Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik Ausarbeitung zum
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Ausarbeitung zum Vortrag
im Rahmen des Hauptseminars Experimentalphysik
Physikalische Grundlagen in der medizinischen Diagnostik
an der Universität Duisburg-Essen
Standort Duisburg
SS 2006
Marcel Ruth
Essen, Juli 2006
Betreuer: Dr. Kleinefeld
Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
GLIEDERUNG:
1. EINLEITUNG / MOTIVATION ............................................................................... 3
2 LASER ................................................................................................................... 4
2.1 Was ist ein Laser? .................................................................................................................................. 4
2.2 Elektromagnetische Strahlung.............................................................................................................. 5
2.3 Kohärenz.................................................................................................................................................. 6
2.4 Absorption, spontane und induzierte Emission .................................................................................. 9
2.5 Lebensdauer, Ratengleichungen ....................................................................................................... 10
2.6 Besetzungsinversion, Lasermedium / aktives Medium ................................................................... 12
2.7 Pumpen .................................................................................................................................................. 13
2.8 Linienbreite ............................................................................................................................................ 14
2.9 Laser-Resonator, Lasermoden ........................................................................................................... 14
2.10 Laserschwelle ..................................................................................................................................... 18
2.11 Laser-Systeme, Helium-Neon-Gas-Laser....................................................................................... 18
3. LASER INDUZIERTE FLUORESZENZ............................................................... 21
3.1 Physikalische Grundlagen ................................................................................................................... 21
3.1.1 Energieniveaus bei Molekülen ............................................................................................... 21
3.1.2 Optische Übergänge................................................................................................................ 23
3.1.3 Franck-Condon-Prinzip ........................................................................................................... 23
3.1.4 Fluoreszenz .............................................................................................................................. 24
3.2 Methode ................................................................................................................................................. 26
3.3 Anwendungen ....................................................................................................................................... 32
3.3.1 HIV und Leukämie Diagnose mit dem Durchflusscytometer ............................................. 33
3.3.2 Speiseröhrenkrebs Diagnostik ............................................................................................... 34
3.3.3 Spermiensortierung mit dem Durchflusscytometer............................................................. 35
3.3.4 Immunfluoreszenz.................................................................................................................... 35
4. LASERTOMOGRAPHISCHES SCANNEN (LTS)............................................... 36
4.1 Methode ................................................................................................................................................. 36
4.2 Anwendungsbereiche........................................................................................................................... 41
4.2.1 Netzhautscanning (Laser-Scanning Ophthalmoscope)...................................................... 41
4.2.2 Gewebe Laser-Mikroskopie.................................................................................................... 42
4.2.3 Bodyscanning ........................................................................................................................... 43
5. OPTISCHE KOHÄRENZTOMOGRAPHIE (OCT) ............................................... 45
5.1 Physikalische Grundlagen ................................................................................................................... 45
5.1.1 Elektromagnetische Wellen, Intensität, Interferenz ............................................................ 45
5.1.2 Michelson-Interferometer........................................................................................................ 47
5.1.3 Lichtquellen kurzer Kohärenzlänge, Auflösung ................................................................... 48
5.2 Methode ................................................................................................................................................. 50
5.3 Anwendungsbereiche........................................................................................................................... 53
5.3.1 Ophthalmologie ........................................................................................................................ 53
5.3.2 Dermatologie ............................................................................................................................ 54
5.3.3 Urologie und HNO-Heilkunde................................................................................................. 55
5.3.4 Zahnheilkunde .......................................................................................................................... 55
5.4 Vor- und Nachteile der OCT................................................................................................................ 56
6. RESUME - PERSPEKTIVE ................................................................................. 57
7. QUELLEN- UND LITERATURVERZEICHNIS .................................................... 58
Hauptseminar Experimentalphysik SS 2006
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
1. Einleitung / Motivation
Die Medizin ist stets auf der Suche nach nicht-invasiven Verfahren zur möglichst frühzeitigen
Diagnose von Krankheiten. Diese Verfahren sollten zum Einen zuverlässig Informationen
über das Untersuchungsobjekt liefern und zum Anderen möglichst unproblematisch sein. D.h.
der Patient sollte in möglichst kurzer Zeit möglichst unkompliziert untersucht werden können.
Hierbei können unnatürliche, kohärente Lichtquellen eine nützliche Hilfe sein. Solche sind
insbesondere der Laser, welcher sich aufgrund einiger Eigenschaften sehr gut für einige Anwendungen eignet:
- scharfe Bündelung
Der Laser ist aufgrund der scharfen Bündelung des Strahls für Vermessungs- und
Scannverfahren gut geeignet (z.B. Lasertomographisches Scannen).
