitere Funktion der H-Untereinheit könnte die Abschirmung des Ubichinons in der QA-Bindungsstelle von der wässrigen Umgebung sein [36], was für den Ablauf des Protonentransfers im Reaktionszentrum von Bedeutung ist. Auf der periplasmatischen Seite der Membran findet sich die Bindungsstelle für den sekundären Donator, das Cytochrom c2. Die Strukturen der Untereinheiten L, M, und H des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis sind homolog zu den Strukturen von Rhodobacter sphaeroides. Dieses Reaktionszentrum hat aber eine zusätzliche Untereinheit, die Cytochrom cUntereinheit, die in Abbildung A.3.2.2 dargestellt ist. Dieses Cytochrom c aus 333 Aminosäuren mit einer Molmasse von ca. 40000 Da enthält vier Häm-Gruppen und ist an das Reaktionszentrum gebunden [37]. Es ist üblich, die vier Häme auf Grund ihres Redoxpotentials in zwei Gruppen zusammenzufassen: zwei mit hohem Potential (H1 und H2), die sogenannten high potential Häme und zwei mit niedrigem Potential (L1 und L2), die sogenannten low potential Häme. Das Halbstufenpotential der Häme in Blastochloris viridis ist in Tabelle A.3.2.1 aufgeführt [38-41]: Tabelle A.3.2.1: Physikalische Eigenschaften der Tetrahämuntereinheit des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis. Angegeben sind die Halbstufenpotentiale Em,7 und die Absorptionsmaxima l der a-Bande. Em,7 / mV l (a-Bande) / nm Name H1 380 559 Cytochrom c559 H2 310 556 Cytochrom c556 L1 20 552 Cytochrom c552 L2 -60 554 Cytochrom c554 Häm 12 Einleitung L2 H2 L1 H1 Abbildung A.3.2.2: Struktur der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis in atomarer Auflösung [29]. Die Proteinkette ist als Band dargestellt, die relative Lage der Häm-Gruppen und der CysteinReste, an die sie gebundenen sind, sind eingezeichnet. Die Häm-Gruppen werden nach ihrem Redoxpotential mit H1, H2, L1, und L2 bezeichnet (Details im Text). Das Häm H1 ist dem Bacteriochlorophylldimer des Reaktionszentrums am nächsten. Von dieser Seite ist die Cytochrom c-Untereinheit auf der periplasmatischen Seite der Membran an den LM-Komplex des Reaktionszentrum gebunden. Die Cytochrom c-Untereinheit ragt in das Periplasma. Aus der Kristallstruktur erkennt man, dass die Häme näherungsweise linear angeordnet sind. Wie Untersuchungen der Elektronentransferkinetik, EPR- und Lineardichroismus-Messungen gezeigt haben, ist die Zuordnung der Redoxpotentiale zu den Hämen in Blastochloris viridis, wie in Abbildung A.3.2.3 dargestellt [29, 4245]. 13 Einleitung Abbildung A.3.2.3: Anordnung der Cofaktoren des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis und Orientierung der Häme der Cytochrom c-Untereinheit (verändert nach O. Hucke [46]). Die Pfeile zeigen den Weg des lichtinduzierten Elektronentransfers. Nach Anregung durch Licht erfolgt ein Elektronentransfer vom primären Donator P über das Bacteriochlorophyll BA und das Bacteriophäophytin φA zum primären Akzeptor QA, das im Falle von Blastochloris viridis ein Menachinon ist, und von dort auf den sekundären Akzeptor QB (Ubichinon). P+ wird dann von Häm H1 reduziert, das wiederum von Häm H2 reduziert wird. In Klammern sind die Halbstufenpotentiale der Häme der CytochromUntereinheit angegeben. Die Funktion des gebundenen tetrahämen Cytochroms c ist, den primären Donator nach erfolgter lichtinduzierter Ladungstrennung wieder zu reduzieren. Das oxidierte tetrahäme Cytochrom c wird wiederum vom löslichen Cytochrom c2 reduziert. Das tetrahäme Cytochrom c ist in vielen photosynthetischen Bakterien vorhanden [47-53]. Die Struktur dieser Untereinheit variiert in Hinblick auf die elektrochemischen Eigenschaften und Orientierung der Häme. Darüber hinaus werden verschiedene Mechanismen der Elektronenübertragung gefunden. Die besondere Funktion dieser tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit ist noch unklar. 14 Einleitung Die Untereinheiten L, M und C des Reaktionszentrums sind zusammen mit den Untereinheiten des LH I Komplexes im puf Operon im Genom kodiert (pufBALM in Rhodobacter sphaeroides [25] bzw. pufBALMC in Blastochloris viridis [54]). Die HUntereinheit wird an anderer Stelle im Genom kodiert. Im nächsten Kapitel sollen die Elektronentransferreaktionen im Reaktionszentrum näher erläutert werden. A.3.3. Elektronentransferreaktionen im bakteriellen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides Im Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides wird die durch Lichtabsorption aufgenommene Energie durch Ladungstrennung stabilisiert, wie in Abbildung A.3.3.1 schematisch dargestellt. Nach der Absorption eines Photons geht der primäre Elektronendonator P in den angeregten Singulettzustand P* über. Aus diesem wird ein Elektron auf das Bacteriochlorophyllmonomer BA übertragen [55]. Vom BA wird das Elektron über das Bacteriophäophytin φA auf den primären Elektronenakzeptor QA übertragen. Die Elektronenübertragung auf das QA führt zum ersten stabilen ladungsgetrennten Zustand P+QA-. Von diesem erfolgt ein weiterer Elektronentransfer zum sekundären Akzeptor QB. Durch ein lösliches Cytochrom c wird das Radikalkation P+ reduziert und ist somit in der Lage ein weiteres Photon zu absorbieren. Aus dem angeregten Zustand des Donators wird dann wiederum ein Elektron auf das Ubichinonanionradikal QB- übertragen, welches nach Aufnahme zweier Protonen als Ubihydrochinon die Bindungsstelle verlässt und durch ein Ubichinon aus dem Pool der Membran ersetzt wird. 15 Einleitung 1,5 P*φAQAQB 10-12 s Freie Standardenthalpie / eV P+φA-QAQB 1,0 10-10 s 10-9 s 10-8 s hν P+φAQA-QB 10-4 s P+φAQAQB- 0,5 10-1 s 1s 0,0 PφAQAQB Abbildung A.3.3.1: Vereinfachtes Schema der Elektronentransferreaktionen im bakteriellen photosynthetischen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides. Die Größenordnungen der charakteristischen Elektronentransferzeiten sind bei den Pfeilen angegeben, die die jeweiligen Reaktionen symbolisieren. Als Konkurrenzreaktion zu jedem Schritt des Vorwärtselektronentransports tritt die Ladungsrekombination aus dem jeweiligen ladungsgetrennten Zustand auf. Jede Ladungsrekombination stellt eine unproduktive Vergeudung von Energie dar. Daher versucht die Natur, die Ladungsrekombination weitgehend zu unterbinden. Dies geschieht durch Optimierung der Proteinstruktur dahingehend, dass der Vorwärtselektronentransfer um zwei bis drei Größenordnungen schneller ist als die jeweils konkurrierende Ladungsrekombination Elektronentransferreaktionen finden sich in (die Zeiten Abbildung für die A.3.3.1). Die Quantenausbeute beträgt somit nahezu eins. Die hohe Effizienz geht jedoch mit einem hohen Energieverlust einher. Von der Energie des angeregten Singulettzustands des Donators werden nur ca. 35% im ladungsgetrennten Zustand gespeichert. Die Untersuchung sowohl der schnellen Vorwärtselektronentransferschritte wie auch der langsamen Ladungsrekombinationen sind Voraussetzung für das Verständnis, 16 Einleitung wie das Protein die effektive Speicherung der Energie der absorbierten Photonen in einen stabilen ladungsgetrennten Zustand bewerkstelligt. Die Ladungsrekombination, die aus dem Zustand P+QA-QB zurück in den Grundzustand führt, wird durch die Geschwindigkeitskonstante kAP ∼ 10 s-1 charakterisiert. Zwei Bedingungen müssen erfüllt sein, um die Ladungsrekombination von P+QA- in isolierten Reaktionszentren zu beobachten. Zum einen darf kein exogener Elektronendonator den oxidierten primären Donator reduzieren (Cytochrom c2 wird bei der Isolation des Reaktionszentrums entfernt). Außerdem muss der Vorwärtselektronentransfer zum QB unterbunden werden, entweder durch selektive Extraktion von QB oder durch Verwendung eines kompetitiven Inhibitors für die QBBindungsstelle (o-Phenanthrolin oder Terbutryn). In isolierten Reaktionszentren, bei denen QB vorhanden ist, wird hingegen die Ladungsrekombination aus dem Zustand P+QAQB- in den Grundzustand beobachtet (kBP ≈ 1 s-1). Im Falle einer am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c-Untereinheit, wie es bei Blastochloris viridis der Fall ist (siehe Kapitel A.3.2.), kann der primäre Donator vom gebundenen Cytochrom c reduziert werden, sofern dieser reduziert vorliegt. Diese Elektronentransferreaktionen des tetrahämen Cytochrom c werden in Kapitel A.3.5. im Rahmen des bakteriellen lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers beschrieben. Bei Messung der Ladungsrekombination liegen die Reaktionszentren in Lösung vor und stehen mit dem Sauerstoff aus der Luft in Kontakt. Somit liegen oxidierende Bedingungen vor, so dass das gebundene Cytochrom c oxidiert vorliegt und den primären Donator nicht reduzieren kann (vgl. Kapitel B.2.5.1. und C.2.). A.3.4. Struktur und Funktion des Cytochrom Komplex in photosynthetischen Bakterien bc1 Die Cytochrom bc Komplexe bilden eine phylogenetisch vielfältige Gruppe von Membranproteinkomplexen, die sowohl in der mitochondrialen und bakteriellen Atmungskette als auch in der Photosynthese den Elektronentransfer von einem Dihydrochinon zu einem Cytochrom des c-Typs (bzw. eines Fe-S-Proteins mit hohem Potential, HiPIP, oder eines Plastocyanins) katalysieren. Dieser Elektronentransfer ist gekoppelt mit einem Transfer von Protonen durch die Membran und erzeugt so eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen über die Membran, die von 17 Einleitung der ATP-Synthase zur Synthese von ATP genutzt wird. Zu dieser Gruppe von Membranproteinkomplexen gehören die mitochondrialen und bakteriellen Cytochrom bc1 Komplexe sowie die Cytochrom b6f Komplexe aus den Chloroplasten und Cyanobakterien (Reviews finden sich in [56-60]). Der Cytochrom bc1 Komplex (auch Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) konnte sowohl aus Mitochondrien verschiedener Organismen als auch aus verschiedenen Purpurbakterien isoliert werden [61-65]. Der Cytochrom bc1 Komplex von Rhodobacter sphaeroides R-26 konnte erstmals 1982 isoliert werden [66, 67]. Kürzlich konnte die Struktur des mitochondrialen Cytochrom bc1 Komplexes auf atomarer Ebene aufgeklärt werden [68-70], während für den bakteriellen Cytochrom bc1 Komplex auf Grund mangelnder Ausbeute und Stabilität des isolierten Proteins noch keine Struktur-Analyse zur Verfügung steht. Der mitochondriale Cytochrom bc1 Komplex besteht aus 10 oder 11 Untereinheiten, während der bakterielle Cytochrom bc1 Komplex wesentlich einfacher gebaut ist und aus drei (z.B. Rhodospirillum rubrum) oder vier (z.B. Rhodobacter sphaeroides) Untereinheiten besteht [71-73]. Die drei katalytischen Untereinheiten (Cytochrom b, Cytochrom c1 und das Rieske Protein) sind in allen bisher untersuchten Spezies konserviert und sind zusammen auf dem fbc Operon im Genom kodiert [71, 74, 75]. Diese drei Untereinheiten binden alle Redoxzentren des Enzyms. Die Beschreibung der Untereinheiten des Cytochrom bc1 Komplexes erfolgt am Beispiel des Cytochrom bc1 Komplexes von Rhodobacter sphaeroides [63, 76]. Dieser besteht aus vier Untereinheiten: die Cytochrom bUntereinheit, die Cytochrom c1-Untereinheit, das Rieske-Eisen-Schwefel-Protein und die Untereinheit IV (vgl. auch Abbildung A.3.5.1). Die Cytochrom b-Untereinheit (mit einer Molekularmasse von 40 kDa) bindet zwei Häme des b-Typs, Häm bH (Cytochrom b5615) mit einem hohem Halbstufenpotential (Em = 50 mV) und Häm bL (Cytochrom b566) mit einem niedrigen Halbstufenpotential (Em = -90 mV), und bildet die Chinonbindungsstellen Qi und Qo. Sie ist ein integrales Membranprotein, das aus acht transmembranen Helices und einer amphipatischen α-Helix, die sich außerhalb der Membran befindet [77], besteht, in dem die Häme senkrecht zur Membran in einer Linie angeordnet sind. An der Qo-Bindungsstelle wird das Dihydrochinon aus der Membran gebunden und oxidiert. 5 Die Bezeichnung der Cytochrome erfolgt anhand der Wellenlänge im Maximum der α-Bande im UVVIS-Absorptionsspektrum (siehe Abbildung B.2.5.1). 18 Einleitung Cytochrom c1 (34 kDa) ist in der Membran durch eine C-terminale transmembrane αHelix verankert, während der größte Teil des Proteins, das auch die Häm-Gruppe (Em = 270 mV) bindet, sich außerhalb der Membran befindet. Hier verlassen die Elektronen den Cytochrom bc1 Komplex. Das Rieske Eisen-Schwefel Protein (24 kDa) wurde zuerst in den Membranen von Rinderherz Mitochondrien von J. S. Rieske et al. [78-80] gefunden. Es bindet über die N-terminale Domäne an die Membran und ist auf diese Weise mit dem Komplex assoziiert. Der [2Fe-2S]-Cluster befindet sich in dem C-terminalen Teil in Nähe der Oberfläche des Proteins und die koordinierenden Proteinreste sind in allen RieskeProteinen konserviert. Der [2Fe-2S]-Cluster ist von zwei Cysteinen und zwei Histidinen koordiniert und hat ein hohes Halbstufenpotential von ca. 300 mV. Er ist somit der Oxidationsfaktor des Cytochrom bc1 Komplexes. Die Untereinheit IV des Cytochrom bc1 Komplexes aus Rhodobacter sphaeroides hat eine Molmasse von 14 kDa und spielt eine Rolle bei der Bindung von Chinon sowie für die Struktur [67, 72, 76, 81]. Die Elektronentransferreaktionen im Cytochrom bc1 Komplex werden im nächsten Kapitel im Rahmen der Beschreibung des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers nach dem sogenannten Q-Zyklus behandelt. A.3.5. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer als Q-Zyklus Rhodobacter sphaeroides ist das am besten untersuchte photosynthetische Purpurbakterium in Bezug auf die Teilreaktionen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer. Auf Grundlage der Untersuchungen an dieser Spezies ist für die photosynthetische Elektronentransferkette ein Modell erarbeitet worden, das auf den Q-Zyklus basiert, wie ursprünglich von P. Mitchell [82, 83] vorgeschlagen (Abbildung A.3.5.1). Dieses Modell beschreibt die Sequenz der lichtinduzierten Elektronentransferschritte und den Mechanismus der Protonenpumpe, durch die die Energieumwandlung des Sonnenlichtes in chemische Energie erfolgt [84-87]. An diesem Prozess sind zwei transmembrane Proteinkomplexe beteiligt: das Reaktionszentrum und der Cytochrom bc1 Komplex (oder Ubichinol-Cytochrom c1Oxidoreduktase-Komplex). Diese beiden Komplexe sind durch zwei weitere 19 Einleitung Redoxkomponenten miteinander verbunden: das Ubichinon in der hydrophoben Membran und das lösliche Cytochrom c2 im Periplasma. Diese sind Elektronenakzeptoren bzw. Elektronendonatoren zum Reaktionszentrum. Das Ubichinon ist in der Membran gegenüber dem Reaktionszentrum und dem Cytochrom bc1 Komplex im stöchiometrischen Überschuss vorhanden (UbichinonPool). In Membranen von Rhodobacter sphaeroides sind je nach Wachstumsbedingungen 20 - 60 Ubichinon-Moleküle pro Reaktionszentrum vorhanden. Das Ubichinon reagiert am Cytochrom bc1 Komplex an zwei katalytischen Bindungsstellen: Qo auf der periplasmatischen Seite der Membran und Qi auf der cytoplasmatischen Seite. Die beiden Bindungsstellen können selektiv gehemmt werden durch verschiedene Typen von Inhibitoren, wie z.B. Antimycin und Myxothiazol. Im folgenden wird die Sequenz der Teilreaktionen nach einer Photoaktivierung des Reaktionszentrums in einem einzelnen Turnover betrachtet. Wenn das System unter oxidierenden Bedingungen (200 mV bei pH=7) vollständig dunkeladaptiert ist, sind vor der Photoaktivierung der primäre Donator P (Em,7 = 450 mV), das lösliches Cytochrom c2 (Em,7 = 340 mV), die Komponenten des Cytochrom bc1 Komplexes mit hohem Potential, das FeS-Zentrum (Em,7 = 290 mV) sowie Cytochrom c1 (Em,7 = 270 mV) reduziert. Hingegen liegen im Dunkeln die beiden Cytochrome b561 (Em,7 = 50 mV) und b566 (Em,7 = -90 mV), sowie die Ubichinone QA und QB des Reaktionszentrum oxidiert vor. Der Ubichinon-Pool in der Membran (Em,7 = 90 mV) liegt bei diesen Bedingungen vollständig oxidiert vor [88]. Unter diesen Bedingungen wird durch die Photoaktivierung zunächst das Semichinon von QB gebildet. Ein zweiter lichtinduzierter Elektronentransfer ist notwendig, um das Dihydrochinon QBH2 zu bilden, welches mit dem Cytochrom bc1 Komplex reagieren kann. Es ist jedoch bei den üblichen spektroskopischen Untersuchungen nicht möglich, eine vollständige Dunkeladaptation zu erhalten, so dass alleine das Messlicht ausreicht, um in einem Teil der Reaktionszentren QB- zu erzeugen. In diesen Reaktionszentren wird das Dihydrochinon bereits nach den ersten Laserblitz gebildet. Der primäre Donator P+ oxidiert das lösliche Cytochrom c2, das wiederum Cytochrom c1 und das FeS-Zentrum im Cytochrom bc1 Komplex (high potential Zweig) oxidiert. Das Dihydrochinon verlässt das Reaktionszentrum und reagiert an der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes in einer konzertierten, diffusionskontrollierten Reaktion. Ein Elektron reduziert den high potential Zweig des 20 Einleitung Cytochrom bc1 Komplexes und das andere den low potential Zweig, so dass schließlich das an der Qi-Bindungsstelle gebundene Ubichinon reduziert wird. Der Protonentransfer vom Cytoplasma ins Periplasma ist am zyklischen Elektronentransfer gekoppelt. Myxothiazol 2 H+e Periplasma - cyt c2 e FeS Licht Em= +340 mV cyt c1 - e Em = 270 mV Em = 290 mV 2e- Qo P QH2 Em=+450 mV cyt b566 Em = −90 mV Q e- QH2 e- Q cyt b561 Em = 50 mV Q QH2 QH2 - e Qi bc1 Komplex Cytoplasma 2 H+ e- Q QB Antimycin Plasmamembran QA Em = 0 mV RC 2 H+ Abbildung A.3.5.1: Modifizierter Q-Zyklus-Mechanismus für den zyklischen Elektronentransfer in Rhodobacter sphaeroides nach A. R. Crofts et al. [84]. Die Elektronentransferschritte sind mit durchgezogenen Pfeilen eingezeichnet, die Diffusion von Q und QH2 in der Membran mit gestrichelten Pfeilen, und die Aufnahme bzw. Abgabe von Protonen mit gepunkteten Pfeilen. Die Anregung durch Licht wird durch den gezackten Pfeil symbolisiert. Die Halbstufenpotentiale Em der Redoxpartner bei pH = 7 sind angegeben. P: primärer Donator des Reaktionszentrums (RC) Q: Ubichinon QH2: Dihydroubichinon QA, QB,: Bindungsstellen für Ubichinon bzw. Dihydroubichinon am Reaktionszentrum Qi und Qo: Bindungsstellen für Ubichinon bzw. Dihydroubichinon am Cytochrom bc1 Komplex b, c1 und FeS: Cytochrom b, c1 und das Rieske-Protein im Cytochrom bc1 Komplex Für die Reduktion von Q zu QH2 am Reaktionszentrum (RC) müssen zwei Anregungen von P erfolgen. Für die Oxidation eines Äquivalents von QH2 müssen die Elektronentransferschritte von Qo, FeS, cyt c1 und cyt c2 zu P zweimal erfolgen, hingegen die Schritte von Qo über cyt b566 und cyt b561 zu Qi nur einmal. 21 Einleitung Bei reduzierenden Redoxbedingungen (150 - 100 mV) ist der Redoxzustand der Komponenten mit Ausnahme des Ubichinon-Pools, der jetzt teilweise reduziert vorliegt, unverändert. Da jetzt schon vor der Anregung Dihydroubichinon-Moleküle zur Verfügung stehen, ergibt sich nach dem Anregungsblitz eine schnelle Reaktion an der Qo-Bindungsstelle. Dieses Modell wurde aus Messungen an Chromatophoren (Vesikel der intracytoplasmatischen Membran, s.o.) in Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus erhalten. In diesen Spezies ist kein am Reaktionszentrum gebundenes Tetrahäm vorhanden. Cytochrom c2 reduziert direkt den primären Donator P+. Diese Spezies scheinen jedoch eher die Ausnahme bei den Purpurbakterien zu bilden. Bei viele Arten (Blastochloris viridis [41], Chromatium vinosum [48], Rhodocyclus gelatinosus [47], Ectothiorhodospira mobilis, Chloroflexus aurantiacus [50], Rhodospirillum salinarum [89] und Rhodoferax fermentans [90]) wird P+ vom am Reaktionszentrum gebundenen multihämen Cytochrom c reduziert (s.o.). Man vermutet, dass das Schema des Q-Zyklus in seinen grundsätzlichen Elektronentransferschritten auch in diesen Arten gilt. Experimentelle Nachweise wurden in Chromatophoren von Chromatium vinosum [91] und Blastochloris viridis [92] erhalten, auch wenn systematische Untersuchungen der vom Cytochrom bc1 Komplex katalysierten Reaktionen fehlen. Untersuchungen an ganzen Zellen von Blastochloris viridis [92] zeigen, dass sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen6 eine Oxidation des high potential Häms H2 10 µs nach der Anregung durch einen Blitz beobachtet werden kann, das wiederum vom löslichen Cytochrom c2 mit einer Halbwertszeit von 110 µs bei aeroben Bedingungen und 40 µs bei anaeroben Bedingungen rereduziert wird. Das lösliche Cytochrom c2 wird dann mit einer Halbwertszeit von 25 ms bei aeroben Bedingungen und 8 ms bei anaeroben Bedingungen in einer Reaktion, an der der Cytochrom bc1 Komplex beteiligt ist, rereduziert. Eine Photooxidierung der low potential Häme konnte selbst bei den reduzierendsten Bedingungen, d.h. bei anaeroben Bedingungen, nicht beobachtet werden. Im gebundenen Cytochrom c erfolgt der lichtinduzierte Elektronentransfer bei höheren Potentialen, wenn nur ein high potential Häm reduziert vorliegt, mit einer Halbwertszeit von 230 ns von H1 zum primären Donator P+. Bei niedrigeren Potentialen, wenn beide high potential Häme reduziert vorliegen, erfolgt der Elektronentransfer von H1 zu P+ mit einer 6 Aerobe Bedingungen wurden erzeugt, indem Luft durch die Zellsuspension geleitet wurde, anaerobe Bedingungen hingegen durch Zugabe von 20 mM Glucose und 3 mg/ml Glucoseoxidase, wobei Stickstoff durch die Suspension geleitet wurde [92]. 22 Einleitung Halbwertszeit von 190 ns. H1 wird anschließend von H2 mit einer Halbwertszeit von 1,7 µs reduziert und dieses wird wiederum von Cytochrom c2 rereduziert [93]. Der beschriebene Mechanismus des Elektronentransfers im gebundenen Cytochrom c von Blastochloris viridis ist in Abbildung A.4.5.1 schematisch dargestellt und mit dem Mechanismus des Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans verglichen (siehe Kapitel A.4.5.). Zur Zeit geht man davon aus, dass bei den Bakterienarten mit einem am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c je nach Redoxpotential das Oxidationsäquivalent, das sich nach Anregung bildet, zeitweise auf einem der high potential Häme des Reaktionszentrums lokalisiert ist. Die Reduktion dieses Häms erfolgt dann durch eine lösliche Komponente im Periplasma, das die Elektronen vom Cytochrom bc1 Komplex erhält. Die Art des periplasmatischen Transporters hängt von der untersuchten Spezies ab [94]. Außer Cytochrom c2 [92] kann dies auch ein HiPIP (ein FeS-Protein mit hohem Redoxpotential) und/oder ein Cytochrom c8 sein [95-97]. A.4. Aerobe photosynthetische Bakterien Bei den meisten fakultativ phototrophen Purpurbakterien, wie z.B. Rhodobacter sphaeroides, die sowohl zu einer phototrophen als auch zu einer chemotrophen Energiegewinnung7 befähigt sind, ist neben der Lichteinstrahlung vor allem der Sauerstoffpartialdruck Photosyntheseapparates der wichtigste reguliert, so Faktor, dass 7 ein der hoher die Bildung des Sauerstoffpartialdruck An dieser Stelle sollen einige in Zusammenhang mit Mikroorganismen verwendete Begriffe erläutert werden (nähere Ausführungen finden sich z.B. in [98]): Autotrophe Mikroorganismen speichern Energie, in dem sie aus anorganischen Verbindungen energiereiche Verbindungen synthetisieren. CO2 ist die einzige Kohlenstoffquelle. Heterotrophe Organismen benötigen organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle. Phototrophe Bakterien speichern die Sonnenenergie durch Synthese energiereicher Verbindungen (Photosynthese). Photoautotrophe Organismen nutzen die Sonnenenergie und CO2 ist die einzige Kohlenstoffquelle. Chemotrophe Organismen benutzt energiereiche Verbindungen als Energiequelle. Chemohetrotrophe Organismen benutzen energiereiche Verbindungen als Energiequelle und brauchen organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle. Aerobe Bakterien benötigen Sauerstoff für das Zellwachstum. Anaerobe Bakterien benötigen kein Sauerstoff für das Zellwachstum und können nicht an der Luft (21% Sauerstoff) wachsen. Für sie ist Sauerstoff toxisch. 23 Einleitung besonders im Licht die Biosynthese des Photosyntheseapparates hemmt [99-101]. Eine Ausnahme dazu bilden Rhodovulum sulfidophilum und Rhodospirillum cetenum, die auch bei Anwesenheit von Sauerstoff den Photosyntheseapparat ausbilden können [102, 103]. Ende der 70er Jahre wurde erstmals eine neue physiologische Gruppe von Bakterien entdeckt, die Bacteriochlorophyll a-haltigen, obligat aeroben photosynthetischen Bakterien [104-106]. Die aeroben photosynthetischen Bakterien8 können den Photosyntheseapparat ausschließlich unter aeroben Bedingungen bilden, und ein effizienter photoinduzierter Ladungstransfer findet nur unter aeroben Bedingungen statt. Unter anaeroben Bedingungen hingegen findet keine Photosynthese statt, d.h. diese Bakterien sind nicht in der Lage, phototroph in Abwesenheit von Sauerstoff bzw. von externen Oxidantien zu wachsen. In den letzten Jahrzehnten wurden über 20 Spezies aerober photosynthetischer Bakterien aus verschiedenen marinen und Süßwasserstandorten isoliert und untersucht (zum Überblick siehe [107] und [109]). Alle bisher bekannten Arten mit Ausnahme von Roseobacter denitrificans haben eine obligat aerobe chemoheterotrophe Lebensweise. Roseobacter denitrificans ist in der Lage, auch anaerob mit Nitrat oder Trimethylaminoxid (TMAO) als Elektronenakzeptor im Licht zu wachsen [110, 111]. Da Licht und hoher Sauerstoff-Gehalt die Ausbildung des Photosyntheseapparates und die Synthese von Bacteriochlorophyll a hemmen, scheint die Photosynthese unter Standortbedingungen keinen signifikanten Beitrag zum Energiestoffwechsel der aeroben photosynthetischen Bakterien zu liefern. Über Nacht (also im Dunkeln) und bei niedrigem Sauerstoffgehalt wird der Photosyntheseapparat in geringem Umfang gebildet. Er kann in den frühen Morgenstunden bevor ein lichtbedingter Abbau der Photosynthesepigmente einsetzt, einen kleinen Beitrag zum Energiestoffwechsel der Bakterien leisten [112]. Unter Ausschluss von Sauerstoff im Licht findet kein Wachstum statt, da diese Bakterien keinen anaeroben Lichtstoffwechsel betreiben können. Die Ursache hierfür ist zur Zeit Gegenstand intensiver Untersuchungen. Die Tatsache, dass aerobe photosynthetische Bakterien nicht photoautotroph wachsen können und Sauerstoff benötigen, führte zur Hypothese, dass diese die evolutionäre Verbindung zwischen den photosynthetischen Purpurbakterien und den aeroben Heterotrophen bilden [113] oder in ihrer Entwicklung zu aeroben Bakterien 8 Diese neue Gruppe von Bakterien soll hier aerobe photosynthetische Bakterien genannt werden. Sie wurden in der Literatur zunächst als (obligat) aerobe Bacteriochlorophyll-enthaltende Bakterien [106], später auch als (obligat) aerobe Photoheterotrophen, aerobe anoxygene Bakterien, aerobe anoxygene Phototrophe [107], obligat aerobe phototrophe Bakterien und quasi-photosynthetische Bakterien [108] bezeichnet. 24 Einleitung einen überflüssigen, nicht funktionierenden Photosyntheseapparat beibehalten haben. Ferner könnten diese Organismen den Photosyntheseapparat aeroben Bedingungen angepasst haben und einen kompetenten photosynthetischen Elektronentransfer als zusätzliche Möglichkeit der Energiegewinnung im Rahmen eines effizienten heterotrophen Metabolisums aufrechterhalten [114]. Im Folgenden soll ein Überblick über die aeroben photosynthetischen Bakterien gegeben werden, wobei der Schwerpunkt auf Roseobacter denitrificans9 liegt. Diese Spezies ist am besten charakterisiert und wurde für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit verwendet. A.4.1. Habitat, Morphologie und Phylogenese Alle bisher bekannten Arten der aeroben photosynthetischen Bakterien haben eine obligat aerobe chemoheterotrophe Lebensweise. Roseobacter denitrificans bildet insofern eine Ausnahme, als diese Bakterien auch unter anaeroben Bedingungen in Anwesenheit von Elektronenakzeptoren wie Nitrat oder TMAO10 im Licht wachsen. Die aeroben photosynthetischen Bakterien wurden hauptsächlich aus nahrungsreichen, geschützten wässrigen Umgebungen wie Sandstränden, Seetang u.ä. isoliert. Die ersten Arten wurden in den marinen Gewässern an der japanischen Küste in der Nähe von Tokio gefunden [106]. Weitere marine Arten wurden an den Küsten Australiens [106] und der kanadischen Küste bei Vancouver [115] gefunden. Süßwasserarten wurden in Russland gefunden [116]. Trotz der weiten Verbreitung dieser aeroben photosynthetischen Bakterien in verschiedenen ökologischen Nischen, wo sie bis zu 30% der heterotrophen Bakterien ausmachen, ist die ökologische Bedeutung und ihre Rolle in den Populationen von Mikroben bis heute unklar. Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Verbreitung von aeroben photosynthetischen Bakterien über nahrungsreiche, geschützte ökologische Nischen hinausgeht und sie in den oberen Schichten der Ozeane der Welt verbreitet sind, wo sie mindestens 11% der gesamten mikrobiellen Organismen ausmachen [114, 117]. Die aeroben photosynthetischen Bakterien der Ozeane bilden eine relativ 9 Früher als Erythrobacter sp. OCh 114 bezeichnet. Trimethylamino-N-oxid 10 25 Einleitung einheitliche, weitverbreitete Klasse, die mit den phänotypisch vielfältigen aeroben photosynthetischen Bakterien der nahrungsreichen ökologischen Nischen verwandt sind, wobei letztere möglicherweise sich aus einem Vorläufer der ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien entwickelt haben könnten. Die ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien koexistieren mit den oxygenen Photoautotrophen der Ozeane und leisten einen nicht zu unterschätzenden Beitrag zum organischen und anorganischen Kohlenstoff-Zyklus im Ozean, dessen Details noch völlig unbekannt sind [117]. Neueste Analysen der Genome von ozeanischen aeroben photosynthetischen Bakterien zeigen, dass in den Ozeanen noch wesentlich mehr bisher noch nicht kultivierte und charakterisierte, z.T. nur entfernt miteinander verwandte Arten von aeroben photosynthetischen Bakterien verbreitet sind [118]. Alle bisher untersuchten aeroben photosynthetischen Bakterien haben eine gramnegative Zellwand, ihre Morphologien sind jedoch sehr verschieden. Die marine Spezies Roseobacter denitrificans, die 1979 von T. Shiba [106] isoliert wurde, vermehrt sich durch binäre Zellteilung und bildet ovoid bis stäbchenförmige Zellen mit einer Größe von ca. 0,5 µm x 1,0 µm. Die meisten Spezies sind mobil und haben polar oder subpolar angeordnete Flagellen (Geißeln). Die meisten Purpurbakterien haben zusätzlich zur Plasmamembran ein System von intracytoplasmatischen Membranen (ICM) mit Morphologien, die von Spezies zu Spezies variieren können. Die ICM wird aus der Plasmamembran gebildet und ist mit ihr verbunden. Sie kann Vesikel, Tubuli oder thylakoidähnliche Gebilde bilden. Die Proteinkomplexe des Photosyntheseapparates sind fast ausschließlich in den ICM zu finden. Bei den meisten Purpurbakterien wird die Ausbildung der ICM durch Licht und Sauerstoffpartialdruck reguliert. Bei den aeroben photosynthetischen Bakterien hingegen sind iIntracytoplasmatische Membranen wahrscheinlich nicht vorhanden und wurden in den Genera Erythrobacter und Erythromonas nicht gefunden. In Roseobacter denitrificans wurden hingegen gelegentlich vesikelähnliche Strukturen gefunden wie in Abbildung A.4.1.1 dargestellt [119]. 26 Einleitung Abbildung A.4.1.1: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Zelle von Roseobacter denitrificans [119]. Der Balken entspricht 0,5 µm. Man kann die innere cytoplasmatische und die äußere Membran erkennen sowie Vesikel in der Größe von ca. 100 nm Durchmesser, die die intracytoplasmatische Membran (ICM) bilden. Der BacteriochlorophyllGehalt der Zellen betrug 3,8 nmol/mg Trockengewicht. Die aeroben photosynthetischen Bakterien [107] bilden zwei marine (Erythrobacter und Roseobacter) und sechs Süßwasser-Genera (Erythromicrobium, Roseococcus, Porphyrobacter, Acidiphilium, Erythromonas und Sandaracinobacter). Phylogenetisch sind aerobe photosynthetische Bakterien im Stammbaum der photosynthetischen Bakterien in der α-Subklasse der Proteobakterien, zu denen die photosynthetischen Purpurbakterien gehören, einzuordnen11. Die starke Verbreitung in verschiedenen Untergruppen deutet darauf hin, dass sie sich aus verschiedenen unabhängigen Purpurbakterien entwickelt haben könnten. Interessanterweise bringt die vergleichende Sequenzanalyse der 16S ribosomalen RNA Roseobacter denitrificans in relativ nahe phylogenetische Verwandtschaft zu den fakultativen Phototrophen Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides [121], während es nur entferntere Verwandtschaft zu den anderen aeroben photosynthetischen Bakterien zeigt [122]. 11 Eine vereinfachte Beschreibung des Stammbaumes der photosynthetischen Bakterien und ihrer phylogenetischen Verwandtschaften findet sich in G. Drews [120]. 27 Einleitung A.4.2. Pigmente Charakteristisch für alle Arten von aeroben photosynthetischen Bakterien sind die großen Mengen an Carotinoiden, die deren Farbe bestimmen. Die Zusammensetzung variiert von Spezies zu Spezies. Ihre Funktion ist der Schutz vor photooxidativen Schäden sowie die Absorption von Licht zur Weiterleitung an die Lichtsammelkomplexe bzw. an das photosynthetische Reaktionszentrum. In Roseobacter denitrificans ist die rosarote Farbe durch Spheroidenon verursacht, das 95% des Carotionoidgehalts ausmacht [123]. Spheroidenon ist auch das häufigste Carotinoid bei semiaerob gezogenen Zellen von einigen Purpurbakterien wie Rhodobacter sphaeroides. Im Gegensatz zu den anderen Arten aerober photosynthetischer Bakterien besitzt Roseobacter denitrificans nur Carotinoide, die nicht-kovalent an das Reaktionszentrum und die Lichtsammelkomplexe gebunden sind (Pigment-ProteinKomplexe) und als lichtsammelnde Pigmente fungieren [124]. Spektroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass Roseobacter denitrificans ein Reaktionszentrum und zwei Antennenkomplexe, LH I bzw. B870 (ähnlich dem in Purpurbakterien) und LH II bzw. B806, besitzt [125, 126]. In den aeroben photosynthetischen Bakterien ist die einzige Form von Bacteriochlorophyll, die gefunden wurde, das Bacteriochlorophyll a, das nichtkovalent in Pigment-Protein-Komplexen (LH I, LH II und Reaktionszentrum) eingebaut ist und Absorptionsmaxima zwischen 800 und 870 nm aufweist (Abbildung A.4.2.1). Im Vergleich zu den Purpurbakterien enthalten die aeroben Bakterien viel geringere Mengen an Bacteriochlorophyll (5 - 10% bzw. ca. 1 - 2 nmol/mg Zellen Trockengewicht [109]), daher überrascht eine geringe Bildung der für die Photosynthese spezialisierten intracytoplasmatischen Membran (ICM) nicht. Das Bacteriochlorophyll a, das von Roseobacter denitrificans isoliert wurde, enthält wie auch bei den meisten Purpurbakterien einen Phytolrest. Das Verhältnis von Bacteriochlorophyll zu Carotinoiden liegt in ganzen Zellen aerober photosynthetischer Bakterien bei ca. 1 : 10, wobei dieser Wert durch Licht und Sauerstoffgehalt während des Zellwachstums beeinflusst wird [109]. Ferner bilden diese Bakterien einen Photosyntheseapparat aus, der in seiner Organisation dem der Purpurbakterien entspricht, aber in wesentlich geringeren Konzentrationen synthetisiert wird. Die bisher bekannten Eigenschaften des Photosyntheseapparates 28 Einleitung in den aeroben photosynthetischen Bakterien sollen im Folgenden beschrieben 900 800 900 800 900 900 800 800 Absorption werden, wobei besonders auf Roseobacter denitrificans eingegangen wird. Wellenlänge (nm) Abbildung A.4.2.1: Absorptionsspektren von Membransuspensionen aerober Bakterien Roseococcus thiosulfatophilus (A), Erythrobacter litoralis (B), Erythromicrobium hydrolyticum (C) und Erythromicrobium ezovicum (D) [109]. Die Ausschnitte zeigen die Absorptionsmaxima des in Proteinkomplexen (Antennenkomplexe und Reaktionszentrum) eingebauten Bacteriochlorophylls a. A.4.3. Struktur und Funktion der Antennenkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien Die Absorptionsmaxima der Antennenkomplexe in den aeroben Bakterien weisen oft unübliche Wellenlängen auf, wie z.B. bei Roseococcus thiosulfatophilus, der einen LH I Komplex B856 (mit einem Absorptionsmaximum bei 856 nm) enthält. Roseobacter denitrificans besitzt zwei Antennenkomplexe, B870 (LH I) und B806 (LH II). LH II wurde isoliert und gereinigt und besteht aus zwei Polypeptiden α und β mit Molekularmassen von jeweils 5,0 kDa und 7,0 kDa. Der Lichtsammelkomplex weist als Pigmente Carotinoide (95% Spheroidenon) und Bacteriochlorophyll a auf. Das UV-VIS-Absorptionsspektrum weist neben dem Absorptionsmaximum bei 806 nm, Bacteriochlorophyll-Absorptionsbanden bei 370 nm und 590 nm auf. Die Bande bei 510 nm ist den Carotinoiden zuzuschreiben (Abbildung A.4.3.1). Die Funktion der 29 Einleitung Lichtsammelkomplexe besteht darin, Lichtquanten zu absorbieren und die Anregungsenergie möglichst effizient mittels Förster-Resonanzenergietransfer an das Reaktionszentrum weiterzuleiten (siehe Kapitel A.3.1.). Im Vergleich zu den Purpurbakterien überlappen die Absorptionsmaxima von B806 (LH II) und B870 (LH I) nur sehr wenig. Untersuchungen von K. Shimada [126] zeigen, dass der Energietransfer von LH II zum LH I-RC-Komplex12 trotzdem effizient verläuft. Das Fluoreszenz-Spektrum der Membran weist bei Raumtemperatur (bei einer Anregungswellenlänge von 800 nm) eine starke Emissionsbande bei 885 nm und eine schwache bei 820 nm auf, die jeweils B870 und B806 zugeschrieben werden können. Vergleicht man das Emissionsspektrum der Membran mit dem einer mit Detergens behandelten Membran, beobachtet man bei der Fluoreszenzbande von B806 einen sehr starken Anstieg und bei der von B870 eine Abnahme. Die Fluoreszenz von B806 wird also in den intakten Membran unterdrückt, was auf einen effizienten Energietransfer von LH II auf den LHI-RC-Komplex schließen lässt. Der Grund für die hohe Effizienz des Energietransfers ist vermutlich die strukturelle Anordnung der Lichtsammelkomplexe in der Membran (siehe Kapitel A.3.1.). Obwohl die Lichtsammelkomplexe in den aeroben photosynthetischen Bakterien in den Absorptionseigenschaften signifikant verschieden von denen der Purpurbakterien sind, scheint ihre Organisation grundsätzlich ähnlich zu sein [109]. 12 RC steht für Reaktionszentrum. 30 Einleitung Absorption ,6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,1 0,0 300 400 500 600 700 800 900 Wellenlänge (nm) Abbildung A.4.3.1: Absorptionsspektrum vom Lichtsammelkomplex LH II aus Roseobacter denitrificans [127]. Die Absorptionsbanden des Bacteriochlorophyll a finden sich bei 370 nm, 590 nm und 806 nm. Bei 510 nm befindet sich eine breite Bande der Absorption der Carotinoide. A.4.4. Struktur und Funktion der Reaktionszentren Die Anwesenheit eines Reaktionszentrums in aeroben photosynthetischen Bakterien wurde zunächst Anfang der 80iger Jahre in Roseobacter denitrificans und Erythrobacter longus [119] durch lichtinduzierte Absorptionsänderungen nachgewiesen. Später konnte das Reaktionszentrum von Roseobacter denitrificans isoliert werden [128]. Die Absorptionsspektren im oxidierten und reduzierten Zustand ähneln den entsprechenden Spektren von Rhodobacter sphaeroides mit Ausnahme der Cytochrom-Banden und der Carotinoid-Banden. Die Cofaktoren des Reaktionszentrums, die die transmembrane Ladungstrennung katalysieren (siehe Kapitel A.3.2. und A.3.3.) sind die gleichen wie in Blastochloris viridis. Das Protein besteht aus vier Untereinheiten, und davon konnte eine als Cytochrom-Untereinheit identifiziert werden [128]. Kürzlich konnte die Primärstruktur der Untereinheiten L und M des Reaktionszentrums sowie der Polypeptide α und β des LH I Komplexes durch Sequenzanalyse des puf Operons, das die Gene der Untereinheiten L, M und C des Reaktionszentrum (pufLMC) sowie der Polypeptide des LH I Komplexes (pufAB) enthält, ermittelt werden [129, 130]. Das pufC Gen kodiert die Untereinheit 31 Einleitung des tetrahämen Cytochroms c, das aus 352 Aminosäuren besteht (Mr = 39043 Da). Dabei sind 20% bzw. 34% der Aminosäuren identisch mit den Aminosäuren der Cytochrom c-Untereinheit von Chloroflexus aurantiacus bzw. Rubrivirax gelatinosum. Der hydrophobe N-terminale Bereich ist wahrscheinlich für die Verankerung der Untereinheit Roseobacter in der Membran denitrificans, verantwortlich. Blastochloris viridis, Das Sequenz-Alignment Rubrivirax gelatinosum von und Chloroflexus aurantiacus hat es ermöglicht, die Aminosäuren zu identifizieren, die die Häme binden (Cys-X-X-Cys). Bislang gab es nur relativ wenige Arbeiten, die sich mit der physikalischen Charakterisierung der Reaktionszentren aerober photosynthetischer Bakterien beschäftigten. Messungen an Membranen aus Roseobacter denitrificans ergaben für den primären Elektronenakzeptor QA ein Halbstufenpotential von Em,7 = 35 mV [131]. Dieser Wert war wesentlich größer verglichen mit dem Halbstufenpotential von Em,7 = 0 mV bzw. Em,7 = -100 mV, den Dutton et. al. für Chromatophoren aus Rhodobacter sphaeroides bzw. Chromatium vinosum gefunden haben[132]. Daraus schlossen K. Okamura et al. [131], dass QA in dunkeladaptierten Zellen reduziert vorliegt. Da QA ein Ein-Elektronen-Akzeptor ist, kann unter diesen Bedingungen kein lichtinduzierter Elektronentransfer stattfinden. In Gegenwart von Sauerstoff wird QAoxidiert, und der Prozess der Photosynthese kann ablaufen. Dies erklärt, warum diese Bakterien Sauerstoff zum Wachsen benötigen. In isolierten Reaktionszentren wurde für QA ein Wert von Em = -44 mV und für den primären Donator P ein Halbstufenpotential von Em,7 = 435 mV gefunden [128]. Das Ergebnis für QA entspricht dabei im Rahmen der Messgenauigkeit dem von Rhodobacter sphaeroides [133]. Der Grund für diese Diskrepanz zwischen den gemessenen Daten an Reaktionszentren und Membranen ist unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Der two electron gate Mechanismus konnte durch Untersuchung der binären Oszillationen, die aus der Ubisemichinonbildung nach Lichtanregung resultieren, durch eine Sequenz von vier aufeinanderfolgenden Anregungsblitzen verifiziert werden. Auch die Ladungsrekombinationskinetiken ähneln denen in Rhodobacter sphaeroides (siehe Kapitel A.3.3.). Für die Rekombination von P+QA- zu PQA bzw. von P+QB- zu PQB wurde jeweils eine Halbwertzeit von 20 ms (in Anwesenheit von 10 mM o-Phenanthrolin) bzw. 0,8 s ermittelt [128]. 