abstract - ETH E

Research Collection
Doctoral Thesis
Cell cycle regulation of DNA breakage by MUS81 nuclease
Author(s):
Duda, Heike
Publication Date:
2017
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-b-000181777
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ETH Library
Diss.ETHNo.24367
CellcycleregulationofDNAbreakageby
MUS81nuclease
Adissertationsubmittedto
ETHZURICH
forthedegreeofDoctorofSciences
presentedby
HeikeDUDA
Diplom-Biochemikerin,Friedrich-Schiller-UniversitätJena
bornOctober18th1987inWiesbaden,Germany
acceptedontherecommendationof
Prof.Dr.SabineWerner
Prof.Dr.JoaoMatos
Prof.Dr.YvesBarral
2017
ABSTRACT
DNA replication and chromosome segregation are essential processes in the cell
cycle, but in eukaryotes are incompatible with each other, as they require vastly
different cellular environments. In interphase, branched DNA structures are
generated in high numbers as intermediates of DNA replication and/or repair. In
mitosis, the same intermediates give rise to genome instability: they physically
interfere with the segregation of the partly replicated chromosomes. To minimize
the risk to genome integrity, eukaryotic cells separate DNA replication and
chromosomesegregationintime.Furthermore,ifreplicationintermediatespersist,
theyaretargetedfornucleolyticresolutionattheonsetofmitosis,bythestructureselective endonuclease MUS81. How MUS81 function is regulated to prevent
deleteriousprocessingofintactreplicationintermediatesinS-phasewasunclear.
In this work, I investigated the regulation of MUS81 function on replication
intermediates in human cell lines. I found that while MUS81 is catalytically active
throughoutthecellcycle,efficientsubstratetargetingrequiresassociationwiththe
nucleasescaffoldSLX4.MUS81-SLX4associationiscellcycleregulatedandrequires
CDK1-mediated phosphorylation of SLX4. To prevent unscheduled processing of
replication intermediates during S-phase, WEE1 kinase phosphorylates and inhibits
CDK1.Accordingly,inhibitionofWEE1ledtoprematureMUS81-SLX4associationand
localization of MUS81 to S-phase chromatin. At the same time, WEE1 inhibition
halted DNA replication and led to catastrophic MUS81-dependent chromosome
pulverization. Hence, I propose that by inhibiting CDK1 activity in S-phase, WEE1
indirectly prevents premature association of MUS81 and SLX4 and safeguards DNA
replicationbypreventinguntimelyprocessingofreplicationintermediates.
Surprisingly, MUS81-SLX4 was required not only for chromosome fragmentation in
WEE1inhibitedcells,butalsoforprematuremitoticentrycausedbyuntimelyCDK1
activity in S-phase. Restoring DNA replication by depletion of MUS81-SLX4 delayed
CDK1 activation and mitotic entry upon WEE1 inhibition until after bulk DNA
replicationwasconcluded.Iproposethatactivereplicationleadstothegeneration
ofasignalthatdelaysmitoticentry,thusassistingWEE1inensuringappropriateS
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phase length. Delaying mitotic entry indirectly delays MUS81-SLX4 assembly.
Conversely,MUS81-SLX4associationduringmitosispromotestargetedresolutionof
persistent replication intermediates and safeguards chromosome segregation. The
resulting double-negative feedback loop between replication intermediates and a
replicationforkprocessingnuclease,MUS81-SXL4,willcontributetorenderingDNA
replicationandmitosismutuallyexclusiveineukaryotes.
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INKÜRZE
DieVerdopplungderDNAunddieZellteilungsindzentraleVorgängeimLebenszyklus
einerZelle.IneukaryotischenZellensindsiejedochinkompatibelmiteinander,dasie
ein sehr unterschiedliches zelluläres Umfeld erfordern. In der Interphase werden
großeMengenverzweigterDNA-Strukturenerzeugt,diealsIntermediatevonDNAReplikation und/ oder –Reparatur dienen. In der Mitose führen dieselben DNAStrukturenzurDestabilisierungdesGenoms:Sieverbindenunvollständigverdoppelte
Chromosomen und behindern damit deren Segregation. Um die Risiken für die
Stabilität ihres Genoms gering zu halten, führen eukaryotische Zellen DNAReplikation und Chromosomensegregation zu unterschiedlichen Zeiten durch.
SolltenReplikationsintermediatebiszumBeginnderMitoseüberdauern,werdensie
von der Endonuklease MUS81 aufgelöst, die bevorzugt verzweigte DNA-Strukturen
schneidet. Wie MUS81 reguliert wird, um ein schädliches Zerschneiden intakter
ReplikationsintermediatewährendderS-Phasezuverhindern,warbisherunklar.
Diese Arbeit behandelt die Regulation der Aktivität von MUS81 an
Replikationsintermediaten in menschlichen Zelllinien. Ich konnte feststellen, dass
MUS81währenddesgesamtenZellzykluskatalytischaktivist,jedochzureffektiven
SubstraterkennungmitdemGerüstproteinSLX4assoziiertseinmuss.DieInteraktion
vonMUS81undSLX4istzellzyklusabhängigunderfordertPhosphorylierungvonSLX4
durchCDK1.UmeinunkontrolliertesZerschneidenvonReplikationsintermediatenin
der S-phase zu verhindern, wird CDK1 von der Kinase WEE1 phosporyliert und
inhibiert.FolgerichtigführtedieHemmungvonWEE1zuvorzeitigerAssoziationvon
MUS81 und SLX4 und zur Lokalisierung von MUS81 zu S-Phase-Chromatin.
Gleichzeitig führte WEE1-Hemmung zum Abbruch der DNA-Replikation und zur
MUS81-abhängigen Fragmentierung des Chromatins. Daher schlage ich vor, dass
WEE1, durch die Hemmung von CDK1 in der S-phase, indirekt einer vorzeitigen
AssoziationvonMUS81undSLX4vorbeugtunddieDNA-Replikationschützt,indem
eseinvorzeitigesZerschneidenvonReplikationsintermediatenverhindert.
Überraschenderweise war MUS81 nicht nur für die Chromatinfragmentierung nach
der Hemmung von WEE1 erforderlich, sondern auch für den vorzeitigen Eintritt in
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dieMitose,derdurchverfrühteCDK1-AktivitätinderS-Phaseverursachtwurde.Die
Wiederherstellung der DNA-Replikation durch RNA-Silencing von MUS81 oder SLX4
verzögertedieAktivierungvonCDK1unddenBeginnderMitose,bisderGroßteilder
DNA-Replikationabgeschlossenwar.Ichschlagevor,dassaktiveReplikationderDNA
ein Signal erzeugt, das den Eintritt in die Mitose verzögert und damit WEE1 darin
unterstützt, eine angemessene Länge der S-Phase zu gewährleisten. Umgekehrt
führt Assoziation von MUS81 und SLX4 in der Mitose zur Auflösung verbliebener
Replikationsintermediate und sichert die Segregation der Chromosomen ab. Die
resultierenden negativen Rückkopplungen zwischen Replikationsintermediaten und
einer für sie spezifischen Nuklease, MUS81-SLX4, trägt dazu bei, dass sich DNAReplikationundMitoseineukaryotischenZellengegenseitigausschließen.
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