- räumliche und zeitliche Kohärenz
Durch die hohe Kohärenz der Laserstrahlung ist die Bestimmung geometrischer sehr
geringer Längenunterschiede in der Interferometrie möglich (z.B. Optische Kohärenztomographie (nutzt hohe räumliche Kohärenz, allerdings gewollt kurze Kohärenzlängen modifizierter Laser))
- Monochromasie
Da ein Laser sehr monochromatisch ist, können gezielte Anregungen im zu untersuchenden Gewebe gemacht werden. Durch die Analyse der vom Gewebe wieder ausgesandten Fluoreszenzstrahlung können Aussagen über dessen Art gemacht werden (laserinduzierte Fluoreszenz)
- hohe Energiedichte
Die hohe Energiedichte erlaubt es den Laser über die Diagnostik hinaus auch in der
Therapie z.B. als Schneidewerkzeug zum Entfernen von u. a. Tumoren oder als
Schweißwerkzeug zum Anschweißen einer losgelösten Netzhaut einzusetzen.
Seit einigen Jahren gibt es Verfahren, die dank dieser Lichtquelle dem Patienten unangenehme Eingriffe, die Risiken und Nebenwirkungen haben, ersparen. In diesem Vortrag werden
drei unterschiedliche Verfahren dargestellt und die zugrunde liegende Physik sowie Anwendungsgebiete erläutert:
Laserfluoreszenzspektroskopie
Lasertomographisches Scannen
Optische Kohärenztomographie
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
2 Laser
2.1 Was ist ein Laser?
Das Wort Laser ist ein Akronym und steht für:
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
Das bedeutet:
Licht-Verstärkung durch stimulierte Emission von Strahlung
Der Laser ist eine Lichtquelle und wirkt als Oszillator und Verstärker für monochromatisches
sichtbares, infrarotes und ultraviolettes Licht. Er beruht auf dem gleichen Prinzip wie der im
Mikrowellenbereich arbeitende Maser (Microwave Amplification by Stimulated Emission of
Radiation). Man kann heutzutage Laser aller Wellenlängen zwischen 1µm und 3mm bauen,
wobei ihre Leistung zwischen 1µW und 1TW liegt. Auch die Maße eines Lasers variieren
sehr stark, so gibt es Halbleiterlaser, die kleiner als 1mm, und Fusionslaser, die größer als
100m sind.
ν
λ
Abb.: Frequenz- und Wellenlängenspektrum elektromagnetischer Strahlung [31]
Die Strahlung eines Lasers ist in der Regel in einem engen Strahl gebündelt, der sich nur aufgrund von Beugungseffekten geringfügig aufweitet (z.B. 600nm Laserstrahl von 2mm
Durchmesser auf 3cm Durchmesser in 100m Entfernung). Zudem ist sie unter Umständen
auch extrem monochromatisch.
Das Verhältnis von abgegebener Strahlungsleistung zu aufgewendeter elektrischer Leistung
ist der Wirkungsgrad eines Lasers und liegt häufig bei unter 0,1% (es gibt aber auch Laser mit
Wirkungsgraden bis zu 40%). Obwohl die Ausgangsleistung vieler Laser sehr gering ist (z.B.
1mW beim He-Ne-Laser), erreicht man aufgrund der starken Fokussierung sehr hohe Strahlungsintensitäten (z.B. 1GW/cm2 = 1TW/m2). Diese können bei gepulsten Lasern kurzzeitig
Werte von 1019 W/m2 erreichen. Die entsprechenden elektrischen Felder haben dann Stärken
von etwa 60 MV/m bzw. 60 GV/m beim gepulsten Laser.
Das Licht des Lasers entsteht in der Regel durch Übergänge von Elektronen aus energetisch
angeregten Atomzuständen, die durch eine Lichtwelle geeigneter Frequenz stimuliert bzw.
induziert werden, während konventionelle Lichtquellen Licht nur durch spontane (zeitlich und
räumlich unkorrelierte Übergänge aussenden. Beim Laser überlagert sich das erzeugte Licht
mit der erregenden Lichtwelle phasengleich, mit gleicher Polarisation und in gleicher Richtung. Die Lichtwelle wird somit kohärent verstärkt. Dieses ist allerdings nur dann möglich,
wenn mehr Atome im angeregten, als im Grundzustand vorliegen, da dann die induzierte EHauptseminar Experimentalphysik SS 2006
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
mission gegenüber der Absorption überwiegt. Dieser Zustand wird als Besetzungsinversion
bezeichnet. Bei zwei Niveau-Systemen ist dieses nicht möglich. Hier ist die Wahrscheinlichkeit der Emission genauso groß wie die der Absorption, so dass sich höchstens genauso viele
Atome im angeregten Zustand befinden, wie im Grundzustand. Das sog. Lasermedium hat
somit also mindestens drei Niveaus. Die Anregung des Lasermediums geschieht durch das
sog. Pumpen.