32 Einleitung Ebenso wurden in Roseobacter denitrificans die thermodynamischen und spektroskopischen Eigenschaften des tetrahämen Cytochrom c im isolierten Reaktionszentrum untersucht [108]: Tabelle A.4.4.1: Physikochemische Eigenschaften der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans [108]. Die Halbstufenpotentiale wurden bei pH = 7 angegeben. Häm Halbstufenpotential Absorptionsmaximum l (a-Bande) / nm Em,7 / mV Name H1 290 555 Cytochrom c555 H2 240 554 Cytochrom c554 L1 / L2 1 90 553 Cytochrom c553 1 Die low potential Häme können spektroskopisch nicht unterschieden werden. Aus Untersuchungen des Linearen Dichroismus wurde die Orientierung der Häme in bezug auf die Membranebene abgeschätzt [108]. Die Häme H1, H2, L1 und L2 bilden jeweils Winkel von 40°, 55°, 90° bzw. 40° und 40° bzw. 90° mit der Membranebene. L1 und L2 haben ein sehr ähnliches Potential und können deshalb nicht unterschieden werden. Die Orientierung der Häme in Blastochloris viridis, Rubrivirax gelatinosum, Chromatium vinosum, Chloroflexus aurantiacus und Roseobacter denitrificans ist in Tabelle A.4.4.2 verglichen. In Roseobacter denitrificans sind die Halbstufenpotentiale der high potential Häme H1 und H2 niedriger als in den anderen photosynthetischen Bakterien (in Blastochloris viridis ist Em,7 = 370 mV für H1 und Em,7 = 320 mV für H2; in Chromatium vinosum ist Em,7 = 350 mV für H1 und Em,7 = 320 mV für H2). Hingegen sind die Halbstufenpotentiale der low potential Häme L1 und L2 höher als in Blastochloris viridis und Chromatium vinosum. Ähnlicher sind die Werte bei Rubrivirax gelatinosum und Chloroflexus aurantiacus [47, 50]. 33 Einleitung Tabelle A.4.4.2: Orientierung der Häme der tetrahämen Cytochrom cUntereinheit des Reaktionszentrums in bezug auf die Membranebene verschiedener photosynthetischer Bakterien. Blastochloris viridis Rubrivirax gelatinosum Chromatium vinosum Chloroflexus aurantiacus Roseobacter denitrificans [108] [42] [48] [134] [108] H1 80° 0° 30° 30° 40° L1 60° 90° 0° bzw. 40°1 40° - 50° 90° bzw. 40°1 H2 55° 90° 90° 90° 55° L2 85° 0° 40° bzw. 0°1 45° 40° bzw. 90°1 1 Die Häme L1 und L2 können bei diesen Spezies nicht spektroskopisch unterschieden werden. A.4.5. Der zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans und beteiligte Enzymkomplexe Das Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans hat ebenso wie in anderen aeroben photosynthetischen Bakterien der Genera Erythromonas, Sandaracinobacter und Roseococcus [115, 116] eine tetrahäme Cytochrom cUntereinheit. Die Elektronentransferkinetiken vom tetrahämen Cytochrom c zum primären Donator P+ wurden kürzlich im Detail an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans untersucht [93]. In einem weiten Bereich des eingestellten Redoxpotentials (Eh = 500 - 100 mV) zeigt die Reduktionskinetik des durch Anregung mit einem Laserimpuls oxidierten primären Donators P+ zu P drei exponentielle Phasen (vgl. Abbildung A.4.5.1): eine langsame Phase mit einer Halbwertzeit t1/2 > 10 ms und zwei schnelle Phasen mit t1/2 = 5 µs bzw. 280 ns. Die langsame Phase überwiegt bei einem eingestellten Redoxpotential Eh > 290 mV und verschwindet, wenn das Potential verringert wird mit einem scheinbaren Halbstufenpotential Em,7 = 290 mV. Diese Phase entspricht der Rekombination von P+ mit QA- zu PQA und verschwindet mit zunehmender Reduktion von H1 (Em,7 = 290 mV) bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials. Die schnelle Phase mit 5 µs entsteht in dem Maße wie die langsame verschwindet und entspricht dem Elektronentransfer von H1 nach P+. Kommt man bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials in den 34 Einleitung Bereich, in dem H2 anfängt, vor der Photoanregung reduziert vorzuliegen (Eh ≈ 240 mV), verschwindet die 5 µs Phase und wird nach und nach durch die schnellere 280 ns Phase ersetzt. Diese Phase entspricht dem Elektronentransfer von H2 zu P+. Die Elektronentransferkinetik zwischen den high potential Hämen und dem primären Donator in Roseobacter denitrificans unterscheidet sich stark von der in Blastochloris viridis. In Blastochloris viridis erfolgt die Reduktion des primären Donators P+ mit 230 ns, wenn H1 reduziert vorliegt, und mit 190 ns, wenn beide high potential Häme vor der Anregung reduziert sind, wobei H2 zunächst H1 mit einer Halbwertszeit t1/2 = 1,7 µs reduziert [135]. In Roseobacter denitrificans ist der Elektronentransfer von H1 zu P+ 20mal langsamer. Das lässt vermuten, dass H1 nicht das dem Reaktionszentrum am nächsten liegende Häm ist. Zudem lässt sich die Verringerung der Halbwertszeit des Elektronentransfers von den Hämen auf P+, wenn beide Häme reduziert vorliegen, nicht mit einem Elektronentransfer von H2 auf H1, welches dann P reduziert, erklären. Daher wurde vorgeschlagen, dass in Roseobacter denitrificans im Unterschied zu Blastochloris viridis H2 das dem Reaktionszentrum nächste Häm sein muss. Aus der Sequenzanalyse und aus dem Vergleich mit Blastochloris viridis und Rhodocyclus gelatinosus wird vermutet, dass ein low potential Häm zwischen H1 und H2 liegt. Demnach wäre die Reihenfolge der Häme im gebundenen Cytochrom c wie folgt: P H2 L1 H1 L2 35 Einleitung Em,7 = 450 mV Em,7 = 435 mV Em,7 = 380 mV Em,7 = 240 mV Em,7 = 20 mV Em,7 = 90 mV Em,7 = 310 mV Em,7 = 290 mV Em,7 = -60 mV Em,7 = 90 mV Abbildung A.4.5.1: Anordnung der Häme im tetrahämen Cytochrom c von Roseobacter denitrificans (rechts) im Vergleich zu Blastochloris viridis (links) nach D. Garcia et al. [93]. Angegeben sind die Halbwertszeiten für die Elektronentransferreaktionen, die durch Pfeile symbolisiert sind sowie die Halbstufenpotentiale der Redoxkomponenten (siehe Text). Bei 0 mV, wenn die low potential Häme reduziert vorliegen wird P+ mit einer Halbwertszeit von 160 ns reduziert, ein ähnlicher Wert wie bei Blastochloris viridis [92]. Die Organisation der Häme, wie sie für Roseobacter denitrificans vorgeschlagen wurde, konnte auch für Chromatium vinosum und Rhodocyclus gelatinosus verifiziert werden [47, 48]. In beiden Spezies ist die Ebene des Häms H2 senkrecht zur Membranebene und damit parallel zum Bacteriochlorophylldimer. Diese Orientierung begünstigt einen schnellen Elektronentransfer zwischen H2 und P+. Ähnliches könnte bei Roseobacter denitrificans der Fall sein. Die Ebene des Häms H2 bildet in der Tat einen größeren Winkel mit der Membranebene als das Häm H1. Der Vergleich zeigt, wie die funktionelle Anordnung der Häme in der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums von der Spezies abhängt. In Chloroflexus aurantiacus wurde z.B. eine Reihenfolge P-H1-L1-L2-H2 postuliert [136]. Untersuchungen an ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans zeigen, dass neben dem tetrahämen Cytochrom c noch ein lösliches Cytochrom c am lichtinduzierte Elektronentransfer beteiligt ist [108]. Es wurden blitzinduzierte Absorptionsänderungen in der α-Bande der Cytochrome des c-Typs zeitabhängig unter aeroben Bedingungen gemessen. Das Differenzspektrum hat ein Absorptionsmaximum bei 554 nm, aufgenommen 10 µs nach der Anregung, was der Oxidation von H2 entspricht. Nach weiteren 6 ms ist das Maximum auf 552 nm 36 Einleitung verschoben und zeigt somit die Beteiligung eines anderen Cytochrom c, das als Cytochrom c551 identifiziert wurde [108]. Cytochrom c551 wurde isoliert und aufgereinigt [137] und ist das häufigste lösliche Cytochrom in Roseobacter denitrificans. Es hat Absorptionsmaxima bei 277 nm, 410 nm sowie zwischen 524 und 525 nm im oxidierten Zustand, während im reduzierten Zustand die Werte bei 415 nm, 522 nm sowie bei 550,5 nm liegen. Das Halbstufenpotential beträgt Em,7 = 250 mV bei pH = 7. Die Aminosäuresequenzanalyse [138] hat ergeben, dass dieses lösliche Protein aus 119 Aminosäuren besteht und einer Molmasse von 13235 Da hat. Das Alignment mit den Sequenzen anderer Cytochrome c zeigt, dass es dem Cytochrom c2 von Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides und Paracoccus denitrificans ähnlich ist. Obwohl die physikochemischen Eigenschaften ähnlich sind, überträgt Cytochrom c551 die Elektronen nicht wie Cytochrom c2 direkt auf P+, sondern über die tetrahäme Cytochrom c-Untereinheit. Das Cytochrom c551 in Roseobacter denitrificans ist möglicherweise sowohl an der Photosynthese als auch an der Zellatmung beteiligt [139]. Versuche an ganzen Zellen zeigen, dass Cytochrom c551 von H2 mit einer Halbwertzeit von 1,5 ms oxidiert wird [108]. Die darauffolgende Rereduktion erfolgt mit t1/2 > 10 ms. Wird die Viskosität der Zellsuspension durch Zugabe von 20% Ethylglycol erhöht, verdoppelt sich sowohl die Halbwertszeit der Oxidation als auch die der Rereduktion des Cytochrom c551. Dieses steht in Einklang mit der Hypothese, dass Cytochrom c551 mit dem tetrahämen Cytochrom reagiert und seinerseits Elektronen aus der zyklischen Transportkette in einem diffusionskontrollierten Prozess zweiter Ordnung erhält. Es ist anzunehmen, dass auch in Roseobacter denitrificans ein zyklischer Elektronentransfer stattfindet, an dem ein Cytochrom bc1 Komplex beteiligt ist. Dieser Komplex wurde bisher nicht isoliert, aber seine Beteiligung in der aeroben Zellatmungskette vorgeschlagen, um die Inhibierung durch spezifische Inhibitoren wie Antimycin und Myxothiazol zu erklären [139]. In der Literatur sind bisher keine Daten veröffentlicht worden, die die Beteiligung des Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer zeigen. In ganzen Zellen konnte gezeigt werden, dass die Rereduktion von Cytochrom c551 mit zunehmender Konzentration an Myxothiazol (< 1 µM) verlangsamt wird [108]. Dieses Ergebnis lässt die Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes vermuten und ist im Einklang mit der Hypothese, dass Cytochrom c551 den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer 37 Einleitung ermöglicht, indem es Elektronen vom Cytochrom bc1 Komplex übernimmt und zum tetrahämen Cytochrom c des Reaktionszentrums überträgt. Unter semiaeroben Bedingungen wird in ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans die Amplitude der Photooxidation der Cytochrome des c-Typs gegenüber aeroben Bedingungen um ca. 20% verringert, vermutlich wegen der partiellen Präreduktion des primären Akzeptors QA im Reaktionszentrum. Zudem verschiebt sich das Maximum in der α-Bande der Cytochrome im lichtinduzierten Differenzspektrum von 554 nm zu 553 nm, was dem Absorptionsmaximum der low potential Häme entspricht [108]. Unter diesen Bedingungen liegt also eines oder beide low potential Häme L vor der Anregung teilweise reduziert vor. Die beobachtete Photooxidierung nimmt nur sehr langsam mit einer Halbwertzeit von ca. 5 s ab und zeigt, dass unter diesen offensichtlich sehr reduzierenden Redoxbedingungen kein zyklischer Elektronentransfer mittels Cytochrom c551 möglich ist. Aus thermodynamischer Sicht ist dieses Verhalten in Einklang mit den Redoxpotentialen der low potential Häme L (90 mV), die sehr viel niedriger sind als Cytochrom c551 (250 mV) und daher keinen Elektronentransfer ermöglichen. Abbildung A.4.5.2. fasst die bisherigen Ergebnisse der Untersuchungen des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers zusammen. 38 in Roseobacter denitrificans Einleitung ePeriplasma cyt c L2 Em= +90mV cyt c551 H1 Em= +290mV Em = +250 mV L1 Em= +90mV Licht H2 Em= +240mV eP870 Em = +435 mV Cytochrom bc1 Komplex Plasmamembran e- eQB Cytoplasma QA Em,Chrom= 34 mV Em,RC = -44 mV RC Abbildung A.4.5.2: Schematische Darstellung des zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans. Die Halbstufenpotentiale des am Reaktionszentrum (RC) gebundenen Cytochrom c (cyt c) wurden in isolierten Reaktionszentren gemessen [108], ebenso wie das Redoxpotential des primären Donators [128]. Das Halbstufenpotential des primären Akzeptors QA wurde zunächst in Chromatophoren (Chrom [131]) und später in isolierten Reaktionszentren (RC [128]). Das Halbstufenpotential von Cytochrom c551 wurde im isolierten Protein bestimmt [137]. Die Elektronentransferreaktion wurde im isolierten Reaktionszentrum bestimmt [93]. Der Elektronentransfer von Cytochrom (cyt) c551 zum tetrahämen Cytochrom c wurde in ganzen Zellen gemessen [93]. Der Cytochrom bc1 Komplex konnte nicht direkt nachgewiesen werden. Aerobe photosynthetische Bakterien können nicht unter anoxischen Bedingungen wachsen und den Photosyntheseapparat synthetisieren. In ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans findet die lichtinduzierte ATP-Synthese nur unter aeroben Bedingungen statt [140]. So wurde beobachtet, dass in Zellsuspensionen die durch kontinuierliches Licht unter aeroben Bedingungen induzierten pH-Veränderungen unter anoxischen Bedingungen verschwanden [131]. Ebenso wird die photochemische Aktivität stark gehemmt, wenn man von aeroben zu anaeroben Bedingungen wechselt. Sowohl die lichtinduzierte Oxidation des primären Donators, als auch die Oxidation des Cytochrom c551 nach Anregung durch einen Blitz ist unter 39 Einleitung anaeroben Bedingungen blockiert. Die photochemische Aktivität kommt nach und nach zurück, wenn man die Zellsuspension belüftet [131]. Die Interpretation dieses Verhaltens mit Hilfe der thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften der photosynthetischen und/oder respiratorischen Elektronentransferkette ist Gegenstand der Forschung. Bisher wurde die Inhibierung der photochemischen Aktivität in Anaerobiosis mit der Präreduktion des primären Akzeptors QA des Reaktionszentrums begründet, da Redoxtitrationen von QA in Chromatophoren von Roseobacter denitrificans einen Wert von 35 mV ergeben haben [131]. Dieser Wert ist positiver als bei anderen photosynthetischen Bakterien wie Rhodobacter sphaeroides, und deshalb sollte QA in Roseobacter denitrificans unter anaeroben Bedingungen leichter reduziert werden als in anderen photosynthetischen Bakterien. Eine weitere mögliche Ursache für die Blockierung des lichtinduzierten Elektronentransfers unter anaeroben Bedingungen könnte die Unfähigkeit der Zellen sein, ein für den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer optimales Redoxpotential aufrechtzuerhalten, so dass unter diesen Bedingungen der Q-Pool vollständig reduziert vorliegen würde und der Elektronentransferzyklus unterbrochen wäre. Es wurde beobachtet, dass Roseobacter denitrificans unter anaeroben Bedingungen wachsen kann und externe Oxidantien wie TMAO oder Nitrat in der Lage sind, die photochemische Aktivität unter anaeroben Bedingungen in ganzen Zellen wieder herzustellen [139]. Dies zeigt, dass in Roseobacter denitrificans unter Sauerstoffausschluss externe Oxidantien als Elektronenakzeptoren benutzt werden können, um Reduktionsäquivalente aus der Elektronentransferkette zu entfernen und einen optimalen Redoxzustand in der Zelle wiederherzustellen. Auf diese Weise ist auch unter anaeroben Bedingungen eine photochemische Aktivität möglich. 40 Einleitung A.5. Motivation und Ziele der Arbeit Im ersten Teil der Arbeit sollte die Anzucht des Bakteriums Roseobacter denitrificans in einem Fermenter sowie die Isolation und Reinigung von photosynthetischen Reaktionszentren etabliert werden. Dabei sollte die Präparationsvorschrift vor allem im Hinblick auf eine hohe Ausbeute an reinen und funktionalen Reaktionszentren optimiert werden. Die erhaltenen Reaktionszentren sollten mittels transienter Absorptionsspektroskopie charakterisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollte der photosynthetische Apparat von Roseobacter denitrificans über die Messung lichtinduzierter Redoxänderungen der Cytochrome b und c bei definierten Redoxbedingungen untersucht werden: • Es sollte die Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer (Q-Zyklus) nachgewiesen werden, indem die Redoxänderungen von Cytochromen des b-Typs nach Anregung durch einen Blitz mittels transienter Absorptionsspektroskopie in Abhängigkeit von der Zeit untersucht wurden. Das high potential Cytochrom b sollte anhand des Absorptionsdifferenzspektrums und des Halbstufenpotentials charakterisiert werden. • Darüber hinaus sollten die Elektronentransferreaktionen vom Cytochrom bc1 Komplex zur tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums untersucht und die Beteiligung des löslichen Cytochrom c551 in einer diffusionskontrollierten Reaktion nachgewiesen werden. • Die Häme des am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c sollten anhand ihrer Absorptionsdifferenzspektren und der Halbstufenpotentiale charakterisiert sowie deren Funktion beim zyklischen Elektronentransfer in Abhängigkeit des eingestellten Redoxpotentials untersucht werden. • Die Größe des Ubichinon-Pools in Membranen aus Roseobacter denitrificans sollte durch Extraktion des Ubichinons aus der Membran bestimmt werden. 41 Materialien und Methoden B. Materialien und Methoden B.1. Materialien B.1.1. Chemikalien Die für das Ansetzen von Puffern und Stammlösungen benötigten Chemikalien, sowie benötigte Lösungsmittel und andere gängige Chemikalien wurden von kommerziellen Anbietern (Fluka, Aldrich, Merck, Roth, Sigma, etc.) bezogen und, wenn nicht anders angegeben, ohne vorherige Reinigung eingesetzt. Aufgelistet sind hier die Quellen der Chemikalien, die besondere Eigenschaften erfordern oder generell schwer zu erhalten sind. Anzucht von Roseobacter denitrificans: Der Stamm von Roseobacter denitrificans (ATCC Number: 33942) wurde erhalten von der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, FAX: 703-365-2750, email: [email protected]. Pepton Casein, Hefeextrakt (Yeast Extract) und Agar-Agar wurden von Fluka, Deisenhofen bezogen, Bacto Pepton von Difco, USA, bestellbar bei Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Tel.: 06221/305-0, Fax: 06221/305-216. Antifoam 204 wurde von Sigma, Seelze/Taufkirchen bezogen. Präparationen: Der Proteasen-Inhibitoren-Cocktail Complete wurde bei Boehringer, Mannheim erhalten, DNAse I sowie Triton X-100 Molecular Biology Grade bei Calbiochem, Bad Soden / Schwalbach, LDAO bei Fluka, Deisenhofen. Für die Säulenchromatographien wurden fertige Säulen bei Pharmacia, Freiburg gekauft: PD-10 desalting Column und HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Bei TosoHaas, Japan (TosoHaas Stuttgart, Tel.: 0711-13257-0, Fax: 0711-13257-89) 43 Materialien und Methoden wurde das Säulenmaterial DEAE Toyopearl Chromatographic Resin 650M bezogen. Der BCA Protein Assay Kit wurde bei Pierce, USA; bestellbar bei KMF Laborchemie Handels GmbH, Sankt Augustin, Tel.: 0224196850, Fax: 02241968535, erhalten. Der LMW Electrophoresis Calibration Kit wurde bei Pharmacia, Freiburg erhalten. Bei Millipore, Eschborn wurden die PM-30 und YM-100 Flachmembranen (mit einem Ausschlussmasse von 30000 Da bzw. 100000 Da) für die Amicon Rührzelle und die PM-100 Centricon-Konzentratoren bezogen. Spektroskopische Untersuchungen: 1,10-Phenanthrolin Monohydrat wurde von Merck, Darmstadt bezogen, Terbutryn von Riedel de Haen, Seelze. Die Mediatoren 3,6-Diaminodurol (2,3,5,6-Tetramethyl-p-phenylendiamin), p-Benzochinon, 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, Durochinon (2,3,5,6Tetramethyl-1,4-benzochinon), methosulfat), Phenazin Phenazin Ethosulfat Hydroxy-1,4-Naphthochinon wurden Methosulfat (N-Methylphenazonium- (N-Methylphenazoniumethosulfat) bezogen von Aldrich bzw. und 2- Sigma, Seelze/Taufkirchen. Valinomycin und Nigericin wurden erhalten bei Sigma, Seelze/Taufkirchen. Cytochrome c Type 6 (aus Pferdeherz) wurde von Sigma, Seelze/Taufkirchen bezogen. 44 Materialien und Methoden B.1.2. Puffer und Lösungen B.1.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans In den Tabellen B.1.2.1.1 bis 1.2.1.5 sind die für die Anzucht von Roseobacter denitrificans verwendeten Stammlösungen und Medien aufgelistet. Tabelle B.1.2.1.1: Rbor (Roseobacter denitrificans organic rich) -Medium Lösung I 74 % (v/v) Lösung II 25 % (v/v) Vitamine Stammlösung 1 % (v/v) Glycerin 1,84 g/l Die Lösungen werden getrennt autoklaviert und unter sterilen Bedingungen zusammen gegeben. Bei kleineren Ansätzen kann die Vitamin Stammlösung und das Glycerin vor dem Autoklavieren zur Lösung I hinzugegeben werden. Tabelle B.1.2.1.2: Lösung I NaCl MgSO4⋅6 H2O KCl Pepton Casein Hefe Extrakt Bacto Pepton Spurenelemente Stammlösung pH=7,8 (HCl) 31,75 g/l 2,70 g/l 0,81 g/l 1,35 g/l 1,35 g/l 1,35 g/l 1,35 % (v/v) Tabelle B.1.2.1.3: Lösung II MgCl2⋅6 H2O CaCl2⋅2 H2O 40 g/l 5,84 g/l 45 Materialien und Methoden Tabelle B.1.2.1.4: Spurenelemente Stammlösung Titriplex II FeSO4⋅7 H2O MnCl2⋅2 H2O CoCl2⋅6 H2O CuCl2⋅2 H2O NiCl2⋅6 H2O Na2MO4⋅2 H2O ZnSO4⋅7 H2O H3BO3 pH≈3 (HCl) Tabelle B.1.2.1.5: Vitamine Stammlösung Nicotinsäure Nicotinsäureamid Thiamin Biotin 0,5 g/l 0,3 g/l 3 mg/l 5 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 3 mg/l 5 mg/l 2 mg/l 0,2 g/l 0,2 g/l 0,4 g/l 8 mg/l B.1.2.2. Präparation von Membranen und Reaktionszentren In den Tabellen B.1.2.2.1 bis B.1.2.2.10 sind die für die Isolierung der Membranfragmente und für die Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans verwendeten Stammlösungen und Medien aufgelistet. Für die Herstellung der Puffer werden folgende Stammlösungen verwendet: 1 M Tris/HCl (pH = 7,5) 100 mM EDTA/NaOH (pH = 7,5) Außerdem wurden bei den Präparationen folgende Puffer verwendet (siehe Kapitel B.2.2. und B.2.3.): 20 mM Tris / HCl (pH = 7,8) 20 mM Tris /HCl (pH = 7,5) 46 Materialien und Methoden • Lösungen für die Präparation nach K. Takamiya Tabelle B.1.2.2.1: Tris-Puffer I für Solubilisierung Tris NaCl Phenylmethylsulfonylfluorid pH=7,5 (HCl) 20 mM 0,1 M 1 mM Tabelle B.1.2.2.2: Tris-Puffer IV A für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mM Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M pH=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV A mit der entsprechenden NaCl-Konzentration (siehe Kapitel B.2.3.1.). • Lösungen für die Präparation mittels Dichtegradientenfraktionierung Tabelle B.1.2.2.3: Saccharose-Lösungen für Dichtegradientenzentrifugation Tris 20 mM LDAO 0,4% pH=7,8 (HCl) Im Tris/HCl-Puffer wurde jeweils 1,2 M, 0,9 M bzw. 0,3 M Saccharose gelöst (siehe Kapitel B.2.3.2.4.). Tabelle B.1.2.2.4: LDAO-Stammlösung LDAO (N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxid) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (C4H11NO3) pH=7,5 (HCl) LDAO wird als 30%ige Stammlösung in H2O eingesetzt. 47 10% (v/v) 20 mM Materialien und Methoden Tabelle B.1.2.2.5: Tris-Puffer IV für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mM EDTA (C10H14N2NO2O8.2H2O) 1 mM Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M NaN3 1 mM pH=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren (siehe Kapitel B.2.3.2.5.) verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV mit der entsprechenden NaCl-Konzentration. • Lösungen für die Präparation nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya Tabelle B.1.2.2.6: LDAO-Stammlösung LDAO (N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxid) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (C4H11NO3) pH=7,5 (HCl) 10% (v/v) 20 mM LDAO wird als 30%ige Stammlösung in H2O eingesetzt. Tabelle B.1.2.2.7: Tris-Puffer II für Ammoniumsulfat-Fällung Tris Triton X-100 (Polyethylenglycol-p-isooctylphenyl ether; Octylphenoxypolyethoxyethanol) pH=7,5 (HCl) 20 mM 0,6% Triton X-100 wird als 10%ige Stammlösung in H2O eingesetzt (Ausnahme bei sehr großen Ansätzen). Tabelle B.1.2.2.8: Tris-Puffer III für Gelfiltration Tris Triton X-100 NaCl NaN3 pH=7,5 (HCl) 20 mM 0,2% (v/v) 0,1 M 1 mM Die Lösung wird mit einem 0,45 µm-Sterilfilter von kleinen Partikeln befreit. 48 Materialien und Methoden Tabelle B.1.2.2.9: Tris-Puffer IV für Anionenaustausch-Chromatographie Tris 20 mM EDTA (C10H14N2NO2O8.2H2O) 1 mM Triton X-100 0,1% (v/v) NaCl 0,1 M NaN3 1 mM pH=7,5 (HCl) Die NaCl-Puffer, die beim Eluieren (siehe Kapitel B.2.3.3.6.) verwendet werden, entsprechen dem Tris-Puffer IV mit der jeweiligen NaCl-Konzentration. Tabelle B.1.2.2.10: Tris-Puffer V für Entsalzung Tris EDTA Triton X-100 NaN3 pH=7,5 (HCl) Tabelle B.1.2.2.11: Tris-Puffer VI für Aufkonzentrierung Tris EDTA pH=7,5 (HCl) 20 mM 1 mM 0,025% (v/v) 1 mM 20 mM 1 mM B.1.2.3. BCA-Proteinbestimmung Die für den BCA-Protein-Test benötigten Lösungen werden kommerziell bei Pierce erworben: - BCA Protein Assay Reagent A - BCA Protein Assay Reagent B - BSA-Proteinstandard 49 Materialien und Methoden B.1.2.4. SDS-Page-Gelelektrophorese In den Tabellen B.1.2.4.1 bis B.1.2.4.9 sind die für die SDS-Gelelektrophorese verwendeten Lösungen aufgelistet. Tabelle B.1.2.4.1: Acrylamidstammlösung Acrylamid/Bisacrylamid im Mischungsverhältnis 37,5 : 1 Tabelle B.1.2.4.2: Probenpuffer Tris pH=8,0 SDS Glycerin Dithiothreitol (DTT) Bromphenolblau 40%ige Lösung von Sigma 20 mM 3% bzw. 5% (w/v) 25% (v/v) 40 mM 0,025% (w/v) Wird in Aliquots bei -20°C gelagert. Tabelle B.1.2.4.3: Trenngelpuffer Tris pH=8,0 SDS 1,5 M 0,4% Tabelle B.1.2.4.4: Sammelgelpuffer Tris pH=6,8 SDS 0,5 M 0,4% Tabelle B.1.2.4.5: APS-Lösung APS (Ammoniumperoxodisulfat) 0,1 g / 1 ml H2O Tabelle B.1.2.4.6: Elektrophoresepuffer Tris Glycin SDS erhaltener pH ≈ 8,3 (nicht mit HCl titrieren) 50 50 mM 0,384 M 0,1% Materialien und Methoden Tabelle B.1.2.4.7: Fixierer Ethanol Essigsäure 30% 10% Tabelle B.1.2.4.8: Färber Ethanol Essigsäure Coomassie 25% 10% 0,1% Tabelle B.1.2.4.9: Proteinreferenz Phosphorylase b BSA Ovalbumin Carbonic Anhydrase Soybean Trypsin Inhbitor α-Lactalbumin 94000 Da 67000 Da 43000 Da 30000 Da 20000 Da 14000 Da Es werden 600 µg Proteinreferenz in 300 µl H2O aufgenommen. B.1.2.5. Spektroskopische Untersuchungen In den Tabellen B.1.2.5.1 bis B.1.2.5.3 sind die Lösungen und Puffer aufgelistet, die bei den spektroskopischen Untersuchungen an Membranen sowie an isolierten Reaktionszentren verwendet wurden. Tabelle B.1.2.5.1: Tris-Puffer VII für Reaktionszentren Tris EDTA (C10H14N2NO2O8⋅2H2O) Triton X-100 pH=7,5 (HCl) 51 20 mM 1 mM 0,025% (v/v) Materialien und Methoden Tabelle B.1.2.5.2: Mops-Puffer I für Reaktionszentren Mops (3-Morpholino-propansulfonsäure) KCl Triton X-100 pH=7,2 (NaOH) 10 mmol/l 50 mmol/l 0,25% (v/v) Tabelle B.1.2.5.3: Mops-Puffer II für Membranen Mops (3-Morpholino-propansulfonsäure) KCl pH=7,0 (NaOH) 50 mmol/l 100 mmol/l B.1.2.5.1. Ubichinonstammlösung Bei der Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren gehen die Ubichinone in den Bindungstaschen QA und QB verloren. Zur Aktivitätsbestimmung müssen diese wieder mit Ubichinon besetzt werden. Aufgrund seiner langen Isoprenkette ist das Ubichinon in wässrigen Systemen extrem schlecht löslich. Das Ubichinon zeigt aber detergensähnliche Eigenschaften, da es aus einer langen aliphatischen Kette und einer polaren Kopfgruppe besteht. Daher lässt es sich in wässrigen Systemen zusammen mit Detergens in Form von Mischmizellen in Lösung bringen [141]. In dieser Arbeit kamen Mischmizellen aus Ubichinon und Triton X-100 zur Anwendung (zu Testzwecken wurden auch Mischmizellen aus Ubichinon mit LDAO bzw. n-Dodecyl-β-D-maltosid verwendet). Für die Herstellung von Mischmizellen aus Ubichinon und Detergens wurden in einem 50 ml Rundkolben 10 - 50 mg Ubichinon in möglichst wenig Ethanol bei ca. 50°C gelöst. Anschließend wurde durch Einblasen von Stickstoff das Ethanol wieder entfernt und dadurch das Ubichinon als Film am Glasrand abgeschieden. Auf diese Weise wird die Oberfläche des Ubichinons vergrößert und die Lösungseigenschaften verbessert. Dann wurden 16 - 80 ml der gewünschten Detergenslösung (Triton X100, 1% (w/v) bzw. 15 mM, CMC = 0,2 mmol/l; LDAO, 1% (v/v) bzw. 13 mM, CMC = 0,14 mmol/l; n-Dodecyl-β-D-maltosid, 1% (w/v) bzw. 20 mM, CMC = 0,12 mmol/l [142]) in Mops/NaOH-Puffer (pH = 7,2) zugegeben und der Ansatz über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Konzentration des zuzugebenden Detergens wurde oberhalb der jeweiligen kritischen Mizellenkonzentration gewählt. Anschließend 52 Materialien und Methoden wurde die Lösung vorsichtig abdekantiert. Sofern sich noch ungelöste Ubichinonpartikel in der Lösung befanden, wurden diese über eine Fritte vorsichtig abgesaugt. Um die Konzentration der Ubichinonlösung zu bestimmen, wurde ein Teil der Lösung auf zwei Küvetten verteilt. Zur Messküvette wurde vorsichtig eine Spatelspitze NaBH4 gegeben und nach Beendigung der Reduktion das Differenzspektrum zwischen Hydrochinon und Chinon gemessen. Die Differenz zwischen den Extinktionskoeffizienten des Ubihydrochinons und des Ubichinons beträgt bei 275 nm ∆ε275nm = 12,25 cm-1mM-1 [143]. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes (Gleichung B.1.2.5.1.1) wurde aus der gemessenen Absorptionsdifferenz die Konzentration der Ubichinonstammlösung berechnet. E = OD = A = εcd = log I0/I Gleichung B.1.2.5.1.1 mit: OD ≡ optische Dichte E ≡ Extinktion A ≡ Absorption ε ≡ molarer dekadischer Extinktionskoeffizient c ≡ Konzentration der Probe d ≡ Schichtdicke der Probe I0 ≡ eingestrahlte Lichtintensität I ≡ Lichtintensität nach der Probe Die Konzentration des Ubichinons lag je nach Ansatz zwischen 100 und 300 µmol/l, wobei im allgemeinen mit den Detergentien Triton X-100 (bis zu 700 µmol/l) und LDAO höhere Konzentrationen erreicht wurden als mit n-Dodecyl-β-D-maltosid. B.1.2.5.2. Inhibitorlösung für die QB-Bindungsstelle Als Inhibitor wurde das Triazinherbizid 2-tert-Butylamino-4-ethyl-amino-6-methylthio1,3,5-triazin (Handelsname: Terbutryn; Riedel de Haen) verwendet, das mit einer Konzentration von 10 mmol/l in Ethanol gelöst wurde. Die Endkonzentration in den Messansätzen betrug 100 µmol/l. 53 Materialien und Methoden Alternativ wurde o-Phenanthrolin in Ethanol (c = 500 mM) verwendet. Die Endkonzentration in der Probe betrug 10 mM. In beiden Fällen war der Ethanolgehalt kleiner als 1%. B.1.2.5.3. Redoxmediatoren, Entkoppler und Inhibitoren für die Messungen an Membranen von Roseobacter denitrificans Die verwendeten Mediatoren (Diaminodurol, p-Benzochinon, 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, Durochinon, Phenazin Methosulfat, Phenazin Ethosulfat, 2Hydroxy-1,4-naphthochinon) sowie die Entkoppler Nigericin und Valinomycin und die verwendeten Inhibitoren Myxothiazol und Antimycin A wurden als konzentrierte Lösungen in Ethanol eingesetzt. Die Endkonzentration an Ethanol in der Probe war < 3% (v/v), so dass Ethanol selbst keinen Effekt auf den Ladungstransfer hatte. 54 Materialien und Methoden B.2. Methoden B.2.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans B.2.1.1. Stämme Der Stamm von Roseobacter denitrificans wurde von der American Type Culture Collection (ATCC Number: 33942) bezogen. Die Langzeitkultur wurde in 20% Glycerin in Rbor-Medium (siehe Kapitel B.1.2.1.) bei -80°C gelagert. B.2.1.2. Anzucht Die Anzucht von Roseobacter denitrificans erfolgte in einer statischen Kultur nach einer modifizierten Vorschrift von Y. Shioi [144]. Sie erfolgte durch Ausplattieren, zwei Vorkulturen und Kultivierung im Fermenter, wie schematisch in Abbildung B.2.1.2.1 dargestellt. Nach etwa 4 Tagen konnten etwa 100 g Zellen im 28 l-Fermenter bzw. nach etwa 5 Tagen etwa 800 g Zellen im 200 lFermenter gewonnen werden. Alle verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.1. aufgelistet. 55 Materialien und Methoden Langzeitkultur Roseobacter denitrificans Agarplatte Wärmeschrank 1 - 2 Tage Vorkultur I 3 x 12 ml Schüttler 16 h Vorkultur I 2 x 12 ml Schüttler 16h Vorkultur II 3 x 200ml Schüttler 16 h Vorkultur II 2x 200ml Schüttler 16 h Hauptkultur 28 l Fermenter 17 h Hauptkultur 200 l Fermenter 30 h Abbildung B.2.1.2.1: Anzucht des Bakteriums Roseobacter denitrificans B.2.1.2.1. Vorkulturen Die Langzeitkultur von Roseobacter denitrificans wurde mit einer sterilen Öse auf eine Agarplatte (20 g Agar Agar auf 1 l Rbor-Medium) übertragen. Die Festkultur wurde im Brutschrank bei 30°C im Dunkeln angezogen. Nach 1 - 2 Tagen waren einzelne rosarote Kolonien sichtbar, und die Kultur wurde in eine Flüssigkultur (12 ml Rbor-Medium) überführt. Diese wurde bei 30°C in Schikane Kolben bei 200 rpm in einem Schüttler (New Brunswick Scientific, G25) semiaerob im Dunkeln angezogen. Nach Erreichen des letzten Drittels der exponentiellen Wachstumsphase (ca. 16 h; OD660 ≈ 1,5) wurde diese Vorkultur zum Animpfen einer zweiten größeren Vorkultur 56 Materialien und Methoden (200 ml Rbor-Medium) verwendet, die unter den gleichen Bedingungen angezogen wurde. Nach Erreichen des letzten Drittels der exponentiellen Wachstumsphase (ca. 16 h; OD660 ≈ 1,5) wurde diese zweite Vorkultur zum Animpfen eines größeren Ansatzes (siehe unten) verwendet. Die Vorkulturen müssen innerhalb von wenigen Stunden weiter verwendet werden, da die Zellen dann sehr schnell in die Absterbephase übergehen. Die Festkulturen können im Kühlschrank bei 4°C einige Tage aufbewahrt werden. B.2.1.2.2. Hauptkulturen 28 l-Fermenter Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in einem 28 l -Fermenter von Bioengineering (Laborpilot LP 35 l) mit einem Arbeitsvolumen von 28 l bei 30°C im Dunkeln bei 250 350 rpm Rührwerksdrehzahl und semiaeroben Bedingungen unter Luftzufuhr über einen Pressluftgenerator (zur Handhabung des Fermenters siehe [145]). Zur Vorbereitung der Fermentation wurde Lösung I in den Fermenter eingefüllt und 20 min bei 121°C sterilisiert. Mit Hilfe eines autoklavierten Trichters wurden anschließend Lösung II, Glycerin, die Spurenelemente-Stammlösung, die VitamineStammlösung sowie 5 ml der Antischaumemulsion (eine Emulsion von 1 Teil Antifoam 204 mit 99 Teilen H2O) zugegeben (jeweils vorher autoklaviert). Anschließend wurde durch eine Voreichung eine 70%ige O2-Sättigung eingestellt. Zum Schluss wurde mit ca. 600 ml Vorkultur II angeimpft. Der Verlauf der Fermentation wurde durch eine stündliche Messung der optischen Dichte bei 660 nm sowie des Spektrums zwischen 600 und 1000 nm und durch eine kontinuierliche Messung des Sauerstoffgehalts im Medium, überprüft. Nach ca. 17 h erreichten die Zellen das Ende der exponentiellen Wachstumsphase (OD660 ≈ 2,0) ; der Fermenter wurde auf 5°C abgekühlt und die Zellen mittels Durchflusszentrifuge (CEPA GLE mit SK Rotor) geerntet, weiterverarbeitet (bzw. eingefroren) und bei -80°C gelagert. 57 Materialien und Methoden 200 l-Fermenter Um schneller zu größeren Mengen an Zellmaterial für die Präparationen (siehe unten) zu kommen, wurde die Anzucht auch in Zusammenarbeit mit N. Gad’on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie, Mikrobiologie in einem 200 l -Fermenter von Bioengineering durchgeführt (Arbeitsvolumen 200 l). Die Vorbereitungen des Fermenters erfolgten analog zum 28 l -Fermenter. Es wurden 100 ml (1% (w/v)) der Antischaumemulsion zugegeben. Der Fermenter wurde mit 400 ml der Vorkultur II angeimpft, und die Fermentation erfolgte bei 30°C mit einer Rührergeschwindigkeit von 180 - 250 rpm und einem Luftdurchfluss von 40 - 80 l/min. Der Verlauf der Fermentation wurde durch mehrere Messungen der optischen Dichte bei 578 nm überprüft. Nach ca. 30 h bei einer OD578 ≈ 3,0 wurden die Zellen mittels Durchlaufzentrifuge geerntet, eingefroren und bei -80°C gelagert. 58 Materialien und Methoden B.2.2. Isolierung und Reinigung der Membranen aus Roseobacter denitrificans Die Isolierung und Reinigung der Membranen von Roseobacter denitrificans erfolgte nach dem Schema in Abbildung B.2.2.1 analog zu den ersten Schritten der Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren (siehe Kapitel B.2.3.). Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.2. aufgelistet. Roseobacter denitrificans Zellen French Press Zentrifugation Überstand Membranen + Cytoplasma Niederschlag nicht aufgeschlossene Zellen Ultrazentrifugation Überstand Cytoplasma Niederschlag Membranen Pufferwechsel 100 mM Mops / NaOH pH=7,0 Abbildung B.2.2.1: Isolation der Membranen aus Roseobacter denitrificans. 59 Materialien und Methoden B.2.2.1. Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 durch 30 min rühren bei 4°C resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4°C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B.2.2.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mM Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase I ohne rühren French Press Zelle über Nacht im Kühlraum vorkühlen Zellaufschluss in der French Press (French Pressure Cell Press, SLM Aminco) der vorbereiteten Zellsuspension bei 20000 - 27000 psi (entspricht der Einstellung 1300 - 1700 psig am Gerät) Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 13000 rpm (17000 g) und 30 min bei 4°C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen, während der Niederschlag verworfen wird Überstand 60 min bei 4°C im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm (300000 g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen und den Niederschlag weiterverarbeiten 60 Materialien und Methoden B.2.2.3. Pufferwechsel Niederschlag in 200 ml 100 mM Mops/NaOH-Puffer pH = 7,0 resuspendieren und homogenisieren Überstand 60 min bei 4°C im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm (300000 g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschlag weiterverarbeiten Die ersten drei Schritte wiederholen Den Niederschlag (Membranen) in möglichst wenig 100 mM Mops/NaOH-Puffer pH = 7,0 resuspendieren und homogenisieren, anschließend 50% Glycerin zugeben und bei -20°C lagern, so dass das H2O nicht kristallisiert und die Proteine nicht zerstört werden. 61 Materialien und Methoden B.2.3. Isolierung und Reinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Für die Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurden verschiedene Vorschriften getestet, die im Folgenden beschrieben werden sollen (für Details siehe Kapitel C.2.). Letztendlich wurde die in Kapitel B.2.3.3. beschriebene modifizierte Vorschrift von K. Takamiya für die Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren in dieser Arbeit verwendet. Alle verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.2. beschrieben. B.2.3.1. Vorschrift nach K. Takamiya Abbildung B.2.3.1.1 zeigt schematisch die Isolationsvorschrift nach K. Takamiya et al. [128, 131, 146, 147]. Aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellen können in 2 - 3 Tagen ca. 10 mg Reaktionszentren isoliert werden. 62 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Roseobacter denitrificans Membranen Vorsolubilisierung mit 0,45% LDAO Solubilisierung mit 0,45% LDAO nach Verdünnung auf das doppelte Probenvolumen Ultrazentrifugation Überstand 1. DEAE-SephacelAnionenaustauschChromatographie reaktionszentrenreiche Fraktionen sammeln und um das 5fache verdünnen 2. DEAE-SephacelAnionenaustauschChromatographie Reaktionszentren Abbildung B.2.3.1.1: Schema der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya et al. [128]. 63 Materialien und Methoden B.2.3.1.1. Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 durch Rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentzrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4°C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B.2.3.1.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mM Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne rühren Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension in der vorgekühlten French Press Zelle bei 20000 - 27000 psi Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 13000 rpm (17000 g) 30 min bei 4°C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4°C im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm (300000 g) zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, Pellet in möglichst wenig Tris-Puffer I resuspendieren und homogenisieren (Potter) Membranen in flüssigen N2 einfrieren und bei -80°C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern 64 Materialien und Methoden B.2.3.1.3. Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; Bacteriochlorophyllgehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B.2.4.1.) und mit Tris-Puffer I, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mM BacteriochlorophyllKonzentration verdünnen die 30%ige (v/v) LDAO-Lösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO 30 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm (300000 g) 60 min bei 4°C (Beckman Ultrazentrifuge L7) Der Überstand wird verworfen; der Niederschlag wird in Tris-Puffer I resuspendiert und homogenisiert, so dass das ursprüngliche Volumen verdoppelt wird (unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung) Das entsprechende Volumen an 30%iger (v/v) LDAO-Lösung (s.o.) wird unter rühren langsam dazu getropft, so dass eine Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO erreicht wird 60 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm (300000 g) 60 min bei 4°C (Beckman Ultrazentrifuge L7) Der Überstand wird abgenommen und sofort weiterverarbeitet; er beinhaltet die solubilisierten Proteine; der Niederschlag wird verworfen B.2.3.1.4. Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: • Durchmesser: 2 cm • Länge: ca. 16 cm • Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV A aufbewahrt. 65 Materialien und Methoden Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV A äquilibriert, Flussrate: 50 - 20 ml/min Probe nach Solubilisierung (s.o.) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV A, Flussrate: 50 - 20 ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV A; Flussrate: 50 - 20ml/min Die RC-enthaltenden Fraktionen mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt (vgl. Kapitel B.2.4.4.) Das Eluat der 1. Anionenaustausch-Chromatographie wird auf das 5fache verdünnt und durch eine 2. Anionenaustausch-Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weiter aufgereinigt Die erhaltenen RC-Fraktionen werden gesammelt, aufkonzentriert, mit flüssigem N2 schockgefroren und bei -80°C gelagert B.2.3.2. Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation Als weitere Methode zur Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurde in Zusammenarbeit mit N. Gad’on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie II die Methode der Dichtegradientenfraktionierung getestet. Abbildung B.2.3.2.1 zeigt schematisch die verwendete Isolationsvorschrift. Aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellen können in ca. 10 - 15 Tagen 3 - 5 mg Reaktionszentren isoliert werden. 66 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Roseobacter denitrificans Membranen Solubilisierung mit 0,5% LDAO Auftragung der solubilisierten Membranproteine auf einen Saccharosegradienten Ultrazentrifugation über Nacht reaktionszentrenreiche Fraktionen sammeln DEAE-ToyopearlAnionenaustauschChromatographie Eluat Reaktionszentren Abbildung B.2.3.2.1: Schematische Darstellung der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans mittels Dichtegradientenfraktionierung. B.2.3.2.1. Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 durch rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentzrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4°C zentrifugieren Niederschlag in 300 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten 67 Materialien und Methoden B.2.3.2.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mM Endkonzentration) unter rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne rühren Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension in einer vorgekühlten French Press Zelle bei 20000 - 27000 psi Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 13000 rpm (17000 g) 30 min bei 4°C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4°C im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschag in möglichst wenig Puffer resuspendieren (20 mM Tris / HCl / pH = 7,5) und homogenisieren (Potter) Protease Inhibitor und EDTA (1 mM Endkonzentration) hinzugeben und bis zum Lösen rühren Membranen in flüssigen N2 einfrieren und bei -80°C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern B.2.3.2.3. Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; Bacteriochlorophyllgehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B.2.4.1.) und mit 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mM Bacteriochlorophyll-Konzentration verdünnen die 1%ige (v/v) LDAO-Stammlösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) LDAO und 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln rühren die solubilisierte Protein-Lösung (ca. 200 ml) wird gleich weiterverarbeitet 68 Materialien und Methoden B.2.3.2.4. Dichtegradientenfraktionierung der Membranproteine der Saccharose-Gradient wird hergestellt, indem je 7 ml einer 1,2 M, 0,9 M und 0,3 M Saccharose-Lösung in 20 mM Tris-Puffer (pH = 7,8) mit 0,4% LDAO in Zentrifugenröhrchen, wie in Abbildung B.2.3.2.4.1A schematisch dargestellt, übereinandergeschichtet werden nach der Solubilisierung werden 2 - 2,5 ml Protein-Lösung auf den SaccharoseGradienten aufgetragen und über Nacht (16 h) im Ti 60 Rotor bei 38000 rpm (250000 g) bei 4°C zentrifugiert (Beckman Ultrazentrifuge L7); es werden ca. 10 Zentrifugenläufe durchgeführt, um das gesamten Volumen an solubilisierten Membranproteine aufzutrennen die Reaktionszentren werden an der Grenzschicht zwischen 1,2 M und 0,9 M Saccharose-Lösung (siehe Abbildung B.2.3.2.4.1B) mit Hilfe einer Pipette gewonnen Die Reaktionszentren-Fraktionen werden gesammelt und weiterverarbeitet A B Cytochrom 0,3 M LH I 0,9 M LH II Reaktionszentren 1,2 M Niederschlag Abbildung B.2.3.2.4.1: Schematische Darstellung des Saccharose-Gradienten (A) und Auftrennung der Membranproteine mittels Dichtegradientenzentrifugation (B). 69 Materialien und Methoden B.2.3.2.5. Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: • Durchmesser: 2 cm • Länge: ca. 16 cm • Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV aufbewahrt. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV äquilibriert, Flussrate: 50 - 20 ml/min gesammelte Fraktionen der Dichtegradientenfraktionierung (s.o.) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV, Flussrate: 50 - 20 ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV; Flussrate: 50 - 20ml/min Die RC-enthaltenden Fraktionen mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt (vgl. Kapitel B.2.4.4.), schockgefroren und bei -80°C gelagert 70 aufkonzentriert, mit flüssigem N2 Materialien und Methoden B.2.3.3. Modifizierte Vorschrift von K. Takamiya Zur Isolierung und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans wurde die Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] modifiziert. Im folgenden wird die in dieser Arbeit verwendete Vorschrift im Detail beschrieben. Sie ermöglicht es, aus 100 g Roseobacter denitrificans Zellmasse in etwa 10 Tagen ca. 15 mg (50 ODV) Reaktionszentren zu isolieren. Sämtliche Isolationsschritte wurden im Dunkeln und, wenn nicht anders angegeben, auf Eis oder im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. In Abbildung B.2.3.3.1 sind die Isolierungs- und Aufreinigungsschritte schematisch dargestellt. 71 Materialien und Methoden Roseobacter denitrificans Zellen French Press Zentrifugation Überstand Membranen + Cytoplasma Niederschlag nicht aufgeschlossene Zellen Ultrazentrifugation Niederschlag Membranen Überstand Cytoplasma Aufweichen der Zellmembran mit LDAO Solubilisierung mit LDAO Ultrazentrifugation Niederschlag Membranen Überstand solubilisierte Membranproteine Ammoniumsulfat-Fällung (mit Detergenswechsel zu Triton X-100) Zentrifugation Überstand andere Membranproteine, z.B. LH II „schwimmender“ Niederschlag RC + andere Membranproteine Gelfiltration Eluat RC + andere Proteine andere Proteine Anionenaustausch-Chromatographie Eluat Reaktionszentrum übrige Membranproteine Abbildung B.2.3.3.1: Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. 72 Materialien und Methoden B.2.3.3.1. Waschen der Zellen 100 g Roseobacter denitrificans Zellen über Nacht im Kühlschrank auftauen Zellen in 800 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 durch rühren resuspendieren 20 min im JA 10 Rotor (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) bei 9000 rpm (10000 g) bei 4°C zentrifugieren gelblich-klar rosarot Niederschlag in 300 ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,8 resuspendieren und homogenisieren (Potter), Überstand verwerfen Suspension direkt weiterverarbeiten B.2.3.3.2. Zellaufschluss und Isolierung der Membranen Zugabe von Protease Inhibitor (1 Tablette pro 50 ml Zellsuspension) und EDTA (1 mM Endkonzentration) unter Rühren Zugabe von einer Spatelspitze DNase ohne Rühren French Press Zelle über Nacht im Kühlraum vorkühlen Zellaufschluss der vorbereiteten Zellsuspension bei 20000 - 27000 psi (entspricht der Einstellung 1300 - 1700 psig am Gerät) Probe auf Eis auffangen und vor Licht schützen Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 13000 rpm (17000 g) 30 min bei 4°C (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) 73 Materialien und Methoden dunkelrot fast undurchsichtig Membranen rosarot Zellbruchstücke Überstand (enthält aufgeschlossene Zellen) wird abgenommen; der Niederschlag wird verworfen Überstand 60 min bei 4°C im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm zentrifugieren (Beckman Ultrazentrifuge L7) Überstand verwerfen, den Niederschlag in möglichst wenig Puffer resuspendieren (20 mM Tris / HCl / pH = 7,5) und homogenisieren (Potter) Protease Inhibitor und EDTA (1 mM Endkonzentration) hinzugeben und bis zum Lösen rühren Membranen in flüssigen N2 einfrieren und bei -80°C Kühlschrank oder über Nacht auf Eis im Dunkeln lagern B.2.3.3.3. Solubilisierung der Membranproteine Membranen gegebenenfalls auftauen, homogenisieren; BChl- bzw. Proteingehalt der Suspension bestimmen (siehe Kapitel B.2.4.1. und B.2.4.2.) und mit 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,5, unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung, auf 0,2 mM bzw. 20 mg/ml einstellen (in der Regel 100 - 120 ml) die 10%ige (v/v) LDAO-Stammlösung langsam unter rühren dazu tropfen bis zu einer Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO 30 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm 60 min bei 4°C (Beckman Ultrazentrifuge L7) 74 Materialien und Methoden klar rot Der Überstand wird verworfen; das Pellet wird in 20 mM Tris/HCl-Puffer pH = 7,5 resuspendiert und homogenisiert, so dass das ursprüngliche Volumen verdoppelt wird (unter Berücksichtigung des Volumens der LDAO-Lösung) Das entsprechende Volumen an 10%iger (v/v) LDAO-Lösung in Puffer (s.o.) wird unter Rühren langsam dazu getropft, so dass eine Endkonzentration von 0,45% (v/v) LDAO erreicht wird 60 min bei RT im Dunkeln rühren Zentrifugation im Ti 55,2 Rotor bei 52000 rpm 60 min bei 4°C (Beckman Ultrazentrifuge L7) durchsichtig rot solubilisierte Proteine rot Der Überstand wird abgenommen und sofort weiterverarbeitet; er enthält die solubilisierten Proteine; der Niederschlag wird verworfen 75 Materialien und Methoden B.2.3.3.4. Ammoniumsulfat-Fällung Es wurde alternativ die fraktionierende oder die 50%ige Ammoniumsulfat-Fällung durchgeführt (vgl. Kapitel C.2.1.3.). A. Fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung 50%-Fällung (w/v) Zugabe der aus der Tabelle B.2.3.3.4.1. berechneten Menge an festem Ammoniumsulfat unter rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 10000 rpm bei 4°C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) „schwimmender“ Niederschlag in 1/4 des Ausgangsvolumen der Probe an TrisPuffer II (20 mM Tris/HCl-Puffer pH=7,5 mit 0,6% (v/v) Triton X-100) aufnehmen und vorsichtig homogenisieren „schwimmender“ Niederschlag durchsichtig rot 50%-Waschung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 50% unter rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 10000 rpm bei 4°C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) 76 Materialien und Methoden Niederschlag wie oben abnehmen und im gleichen Volumen Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren die 50%ige Waschung kann wiederholt werden, um einen besseren Detergensaustausch zu erhalten 35%-Fällung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 35% unter rühren Zentrifugation im JA-20 Rotor bei 10000 rpm bei 4°C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Den Überstand abnehmen (hier befinden sich die Reaktionszentren) und weiterverarbeiten, den Niederschlag verwerfen 65%-Fällung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 65% unter rühren (Differenz zu 35%) Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 18000 rpm bei 4°C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Überstand wird verworfen und der „schwimmende“ Niederschlag in 1/20 des Ausgangsvolumens der Probe in Tris-Puffer II aufgenommen und vorsichtig homogenisiert Zur vollständigen Abtrennung nicht gelöster Bestandteile wird anschließend im JA-20 Rotor bei 20000 rpm 20 min bei 4°C zentrifugiert (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS). Der Überstand wird so abgenommen, dass keine festen Partikel in die Lösung kommen, den Vorgang eventuell wiederholen Probe gleich weiterverarbeiten oder nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20°C lagern, damit das H2O nicht kristallisieren kann und die Proteine bei der Lagerung nicht zerstört werden 77 Materialien und Methoden B. 50%ige Ammoniumsulfatfällung 50%-Fällung (w/v) Zugabe der aus der Tabelle B.2.3.3.4.1 berechneten Menge an festen Ammoniumsulfat unter rühren und weitere 15 min rühren Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 10000 rpm bei 4°C 20 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Der Niederschlag schwimmt auf der Flüssigkeit („floating pellet“), in 1/4 des Ausgangsvolumens der Probe (ca. 20 ml) an Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren, den Rest verwerfen Tabelle B.2.3.3.4.1: Die Menge an festem Ammoniumsulfat, die einer Lösung zugefügt werden muss, um die gewünschte Endkonzentration bei 0°C zu erreichen [148]. Endkonzentration an Ammoniumsulfat, % Sättigung bei 0°C Anfangskonzentration an Ammoniumsulfat, % Sättigung bei 0°C g festes Ammoniumsulfat, das 100 ml einer Lösung zugegeben wird 78 Materialien und Methoden 50%-Waschung (w/v) Tropfenweise Zugabe von gesättigter, neutralisierter Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Sättigung von 50% unter rühren (insgesamt 15 min rühren). Zentrifugation im JA 20 Rotor bei 10000 rpm bei 4°C 10 min (Beckman Kühlzentrifuge J2-HS) Niederschlag wie oben abnehmen und im gleichen Volumen Tris-Puffer II aufnehmen und vorsichtig homogenisieren Die 50%ige Waschung kann wiederholt werden, um einen besseren Detergensaustausch zu erhalten. Dies gilt besonders, wenn die Probe länger gelagert werden soll. Abtrennung nichtgelöster Bestandteile Zur vollständigen Abtrennung nichtgelöster Bestandteile wird anschließend in der Biofuge 28 RS mit dem Eppendorf-Rotor Nr. 3740 bei 18000 rpm (21400 g) 20 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird so abgenommen, dass keine festen Partikel in die Lösung kommen. Probe gleich weiterverarbeiten oder nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20°C lagern B.2.3.3.5. Gelfiltration Es wird eine HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade-Säule verwendet: • Durchmesser: 16 mm • Länge: ca. 60 cm • Säulenvolumen: ca. 120 ml Die Säule wird bei längeren Zeiträumen in 20% Ethanol gelagert; Inbetriebnahme erfolgt nach Anleitung; es sind mehrere (ca. 4) Läufe notwendig Die Säule wird mit 3 Säulenvolumen (3 x 120 ml) Tris-Puffer III äquilibriert 79 Materialien und Methoden Auftragung der Probe aus der Ammoniumsulfat-Fällung (Probenvolumen: 4 - 5 ml) ohne Pumpe Elution mit Tris-Puffer III, Flussrate: 30 ml/h Die Reaktionszentren enthaltenden Fraktionen werden gesammelt (Detektion nach den Spektren, vgl. Abbildung C.2.2.2) und nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20°C gelagert B.2.3.3.6. Anionenaustausch-Chromatographie Es wird eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M Säulenmaterial verwendet: • Durchmesser: 2 cm • Länge: ca. 16 cm • Volumen: ca. 50 ml Die Säule wird nach Anleitung vorbereitet und in Tris-Puffer IV aufbewahrt. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (5 x 50 ml) Tris-Puffer IV äquilibriert, Flussrate: 20 - 50 ml/min Probe (aus den ca. 4 Gelfiltrationen gesammelt) auftragen Waschen mit 1 Säulenvolumen (50 ml) Tris-Puffer IV, Flussrate: 20 - 50 ml/min Elution: der Gradient erfolgt in Stufen von jeweils 50 ml (entspricht einem Säulenvolumen): 0,20 M NaCl 0,25 M NaCl 0,28 M NaCl 0,30 M NaCl 0,50 M NaCl Flussrate: 5 ml/min Detektion: Spektrum zwischen 300 nm und 900 nm Waschen der Säule mit Tris-Puffer IV; Flussrate: 20 - 50ml/min 80 Materialien und Methoden Die Reaktionszentren enthaltenden Fraktionen (vgl. Abbildung B.2.4.4.3) mit hohem Proteingehalt (ODV) werden gesammelt und gleich weiterverarbeitet (vgl. Kapitel B.2.4.4.) B.2.3.3.7. Entsalzung Es wird eine Sephadex G-25 M PD-10 Entsalzungssäule verwendet: • Säulenvolumen: 9,1 ml • Probenvolumen: 2,5 ml • Flussrate: durch die Schwerkraft gegeben Zur Entsalzung muss die Probe aus dem Anionenaustauscher gegebenenfalls geteilt werden. Die Säule wird mit 25 ml Tris-Puffer V äquilibriert Die Probe (2,5 ml) wird aufgetragen und einsickern gelassen, während das Eluat verworfen wird Es wird mit 3,5 ml Tris-Puffer V eluiert; das farbige Eluat wird gesammelt Säule waschen Probe gleich weiterverarbeiten Sollten die Reaktionszentren noch nicht rein genug sein, folgt eine zweite Aufreinigung durch Anionenaustauscher und Entsalzung. Der Reinheitsgrad wird zunächst anhand des UV-VIS-Spektrum beurteilt, welches mit dem Spektrum reiner Reaktionszentren, wie in Abbildung B.2.4.4.3 dargestellt, verglichen wird. Insbesondere wird darauf geachtet, dass die Amplituden der Banden bei 750 nm und 860 nm im Verhältnis 1 : 1 stehen und das Verhältnis der Amplituden der Banden bei 750 nm, 802 nm und 860 nm möglichst nahe bei 1 : 2 : 1 ist. 81 Materialien und Methoden B.2.3.3.8. Aufkonzentrierung Die Aufkonzentrierung geschieht mittels einer YM 100 Membran (mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 100000 Da) in einer Amicon-Rührzelle bei 4°C. Bei kleineren Volumina werden PM 100 Centricon Konzentratoren verwendet. Die Proben werden bis zu einer OD802 von 30 aufkonzentriert. B.2.3.3.9. Lagerung der Reaktionszentren Die erhaltenen Reaktionszentren werden in Aliquots unter Zusatz von 20% Glycerin in Tris-Puffer IV bei -20°C gelagert. Die Reaktionszentren können nicht wie sonst üblich bei -80°C gelagert werden, da das Kristallisieren des H2O das Protein soweit zerstört, dass keine Ladungstrennung mehr beobachtet werden kann (siehe Kapitel C.2.1.) 82 Materialien und Methoden B.2.4. Charakterisierung der Proben B.2.4.1. Bacteriochlorophyll-Bestimmung Die Bacteriochlorophyll (BChl)-Konzentration in den Membransuspensionen wurde durch Extraktion mit einer Aceton/Methanol-Mischung im Verhältnis 7 : 2 (v/v) und Absorptionsmessung mit einem Perkin-Elmer Lambda 2 Spektrometer bei 770 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge beträgt der Extinktionskoeffizient für das Bacteriochlorophyll ε = 75 mM-1cm-1 [149]. B.2.4.2. Proteinbestimmung mit dem BCA-Proteintest Die Bestimmung der Proteinkonzentration während der Isolation und Reinigung erfolgte mit dem BCA-Proteintest [150]. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.3. beschrieben. Der BCA-Test ähnelt der Proteinbestimmung nach Lowry, hat aber eine geringere Störanfälligkeit gegenüber Detergentien, wie sie insbesondere zur Solubilisierung von Membranproteinen verwendet werden. Die Methode kombiniert den Biuret-Proteintest mit 2,2’-Bicinchoninsäure Detektionssystem. Die Methode beruht auf der Reduktion von Cu 2+ (BCA) als + zu Cu durch Cystein, Tyrosin, Tryptophan und die Peptidbindungen des Proteins. BCA bildet spezifisch mit Cu+ einen violetten Farbkomplex mit einem Absorptionsmaximum bei 562 nm. Eine Eichung erfolgt mit einem BSA (Bovine Serum Albumin) Standard, der im Bereich von 2,0 – 20 µg/ml eine lineare Zunahme der Absorption mit der Konzentration zeigt. Es können Proteinkonzentrationen bis 5 µg/ml nachgewiesen werden Die Proteinbestimmung erfolgt direkt in Küvetten. Dazu werden die Proben sowie der Proteinstandard nach Anleitung mit den Test-Lösungen (BCA Protein Assay Reagent A und Reagent B) vermischt, inkubiert und in einem UV-VIS-Spektrometer vermessen. 83 Materialien und Methoden B.2.4.3. SDS-PAGE-Gelelektrophorese Die Standardmethode der SDS-Gelelektrophorese [151] wurde zur Charakterisierung des isolierten Reaktionszentrums und seiner Untereinheiten sowie zur Überprüfung seiner Reinheit angewendet. Ebenso wurde mit dieser Methode der Verlauf der Isolierung und Reinigung des Proteins dokumentiert. Natriumdodecylsulfat (SDS) ist ein anionisches Detergens, das an die hydrophoben Regionen des zu untersuchenden Proteins bindet (bei den meisten Proteinen mit einem konstanten Verhältnis von etwa einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäureresten), es in seine Untereinheiten dissoziiert (durch Disulfid-Brücken zusammengehaltene Untereinheiten werden mit Dithiothreitol (DTT) dissoziiert) und die Eigenladung des Proteins maskiert. Dadurch weisen SDS-beladene Proteine nahezu identische Ladungs-Masse-Verhältnisse und ähnliche Formen auf. Die Proteine werden bei einer SDS-Gelelektrophorese in der Reihenfolge der molaren Massen getrennt. Die Molmasse des zu untersuchenden Proteins wurde durch den Vergleich mit einem mitlaufenden Proteinstandard ermittelt. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.4. beschrieben. B.2.4.3.1. Gießen der Gele In der Gießkammer können zwei Gele gleichzeitig gegossen werden. Die Gele wurden sofort verwendet. Trenngel (12,5 %; 1 mm Dicke; für zwei Gele) - 7,35 ml H2O - 4,25 ml Trenngelpuffer (siehe Tabelle B.1.2.4.3) - 5,3 ml Acrylamidstammlösung (siehe Tabelle B.1.2.4.1) - 10 min entgasen - 130 µl APS-Lösung (siehe Tabelle B.1.2.4.5) - 6 µl TEMED (startet die Polymerisation) 84 Materialien und Methoden Sammelgel (5 %; 1 mm Dicke; für zwei Gele) - 4,38 ml H2O - 2 ml Sammelgelpuffer (siehe Tabelle B.1.2.4.4) - 1 ml Acrylamidstammlösung - 10 min entgasen - 94 µl APS-Lösung - 8 µl TEMED B.2.4.3.2. Probenvorbereitung Die Proteinprobe wurde im gleichen Verhältnis mit dem Probenpuffer vermischt und 30 min bei 60°C inkubiert. Die Proteinkonzentration betrug etwa 1 mg/ml. Es wurden ca. 1 - 2 µg Protein pro erwartete Bande auf eine Bahn aufgetragen. B.2.4.3.3. Elektrophorese Die Elektrophorese wurde nach einer Standardmethode bei einer konstanten Stromstärke von ca. 5 mA pro Gel im Sammelgelbereich und ca. 28 mA pro Gel im Trenngelbereich durchgeführt und dauert ca. 1 - 2 h. Als Elektrophorese-Apparatur wurde die Mini Protean II von Biorad verwendet, in der bis zu zwei Gele eingebaut werden können. B.2.4.3.4. Färbung der Gele mit Coomassie Brilliant Blue Jedes Gel wurde getrennt in einer Plastikbox unter schwenken mit Coomassie Brilliant Blue G-250 eingefärbt. 30 min in Fixierer-Lösung schwenken 1 h in Färber-Lösung schwenken 85 Materialien und Methoden in Fixierer-Lösung entfärben, bis die Banden sichtbar werden und der Hintergrund klar wird Gel in 10 % Essigsäure-Lösung aufbewahren B.2.4.3.5. Gel-Dokumentation Die fertigen Gele wurden dokumentiert und ausgewertet. Als Protein Referenz diente der LMW Electrophoresis Calibration Kit von Pharmacia Biotech sowie aufgereinigtes Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides. Die Gele wurden mit einer Gel-Dokumentationsanlage Digit Store System 95KFE103 von INTAS gespeichert und mit dem Programm Gelscan bearbeitet. B.2.4.4. UV-VIS-Absorptionsspektren Die UV-VIS-Spektren der Zellen, der Membranen und des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans wurden an einem Perkin-Elmer Lambda 2 Spektrometer aufgenommen. Je nach benötigten Extinktionswerten wurden Spektren im Bereich zwischen 650 und 900 nm für die Suspension der Zellen, 300 und 900 nm für die Membranen und zwischen 300 und 900 nm bzw. 700 nm und 900 nm für die Reaktionszentren-Lösungen aufgenommen (Schichtdicke = 1 cm). Diese Aufnahmen dienen zur Dokumentation der Anzucht von Roseobacter denitrificans sowie der Isolationen von Membranen und Reaktionszentren. Zudem wurden Spektren von jeder Probe vor und nach Messreihen aufgenommen. Abbildungen B.2.4.4.1 bis 3 zeigen typische Spektren der Zellsuspension, der Membranen und des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans. Aus den Spektren der Reaktionszentren-Lösungen wird die optische Dichte OD802 bestimmt. Sie entspricht der Absorption der Bacteriochlorophylle im Reaktionszentrum (und damit der Absorption des Proteins) und wird bei der Charakterisierung von Reaktionszentrenpräparationen häufig Konzentrationsangaben verwendet (siehe Gleichung B.1.2.5.1.1). 86 anstelle von Materialien und Methoden Mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten des Reaktionszentrums kann die optische Dichte (OD) in Konzentrationseinheiten umgerechnet werden (ε802 = 288 mM-1cm-1 für Rhodobacter sphaeroides [152]). Aus der OD802 und dem Volumen der Probe in ml berechnet sich: ODV = OD802 x VProbe Gleichung B.2.4.4.1 Mit Hilfe der Molmasse Mr des Reaktionszentrums (Mr = 136056 Da aus der DNASequenz abgeleitet nach [129, 130, 153] bzw. Mr = 130000 Da apparente Molmasse aus SDS-PAGE [128]) und des Extinktionskoeffizienten lässt sich diese Größe dann in Stoffmengen (mg bzw. nmol) umrechnen. optische Dichte 2,35 806 nm 2,30 870 nm 2,25 2,20 2,15 700 750 800 850 W ellenlänge (nm ) Abbildung B.2.4.4.1: Absorptionsspektrum der Flüssigkultur von Roseobacter denitrificans Zellen. Das Maximum bei 806 nm zeigt die Absorption des Bacteriochlorophylls a von LH II, während das Maximum bei 870 nm die Absorption des Bacteriochlorophylls a des RC-LH I-Komplexes zeigt. 87 Materialien und Methoden 870 nm 0,5 806 nm 0,6 590 nm 0,7 510 nm optische Dichte 0,8 420 nm 0,9 370 nm 1,0 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 400 500 600 700 800 900 W ellenlänge (nm ) Abbildung B.2.4.4.2: Absorptionsspektrum von gereinigten Roseobacter denitrificans Membranen in 100 mM Mops/NaOH-Puffer (pH = 7,0). Das Maximum bei 870 nm entspricht der Absorption von Bacteriochlorophyll a im LH I-RCKomplex, das Maximum bei 806 nm der Absorption des Bacteriochlorophylls a im LH II. Weiterhin zeigt das Bacteriochlorophyll a Absorptionsbanden bei 590 nm und 370 nm. Die breite Bande mit Maximum bei 510 nm entspricht der Absorption der Carotinoide (95% Spheroidenon) und die Schulter bei 420 nm der Absorption der Cytochrome. 3,5 370 nm 420 nm 802 nm 2,5 2,0 860 nm 500-550 nm 1,0 750 nm 1,5 600 nm optische Dichte 3,0 0,5 0,0 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 W ellenlänge (nm ) Abbildung B.2.4.4.3: Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Die Absorptionsmaxima bei 860 nm und 600 nm entsprechen dem Bacteriochlorophylldimer, das Maximum bei 802 nm entspricht dem Bacteriochlorophyllmonomer und das Maximum bei 750 nm dem Bacteriophäophytin. Im Bereich von 500 bis 550 nm liegen die Banden des Bacteriophäophytin, der Carotinoide und der Cytochrome c (α-Banden bei 550 nm) übereinander. Bei 420 nm beobachtet man die Soret-Banden der c-Typ Cytochrome, während bei 370 nm das Bacteriochlorophyllmonomer absorbiert. Die Reaktionszentren sind in 20 mM Tris/HCl (pH = 7,5) / 1 mM EDTA / 0,25% (v/v) Triton X-100 gelöst. 88 Materialien und Methoden B.2.5. Transiente Absorptionsspektroskopie Elektronentransferreaktionen in photosynthetischen Reaktionszentren und den anderen an der Photosynthese beteiligten Proteinen lassen sich mit Hilfe der optischen Spektroskopie anhand der Extinktionsänderungen einzelner Spezies verfolgen. Diese Änderungen werden durch die mit dem Elektronentransfer verbundenen Oxidations- und Reduktionsreaktionen und der Änderung der jeweiligen Extinktionskoeffizienten von Cofaktoren + - + verursacht. Die Rekombination der - ladungsgetrennten Zustände P QA und P QAQB im Reaktionszentrum kann z.B. mit Hilfe der Absorptionsänderung des bei der Ladungsrekombination rereduzierten primären Elektronendonators untersucht werden. In dieser Arbeit wurde hierfür die Qy-Bande des Donators P bei 860 nm verwendet, da der Differenz- extinktionskoeffizient zwischen reduziertem und oxidiertem Zustand in dieser Bande relativ groß ist. Für Rhodobacter sphaeroides ist ∆εP/P+(865 nm) = 112 mM-1cm-1 [152]. Auf Grund der Strukturähnlichkeiten ist anzunehmen, dass sich der Differenzextinktionskoeffizient in Roseobacter denitrificans in einem ähnlichen Bereich bewegt. Alternativ dazu lassen sich Änderungen des Redoxzustandes auch im Bereich der Soret-Bande (370 nm), der Qx-Bande (600 nm) oder im langwelligen Bereich bei 1250 nm, wo der Donator stark absorbiert, untersuchen. Ebenso lässt sich die Reduktion der Ubichinone spektroskopisch verfolgen. Das Semichinonanionradikal des Ubichinons zeigt eine charakteristische Bande bei ca. 450 nm. Der Differenzextinktionskoeffizient ∆εUQ/UQ-(445 nm) = 8,5 mM-1cm-1 (für QB in Rhodobacter sphaeroides [154]) ist jedoch sehr klein. Daher wurden in dieser Arbeit die Ladungsrekombinationskinetiken im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans über die Reduktion von P+ gemessen. Auch die Redoxänderungen der Cytochrome können spektroskopisch untersucht werden. Abbildung B.2.5.1 zeigt schematisch das typische Spektrum von Cytochrom c im oxidierten und reduzierten Zustand. Eingezeichnet sind die charakteristischen Banden (α-, β- und γ-Bande), in denen die Absorptionsänderungen, die mit den Redoxänderungen einhergehen, verfolgt werden können. Die Differenzextinktionskoeffizienten liegen im Bereich von ∆εox/red(γ-Bande) ≈ 60 mM-1 cm-1 und ∆εox/red(α-Bande) ≈ 20 mM-1 cm-1 (vgl. Abbildung B.2.5.1). Cytochrome werden nach der Lage ihrer α-Bande in 89 Materialien und Methoden Cytochrome des Typs a (Häm A mit dem Maximum der α-Bande bei 600 nm), des Typs b (Eisen-Protoporphyrin IX mit dem Maximum der α-Bande bei 560 nm) und des Typs c (Häm C mit dem Maximum der α-Bande bei 550 nm) eingeteilt. Durch gezielte Wahl der Wellenlänge, bei der Absorptionsänderungen beobachtet werden, können Cytochrome und der Elektronentransfer zwischen den Redoxzentren von Proteinen eines Systems (also auch differenziert in Zellen oder isolierten Membranen, in denen eine komplexe Mischung verschiedenster Cytochrome vorliegt) untersucht werden. γ-Bande α-Bande β-Bande Abbildung B.2.5.1: Absorptionsspektrum einer 10 µM Lösung von Cytochrom c im reduzierten (durchgezogene Linie) und oxidierten Zustand (gepunktete Linie). Die drei charakteristischen Banden im Spektrum von reduziertem Cytochrom werden als γ- (oder Soret-), α- und β-Bande bezeichnet. Sie entsprechen den p-p*-Übergängen des Häms aus dem Grundzustand S0 in die drei angeregten Zustände S1, S2 und S3. Der energetisch höchste Übergang S0 Æ S3 liegt zwischen 390 und 430 nm (g-Bande) und verschiebt sich durch Reduktion zum Längerwelligen. Reduziertes Cytochrom c zeigt bei 520 nm die bBande (S0 Æ S2 Übergang) und bei 550 nm die a-Bande (S0 Æ S1 Übergang). Im oxidierten Zustand liegt zwischen 500 und 600 nm eine breite Absorptionsbande vor. 90 Materialien und Methoden B.2.5.1. Messungen an isolierten Reaktionszentren B.2.5.1.1. Messanordung Der Aufbau der Apparatur wurde im Detail bei R. Schmid [155] beschrieben. Als Lichtquelle wurde eine Philips Halogenlampe (12 V, 50 W, abgelöteter Blechkragen) verwendet. Das Messlicht wurde mit dem Monochromator eines Sigma ZWS 11 Spektrometers monochromatisiert und mit Lichtleitern zur Probe geführt (Schichtdicke = 1 cm). Die Detektion des Messlichtes erfolgte mit einem im nahen Infrarot sensitiven Sekundärelektronenvervielfacher (SEV, Hamamatsu R316(S-1)), der über ein Sigma ZWS 11 Spektrometer mit einer Hochspannung von 1000 V betrieben wurde. Das erhaltene Spannungssignal wurde verstärkt und digital gefiltert (Stanford Research Systems SR570) sowie auf einem Speicher Oszilloskop (LeCroy 9310AM) aufgezeichnet. Zur Messung der Ladungsrekombination muss die optische Anregung des Reaktionszentrums und damit die Ladungstrennung induziert werden. Die Anregung des Reaktionszentrums erfolgte im Bereich der Qx-Bande des primären Donators und der akzessorischen Bacteriochlorophylle bei einer Wellenlänge von 590 nm mit einem blitzlampengepumpten Farbstofflaser (Cynosure SLL-250, Rhodaminchlorid 590 (Fa. Exciton) in Methanol, Pulsbreite = 400 ns, Energie pro Puls ca. 0,2 J), der im rechten Winkel zum Messlicht in die Probenkammer eingekoppelt war. Die Auslösung des Laserblitzes erfolgte entweder manuell oder mit Hilfe eines Pulsgenerators (Stanford Research Systems, DG 535). Der Aufzeichnungsvorgang am Oszilloskop wurde durch eine auf das Streulicht des Lasers ansprechende Photodiode (Eigenbau der Elektronikwerkstatt des Instituts für Physikalische Chemie) ausgelöst. Der SEV wurde mit einem für den langwelligen Teil des Lichtes durchlässigen Kantenfilter (780-FG07-50, Lot-Oriel) oder einem Interferenzfilter (870FS10-50, Lot-Oriel) vor Laserstreulicht geschützt. In der Abbildung B.2.5.1.1 ist ein Schema dieser Messanordnung gegeben. 91 Materialien und Methoden Optischer Filter Sekundärelektronenvervielfacher Probenkammer Lampe Monochromator Verstärker/ elektronischer Filter Laser Oszilloskop PC Abbildung B.2.5.1.1: Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans (Zeitauflösung 400 ns, bedingt durch die Pulsbreite des Lasers). B.2.5.1.2. Probenvorbereitung und Messbedingungen Für die spektroskopischen Untersuchungen wurden 2,5 ml Fluoreszenzküvetten aus Quarzglas (Helma 108F-QS) verwendet. Die Reaktionszentren waren in Tris-Puffer VII oder in Mops-Puffer I für Reaktionszentren (siehe Kapitel B.1.2.5.) gelöst. Die Konzentration der Reaktionszentren lag zwischen 0,1 < OD802 < 1,0 (entspricht einer Konzentration von 0,3 - 3 µM). Die Absorptionsänderung wurde bei 860 nm verfolgt, dem Maximum in der Bacteriochlorophylldimer-Bande. 92 Materialien und Methoden B.2.5.1.3. Absorptionsdifferenzspektroskopie: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten der Ladungsrekombination von P+QA- bzw. P+QB- und des Besetzungsgrades der QA- und QB-Bindungsstellen im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans Die Messungen erfolgten als Differenzmessungen, d.h. das Ausgangssignal V0, das proportional zur Zahl der Photonen (und damit auch der Lichtintensität I0) ist, die die Probe vor der Anregung durchlaufen, wurde durch eine mit Hilfe der Verstärkereinheit angelegte Gegenspannung auf 0 mV kompensiert. Verstärkt wurde folglich nur das Differenzsignal. Zur weiteren Verbesserung des Signal-RauschVerhältnisses wurden mehrere Messungen auf dem Oszilloskop gemittelt. Die gemittelten Daten wurden zur Weiterverarbeitung auf einen IBM-kompatiblen Personalcomputer übertragen. Die Umrechnung der gemessenen Spannungsänderungen in Absorptions- änderungen erfolgte gemäß Gleichung B.2.5.1.3.1: ∆A(t) = -log[1+∆U(t)/U0] Gleichung B.2.5.1.3.1 mit: ∆A ≡ Absorptionsänderung als Funktion der Zeit ∆U ≡ Spannungsänderung als Funktion der Zeit U0 ≡ Spannung vor der Anregung Aus den Absorptionsänderungen Geschwindigkeitskonstanten Konzentrationsänderungen ∆A als bestimmt der beteiligten Funktion werden, Spezies der Zeit da proportional können diese sind die den (siehe Abbildung B.2.5.1.3.1). Im Prinzip lassen sich die Elektronentransferreaktionen im Reaktionszentrum mit einer Kinetik erster Ordnung beschreiben. Die Kurvenanpassung erfolgt dann mit einer einfachen Exponentialfunktion: ∆A(t) = ∆A1 exp(-kAPt) + C Gleichung B.2.5.1.3.2 93 Materialien und Methoden mit: ∆A(t) ≡ Gesamtänderung der Amplitude als Funktion der Zeit ∆A1 ≡ Amplitude der Komponente 1 kAP ≡ Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von QA- Absorptionsänderung, ∆ A 860 t ≡ Zeit C ≡ Konstante 0,00 -0,01 -0,02 -0,03 -0,04 Laserblitz 0,00 0,05 0,10 0,15 Zeit (s) Abbildung B.2.5.1.3.1: Ladungsrekombination von QA- und P+ im bakteriellen Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans. Die Ladungstrennung erfolgt durch einen Laserblitz bei t = 0 s. Die Amplitude des Signals entspricht der Zahl der Reaktionszentren im Zustand P+. Bei Ladungsrekombination wird P+ reduziert und die Kinetik klingt monoexponentiell ab mit einer Geschwindigkeitskonstante von ≈ 35 s-1. Dies entspricht der schnellen Kinetik von Reaktionszentren, die kein Ubichinon in der QB-Bindungsstelle enthalten, und demzufolge mit kAP-1 rekombinieren. Über 99% der Reaktionszentren haben kein gebundenes Ubichinon in der QB-Bindungstasche, so dass keine Rekombination von kBP-1 beobachtet werden kann. Nach etwa 10 kAP-1 ist das System vollständig rekombiniert, und man erhält die Ausgangsabsorption (∆A860 ≅ 0). 94 Materialien und Methoden Für den Fall zweier Parallelreaktionen ist jedoch eine weitere Exponentialfunktion zur Beschreibung der Messdaten notwendig: ∆A(t) = ∆A1 exp(-kAPt) + ∆A2 exp(-kBPt) + C‘ Gleichung B.2.5.1.3.3 mit: ∆A(t) ≡ Gesamtänderung der Amplitude als Funktion der Zeit ∆A1 ≡ Amplitude der Komponente 1 zur Zeit t = 0 ∆A2 ≡ Amplitude der Komponente 2 zur Zeit t = 0 kAP ≡ Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von QAkBP≡ Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von QBt ≡ Zeit C‘ ≡ Konstante Die zusätzlichen Konstanten C bzw. C‘ werden benötigt, um den Signalabfall für einen Bruchteil an Reaktionszentren zu korrigieren, bei denen das Elektron auf QAbzw. QB- durch unkontrollierten Elektronenfluss verschwindet oder oxidiert wird und somit der photooxidierte Donator zurückbleibt. Um die Geschwindigkeitskonstante der Ladungstrennung von QA- (kAP) im Reaktionszentrum zu bestimmen, wurde selektiv das Ubichinon der Q B- Bindungsstelle durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors verdrängt. Es wurde entweder Terbutryn mit einer Endkonzentration von 100 µM oder o-Phenanthrolin mit einer Endkonzentration von bis zu 10 mM eingesetzt (siehe Kapitel B.1.2.5.2.). Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur wurde die Messung durchgeführt. Der Wert für kAP lässt sich dann durch Anpassung der Kinetik nach Gleichung B.2.5.1.3.3 erhalten. Analog kann die Geschwindigkeitskonstante der Ladungsrekombination von QB- (kBP) bestimmt werden. In der Regel ging jedoch bei der Präparation der Reaktionszentren ein Teil des Ubichinons in den Bindungsstellen verloren, so dass die Reaktionszentren vor der Messung zunächst mit Ubichinon rekonstituiert werden mussten. Hierzu wurde die Probe mit einer Ubichinonstammlösung (Ubichinon in Detergensmizellen) titriert, bis die maximale Besetzung erreicht wurde. Trotzdem trat generell das Problem auf, dass die QB-Bindungsstelle nicht vollständig besetzt vorliegt, so dass in der Regel eine zweiphasige Kinetik beobachtet wurde: eine 95 Materialien und Methoden schnelle Phase, verursacht durch Reaktionszentren, die nur Ubichinon in der QABindungsstelle enthalten und mit der Geschwindigkeitskonstante kAP rekombinieren, und eine langsame Phase der Reaktionszentren, die beide Ubichinon- Bindungsstellen besetzt haben, mit der Geschwindigkeitskonstante kBP. Für die Auswertung ist also die Bestimmung von kAP notwendig. Diese wurde in der biexponentiellen Kurvenanpassung (Gleichung B.2.5.1.3.3) vorgegeben und kBP aus einer Vier-Parameter-Anpassung bestimmt. Die erhaltene Amplitude der schnellen Phase entspricht der Besetzungszahl von Ubichinon in der QA-Bindungsstelle. Sie wurde bestimmt, in dem man das Ausbleichen der Absorptionsbande des Bacteriochlorophylldimers in einem sehr kleinen Zeitfenster (< 20 ms) misst und die Amplitude des Signals ∆A860(t=0) durch lineare Extrapolation ermittelt. Der Quotient aus der Absorptionsänderung ∆A860(t=0) und der Absorption A860 ist ein Maß für die Besetzung von QA mit einem Chinon. Für Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides hat dieser Quotient je nach Präparation den Wert von 0,8 - 0,9 für eine vollbesetzte QA-Bindungsstelle. Die Amplitude der langsamen Phase ∆A860(langsame Phase) entspricht der Anzahl an Reaktionszentren mit Ubichinon in der QB-Bindungsstelle. Zur Bestimmung der relativen Besetzung der QB-Bindungsstelle bezüglich der QA-Bindungsstelle wurde der Quotient aus ∆A860(langsame Phase) und ∆A860(t=0) gebildet. Die nichtlineare Kurvenanpassung erfolgte mit dem Programm Peakfit (Version 4,05, SPSS Inc.). 96 Materialien und Methoden B.2.5.2. Messungen an Membranen B.2.5.2.1. Messanordnung Die Untersuchungen des photosynthetischen Apparates an Membranen aus Roseobacter denitrificans wurde am Dipartimento di Biologia, Università di Bologna im Labor von Prof. Dr. G. Venturoli durchgeführt. Der Aufbau des optischen Systems der Apparatur bestand aus einer Reihe von ORIEL Elementen, die auf einen schwingungsgedämpften Tisch linear angeordnet wurden [96]. Als Lichtquelle diente eine Halogenquarzlampe (150 W, 15 V), die von einem Countant ACS1000 betrieben wurde und in einem Beleuchtungsapparat von ORIEL (Modell 7340) eingebaut war. Die Wellenlänge des Messlichtes wurde durch einen doppelten Monochromator von ORIEL (Gitter von 1200 l/mm; Eingangsöffnung 600 µm, Ausgangsöffnung 280 µm) ausgewählt. Ein System aus zwei bikonvexen Linsen mit einem Durchmesser von 25,4 mm und einer Brennweite von 50 mm bzw. 25 mm, fokussierte das Messlicht auf die Küvette in der Probenkammer (Schichtdicke = 1 cm). Durch einen Magnetrührer unter der Probenkammer konnte die Probe in der Küvette gerührt werden. Das Messlicht wurde von einem Photomultiplier PHILIPS XP2013B (10 Dynoden; semitransparente Photokathode Typ S20) detektiert. Der Anodenstrom des Photomultipliers wurde in Spannung umgewandelt und zu einem Drei-PhasenVerstärker weitergeleitet. Am Verstärker konnte eine Gegenspannung angelegt werden, um das vom Messlicht hervorgerufene Spannungssignal im Photomultiplier zu kompensieren, so dass auch kleine Änderungen des Signals mit ausreichender Auflösung gemessen werden können. Um eine Anregung der Probe durch das Messlicht zu vermeiden, wurde die Probe dem Messlicht nur für die für die Messung erforderliche Zeit (durch Öffnen und Schließen eines Shutters im Messlicht Strahlengang) ausgesetzt. Das System wurde durch eine Photodiode vervollständigt, der ein Teil des Messlichtes (10%) mittels eines Strahlteilers zugeleitet wurde. Diese Anordnung wurde für langsame Messungen (Messdauer länger als 50 ms) verwendet, um die Qualität der Signale zu verbessern, die bei diesen Bedingungen unter den kleinen Änderungen der Lichtintensität des Messlichtes leiden. Dazu wurde das Signal des Photomultipliers mit dem Signal der Photodiode (vor der Probe) nach entsprechender Verstärkung verglichen und normalisiert. 