2.2 Elektromagnetische Strahlung
Ebenso wie Mikrowellen, Radiowellen, Röntgen- und γ-Strahlung ist Licht eine elektromagnetische Welle. Auch das Laserlicht ist im gesamten Wellenlängenbereich von 1µm bis
3mm eine elektromagnetische Welle, deren elektrische und magnetische Felder E und B durch
die Maxwell-Gleichungen (im Vakuum) beschrieben werden:
()
()
r
r ρ
div E = ∇ ⋅ E =
r
r
div B = ∇ ⋅ B = 0
ε0
()
()
r
r 1 r&
r
rot B = ∇ × B = 2 E + µ 0 j
c
r
r
r&
rot E = ∇ × E = − B
Aus den Maxwell-Gleichungen folgen die Wellengleichungen:
r
r
r&
rot E = ∇ × E = − B
|⋅ rot
r
r
r&
rot rot E = ∇ × ∇ × E = rot − B
⇒
()
( ( ))
(
( )
)
(
Und die rechte Seite ist:
) ( )
r
r r
r
∇ × ∇ × E = ∇{
∇E − E (∆ ) = ∇(ρ ε 0 ) + ∆E
Mit der „bac-cab“– Regel ergibt die linke Seite:
ρ
( )
(
)
(
)
ε0
r&
r
r
rot − B = ∇ × − ∂∂t B = − ∂∂t ∇ × B = − ∂∂t
12
3r
r
1
c2
(
1 ∂
c 2 ∂t
r
r
E + µ0 j
)
&
E + µ0 j
Für ρ = j = 0 gehen die Gleichungen über in:
r ρ =0 r
∇( ε 0 ) + ∆E = ∆E
−
ρ
r
∆E = − c12
⇒
∂2
∂t 2
r
E
⇔
∂
∂t
(
1 ∂
c 2 ∂t
)
r
r
r j =0
E + µ 0 j = − ∂∂t
(
1 ∂
c 2 ∂t
)
r
E = − c12
∂2
∂t 2
r
E
r
&r&
∆E + c12 E = 0
Analog folgt die Wellengleichung für das magnetische Feld B:
()
r
r 1 r&
r
rot B = ∇ × B = 2 E + µ 0 j
|⋅ rot
c
r
r
r
r
1 r&
1 r&
⇒
rot rot B = ∇ × ∇ × B = rot 2 E + µ 0 j = ∇ × 2 E + µ 0 j
c
c
r
r r
r
Mit der „bac-cab“– Regel ergibt die linke Seite:
∇ × ∇ × B = ∇{
∇B − B(∆ ) = ∆B
0
r
r
r
r
r
r
2
1 ∂
1 ∂
Und die rechte Seite ist:
∇ × c 2 ∂t E + µ 0 j = c 2 ∂t ∇ × E + µ 0 (∇ × j ) = − c12 ∂∂t 2 B + µ 0 (∇ × j )
123
r
( ( ))
(
)
(
(
)
(
) ( )
)
− ∂∂t B
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
r
−
Für ρ = j = 0 geht die Gleichungen über in:
⇒
r
∆B = − c12
∂2
∂t 2
r
B
⇔
1 ∂2
c 2 ∂t 2
r
r j =0
B + µ 0 (∇ × j ) = − c12
∂2
∂t 2
r
B
r
&r&
∆B + c12 B = 0
Die Wellengleichungen werden durch die Gleichungen ebener Wellen gelöst:
rr
rr
r r
r
r r
r
E (r , t ) = E 0 ⋅ e i (kr −ωt )
und
B(r , t ) = B0 ⋅ e i (kr −ωt )
Hierbei sind E0 und B0 die Amplituden, k⋅r-ωt ist die Phase. k ist der Wellenvektor und ω die
Kreisfrequenz. Durch Einsetzen in die Maxwellgleichungen lässt sich die Transversalität der
elektromagnetischen Wellen zeigen:
r ρ ρ =0
∇⋅E =
=0
ε0
r
∇⋅B = 0
rr
rr
r r
r r
r
∇ ⋅ E 0 ⋅ e i (kr −ωt ) = ik ⋅ E 0 ⋅ e i (kr −ωt ) = ik ⋅ E = 0
⇒
⇒
rr
rr
r r
r r
r
∇ ⋅ B0 ⋅ e i (k r −ωt ) = ik ⋅ B0 ⋅ e i (kr −ωt ) = ik ⋅ B = 0
⇒
r r
k ⊥E
⇒
r r
k ⊥B
D.h. das elektrische und das magnetische Feld oszillieren senkrecht zueinander senkrecht zur
Ausbreitungsrichtung der Welle, welche durch den Wellenvektor k beschrieben wird.
k
B
Abb.: Momentanbild einer Elektromagnetischen Welle, die sich in x-Richtung ausbreitet [N9]
2.3 Kohärenz
Die Fähigkeit unterschiedlicher Wellen stationäre Interferenzerscheinungen hervorzurufen
wird - abgeleitet vom lateinischen cohaerere1 - mit Kohärenz bezeichnet. Anders ausgedrückt:
Zwei oder mehrere Wellen sind genau dann kohärent, wenn sie zeitlich unveränderliche Interferenzphänomene erzeugen können. Dazu ist eine zeitlich konstante Phasendifferenz der Wellen nötig.
rr
r r
r
r
E1 (r , t ) = E 01 ⋅ e i (kr −ωt ) = E 01 ⋅ e i (ϕ )
rr
r r
r
r
E (r , t ) = E ⋅ e i (k r −ωt + ∆ϕ ) = E ⋅ e i (ϕ + ∆ϕ )
2
02
02
Bei inkohärentem Licht addieren sich in der Regel die Intensitäten zweier unterschiedlicher
Lichtquellen, die an der gleichen Stelle auftreffen:
I = I1 + I 2
1
cohaerere = zusammenhängen
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Bei kohärentem Licht hingegen lassen sich Interferenzen zweier elektromagnetischer Wellen
mit gleicher Wellenlänge λ = c / ν, Phasendifferenz ∆φ und Intensitäten I1 und I2 beobachten.
Die Intensität an einem Ort ist dann:
s
I = I 1 + I 2 + 2 I 1 I 2 cos 2π + ∆ϕ
λ
Hierbei wird der zusätzliche Term als Interferenz- oder Modulationsterm bezeichnet. s ist die
Wegdifferenz zwischen beiden Wellen (siehe auch 5.1).
Man unterscheidet zwischen zeitlicher und räumlicher Kohärenz.
1.) zeitliche Kohärenz
Ein Maß für die zeitliche Kohärenz elektromagnetischer Wellen ist die Länge eines Wellenzuges, die sog. Kohärenzlänge Lc. Die Kohärenzlänge ist definiert als maximaler Wellenlängenunterschied smax, bei dem man den Modulationsterm noch beobachten kann. Da die Geschwindigkeit der elektromagnetischen Welle im Vakuum die Lichtgeschwindigkeit c ist,
lässt sich aus der Kohärenzlänge die Kohärenzzeit berechnen:
c=
Lc
τc
⇔
τc =
Lc
c
Die Kohärenzzeit ist mit der spektralen Frequenzbreite ∆ν der elektromagnetischen Welle
verknüpft:
1
c
∆ν =
=
2πτ c 2πLc
Die Kohärenzlänge Lc der Strahlung einer Lichtquelle wird also umso größer, je kleiner die
spektrale Halbwertsbreite ∆ν der emittierten Strahlung ist. Damit ist die zeitliche Kohärenz
ein Maß für die spektrale Reinheit der elektromagnetischen Strahlung. Zur Veranschaulichung
sind in der folgenden Tabelle Kohärenzlänge Lc, Kohärenzzeit τc und Bandbreit ∆ν einiger
Strahlungsquellen im direkten Vergleich dargestellt:
Ne
NiederdruckCd
spektrallampen
Kr
He-Ne
Laser
λ=c/ν
in [µm]
Lc
in [m]
τc
in [s]
∆ν / ν
0,6328
0,6438
0,60578
0,6328
3⋅10-2
3⋅10-1
1⋅102
5⋅105
1⋅10-10
1⋅10-9
3⋅10-7
1,6⋅10-3
3,4⋅10-6
3,4⋅10-7
1,1⋅10-9
2,1⋅10-11
Tabelle: Vergleich der Kohärenz bekannter Spektrallampen mit dem He-Ne-Laser [6]
Abb.: Zeitliche Kohärenz [39]
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2.) räumliche Kohärenz
Unter räumlicher Kohärenz versteht man die Fähigkeit einer Lichtquelle zur gleichen Zeit an
verschiedenen Orten stationäre Interferenzphänomene hervorzurufen. Verdeutlichen kann
man dieses anhand des Young’schen Doppelspalt-Experimentes, mit welchem man die räumliche Kohärenz auch messen kann.