97 Materialien und Methoden Für die Anregung der Probe wurde eine Xenonlampe (EG&G; Pulsbreite 4 µs) verwendet, die im rechten Winkel zum Messstrahl in die Probenkammer eingekoppelt wurde. Das Anregungslicht wurde durch einen Kodak Wratten 88 A Filter (durchlässig für den Spektralbereich zwischen 730 und 950 nm) geleitet. Das System zur Datenaufnahme bestand aus einem digitalen Oszilloskop (Le Croy 9410, 100 MHz) mit einem Interface zu einem Personal Computer. Zu Beginn der Messung wurde durch Auslösung eines Schalters der Lichtschalter geöffnet, der Magnetrührer gestoppt und der Ventilator für die Kühlung der Lampe ausgeschaltet (um mechanische Schwingungen auszuschließen) sowie zeitlich verzögert der Impulsgenerator aktiviert, der die Signale zur Auslösung der Blitzlampe für die Anregung sowie zur Auslösung der Datenaufzeichnung am Oszilloskop weiterleitet. In Abbildung B.2.5.2.1.1 ist ein Schema der beschriebenen Messanordnung dargestellt. Die Zeitauflösung der gesamten Apparatur war, durch die Dauer des Anregungsblitzes bedingt, auf einige µs begrenzt. 98 Materialien und Methoden 1 Lampe 2 Betreiber der Lampe 3 Doppelter Monochromator 4 Beam Splitter 5 Photodiode 6 Probenkammer 7 Photomultiplier 8 Blitzlampe 9 Impulsgenerator 10 Betreiber der Blitzlampe 11 Platinelektrode 12 Calomel-Referenzelektrode 13 Salzbrücke 14 Voltmeter 15 Argonflasche 16 Magnetrührer für die Probe 17 Verstärker und Betreiber des Photomultipliers 18 Oszilloskop 19 Trigger 20 Verstärker der Photodiode 21 Personal Computer 22 Monitor 23 Shutter Abbildung B.2.5.2.1.1: Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans. Die Redoxküvette (siehe Kapitel B.2.6.) wird in der Probenkammer 6 eingesetzt und angeschlossen. Die Zeitauflösung der gesamten Apparatur beträgt einige µs, bedingt durch die Dauer des Anregungsblitzes. 99 Materialien und Methoden B.2.5.2.2. Probenvorbereitung und Messbedingungen Die Membranen wurden mit einer Endkonzentration an Bacteriochlorophyll von 10 15 µM in Mops-Puffer II pH = 7,0 suspendiert. Die Konzentration der Reaktionszentren in der Membransuspension wurde aus der Absorptionsänderung, die bei 605 nm gemessen wurde und dem Extinktionskoeffizienten ∆ε605 = 19,5 mM-1cm-1 [156, 157] mit Hilfe des Lambert-Beer Gesetzes (Gleichung B.1.2.3.1.1, Kapitel B.1.2.5.) berechnet. Zur Bestimmung wurde die Wellenlänge λ = 605 nm gewählt, da sie das maximale Ausbleichen der Bande nach Anregung durch Licht zeigt und keine Interferenzen durch andere Redoxkomponenten vorhanden sind. Es wurden 10 µM Valinomycin und 10 µM Nigericin zugegeben. Diese Entkoppler (oder Ionophoren) heben das Membranpotential der Membran und die pH-Differenz zwischen Cytoplasma und Periplasma auf, das durch den zyklischen Elektronentransfer erzeugt wird. Valinomycin macht die Membran für K+-Kationen durchlässig, während Nigericin den ladungsneutralen Austausch von H+ und K+ durch die Membran katalysiert. Die Mediatoren wurden mit einer Konzentration von 10 µM zugesetzt, außer Diaminodurol, Phenazin Methosulfat und Phenazin Ethosulfat, die mit einer Konzentration von 5 µM eingesetzt wurden. Nicht alle Mediatoren wurden in allen kinetischen Messungen eingesetzt (siehe hierzu Kapitel C.3.2.). Antimycin A und Myxothiazol wurden als spezifische Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes mit einer Konzentration von 10 µM bzw. 0,5 µM bei bestimmten Experimenten zugesetzt (siehe Kapitel C.3.2.). Antimycin A bindet an der QiBindungstelle des Cytochrom bc1 Komplexes, Myxothiazol an der Qo-Bindungsstelle und verhindern so die Bindung von Ubichinon (siehe Kapitel D.2.). Myxothiazol bindet auch an der QB-Bindungstelle im Reaktionszentrum, wie in Rhodobacter sphaeroides nachgewiesen wurde [158], wenn auch mit einer geringeren Affinität (Dissoziationskonstante KD = 1,5 . 10-5 M). Daher wurde die Konzentration von Myxothiazol in der Probe so gering gehalten (0,5 µM), dass keine Inhibierung der Photochemie im Reaktionszentrum stattfinden konnte. Das Redoxpotential der Membransuspension wurde durch Zugabe von Reduktionsmitteln (Natriumascorbat und Natriumdithionit) oder von Oxidationsmitteln (Kaliumhexacyanoferrat) eingestellt (siehe Kapitel B.2.6.). 100 Materialien und Methoden Um die Trübung der Probe zu reduzieren und damit das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurden die Proben vor Zugabe der Mediatoren, der Entkoppler und der Inhibitoren auf Eiswasser beschallt (MSE Sonifier, Stufe 3, mittlere Stärke; 3 x 3 s mit 60 s Pause). In Abbildung B.2.5.2.2.1 ist eine typische Messkurve dargestellt: Die lichtinduzierte Absorptionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge und bei einem bestimmten eingestellten Redoxpotential ist gegen die Zeit aufgetragen. Im Zeitpunkt t = 0 und t = 500 ms erfolgt jeweils eine Anregung des Systems mit einem Blitz. Um ein besseres Signal-Rausch-Verhältniss zu erhalten, wurden je nach Messbedingungen bis zu 64 Messungen gemittelt (siehe Angaben in Kapitel C.3.2.). Aus den gemessenen Kinetiken wurde die Änderung der Amplitude bei der gewählten Wellenlänge zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Anregung ermittelt. Die erhaltenen Absorptionsänderungen wurden dann in Abhängigkeit von der Wellenlänge („Differenzspektren“), vom angelegten Redoxpotential Eh („Titrationen“) Absorptionsänderung, ∆ A 430 x 10 3 sowie von Viskosität und Ionenstärke graphisch dargestellt (siehe Kapitel C.3.2.). 5 4 3 2 + Antim ycin + M yxothiazol 1 0 0 500 1000 Zeit (ms) Abbildung B.2.5.2.2.1: Einfluss von Inhibitoren auf den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Membranen aus Roseobacter denitrificans. Bei t = 0 und t = 500 ms erfolgt jeweils eine Anregung durch einen Blitz. Die Messung erfolgte bei Eh = 390 mV unter Zugabe der Inhibitoren Myxothiazol und Antimycin A bei 430 nm (Soret-Bande der Cytochrome des Typs b). Es wurden 64 Messungen mit einer Dunkelzeit von 90 s zwischen den einzelnen Messungen gemittelt (weitere Details finden sich in Kapitel C.3.2.). 101 Materialien und Methoden B.2.6. Redox-Potentiometrie Die kinetischen Untersuchungen der lichtinduzierten Elektronentransferreaktionen an suspendierten Membranen aus Roseobacter denitrificans erfordern eine genaue Kontrolle der Redoxzustände der beteiligten Redoxpartner und damit des Redoxpotentials der Suspension. Um dies zu gewährleisten, wurde für die Messungen eine spezielle Redoxküvette verwendet, die es ermöglicht, während der Messung strikt anaerobe Bedingungen einzuhalten. Abbildung B.2.6.1 zeigt eine schematische Darstellung der Küvette und in Abbildung B.2.5.2.1.1 ist dargestellt wie sie in das Spektrometer eingebaut wird. Pt-Elektrode Argon Argon zur Kalomel-Referenzelektrode Küvette mit der Probe Rührer Abbildung B.2.6.1: Schematische Darstellung der Redoxküvette. Die Platin-Elektrode taucht in die Probe ein. Es besteht ein Kontakt über eine Salzbrücke zur Kalomel-ReferenzElektrode. Die Probe kann gerührt werden und wird unter Argon (d.h. sauerstofffrei) gehalten. Die Funktionsweise ist im Text beschrieben. 102 Materialien und Methoden Zur Einstellung des Redoxpotentials der Suspension wurde die Redoxküvette unter konstantem Argondurchfluss gehalten und die Suspension mit einem Magnetrührer gerührt. Das Redoxpotential wurde mittels einer Platinelektrode (Radiometer Pt 100), dessen Platinplättchen direkt in die Membran-Suspension tauchen, und einer Kalomel-Referenzelektrode gemessen. Das Redoxpotential der Kalomel-Referenzelektrode Eh(cal) gegen die StandardWasserstoffelektrode (SHE) bei einer bestimmten Temperatur T ist durch folgende Gleichung gegeben: Eh(cal)= 260,6 mV - (0,69 mV/°C x T) Gleichung B.2.6.1 Das Redoxpotential der Suspension (und damit der Redoxzustand der am Elektronentransfer beteiligten Redoxpartner) wurde durch Zugabe von Reduktionsmitteln (Natriumascorbat und Natriumdithionit) oder von Oxidationsmitteln (Kaliumhexacyanoferrat) eingestellt. Das eingestellte Redoxpotential der Membransuspension bewirkt in Abhängigkeit des jeweiligen Halbstufenpotentials die Reduktion oder Oxidation der Redoxkomponente. Damit kommt es nach Anregung durch Licht je nach eingestellten Redoxpotential zu unterschiedlichen Redox- bzw. Elektronentransfer-Reaktionen, deren Untersuchung Gegenstand dieser Arbeit ist. Der reduzierte bzw. oxidierte Anteil einer Redoxkomponente bei einem bestimmten Redoxpotential wird mit Hilfe der Nernst-Gleichung (Gleichung B.2.6.3) berechnet. Für den Redox-Prozess an einer Elektrode gilt: ox + z e- red Gleichung B.2.6.2 Die Nernst-Gleichung ergibt sich zu: E = E + RT zF ln aox Gleichung B.2.6.3 ared mit: E ≡ Elektrodenpotential E ≡ Standardpotential der Elektrode aox ≡ Aktivität der Spezies im oxidierten Zustand ared ≡ Aktivität der Spezies im reduzierten Zustand 103 Materialien und Methoden R ≡ Gaskonstante ≡ 8,31441 JK-1mol-1 T ≡ Temperatur in K z ≡ stöchiometrischer Faktor der Elektronen F ≡ Faraday-Konstante ≡ 9,64846 104 Cmol-1 Es ist: E=E + RT zF ln fox fred + RT zF ln cox Gleichung B.2.6.4 cred mit: fox ≡ Aktivitätskoeffizient der Spezies im oxidierten Zustand fred ≡ Aktivitätskoeffizient der Spezies im reduzierten Zustand cox ≡ Konzentration der Spezies im oxidierten Zustand cred ≡ Konzentration der Spezies im reduzierten Zustand Bei biochemischen Prozessen setzt man meistens voraus, dass: fox = fred ≈ 1 Gleichung B.2.6.5 Somit können statt der Aktivitäten die Konzentrationen der entsprechenden Spezies verwendet werden. Darüber hinaus wird zumeist noch der biochemische Standardzustand (c[H+] = 10-7 M und die Konzentrationen sind die Summenkonzentrationen der jeweiligen Stoffe) eingeführt: Eh = E’m,7 + RT zF ln cox Gleichung B.2.6.6 cred Für den Fall, dass Gleichung B.2.6.7 cox = cred ergibt sich Eh = E’m,7 ≡ Em,7 Gleichung B.2.6.8 104 Materialien und Methoden Der Wert von Em,7 wird als Halbstufenpotential bezeichnet und bei pH = 7 gemessen. Zum Beispiel berechnet sich der Anteil an oxidierten H1 (Em,7 = 290 mV) der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums bei einem eingestellten Redoxpotential Eh = 375 mV (siehe Kapitel C.3.2.2.) wie folgt: Eh = Em,7 + RT zF ln cox Gleichung B.2.6.9 cred mit: Em,7 = 290 mV Eh = 375 mV zu: ln cox cred = (0,375 - 0,29) V / 0,0257 V Gleichung B.2.6.10 das Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem Anteil von H1 beträgt somit: cox cred = 27,39 Gleichung B.2.6.11 und damit erhält man für den oxidierten Anteil von H1: cox cges Gleichung B.2.6.12 = 0,96 mit: Gleichung B.2.6.13 cges = cox + cred Um eine schnelle Gleichgewichtseinstellung zwischen dem biologischen System und der externen wässrigen Umgebung, in der die Messelektroden eintauchen, herzustellen, ist der Einsatz von Redoxmediatoren notwendig. Dies sind organische Moleküle mit partiell hydrophoben Eigenschaften und von geringerer Größe als die 105 Materialien und Methoden zu untersuchenden Komponenten, die in der Lage sind sowohl mit den biologischen Redoxzentren als auch mit den gelösten Redoxstoffen zu reagieren, so dass sie die Oxidations- bzw. Reduktionsmittel aus der wässrigen Umgebung dem Protein zugänglich machen. Ohne den Einsatz von Mediatoren wären die Redoxzentren des zu untersuchenden Systems durch die Proteinstruktur von der wässrigen Umgebung abgeschirmt. Die wichtigsten Voraussetzungen für Redoxmediatoren sind: - Sie müssen wirksam und reversibel sowohl mit der Elektrode als auch mit den biologischen Proteinkomplexen reagieren. - Sie müssen stabil in Bezug auf Oxidation und Reduktion sein. - Sie dürfen keine durch eine Änderung ihres Redoxzustands bedingte Absorptionsänderungen im Wellenlängenbereich des Spektrums der zu untersuchenden Redoxpartner des Proteins zeigen. In Tabelle B.2.6.1 werden die in dieser Arbeit verwendeten Mediatoren und ihre Redoxpotentiale bei pH = 7 (Em,7) sowie deren pH-Abhängigkeit aufgelistet. Tabelle B.2.6.1: Verwendete Redoxmediatoren mit ihrem Halbstufenpotential bei pH = 7,0, den pKA-Werten und der Molmasse [159-162]. Halbstufenpotential gegen SHE1 (mV) pKA-Werte Molmasse (g/mol) Diaminoduren +275 6,6 ; 7,7 164,25 p-Benzochinon +280 9,85 ; 11,4 108,1 1,2-Naphthochinon +145 - 158,16 1,4-Naphthochinon +36 - 158,16 Durochinon +5 - 164,2 Phenazin Methosulfat +85 9,0 306,3 Phenazin Ethosulfat +65 9,0 334,4 2-Hydroxy-Naphthochinon -220 8,2 174,16 Mediator 1 Standardwasserstoffelektrode 106 Materialien und Methoden B.2.7. Bestimmung des Ubichinongehalts in der Membran aus Roseobacter denitrificans Der Ubichinongehalt in der Membran aus Roseobacter denitrificans wurde durch vollständige Extraktion und Reverse-phase HPLC Analyse mit einer ODS-Säule bestimmt [163]. Die Membranen wurden in 50 mM Mops / 100 mM KCl-Puffer (pH = 7) resuspendiert und dreimal mit einem Methanol/Petrolether-Gemisch im Verhältnis 6 : 4 extrahiert. Die drei Extrakte wurden vereint und die Etherphase wurde eingedampft. Die so erhaltenen eingetrockneten Proben wurden in Ethanol (HPLC grade) gelöst. Zur Analyse wurde die Elution auf einer HPLC-Säule bei 275 nm verfolgt. Die mobile Phase enthielt 96% Ethanol und 4% H2O. Es wurde eine Eichung mit reinem Ubichinon in verschiedenen Konzentrationen erstellt. Durch Vergleich der Chromatogramme der zu untersuchenden Extrakte mit denen der reinen UbichinonProben konnte Ubichinon klar von anderen Komponenten im Extrakt unterschieden werden. Die integrierten Banden vom Elutionsprofil des reinen Ubichinons sind proportional zur Konzentration an Ubichinon in der Probe im Bereich zwischen 0 und 240 pmol. Es wurde eine Eichkurve erstellt, die zur Bestimmung der Konzentration an Ubichinon in den Extrakten verwendet wurde. 107 Ergebnisse C. Ergebnisse C.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans Die Anzucht von Roseobacter denitrificans erfolgte standardmäßig in einer statischen Kultur in einem 28 l-Fermenter bzw. in einem 200 l-Fermenter nach einer modifizierten Vorschrift von Y. Shioi [144], wie in Kapitel B.2.1. beschrieben. Das Kulturmedium wurde leicht verändert. Die Zusammensetzung der Salze wurde vereinfacht. Es wurden andere organische Substrate verwendet, und vor allem wurden neben dem Vitamine-Cocktail auch ein Spurenelemente-Cocktail zugegeben (vgl. Kapitel B.2.1.). Die Belüftung der Kultur im Fermenter wurde durch die Luftzufuhr über eine Pressluftpumpe und die Rührergeschwindigkeit eingestellt. Die Anzucht wurde bei 30°C durchgeführt. Das Ziel war, eine möglichst hohe Ausbeute an Zellen zu erhalten, die einen hohen Anteil an Bacteriochlorophyll in der Membran aufweisen sollten, wenig Carotinoide bilden und bei denen das Mengenverhältnis RC/LH I : LH II zu Gunsten der Reaktionszentren verschoben sein sollte. Eine erhöhte Luftzufuhr begünstigt das Wachstum (nach T. Shiba [164] erhält man bei 55% O2 die optimale Wachstumsrate), kann aber auch zur vermehrten Bildung von Lipopolysacchariden auf der äußeren Membran führen, die den Aufschluss der Zellen in der French-Press und das Gewinnen von Membranen (siehe Kapitel B.2.2. bzw. B.2.3.) erschwert bzw. verhindert [165]. Daher wurde in der Anfangsphase eine geringere Luftzufuhr und Rührergeschwindigkeit verwendet (ca. 70% O2 und 200 bis 250 rpm Rührergeschwindigkeit im 28 l-Fermenter; ca. 40 l/min Luftzufuhr und 150 bis 200 rpm Rührergeschwindigkeit im 200 l-Fermenter), die während der exponentiellen Wachstumsphase erhöht wurde, um das Zellwachstum zu begünstigen (85% O2 und 300 rpm Rührergeschwindigkeit im 28 l-Fermenter; 80 l/min Luftzufuhr und 250 rpm Rührergeschwindigkeit im 200 l-Fermenter). Es wurde versucht, durch Variierung der Luftzufuhr und der Rührergeschwindigkeit das Verhältnis von BCHl : Carotinoide (1:10) zu verbessern, um die Isolierung des Reaktionszentrums aus den Zellen zu erleichtern. Es konnte aber kein Effekt nachgewiesen werden. Auch das Verhältnis von RC-LH I-Komplex zu LH II konnte nicht verbessert werden. Die Bildung von LH II kann durch Licht inhibiert werden 109 Ergebnisse [166]; dies war aber bei den verwendeten Fermentern nicht durchzuführen. Ein weiteres Problem für den Zellaufschluss könnten Einlagerungen von Polysacchariden, Polyhydroxyalkanoaten und Polyphosphaten in die Zelle darstellen, die bei bestimmten Wachstumsbedingungen stattfinden können [109]. Ein ungünstiges Verhältnis von C und N im Nährmedium könnte sich negativ auswirken, allerdings ist über die genaue Ursache und Bedingungen für solche Einlagerungen nichts bekannt. Es wurde mit einer kleinen Menge an Bakterienzellen angeimpft (insbesondere beim großen Fermenter mit 200 l Arbeitsvolumen), was zwar eine längere lag-Phase bedingte, wodurch aber ein stärkeres Wachstum der Zellen und eine bessere Bildung von Bacteriochlorophyll (gemessen anhand der charakteristischen Absorptionsmaxima im Spektrum bei 810 nm (RC-LH I) und 870 nm (LH II)) erreicht werden konnte. Das Wachstum der Zellen im 28 l-Fermenter wurde durch die Messung der Zunahme der Trübung der Zellsuspension mittels der optischen Dichte bei 660 nm, das Wachstum der Zellen im 200 l-Fermeter analog durch die Messung der optischen Dichte bei 578 nm verfolgt. Nach dem Animpfen betrug die optische Dichte im 28 l-Fermenter OD660 ≈ 0,05 bis 0,1 und im 200 l-Fermenter OD578 ≈ 0,005 bis 0,01. Standardmäßig wurde eine Wachstumskurve aufgenommen, indem die Absorption als Maß der Zellmenge gegen die Zeit aufgetragen wurde, um den geeigneten Zeitpunkt für das Ernten der Zellen zu ermitteln. Die Wachstumskurve hat eine sigmoidale Gestalt, bei der verschiedene Wachstumsphasen unterschieden werden: - lag-Phase: Sie umfasst das Zeitintervall zwischen dem Impfen und Erreichen der maximalen Teilungsphase. Ihre Länge ist abhängig von der Menge und Konzentration der zum Impfen verwendeten Vorkultur sowie von den Bakterienund Nährmedium-Eigenschaften. - log-Phase: Sie wird durch eine konstante minimale charakterisiert, die von der Bakterienart abhängt. - stationäre Phase: In dieser Phase hört das Zellenwachstum auf. - letale Phase: Hier beginnen die Zellen abzusterben. 110 Generationszeit Ergebnisse In den Abbildungen C.1.1 und C.1.2 sind die Wachstumskurven der Anzucht von Roseobacter denitrificans im 28 l-Fermenter bzw. im 200 l-Fermenter dargestellt. Absorption, A 660 1,5 1,0 0,5 0,0 0 5 10 15 20 25 Zeit (h) Abbildung C.1.1: Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 28 l-Fermenter. Bei dieser Anzucht wurde bei einer OD660 ≈ 1,7 abgeerntet. 4 Absorption, A578 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Zeit (h) Abbildung C.1.2: Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 200 l-Fermenter. Man beachte die relativ lange lag-Phase von ca. 15 h. Es wurde bei einer OD578 ≈ 3,0 abgeerntet. 111 Ergebnisse Die Fermentation wurde am Ende der log-Phase abgebrochen, um die Zellen mit einer Durchflusszentrifuge abzuernten. Um das Absterben und andere Veränderungen der Zellen, die das Verarbeiten der Zellen beeinträchtigen könnten, in dieser Zeit zu verhindern, wurde die Kultur sofort auf 10°C abgekühlt. Die geernteten Zellen wurden anschließend bei -80°C eingefroren. Die Ausbeute im 28 l-Fermenter nach ca. 17 bis 20 h Laufzeit betrug 3,5 bis 4,0 g/l Medium (Nassgewicht); die Ausbeute im 200 l-Fermenter nach ca. 30 h Laufzeit betrug ca. 3,5 g/l Medium (Nassgewicht). In Tabelle C.1.1 sind die im Text beschriebenen Daten zu der Anzucht im Fermenter zusammengefasst. Tabelle C.1.1: Zusammenfassung der Bedingungen und Ergebnisse für die Anzucht von Roseobacter denitrificans im 28 l-Fermenter und im 200 l-Fermenter (siehe auch Text). OD660 beim Animpfen OD578 beim Animpfen T (°C) O2 während der lag-Phase (%) Luftzufuhr während der lag-Phase (l/min) O2 während der log-Phase (%) Luftzufuhr während der log-Phase (l/min) Laufzeit (h) Länge der lag-Phase (h) OD660 beim Ernten der Zellen OD578 beim Ernten der Zellen Ausbeute (g Nassgewicht/ l Medium) 112 28 l-Fermenter 0,05 - 0,1 30 70 - 200 l-Fermenter 0,005 - 0,01 30 40 85 - 80 17 - 20 5-8 1,8 - 2,3 3,5 - 4,0 28 - 30 15 - 16 2,5 - 3,0 3,0 - 3,5 Ergebnisse C.2. Untersuchungen an isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans C.2.1. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Grundsätzlich umfasst die Isolation eines Membranproteins folgende Schritte: - Aufbrechen der Zellen; - Gewinnung von Membranvesikel bzw. Chromatophoren oder von Membranfragmenten; - Solubilisierung der Membranproteine mit einem geeigneten Detergens; - Abtrennung des gewünschten Membranproteins. Bei der Isolation von Reaktionszentren aus Purpurbakterien werden u.a. modifizierte Vorschriften nach der Methode von G. Feher und M.Y. Okamura für Rhodobacter sphaeroides [167] verwendet. Bei dieser Methode werden nach dem Zellaufschluss die gewonnenen Chromatophoren mit LDAO zur Solubilisierung der Membranproteine behandelt und die Reaktionszentren mittels AnionenaustauschChromatographie von den restlichen Proteinen abgetrennt. Dieses Präparationsschema kann im Prinzip auch bei der Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans angewendet werden [128]. Es beinhaltet im wesentlichen folgende Schritte: - Aufbrechen der Zellen mit einer French Press; - Gewinnung der Chromatophoren durch fraktionierende Zentrifugation; - Vorsolubilisierung und Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO; - Abtrennung der Reaktionszentren über eine DEAE-Sephacel- Anionenaustausch-Säule durch Elution mit NaCl. Daneben wird in der Literatur ein anderes Verfahren beschrieben, was auf einer Dichtegradientenzentrifugation beruht. Dieses Verfahren wurde bereits sehr + erfolgreich zur Reinigung der H -ATPase aus Spinat-Chloroplasten (CF0F1) [168] und aus Escherichia coli (EF0F1) [169] verwendet. Auch bei der Isolation von 113 Ergebnisse Lichtsammelkomplexen aus photosynthetischen Bakterien [170] fand die Methode mit den folgenden Schritten Anwendung: - Aufbrechen der Zellen mit einer French Press; - Gewinnung von Membranvesikel durch Ultrazentrifugation; - Abtrennung der Cytoplasmamembran durch Dichtegradientenzentrifugation; - Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO; - Abtrennung von LH I und LH II durch Dichtegradientenzentrifugation; - Weitere Aufreinigung von LH I und LH II durch AnionenaustauschChromatographie. Ziel der Arbeit war funktionale Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans in möglichst hoher Ausbeute mit allen Untereinheiten (H, M, L und C; siehe Kapitel A.4.4.) und Cofaktoren zu erhalten. Die Funktionalität der Reaktionszentren wurde über die Ladungsrekombination vom primären Akzeptor QA bzw. vom sekundären Akzeptor QB zum primären Donator P nachgewiesen. C.2.1.1. Isolation der Reaktionszentren aus denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya Roseobacter Zunächst wurden die Reaktionszentren nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128, 131, 146, 147] isoliert und aufgereinigt. Die Isolationsvorschrift ist in Kapitel B.2.3.1. beschrieben, die verwendeten Lösungen in Kapitel B.1.2.2.. Bei allen Präparationen wurden die Zellen zunächst mittels einer French Press aufgebrochen (siehe Kapitel B.2.2.). Da bei einigen Präparationen nach dem Zellaufschluss im SDS-Gel keine Proteinbanden mehr erkennbar waren, schloss man daraus, dass beim Zellaufschluss Proteasen freigesetzt wurden, die die Proteine zerstören. In den folgenden Präparationen wurde dies behoben, indem beim Zellaufschluss das Protease-Inhibitoren-Cocktail Complete (Boehringer) und 1 mM EDTA zugegeben wurde. 114 Ergebnisse Bei einigen Präparationen ließen sich die Zellen nicht aufschließen und oft war die Ausbeute an gewonnenen Membranen nach dem Zellaufschluss sehr gering. Daher wurde der Zellaufschluss einer Zellsuspension mit der French Press bis zu 5x hintereinander mit dem maximalen Druck (27000 psi) wiederholt. Alternativ wurde die Zellsuspension mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzuschließen. Keine dieser Methoden verbesserte den Zellaufschluss. Bei diesen Untersuchungen wurde aber festgestellt, dass die Zellsuspension sich im Laufe der Zeit verändert (obwohl die Präparationsschritte bei 4°C durchgeführt wurden) und zu einer leicht zähflüssigen und schäumenden Suspension wurde, die sich dann nicht mehr aufschließen ließ. Um dies zu vermeiden, wurden die Zellen in den folgenden Präparationen im Kühlschrank bei 4°C über Nacht aufgetaut, in 4°C kalten Puffer resuspendiert, homogenisiert und gewaschen sowie danach sofort und zügig in der vorgekühlten French Press mit einem Durchgang bei 27000 psi aufgebrochen und die Membranen durch Zentrifugation bei 4°C gewonnen. Dennoch konnten bei einigen Präparationen die Zellen nicht oder nicht vollständig aufgeschlossen werden, was auf ein unterschiedliches Wachstum der Zellen zurückgeführt wurde (siehe Kapitel C.1.). Im Folgenden soll der Verlauf und das Ergebnis der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] beschrieben werden. Abweichend zur Vorschrift wie in Kapitel B.2.3.1. beschrieben wurde mit 0,4% LDAO solubilisiert, da die Bacteriochlorophyllkonzentration in der Membransuspension nach dem Zellaufschluss nur 0,16 mM (anstatt 0,2 mM) betrug. Es wurden zwei Anionenaustausch-Reinigungsschritte durchgeführt und dabei 15 ODV bzw. 5 mg Reaktionszentren aus ca. 65 g Zellen von Roseobacter denitrificans gewonnen. Abbildung C.2.1.1.1 zeigt die UV-VIS-Absorptionsspektren der Zellen von Roseobacter denitrificans zwischen 660 und 900 nm vor Beginn der Präparation und im Verlauf der Isolation der Reaktionszentren beginnend mit der Abtrennung der Membranen vom Cytoplasma und größeren Membranen zwischen 700 und 900 nm bzw. zwischen 300 und 900 nm. Im Spektrum der Zellen erkennt man die charakteristischen Absorptionsbanden des LH II bei 806 nm und des LH I-RCKomplexes bei 870 nm, die auch nach Isolation der Membranen erhalten bleiben. Im Spektrum der Membranen wird lediglich die Trübung der Probe stark reduziert. Nach der Solubilisierung mit 0,4% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Jetzt sind 115 Ergebnisse Absorptionsbanden von an Protein gebundenem Bacteriochlorophyll im Bereich zwischen 700 und 900 nm zu erkennen, die sowohl von Reaktionszentren als auch von LH I und LH II herrühren. Das Spektrum zwischen 300 und 600 nm ändert sich ebenfalls im Vergleich zum Spektrum von Membranen (siehe Kapitel C.2.2.). Nach der 1. Anionenaustausch-Säule entspricht das Spektrum schon weitgehend dem typischen Spektrum isolierter Reaktionszentren (vgl. Abbildung B.2.4.4.3), lediglich die Amplituden der Banden, insbesondere die Amplituden der Banden bei 750, 802 und 860 nm, stehen noch nicht im richtigen Verhältnis zueinander, was auf noch vorhandene Verunreinigungen hindeutet. Das Spektrum nach weiterer Reinigung durch eine 2. Anionenaustausch-Säule entspricht dem Spektrum gereinigter Reaktionszentren (vgl. Abbildung B.2.4.4.3). 116 Ergebnisse A 0,45 1,85 1,80 1,75 0,40 Absorption Absorption 1,90 B Membranen 0,35 0,30 0,25 0,20 Zellen 0,15 1,70 700 750 800 850 700 Wellenlänge (nm) 750 Absorption 0 ,6 Solubilisierung mit 0,4% LDAO 0 ,4 800 850 Wellenlänge (nm) C 0 ,2 0 ,0 300 400 500 600 700 800 Wellenlänge (nm) 0 ,4 Absorption D 1. DEAE-SäulenChromatographie 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 400 500 600 700 800 Wellenlänge (nm) E 0 ,1 0 gereinigte Reaktionszentren Absorption 0 ,0 8 0 ,0 6 0 ,0 4 0 ,0 2 0 ,0 0 400 500 600 700 800 Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.1.1.1: Verlauf der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya. (A) Zellsuspension, (B) nach Isolation der Membranen, (C) nach Solubilisierung mit 0,4% LDAO (D) nach der Isolation von Reaktionszentren und Aufreinigung mit einer Anionenaustausch-Säule und (E) die gereinigten Reaktionszentren nach der zweiten Anionenaustausch-Säule. 117 Ergebnisse Abbildung C.2.1.1.2 zeigt das SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren. Die Proben wurden vorbereitet wie in Kapitel B.2.4.3. beschrieben. Im SDS-Gel sind die Untereinheiten M, L und die Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums zu erkennen, während die H-Untereinheit fehlt. Die isolierten Reaktionszentren zeigen auch keinerlei Rekombinationskinetik (vgl. Kapitel B.2.5.1.3.). Mit dieser Methode konnten also keine aktiven Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans erhalten werden, da die H-Untereinheit während der Präparation abdissoziierte und möglicherweise weitere Schädigungen des Reaktionszentrums auftraten. 94000 67000 Cyt 43000 M L H M L 30000 20000 14000 RC I RC II RC III Ref sphe Abbildung C.2.1.1.2: SDS-Gel von isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya [128].. RC I, RC II und RC III sind verschiedene gesammelte Fraktionen an Reaktionszentren aus einer Präparation. Ref ist der Proteinstandard mit den angegebenen Molmassen und sphe sind aufgereinigte Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides. Weitere Erläuterungen im Text. 118 Ergebnisse C.2.1.2. Isolation der Reaktionszentren aus denitrificans durch Dichtegradientenfraktionierung Roseobacter Als Nächstes wurde in Zusammenarbeit mit N. Gad’on, Arbeitskreis Prof. Dr. G. Fuchs, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Institut für Biologie, Mikrobiologie die Methode der Dichtegradientenfraktionierung getestet, um reine intakte Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans zu isolieren. Die verwendete Vorschrift ist in Kapitel B.2.3.2. beschrieben, die Lösungen in Kapitel B.1.2.2.. Diese Methode lieferte sehr reine und stabile Reaktionszentren. Dennoch musste diese Methode verworfen werden, da sie nur kleine Mengen verarbeiten kann. Für die Präparation von Reaktionszentren aus 100 g Zellen sind 10 und mehr Dichtegradientenzentrifugationen nötig, denn die Ausbeute an Reaktionszentren ist eher gering (ca. 10 - 15 ODV bzw. 3 - 5 mg Reaktionszentren aus 100 g Zellen), was möglicherweise auch auf Verluste bei der Entnahme der gewünschten Fraktion aus dem Dichtegradienten zurückzuführen ist. Auf eine weitere spektroskopische Charakterisierung wurde aus diesen Gründen verzichtet. C.2.1.3. Isolation der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der modifizierten Vorschrift von K. Takamiya Wie in Kapitel C.2.1.1. beschrieben, konnten nach der Vorschrift von K. Takamiya et al. [128] keine intakten und aktiven Reaktionszentren isoliert werden. Daher wurde diese Vorschrift wie im Folgenden dargestellt modifiziert. Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO Die Solubilisierung der Membranproteine mit LDAO wurde untersucht, um die Ausbeute an Reaktionszentren zu erhöhen. Dazu wurde die Konzentration an zugegebenem Detergens variiert (Abbildung C.2.1.3.1). Die Vorsolubilisierung nach K. Takamiya et al. [128], die die Membranstruktur aufweiten soll, um die Effektivität der darauffolgenden Solubilisierung zu erhöhen, wurde beibehalten. Hierzu wurden die Membranen mit einer Bacteriochlorophyll-Konzentration von 0,2 mM (ca. 20 119 Ergebnisse mg/ml Gesamtprotein) eingesetzt. Es zeigte sich, dass Konzentrationen von LDAO > 1% insbesondere die Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans zerstörten, eine Konzentration von LDAO < 0,4% jedoch kein Protein zu lösen vermochte. Die Bestimmung der benötigten LDAO Konzentration im Vorfeld durch Titration kleiner Proben der verwendeten Membranen-Suspension mit 0,4 bis 0,5% LDAO und Ultrazentrifugation mit einer Airfuge (die Methode ist im Detail bei R. Schmid beschrieben [155]) verbessert die Ausbeute an Reaktionszentren nur geringfügig (von ca. 35 auf ca. 50 ODV bzw. von 10 mg auf 15 mg Reaktionszentren aus ca. 100 g Zellen pro Präparation). Dennoch kann sich unter Umständen der dazu erforderliche Arbeitsaufwand lohnen, da ohnehin nur eine geringe Ausbeute an Reaktionszentren erwartet werden kann, wenn man voraussetzt, dass in Zellen von Roseobacter denitrificans selbst unter optimalen Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Rhodobacter sphaeroides (aus 100 g Zellen werden ca. 120 mg bzw. 420 ODV Reaktionszentren gewonnen; [171]) nur etwa 1/10 Reaktionszentren gebildet werden [172]. 120 Absorption Ergebnisse 0,05 0,40% LDAO 0,00 500 600 700 Wellenlänge (nm) 800 Absorption 0,20 0,50% LDAO 0,15 0,10 0,05 0,00 500 600 700 800 Absorption Wellenlänge (nm) 0,5 0,55% LDAO 0,0 500 600 700 Wellenlänge (nm) 800 Absorption 1,0 0,70% LDAO 0,5 0,0 500 600 700 800 Wellenlänge (nm) Absorption 1,0 0,95% LDAO 0,5 0,0 500 600 700 800 Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.1.3.1: Solubilisierung mit unterschiedlichen Konzentrationen an LDAO. Ab einer Konzentration von 0,55% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Die typischen Absorptionsbanden für das Membranen-Spektrum verschwinden, und es treten die typischen Banden für die aus den Membranen herausgelösten Proteinkomplexe auf (siehe Kapitel B.2.4.4.). Bei höheren LDAO-Konzentrationen werden mehr Proteine herausgelöst. Im weiteren Verlauf der Präparation stellte sich jedoch heraus, dass durch eine höhere LDAOKonzentration die H-Untereinheit vom Reaktionszentrum abgelöst wird und vermutlich weitere Schädigungen (Aufweitung der Bindungstasche) erfolgen, so dass keine Rekombinationskinetik zu beobachten war (siehe Kapitel C.2.2.). Die optimale Konzentration an LDAO betrug in diesem Fall 0,50%. Die geringste Konzentration, bei der sich die Proteinkomplexe aus der Membran herauslösen ließen, war 0,55% LDAO. Bei Verwendung eines Vorsolubilisierungsschrittes (siehe Text bzw. vgl. Kapitel B.2.3.1.3. und B.2.3.3.3.) wurde dann die niedrigere Konzentration an LDAO verwendet. 121 Ergebnisse Abtrennung der Reaktionszentren von den restlichen Membranproteinen Die Abtrennung der Reaktionszentren von den anderen Membranproteinen mittels Anionenaustausch-Chromatographie wurde mehrfach untersucht und variiert. Als Säulenmaterial wurde DEAE Toyopearl Chromatographic Resin 650M eingesetzt, das in der Arbeitsgruppe bei der Isolation der Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides verwendet wurde und von den getesteten Säulenmaterialien die beste Aufreinigung der Reaktionszentren zeigte [171]. Die Elution der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans erfolgte mit einem NaCl-Stufen-Gradienten (0,1 - 0,5 M NaCl). Die Reaktionszentren wurden bei der DEAE-Toyopearl-Säule bei 0,28 M NaCl eluiert (bei der DEAE-Sephacel-Säule in der Vorschrift von K. Takamiya bei 0,35 M NaCl; [128]). Gegebenenfalls wurde eine zweite Aufreinigung mit der DEAEToyopearl-Säule angeschlossen, um die Reinheit der erhaltenen Reaktionszentren zu verbessern. Trotz des Detergenswechsel von LDAO zu Triton X-100 (milderes Detergens) bei der Aufreinigung der Reaktionszentren [128] wurde festgestellt, dass die erhaltenen Reaktionszentren instabil waren und bei Lagerung in Puffer mit 0,1 % Triton [128] bei 4°C innerhalb einiger Stunden bzw. beim Einfrieren und wieder Auftauen zerstört wurden. Dies zeigte Reaktionszentren. sich durch Insbesondere Änderungen ging die im UV-VIS-Spektrum Absorptionsbande der des Bacteriochlorophylldimers (primärer Donator P) bei 860 nm zurück oder verschwand ganz (Abbildung C.2.1.3.2). Weiterhin konnte an solchen Reaktionszentren-Proben keine Aktivität in Form einer blitzinduzierten Ladungsrekombination nachgewiesen werden. Die Zerstörung der Reaktionszentren nach der Isolation wurde auf die aggressive Wirkung der verwendeten Detergentien (LDAO und Triton X-100) in hoher Konzentration zurückgeführt. Zudem wurde vermutet, dass auch die erhöhte NaClKonzentration die Reaktionszentren destabilisieren könnte. Die gleiche Wirkung hatte offensichtlich auch die Kristallisation des H2O beim Einfrieren der ReaktionszentrenProben. 122 Ergebnisse 0.1 Absorption nach dem Auftauen 0.0 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.1.3.2: Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren nach dem Auftauen. Die Reaktionszentren wurden zur Lagerung mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei -80°C gelagert. Die Bacteriochlorophylldimer-Bande bei 860 nm ist fast vollständig verschwunden, die Reaktionszentren sind inaktiv. Diese Instabilität der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans gegen Detergentien, Salzen und Einfrieren ist ungewöhnlich groß, wenn man sie z.B. mit den Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides vergleicht, die ohne weiteres in 0,025% LDAO bei -80°C gelagert werden können. Um die Zerstörung der Reaktionszentren zu vermeiden, wurden folgende Maßnahmen getroffen: • Die Reaktionszentren-Proben wurden nach der Anionenaustausch-Säule sofort entsalzt, bevor sie weiterverarbeitet wurden (weitere Aufreinigung, Aufkonzentrierung oder Lagerung). • Die Reaktionszentren-Proben wurden nach Zugabe von 20% Glycerin bei -20°C gelagert, so dass das H2O nicht kristallisierte. 123 Ergebnisse Es wurden verschiedene Methoden getestet, um die Konzentration an Detergens zu erniedrigen. Insbesondere wurde versucht, die LDAO-Konzentration nach der Solubilisierung der Membranproteine möglichst rasch zu verringern, da dieses Detergens (ionisches Detergens) wesentlich aggressiver ist als Triton X-100 (nichtionisches Detergens) und eine Mischmizellen-Bildung nach dem Detergenswechsel bei der Aufreinigung wahrscheinlich ist. • Zunächst wurde versucht, das LDAO nach der Solubilisierung durch Behandlung mit Biobeads, die Detergensmoleküle binden können, zu entfernen. Die LDAO-Konzentration konnte dadurch nur geringfügig verringert werden. Diese Methode konnte bei den verwendeten großen Volumina (>100 ml) die große Menge an Detergensmolekülen (ca. 0,5% LDAO) nicht bewältigen. • Es wurde versucht, die Detergensmoleküle durch Dialyse bei 4°C gegen einen Puffer, der kein Detergens enthielt, zu entfernen (diese Methode wird bei Rhodobacter sphaeroides angewendet [155]). Diese Methode ist aber nicht schnell genug, und die Reaktionszentren wurden während der Dialyse zerstört. • Als weitere Methode zur Abtrennung von überschüssigem Detergens (LDAO) wurde die Gelfiltration untersucht. Ausgehend von der Vorschrift nach K. Takamiya et al. [128] wurde nach der Solubilisierung der Proteine mit LDAO und vor der Anionenaustausch-Chromatographie der Detergensaustausch zum weniger aggressiven Triton X-100 mittels Gelfiltration durchgeführt. Hierzu musste das Probenvolumen nach der Solubilisierung mittels Ammoniumsulfat-Fällung, wie in Kapitel B.2.3.3.4. beschrieben, auf ca. ¼ (ca. 20 ml) des Ausgangsvolumen reduziert werden. Schon während dieses Schrittes wurde das Detergens gewechselt. Dann wurde die Probe in ca. 4 - 5 Proben zu jeweils 5 ml aufgeteilt, die jeweils auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen und wie in Kapitel B.2.3.3.5. beschrieben eluiert wurden. Die einzelnen Proben aus den Gelfiltrationen wurden bei -20°C gelagert, für zusammengegeben die und Anionenaustausch-Chromatographie wie in 124 Kapitel B.2.3.3.6. wieder beschrieben Ergebnisse weiterverarbeitet. Diese Methode war von den untersuchten am zufriedenstellendsten, obwohl auch sie einen Zeitaufwand von mehreren Tagen bedeutete (siehe auch Kapitel C.2.2.). • Nach der Anionenaustausch-Chromatographie wurde die Triton X-100 Konzentration in den Puffern beim Entsalzen und Aufkonzentrieren der Reaktionszentren-Proben auf 0,025 % verringert. • Die Konzentrierung der Reaktionszentren-Proben geschah mit einer AmiconRührzelle über eine YM 100-Membran, die Moleküle mit einer Molmasse von ≤ 100 KDa durchlässt und Moleküle, die größer sind, zurückhält. Auf diese Weise sollten die reaktionszentrenfreien Detergensmizellen (90000 Da nach Herstellerangaben der Firma Roth, Karlsruhe) die Lösung verlassen können, während das Reaktionszentrum (136000 Da) zurückgehalten wird. Dies verhindert eine Aufkonzentrierung des Detergens, was die isolierten Reaktionszentren zerstören würde. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit sich die Ammoniumsulfat-Fällung zur Abtrennung von Proteinverunreinigungen eignet. Hierzu wurde neben der einfachen 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung eine fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung in drei Schritten getestet. Beide Methoden sind in Kapitel B.2.3.3.4. beschrieben. Für die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung wurde zunächst eine Fällung und darauffolgende Waschung mit 50% Ammoniumsulfat-Sättigung in der Lösung durchgeführt. Dieser Schritt bewirkte hauptsächlich die Abtrennung von einem Teil der LH II Komplexe. Anschließend wurde der Niederschlag wieder in Puffer aufgenommen und mit 35% Ammoniumsulfat gefällt. Dabei blieben die Reaktionszentren in Lösung, während andere Proteinverunreinigungen gefällt wurden. Anschließend wurde der Überstand, der die Reaktionszentren enthielt, mit 65% Ammoniumsulfat versetzt und so das gesamte übriggebliebene Protein gefällt, das wieder in Puffer aufgenommen und mittels Gelfiltration wie in Kapitel B.2.3.3.5. beschrieben weiterverarbeitet wurde. Die so erhaltene Vorreinigung der Reaktionszentren ging einher mit nicht vernachlässigbaren Proteinverlusten, da insbesondere bei der 35%-Fällung ein erheblicher Teil der Reaktionszentren mitgefällt wurde und damit für die Präparation verloren ging. Die Ausbeute an 125 Ergebnisse Reaktionszentren mit der fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung betrug 21 ODV bzw. 7 mg, während mit der 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung 45 ODV bzw. 15 mg Reaktionszentren erhalten wurden. Daher wurde die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung durch eine einfache 50%-Fällung ersetzt, die in jedem Fall einen Teil der LH II Komplexe aus der Proteinlösung abtrennen konnte. Gleichzeitig wurde dadurch der benötigte Zeitaufwand reduziert, was ein wichtiger Faktor bei der Erhaltung der Aktivität der Reaktionszentren während der Aufreinigung ist. Die Ergebnisse der Präparation mit fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung sowie der Präparation mit 50%iger Ammoniumsulfat-Fällung sind in Kapitel C.2.2. beschrieben. 