Abb.: Skizzen zur Verdeutlichung der räumlichen Kohärenz [3]
a) räumlich ausgedehnte Lichtquelle LQ, deren Licht auf einen Doppelspalt A fällt
b) Wegstrecken des Lichtes zu den beiden Spalten
Hierbei beleuchtet die Strahlung einer parallel zur Doppelspaltebene A in der Länge b ausgedehnte Lichtquelle die zwei Spalte S1 und S2. Die Intensität im Punkt P in der Beobachtungsebene B hängt zum Einen von der Wegdifferenz S1P-S2P und zum Anderen von der Phasendifferenz ∆φ in den beiden Punkten S1 und S2 ab. Die Phasen in den Punkten setzen sich aus
den Teilphasen von den einzelnen Flächenelementen df der Quelle unter Berücksichtigung der
verschiedenen Weglängen dfS1 bzw. dfS2 zusammen. Schwankt die Phasendifferenz ∆φ zwischen den Gesamtamplituden in S1 und S2 bei statistischer Emission der verschiedenen Quellenpunkte Q um mehr als π, so wird sich die Interferenzstruktur in Ebene B zeitlich wegmitteln. Dieses ist der Fall, wenn in Abb. b) die Wegdifferenz ∆SR = b⋅sin(θ/2) größer als λ/2
wird.
Die Bedingung für eine kohärente Beleuchtung der Spalte lautet also:
R ⋅ sin ( 2 ) =
θ
Mit
⇒
b⋅
⇒
b ⋅
2
d
2R
d
2
= b ⋅ sin ( 2 ) <
d2
R2
θ
λ
2
= F ⋅ dΩ < λ
⇔
sin ( 2 ) =
⇒
bd
R
θ
∆s = b ⋅ sin (θ2 ) <
d
2R
<λ
2
Das bedeutet also, dass je größer die Fläche F = b2
der Lichtquelle ist, desto kleiner wird der Raumwinkel dΩ, innerhalb dessen die ausgesandte
Strahlung räumlich kohärent ist.
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Abb.: Räumliche Kohärenz [39]
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λ
2
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2.4 Absorption, spontane und induzierte Emission
Atome und Moleküle liegen in der Regel im stabilen Grundzustand, d.h. dem energetisch
günstigsten Zustand vor. Im Grundzustand können sie keine Energie abgeben. Jedes Atom
und Molekül besitzt jedoch weitere Zustände, deren Energien größer als die des Grundzustandes sind. Durch Zufuhr von Energie können die Atome und Moleküle in einen sog. angeregten Zustand übergehen. Diesen Vorgang nennt man Absorption, da die dazu notwendige Energie von anderen Teilchen kommt, insbesondere von freien Elektronen, oder Lichtquanten,
den sog. Photonen, welche von dem Atom oder dem Molekül absorbiert werden.
Absorption:
E
Ein Elektron im Grundzustand absorbiert ein Photon
mit der Energie hν und wird damit aus dem
Grundzustand E1 in einen energetisch höheren
(angeregten) Zustand E2 angehoben.
angeregter Zustand
E2
hν
E1
Grundzustand
Der umgekehrte Vorgang ist die Emission. Sie geschieht plötzlich und unkorreliert und wird
daher als spontane Emission bezeichnet. Hierzu muss sich das Atom oder das Molekül in einem angeregten Zustand befinden, um seine Energie in Form eines Photons wieder abzugeben:
E
Spontane Emission:
Ein Elektron im angeregten Zustand E2 fällt spontan
in einen energetisch tieferen Zustand (z.B. den
Grundzustand) E1 zurück und gibt die Energiedifferenz ∆E = E2 – E1 = hν in Form eines Photons
ab.
angeregter Zustand
E2
hν
E1
Grundzustand
1917 postulierte Einstein die induzierte Emission
von Licht, was die physikalische Grundlage für den Laser ist. Bei diesem Vorgang bleibt das
einfallende und induzierende Photon, anders als bei der Absorption erhalten, und regt das angeregte Atom oder Molekül zur Abregung an. Das emittierte Photon hat die gleiche Wellenlänge, Phase, Polarisation und Ausbreitungsrichtung wie das induzierende Photon und verstärkt dieses somit kohärent.
Induzierte Emission:
Das einfallende Photon der
Frequenz hν regt das das Elektron
zur Abregung an, welches bei dem
Übergang von E2 nach E1 ein in
allen Quantenzahlen dem induzierenden Photon entsprechendes
Photon aussendet.
E
angeregter Zustand
E2
hν
E1
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hν
hν
Grundzustand
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2.5 Lebensdauer, Ratengleichungen
Die Wahrscheinlichkeit der spontanen Emission, also die Wahrscheinlichkeit, dass pro Sekunde ein Photon von einem angeregten Atom oder Molekül beim Übergang vom Energieniveau j nach i spontan emittiert wird, wird durch den sog. Einsteinkoeffizienten Aj→i = Aji beschrieben.
Ist das Energieniveau Ej mit der Besetzungszahl Nj besetzt, so ist die Abnahme der Besetzungszahl dNj pro Zeitintervall dt gegeben durch:
dN j = − A ji ⋅ N j ⋅ dt
Durch Trennung der Variablen und anschließende Integration folgt die Gleichung für die Besetzungsdichte in Abhängigkeit von der Zeit und der anfänglichen Besetzungszahl Nj0 bei t=0:
Nj
⇒
∫
N j0
Nj
ln
N
j0
t
1 ~
~
~ dN j = − ∫ A ji ⋅ d t
Nj
0
⇒
= − A ji ⋅ t
⇒
N j = N j0 ⋅ e
− A ji ⋅t
Die mittlere Lebensdauer τ0 des angeregten Zustandes Nj ist definiert als der Kehrwert der
Summe aller Übergangswahrscheinlichkeiten von diesem Zustand aus:
τ0 =
1
∑ A ji
Die oben stehende Gleichung wird Ratengleichung genannt und in der Regel in folgender
Form geschrieben:
dN j
−
= A ji ⋅ N j
dt
So kann man für jedes Energieniveau eine Ratengleichung sowohl für die Emission, als auch
für die Absorption formulieren. Bei einem durch ein Strahlungsfeld hervorgerufenen, also
induzierten Übergang (Absorption oder Emission) ist die Wahrscheinlichkeit für den Übergang auch stark von der spektralen Energiedichte ρ(ν) des Strahlungsfeldes abhängig und
wird daher nicht mit dem Einsteinkoeffizienten Aji, sondern mit ρ(ν)⋅Bij beschrieben:
−
dN j
dt
= ρ (ν )B ji ⋅ N j
Bij ist auch hier eine Konstante, welche die Wahrscheinlichkeit für den Prozess beschreibt.
In einem vereinfachten Modell zur Beschreibung der Vorgänge Emission und Absorption von
Licht haben viele gleichartige Atome Elektronen in nur zwei (nicht entarteten) Zuständen. Im
Grundzustand haben sie die Energie E1 und im angeregten Zustand die Energie E2. Ist N1 nun
die Zahl der Atome im Grundzustand und N2 die Zahl der Atome im angeregten Zustand und
trifft eine Lichtwelle mit der Frequenz
(E − E1 )
ν 12 = 2
h
und der spektralen Energiedichte ρ(ν) auf die Atome, so wird diese z. T. absorbiert. Bei der
Absorption gehen die Elektronen aus dem Grundzustand E1 in den angeregten Zustand E2
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
über, da die Lichtwelle genau die entsprechende Energie E = hν12 = E2 - E1 besitzt. Pro Zeiteinheit ist die Anzahl der angeregten Atome dabei
−
dN 1
= N 1 ρ (ν )B12 .
dt
In dieser sog. Ratengleichung ist B12 eine Konstante, die die Wahrscheinlichkeit für den Absorptionsprozess, also den Übergang der Atome von 1 nach 2 angibt.
In der gleichen Zeit finden umgekehrt aber auch Emissionsprozesse statt, die z. T. spontan
sind, und von der endlichen Lebensdauer der angeregten Zustände her rühren. Nach Einstein
folgt aus der mikroskopischen Umkehrbarkeit des Absorptionsprozesses, dass auch Übergänge von 2 nach 1 durch die einlaufende Lichtwelle induziert werden. Die Anzahl der Atome,
die pro Zeiteinheit in den Grundzustand übergehen, ist damit:
−
dN 2
= N 2 ( A21 + ρ (ν )B21 ) .
dt
A21 ist hier die Konstante, welche die Wahrscheinlichkeit für die spontane, und B21 die Konstante, welche die Wahrscheinlichkeit für die induzierte Emission angeben.
Im thermischen Gleichgewicht der Atome mit der Strahlung sind die sog. Besetzungszahlen
N1 und N2 zeitlich konstant, es finden also genauso viele Emissions- wie Absorptionsprozesse
statt. Das Verhältnis N2/N1 ist dabei durch den Boltzmann-Faktor gegeben:
hν
N2
.