126 Ergebnisse C.2.2. Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Präparationsvorschrift In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Isolation und Aufreinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach Optimierung der Vorschrift wie in Kapitel B.2.3.3 und C.2.1.3 beschrieben dargestellt. Die verwendeten Lösungen sind in Kapitel B.1.2.2. beschrieben. Zur Dokumentation der Isolationsprozedur wurden am Ende bestimmter Präparationsschritte Proben entnommen, um den Bacteriochlorophyll- bzw. Proteingehalt zu bestimmen, die Absorptionsspektren aufzunehmen, ein SDS-Gel der Proteine zu machen und/oder die Ladungsrekombination zu messen (siehe Kapitel B.2.4. und B.2.5.). Für die im folgenden beschriebene Präparation von Reaktionszentren wurden 75 g Zellen von Roseobacter denitrificans eingesetzt. Es wurde mit 0,5% LDAO solubilisiert und eine fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung durchgeführt. In Abbildung C.2.2.1 ist die Proteinmenge im Verlauf der Isolation dargestellt. Die Angaben beziehen sich auf eine Ausgangszellmasse von 75 g (Nassgewicht). 7000 mg Zellsuspension 4800 mg aufgeschlossene Zellen 2250 mg Membranen 1630 mg solubilisierte Proteine 149 mg Ammoniumsulfat-Fällung 98 mg nach der Gelfiltration 10 mg isolierte Reaktionszentren Abbildung C.2.2.1: Verlauf der Proteinmenge während der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Die Ausgangszellmasse betrug 75 g (Nassgewicht). Die Präparationsschritte sind in Kapitel B.2.3.3. detailliert beschrieben. 127 Ergebnisse Betrachtet man den Verlauf der Proteinmenge, ist zu Beginn ein starker Verlust durch den Zellaufschluss und die Abtrennung der Membranen zu erkennen. Weitere Verluste treten vor allem nach der fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung und nach Abtrennung der Reaktionszentren durch Anionenaustausch-Chromatographie auf. Abbildung C.2.2.2 zeigt die UV-VIS-Absorptionsspektren zwischen 300 und 900 nm im Verlauf der Isolation beginnend mit der Abtrennung der photosynthetischen Membranen vom Cytoplasma und größeren Membranen. Im Spektrum der Membranen sind deutlich die beiden Maxima der Absorption de LH II(Lichtsammelkomplex II) und RC-LH I-Komplexe (Reaktionszentrum- Lichtsammelkomplex I-Kernkomplex) bei 806 und 870 nm zu erkennen. Die Reaktionszentren sind noch in die Membran eingebettet und bilden einen Komplex mit dem Lichtsammelkomplex LH I aus. Nach der Solubilisierung mit 0,5% LDAO ändert sich das Spektrum deutlich. Jetzt sind Absorptionsbanden von an Protein gebundenem Bacteriochlorophyll im Bereich zwischen 700 und 900 nm zu erkennen, die sowohl von Reaktionszentren als auch von LH I und LH II herrühren. Das Spektrum zwischen 300 und 600 nm ändert sich ebenfalls im Vergleich zum Spektrum der Membranen. Bei 590 und 370 nm erkennt man wiederum die Bacteriochlorophyllbanden. Die breite Bande um die 500 nm entspricht der Absorption von Carotinoiden. Andere Banden, wie z.B. die von Cytochromen (siehe Abbildung B.2.5.1), werden hingegen (fast) vollständig überlagert. In den folgenden Präparationsschritten der Ammoniumsulfat-Fällung und der Gelfiltration ändern sich die Spektren nur wenig. Es werden immer mehr neue Banden bzw. Schultern sichtbar, wie z.B. zwischen 400 und 420 nm die Soret-Bande der Cytochrome oder bei 860 nm die Bande des Bacteriochlorophylldimers des Reaktionszentrums (Abbildung C.2.2.2D). In diesen Präparationsschritten werden nach und nach die Antennenkomplexe und die Carotinoide abgetrennt. Abbildung C.2.2.2E zeigt das Spektrum der isolierten Reaktionszentren nach dem Entsalzen. Aufgrund der relativ kleinen Ausbeute wurde die Probe nicht aufkonzentriert. Dieses Spektrum zeigt alle charakteristischen Banden des Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans (vgl. Abbildung B.2.4.4.3). Das Verhältnis der Amplituden der Banden A750 nm : A802 nm : A860 nm = 1 : 2,5 : 1 ist etwas größer als in isolierten Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides (A760 nm : A802 nm : A865 nm = 1 : 2,2 : 1; [167]) und deutet 128 Ergebnisse daraufhin, dass die Antennenkomplexe nicht restlos von den Reaktionszentren abgetrennt werden konnten. Dies könnte auf die besondere Stabilität des RC-LH IKomplex zurückzuführen sein. Ein ähnliches Verhältnis der Amplituden findet sich auch bei K. Takamiya et al. [128]. 129 Absorption Absorption Ergebnisse 0 ,2 A Membranen 0 ,1 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Wellenlänge (nm) 8 0 0 Absorption Absorption 0 ,6 B Solubilisierung 0 ,4 0 ,2 0 ,0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Wellenlänge (nm) Absorption Absorption 1 ,0 C fraktionierende AmmoniumsulfatFällung 0 ,5 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Wellenlänge (nm) Absorption Absorption 0 ,3 D Gelfiltration 0 ,2 0 ,1 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Absorption Absorption Wellenlänge (nm) E AnionenaustauschChromatographie 1 ,0 0 ,5 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.2.2: Verlauf der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Beschreibung im Text. 130 Ergebnisse Abbildung C.2.2.3 zeigt das SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren. Die Proben wurden vorbereitet wie in Kapitel B.2.4.3. beschrieben. Es sind deutlich die vier Banden der vier Untereinheiten des Reaktionszentrums zu erkennen: die Cytochrom c-Untereinheit bei ca. 50000 Da, die M-Untereinheit bei 32000 Da, die H-Untereinheit bei 30000 Da und die L-Untereinheit bei 26000 Da. Diese Zuordnung der Banden wurde durch N-terminale Sequenzierung der vier Proteine bestätigt [173]. Die dunklere Färbung der Banden des Cytochroms und der H-Untereinheit lässt sich wahrscheinlich auf die höhere Polarität dieser aus der Membran ins Cytoplasma bzw. Periplasma ragenden Proteine, die eine stärkere Anfärbung durch den Farbstoff Coomassie brilliant blue ermöglicht, zurückführen. Die weiteren Banden, die insbesondere bei höheren Molmassen auftreten, könnten auf Komplexbildung zwischen den vier Untereinheiten zurückzuführen sein. Die Solubilisierung der Proteine mit SDS erwies sich als problematisch, da die üblicherweise angewandte Methode [174], die Proteinprobe mit SDS bei 95°C zu kochen, hier nicht angewendet werden konnte, da das Protein dabei agglutinierte und nicht mehr in Lösung zu bringen war. Eine Solubilisierung bei RT hingegen brachte kein Protein in Lösung. Das beste Ergebnis wurde mit einer Erhitzung der Probe auf 60°C erzielt. Darüber hinaus verbesserte eine Erhöhung der SDS-Konzentration von 3% auf 5% die Solubilisierung. 131 Ergebnisse 94000 67000 Cyt 43000 H M L M H L 30000 20000 14000 sphe Ref Roseo Abbildung C.2.2.3: SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans (Roseo). Die mittlere Bahn zeigt die Banden der Referenzproteine (Ref), die Bahn ganz links die Banden der isolierten Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides (sphe). Probenvorbereitung und Durchführung der Gelelektrophorese wie in Kapitel B.2.4.3. beschrieben. 132 Ergebnisse Als nächstes soll das Ergebnis einer weiteren Präparation von Reaktionszentren nach Optimierung der Vorschrift, bei der die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung durch eine 50% Ammoniumsulfat-Fällung ersetzt wurde, wie in Kapitel B.2.3. und C.2.1.3. beschrieben dargestellt werden. Abbildung C.2.2.4 zeigt die UV-VIS-Spektren im Verlauf der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren. Es wurde mit 0,5% LDAO solubilisiert (0,2 mM Bacteriochlorophyll in der Membransuspension). Aus ca. 80 g Zellen von Roseobacter denitrificans wurden 45 ODV bzw. 15 mg Reaktionszentren erhalten. Bei Vergleich der Spektren im Verlauf der Präparation von Reaktionszentren nach Optimierung der Vorschrift bei Durchführung einer 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung mit den Spektren bei Durchführung einer fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung (Abbildung C.2.2.2) sind keine wesentlichen Unterschiede zu erkennen. Das Bandenverhältnis A750 : A802 : A860 der isolierten Reaktionszentren betrug bei dieser Präparation 1 : 2,8 : 1. 133 Ergebnisse Absorption Absorption A Solubilisierung mit LDAO 0 ,2 0 ,1 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Absorption Absorption Wellenlänge (nm) 50%ige AmmoniumsulfatFällung 0 ,2 B 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Wellenlänge (nm) 8 0 0 Absorption Absorption 1 ,0 C Gelfiltration 0 ,5 0 ,0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Absorption Absorption Wellenlänge (nm) D Reaktionszentren 2 1 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Wellenlänge (nm) Abbildung C.2.2.4: Absorptionsspektren im Verlauf der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans mittels 50%iger AmmoniumsulfatFällung. Beschreibung im Text. 134 Ergebnisse Abbildung C.2.2.5 zeigt das SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der optimierten Präparationsvorschrift bei Durchführung einer 50%igen Ammoniumsulfat-Fällung. Wie auch im SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren bei Durchführung einer fraktionierenden Ammoniumsulfat-Fällung (Abbildung C.2.2.3) zeigt das Gel alle vier Banden der Untereinheiten L, M, H und des Cytochroms. 94000 67000 C 43000 M H 30000 L 20000 Referenz RC RC Abbildung C.2.2.5: SDS-Gel von isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Es wurde eine 50%ige Ammoniumsulfat-Fällung durchgeführt. Die Details sind im Text beschrieben. Zusammengefasst ergibt sich, dass die Durchführung von Isolation und Reinigung der Reaktionszentren mittels 50%iger Ammoniumsulfat-Fällung sehr ähnliche Ergebnisse liefert wie die fraktionierende Ammoniumsulfat-Fällung. 135 Ergebnisse Die Aktivität der Reaktionszentren wurde durch die Messungen der Rekombinationskinetiken in den Membranen, nach der Gelfiltration und in den isolierten Reaktionszentren während der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren verfolgt (siehe Kapitel B.2.5.). Die Auswertung der Kinetiken wie in Kapitel B.2.5.1.3. beschrieben ergibt für die Membranen: kAP = 47 s-1 für den Prozess P+QA- → PQA kBP = 0,55 s-1 für den Prozess P+QB- → PQB Die Ladungsrekombinationskinetik nach der Gelfiltration ist ebenfalls zweiphasig: kAP = 32 s-1 für den Prozess P+QA- → PQA kBP = 0,59 s-1 für den Prozess P+QB- → PQB Für isolierte Reaktionszentren hingegen beobachtet man nur eine schnelle Kinetik von: kAP = 32 s-1 für den Prozess P+QA- → PQA Während in den Membranen und den Proben aus der Gelfiltration eine Ladungsrekombination sowohl von QA- als auch von QB- beobachtet werden konnte, ist in den Reaktionszentren das Ubichinon zum Teil verloren gegangen, so dass nur die QA-Bindungsstelle besetzt wurde und nur die schnelle Rekombination von QAbeobachtet werden konnte (Abbildung C.2.2.6). Die Amplitude der schnellen Phase betrug: ∆A860(t=0) = 0,049 136 Ergebnisse daraus errechnet sich mit A860 = 0,164: ∆A860(t=0) / A860 = 0,3 für die Besetzung der QA-Bindungsstelle Der Wert für kAP in Membranen ist etwas größer als in den Reaktionszentren, was auf die beschleunigende Wirkung von o-Phenanthrolin, das zur Verdrängung von Ubichinon aus der QB-Bindungsstelle in Membranen verwendet wurde, zurückzuführen ist. Die Reaktionszentren hatten kein Ubichinon in der QBBindungsstelle, so dass keine Verdrängung durch o-Phenanthrolin nötig war. Der Absorptionsänderung, ∆A860 gleiche Effekt konnte auch in Rhodobacter sphaeroides beobachtet werden [155]. 0.000 -0.005 -0.010 -0.015 -0.020 -0.025 0.00 0.05 0.10 0.15 Zeit (s) Abbildung C.2.2.6: Ladungsrekombinationskinetik in isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Die isolierten Reaktionszentren enthalten kein Ubichinon in der QB-Bindungsstelle, und man beobachtet nur eine schnelle Rekombination von P+QA- zu PQA. Der Pfeil stellt den Zeitpunkt der Anregung durch den Laser dar. Da in allen durchgeführten Präparationen ein Teil des Ubichinons und oft das gesamte Ubichinon in den Bindungsstellen QA und QB verloren ging, wurde versucht, die isolierten Reaktionszentren mit Ubichinon zu rekonstituieren. Dazu wurden wie in Kapitel B.2.5. beschrieben die isolierten Reaktionszentren mit einer UbichinonLösung in Triton X-100 (siehe Kapitel B.1.2.5.1.) über mehrere Stunden bei 137 Ergebnisse Raumtemperatur inkubiert und in 15 bis 30 min Abständen die Ladungsrekombination nach Anregung durch einen Laser gemessen und die Besetzung der Ubichinonbindungsstellen bestimmt (siehe Kapitel B.2.5.1.3.). Obwohl diese Methode bei der Rekonstitution von Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides sehr erfolgreich angewendet wird [155], konnte bei Roseobacter denitrificans keine über die Zeit stabile Rekonstitution erreicht werden. Auch bei der Verwendung von Dodecylmaltosid, einem noch milderen Detergens, um das Ubichinon in Lösung zu bekommen, ist die Rekonstitution von Ubichinon in die Bindungstaschen nur vorübergehend möglich, so dass vermutlich die Detergenskonzentration bei dieser Methode zu hoch ist und die Bindungsstellen der Reaktionszentren zu weit aufgeweitet werden. Dadurch wird kein gebundenens Ubichinon gefunden. Daher wurde versucht über eine Dialyse der Reaktionszentren nach Zugabe der Ubichinon-Lösung in Triton X-100 bzw. Dodecylmaltosid in 10fachem Überschuss gegen Puffer mit 0,02% Triton X-100 bzw. 0,04% Dodecylmaltosid im Verhältnis 1 : 40 über 1 bis 2 Tage zu rekonstituieren. Diese Methode war erfolgreicher, aber es konnte nur eine Besetzung der QA-Bindungsstelle erreicht werden mit ∆A860(t=0)/A860 ≅ 0,3. Eine signifikante Besetzung der QBBindungsstelle wurde nicht beobachtet. Zum Vergleich: Für Rhodobacter sphaeroides wurde für das Ausbleichen der Absorptionsbande bei 865 nm ein Wert von ∆A865(t=0) / A865 = 0,8 (QA-Bindungsstelle) und ein Besetzungsgrad der QBBindungsstelle von 0,7 bis 0,8 gefunden [175]. Um zu prüfen, ob eventuell der primäre Elektronenakzeptor QA (Em,7 = -50 mV; dieses Halbstufenpotential ist jedoch umstritten, siehe Kapitel D.2.3.) bei den gegebenen Messbedingungen reduziert vorliegt und deswegen keine Messung der Rekombinationskinetik möglich war, wurde die Reaktionszentren-Lösung schrittweise mit einer Ferricyanid-Lösung oxidiert. Es konnte kein Effekt beobachtet werden, so dass offenbar die Ubichinone nicht reduziert vorlagen. Bei Zugabe eines Überschusses von Ferricyanid wird der primäre Donator (Em,7 = 435 mV) oxidiert, was über das Ausbleichen der Bande bei 860 nm nachgewiesen wurde. 138 Ergebnisse C.3. Untersuchungen an Roseobacter denitrificans Membranen aus C.3.1. Isolation der Membranen Die Isolation der Membranen wurde wie in Kapitel B.2.2. beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Kapitel C.2. zusammen mit den Ergebnissen der Isolation der Reaktionszentren behandelt. Aus 75 g Zellen (7000 mg Gesamtprotein) wurden 50 ml in 100 mM Mops/NaOHPuffer (pH = 7) suspendierte Membranen (45 µg /µl Protein, d.h. 2250 mg Gesamtprotein, 0,33 mM Bacteriochlorophyll) erhalten. Abbildung C.3.1.1A und B zeigen die Spektren der in 20 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 7,8) suspendierten Zellen und der in 100 mM Mops/NaOH-Puffer (pH = 7) suspendierten Membranen. 2.35 Absorption Absorption 0.2 2.30 2.25 2.20 0.1 2.15 0.0 700 750 800 Wellenlänge (nm) 400 850 500 600 700 Wellenlänge (nm) 800 Wellenlänge Wellenlänge Abbildung C.3.1.1: Spektren der Zellen (A) und der Membranen (B) aus Roseobacter denitrificans. 139 Ergebnisse C.3.2. Transiente optische Spektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans C.3.2.1. Probenvorbehandlung Spektroskopie für die transiente optische Wie in Kapitel B.2.2. beschrieben, wurde aus Zellen von Roseobacter denitrificans eine Membransuspension erhalten. Daraus wurde, wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben, die Probe für die spektroskopischen Untersuchungen vorbereitet. Abweichungen von der Standardprobe werden in den jeweiligen Kapiteln und Bildunterschriften beschrieben. Um Signale mit möglichst gutem Signal-RauschVerhältnis zu erhalten, wurden die Proben vor der Messung mit einem Sonifier beschallt. Dadurch werden die Membranaggregate gelöst, die die Trübung der Probe hervorrufen. Abbildung C.3.2.1.1 zeigt exemplarisch die UV-VIS-Spektren einer Probe vor, nach einer und nach zwei Beschallungen. Schon nach zwei Beschallungen erhöht sich die Transparenz der Probe beachtlich. Standardmäßig wurden jede Probe vor den spektroskopischen Messungen drei mal beschallt, um sicher zu sein, dass die Beschallungen die Trübung der Probe hinreichend verringert haben. Während der Dauer der Messungen (bis zu 4 - 5 Stunden) wurde die Transparenz der Probe beibehalten. Die Amplitude der Bacteriochlorophyll-Banden bei 805 nm und 870 nm verringerte sich, was darauf hindeutet, dass die Antennenkomplexe und das Reaktionszentrum über die relativ lange Dauer von einer Messreihe zum Teil zerstört werden. Im Bereich des Spektrums, in dem die Messreihen dieser Arbeit durchgeführt wurden (400 - 450 nm und 530 - 570 nm), sind hingegen kaum Änderungen im Spektrum zu erkennen (Abbildung C.3.2.1.2). 140 Absorption Ergebnisse Wellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.1.1: Spektrum der für verwendete Probe vor der Beschallung (a), Beschallungen (c). Beschallungsdauer aufeinanderfolgenden Beschallungen von Beschallungen auf Eis gekühlt. die spektroskopischen Untersuchungen nach einer Beschallung (b) und nach zwei von 3 s; Abstand zwischen zwei 60 s. Die Probe wurde während der 2,2 2,0 vor der Messung nach der Messung Absorption 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 400 500 600 700 800 900 W ellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.1.2: Spektrum der für die spektroskopischen Untersuchungen verwendeten Probe vor und nach der Messreihe. Für Erläuterungen siehe Text. 141 Ergebnisse C.3.2.2. Differenzspektrum des primären Elektronendonators nach Anregung durch einen Blitz Bei der Untersuchung der durch Lichtanregung erzeugten Absorptionsänderungen in Membransuspensionen hat man in der Regel eine Überlagerung von Absorptionsänderungen, die durch die Redoxreaktionen der Cytochrome des c- und b-Typs entstehen, und Absorptionsänderungen, die durch die Oxidation des primären Donators P des Reaktionszentrums hervorgerufen werden. Daher ist die genaue Kenntnis des Differenzspektrum des Redoxpaares P/P+ in der α- sowie in der γRegion Voraussetzung für die Analyse der lichtinduzierten Absorptionsänderungen der Cytochrome des c- und b-Typs in der Elektronentransportkette. Mit Hilfe dieses Spektrums ist es möglich, den Beitrag von P+ an den Absorptionsänderungen zu bestimmen und zu korrigieren, um den Beitrag der Redoxänderungen der Cytochrome an der Absorptionsänderung zu bestimmen. Um das Differenzspektrum des primären Donators zu bestimmen, wurde die Membransuspension im Dunkeln bei einem Redoxpotential Eh = (375 ± 5) mV unter Zugabe der Inhibitoren Antimycin A und Myxothiazol äquilibriert und dann die Absorptionsänderung nach Anregung durch einen einzelnen sättigenden Blitz gemessen. Bei diesen stark oxidierenden Redoxbedingungen liegen alle in der Literatur bekannten Redoxkomponenten der Elektronentransportkette oxidiert vor, bis auf den primären Elektronendonator P im Reaktionszentrum (vgl. Abbildung A.4.5.2). Bei Eh = 375 mV ist das Cytochrom c mit dem höchstem Redoxpotential, das Häm H1 im am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c (Em,7 = 290 mV), zu 96% oxidiert, der primäre Donator P (Em,7 = 435 mV) ist hingegen zu 91% reduziert (aus der Nernst-Gleichung berechnet, siehe Kapitel B.2.6.). Unter der Voraussetzung, dass ein Cytochrom bc1 Komplex in Roseobacter denitrificans vorhanden ist und dieser sich genauso verhält wie der aus dem Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides, sollten sich durch Zugabe der Inhibitoren Antimycin A (Qi-Bindungsstelle) und Myxothiazol (Qo-Bindungsstelle) die lichtinduzierten Redoxreaktionen der Cytochrome des b-Typs ausschalten und somit die Rereduktion des primären Donators P+ verhindern lassen (vgl. Abbildung D.2.4.1). Daher erwartet man, dass unter diesen Messbedingungen nur Absorptionsänderungen durch die lichtinduzierte 142 Ergebnisse Oxidation des primären Donators P zu P+ beobachtet werden. Damit in Einklang ist die Tatsache, dass über den gesamten untersuchten spektralen Bereich ein einzelner Blitz eine schnelle (durch das Gerät nicht aufgelöste) Absorptionsänderung (∆A) erzeugt, die mit einer langsamen Kinetik (t1/2 ≥ 1 s) wieder zerfällt. Diese Kinetik entspricht der Ladungsrekombination von P+QB- zu PQB. In Abbildung C.3.2.2.1 ist die Absorptionsänderung 1 ms nach der Anregung durch den Blitz in Abhängigkeit von der Wellenlänge in den spektralen Regionen der α- und γ-Bande dargestellt. Das Spektrum zeigt in der α-Region ein Minimum bei 605 nm, einen isosbestischen Punkt bei 582 nm und eine breite Bande mit ∆A > 0 und Maximum bei 545 nm. Das Verhältnis von ∆A605 zu ∆A540 liegt bei -2,0. Die Wellenlänge bei 540 nm wird oft verwendet, um die Redoxänderungen des primären Donators P in Purpurbakterien zu messen. Die Eigenschaften des Spektrums von P/P+ in Roseobacter denitrificans entsprechen weitgehend denen der Spektren in Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus [157]. In diesen Bakterien ist der isosbestische Punkt leicht verschoben (587 nm), während das Maximum bei 545 nm und das Minimum bei 605 nm den bei Roseobacter denitrificans erhaltenen Werten entsprechen. Auch das Verhältnis ∆A605 : ∆A540 = -1,96 hat den gleichen Wert im Rahmen der Messgenauigkeit. 143 Absorptionsänderung, ∆A x 103 Ergebnisse A 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 Absorptionsänderung, ∆A x 103 Wellenlänge (nm) B 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 400 410 420 430 440 450 460 470 480 Wellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.2.1: Zeitaufgelöste lichtinduzierte Absorptionsdifferenzspektren des primären Elektronendonators im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans in den spektralen Bereichen α (A) und γ (B). Es wurde eine Standardprobe verwendet wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben, mit folgenden Redoxmediatoren und Inhibitoren: 10 µM 1,2Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, p-Benzochinon und 5 µM Diaminoduren sowie 10 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol. Das eingestellte Redoxpotential wurde durch Zugabe von kleinen Mengen von Natriumascorbat bzw. Kaliumhexacyanoferrat auf Eh = (375±5) mV konstant gehalten. Die Daten zeigen die Absorptionsänderungen 1 ms nach einer Anregung durch einen einzelnen Blitz. Jeder Punkt in der Graphik ist der Mittelwert aus 4 Messungen die im Abstand von 60 s gemacht wurden. In dieser Zeit kann die Probe im Dunkeln in den Grundzustand zurückkehren. Bei λ = 605 nm wurden 16 Messungen gemittelt. 144 Ergebnisse Entsprechendes gilt für das gemessene Spektrum in der γ-Region. Hier beobachtet man eine breite und nichtsymmetrische Bande mit einem Maximum bei 440 nm mit einer Schulter bei 415 nm, die man in den Spektren von Rhodobacter sphaeroides genauso vorfindet [157]. Der isosbestische Punkt liegt bei 403 nm in Roseobacter denitrificans und bei 405 nm in Rhodobacter sphaeroides. In der γ-Region des Spektrums ist die gemessene Absorptionsänderung wahrscheinlich zum Teil auf die Bildung des Ubisemichinons an der Bindungsstelle QB des Reaktionszentrums zurückzuführen. Dieser Beitrag ist jedoch eher gering. Aus der gemessenen Absorptionsänderung bei 605 nm (Abbildung C.3.2.2.1A) lässt sich mit dem Extinktionskoeffizienten ∆ε605(P/P+) = 20 mM-1cm-1 [91] die Konzentration des nach Anregung durch einen Blitz photooxidierten Reaktionszentrums auf 0,24 µM bestimmen (nach Lambert-Beer, siehe Kapitel B.1.2.5.1.). Wie man in anderen Messungen bei vergleichbaren Redoxpotentialen Eh beobachten konnte (siehe Kapitel C.3.2.3.), zeigt schon die Anregung durch einen einzelnen Blitz die Bildung von reduziertem Cytochrom b561. Auch wenn eine zweite Anregung (500 ms nach dem ersten Blitz) eine sehr viel höhere Menge an reduziertem Cytochrom b561 bildet (nach dem two-electron-gate Prinzip, siehe Kapitel A.3.5.), zeigen diese Experimente, dass in einem Teil der Reaktionszentren das Ubisemichinon an der QBBindungsstelle schon vor der Anregung durch Licht gebildet wird. Mit dem Extinktionskoeffizienten ∆ε445(QB-/QB) ≅ 8,5 mM-1cm-1 [154] berechnet sich ∆A445 ≈ 2·10-3 für die Bildung von P+QB-. Dieser Wert entspricht maximal 30% des gemessenen Signals bei 445 nm (siehe Abbildung C.3.2.2.1). Insgesamt bestätigen die Daten in Abbildung C.3.2.2.1 die großen Ähnlichkeiten, die auch schon in der Literatur dokumentiert sind, des Reaktionszentrums von Roseobacter denitrificans zu den Reaktionszentren aus Purpurbakterien (siehe Kapitel A.3.2. und A.4.4.). 145 Ergebnisse Bestimmung der Redoxänderungen des primären Donators des Reaktionszentrums und Korrektur der gemessenen Absorptionsänderungen Die Wellenlänge λ = 605 nm eignet sich zur Bestimmung der Redoxänderungen des primären Donators P im Reaktionszentrum, weil sie zum einen das maximale Ausbleichen der Bande nach Anregung durch Licht zeigt, und zum anderen sind bei dieser Wellenlänge keine Interferenzen durch andere Redoxkomponenten vorhanden. Zur Bestimmung und Korrektur des Beitrages der Oxidation des primären Donators an der gemessenen Absorptionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge wird die Absorptionsänderung bei 605 nm ∆A60513 mit einem wellenlängenabhängigen Korrekturfaktor f(λ) multipliziert: ∆Aλ(primärer Donator) = ∆A605 · f(λ) Gleichung C.3.2.2.1 mit: ∆Aλ(primärer Donator) ≡ Absorptionsänderung erzeugt durch die Oxidation des primären Donators bei der Wellenlänge λ ∆A605 ≡ gemessene Absorptionsänderung bei 605 nm f(λ) ≡ Multiplikationsfaktor bei der Wellenlänge λ Der Multiplikationsfaktor f(λ) für jede Wellenlänge ist in Tabelle C.3.2.2.1 aufgelistet. Er berechnet sich aus den Absorptionsänderungen im Differenzspektrum des primären Donators in Abbildung C.3.2.2.1 wie folgt: f(λ) = ∆Aλ(P/P+) / ∆A605(P/P+) Gleichung C.3.2.2.2 mit: f(λ) ≡ Multiplikationsfaktor bei der Wellenlänge λ ∆Aλ (P/P+) ≡ Absorptionsänderung bei der Wellenlänge λ im Differenzspektrum des primären Donators ∆A605 (P/P+) ≡ Absorptionsänderung bei der Wellenlänge 605 nm im Differenzspektrum des primären Donators 13 muss bei jeder Versuchsreihe unter den jeweiligen Messbedingungen gemessen werden 146 Ergebnisse Diese Berechnung ist unabhängig von den Redoxbedingungen und kann somit auch bei Redoxpotentialen Eh, bei denen nach Anregung durch Licht Redoxänderungen von Cytochromen des b- oder c-Typs durch Absorptionsänderungen des photooxidierten primären Donators überlagert werden (vorausgesetzt ∆A605 wird bei den gleichen Bedingungen gemessen), angewandt werden. Subtrahiert man den Beitrag zur Absorptionsänderung der Oxidation des primären Donators ∆Aλ(primärer Donator) von der gemessenen Absorptionsänderung ∆Aλ bei einer bestimmten Wellenlänge λ, erhält man die Absorptionsänderung der Redoxänderung der Cytochrome des b- und/oder c-Typs (siehe z.B. Kapitel C.3.2.5.): ∆Aλ(Cytochrom) = ∆Aλ - ∆Aλ(primärer Donator) Gleichung C.3.2.2.3 mit: ∆Aλ(Cytochrom) ≡ Absorptionsänderung der Redoxreaktion der Cytochrome ∆Aλ ≡ gemessene Absorptionsänderung bei einer Wellenlänge λ ∆Aλ(primärer Donator) ≡ Absorptionsänderung durch die Oxidation des primären Donators 147 Ergebnisse Tabelle C.3.2.2.1: Faktoren f(λ) zur Bestimmung des Anteils der Oxidation des primären Donators P an der gemessenen Absorptionsänderung (siehe Text). λ (nm) 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 f(λ) 0,15 0,10 0,05 0 -0,07 -0,13 -0,20 -0,28 -0,37 -0,44 -0,54 -0,62 -0,69 -0,76 -0,83 -0,88 -0,91 -0,93 -0,96 -0,97 -1,01 -1,04 -1,07 -1,12 -1,16 -1,18 -1,22 -1,25 -1,27 -1,31 -1,35 -1,37 -1,40 -1,40 -1,41 -1,43 -1,43 -1,43 -1,43 -1,43 -1,43 -1,41 -1,40 -1,38 -1,35 -1,34 -1,29 -1,26 -1,21 -1,15 -1,10 -1,03 -0,96 -0,90 λ (nm) 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 f(λ) -0,85 -0,78 -0,73 -0,70 -0,68 -0,65 -0,63 -0,61 -0,59 -0,57 -0,56 -0,56 -0,55 -0,54 -0,54 -0,54 -0,54 -0,54 -0,54 -0,54 -0,53 -0,53 -0,53 -0,53 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 556 557 558 559 560 -0,46 -0,46 -0,48 -0,49 -0,50 -0,51 -0,51 -0,53 -0,53 -0,54 -0,53 -0,51 -0,48 -0,47 -0,42 -0,37 -0,32 -0,28 -0,26 -0,25 -0,23 -0,22 -0,23 -0,23 -0,23 -0,23 -0,23 -0,23 -0,23 148 λ (nm) 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610 611 612 613 f(λ) -0,23 -0,23 -0,23 -0,21 -0,21 -0,19 -0,18 -0,16 -0,15 -0,15 -0,15 -0,14 -0,14 -0,13 -0,13 -0,13 -0,12 -0,10 -0,08 -0,05 -0,01 0,01 0,07 0,08 0,12 0,15 0,18 0,21 0,23 0,28 0,31 0,37 0,43 0,50 0,59 0,68 0,76 0,84 0,88 0,93 0,96 0,98 1,00 1,01 1,00 0,98 0,96 0,93 0,89 0,84 0,78 0,69 0,57 Ergebnisse C.3.2.3. Lichtinduzierte Reduktion von Cytochrom b bei hohen Redoxpotentialen Obwohl in Roseobacter denitrificans ein Cytochrom bc1 Komplex postuliert worden ist [139, 176] (vgl. auch Kapitel A.4.5.), konnte bisher dessen Beteiligung an einem lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfersystem nicht nachgewiesen werden. Setzt man einen Q-Zyklus-Mechanismus voraus, wie man ihn in Purpurbakterien findet [84], würde man Folgendes erwarten (vgl. hierzu Abbildung A.3.5.1): Das nach zwei aufeinander folgenden Photoanregungen an der QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrum aus Ubichinon gebildete Dihydroubichinon wird in einer konzertierten Reaktion an der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes zu Ubichinon oxidiert. Ein Elektron wird dabei in die high potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes eingespeist, wo es nacheinander ein FeS-Zentrum und ein Cytochrom c1 reduziert. Das andere Elektron hingegen wird auf die low potential Kette, bestehend aus zwei hintereinander angeordneten Cytochromen des b-Typs (Cytochrom b566 und b561), übertragen, wo es schließlich in der Qi-Bindungsstelle ein Ubichinon (oder ein Ubisemichinon) reduziert. Zur Bildung von Dihydroubichinon im Cytochrom bc1 Komplex sind zwei Durchgänge notwendig. Bei geeigneten Redoxbedingungen erzeugt also die Photoaktivierung des Reaktionszentrums eine transiente Reduktion von Cytochrom b561, bevor dieses in einer schnellen Reaktion durch das Ubichinon in der Qi-Bindungsstelle oxidiert wird. Setzt man Antimycin zu, wird diese Oxidation gehemmt und reduziertes Cytochrom b kann akkumulieren. Setzt man hingegen Myxothiazol zu, wird die Oxidation des Dihydroubichinon an der Qo-Bindungsstelle gehemmt und die Reduktion von Cytochrom b kann nicht stattfinden. Ziel der folgenden Messungen war es, die lichtinduzierte Reduktion von Cytochrom b in Membranen aus Roseobacter denitrificans nachzuweisen. Dazu wurde bei der Membransuspension von Roseobacter denitrificans ein Redoxpotential von Eh = 390 mV eingestellt und die Reduktion von Cytochrom b nach Anregung durch kurze sättigende Lichtblitze gemessen. Unter diesen Redoxbedingungen liegt der primäre Elektronendonator des Reaktionszentrums überwiegend reduziert vor (ca. 85% mit Em,7(P/P+) = 435 mV), während alle Häme des am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c sowie das lösliche Cytochrom c551 vollständig oxidiert vorliegen (vgl. Abbildung D.2.4.1). Wir können deshalb erwarten, dass nur die Oxidation des 149 Ergebnisse primären Donators und eventuelle Redoxänderungen von Cytochromen des b-Typs zur lichtinduzierten Absorptionsänderung beitragen. Diese sind leicht zu unterscheiden, da die primäre Ladungstrennung im Reaktionszentrum sehr schnell in einem Zeitraum < 200 ps erfolgt, während die Reduktion von Cytochrom b561 eine typische Reaktion zweiter Ordnung ist (abhängig von der Diffusionsgeschwindigkeit der Teilchen) und auf einer viel langsameren Zeitskala > 10 ms erfolgt. Abbildung C.3.2.3.1A zeigt den Effekt der Inhibitoren Antimycin und Myxothiazol auf die Absorptionsänderung bei 430 nm (γ-Bande) nach zwei single turnover Blitzen unter den genannten oxidierenden Bedingungen. Diese Wellenlänge wurde zur Untersuchung der lichtinduzierten Absorptionsänderungen gewählt, weil es sich um das Absorptionsmaximum im (ox-red)-Differenzspektrum der Cytochrome des b-Typs handelt. Nach Anregung durch den Blitz kann eine langsame kinetische Phase beobachtet werden, die durch Antimycin stimuliert und durch Myxothiazol gehemmt wird. Dieses Signal wird von einer schnellen Absorptionsänderung überlagert, die auf die Photooxidation des primären Donators zurückzuführen ist. Abbildung C.3.2.3.1C zeigt die langsame Kinetik, die der Reduktion von Cytochrom b zugerechnet wird, ohne Überlagerung mit der schnellen Kinetik der Photooxidation des primären Donators in Abwesenheit von Inhibitoren, Abbildung C.3.2.3.1B die Kinetik nach Zugabe von Antimycin. Man erkennt aus dem kleinen Differenzsignal von ca. 0,3 x 10-3 nach dem ersten Blitz und von 0,8 x 10-3 nach dem zweiten Blitz in Abbildung C.3.2.3.1C, dass auch in Abwesenheit von Antimycin eine deutliche Reduktion von Cytochrom b erfolgt. In Anwesenheit von Antimycin (Abbildung C.3.2.3.1B) wird wesentlich mehr Cytochrom b reduziert, da es an der QoBindungsstelle nicht durch Ubichinon reoxidiert werden kann. Nur wenig Cytochrom b wird nach dem ersten Blitz reduziert (t1/2 = 200 ms), während wesentlich mehr und mit einer schnelleren Kinetik nach dem zweiten Blitz reduziert wird. Dieses binäre Muster, das sich bei Mehrfachanregung wiederholt (nicht dargestellt), wird erwartet, wenn Cytochrom b von Elektronen, die vom sekundären Akzeptor QB des Reaktionszentrums geliefert werden, in einem two electron gate Mechanismus nach vollständiger Reduktion und Protonierung des Ubichinons zu Ubichinol nach geradzahligen Anregungen durch aufeinanderfolgenden Blitzen reduziert wird. Ähnliche binäre Oszillationen bei blitzinduzierten Reduktionen von Cytochrom b sind auch in Chromatophoren von Rhodobacter capsulatus bei hohen Redoxpotentialen gezeigt worden [177]. 150 Ergebnisse 5 Absorptionsänderung, ∆A430 x 103 4 A b a c 3 2 1 Eh = 390 mV 0 1,5 B 1,0 (b)-(c) Cyt b 0,5 Eh = 390 mV 0,0 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1,5 ∆A430 x 103 Absorptionsänderung, Zeit (ms) Eh = 390 mV C 1,0 (a)-(c) 0,5 Cyt b 0,0 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 Zeit (ms) Abbildung C.3.2.3.1: Der Effekt von Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderungen nach Anregung durch zwei Blitze im Abstand von 500 ms bei 430 nm (γ-Bande). Die Probe wurde wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben vorbereitet. Das Redoxpotential in der Zelle wurde auf 390 mV eingestellt (Kapitel B.2.5.2.2.). Es wurden keine Mediatoren zugegeben. (A) Die Signale sind Mittelungen aus 64 Messungen mit einer Äquilibrierungszeit (Dunkeladaptation) von 90 s zwischen den einzelnen Messungen. Signal a ohne Inhibitor; Signal b nach Zugabe von 5 µM Antimycin; Signal c nach weiterer Zugabe von 0,5 µM Myxothiazol. (B) Signal c wurde von Signal b abgezogen. Dieses Signal entspricht der lichtinduzierten Reduktion von Cytochrom b in Anwesenheit von Antimycin. (C) Signal c wurde von Signal a abgezogen. Dieses Signal entspricht der Reduktion von Cytochrom b in Abwesenheit von Inhibitoren. Die eingezeichneten Pfeile stellen den Zeitpunkt der Anregung durch den Blitz dar. 151 Ergebnisse Abbildung C.3.2.3.2 zeigt die Kinetik der Reduktion von Cytochrom b561 in der αBande bei 562 nm in Anwesenheit von Antimycin nach Abzug des Signals nach Zugabe von Myxothiazol. Obwohl die Kinetik nach dem ersten Blitz der Kinetik in der γ-Bande bei 430 nm (Abbildung C.3.2.3.1C) ähnlich ist, ist die Reduktion von Cytochrom b nach dem zweiten Blitz nicht merklich erhöht. Dies könnte allerdings an einer bei diesen sehr kleinen Signalen nicht ausreichenden Dunkeläquilibrierung (von 60 s) zwischen den Anregungen bei der Messung bei 562 nm liegen, so dass das Absorptionsänderung, ∆A562 x 103 binäre Muster verloren gegangen ist. 0,3 Antimycin - Myxothiazol 0,2 0,1 Cyt b 0,0 Eh = 390 mV -0,1 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 Zeit (ms) Abbildung C.3.2.3.2: Der Effekt der Inhibitoren des bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderung nach Anregung durch zwei Blitze im Abstand von 500 ms bei 562 nm (α-Bande). Die eingezeichneten Pfeile kennzeichnen den Zeitpunkt der Anregung durch einen Blitz. Das abgebildete Signal ist die Subtraktion des Signals aus der Messung in Anwesenheit von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol (nicht dargestellt) vom Signal aus der Messung nach Zugabe von 5 µM Antimycin (nicht dargestellt), analog zu Abbildung C.3.2.3.1.C. Es wurden 90 Messungen gemittelt, mit einer Dunkelzeit von 60 s zwischen den Messungen. 152 Ergebnisse Abbildung C.3.2.3.3 zeigt die Spektren der blitzinduzierten Absorptionsänderungen, die bei Eh = 390 mV nach Zugabe von Antimycin sowie nach weiterer Zugabe von Myxothiazol gemessen wurden. Sie bestätigen die Zuordnung der beobachteten langsamen Phase zur Reduktion von Cytochrom b in Abbildung C.3.2.3.1 und zeigen ein Maximum bei 430 nm im Bereich der Soret-Bande (Abbildung C.3.2.3.3A) und bei 561 nm in der α-Bande (Abbildung C.3.2.3.3B). Das Verhältnis der Redoxextinktionskoeffizienten bei 430 nm und 561 nm ist ca. 4,5, ähnlich wie bei Cytochrom b562 in Rhodobacter sphaeroides [157] und in Chromatium vinosum [91]. 153 ∆ A x 10 3 Absorptionsänderung, 3 ∆A x 10 Ergebnisse 7 A Eh = 390 mV + Antimycin 6 5 + Antimycin + Myxothiazol 4 420 425 430 435 440 ∆ A x 10 Absorptionsänderung, 3∆A x 103 Wellenlänge (nm) 2 1 ++ Antimycin Antimycin B Antimycin ++ Antimycin ++ Myxothiazol Myxothiazol Eh= 390 mV 0 550 555 560 565 570 Wellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.3.3: Das blitzinduzierte Differenzspektrum der Redoxänderungen des Reaktionszentrums und des Cytochrom b in der γ- (A) und der α-Region (B) bei Eh = 390 mV. Die Proben wurden wie in Abbildung C.3.2.3.1 vorbereitet. Die Absorptionsänderungen wurden durch eine Folge von 4 Blitzen im Abstand von 300 ms induziert und die Absorptionsänderungen wurden 300 ms nach dem letzten Blitz aufgenommen in Gegenwart von Antimycin (volle Symbole) und nach weiterer Zugabe von Myxothiazol (leere Symbole). Bei jeder Wellenlänge wurden 16 Messungen gemittelt (60 s Dunkelzeit zwischen den Messungen). Die Linien dienen nur der Veranschaulichung. Verschiedene Symbole (Rauten und Quadrate) entsprechen unabhängigen Messungen mit verschiedenen Proben. 