= exp −
N1
k BT
E2
E
T0 < T2 < T3
T0 = 0K
T4 = ∞
T2 < T3 < T4
E1
Abb.: Anzahl der Atome eines 2-Niveausystems im angeregten und im Grundzustand bei
unterschiedlichen Temperaturen gemäß der Boltzmann-Verteilung
Da im thermischen Gleichgewicht
dN
dN
− 1 = − 2 ist, gilt für die spektrale Energiedichte ρ(ν):
dt
dt
−
⇔
1
⇔
e
hν
−
k BT
dN 1
dN 2
= N 1 ρ (ν )B12 = −
= N 2 ( A21 + ρ (ν )B21 )
dt
dt
hν
ρ (ν )B12
N
N2
= 2
mit
= exp −
( A21 + ρ (ν )B21 ) N1
N1
k BT
( A + ρ (ν )B21 ) = A21
= 21
ρ (ν )B12
ρ (ν )B12
⇔
B
+ 21
B12
A21
ρ (ν ) =
B12 ⋅ e
hν
k BT
⇔
B12 ⋅ e
hν
− k T
B
−
B21
A
= 21
1
ρ (ν )
(spektrale Energiedichte)
− B21
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Die Koeffizienten A und B lassen sich nun noch durch den Vergleich mit der Plankschen
Strahlungsformel bestimmen:
h ⋅ c2
1
E S (λ , T ) = 2π 5
(Emissionsvermögen);
h⋅c
λ
e λ ⋅k BT − 1
mit c = λ ⋅ ν ⇔ λ = c / ν ergibt sich:
A21 =
8πhν 3
B21
c3
und
B12 = B21 .
Das Zahlenverhältnis von induzierten zu spontanen Emissionsprozessen thermischer Strahler
ergibt sich somit zu:
ρ (ν )B21
1
= hν
.
A21
e k BT − 1
Im sichtbaren Bereich des Spektrums ist dieses Verhältnis sehr klein (10-5 für T = 2000K und
λ = 600nm), was bedeutet, dass dort thermische Strahler wie Glühbirnen fast nur durch spontane Emissionen Licht abgeben. Zudem ist bei thermischen Strahlern auch nur ein sehr geringer Bruchteil der Atome im angeregten Zustand (N2/N1 ≈ 10-5), und somit die Zahl der Absorptionsprozesse deutlich höher, als die der induzierten Emission. Da (N1 – N2)ρ(ν)B12 also
positiv ist, wird die erregende Lichtwelle stets geschwächt. Um die Lichtwelle durch induzierte Emission zu verstärken, muss N2 > N1 sein, was nur bei der sog. Besetzungsinversion möglich ist.
2.6 Besetzungsinversion, Lasermedium / aktives Medium
Um eine Besetzungsinversion, also ein überbesetztes, angeregtes Niveau zu realisieren, ist
also ein System nötig, das aus mindestens drei Niveaus besteht. Dieses System ist das sog.
Lasermedium. Dabei eignet sich noch lange nicht jedes System mit mehr als zwei Niveaus
zum Bau eines Lasers, da eine Besetzungsinversion nur dann möglich ist, wenn ein mittleres
Niveau metastabil ist und Atome sich somit länger in diesem Zustand, als im angeregten Zustand verbleiben.
3-Niveau-Laser:
E
angeregter Zustand
E3
E2
hν
E1
Grundzustand
Zur Erzeugung von Besetzungsinversionen sind
zudem nicht nur zwei, sondern mindestens drei
Energieniveaus E3 > E2 > E1 notwendig. Die
Pumpenergie bewirkt dabei einen Übergang von 1
nach 3, wobei die Inversion N3 > N1 erreicht wird,
wenn dieser Übergang optisch verboten ist (nach
den Auswahlregeln für Dipolstrahlung). In diesem
Fall kann das System nur über den Zustand 2 in
den Grundzustand 1 zurückkehren. Durch einen
strahlungslosen Übergang von 3 nach 2 (mit
kleiner Energiedifferenz) ist dann auch eine Besetzungsinversion der Zustände 2 und 1 möglich,
wobei der Übergang von 2 nach 1 als LaserÜbergang fungiert.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
4-Niveau-Laser:
E
angeregter Zustand
E4
E3
hν
E2
Grundzustand
Das Strahlungsfeld ρ passt nur genau auf den
Übergang 1 → 4, daher werden nicht auch die
anderen Niveaus angeregt.
Der 4-Niveau-Laser funktioniert ähnlich wie der 3
Niveau Laser, nur mit 4 anstelle von 3 Niveaus.
Das „vierte“ Niveau liegt dabei zwischen dem
überbesetzten Laser- und dem Grundzustand, so
dass die Elektronen beim Laserübergang in dieses
Niveau übergehen und erst von dort aus in den
Grundzustand zurückkehren. Von dort aus werden
sie dann wieder in das Niveau E4 angeregt.
E1
Als Lasermedium kommen viele unterschiedliche Substanzen in Frage. Sie liegen sogar in
völlig unterschiedlichen Aggregatzuständen vor.