154 Ergebnisse C.3.2.4. Kopplung zwischen der Reduktion von Cytochrom b und der Rereduktion der Cytochrome des c-Typs nach Anregung durch einen Blitz Die Beobachtung der blitzinduzierten Reduktion von Cytochrom b und des Effektes der spezifischen Cytochrom bc1-Inhibitoren Antimycin und Myxothiazol auf die Kinetiken (siehe Kapitel C.3.2.3.), geben Anlass zur Vermutung, dass ein Cytochrom bc1 Komplex an der lichtinduzierten Elektronentransferkette von Roseobacter denitrificans beteiligt ist. Daher wurde der Effekt von Antimycin und Myxothiazol auf die Kinetiken der Redoxänderungen der Cytochrome des b-Typs sowie des c-Typs nach Anregung durch einen Blitz (single turnover excitation) bei niedrigeren Redoxpotentialen gleichzeitig untersucht. Wenn man einen Q-Zyklus-Mechanismus voraussetzt, erfolgt die photoinduzierte Reduktion des Cytochroms b561 über die low potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes in einer konzertierten Reaktion an der Q0-Bindungsstelle im Cytochrom bc1 Komplex, vorausgesetzt die Oxidation der high Potential Kette des Komplexes (Cytochrom c1 und das Rieske-FeS-Zentrum) durch den photooxidierten primären Donator des Reaktionszentrums kann erfolgen (siehe Abbildung A.3.5.1). Somit muss nach Anregung durch einen Blitz zeitgleich die Reduktion des Cytochroms b und die Oxidation der Cytochrome c beobachtet werden können. Die Messungen wurden bei leicht unterschiedlichen Potentialen (Eh = 195 mV, Eh = 160 mV und Eh = 145 mV) durchgeführt (s.u.). Bei allen genannten Potentialen liegen die gleichen Komponenten reduziert bzw. oxidiert vor (s.u.), nur die Anteile ändern sich geringfügig, und der Q-Pool wird bei abnehmendem Potential zunehmend reduziert. Die Variierung des Redoxpotentials hat vor allem technische Gründe, da die Einstellung eines exakten Potentials, insbesondere bei Membransuspensionen auf Grund der hohen Anzahl an Redoxkomponenten nicht trivial ist und unter bestimmten Bedingungen ein definiert eingestelltes Potential über die Dauer einer Messreihe (bis zu mehreren Stunden) besonders bei niedrigeren Potentialen nicht stabil ist, so dass man gegebenenfalls auf ein ähnliches Potential (das stabil ist) ausweichen muss. Ein niedrigeres Potential vergrößert z.B. die Signale der Cytochrom b-Reduktion (s.u.), was für die Auswertung der Messung von Vorteil ist. Bei einem eingestellten Redoxpotential in der Umgebung von Eh = 195 mV liegen in Roseobacter denitrificans beide Häme H1 und H2 des am Reaktionszentrum 155 Ergebnisse gebundenen tetrahämen Cytochroms c (Em,7(H1) = 290 mV und Em,7(H2) = 250 mV; [108]) sowie Cytochrom c551 (Em,7 = 250 mV; [178]) im Dunkeln überwiegend reduziert vor. Bei diesem Potential Eh wird das durch Blitzanregung gebildete P+ innerhalb der Zeitauflösung unserer Messmethodik (im submillisekunden Bereich) unter gleichzeitiger Oxidation von Cytochromen des c-Typs wieder reduziert. Im Bereich der γ-Bande überlagert sich der Beitrag der lichtinduzierten Absorptionsänderungen von Cytochromen des b-Typs und des c-Typs zum Teil (s.u. und Abbildung C.3.2.4.4). Trotzdem kann der Effekt von Antimycin und Myxothiazol auf die Reduktion von Cytochrom b und die parallel erfolgende Rereduktion von Cytochrom c nach einer Photoanregung untersucht werden, wenn man die blitzinduzierten Absorptionsänderungen jeweils bei 430 nm bzw. 422 nm misst. Das Signal bei 422 nm zeigt allein die Redoxänderungen der Cytochrome des cTyps, da sich Cytochrom b bei dieser Wellenlänge isosbestisch verhält (siehe Abbildung C.3.2.3.3A). Nach der schnellen blitzinduzierten Oxidation der Cytochrome c (Häme H1 und H2), gekennzeichnet durch eine schnelle Abnahme des Signals, erfolgt eine langsame Rereduktion, die dadurch charakterisiert ist, dass das Signal langsam wieder zunimmt. Abbildung C.3.2.4.1A zeigt die Inhibierung der Cytochrom c Rereduktion durch Antimycin insbesondere nach dem zweiten Blitz. Zugabe von Myxothiazol zur Probe verlangsamt die Rereduktion von Cytochrom c zusätzlich. Abbildung C.3.2.3.4.1B zeigt den Effekt der Inhibitoren auf die gleichzeitig stattfindende Reduktion von Cytochrom b. Bei 430 nm induziert die Anregung durch einen Blitz eine schnelle Absorptionsabnahme, die der Oxidation von Cytochrom c (Häme H1 und H2) entspricht. Anschließend kann die langsame Kinetik der Cytochrom b Reduktion (die zu einer Absorptionszunahme führt) beobachtet werden, überlagert von dem Beitrag zur Absorptionsänderung durch die Rereduktion der Cytochrome des c-Typs. Wie schon bei höherem Redoxpotential beobachtet, stimuliert Antimycin die Reduktion von Cytochrom b, während Myxothiazol sie hemmt. Man beachte, dass Antimycin bei 430 nm die Wiederherstellung des Signals durch die Zunahme der Reduktion des Cytochrom b beschleunigt, während bei 422 nm eine Signalabnahme zu beobachten ist, da hier nur die Cytochrom c-Rereduktion beobachtet werden kann. 156 Ergebnisse Absorptionsänderung, ∆A430 x 103 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 5 A 0 -5 a b c -10 -15 Kontrolle a + Antimycin b -20 -25 -30 2 0 + Antimycin + Myxothiazol Eh=195 mV B + Antimycin -2 b a -4 c Kontrolle c b a -6 -8 c + Antimycin + Myxothiazol -10 -12 -14 Eh=195 mV 0 500 1000 1500 Zeit (ms) Abbildung C.3.2.4.1: Der Effekt der Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderungen nach Anregung durch zwei Blitze bei 422 nm (A) und bei 430 nm (B). Bei 422 nm sind nur Absorptionsänderungen zu sehen, die von den Cytochromen des c-Typs herrühren, da diese Wellenlänge für Cytochrom b isosbestisch ist, während die Änderungen bei 430 nm indikativ für Cytochrome des b-Typs, aber auch des cTyps sind. Das Redoxpotential wurde auf 195 mV konstant gehalten. Die Probe wurde vorbereitet wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben. Als Redoxmediatoren wurden jeweils 10 µM 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon und p-Benzochinon zugesetzt. Die Signale sind Mittelungen von vier Messungen. Signal a ohne Inhibitor; Signal b nach Zugabe von 5 µM Antimycin; Signal c nach weiterer Zugabe von 0,5 µM Myxothiazol. 157 Ergebnisse Weiterhin wurde der Effekt der Inhibitoren auf die Redoxänderungen der Cytochrome des b- und c-Typs auch in der α-Bande des Spektrums bei einem etwas niedrigeren Redoxpotential von Eh = 145 mV untersucht. Bei 554 nm (Abbildung C.3.2.4.2) wurde eine vergleichbare Kinetik der Cytochrom c-Rereduktion nach der lichtinduzierten Oxidation erhalten wie bei 422 nm (Abbildung C.3.2.4.1A). Auch hier sind die Beiträge der Cytochrom b-Reduktion vernachlässigbar (vgl. Abbildung C.3.2.3.3B). Die Rereduktion des Cytochroms c nach dem ersten und zweiten Blitz erscheint unter diesen Bedingungen in Abwesenheit von Inhibitoren ausgeprägter und schneller. Dies stimmt damit überein, dass bei stärker reduzierenden Bedingungen (d.h. bei niedrigeren Redoxpotentialen, nämlich bei Eh = 145 mV anstatt Eh = 195 mV, vgl. Abbildung C.3.2.4.1A) die Konzentration von Dihydroubichinon im Ubichinon-Pool in der Membran höher ist und dieser dem Cytochrom bc1 Komplex schneller Elektronen zur Verfügung stellen kann. Somit kann die Reduktion der high potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes schneller Absorptionsänderung, ∆ A 554 x 10 3 erfolgen (s.u.). 1 0 -1 a b c -2 -3 -4 -5 -6 E h = 145 mV 0 500 1000 Zeit (ms) a Kontrolle b + Antimycin c + Antimycin + Myxothiazol 1500 2000 Abbildung C.3.2.4.2: Absorptionsänderung bei 554 nm nach zwei aufeinander folgenden Blitzen im Abstand von 500 ms. (a) ohne Inhibitor; (b) mit Antimycin; (c) mit Antimycin und Myxothiazol. Das Redoxpotential wurde auf 145 mV eingestellt. Zugesetzt wurden folgende Redoxmediatoren: jeweils 10 µM 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, p-Benzochinon und Durochinon. Es wurden 4 Messungen im Abstand von 90 s gemittelt. 158 Ergebnisse Abbildung C.3.2.4.3 zeigt die entsprechende Kinetik der Reduktion von Cytochrom b bei Eh = 145 mV in der α-Bande bei 562 nm. Auch bei diesen Redoxbedingungen liegen die Häme H1 und H2 sowie Cytochrom c551 vor der Anregung reduziert vor, und der primäre Donator P+ wird nach der Anregung durch den Blitz sofort reduziert (s.o.). Die schnelle Oxidation der Häme H1 und H2 zeigt jedoch bei dieser Wellenlänge keine signifikante Absorptionsänderung, wie in Abbildung C.3.2.5.2E zu erkennen ist . Der Effekt der Inhibitoren auf die Reduktion des Cytochroms b ist bei Eh = 145 mV ähnlich wie bei höheren Potentialen (siehe Kapitel C.3.2.3.). Genauso beobachtet man hier eine signifikante Reduktion von Cytochrom b auch in Abwesenheit von Antimycin. Dies lässt vermuten, dass in Roseobacter denitrificans die Reoxidation des Cytochroms b561 durch ein Ubichinon (oder Ubisemichinon) an der Qi-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes langsamer stattfindet als im Cytochrom bc1 Komplex von Rhodobacter sphaeroides, oder, dass im thermodynamischen Gleichgewicht die Verteilung des Elektrons stärker zum Cytochrom b561 hin verschoben ist. Wie auch bei Eh = 390 mV stimuliert Antimycin sowohl die Amplitude des Signals als auch die Anfangsgeschwindigkeit der Reduktion des Cytochroms b561, während Myxothiazol das Signal fast vollständig verschwinden lässt. Vergleicht man die Signale der lichtinduzierten Absorptionsänderung bei 562 nm in der α-Bande in Anwesenheit von Antimycin bei Eh = 390 mV (Abbildung C.3.2.3.2) und Eh = 145 mV (Abbildung C.3.2.4.3B), erkennt man, dass bei einer Verringerung des eingestellten Redoxpotentials die Amplitude des Signals sowie die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion signifikant größer wird. Nach der ersten Anregung verringert sich die Halbwertszeit der Oxidation von Cytochrom b561 von t1/2 (Eh = 390 mV) ≅ 200 ms auf t1/2 (Eh = 145 mV) ≅ 40 ms. In Roseobacter denitrificans besteht der Q-Pool wie in Rhodobacter sphaeroides ausschließlich aus Ubichinon-10 [179]. Da man voraussetzen kann, dass die thermodynamischen Eigenschaften des Q-Pools in Roseobacter denitrificans dem von Rhodobacter sphaeroides (Em,7 = 90 mV [88]) ähnlich sind, ist anzunehmen, dass bei stärker reduzierenden Bedingungen die Konzentration an UQH2 im Pool, welches für die Reaktion an der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes zur Verfügung steht, stark erhöht und damit die Reduktion des Cytochrom b wie auch die Rereduktion der high potential Kette (s.o.), nach dem QZyklus-Mechanismus beschleunigt (vgl. Kapitel A.3.5.) wird. 159 Ergebnisse 0 3 500 1000 1500 2000 A 2 Kontrolle Absorptionsänderung, ∆A562 x 103 1 0 3 B 2 + Antimycin 1 0 3 C + Antimycin + Myxothiazol 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 Zeit (ms) Abbildung C.3.2.4.3: Absorptionsänderung bei 562 nm nach Anregung durch zwei aufeinanderfolgende Blitze im Abstand von 500 ms (mit Pfeilen gekennzeichnet). (A) ohne Inhibitor; (B) mit 5 µM Antimycin; (C) mit 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol. Das Redoxpotential wurde auf 145 mV eingestellt. Redoxmediatoren: 1,2-Naphthochinon, 1,4Naphthochinon, p-Benzochinon, Durochinon (jeweils 10 µM). Es wurden 4 Messungen im Abstand von 90 s gemittelt. 160 Ergebnisse Nimmt man einen Differenzextinktionskoeffizienten für Cytochrom b561 von ∆ε561(ox-red) = 20 mM-1cm-1 [157] [91] an, kann aus Abbildung C.3.2.4.3B abgeschätzt werden, dass eine Photoaktivierung ca. 0,3 Cytochrom b561 pro Reaktionszentrum reduziert14. Die Beobachtung der blitzinduzierten Cytochrom b Reduktion bei eingestellten Redoxpotentialen, die einen Elektronentransfer durch Cytochrome des c-Typs zu P+ erlauben, wird durch die zeitaufgelösten Spektren bestätigt, die in ähnlichen Experimenten bei Eh = 160 mV in Anwesenheit und Abwesenheit von Antimycin in der γ-Bande des Spektrums gemessen wurden (Abbildung C.3.2.4.4)15. Dieses etwas niedrigere Potential wurde gewählt, um größere Signale zu erhalten. Die Redoxzustände der Cytochrome des c-Typs und des b-Typs sind im wesentlichen unverändert. Ohne Zugabe von Inhibitoren (Abbildung C.3.2.4.4A) werden die Spektren von den Beiträgen der Redoxänderungen der Cytochrome des c-Typs dominiert. Die Absorptionsänderung 100 µs nach dem ersten Blitz hat ein Maximum bei 422 nm und gibt die schnelle Oxidation des Häms H2 des Reaktionszentrums gebundenen Tetrahäm wieder (s.u.). Nach 400 ms verringert sich die Amplitude, und die Cytochrom c Bande ist leicht zu kürzeren Wellenlängen verschoben. Außerdem ist die Verringerung der Amplitude bei 430 nm stärker ausgeprägt als bei 422 nm. Dies lässt vermuten, dass, wie schon bei höheren Potentialen beobachtet, eine partielle Reduktion von Cytochrom b auch ohne Zugabe von Antimycin erfolgt. Diese Veränderungen werden im Spektrum 500 ms nach dem zweiten Blitz beibehalten, bzw. verstärkt. Nach Zugabe von Antimycin (Abbildung C.3.2.4.4B) ist das Spektrum nach 100 µs unverändert, während nach 400 ms eine gewisse Erhöhung 14 Aus der Amplitude der Absorptionsänderung bei 561 nm kann nach Lambert-Beer (siehe Kapitel B.1.2.5.) mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ∆ε bei 561 nm die Konzentration von Cytochrom b561 ermittelt werden. Die Konzentration der Reaktionszentren in der Probe wird wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben ermittelt. 15 Zum besseren Verständnis der Ausführungen im diesem Kapitel sei darauf hingewiesen, dass die Nomenklatur der Cytochrome auf das Absorptionsmaximum der a-Bande, die nur im reduzierten Zustand auftritt, basiert. Dennoch sind auch die Absorptionsmaxima der g-Bande für ein Cytochrom charakteristisch. So hat Cytochrom b561 Absorptionsmaxima bei 561 nm und bei 430 nm (vgl. Abbildung C.3.2.3.3), Cytochrom c554 (H2) bei 554 und 422nm (vgl. Abbildung C.3.2.5.2), Cytochrom c551 bei 550,5 und 415 nm [137]. Für Cytochrom c533 (L1/L2) sind die Absorptionsmaxima leicht zu kleineren Wellenlängen, und für Cytochrom c555 (H1) leicht zu größeren Wellenlängen verschoben (vgl. auch Kapitel B.2.5. und Abbildung B.2.5.1). Die Messungen in der g-Bande ermöglichen auf Grund des größeren Extinktionskoeffizienten (siehe Kapitel B.2.5.) eine leichtere Auswertung der Ergebnisse, und werden deshalb gründlicher behandelt. Die Messungen in der aBande liefern die gleichen Ergebnisse, und werden zur Ergänzung und Vervollständigung weiter hinten im Kapitel behandelt. 161 Ergebnisse der Absorption mit einem Maximum bei 432 nm beobachtet wird, die die Reduktion von Cytochrom b wiederspiegelt. Die Absorptionsabnahme in der Cytochrom c Bande wird ebenso durch Antimycin stimuliert. Dies zeigt, dass parallel zur Stimulierung der Cytochrom b Reduktion die Rereduktion der nach dem Blitz oxidierten Cytochrome des c-Typs gehemmt wird. Spektren 500 ms nach der zweiten Blitzanregung zeigen eine weitere Akkumulierung von reduziertem Cytochrom b und oxidiertem Cytochrom c. Interessanterweise scheint sich bei Anwesenheit von Antimycin die Bande bei 422 nm im Spektrum 100 µs nach Blitzanregung auf 420 nm zu verschieben (500 ms nach dem zweiten Blitz). Es ist zu vermuten, dass auf einer langsamen Zeitskala ein spektroskopisch unterschiedliches Cytochrom c in der Elektronentransferkette beteiligt ist. Diese Verschiebung der Banden, sowohl in der α- als auch in der γ-Region des Spektrums der Cytochrome des c-Typs, zu kleineren Wellenlängen 95 ms nach der Anregung durch einen Blitz in Gegenwart von Antimycin und Myxothiazol, lässt sich auch bei Eh = 195 mV beobachten (Abbildung C.3.2.4.6). Abbildung C.3.2.4.4C zeigt die zeitaufgelösten Spektren bei den gleichen Bedingungen nach weiterer Zugabe von Myxothiazol. Da der Cytochrom bc1 Komplex an beiden Bindungsstellen blockiert ist, wird der Elektronentransfer zu Cytochrom b verhindert, und die Oxidation von Cytochrom c kann beobachtet werden. Die Bande bei 432 nm verschwindet, d.h. die Reduktion von Cytochrom b wird vollständig gehemmt. Die Amplitude der Cytochrom c Oxidation ist nach dem ersten Blitz (bei 422 nm) kleiner. Nach dem zweiten Blitz ist eine Verschiebung der Bande nicht zu beobachten. 162 Ergebnisse 410 415 420 425 430 435 440 445 450 15 A Inhibit or ohne Inhibitor 10 A bsorpt ionsänderung,DA∆xA10x3 1 0 Absorptionsänderung, 3 5 0 -5 -1 0 -1 5 -2 0 -2 5 Eh = Eh160 = 1 6mV 0 mV -3 0 10 B + + Antimycin A nt im y c in 5 0 -5 -1 0 -1 5 -2 0 -2 5 Eh E =h =160 1 6mV 0 mV -3 0 410 415 420 425 430 435 440 445 450 Absorptionsänderung, ∆ A x 10 3 Wellenlänge (nm) 15 10 C + Antimycin + Myxothiazol 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 100 µ s nach dem 1. Blitz 400 ms nach dem 1. Blitz 500 ms nach dem 2. Blitz E h = 160 mV 410 415 420 425 430 435 440 445 450 Wellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.4.4: Absorptionsdifferenzspektren in der γ-Region aufgenommen nach dem ersten Blitz (volle Kreise nach 100 µs und offenen Kreise nach 400 ms) und 500 ms nach dem zweiten Blitz (offene Dreiecke). Blitze erfolgten im Abstand von 400 ms: (A) in Abwesenheit von Inhibitoren; (B) in Gegenwart von 5 µM Antimycin; (C) nach weiterer Zugabe von 0,5 µM Myxothiazol. Das Redoxpotential wurde auf Eh = 160 mV eingestellt. Als Redoxmediatoren wurden 10 µM 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, p-Benzochinon und 5 µM Diaminoduren zugesetzt. Bei jeder Wellenlänge wurden 4 Messungen gemittelt mit einer Dunkelzeit von 2 min zwischen den Messungen. 163 Ergebnisse Die zeitaufgelösten Spektren in der α-Bande wurden in ähnlichen Experimenten bei Eh = 145 mV in Anwesenheit von Antimycin und nach weiterer Zugabe von Myxothiazol untersucht (Abbildung C.3.2.4.5). Es wurde die Absorptionsänderung 2 ms und 500 ms nach einem Blitz gemessen. Die schnelle Absorptionsänderung hat sowohl in Anwesenheit von Antimycin als auch von Myxothiazol ein Minimum bei 554 nm, d.h. dieses Spektrum spiegelt die Oxidation des H2 wieder. Nach 500 ms ist die Bande der Cytochrom c Oxidation kleiner und zu kleineren Wellenlängen verschoben, in Einklang mit der Hypothese, dass H2 von den Komponenten der high potential Kette, genauer gesagt vom löslichen Cytochrom c551, in einer langsamen Reaktion rereduziert wird (siehe auch Abbildung C.3.2.5.1). In Anwesenheit von Antimycin beobachtet man auf der langsamen Zeitskala auch ein Maximum bei 562 nm, das nach weiterer Zugabe von Myxothiazol fast vollständig verschwindet. Dies spiegelt den Effekt der Inhibitoren auf die Reduktion von Cytochrom b wieder. 164 Absorptionsänderung, ∆ A x 10 3 Ergebnisse 2 A 1 + Antimycin 0 -1 -2 2 ms -3 500 ms Eh = 145 mV -4 540 545 550 555 560 565 570 575 Absorptionsänderung, ∆ A x 10 3 W ellenlänge (nm ) 2 B + A ntim ycin + M yxothiazol 1 0 -1 -2 -3 2 ms 500 m s Eh = 145 mV -4 540 545 550 555 560 565 570 575 W ellenlänge (nm ) Abbildung C.3.2.4.5: Absorptionsdifferenzspektren in der α-Region nach Anregung durch einen Blitz (offene Kreise nach 2 ms, geschlossene Vierecke nach 500 ms). (A) in Gegenwart von 5 µM Antimycin; (B) nach weiterer Zugabe von 0,5 µM Myxothiazol. Mediatoren wie in Abbildung C.3.2.4.3. Jeder Punkt entspricht der Mittelung von zwei Messungen im Abstand von 90 s. 165 Ergebnisse Absorptionsänderung, ∆A x 10 3 A 5 +Antimycin +Myxothiazol 0 -5 -10 2 ms -15 95 ms Eh=195 mV 410 415 420 425 430 435 440 445 Absorptionsänderung, ∆A x 10 3 Wellenlänge (nm) 1,0 B +Antimycin +Myxothiazol 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 -2,0 2 ms -2,5 -3,0 -3,5 95 ms Eh=195 mV 540 545 550 555 560 565 570 Wellenlänge (nm) Abbildung C.3.2.4.6: Blitzinduzierte Absorptiondifferenzspektren in der γ-Region (A) und α-Region (B) des Spektrums bei Eh = 195 mV. Offene Kreise zeigen die Absorptionsänderung 2 ms nach der Anregung durch einen Blitz, volle Quadrate die Absorptionsänderung nach 95 ms. Die Probe wurde vorbereitet wie in Abbildung C.3.2.4.1 beschrieben. Es wurden 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol zugegeben. Insgesamt zeigen die Messungen in Abbildung C.3.2.4.1 bis 6, dass bei einem geeigneten Redoxpotential die blitzinduzierte Reduktion von Cytochrom b561 an die Lieferung von Elektronen zum tetrahämen Cytochrom c gekoppelt ist, mit einem Reaktionsmechanismus, der durch die Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes gehemmt werden kann. 166 Ergebnisse C.3.2.5. Zeitaufgelöste Spektren der Redoxänderungen Cytochromen des c-Typs nach einem single turnover Blitz von Um den Weg der Elektronen von der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes zu dem tetrahämen Cytochrom c besser zu charakterisieren, wurden die Kinetiken der blitzinduzierten Absorptionsänderungen der Cytochrome des c-Typs bei bestimmten eingestellten Redoxpotentialen und vollständiger Inhibierung der Q0und Qi-Bindungsstellen des Cytochrom bc1 Komplexes, sowohl in der γ- als auch in der α-Bande im Detail untersucht. Es wurden die Redoxpotentiale Eh = 310 mV, Eh = 170 mV und Eh = 50 mV auf Grund der vorhandenen Daten in der Literatur [108, 137] gewählt, um in der Membransuspension ein oder mehrere Cytochrome des cTyps selektiv zu reduzieren. Beispiele für die gemessenen Signale bei λ = 422 nm und λ = 415 nm16 zeigt Abbildung C.3.2.5.1. Die spektralen Beiträge des primären Donators wurden wie in Kapitel C.3.2.2. beschrieben korrigiert, so dass die abgebildeten Signale unter den gegebenen Bedingungen ausschließlich die Redoxänderungen der Cytochrome des c-Typs wiederspiegeln. Nach der Anregung durch den Blitz wird eine schnelle Absorptionsänderung erzeugt (< 20 µs), die bei Eh = 310 mV und 50 mV bis zum Ende der Messung konstant bleibt (Abbildung C.3.2.5.1A und C, sowie C.3.2.5.1D und F). Bei einem Potential von Eh = 170 mV hingegen erfolgte eine Photooxidation innerhalb von 15 ms. Bei Vergleich mit den (ox-red)-Differenzspektren der Cytochrome [108] kann man schlussfolgern, dass die Anregung durch einen Blitz eine schnelle Oxidation eines Häms erzeugen, und unter bestimmten Redoxbedingungen das Elektron auf ein oder mehrere weitere Cytochrome des cTyps verteilt wird. Um die genannten Beobachtungen besser zu verstehen, wurde eine spektrale Analyse bei den verschiedenen Redoxpotentialen durchgeführt. 16 Die Wellenlänge l = 422 nm ist charakteristisch für Cytochrom c554 (H2) der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit. Wenn man das zeitaufgelöste Spektrum von Cytochrom c554, das bei Eh = 310 mV aufgenommen werden kann betrachtet, erkennt man, dass es bei 415 nm einen isosbestischen Punkt hat (Abbildung C.3.2.5.2), d.h. die Redoxänderung von Cytochrom c554 zeigt bei dieser Wellenlänge keine Absorptionsänderung. Cytochrom c551 hingegen hat bei 415 ein Absorptionsmaximum [137]. Bei 415 nm können also die Redoxreaktionen dieses Cytochroms c551 (und möglicherweise auch anderer Cytochrome des c-Typs) unabhängig von den Redoxreaktionen des tetrahämen Cytochrom c beobachtet werden. 167 Absorptionsänderung, ∆A415 x 103 Absorptionsänderung, ∆A415 x 103 Absorptionsänderung, ∆A415 x 103 Ergebnisse Eh = 310 mV Eh = 170 mV C Eh = 50 mV Zeit (ms) Abbildung C.3.2.5.1: Lichtinduzierte Absorptionsänderungen nach Anregung durch einen sättigenden Blitz bei Redoxpotentialen von Eh = 310 mV (A bzw. D), Eh = 170 mV (B bzw. E) und Eh = 50 mV (C bzw. F). Die Signale A, B und C wurden bei 415 nm aufgenommen, die Signale D, E und F bei 422 nm. Die Proben wurden vorbereitet wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben. Es wurden 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol zugegeben. Die Zeitauflösung der Messapparatur beträgt 20 µs. Die Signale A und D ent- 168 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 Ergebnisse Eh = 310 mV Eh = 170 mV Eh = 50 mV Zeit (ms) Abbildung C.3.2.5.1: Fortsetzung sprechen der Mittelung von 4 Messungen im Abstand von 60 s, die Signale B und E der Mittelung von 4 Messungen im Abstand von 2 min und die Signale C und F der von 4 Messungen im Abstand von 3 min. Bei den Signalen A und D wurden die Absorptionsbeiträge von P+, wie in Kapitel C.3.2.2. beschrieben, korrigiert. Dazu wurde das Signal bei 605 nm (nicht gezeigt) verwendet, das unter den gleichen Bedingungen aufgenommen wurde. Hier wurden 16 Messungen im Abstand von 60 s gemittelt. 169 Ergebnisse Abbildung C.3.2.5.2 zeigt die in Gegenwart von Antimycin und Myxothiazol gemessenen Absorptionsänderungen jeweils 100 µs und 90 ms nach dem Blitz als Funktion der Wellenlänge bei verschiedenen eingestellten Redoxpotentiale (Eh = 310 mV, Eh = 170 mV und Eh = 50 mV). Durch die Inhibierung des Cytochrom bc1 Komplexes wird keine Absorptionsänderung von Cytochrom b erwartet. Bei Eh = 310 mV ist neben dem primären Donator P nur das Häm H1 zu einem nennenswerten Anteil vor der Anregung reduziert (32% mit Em,7(H1) = 290 mV). Die anderen Cytochrome des c-Typs sind zu mindestens 95% oxidiert und können P+ nach der Photooxidierung nicht wieder reduzieren. Beide Spektren, 100 µs bzw. 90 ms nach der Anregung, haben ein Maximum bei 423 nm in der γ-Region (Abbildung C.3.2.5.2A) und bei 555 nm in der α-Region (Abbildung C.3.2.5.2D), in Übereinstimmung mit der α-Bande im (ox-red)-Differenzspektrum von Häm H1, das in gereinigten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans durch GleichgewichtsRedoxtitration bestimmt wurde [108]. Für die Oxidation von H1 spricht auch die relativ kleine Zeitkonstante der Reaktion (< 20 µs), die mit der Apparatur nicht aufgelöst werden konnte. In isolierten Reaktionszentren wurde die Halbwertszeit des Elektronentransfers von H1 zum primären Donator P mit 5 µs angegeben [93]. Das Spektrum nach 90 ms stimmt mit dem unmittelbar nach der Anregung gemessenen Spektrum überein. Auch auf einer langsameren Zeitskala (bis zu 500 ms nach dem Blitz) konnte keine Abnahme des Signals beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass bei diesem Potential keine Redoxkomponente das photooxidierte Häm H1 reduzieren kann. 170 Ergebnisse 171 Ergebnisse 405 410 415 420 425 430 435 440 445 450 1 0 0 µs 9 0 ms 5 A bsorpt ionsänderung, A 3x 1 0 Absorptionsänderung , ∆A x∆10 3 0 -5 -1 0 A Eh= 3 1 0 mV 10 0 -1 0 9 0 ms -2 0 -3 0 Eh= 1 7 0 mV 10 0 µs B 10 0µs 90 ms 10 0 -1 0 -2 0 -3 0 C Eh = 5 0 m V 405 410 415 420 425 430 435 440 445 450 (nm) WWellenlänge ellenlänge (nm ) Abbildung C.3.2.5.2: Absorptionsdifferenzspektren in der α- und γ-Region 100 µs (volle Symbole) und 90 ms (offene Symbole) nach dem Blitz in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol. (A) und (D) Eh = 310 mV; (B) und (E) Eh = 170 mV; (C) und (F) Eh = 50 mV. In (B) und (E) entsprechen die unterschiedlichen Symbole (Kreise und Quadrate) jeweils Messungen mit verschiedenen Proben. Die experimentellen Bedingungen sind in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben. Der Mediator DAD wurde mit einer erhöhten Konzentration von 10 µM eingesetzt, um eine schnellere Gleichgewichtseinstellung zu erreichen 17. Bei jeder Wellenlänge wurden 12 Messungen mit einer Dunkeladaptation 17 Es wurde durch Experimente mit 2 µM, 5 µM und 10 µM DAD sichergestellt, dass die langsame Oxidation von Cytochrom c unabhängig von der Konzentration an DAD ist. 172 Ergebnisse 535 540 545 550 0 ,5 555 560 565 570 100µs 9 0 ms 0 ,0 A bsorpt ionsänderung, ∆ Ax x1013 0 Absorptionsänderung , ∆A 3 -0 ,5 -1 ,0 -1 ,5 D Eh = 3 1 0 m V 1 0 -1 -2 -3 9 0 ms -4 -5 -6 100 µs Eh= 1 7 0 mV E 1 0 0 µs 9 0 ms 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 F Eh= 5 0 mV -6 535 540 545 550 555 560 565 570 W Wellenlänge ellenlänge(nm) (nm ) Abbildung C.3.2.5.2: Fortsetzung von 2 - 4 min zwischen den Messungen gemittelt (längere Äquilibrierungszeiten wurden bei Eh = 50 mV benutzt). Bei den Messungen bei Eh = 310 mV wurden die Signale um den Beitrag der P+/P-Differenzspektren korrigiert, wie in Kapitel C.3.2.2. beschrieben. Bei niedrigeren Potentialen wird das nach der Blitzanregung gebildete P+ innerhalb der Zeitauflösung unserer Messanordnung von den reduzierten Hämen des tetrahämen Cytochrom c rereduziert, so dass keine Absorptionsänderung der Reduktion von P+ beobachtet werden kann. 173 Ergebnisse Wenn man das Redoxpotential auf Eh = 170 mV verringert, können signifikante Änderungen im Spektrum beobachtet werden. Bei diesem Potential sind die Häme H1 und H2 reduziert (Em,7(H1) = 290 mV und Em,7(H2) = 240 mV; zu 100% bzw. zu 94%), während die low potential Häme L1 und L2 zu 95% oxidiert vorliegen. Bei diesem Potential ist eine Korrektur der Beiträge des primären Donators nicht nötig, da dieser innerhalb der Zeitauflösung der Messung von H2 reduziert wird (t1/2 = 380 ns in isolierten Reaktionszentren [93]). Das Spektrum der schnellen Änderungen 100 µs nach dem Blitz zeigt Maxima bei 422 nm (Abbildung C.3.2.5.2B) und 554 nm (Abbildung C.3.2.5.2E), d.h., im Vergleich zu den Spektren bei Eh = 310 mV, zu kürzeren Wellenlängen verschoben. Die α-Bande entspricht jetzt dem (ox-red)Differenzspektrum von H2 im isolierten Reaktionszentrum [108]. Dies zeigt, dass innerhalb von 100 µs die Elektronenlücke, die durch die Photooxidation von P erzeugt wurde, mit Häm H2 ins Gleichgewicht gekommen ist (entsprechend den relativen Halbstufenpotentialen für die Häme, da H2 ein niedrigeres Potential hat als H1). Auch das Spektrum nach 90 ms ist deutlich zu kleineren Wellenlängen verschoben mit Maxima bei 420 nm und 553 nm sowie einer Schulter bei 550 nm. Unter diesen Redoxbedingungen ist mindestens ein weiteres Cytochrom des c-Typs neben H1 und H2 am Elektronentransfer beteiligt. Diese Komponente wird langsam oxidiert und rereduziert dabei das photooxidierte Häm H2 auf der Millisekundenzeitskala. Bei Eh = 170 mV würde auch das lösliche Cytochrom c551 reduziert vorliegen (Em,7 = 250 mV [137]), das ein Maximum bei 550,5 nm im (oxred)-Differenzspektrum aufweist. Dieses Cytochrom wäre also ein möglicher Kandidat für die beobachtete langsame Redoxänderung ebenso wie Cytochrom c1 vom Cytochrom bc1 Komplex. Aus Abbildung C.3.2.5.2B ist ersichtlich, dass das Differenzspektrum 100 µs nach der Anregung, das der Oxidation von H2 zugeordnet wird, einen isosbestischen Punkt bei 415 nm hat. Die langsame Oxidation von Cytochrom c kann also bei dieser Wellenlänge beobachtet werden, ohne dass Redoxänderungen anderer Cytochrome interferieren. Abbildung C.3.2.5.1B zeigt die Kinetik der langsamen Cytochrom c Oxidation mit t1/2 = 15 ms. In Abbildung C.3.2.5.2C,F werden die Spektren bei Eh = 50 mV gezeigt. Bei diesem Redoxpotential sind die Häme H1 und H2 vor der Anregung durch einen Blitz vollständig reduziert. Ebenso sind die Häme L1 und L2 zu 82% reduziert, wenn für beide Em,7 = 90 mV [108] angenommen wird. Die Absorptionsänderungen nach 174 Ergebnisse 100 µs und nach 90 ms sind im Rahmen der Messgenauigkeit identisch und haben ein Maximum bei 421 nm und 553 nm, d.h. sie entsprechen den Maxima des (oxred)-Differenzspektrums der Häme L1 und L2 im isolierten Reaktionszentrum [108]. Auch nach einer Messdauer von 500 ms folgt auf die schnelle Oxidation keine Rereduktion von Cytochrom c. Die Signale bei diesen reduzierenden Redoxpotentialen zeigen also, dass, wenn ein low potential Häm reduziert vorliegt, dieses in einer schnellen Reaktion den primären Donator P+ reduziert, aber keine weiteren Oxidationen von Cytochromen des c-Typs wie bei Eh = 170 mV erfolgen. Aufgrund der identischen Halbstufenpotentiale lassen sich L1 und L2 nicht unterscheiden. Der Elektronentransport von den Cytochromen des c-Typs mit höherem Halbstufenpotential, wie z.B. Cytochrom c551 (Em,7 = 250 mV; s.o.) zu den Hämen L1 und L2 mit jeweils einem Halbstufenpotential Em,7 = 90 mV ist vermutlich aus thermodynamischen Gründen unterbrochen, da ein uphill Elektronentransfer energetisch ungünstig ist. 175 Ergebnisse C.3.2.6. Der Einfluss von Viskosität und Ionenstärke auf den Elektronentransfer von Cytochrom c551 zum Häm H2 des Reaktionszentrums Die Rereduktion von Häm H2 durch ein anderes Cytochrom vom c-Typ, die nur bei mittleren Potentialen (Eh = 170 mV) beobachtet werden kann, erfolgt im msZeitbereich. Dies deutet auf eine diffusionskontrollierte Reaktion mit einer löslichen Komponente, vermutlich Cytochrom c551 (Em,7 = 250 mV) hin. Diese Hypothese kann über den Einfluss von Viskosität und Ionenstärke auf die Kinetik der langsamen Cytochrom c Oxidation untersucht werden. Die Reaktion wurde bei 415 nm beobachtet, da diese Wellenlänge isosbestisch für die schnelle Oxidation des Häms H2 ist (s. Abbildung C.3.2.5.1B). Die Abhängigkeit von der Viskosität (Tabelle C.3.2.6.1) wurde in einer offenen ungerührten Küvette, ohne Redoxmediatoren mit nur 1 mM Natriumascorbat für die Redoxeinstellung des Systems nach Zugabe von Glycerin untersucht. Damit wurde ausgeschlossen, dass die beobachtete langsame Phase von den Redoxmediatoren beeinflusst werden konnte. Die Halbwertzeit vergrößert sich um einen Faktor 4, wenn man die GlycerinKonzentration auf 60% erhöht. Wie erwartet, verlangsamt eine höhere Viskosität die langsame Oxidation von Cytochrom c. Ebenso wurde die Abhängigkeit von der Ionenstärke nach Zugabe von KCl untersucht. Wie in der Tabelle C.3.2.6.1 gezeigt, erfolgt der Elektronentransfer schneller, wenn man die Konzentration von KCl in der Probe von 20 mM auf 80 mM erhöht. Größere KCl Konzentrationen wirken jedoch inhibierend auf die Kinetik. Die Halbwertszeit steigt von ca. 20 ms bei 80 mM KCl auf 130 ms bei 600 mM KCl und zeigt so, dass elektrostatische Wechselwirkungen die Geschwindigkeitskonstante des Elektronentransfers vom löslichen Cytochrom c zu den Hämen beeinflussen. 176 Ergebnisse Tabelle C.3.2.6.1: Die Kinetik der diffusionskontrollierten Cytochrom c Oxidation nach Anregung durch einen Blitz in Abhängigkeit von der Glycerin Konzentration und der Ionenstärke. Die Kinetiken wurden bei 415 nm aufgenommen. Für jeden Messpunkt wurden jeweils 4 Messungen im Abstand von 2 min gemittelt. Die Standardabweichung wurde aus einem Datensatz mit 5 unabhängigen Messungen ermittelt. Die Abhängigkeit von der Glycerin-Konzentration wurde bei 293 K in einer offenen Küvette bei ausgeschaltetem Rührer gemessen, die 50 mM Mops, 100 mM KCl, 1 mM Natriumascorbat, 10 µM Antimycin, 0,5 µM Myxothiazol, 10 µM Valinomycin und 10 µM Nigericin enthielt. Die Viskosität wurde nach [180] berechnet. Der Effekt der KCl-Konzentration wurde bei Eh = 170 mV wie in Kapitel B.2.5.2. beschrieben gemessen. Glycerin (%, v/v) Viskosität (cP) 0 10 20 40 60 1,0 1,3 2,0 4,8 16,4 t1/2 (ms) 26 ± 6 23 ± 8 51 ±12 68 ± 9 91 ±13 [KCl] (mM) t1/2 (ms) 20 40 80 160 260 320 500 640 29 ± 7 30 ± 6 22 ± 5 25 ± 4 43 ± 8 47 ± 7 72 ± 6 128 ±12 177 Ergebnisse C.3.2.7. Orientierung des Reaktionszentrums in der Membran Die Durchlässigkeit und die Orientierung der für die Messungen präparierten Membranvesikel können untersucht werden, indem man die Oxidation eines exogen zugegebenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von Blitzen verfolgt. Die Chromatophoren der Purpurbakterien wie z.B. Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus bestehen hauptsächlich aus geschlossenen Vesikel der intracytoplasmatischen Membran (ICM) mit einer festen Orientierung der Membran, so dass der primäre Donator des Reaktionszentrums in das Innere des Vesikels zeigt (inside-out-Orientierung). In diesen Präparationen wird der oxidierte primäre Donator P+ durch das in das Vesikel eingeschlossene lösliche Cytochrom c2 reduziert. Die Zugabe von exogenem Cytochrom c führt nicht zu einer wesentlichen Zunahme der Oxidation von Cytochromen des c-Typs, da P+ nicht vom exogenen Cytochrom c, das sich außerhalb der Chromatophoren befindet, reduziert werden kann. Wird hingegen das exogene Cytochrom c nach Zugabe im stöchiometrischen Überschuss zur Probe oxidiert, bedeutet dies, dass der primäre Donator P+ vom exogenen Cytochrom c erreicht werden kann. Dies ist nur möglich, wenn entweder die Membranvesikel durchlässig wären oder die Orientierung der Membran umgekehrt wäre (right-sideout-Orientierung). Abbildung C.3.2.7.1 und 2 zeigen den Effekt der Zugabe von Cytochrom c aus Pferdeherz (Em,7 = 261 mV, [181]) zu einer Suspension von Membranen aus Roseobacter denitrificans auf die Absorptionsänderung bei 554 nm und 422 nm (den Absorptionsmaxima des tetrahämen Cytochrom c in der a- und g-Bande) nach Anregung durch 18 aufeinander folgende Blitze im Abstand von 50 ms. Die Messungen wurden unter Luftausschluss (Anaerobiosis) bei einem Redoxpotential von Eh = (170 ± 5) mV durchgeführt. Bei diesem Redoxpotential sind die Häme H1 und H2 der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums, das Cytochrom c551 und das exogene Cytochrom c reduziert, welches mit einer Endkonzentration von 4 µM (11facher Überschuss bezogen auf die Konzentration der Reaktionszentren von 0,35 µM) zugegeben wurde. Abbildung C.3.2.7.1A und 2A zeigen, dass in Abwesenheit von exogenem Cytochrom c, die Sequenz von Anregungsblitzen nur bei den ersten Elektronentransferzyklen zur Oxidation von Cytochromen des c-Typs führt. Nach 178 Ergebnisse dem 6. Blitz ist keine weitere Oxidation mehr zu beobachten, und die Menge an photooxidiertem Cytochrom c bleibt während der Dauer der Messung (d.h. während 1 s) konstant. Die beobachteten Kinetiken bei 554 nm (Abbildung C.3.2.7.1A) und bei 422 nm (Abbildung C.3.2.7.2A) sind sehr ähnlich, im Einklang mit der Erwartung, dass bei beiden Signalen der Beitrag der Redoxänderung der gebundenen Häme überwiegt. Nach der zweiten Photoanregung werden schon mehr als 65% des endogenen Cytochroms c oxidiert. Die Tatsache, dass noch Zyklen nötig sind, um eine vollständige Oxidation zu erhalten, kann damit erklärt werden, dass der Anregungsblitz nur etwa zu 80% sättigend ist, Cytochrom c551 im Vesikel vorliegt und auch Cytochrom c1 im Cytochrom bc1 Komplex einen Beitrag zur Redoxänderung liefert. Die Zugabe von exogenem Cytochrom c erhöht das Ausmaß der Oxidation von Cytochrom c nach der Sequenz von Anregungsblitzen deutlich, wie in Abbildung C.3.2.7.1B (bei 554 nm) und 2B (bei 422 nm) zu erkennen ist. Die Oxidation des Cytochroms c erreicht nach dem 6. Blitz kein Plateau, sondern steigt weiter bis zum letzten Blitz an. Dies bedeutet, dass das exogene Cytochrom c photooxidiert wird und der primäre Donator P sowie die Tetrahämuntereinheit des Reaktionszentrums zumindest bei einem Teil der Membranvesikel für das exogene Cytochrom c zugänglich sind. Auch diese beobachteten Kinetiken bei 554 nm und 422 nm sind sich sehr ähnlich. Diese Kinetiken unterscheiden sich von den entsprechenden Kinetiken ohne Zugabe von exogenem Cytochrom c. Während in Abwesenheit von exogenem Cytochrom c die Absorptionsänderungen nach jedem Blitz in der Dunkelzeit zwischen den Blitzen nur langsam abnehmen, wird bei Zugabe von exogenem Cytochrom c eine viel schnellere Abnahme der Absorptionsänderung nach jedem Blitz (t1/2 < 10 ms) sowohl bei 554 nm als auch bei 422 nm beobachtet. 179 Absorptionsänderung, ∆A554 x 103 Absorptionsänderung, ∆A554 x 103 Ergebnisse Abbildung C.3.2.7.1: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von 18 Blitzen bei 554 nm. Die Blitze erfolgten im Abstand von 50 ms. Die Probe wurde wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben vorbereitet. Folgende Redoxmediatoren wurden zugegeben: 1,2-Naphthochinon, 1,4-Naphthochinon, p-Benzochinon und Durochinon. Die Messungen wurden bei einem Redoxpotential von Eh = 170 mV durchgeführt. (A) zeigt die Oxidation von Cytochrom c ohne Zugabe von Cytochrom c (Pferdeherz); (B) zeigt die Oxidation nach Zugabe von 4 µM Cytochrom c (Pferdeherz). Die Reaktionszentrenkonzentration betrug 0,35 µM. 180 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 Absorptionsänderung, ∆A422 x 103 Ergebnisse Abbildung C.3.2.7.2: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von Blitzen im Abstand von 50 ms bei 422 nm. (A) ohne (B) nach Zugabe von 4 µM Cytochrom c aus Pferdeherz. Probenvorbereitung und Messbedingungen wie in Abbildung C.3.2.7.1 beschrieben. 181 Ergebnisse Die gewählten Wellenlängen sind optimiert für die Untersuchung der Redoxänderungen von high potential Hämen H1 (Absorptionsmaximum bei 555 nm) und H2 (Absorptionsmaximum bei 554 nm). Bei diesen Wellenlängen ist der Beitrag zur Absorptionsänderung des exogenen Cytochroms c (aus Pferdeherz) jedoch geringer, da sein (ox-red)-Differenzspektrum ein Maximum bei 550 nm aufweist [181]. Das beobachtete Verhalten zeigt, dass das exogene Cytochrom c oxidiert wird und dabei seine Elektronen auf einem oder beiden high potential Hämen überträgt. Die gemessenen Signale entsprechen daher der Zunahme an oxidiertem exogenen Cytochrom c sowie der partiellen Photooxidierung und darauffolgender Rereduktion der Häme H1 und/oder H2 durch das exogene Cytochrom c nach jedem Anregungsblitz. Dies wird durch Messungen in Anwesenheit von exogenem Cytochrom c bei gleichen Messbedingungen, aber bei zwei anderen Wellenlängen 550 nm (Abbildung C.3.2.7.3A) und 416 nm (Abbildung C.3.2.7.3B) bestätigt. Bei 550 nm wird erwartet, dass der Beitrag zur Absorptionsänderung des exogenen Cytochroms c überwiegt. Bei 416 nm liegt ein isosbestischer Punkt im Spektrum der Häme H1 und H2 vor, so dass bei dieser Wellenlänge nur die Absorptionsänderung des exogenen Cytochroms c beobachtet wird. In der Tat beobachtet man bei beiden Wellenlängen keinen Zerfall der Absorptionsänderung nach der Anregung zwischen den Blitzen. Bei 416 nm beobachtet man hingegen nach dem Blitz die Oxidation des exogenen Cytochroms c mit einer Kinetik zweiter Ordnung, wie man sie für einen Elektronentransfer zwischen diffundierenden Redoxpartnern erwartet. Diese Messungen zeigen, dass exogenes Cytochrom c (aus Pferdeherz) in der Lage ist, den high potential Hämen (wahrscheinlich dem H2) mit guter Effizienz Elektronen zu übertragen. Somit ist zumindest in einem Teil der Membranen das Tetrahäm dem exogenen Cytochrom c zugänglich, d.h. die isolierten Membranen liegen nicht als Vesikel vor bzw. die Orientierung der Membranvesikel ist entgegengesetzt zur Orientierung bei den Chromatophoren aus Purpurbakterien. Die Überlagerung der Absorptionsänderungen der Häme und des exogenen Cytochroms c verhindert eine genaue Abschätzung der Fraktion von Reaktionszentren in den Membranen, dessen Tetrahäm für ein exogenes Cytochrom c zugänglich ist. 182 Absorptionsänderung, ∆A416 x 103 Absorptionsänderung, ∆A550 x 103 Ergebnisse Abbildung C.3.2.7.3: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von 18 Blitzen im Abstand von 50 ms bei 550 nm (A) und 416 nm (B). Probenvorbereitung und Messbedingungen wie in Abbildung C.3.2.7.1 beschrieben. Es wurden jeweils 4 mM Cytochrom c aus Pferdeherz zugegeben. 183 Ergebnisse C.3.2.8. Titration der blitzinduzierten Cytochrome des b-Typs und c-Typs Redoxänderungen der Wie in den vorherigen Abschnitten gezeigt wurde, sind mindestens drei verschiedene Cytochrome des c-Typs (spektroskopisch charakterisiert durch das Maximum in der α-Bande jeweils bei 555, 554 und 553 nm) in der Lage, das durch einen sättigenden Blitz erzeugte P+ im Submillisekundenbereich zu rereduzieren. Basierend auf den vorhandenen Informationen können diese Spezies mit den Hämen H1, H2, und L1/L2 des am Reaktionszentrum gebundenen Tetrahäms identifiziert werden. Abbildung C.3.2.8.1 zeigt die Redoxtitrationskurve der schnellen Absorptionsänderung bei 422 nm (dies ist das Absorptionsmaximum des tetrahämen Cytochrom c in der g-Bande), die durch einen Anregungsblitz erzeugt wurde. Im Potentialbereich zwischen 400 mV < Eh < 260 mV entsteht das Signal der blitzinduzierten Oxidation von Cytochrom c. Hier gibt die durchgezogene Linie die theoretische Titrationskurve wieder, berechnet aus den folgenden Annahmen (vgl. auch [96]): ein Oxidationsäquivalent wird bei der Photoanregung erzeugt, wenn der - primäre Donator P vor dem Blitz reduziert vorliegt; die gebildete Elektronenlücke im Reaktionszentrum äquilibriert in der H2-H1- - P-Redoxkette im Submillisekundenbereich; die Halbstufenpotentiale der Häme H1 und H2 in Membranen entsprechen - denen im gereinigten Reaktionszentrum, d.h. Em,7 = 290 mV bzw. 240 mV; die Differenzextinktionskoeffizienten ∆ε für H1 und H2 sind bei 422 nm - identisch. Für die Oxidation der high potential Häme18 bei einem eingestellten Redoxpotential Eh nach Anregung durch den Blitz gelten demnach folgende Gleichungen: 2 Σ (o – o ) + o i i0 P - oP0= {exp [(Eh - EmP) F/RT] + 1 }-1 x {exp [(EmQ - Eh) F/RT] + 1 }-1 i=1 18 Gleichung C.3.2.8.1 Die low potential Häme wurden vernachlässigt, da ihr Halbstufenpotential viel kleiner ist. 184 Ergebnisse Emi + RT/F ln [ oi / (1-oi) ] = EmP + RT/F ln [ oP / (1-oP) ] i = 1,2 Gleichung C.3.2.8.2 mit: oi0 / oi ≡ oxidierte Form des i-ten Häms vor und nach der Anregung durch den Blitz oP0 / oP ≡ oxidierte Form des primären Donators vor und nach der Anregung durch den Blitz Eh ≡ eingestelltes Redoxpotential EmP ≡ Halbstufenpotential des primären Donators EmQ ≡ Halbstufenpotential des primären Akzeptors QA Emi ≡ Halbstufenpotential des i-ten Häms Die Lösung dieser Gleichungen ergibt eine Redoxtitrationskurve der erwarteten lichtinduzierten Oxidation für jedes Häm (∆oi = oi - oi0). Die lichtinduzierte Absorptionsänderung bei 422 nm wird dann nach folgender Gleichung berechnet: 2 ∆A = ∆Amax Σ i=1 ∆oi Gleichung C.3.2.8.3 Wenn man bedenkt, dass die einzige Variable der Simulation die maximale Amplitude der Absorptionsänderung (bestimmt aus dem absoluten Wert des Differenzextinktionskoeffizienten der Häme) ist, ist die Übereinstimmung der theoretischen Titrationskurve mit den experimentellen Ergebnissen hervorragend. Dies bestätigt weiterhin die Schlussfolgerungen der spektralen Analyse in Abbildung C.3.2.5.2 in Kapitel C.3.2.5.. Wenn man das Redoxpotential unter 50 mV absenkt, verschwindet das Signal der blitzinduzierten Oxidation von Cytochrom c und spiegelt damit die zunehmende Blockierung der lichtinduzierten Ladungstrennung wieder, wahrscheinlich hervorgerufen durch die Reduktion des primären Akzeptors QA im Reaktionszentrum. Eine nichtlineare Kurvenanpassung in diesem Bereich der Titration (50 mV > Eh > 150 mV) nach der Nernst-Gleichung stimmt sehr gut mit den experimentellen Daten überein und ergibt ein Halbstufenpotential Em,7 = -50 mV für QA/QA-. Demnach entspricht dieses Ergebnis dem Halbstufenpotential für QA/QA- in Rhodobacter sphaeroides Em,7 = -50 mV [133]. 185 Absorptionsänderungen, ∆A422 x 10 3 Ergebnisse 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -100 0 100 200 300 400 500 600 Redoxpotential, Redoxpotential, EE (mV) h (mV) h Abbildung C.3.2.8.1: Redoxtitration der Absorptionsänderung bei 422 nm, aufgenommen 0,5 ms nach Anregung durch einen einzelnen Blitz sowie in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol. Die Probe wurde wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben vorbereitet. Bei Eh > 250 mV wurden die Signale um den Beitrag des primären Donators P+ zur Absorptionsänderung korrigiert. Die durchgezogene Kurve entspricht der theoretischen Eh-Abhängigkeit (siehe Text für Details). Die in Kapitel C.3.2.4. und C.3.2.5. vorgestellten Messungen zeigen, dass bei einem entsprechenden Redoxpotential das durch den Blitz oxidierte Häm H2 in einer Reaktion, die sensitiv für die Cytochrom bc1-Inhibitoren ist, rereduziert wird, und daraufhin zeitgleich eine langsame Oxidation eines Cytochroms des c-Typs, das sich spektroskopisch von den am Reaktionszentrum gebundenen Hämen unterscheidet, erfolgt. Abbildung C.3.2.8.2 zeigt die Redoxtitration dieser langsamen Cytochrom c Oxidation, gemessen bei 415 nm19, in Anwesenheit von Antimycin und Myxothiazol. Das Signal entsteht mit einem scheinbaren Halbstufenpotential Em,7 ≅ 220 mV. Es 19 isosbestisch für die Redoxreaktionen der Häme des am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c 186 Ergebnisse verschwindet mit einem scheinbaren Halbstufenpotential Em,7 ≅ 75 mV. Dieses Verhalten steht im Einklang mit den Ergebnissen in Abbildung C.3.2.5.1. Das Auftreten dieser langsamen Phase der Oxidation scheint in der Tat die Präreduktion eines löslichen Redoxcarriers, möglicherweise Cytochrom c551 (Em,7 = 250 mV; s. Kapitel D.2.1.) zu erfordern. Andererseits wird bei niedrigen Redoxpotentialen die langsame Oxidation von Cytochrom c durch die schnelle Äquilibrierung von P+ mit den low potential Hämen L1/L2 (Em,7 = 90 mV), die vor dem Blitz reduziert vorliegen, Absorptionsänderung, ∆ A 415 x 10 3 verhindert. 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 50 100 150 200 250 300 350 Redoxpotential, E h (m V) Abbildung C.3.2.8.2: Redoxtitration der Absorptionsänderungen bei 415 nm, aufgenommen 100 ms nach der Anregung durch einen einzelnen Blitz in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol. Die Probe wurde wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben vorbereitet. Absorptionsbeiträge durch P+ wurden korrigiert (siehe Kapitel C.3.2.2.). 187 Ergebnisse Die Abhängigkeit der lichtinduzierten Cytochrom b Reduktion vom eingestellten Redoxpotential wurde durch Messung der Kinetik von Absorptionsänderungen nach einem einzelnen Blitz bei 562 nm in Anwesenheit von Antimycin im Potentialbereich zwischen -20 mV < Eh < 200 mV untersucht. In diesem Bereich ist das blitzinduzierte Signal bei 562 nm überwiegend frei von Beiträgen von Redoxänderungen anderer Komponenten in der Elektronentransportkette. Das Signal der blitzinduzierten Reduktion von Cytochrom b (Abbildung C.3.2.8.3) verschwindet mit Verringerung des Potentials Eh mit einem scheinbaren Halbstufenpotential Em,7 = 65 mV. Dieser Wert sollte als die obere Grenze für das Halbstufenpotential von Cytochrom b561 betrachtet werden (s. Kapitel D.2.2.). Die Kinetik der Reduktion von Cytochrom b nach einem Blitz wird beschleunigt bei Redoxpotentialen Eh = 200 mV (t1/2 ≅ 45 ms) im Vergleich zu sehr oxidierenden Redoxpotentialen Eh = 390 mV (t1/2 ≅ 200 ms, s. Abbildung C.3.2.3.1). Wird hingegen Eh weiter verringert, so beobachtet man kleinere Halbwertszeiten. Bei Eh = 100 mV wird ein Minimum von ca. 15 - 20 ms erreicht. Dieses Verhalten könnte die zunehmende Reduktion des Ubichinon-Pools vor der Anregung durch einen Blitz wiederspiegeln. Unter diesen Umständen steht dem Cytochrom bc1 Komplex jederzeit Dihydroubichinon zur Oxidation an der Qo-Bindungsstelle und darauffolgender Reduktion der high sowie der low potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes zur Verfügung, sofern die high potential Kette zunächst nach blitzinduzierter Oxidation des primären Donators P des Reaktionszentrums über Cytochrom c551 oxidiert wurde (vgl. Abbildung D.2.4.1). Die Oxidation von Dihydroubichinon an der Qo-Bindungsstelle ist ein diffusionskontrollierter Prozess, der um so schneller abläuft je mehr Substrat zur Verfügung steht (vgl. auch Kapitel D.2.2.). Die Gesamtkonzentration an photoreduzierbarem Cytochrom b wurde in verschiedenen Präparationen aus der Absorptionsänderung, die bei 561 nm in Anwesenheit von Antimycin nach vier Blitzen im Abstand von jeweils 200 ms bei optimalen Redoxpotential Redoxextinktionskoeffizienten erzeugt für wurde, abgeschätzt. Cytochrom b561 bei Wenn 562 man nm einen von ∆ε562 = 19,5 mM-1cm-1 annimmt [91, 157], erhält man ca. 0,3 Cytochrom b Moleküle pro Reaktionszentrum (die Konzentration der Reaktionszentren wird mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ∆ε605 bei 605 nm bestimmt; siehe Kapitel B.2.5.2.2.). 188 Absorptionsänderung, ∆ A 562 x 10 3 Ergebnisse 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 50 100 150 200 Redoxpotential, E h (m V) Abbildung C.3.2.8.3: Bestimmung des Halbstufenpotentials von Cytochrom b. Die Probe wurde wie in Kapitel B.2.5.2.2. beschrieben vorbereitet. Absorptionsänderungen wurden nach Zugabe von 10 µM Antimycin bei 562 nm 180 ms nach dem Blitz gemessen. Bei jedem eingestellten Redoxpotential wurde über 8 Messungen gemittelt. Die Dunkelzeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen betrug jeweils 3 min. Die Kurve entspricht einer nichtlinearen Anpassung an die Nernst-Gleichung mit n = 1 und Em,7 = 65 mV (siehe Gleichung B.2.6.3). 189 Ergebnisse C.3.3. Bestimmung des Ubichinongehaltes in Membranen aus Roseobacter denitrificans Wie in Kapitel C.3.2.8. beschrieben werden die Kinetiken der Cytochrom b Reduktion bei niedrigen Redoxpotentialen stark verlangsamt. Dieses Verhalten könnte auf eine progressive Präreduktion eines möglicherweise in der Membran aus Roseobacter denitrificans vorhandenen Ubichinon-Pools ähnlich wie in Purpurbakterien vor der Anregung beruhen. Um diesen Ubichinon-Pool in der Membran von Roseobacter denitrificans nachzuweisen und dessen Eigenschaften zu bestimmen, wurde die Gesamtmenge an Ubichinon bestimmt. Dazu wurden aus drei verschiedenen Membranpräparationen mit einer Methanol/Petrolether-Mischung die Chinone vollständig extrahiert und anschließend, nachdem das Lösungsmittel gewechselt wurde, in Ethanol mittels HPLC analysiert (s. Kapitel B.2.7.). Das Elutionsprofil zeigte zwei scharfe Banden, von denen die erste dem Solvens zugeordnet werden konnte. Durch Eichung mit verschiedenen Chinonen konnte die zweite Bande als Ubichinon-Bande identifiziert werden. Eine Eichung mit reinem Ubichinon in verschiedenen Konzentrationen ermöglichte eine quantitative Auswertung der Ubichinonbanden. Tabelle C.3.3.1 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse von Membranextrakten aus Roseobacter denitrificans. Da die HPLC-Methode eine genaue Bestimmung der Ubichinon-Menge in der Probe auf ±10 pmol ermöglicht, besteht die größte Fehlerquelle bei der verwendeten Methode in einer möglicherweise nicht vollständigen Extraktion des Ubichinons aus der Membransuspension. Daher wurde der höchste ermittelte Wert als realistisches Ergebnis gewertet. Somit liefert die Analyse der Extrakte eine Stöchiometrie von 20±5 Ubichinon-10 Molekülen pro Reaktionszentrum, d.h. die typische Größe des Ubichinon-Pools wie er in Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus gefunden wird [88, 182, 183]. 190 Ergebnisse Tabelle C.3.3.1: HPLC-Analyse von Membranextrakten aus Roseobacter denitrificans. Die Konzentration an Ubichinon in der Probe wurde wie im Text beschrieben bestimmt. Die Konzentration an photoaktiven Reaktionszentren in der Probe wurde über die Absorptionsänderung nach einer Folge von Blitzen im Abstand von 20 ms bei 605 nm mit dem Extinktionskoeffizienten ε605 = 19,5 mM-1cm-1 [156, 157] bestimmt (vgl. Kapitel B.2.5.2.2.). Nr. 1 2 3 4 5 6 7 Stoffmenge1 / pmol Gesamtstoffmenge2 / µmol V3 / µl [UQ]4 / µM [RC]5 / µM UQ-10 / RC 860 870 820 770 740 315 1750 21500 21500 21500 21500 18500 18500 18500 250 250 250 250 250 250 250 86 87 82 77 74 31,5 175 5,5 5,5 5,5 5,5 8,5 4,25 8,5 16 16 15 14 9 7 20 1 Stoffmenge, die in 40 µl Extrakt mittels HPLC bestimmt wurde Stoffmenge im gesamten Extrakt (1ml) 3 Volumen der Membranenprobe 4 Konzentration an Ubichinon in den Membranen 5 Konzentration an Reaktionszentren in den Membranen 2 191 Diskussion D. Diskussion D.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans, Isolation von photosynthetischen Membranen und Reaktionszentren D.1.1. Anzucht von Roseobacter denitrificans In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen von Roseobacter denitrificans in Fermentern angezogen. Hierzu wurden die in der Literatur [144] beschriebenen Bedingungen für die Anzucht in Kolben auf einer Schüttelbank der Anzucht in Fermentern angepasst. Mit der modifizierten Vorschrift können innerhalb von vier Tagen im 28 l-Fermenter von Bioengineering etwa 100 - 120 g Zellen und innerhalb von fünf Tagen im 200 l-Fermenter von Bioengineering etwa 600 - 700 g Zellen erhalten werden (vgl. Kapitel C.1.). Die Ausbeute beträgt daher 3 - 4 g / l Medium (Nassgewicht), wobei im 200 l-Fermenter die Ausbeute eher geringer ausfällt. Nach Y. Shioi [144] wurden bei der Anzucht in Kolben auf der Schüttelbank eine etwa doppelt so hohe Ausbeute erzielt (7 - 8 g / l Medium (Nassgewicht)). Der Grund für die Abweichungen ist unklar. Dennoch wurde die Anzucht im Fermenter der im Kolben vorgezogen, weil sie in relativ kurzer Zeit eine große Menge an Zellen für die Isolation von Reaktionszentren liefert. Die Ausbeute der Anzucht von Roseobacter denitrificans Zellen liegt im Bereich der Ausbeuten für die Anzucht von anoxygenen photosynthetischen Purpurbakterien wie z.B. Rhodobacter sphaeroides, die anaerob entweder in Flaschen oder in Glasfermentern im Licht angezogen werden (Ausbeute ca. 4 - 5 g / l Medium (Nassgewicht) [171]). Bei der Anzucht von aeroben nicht-photosynthetischen Bakterien sind die Ausbeuten hingegen in der Regel höher. Dort liegen die Ausbeuten, je nach Wachstumsbedingungen, bei bis zu 10 - 20 g / l Medium, z.B. bei der Anzucht von Escherichia coli. 193 Diskussion Eine Verbesserung der Pigmentzusammensetzung der Zellen durch Variierung der Luftzufuhr, d.h. eine Verringerung der am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer nicht beteiligten stark absorbierenden Pigmente (Carotinoide und Bacteriochlorophylle der Antennenkomplexe, siehe Kapitel A.4.2.), um die Isolation des Reaktionszentrums sowie die spektroskopischen Messungen der Elektronentransferreaktionen in isolierten Membranen zu erleichtern, brachte keinen Erfolg. Eine Inhibierung der LH II-Biosynthese kann durch Anzucht im Licht erreicht werden [109]. Hierzu müsste die Anzucht von Roseobacter denitrificans in speziellen Glasfermentern erfolgen und die Wachstumsbedingungen angepasst werden. Da die Abtrennung der Lichtsammelkomplexe während der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans sehr aufwendig ist (vgl. Kapitel D.1.3.) könnte der Aufbau einer entsprechenden Anzuchtapparatur lohnenswert sein. Auch für die spektroskopischen Untersuchungen an photosynthetischen Membranen aus Roseobacter denitrificans wäre ein günstigeres Verhältnis von Reaktionszentren zu Lichtsammelkomplexen von Vorteil. Neueste Untersuchungen von Z. Kolber et al. [114, 117] haben gezeigt, dass aerobe photosynthetische Bakterien nicht nur in besonderen ökologischen Nischen vorkommen (siehe Kapitel A.4.1.), sondern weitverbreitet in den oberen Schichten der Ozeane sind. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass aerobe photosynthetische Bakterien in nährstoffreicher Umgebung (organic-rich environment) die Biosynthese von Bacteriochlorophyll und Reaktionszentren unterdrücken, einige Spezies unter diesen Bedingungen keine photosynthetischen Pigmente synthetisieren und demzufolge auch keine Photosynthese durchführen [184]. Werden diese Bakterien in nährstoffarmen Medien angezogen (low-organic carbon diet mit ca. 10 - 100 µM organischem Kohlenstoff), beginnen sie wieder Bacteriochlorophyll zu synthetisieren. Entsprechend könnte die Anzucht von Roseobacter denitrificans in nährstoffarmen Medien die Menge an Reaktionszentren in den Zellen erhöhen und damit sowohl die Isolation des Reaktionszentrums als auch Messungen der lichtinduzierten zyklischen Elektronentransferreaktionen in Membranen erleichtern. Die Ausbeute an Zellen bei der Anzucht in nährstoffarmen Medien wäre im Vergleich zu der Anzucht in nährstoffreichen Medien sicherlich geringer, wie aus Untersuchungen von Y. Shioi [144] abzuleiten ist. Dennoch bliebe abzuwägen, welche Vorteile überwiegen. 194 Diskussion Sinnvoll wäre auch, die Anzucht von Roseobacter denitrificans unter natürlichen Bedingungen durchzuführen, um Zellen zu erhalten, deren Eigenschaften denen der Bakterien in ihrer natürlichen Umgebung entsprechen. Dies könnte bei der Untersuchung der Eigenschaften des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers an Membranen von Vorteil sein. D.1.2. Isolierung der photosynthetischen Membranen In der vorliegenden Arbeit wurden die photosynthetischen Membranen aus Roseobacter denitrificans isoliert. Mit der Isolationsvorschrift konnten aus 75 g Zellen ca. 10 g Membranen (Membranvesikel) gewonnen werden (vgl. Kapitel C.3.1.). Die Untersuchung der Durchlässigkeit und Orientierung isolierter photosynthetischer Membranvesikel erfolgte mit Hilfe eines exogen zugegebenen reduzierten Cytochroms c aus Pferdeherz, das über die gebundene Cytochrom c-Untereinheit den nach Anregung durch einen Blitz oxidierten primären Donator des Reaktionszentrums reduzieren kann und dabei selbst oxidiert wird (siehe Kapitel C.3.2.7.). Die Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch einen Blitz kann nur beobachtet werden, wenn dieses an die am Reaktionszentrum gebundene Cytochrom c-Untereinheit binden kann, die sich in der intakten Zelle auf der periplasmatischen Seite der Membran befindet (siehe Abbildung D.2.4.1). Das Experiment ergab, dass das zugegebene exogene Cytochrom c von den isolierten photosynthetischen Membranvesikel nach Anregung durch einen Blitz oxidiert wurde. Somit muss in den isolierten Membranvesikel aus Roseobacter denitrificans die am Reaktionszentrum gebundene Cytochrom c-Untereinheit vom Lösungsmittel aus zugänglich sein. Dies bedeutet, dass die Membranvesikel entweder eine right-sideout-Orientierung haben, bei der die Proteine, die sich in der intakten Zelle auf der periplasmatischen Seite der Membran befinden, auf der Oberfläche der Vesikel, und die Proteine, die sich auf der cytoplasmatischen Seite der Membran befinden, im Inneren der Vesikel anzutreffen sind (vgl. Abbildung D.1.2.1). Im Falle der Proteine, die am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer beteiligt sind, würde dies bedeuten, dass der primäre Donator sowie die tetrahäme Cytochrom c-Untereinheit 195 Diskussion des Reaktionszentrums, das lösliche Cytochrom c551 sowie Cytochrom c1 vom Cytochrom bc1 Komplex auf der Außenseite der Vesikel anzutreffen und somit vom Lösungsmittel aus zugänglich wären, während Cytochrom b562 des Cytochrom bc1 Komplexes und die QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrums sich im Inneren des Vesikels befinden und somit von der wässrigen Außenphase her nicht zugänglich sind. Eine andere mögliche Interpretation der erhaltenen Ergebnisse wäre, dass die isolierten Membranvesikel eine inside-out-Orientierung (vgl. Abbildung D.1.2.1) haben, d.h. die Proteine der periplasmatischen Seite der Plasmamembran befinden sich im Inneren der Vesikel und die Proteine der cytoplasmatischen Seite auf der Außenseite der Vesikel. Die Membran ist aber durchlässig, so dass auch Proteine im Inneren der Vesikel (in diesem Falle die Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums) vom Lösungsmittel aus zugänglich sind. Letztere Interpretation ist wahrscheinlicher, wenn man in Betracht zieht, dass bei der Isolierung von photosynthetischen Membranen aus Purpurbakterien wie z.B. Rhodobacter sphaeroides (auch Chromatophoren genannt) in der Regel eine inside-outOrientierung der Vesikel erhalten wird [185]. Diese Interpretation wird auch durch die Tatsache bekräftigt, dass bei der Isolation der Membranvesikel das lösliche Cytochrom c551 nur zum Teil verloren geht und so ein lichtinduzierter zyklischer Elektronentransfer möglich ist. Dies spricht eher für eine Durchlässigkeit der Vesikel als für eine right-side-out-Orientierung, da man im letzteren Fall erwartet, dass alle löslichen Proteine, die sich auf der Oberfläche der Vesikel befinden, bei der Isolation und Umpufferung (siehe Kapitel B.2.2.) abgetrennt werden. 196 Diskussion inside-out Cytoplasma Zellaufschluss poröse Vesikel Zelle Periplasma right-side-out Cyt c Reaktionszentrum Vesikel HML-Komplex Abbildung D.1.2.1: Schematische Darstellung der Orientierung der Membranvesikel nach dem Zellaufschluss. Dargestellt sind sowohl Vesikel mit right-side-out-Orientierung, bei denen die Proteine (am Beispiel des Reaktionszentrums) die gleiche Orientierung in der Membran haben wie in den Zellen, und mit inside-out-Orientierung, bei denen die Orientierung der Proteine umgekehrt ist. Poröse Vesikel haben eine durchlässige Membran, so dass z.B. exogenes Cytochrom c in das Vesikel hinein diffundieren kann (vgl. Text). Bei der Präparation der Vesikel überwiegt eine der möglichen Orientierungen der Membran. D.1.3. Isolierung des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans In der vorliegenden Arbeit wurde das photosynthetische Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans isoliert. Nach dem die in der Literatur beschriebene Isolationsmethode [128] Reaktionszentren ergab, denen die H-Untereinheit fehlte, wurde sie diesbezüglich optimiert (siehe Kapitel C.2.2.). Eine Optimierung erfolgte auch in Bezug auf die Stabilität, die Ausbeute und den Ubichinongehalt der erhaltenen Reaktionszentren. 197 Diskussion Mit der optimierten Isolationsvorschrift lassen sich aus 75 g Roseobacter denitrificans Zellen innerhalb von etwa 10 Tagen etwa 10 mg Reaktionszentren gewinnen. Die isolierten Reaktionszentren besitzen alle vier Untereinheiten (H, M, L und Cytochrom c), haben aber z.T. die Ubichinone in den Bindungsstellen QA und QB verloren. Eine Rekonstitution des Ubichinons in die Bindungsstellen gelingt nur teilweise (siehe Kapitel C.2.2.). Die isolierten Reaktionszentren zeigen auch nach Rekonstitution eine Besetzung der QA-Bindungsstelle von nur ca. 30 %. Die QB-Bindungsstelle bleibt fast gänzlich unbesetzt. Die Ladungsrekombinationskinetik für den Prozess P+QA- → PQA ergab eine Geschwindigkeitskonstante kAP = 32 s-1, die sich nach Zugabe von oPhenanthrolin auf kAP = 45 s-1 erhöht. Diese entspricht der von K. Takamiya et al. veröffentlichten Geschwindigkeitskonstante [128]. Die Ausbeute an Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans ist wesentlich geringer als bei Rhodobacter sphaeroides, wo aus 100 g Zellen in 6 Tagen 120 mg Reaktionszentren isoliert werden können [171]. Dieses Ergebnis spiegelt die geringere Ausbildung des Photosyntheseapparates in Roseobacter denitrificans im Vergleich zu den Purpurbakterien wieder. So werden in Roseobacter denitrificans nur etwa 10% der Bacteriochlorophyll-Menge von Rhodobacter capsulatus gebildet [172]. Insgesamt zeigen die in dieser Arbeit durchgeführten Verbesserungen der Isolationsvorschrift, dass die Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans im Vergleich zu Purpurbakterien ungewöhnlich instabil gegenüber Detergentien, Salz sowie mehrmaligem Einfrieren und Auftauen sind. Um stabile Reaktionszentren, die für spektroskopische Untersuchungen der Elektronentransferkinetiken (oder auch für Untersuchungen der Proteinstruktur) eingesetzt werden können, zu erhalten, sind die in dieser Arbeit durchgeführten Verbesserungen noch nicht ausreichend. Neben dem bereits publizierten Detergenswechsel von LDAO zu Triton X-100 [128] und der anschließenden Verringerung der Detergenskonzentration ─ die bei den einzelnen Präparationsschritten noch weiter bis zur kritischen Micellenkonzentration (CMC) verringert werden sollte, so dass gerade genug Detergens in der Probe vorhanden ist, um die Proteine20 in Lösung zu halten ─ könnte auch die Verringerung der 20 das Reaktionszentrum sowie die in den einzelnen Präparationsschritten noch vorhandenen Verunreinigungen (z.B. Lichtsammelkomplexe) 198 Diskussion Präparationsdauer eine entscheidende Rolle spielen. Bei der Isolation von Membranproteinkomplexen wurde oft beobachtet, dass längere Lagerung der Zwischenstufen bei 4°C oder bei Raumtemperatur unweigerlich zur Verringerung der Aktivität des Proteins führt. Um die Präparationsdauer zu verkürzen, wären mehrere Möglichkeiten denkbar: Zunächst könnte die Solubilisierungsprozedur vereinfacht werden, indem keine Vorsolubilisierung wie in Kapitel B.2.3.3.3. beschrieben durchgeführt wird. Die für die Solubilisierung optimale Detergenskonzentration könnte dann durch Solubilisierung von Aliquots an Reaktionszentren bei verschiedenen Detergenskonzentrationen, anschließender Zentrifugation in der Airfuge und nachfolgender spektroskopischer UV/VIS-Analyse wie bei Rhodobacter sphaeroides bestimmt werden [155, 171]. Als nächstes könnte die auf die Solubilisierung folgende Ammoniumsulfat-Fällung noch weiter verkürzt werden, indem eine einfache 50%ige Fällung ohne darauffolgende Waschung durchgeführt wird (vgl. Kapitel B.2.3.3.4.). Die Menge an Ammoniumsulfat, die für die Fällung des Proteins notwendig ist, könnte zudem noch genauer ermittelt werden. Der darauffolgende Präparationsschritt der Gelfiltration (vgl. Kapitel B.2.3.3.5.) sollte automatisiert werden, so dass die Gelfiltration unbeaufsichtigt über Nacht laufen kann. Um die gesamte Probe aus der Ammoniumsulfat-Fällung in einem Schritt mittels Gelfiltration aufreinigen zu können, müsste eine entsprechend große präparative Gelfiltrationssäule aufgebaut werden. Die anschließende Anionenaustauscherchromatographie (vgl. Kapitel B.2.3.3.6.) ist an sich eine schnelle Methode, die verhältnismäßig wenig Zeit in Anspruch nimmt. Eine weitere Verbesserung könnte möglicherweise durch den Einsatz der Perfusionschromatographie erreicht werden, wenn eine geeignete Chromatographiematrix gefunden werden kann. Diese Methode wurde u.a. bei der Isolation von Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides getestet [186] und ermöglicht durch eine besondere Porenstruktur der Chromatographiematrix eine schnellere und schärfere Trennung von Proteinen. Durch die genannten Vereinfachungen der Isolationsvorschrift würde sich die Präparationsdauer von 10 Tagen auf zwei Tage (48 h) verringern. Eine Lagerung der Zwischenstufen der einzelnen Präparationsschritte, die auch Ursache für die Zerstörung der Reaktionszentren sein kann, würde dabei entfallen. 199 Diskussion Die Besetzung der Ubichinon-Bindungsstellen des Reaktionszentrums könnte verbessert werden, wenn die Detergenskonzentration Präparationsschritten weiter herabgesetzt werden kann. in den Somit einzelnen würde eine Rekonstitution wie in Kapitel C.2.2. beschrieben ähnlich wie bei der Isolation der Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides entfallen. Sollte hingegen eine Rekonstitution weiterhin notwendig sein, liegt auch hier das Problem in der relativ hohen Detergenskonzentration (1%) und der langen Inkubationsdauer (mehrere Stunden bei Raumtemperatur). Hier könnte eine Verbesserung durch Verringerung der Detergenskonzentration und Rekonstitution durch Dialyse bei 4°C, ähnlich wie in Kapitel C.2.2. beschrieben, erreicht werden. 200 Diskussion D.2. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer (Q-Zyklus) in Roseobacter denitrificans D.2.1. Elektronentransfer von Cytochromen des c-Typs zum primären Donator des Reaktionszentrums Die Redoxeigenschaften und das UV-VIS-Spektrum des primären Donators P+ im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans sind denen der anoxygenen Purpurbakterien mit Typ II Reaktionszentrum wie Rhodobacter sphaeroides bzw. Blastochloris viridis sehr ähnlich, wie die lichtinduzierten Differenzspektren an photosynthetischen Membranen in dieser Arbeit (siehe Abbildung C.3.2.2.1) sowie das Halbstufenpotential von Em,7 = 435 mV, das am isolierten Reaktionszentrum gemessen wurde [128], zeigen. Das Reaktionszentrum von Roseobacter denitrificans konnte bis heute noch nicht kristallisiert werden. Der Vergleich der Aminosäuresequenz des HLM-Komplexes zeigt eine große Sequenzhomologie (70%) zum Reaktionszentrum aus anaeroben photosynthetischen Bakterien. Für die Cytochrom c-Untereinheit hingegen liegt die Homologie nur bei 29% [153]. Ausgehend von experimentell bestimmten Strukturen wurde ein Homologiemodell der Struktur des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans berechnet [46]. Dieses stimmt weitgehend mit der Struktur des Reaktionszentrums aus Purpurbakterien überein. Die Halbstufenpotentiale der am Reaktionszentrum gebundenen Häme wurden durch Gleichgewichts-Redoxtitrationen im Dunkeln an isolierten Reaktionszentren bestimmt. Ebenso wurden die (ox-red)-Differenzspektren der Häme im Bereich der αBanden an isolierten Reaktionszentren gemessen [108]. In der vorliegenden Arbeit wurde die lichtinduzierte Cytochrom c-Oxidation nach Anregung durch einen Blitz in isolierten photosynthetischen Membranen aus Roseobacter denitrificans unter definierten Redoxbedingungen sowohl in der α- als auch in der γ-Bande untersucht (vgl. Kapitel C.3.2.5. und C.3.2.8.). Die Messungen (vgl. Abbildung C.3.2.5.2 und Abbildung C.3.2.8.1) zeigen, dass die Elektronenlücke, die beim primären Donator P+ nach einer Photoanregung erzeugt wird, nach weniger als einer Millisekunde auf die Redoxkette P-H2-L1-H1-L2 entsprechend der Redoxpotentialeinstellung des Systems vor dem Blitz und in 201 Diskussion Übereinstimmung mit den im isolierten Komplex ermittelten Halbstufenpotentialen der Häme verteilt wird: Liegt nur H1 vor der Anregung im Dunkeln reduziert vor, verlagert sich die Elektronenlücke nach Anregung durch einen Blitz auf H1, liegen H1 und H2 reduziert vor, verlagert sich die Elektronenlücke auf H2 und, wenn alle Häme reduziert vorliegen, auf L1/L2. Mit diesem Ergebnis stimmen auch die am isolierten Reaktionszentrum gemessenen Kinetiken der blitzinduzierten Rereduktion des oxidierten primären Donators P+ überein. D. Garcia et al. [93] konnten zeigen, dass der nach Anregung durch Licht oxidierte primäre Donator P+ mit einer Halbwertszeit t1/2 = 5 µs, 380 ns bzw. 160 ns rereduziert wird, wenn jeweils nur H1, H1 und H2 bzw. alle Häme vor der Anregung im Dunkeln reduziert vorliegen (in Abhängigkeit vom eingestellten Redoxpotential). Die Zeitauflösung der in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlaubt nicht zu unterscheiden, ob Häm H2 direkt den primären Donator P+ reduziert oder zunächst Häm H1 reduziert, das dann den primären Donator P+ reduziert. Ebenso wenig lässt sich bestimmen, ob die Photooxidation der low potential Häme L1/L2 über einen direkten Elektronentransfer zum primären Donator P+ oder einen Elektronentransfer zwischen den Hämen mit Beteiligung der high potential Häme erfolgt. Auf Grund des großen Unterschieds der gemessenen Halbwertszeiten wurde von D. Garcia et al. [93] vorgeschlagen, dass H2 das nächste Häm zum primären Donator P sein muss und direkt den primären Donator P+ reduziert. Untersuchungen der Elektronentransferreaktionen von der Cytochrom c-Untereinheit zum primären Donator des Reaktionszentrums an anderen photosynthetischen Bakterien ergaben je nach Spezies unterschiedliche Mechanismen. In Blastochloris viridis erfolgt der Elektronentransfer vom Häm H2 über Häm H1 auf den primären Donator P. Die Häme sind in folgender Reihe angeordnet: L2 – H2 – L1 – H1 – P [40, 42, 43, 187]. In Chloroflexus aurantiacus sind die Häme hingegen in der Reihenfolge H2 – L2 – L1 – H1 – P angeordnet [136] und in Chromatium vinosum in der Reihe L2 – H1 – L1 – H2 – P [48] wie in Roseobacter denitrificans. Die funktionale Organisation der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit scheint kein allgemeingültiges Muster in den photosynthetischen Bakterien zu haben, sondern hängt von der Auswirkungen für Spezies das ab. Dies hat lichtinduzierte möglicherweise zyklische photosynthetischen Bakterien [93, 188, 189]. 202 bisher unbekannte Elektronentransfersystem in Diskussion Durch Analyse der zeitaufgelösten Spektren (siehe Abbildung C.3.2.5.2) konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in Membranen von Roseobacter denitrificans nur das Häm H2 nach Photooxidation langsam rereduziert wird und dabei gleichzeitig ein weiteres Cytochrom c oxidiert wird. Die Menge an Cytochrom c, die durch diesen Prozess langsam oxidiert wird, wird durch Antimycin erhöht, insbesondere nach Mehrfachanregungen (vgl. Abbildung C.3.2.4.4) und dies zeigt, dass ein Cytochrom bc1 Komplex am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer beteiligt ist (s.u.). Die Cytochrom c Bande, die in Anwesenheit der Inhibitoren auf einer langsamen Zeitskala auftritt, könnte Beiträge der Oxidation von Cytochrom c1, des Cytochrom bc1 Komplexes sowie des löslichen Cytochroms c enthalten und so die Elektronentransferkette vom Cytochrom bc1 Komplex zum am Reaktionszentrum gebundenen Tetrahäm wiederspiegeln. In Einklang mit der Beteiligung einer löslichen Redoxkomponente ist die signifikante Verlangsamung der Reaktion bei Erhöhung der Viskosität (siehe Tabelle C.3.2.6.1). Die Abhängigkeit von der Ionenstärke (siehe Tabelle C.3.2.6.1) deutet ebenso darauf hin, dass die gemessene langsame Cytochrom c Oxidation über einen Mechanismus erfolgt, der die Wechselwirkung des am Reaktionszentrum gebundenen Tetrahäms mit einem zweiten löslichen Redoxprotein erfordert. Diese wird von elektrostatischen Wechselwirkungen bestimmt. In Blastochloris viridis konnte durch die Untersuchung der Ionenstärkeabhängigkeit des Elektronentransfers vom löslichen Cytochrom c2 zum am Reaktionszentrum gebundenen Tetrahäm nachgewiesen werden, dass die elektrostatischen Wechselwirkungen der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung für einen effektiven Elektronentransfer sind [190]. Die lösliche Spezies in Roseobacter denitrificans kann mit Cytochrom c551 (Em,7 = 250 mV), das aus Roseobacter denitrificans isoliert werden konnte [137], identifiziert werden. Dies wird durch Untersuchungen der Abhängigkeit der langsamen Phase der Cytochrom c Oxidation vom eingestellten Redoxpotential Eh in isolierten Membranen aus Roseobacter denitrificans (vgl. Abbildung C.3.2.8.2), die ein scheinbares Halbstufenpotential von 220 mV für das lösliche Cytochrom c ergeben bestätigt, ein Wert, der leicht unter dem Halbstufenpotential für das gereinigte Cytochrom c551 liegt (s.o.). Bedenkt man aber, dass sich nach der schnellen Photooxidation von Häm H2 die Elektronenlücke nach dem Q-Zyklus-Mechanismus (siehe Kapitel A.3.5.) auf Cytochrom c551, Cytochrom c1 und das Rieske-FeS203 Diskussion Zentrum des Cytochrom bc1 Komplexes verteilt, kann nicht erwartet werden, dass die Titration der langsamen Oxidation von Cytochrom c das exakte Halbstufenpotential von Cytochrom c551 wiedergibt, da das gemessene Halbstufenpotential von der Stöchiometrie der löslichen Komponente und des Cytochrom bc1 Komplexes sowie den Halbstufenpotentialen von Cytochrom c1 und dem FeS-Cluster abhängt. In Rhodobacter sphaeroides wurden für das FeS-Zentrum, das Cytochrom c1 und das Cytochrom c2 Halbstufenpotentiale von jeweils Em,7 = 290 mV, 270 mV und 340 mV bestimmt (siehe Abbildung A.3.5.1 [84]). Wenn man vereinfachend annimmt, dass in Rhodobacter sphaeroides die Redoxkomponenten im gleichen Verhältnis vorliegen und das Elektron sich zu gleichen Teilen auf die Redoxkomponenten verteilt, würde man bei einer Titration den Mittelwert der Halbstufenpotentiale der Redoxkomponenten, d.h. ein scheinbares Halbstufenpotential von Em,7 ≈ 300 mV erhalten, das um 40 mV niedriger liegt als im isolierten Cytochrom c2. Nimmt man eine ähnliche Abstufung der Halbstufenpotentiale für das FeS-Zentrum, das Cytochrom c1 und das Cytochrom c551 in Roseobacter denitrificans an, kann dies leicht zu einer Verschiebung des gemessenen Halbstufenpotentials von 30 mV zu niedrigeren Werten bezogen auf das Halbstufenpotential von Cytochrom c551 sowie zu Abweichungen vom Nernst-Verhalten führen. Die Amplitude der langsamen Cytochrom c Oxidation nimmt bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials unter 120 mV immer stärker mit einem scheinbaren Halbstufenpotential von Em,7 = 75 mV ab (vgl. Abbildung C.3.2.8.2). Dieses Verhalten stimmt mit dem Elektronentransferweg vom Cytochrom bc1 Komplex über das lösliche Cytochrom c551 zum Häm H2 des tetrahämen Cytochroms c des Reaktionszentrums, wie oben vorgeschlagen, überein. Bei diesem Potential werden die low potential Häme L1/L2 (Em,7 = 90 mV) im Dunkeln zunehmend reduziert und können so den durch den Blitz oxidierten primären Donator P+ schnell rereduzieren. Damit wird die Oxidation des löslichen Cytochroms c durch das Häm H2 und die darauf folgende Oxidation der high potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes verhindert. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Messungen an ganzen Zellen von Roseobacter denitrificans [108]. Unter aeroben Bedingungen liegen Zellen bei atmosphärischen Luftdruck (1013 mbar) mit einem Sauerstoffpartialdruck von 213 mbar vor. Bei semiaeroben Bedingungen ist der 204 Diskussion Sauerstoffgehalt reduziert und bei anaeroben Bedingungen ist kein Sauerstoff für die Bakterien verfügbar. An dieser Stelle soll qualitativ der Zusammenhang zwischen Redoxpotential und Sauerstoffpartialdruck in der Zelle beschrieben werden. Hierzu wird die Nernst-Gleichung (Gleichung B.2.6.3 in Kapitel B.2.6.) verwendet. Nimmt man an, dass der pH-Wert im Zellinneren leicht sauer ist21, reagiert in wässrigem Medium gelöster Sauerstoff nach folgender Reaktionsgleichung: O2 + 4 H+ + 4 eDamit ergibt 2 H2O sich die Gleichung D.2.1.1 Nernst-Gleichung unter Vernachlässigung der Aktivitätskoeffizienten (vgl. Kapitel B.2.6.) für diese Reaktion zu: RT E=E + ln zF pO2 /p [H+]4/c4 Gleichung D.2.1.2 xH2O2 mit: E ≡ Redoxpotential von Sauerstoff E ≡ Standardpotential für die Redoxreaktion von O2 zu H2O in saurer wässriger Lösung pO2 ≡ Sauerstoffpartialdruck in Lösung [H+] ≡ Konzentration der Protonen xH2O ≡ Molenbruch von H2O R ≡ Gaskonstante ≡ 8,31441 JK-1mol-1 T ≡ Temperatur in K z ≡ Zahl der pro Formelumsatz übertragenen Elektronen F ≡ Faraday-Konstante ≡ 9,64846 104 Cmol-1 Mit xH2O ≈ 1, z = 4 ergibt sich bei Raumtemperatur (RT): 0,059 E = E + z lg pO2 /p · [H+]4/c4 Gleichung D.2.1.3 mit E = 1,23 V [192] Der Sauerstoffpartialdruck in der Atmosphäre in Höhe des Meeresspiegel beträgt: pO2 = 213 mbar 21 Die Messung des pH-Wertes im Zellinneren ist schwierig und hängt von den Bedingungen ab. Wahrscheinlich reagieren die Zellinhalte leicht sauer (pH = 6 bis 7) [191]. 205 Diskussion Damit ergibt sich mit pH = 6, p = 1013 mbar und c = 1 M nach Gleichung D.2.1.3: E = 0,866 V Bei Verringerung des Sauerstoffpartialdrucks um Faktor 100 des atmosphärischen Partialdruckes, verringert sich das Redoxpotential für O2 nach der dargestellten vereinfachten Rechnung um 30 mV. Damit ergibt sich bei einer Verringerung des Sauerstoffpartialdruckes eine Abnahme des Redoxpotentials in der Zelle. In Zellen von Roseobacter denitrificans konnte unter semiaeroben Bedingungen ein low potential Häm L nach Anregung durch Licht photooxidiert werden, das nicht rereduziert wurde. Dies steht im Einklang mit den Messungen der vorliegenden Arbeit (siehe Kapitel C.3.2.5.), bei denen bei einem eingestellten Redoxpotential von Eh = 50 mV keine Rereduktion der low potential Häme L1/L2 durch das lösliche Cytochrom c551 beobachtet wurde, vermutlich weil dieser Schritt thermodynamisch ungünstig ist. Daraus kann geschlossen werden, dass in intakten Zellen von Roseobacter denitrificans unter semiaeroben Bedingungen ein Redoxpotential von ≤ 50 mV für die Cytochrom c Kette vorliegen muss. Die Photooxidation der low potential Häme unter semiaeroben oder anaeroben Bedingungen wird hingegen in ganzen Zellen von Blastochloris viridis nicht beobachtet [92]. Dieses unterschiedliche Verhalten unter semiaeroben Bedingungen kann auf die unterschiedlichen Halbstufenpotentiale der low potential Häme zurückgeführt werden, die in Roseobacter denitrificans wesentlich höher sind (Em,7 = 90 mV) als in Blastochloris viridis (Em,7 = 20 mV bzw. -60 mV). Bei einem Redoxpotential von 50 mV liegen die low potential Häme in Roseobacter denitrificans unter semiaeroben Bedingungen reduziert vor, während in Blastochloris viridis unter diesen Bedingungen diese Häme oxidiert vorliegen. Im letzteren Falle erfolgt bei niedrigen Redoxpotentialen ein schneller Elektronentransfer vom löslichen Cytochrom c2 zum high potential Häm H2 [92], so dass Wachstum der Bakterien unter semiaeroben / anaeroben Bedingungen beobachtet werden kann. In Blastochloris viridis [190, 193] sowie in Rhodocyclus gelatinosus [194] konnte auf Grund der elektrostatischen Oberflächeneigenschaften und der Gestalt der Cytochrom c-Untereinheit nachgewiesen werden, dass das lösliche Cytochrom c2 nahe am low potential Häm L2 bindet, welches sich in der Nähe der Oberfläche des Proteins befindet (vgl. Abbildung A.3.2.3). Die Untersuchungen des Strukturmodells 206 Diskussion des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans [46] liefert auf Grund eines insgesamt überwiegend negativen Oberflächenpotentials der Tetrahäm-Untereinheit keine klaren Hinweise für die Bindungsstelle des löslichen Cytochrom c551. Berücksichtigt man bei der Berechnung der elektrostatischen Oberflächeneigenschaften, dass Roseobacter denitrificans ein marines Bakterium ist und infolgedessen eine höhere Ionenstärke im periplasmatischen Raum vorhanden ist als in Süßwasserbakterien wie Blastochloris viridis, erhält man eine stärkere Differenzierung der elektrostatischen Eigenschaften der Oberfläche, die ähnlich wie in Blastochloris viridis die Bindung des löslichen Cytochroms c551 in der Nähe des äußersten Häms L2 begünstigen würde. D.2.2. Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans Obwohl ein lichtinduzierter zyklischer Elektronentransfer ähnlich dem in Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus generell in Purpurbakterien mit einem am Reaktionszentrum gebundenem Tetrahäm vermutet wird, sind nur wenige Untersuchungen über die Redoxwechselwirkungen zwischen dem Reaktionszentrum und dem Cytochrom bc1 Komplex in diesen Bakterien bekannt. Ein direkter Beweis für die Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am lichtinduzierten Elektronentransfer konnte bisher nur in Zellen von Blastochloris viridis [92] und in Chromatophoren von Chromatium vinosum [91, 195] erhalten werden. In dieser Arbeit konnte erstmalig durch Untersuchung der Kinetiken der blitzinduzierten Reduktion von Cytochrom b561 unter definierten Redoxbedingungen (vgl. Kapitel C.3.2.3.) die Beteiligung eines Cytochrom bc1 Komplexes am photoinduzierten Elektronentransfer in einem obligat aeroben photosynthetischen Bakterium, i.e. Roseobacter denitrificans, gezeigt werden. Dabei wurde zunächst das Cytochrom b561 mittels blitzinduziertem (ox-red)-Differenzspektrum identifiziert (vgl. Abbildung C.3.2.3.3). Dieses zeigt ein Maximum in der α-Bande bei 561 nm und ein Maximum in der γ-Bande bei 430 nm. Die spektroskopischen Eigenschaften des 207 Diskussion Cytochroms b561 aus Roseobacter denitrificans sind vergleichbar mit denen des Cytochroms b562 aus Rhodobacter sphaeroides. Viele der Merkmale der Cytochrom b Redoxänderungen, die in Roseobacter denitrificans entdeckt wurden, können im Rahmen eines Q-Zyklus-Modell (siehe Kapitel A.3.5.) interpretiert werden. Die Halbwertszeit der Cytochrom b-Reduktion liegt im Hundertstelsekundenbereich und spricht für eine Reaktion zweiter Ordnung. Dabei wird die Reduktionsgeschwindigkeit der Cytochrom b Reduktion durch die Diffusionsgeschwindigkeit des Dihydroubichinons UQH2 aus dem Q-Pool zur QoBindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes bestimmt. Bei allen eingestellten Redoxpotentialen Eh, die getestet wurden, wird die blitzinduzierte Cytochrom b Reduktion von Antimycin stimuliert und von Myxothiazol gehemmt. Im Unterschied zu anaeroben photosynthetischen Purpurbakterien wie Rhodobacter sphaeroides [196-198] kann eine signifikante Reduktion von Cytochrom b schon in Abwesenheit von Antimycin beobachtet werden (vgl. Abbildung C.3.2.3.1), was auf eine relativ langsame Reoxidation von Cytochrom b561 an der Qi-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes hindeutet. Bei Einstellung eines hohen Redoxpotentials (390 mV) zeigt die Cytochrom bReduktion ein binäres Oszillationsmuster (siehe Abbildung C.3.2.3.1), das phasenverschoben zu den binären Oszillationen der Semichinonbildung ist, die im Reaktionszentrum beobachtet wurden [128]. Unter diesen oxidierenden Bedingungen ist das Reduktionsmittel für Cytochrom b561 das Dihydroubichinon (UQH2), das an der QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrums in einem two electron gate Mechanismus gebildet wird. Eines der wichtigsten Merkmale des Q-Zyklus Modells ist, dass die Oxidation des Dihydroubichinons UQH2 an der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes in einer konzertierten Reaktion verläuft, bei der das erste Elektron auf die high potential Kette des Komplexes (Rieske-Protein, Cytochrom c1) übertragen wird und so später den primären Donator P+ reduziert, während das zweite Elektron zur low potential Cytochrom b-Kette Übereinstimmung übertragen damit wird (vgl. zeigen die auch Abbildung zeitaufgelöst D.2.4.1). In gemessenen Absorptionsdifferenzspektren der blitzinduzierten Cytochrom b- und Cytochrom cRedoxänderungen bei mittleren Redoxpotentialen (Eh = 145 - 195 mV), dass die Reduktion von Cytochrom b am Elektronentransfer vom Cytochrom bc1 Komplex zum 208 Diskussion photooxidierten Häm H2 der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums gekoppelt ist (vgl. Abbildung C.3.2.4.4). Wie schon im vorhergehenden Kapitel diskutiert, scheint dieser letzte Prozess durch einen löslichen Redoxcarrier vermittelt zu werden, wahrscheinlich Cytochrom c551. Wenn man das Redoxpotential von 200 mV auf 100 mV verringert, wird die Halbwertszeit der Cytochrom b Reduktion auf ca. 30 ms, d.h. um den Faktor 2 - 3 verkleinert. Nach dem Q-Zyklus Modell sollte die Reduktion von Cytochrom b in Gegenwart von Antimycin durch die Oxidation des Dihydroubichinons UQH2 an der Qo-Bindungssstelle in einer Reaktion zweiter Ordnung stattfinden (s.o.). Die beobachtete Beschleunigung der Cytochrom b-Reduktionskinetik bei niedrigerem Redoxpotential könnte daher die fortschreitende Reduktion des Q-Pools, d.h. die Zunahme von Dihydroubichinon in der Membran, wiederspiegeln. In der vorliegenden Arbeit wurde in Membranen von Roseobacter denitrificans ein Ubichinon-Pool von ca. 20 Ubichinonen/Dihydroubichinonen pro Reaktionszentrum gefunden (siehe Kapitel C.3.3.). Wenn man annimmt, dass das Halbstufenpotential des Redoxpaares Ubichinon/Dihydroubichinon in der Membran bei ähnlicher Zusammensetzung der Membranlipide wie in Rhodobacter sphaeroides [88] Em,7 = 90 mV bei pH = 7 ist, sollte in diesem Potentialbereich (100 mV) eine zunehmende Konzentration an Dihydroubichinon UQH2 (reduzierte Spezies) an der Qo-Bindungsstelle zur Verfügung stehen. Selbst unter optimalen Redoxbedingungen ist die Reaktion jedoch viel langsamer als in Chromatophoren von Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus [84, 199] und der Effekt der Beschleunigung durch Verringerung des angelegten Potentials scheint gering zu sein. Die Größe des Q-Pools in Roseobacter denitrificans ist vergleichbar mit dem in Rhodobacter sphaeroides [88]. Auf Grund der Kopplung der Elektronentransferreaktionen der high potential und der low potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes (siehe Kapitel A.3.5.) liegt es nahe, dass die Geschwindigkeit der Cytochrom b Reduktion durch die Geschwindigkeit der Oxidation der high potential Kette des Cytochrom bc1 Komplexes bestimmt wird. Dieser Prozess ist wahrscheinlich langsam auf Grund der niedrigen Konzentration des löslichen Elektronencarriers Cytochrom c551, der die Redoxwechselwirkungen zwischen dem tetrahämen Cytochrom c und dem Cytochrom bc1 Komplex vermittelt. Dementsprechend ist die Halbwertszeit der Cytochrom b-Reduktion der für die langsame Cytochrom c-Oxidation sehr ähnlich (s. Tabelle C.3.2.6.1). Der partielle 209 Diskussion Verlust des löslichen Cytochroms c551 beim Zellaufschluss wird bestätigt durch die Detektion großer Mengen dieser Komponente im Überstand. Wie in Kapitel D.1.2. beschrieben scheint ein größerer Anteil der Membranvesikel offen zu sein. Unter optimalen Redoxbedingungen wurden etwa 0,3 Cytochrome b pro Reaktionszentrum nach Anregung durch einen Blitz reduziert (vgl. Kapitel C.3.2.8.). Die Stöchiometrie der am zyklischen Elektronentransfer beteiligten Proteinkomplexe ergibt sich also zu nur 1 Cytochrom bc1 Komplex auf 3 Reaktionszentren. In Rhodobacter sphaeroides wurde hingegen ein Verhältnis von 1 Cytochrom bc1 Komplex zu 2 Reaktionszentren gefunden [5, 200]. Die Titration der blitzinduzierten Cytochrom b561 Reduktion ergibt ein scheinbares Halbstufenpotential von Em,7 = 65 mV (vgl. Abbildung C.3.2.8.3). Die Interpretation dieses Ergebnisses ist komplex. Die unmittelbare Interpretation wäre, dass das Gleichgewichtsredoxpotential des Cytochrom b561 mit diesem Wert übereinstimmt und das Verschwinden der Cytochroms c561-Reduktion beim Verringern des angelegten Redoxpotentials aus der Präreduktion des Cytochroms im Dunkeln folgt. Dennoch liegen bei diesen Potentialen die low potential Häme der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums zunehmend reduziert im Dunkeln vor und reduzieren in einer schnellen Reaktion den primären Donator P+. Wie schon diskutiert, verhindert dies die Oxidation des löslichen Cytochrom c551, und, da das FeS-Zentrum und Cytochrom c1 wahrscheinlich bei diesen Redoxpotentialen ebenso reduziert vorliegen22, kann auch die Oxidation der high potential Kette des Komplexes nicht stattfinden. Es ist demnach wahrscheinlich, dass die Reduktion des Cytochrom b561, unabhängig von seinem Halbstufenpotential, bei diesen Redoxpotentialen nicht stattfinden kann, weil das Dihydroubichinon UQH2 an der QoBindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes nicht durch die high potential Kette zum Semichinon oxidiert werden kann. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass die Amplitude der Cytochrom c561-Reduktion und der langsamen Oxidation von Cytochrom c fast parallel bei Verringerung des eingestellten Redoxpotentials verschwinden (vgl. Abbildung C.3.2.8.2). Diese Übereinstimmung ist mit einem QZyklus-Mechanismus vereinbar. 22 Dies gilt, wenn man ähnliche Halbstufenpotentiale wie für Rhodobacter sphaeroides annimmt (vgl. Abbildung A.3.5.1). 210 Diskussion Diese Interpretation wird auch gestützt durch vorläufige Ergebnisse aus Gleichgewichts-Redoxtitrationen der Cytochrome des b-Typs im Dunkeln, die in isolierten Membranen aus Roseobacter denitrificans durchgeführt wurden [201]. Diese Untersuchungen haben die Anwesenheit von zwei Cytochromen des b-Typs gezeigt, mit Em ≅ 25 mV und Em ≅ -165 mV, die auf Grund ihrer spektralen Eigenschaften jeweils zu Cytochrom b561 und Cytochrom b566 zugeordnet wurden. Ähnliche Werte wurden in Rhodobacter sphaeroides ermittelt: Em = 50 mV für Cytochrom b562 und Em = -90 mV für Cytochrom b566 [157, 202]. Cytochrom b566 konnte bei den lichtinduzierten spektroskopischen Messungen nicht beobachtet werden, da der Elektronentransfer zum Cytochrom b561 für die Zeitauflösung der Messapparatur zu schnell ist (< µs). Auch in anaeroben photosynthetischen Purpurbakterien wie Rhodobacter sphaeroides wurden schnelle Elektronentransferzeiten (t1/2 < 25 µs, was der Zeitauflösung der Messapparatur in diesen Experimenten entspricht [203]) von Cytochrom b566 zu Cytochrom b562 beobachtet. D.2.3. Das Halbstufenpotential des primären Elektronenakzeptors QA im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans Das Verschwinden der photosynthetischen Aktivität in Anaerobiosis (d.h. unter Sauerstoffausschluss), das in Roseobacter denitrificans und im Allgemeinen bei aeroben photosynthetischen Bakterien beobachtet wird, wurde in der Literatur auf die Präreduktion des primären Elektronenakzeptors QA des Reaktionszentrums unter diesen Bedingungen zurückgeführt (siehe Kapitel A.4.5.). So wurde in isolierten Membranen von Roseobacter denitrificans ein höheres Halbstufenpotential als in anoxygenen photosynthetischen Purpurbakterien von Em,7 = 35 mV gemessen [131]. In isolierten Reaktionszentren wurde hingegen ein niedrigeres Halbstufenpotential von Em,7 = -44 mV bestimmt [128]. In Voruntersuchungen zur Titration von QA/QA- konnte in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden, dass die Reoxidation des nach Anregung durch einen Blitz reduzierten primären Akzeptors QA- bei niedrigen Redoxpotentialen ein sehr langsamer Prozess ist, und zwar auch in Anwesenheit effizienter Redoxmediatoren 211 Diskussion wie 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon. Eine exakte Äquilibrierung des Akzeptors während der Titration erfordert eine Dunkeladaptation der Probe von mehreren Minuten zwischen den Anregungen durch einen Blitz und eine kurze Belichtung der Probe durch den Messstrahl vor der Anregung. Wenn man diese Maßnahmen nicht beachtet, können Abweichungen vom Nernstverhalten beobachtet werden, was systematisch zu einer Überschätzung des Halbstufenpotentials führt. Dies gilt insbesondere bei Reaktionszentren mit Tetrahäm-Untereinheit, da bei niedrigen Potentialen die Häme reduziert vorliegen und schon bei geringfügiger Beleuchtung (z.B. durch den Messstrahl) in einem Teil der Reaktionszentren QA- vor der Anregung durch den Blitz gebildet wird. Damit würde das Redoxpotential von QA überschätzt werden. Andererseits kann ein systematischer Fehler, der eine Unterschätzung des bestimmten Redoxpotentials zur Folge haben würde, ausgeschlossen werden, weil die Reversibilität der Titration überprüft wurde. Nach Ermittlung der geeigneten Bedingungen für eine vollständige Dunkeläquilibrierung konnte in der vorliegenden Arbeit ein Halbstufenpotential von Em,7 = -50 mV gemessen werden, in guter Übereinstimmung mit dem an Reaktionszentren gemessenen Wert für QA/QA-. Für Roseobacter denitrificans [128] und Rhodobacter sphaeroides [133] wurde in isolierten Reaktionszentren jeweils ein Wert von Em,7 ≈ -50 mV bestimmt. Danach können die thermodynamischen Eigenschaften des primären Akzeptors kaum der Grund für das Unvermögen der Zelle sein, Photosynthese unter anaeroben Bedingungen durchzuführen. Dieses Ergebnis wird durch neueste Untersuchungen zur Struktur des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans bestätigt [46]. Die Berechnung eines Homologiemodells ergab eine weitgehende Übereinstimmung mit der Struktur des Reaktionszentrums aus Purpurbakterien wie Blastochloris viridis. Insbesondere in der Umgebung des primären Akzeptors QA ist die Proteinstruktur konserviert, so dass sich keine Merkmale finden, die eine Erhöhung des Halbstufenpotentials von QA erklären könnten. 212 Diskussion D.2.4. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans: Schlussfolgerungen und Ausblick. In dieser Arbeit wurden die Elektronentransferreaktionen, die durch die Anregung durch einen einzelnen Blitz (single turnover) in photosynthetischen Membranen aus Roseobacter denitrificans induziert wurden, unter kontrollierten Redoxbedingungen untersucht. Die Ergebnisse liefern den direkten Nachweis, dass ein Cytochrom bc1 Komplex an einem zyklischen Elektronentransfersystem in Roseobacter denitrificans beteiligt ist und dieses Elektronentransfersystem im Rahmen bisher bekannter QZyklus-Modelle diskutiert werden kann [84, 91]. Der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans ist in Abbildung D.2.4.1 schematisch dargestellt. Nach der Anregung durch den Blitz reagiert das Dihydroubichinon, das entweder an der QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrums nach erfolgter Ladungstrennung produziert wurde oder reduziert im Q-Pool vorliegt, an der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes und überträgt ein Elektron an die high potential Kette und eines an die low potential Kette und reduziert so Cytochrom b561. Die Reoxidation des durch den Blitz reduzierten Cytochroms b561 durch ein Ubichinon aus dem Q-Pool an der Qi-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes ist viel langsamer als in Cytochrom bc1 Komplexen der anaeroben Bakterien. In diesem Verhalten, scheint der Cytochrom bc1 Komplex von Roseobacter denitrificans den Cytochrom b6f Komplexen in Cyanobakterien und Chloroplasten ähnlicher zu sein, für den eine niedrige Stabilitätskonstante des Semichinons an der Qi-Bindungsstelle postuliert wurde [204]. Das lösliche Cytochrom c551, das die Redoxwechselwirkungen zwischen dem Cytochrom bc1 Komplex und dem am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c vermittelt, reduziert selektiv Häm H2, das vom photooxidierten primären Donator P+ oxidiert wurde. Wenn die low potential Häme (Em,7 = 90 mV) im Dunkeln bei niedrigen Potentialen (Eh < 50 mV) reduziert vorliegen, wird der zyklische Elektronentransfer nach einer Anregung durch einen Blitz verhindert, da der oxidierte primäre Donator P+ schnell von den low potential Hämen reduziert wird. Diese können nicht von Cytochrom c551 rereduziert werden, und somit wird der Zyklus unterbrochen. Ebenso ist der lichtinduzierte zyklische Elektronentransfer bei hohen Potentialen (Eh > 290 mV) unterbrochen, wenn H2 vor der Anregung durch den Blitz oxidiert vorliegt. Die 213 Diskussion Bildung von Dihydroubichinon an der QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrums erfordert zwei aufeinanderfolgende Anregungen durch jeweils einen Blitz ebenso wie die Bildung von Dihydroubichinon an der Qi-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes zwei turnover des Komplexes erfordert. 214 Diskussion cyt c Myxothiazol Periplasma high potential Kette L2 Em= +90mV cyt c551 Em= +250 mV H1 Em= +290mV e e- Licht L1 Em= +90mV - H2 Em= +240mV eP870 Qo e- Em=+435 mV low potential Kette Q / QH2 Plasmamembran ecyt b561 Em ≤ 65 mV eQi e- bc1 Komplex Cytoplasma QB Antimycin QA Em = -50 mV RC Abbildung D.2.4.1: Lichtinduzierter zyklischer Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans. Zusammenfassung der in dieser Arbeit und in der Literatur veröffentlichten Ergebnisse [93, 108, 128, 137]. Der gezackte Pfeil stellt die Anregung des primären Donators P durch Licht dar, die durchgezogenen Pfeile die Elektronentransferschritte und die gepunkteten Pfeile die Diffusion von Ubichinon (Q) bzw. Dihydroubichinon (QH2) von und zu den Bindungsstellen des Reaktionszentrums (RC) und des Cytochrom bc1 Komplexes (nämlich QB bzw. Qo und Qi) bzw. in die Membran (Ubichinon-Pool Q / QH2). Die Balken kennzeichnen die Stellen, bei denen die Inhibitoren Antimycin bzw. Myxothiazol den Elektronentransfer blockieren. Soweit bekannt, sind die Halbstufenpotentiale Em der Redoxkomponenten angegeben. Die Beschreibung des Elektronentransferzyklus erfolgt im Text. Die Elektronentransferreaktionen erfolgen vom am Reaktionszentrum gebundenen Cytochrom c je nach eingestelltem Redoxpotential entweder von H1, H2 oder von L1/L2 zum primären Donator P+. Eingezeichnet ist der Elektronentransfer von H2 zu P+, der bei mittleren Potentialen (Eh ≈ 190 mV), wenn der Elektronentransferzyklus geschlossen ist, stattfindet. An der Qo-Bindungsstelle des Cytochrom bc1 Komplexes werden gleichzeitig zwei Elektronen vom Dihydroubichinon in einer konzertierten Reaktion auf die high potential und auf die low potential Kette übertragen. Der Transfer von Protonen über die Plasmamembran ist in diesem Schema aus Gründen der Übersicht nicht berücksichtigt. 215 Diskussion Im Gegensatz zu dem, was bisher vermutet wurde, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die thermodynamischen Eigenschaften des primären Akzeptors QA nicht für die Beeinträchtigung des photosynthetischen Elektronentransfers unter anaeroben Bedingungen verantwortlich gemacht werden können. Es scheint wahrscheinlicher, dass das Unvermögen von Roseobacter denitrificans, unter anaeroben Bedingungen Photosynthese zu betreiben, auf eine Überreduktion des Q-Pools23 zurückzuführen ist, die durch das Zusammenspiel der Elektronentransferketten der Photosynthese und der Zellatmung bestimmt ist. Wenn der Q-Pool unter anaeroben Bedingungen überwiegend reduziert (Dihydroubichinon im Überschuss) vorliegt, wird die Rate, mit der das Dihydroubichinon UQH2, das an der QBBindungsstelle des Reaktionszentrums entsteht, gegen ein oxidiertes Ubichinonmolekül UQ aus dem Pool ausgetauscht wird, kritisch für die Funktion der Photochemie des Reaktionszentrums. Im Labor von D. Oesterhelt wurde für Rhodobacter sphaeroides gezeigt, dass das pufX-Protein des Antennenkomplexes eine wesentliche Rolle bei der Erleichterung dieses Austauschprozesses spielt [205207]. In Rhodobacter sphaeroides kommt dabei ein pufX-Protein auf ein Reaktionszentrum [208]. PufX bildet eine Transmembranhelix [209] und bindet wahrscheinlich sowohl an das LH I als auch an das Reaktionszentrum (in der Nähe der QB-Bindungsstelle) des LH I-RC-Kernkomplexes in der Membran [208, 210-212]. Dabei verhindert es die Ausbildung eines geschlossenen LH I-Ringes um das Reaktionszentrum und erleichtert so möglicherweise den Austausch von Dihydroubichinon mit Ubichinon aus dem Q-Pool in der Membran an der QBBindungsstelle des Reaktionszentrums [213]. PufX hat somit eine wichtige und eine komplexe Funktion bei der strukturellen Organisation des photosynthetischen Kernkomplexes in Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides, deren Details weiterhin unverstanden sind. In neueren Arbeiten wurde die Rolle des C- und N-Terminus von pufX auf die Organisation des LH I-RC-Komplexes untersucht [214]. Dabei konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus verantwortlich für die Insertion von pufX in den Kernkomplex ist. Die transmembrane helikale Region ist wichtig für den Austausch Interessanterweise sphaeroides [206] von Hydroubichinon mit Ubichinon zeigen die pufX-deletierten sowie von Rhodobacter Mutanten capsulatus aus von [215] dem Q-Pool. Rhodobacter das gleiche Unvermögen, unter anaeroben Bedingungen photosynthetisch zu wachsen, wie 23 D.h. es liegen in der Membran im Verhältnis viel mehr Dihydroubichinon-Moleküle als UbichinonMoleküle vor. 216 Diskussion Roseobacter denitrificans. Darüber hinaus stellt die Zugabe externer Hilfsoxidantien (Dimethylsulfoxid und TMAO) die photosynthetischen Aktivitäten unter anaeroben Bedingungen sowohl in Roseobacter denitrificans [139] als auch in den pufX deletierten Mutanten von Rhodobacter sphaeroides [207] wieder her. Da auch in Roseobacter denitrificans das pufX-Gen nicht vorhanden ist [129, 130], könnte man spekulieren, dass ein gehinderter Austausch von Dihydroubichinon (UQH2) und Ubichinon (UQ) an der QB-Bindungsstelle des Reaktionszentrums mitverantwortlich für die Blockierung des photosynthetischen Elektronentransfers in anaeroben Zellen von Roseobacter denitrificans ist. Die Tatsache, dass der Q-Pool unter anaeroben Bedingungen reduziert vorliegt, wird durch neuere Untersuchungen der respiratorischen Elektronentransferkette in Roseobacter denitrificans bekräftigt [216]. In Roseobacter denitrificans wurde eine lineare respiratorische Elektronentransferkette gefunden, die einige Redoxkomponenten mit dem lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer teilt (wie z.B. den Cytochrom bc1 Komplex oder das Cytochrom c551). Dieser Weg endet mit einer Cytochrom c-Oxidase des aa3-Typs. Im Gegensatz zu den Purpurbakterien wurde kein Hydrochinon-Oxidase-Weg (quinol oxidase pathway) gefunden, der in Membranen von Rhodobacter capsulatus und Rhodopseudomonas rubrum einen photoinduzierten nicht-zyklischen Elektronentransfer katalysiert, wobei Hydroubichinon (UQH2) oxidiert wird und O2 zu H2O reduziert wird (lichtinduzierte O2Aufnahme), und daher für die Regulation des Redoxzustandes des Q-Pools sowie der Photophosphorylierungsaktivität von Bedeutung ist [217, 218]. So verändert kontinuierliches Licht nicht den Redoxzustand des Q-Pools unter respiratorischen steady state Bedingungen solange der Hydrochinon-Oxidase-Weg aktiv ist [219]. Dies wirkt sich auf die Photophosphorylierungsrate aus, da der zyklische Elektronentransfer blockiert wird, wenn der Q-Pool (der mit dem sekundären Elektronenakzeptor des Reaktionszentrums QB im Gleichgewicht steht) vollständig reduziert (d.h. UQH2 überwiegt gegenüber UQ) vorliegt [87]. So konnten M. Candela et al. [216] auch zeigen, dass lichtinduzierte ATP-Synthese in Roseobacter denitrificans nur unter oxischen Bedingungen stattfindet. Die lichtinduzierte ATPSynthese erfordert geeignete Redoxbedingungen mit einem intrazellulären Redoxpotential zwischen 80 und 140 mV (Redoxgleichgewicht). Dieses liegt im Bereich des Halbstufenpotentials des Q-Pools (Em,7 = 90 mV). In Roseobacter 217 Diskussion denitrificans können überschüssige Reduktionsäquivalente im Q-Pool (Hydroubichinon) in Ermangelung alternativer terminaler Oxidasen (wie z.B. die Hydrochinon-Oxidase), nur über die lineare respiratorische Elektronentransferkette abgebaut werden. Somit könnte ein sehr aktiver respiratorischer Elektronentransfer die Voraussetzung für die Funktionsfähigkeit aller am lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer beteiligten Redoxkomponenten sein. Die Funktion der Hilfsoxidantien wie TMAO wäre demnach, die überschüssigen Reduktionsäquivalente auf der Ebene des Q-Pools (Dihydroubichinon) abzubauen, so dass ein lichtinduzierter zyklischer Elektronentransfer ungehindert erfolgen kann. Die Überreduktion des Q-Pools unter anaeroben Bedingungen bewirkt, dass auch die low potential Häme des am Reaktionszentrum gebundenen Cytochroms c reduziert vorliegen. Ein weiterer wichtiger Mechanismus zur Stabilisierung des intrazellulären Redoxzustandes während des phototrophen Wachstums ist die CO2-Fixierung durch den Calvin-Zyklus [220]. Keines der aeroben photosynthetischen Bakterien konnte jedoch bisher autotroph angezogen werden und das wichtigste Enzym des CalvinZyklus (Ribulosebisphosphatcarboxylase, Rubisco) konnte in keiner bisher isolierten Spezies gefunden werden [109]. Lediglich in einigen Spezies konnte eine lichtinduzierte CO2-Aufnahme beobachtet werden, die der Phosphoenolpyruvatcarboxylase zugeordnet wurde. Aerobe photosynthetische Bakterien sind scheinbar nicht in der Lage, das intrazelluläre Redoxgleichgewicht zu regulieren. Weitere Studien sind notwendig, um die Regulationsmechanismen der Photosynthese in den aeroben photosynthetischen Bakterien zu verstehen, insbesondere in Hinblick auf ihre ökologische Bedeutung. Neueste Studien zeigen, dass aerobe photosynthetische Bakterien 11% der gesamten Mikrobenpopulation in den oberen Schichten der Ozeane ausmachen und dort 2 - 5% des gesamten photosynthetischen Elektronentransfers betreiben [114, 117]. Die Menge an fixiertem Kohlenstoff ist jedoch niedrig. Ihre Bedeutung für den Kohlenstoff-Zyklus liegt nicht so sehr in der Fixierung von Kohlenstoff sondern im geringeren Verbrauch von organischem Kohlenstoff durch die Zellatmung, da sie einen großen Teil (50 - 80%) ihres Energiebedarfs über die photosynthetische ATPSynthese decken [184]. 218 Diskussion Um den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in den aeroben photosynthetischen Bakterien besser zu verstehen, sollten die noch fehlenden Redoxkomponenten (FeS-Zentrum, Cytochrom c1, Cytochrom b566) charakterisiert und die Elektronentransferkinetiken bestimmt werden. Für die Untersuchungen der spektroskopischen und Redoxeigenschaften der Cytochrome c1, b566 (sowie auch die genauere Untersuchung des Cytochroms b561) wäre die Isolation des Cytochrom bc1 Komplexes hilfreich, da Überlagerungen von anderen Cytochromen (sowie anderer stark absorbierender Substanzen) in der Membran entfallen würden. Allerdings sind am isolierten Cytochrom bc1 Komplex keine lichtinduzierten Messungen des Elektronentransfers möglich. Diese wären dann möglich, wenn man die isolierten Enzymkomplexe in Proteoliposomen rekonstituieren könnte. N. Gabellini et al. [221] gelang es, Reaktionszentren, Cytochrom bc1 Komplex und ATP-Synthase aus Rhodobacter capsulatus in Liposomen einzubauen und den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer sowie die Photophosphorylierung zu messen. Ferner sind die Elektronentransferkinetiken von QA- nach QB, QA- nach QB- und die Protonierung zum Dihydroubichinon von Interesse sowie die Austauschrate von Dihydroubichinon an der QB-Bindungsstelle, da ein langsamer Elektronentransfer vom primären zum sekundären Elektronenakzeptor, eine langsame Protonenaufnahme bzw. ein langsamer Austausch vom Dihydroubichinon mit Ubichinon aus dem Q-Pool der Membran unter anaeroben Bedingungen jeweils die Ursache für die Beeinträchtigung des lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfers unter den genannten Bedingungen sein kann. Man erwartet also, dass die genannten Elektronentransferreaktionen und/oder die Austauschrate von Dihydroubichinon mit Ubichinon bei Verringerung des Potentials auf ca. 50 mV deutlich langsamer werden. Der Elektronentransfer von QA- nach QB kann am isolierten Reaktionszentrum durch Messung der transienten Absorptionsänderung in Abhängigkeit vom eingestellten Redoxpotential nach Anregung durch einen Blitz bei 750 und 770 nm [222] oder aus Messungen der Menge an oxidiertem Cytochrom c aus Pferdeherz oder Cytochrom c2, das der Probe zugegeben wird, nach zwei aufeinanderfolgenden Blitzanregungen oder bei kontinuierlicher Beleuchtung [223-225] ermittelt werden. Bei Messung der Kinetiken in Abhängigkeit von der Ubichinon-Konzentration kann auch die Dissoziationskonstante KD für Ubichinon-10 bestimmt werden. Da Ubichinon-10 in H2O schwer löslich ist, muss es hierzu mit Detergentien in Lösung gebracht werden. Eine Bestimmung kann aber auch nach Solubilisierung des Reaktionszentrums in 219 Diskussion inversen Phospholipid-Mizellen in n-Hexan erfolgen, wobei Ubichinon in der organischen Phase gelöst vorliegt [226]. Dies hat den Vorteil, dass die Bestimmung der Austauschrate von Dihydroubichinon mit Ubichinon unabhängig von den Eigenschaften der Ubichinon-Detergens-Mizellen ist. Um zu prüfen, ob der Austausch durch den LH I-Komplex auf Grund des in Roseobacter denitrificans fehlenden pufX-Proteins (s.o.) verursacht wird, wären analoge Messungen am LH IRC-Kernkomplex von Interesse. Eine geeignete Prozedur für die Isolation müsste entwickelt werden. Die Messung könnten auch an isolierten Membranen erfolgen. Auch Untersuchungen der Funktion der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums sind von Interesse. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit geht hervor, dass die Voraussetzung von aeroben Wachstumsbedingungen für Roseobacter denitrificans auf das erhöhte Halbstufenpotential der low potential Häme L1/L2 im Vergleich zu Blastochloris viridis zurückzuführen ist. Die Struktur der Tetrahäm-Untereinheit konnte mittels Homologiemodellierung ermittelt werden [46]. Über elektrostatische Rechnungen könnten die Redoxpotentiale der Häme ermittelt werden. Darauf basierend könnten durch Konstruktion geeigneter Mutanten die Potentiale der low potential Häme L1/L2 auf die entsprechenden Werte von Blastochloris viridis angeglichen werden. Liegt die Ursache für das beobachtete Wachstumsverhalten allein an der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit, sollte an diesen Mutanten Wachstum im Licht unter Sauerstoffausschluss wie bei den anaeroben photosynthetischen Bakterien beobachtet werden können. 220 Literaturverzeichnis 1. Stryer, L. (1991) Biochemie. Spektrum Verlag, Heidelberg. 2. Blankenship, R. E. (1992) Origin and early evolution of photosynthesis. Photosynthesis Research 33, 91 - 111. 3. Mitchell, P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by chemi-osmotic type of mechanism. Nature 191, 144 - 148. 4. Loach, P. A. (2000) Supramolecular complexes in photosynthetic bacteria. 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Xiche et al. mit Blick auf die Membran, in der die Proteinkomplexe eingebettet sind Die Struktur des photosynthetischen Reaktionszentrums aus Rhodobacter sphaeroides in atomarer Auflösung Struktur der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums von Blastochloris viridis in atomarer Auflösung Anordnung der Cofaktoren des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis und Orientierung der Häme der Cytochrom cUntereinheit Vereinfachtes Schema der Elektronentransferreaktionen im bakteriellen photosynthetischen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides Modifizierter Q-Zyklus-Mechanismus für den zyklischen Elektronentransfer in Rhodobacter sphaeroides nach A. R. Crofts et al. Elektronenmikroskopische Aufnahme der Zelle von Roseobacter denitrificans Absorptionsspektren von Membransuspensionen der aeroben Bakterien Roseococcus thiosulfatophilus, Erythrobacter litoralis, Erythromicrobium hydrolyticum und Erythromicrobium ezovicum Absorptionsspektrum vom Lichtsammelkomplex LH II aus Roseobacter denitrificans Anordnung der Häme im tetrahämen Cytochrom c aus Roseobacter denitrificans im Vergleich zu Blastochloris viridis nach D. Garcia et al. Schematische Darstellung der bisherigen Daten zum zyklischen Elektronentransfers in Roseobacter denitrificans B.2.1.2.1: Anzucht des Bakteriums Roseobacter denitrificans Isolation der Membranen aus Roseobacter denitrificans B.2.2.1: B.2.3.1.1: Schema der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya et al. B.2.3.2.1: Schematische Darstellung der Isolation und Aufreinigung der Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans mittels Dichtegradientenfraktionierung B.2.3.2.4.1: Schematische Darstellung des Saccharose-Gradienten und der Auftrennung der Membranproteine mittels Dichtegradientenzentrifugation B.2.3.3.1: Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans 241 4 6 9 11 13 14 16 21 27 29 31 36 39 56 59 63 67 69 72 der Flüssigkultur von Roseobacter B.2.4.4.1: Absorptionsspektrum denitrificans Zellen B.2.4.4.2: Absorptionsspektrum von gereinigten Roseobacter denitrificans Membranen in 100 mM Mops-Puffer (pH = 7,0) B.2.4.4.3: Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Absorptionsspektrum einer 10 µM Lösung von Cytochrom c im B.2.5.1: reduzierten und oxidierten Zustand B.2.5.1.1: Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Ladungsrekombination von QA- und P+ im bakteriellen B.2.5.1.3.1: Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans B.2.5.2.1.1: Messanordnung für die transiente Absorptionsspektroskopie an Membranen aus Roseobacter denitrificans B.2.5.2.2.1: Einfluss von Inhibitoren auf den lichtinduzierten zyklischen Elektronentransfer in Membranen aus Roseobacter denitrificans Schematische Darstellung der Redoxküvette B.2.6.1: C.1.1: C.1.2: C.2.1.1.1: C.2.1.1.2: C.2.1.3.1: C.2.1.3.2: C.2.2.1: C.2.2.2: C.2.2.3: C.2.2.4: C.2.2.5: C.2.2.6: C.3 C.3.2.1.1: C.3.2.1.2: Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 28 l-Fermenter Wachstumskurve der Anzucht von Roseobacter denitrificans Bakterien im 200 l-Fermenter Verlauf der Isolation von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach K. Takamiya SDS-Gel von isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans nach der Vorschrift von K. Takamiya Solubilisierung mit unterschiedlichen Konzentrationen an LDAO Absorptionsspektrum von gereinigten Reaktionszentren nach dem Auftauen Verlauf der Proteinmenge während der Isolation und Aufreinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Verlauf der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans SDS-Gel der isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Absorptionsspektren im Verlauf der Isolation und Reinigung von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans mittels 50%iger Ammoniumsulfat-Fällung SDS-Gel von isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Ladungsrekombinationskinetik in isolierten Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans Spektren der Zellen und Membranen aus Roseobacter denitrificans Spektrum der für die spektroskopische Untersuchungen verwendete Probe vor der Beschallung (a), nach einer Beschallung (b) und nach zwei Beschallungen (c) Spektrum der für die spektroskopischen Untersuchungen verwendete Probe vor und nach der Messreihe 242 87 88 88 90 92 94 99 101 102 111 111 117 118 121 123 127 130 132 134 135 137 139 141 141 C.3.2.2.1: Zeitaufgelöste lichtinduzierte Absorptionsspektren des primären Elektronendonators im Reaktionszentrum aus Roseobacter denitrificans in den spektralen Bereichen α und γ 144 C.3.2.3.1: Der Effekt von Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderungen nach Anregung durch zwei Blitze im Abstand von 500 ms bei 430 nm (g-Bande) 151 C.3.2.3.2: Der Effekt der Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderung nach Anregung durch zwei Blitze im Abstand von 500 ms bei 562 nm (α-Bande) 152 C.3.2.3.3: Das blitzinduzierte Differenzspektrum der Redoxänderungen des Reaktionszentrum und des Cytochrom b in der γ- und der αRegion bei Eh = 390 mV 154 C.3.2.4.1: Der Effekt der Inhibitoren des Cytochrom bc1 Komplexes auf die Kinetik der Absorptionsänderungen nach Anregung durch zwei Blitze bei 422 nm und bei 430 nm 157 bei 554 nm nach zwei C.3.2.4.2: Absorptionsänderung aufeinanderfolgenden Blitzen im Abstand von 500 ms 158 C.3.2.4.3: Absorptionsänderung bei 562 nm nach Anregung durch zwei aufeinanderfolgende Blitze im Abstand von 500 ms 160 C.3.2.4.4: Absorptionsdifferenzspektrum in der γ-Region aufgenommen nach dem ersten Blitz (nach 100 µs und 400 ms) und 500 ms nach dem zweiten Blitz 163 C.3.2.4.5: Absorptionsdifferenzspektren in der α-Region nach Anregung durch einen Blitz (nach 2 ms und 500 ms) 165 C.3.2.4.6: Blitzinduzierte Absorptionsdifferenzspektren in der γ- Region und α-Region des Spektrums bei Eh = 195 mV 166 C.3.2.5.1: Lichtinduzierte Absorptionsänderungen nach Anregung durch einen sättigenden Blitz bei Redoxpotentialen von Eh = 310 mV, Eh = 170 mV und Eh = 50 mV 168/169 C.3.2.5.2: Absorptionsdifferenzspektren in der α- und γ- Region 100 µs und 90 ms nach dem Blitz in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol 172/173 C.3.2.7.1: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von 18 Blitzen bei 554 nm 180 C.3.2.7.2: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von Blitzen im Abstand von 50 ms bei 422 nm 181 C.3.2.7.3: Oxidation des exogenen Cytochroms c nach Anregung durch eine Sequenz von 18 Blitzen im Abstand von 50 ms bei 550 nm und 416 nm 183 C.3.2.8.1: Redoxtitration der Absorptionsänderung bei 422 nm, aufgenommen 0,5 ms nach Anregung durch einen einzelnen Blitz sowie in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol 185 C.3.2.8.2: Redoxtitration der Absorptionsänderungen bei 415 nm, aufgenommen 100 ms nach der Anregung durch einen einzelnen Blitz in Gegenwart von 5 µM Antimycin und 0,5 µM Myxothiazol 187 C.3.2.8.3: Bestimmung des Halbstufenpotentials von Cytochrom b 189 243 D.1.2.1: D.2.4.1: Schematische Darstellung der Orientierung der Membranvesikel nach dem Zellaufschluss Lichtinduzierter zyklischer Elektronentransfer in Roseobacter denitrificans 244 197 215 Tabellenverzeichnis A.3.2.1: A.4.4.1: A.4.4.2: Physikochemische Eigenschaften der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums aus Blastochloris viridis Physikochemische Eigenschaften der Tetrahäm-Untereinheit des Reaktionszentrums aus Roseobacter denitrificans Orientierung der Häme der tetrahämen Cytochrom c-Untereinheit des Reaktionszentrums in Bezug auf die Membranebene verschiedener photosynthetischer Bakterien 12 33 34 B.1.2.1.1: RbOR (Roseobacter denitrificans organic rich) -Medium 45 B.1.2.1.2: Lösung I 45 B.1.2.1.3: Lösung II 45 B.1.2.1.4: Spurenelemente Stammlösung 46 B.1.2.1.5: Vitamine Stammlösung 46 B.1.2.2.1: Tris-Puffer I für Solubilisierung 47 B.1.2.2.2: Tris-Puffer IV A für Anionenaustausch-Chromatographie 47 B.1.2.2.3: Saccharose-Lösungen für Dichtegradienten-Zentrifugation 47 B.1.2.2.4: LDAO-Stammlösung 47 B.1.2.2.5: Tris-Puffer IV für Anionenaustausch-Chromatographie 48 B.1.2.2.6: Tris-Puffer II für Ammoniumsulfat-Fällung 48 B.1.2.2.7: Tris-Puffer III für Gelfiltration 48 B.1.2.2.8: Tris-Puffer IV für Anionenaustauscher-Chromatographie 49 B.1.2.2.9: Tris-Puffer V für Entsalzung 49 B.1.2.2.10: Tris-Puffer VI für Aufkonzentrierung 49 B.1.2.4.1: Acrylamidstammlösung 50 B.1.2.4.2: Probenpuffer 50 B.1.2.4.3: Trenngelpuffer 50 B.1.2.4.4: Sammelgelpuffer 50 B.1.2.4.5: APS-Lösung 50 B.1.2.4.6: Elektrophoresepuffer 50 B.1.2.4.7: Fixierer 51 B.1.2.4.8: Färber 51 B.1.2.4.9: Proteinreferenz 51 B.1.2.5.1: Tris-Puffer VII für Reaktionszentren 51 B.1.2.5.2: Mops-Puffer I für Reaktionszentren 52 B.1.2.5.3: Mops-Puffer II für Membranen 52 B.2.3.3.4.1: Die Menge an festem Ammoniumsulfat, die einer Lösung zugefügt werden muss, um die gewünschte Endkonzentration bei 0°C zu erreichen 78 In dieser Arbeit verwendete Redoxmediatoren mit ihrem B.2.6.1: Halbstufenpotential bei pH = 7,0, den pKA-Werten und der Molmasse 106 Zusammenfassung der Bedingungen und Ergebnisse für die Anzucht von Roseobacter denitrificans im 28 l-Fermenter und im 200 l-Fermenter 112 C.3.2.2.1: Faktoren f(λ) zur Bestimmung des Anteils der Oxidation des primären Donators P an der gemessenen Absorptionsänderung 148 C.1.1: 245 C.3.2.6.1: Die Kinetik der diffusionskontrollierten Cytochrom c Oxidation nach Anregung durch eine Blitz in Abhängigkeit von der Glycerin Konzentration und der Ionenstärke 177 HPLC Analyse von Membranenextrakten aus Roseobacter C.3.3.1: denitrificans 191 246 Danksagung Mein Dank gilt allen, die mich bei meiner Arbeit auf verschiedenste Weise unterstützt haben: Prof. Dr. P. Gräber danke ich für die Ermöglichung dieser Arbeit am Institut für Physikalische Chemie, die Bereitstellung von Räumen und Geräten, seine Unterstützung und nicht zuletzt für die angenehme Arbeitsatmosphäre. PD Dr. A. Labahn danke ich ganz besonders für seine Unterstützung in allen Phasen dieser Arbeit, seine sehr hilfreichen Anregungen und seine stete Diskussionsbereitschaft. Prof. Dr. G. Venturoli sowie seinen Mitarbeitern im Laboratorio di Biochimica e Biophisica, Dipartimento di Biologia der Universität in Bologna danke ich ganz herzlich für die freundliche Aufnahme, die sehr gute Zusammenarbeit, die vielen Anregungen und die Hilfsbereitschaft im Labor sowie bei der Organisation meiner Aufenthalte in Bologna. Ich danke seinen Diplomanden Anna V. Carluccio und Marco Contarini für die Mitarbeit bei den spektroskopischen Messungen bzw. bei der Isolation von Reaktionszentren. Zudem möchte ich Dr. Paola Turina für Ihre Hilfsbereitschaft und Ihre Freundlichkeit danken. Prof. Dr. G. Drews danke ich für das große Interesse bezüglich der Untersuchungen an aeroben photosynthetischen Bakterien und seine vielen Anregungen. Prof. Dr. G. Fuchs und N. Gad’on, Institut für Biologie II der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, danke ich für die Durchführung der Anzucht von Roseobacter denitrificans im 200 lFermenter der Firma Bioengineering. Dr. Stefan Herter danke ich für die leider nur kurze Zusammenarbeit bei der Optimierung der Isolationsvorschrift von Reaktionszentren aus Roseobacter denitrificans. Dank auch an Annette Blau, die im Rahmen eines Mitarbeiterpraktikums bei der Anzucht von Roseobacter denitrificans geholfen hat. Vielen Dank an die technischen Assistenten des Instituts für Physikalische Chemie, Christine Disch, Ursula Friedrich, Ruth Lehmann, Monika Siegel und Willi Wangler, für die Unterstützung im Laboralltag. Vielen Dank an die Mitarbeiter der Mechanik- und Elektronikwerkstatt des Instituts für Physikalische Chemie. Mein Dank gilt auch Dr. Susanne Fischer und Rolf Reuter für die Hilfe bei der Handhabung des 28 l-Fermenters der Firma Bioengineering sowie Dr. Ralf Schmid für die Handhabung des Laserspektrometers. Besonderen Dank für Anregungen und Diskussionen möchte ich der „Freitag-Runde“ aussprechen. 247 Allen Mitarbeitern des Instituts für Physikalische Chemie, ins besondere allen HabilitantInnen, DoktorandInnen und DiplomandInnen danke ich für die freundliche Arbeitsatmosphäre. Ich danke dem Graduiertenkolleg „Systeme von ungepaarte Elektronen in Chemie, Physik und Biologie“ und der deutschen Forschungsgemeinschaft für die finanzielle Unterstützung. Last but not least danke ich ganz besonders herzlich meiner Familie! Lieber kleiner Janis, Dir danke ich dafür, dass Du mir immer wieder das Lächeln auf die Lippen zurück gezaubert hast. 248