Zum Beispiel:
Lasertyp
Lasermedium
Aggregatzustand
He-Ne-Laser
Farbstoff(Dye-)laser
Rubin-, Nd:YAG-, Titan-Saphir-Laser
(Helium,) Neon
Farbstoffmoleküle
Kristalle (Rubin, Nd:YAG,
Titan-Saphir)
gasförmig
flüssig
fest
2.7 Pumpen
Um durch induzierte Emission Lichtverstärkung zu bewirken, muss dem Lasermedium Energie (die sog. Pumpenergie) zugeführt werden. Während bei Flüssigkeiten und Festkörpern
diese Energie durch Licht eingestrahlt wird, erfolgt die Zufuhr von Energie bei Gaslasern
durch Elektronenstöße in einer elektrischen Gasentladung.
Bei einem 3-Niveau-Laser bewirkt die Pumpenergie den Übergang von 1 nach 3, bei einem 4
Niveaulaser den Übergang von 1 nach 4. Der Übergang in andere Niveaus findet nicht statt,
da die Pumpenergie genau der Differenz
E Pump = E3 bzw. 4 − E1
entspricht.
Der Vorgang der Zuführung der Pumpenergie wird mit Pumpen bezeichnet.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Pumpprozesse bei unterschiedlichen Lasern (Übersicht):
Gaslaser
Stoßanregung der Atome, Ionen oder Moleküle in Gasen und Plasmen
Festkörper- und
Farbstofflaser
Anregung durch externe, elektromagnetische Strahlung, d.h. durch sog. optisches Pumpen
Halbleiterlaser
Anregung durch Stromdurchgang, d.h. Ladungsträgerinjektion in Halbleitern
chemische Laser
Chemische Reaktionen
2.8 Linienbreite
Die von einem Lasermedium emittierten Photonen sind nicht 100% monochromatisch. Drei
mögliche Prozesse verbreitern das Emissionsprofil:
Natürliche Linienbreite:
Aufgrund der Heisenbergschen Energie-Zeit-Unschärferelation ist die Energie bei einer Lebensdauer τ des Zustandes nur auf ∆E = h / 2πτ genau bestimmbar. Daraus resultiert die Unschärfe der entsprechenden Frequenz ∆ν = ∆E / h = 1 / 2πτ und somit ein verbreitertes Emissionsprofil.
Stoß- / Druckverbreiterung:
Bei manchen Lasermedien ist es möglich, dass durch Stöße strahlungslos Energie den Molekülen entzogen oder hinzugefügt wird. Dadurch verkleinert bzw. vergrößert sich die Energiedifferenz beim Laserübergang und es kommt zur Aufweitung des Emissionsprofils. Die Energiedifferenz wird in Rotations-, Vibrations- oder Translationsenergie umgewandelt.
Dopplerverbreiterung:
Da sich die Atome bzw. Moleküle des Lasermediums je nach Aggregatzustand und Temperatur mehr oder weniger in Bewegung befinden geschieht gemäß dem Doppler-Effekt eine Frequenzerhöhung bei einer Relativbewegung in Emissionsrichtung und eine Frequenzerniedrigung bei entgegengesetzter Bewegung.
2.9 Laser-Resonator, Lasermoden
In einem Laser wird das Licht durch eine Anordnung zweier Spiegel immer wieder durch das
Lasermedium (das Gebiet, in dem Besetzungsinversion herrscht) geleitet. Von dem lateinischen Wort „resonare“ (= zurücksingen, hallen) abgeleitet, nennt man dieses einen optischen
Resonator. Im Resonator wird das Licht beim Hin- und Herlaufen zwischen beiden Spiegeln
immer weiter verstärkt, bis der Leistungszuwachs innerhalb des Systems durch die Abnahme
der Besetzungsinversion und die immer stärker ansteigenden Verluste ausgeglichen wird.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Um das Laserlicht zur Anwendung aus dem Resonator auszukoppeln, ist mindestens einer der
beiden Spiegel teilweise durchlässig. Dabei beschreibt man die Durchlässigkeit der Spiegel
mit dem Reflexionskoeffizienten R für die Intensität.
R = 1 = 100% :
R = 0 = 0% :
totale Reflexion / keine Transmission
totale Transmission / keine Reflexion
(vorausgesetzt es gibt im Spiegel keine Absorption)
Wie oben bereits angesprochen, muss bei einem Umgang des Lichtstrahls durch den Resonator die Verstärkung die Verluste (inklusive der Auskopplung) mindestens kompensieren oder
sogar übertreffen. Somit liegt der Reflexionskoeffizient je nach Laser zwischen etwa 85% und
99%.
Hierbei ist die Geometrie der Spiegel keineswegs irrelevant. Sie entscheidet darüber, ob ein
Resonator optisch stabil oder instabil ist. Häufig wählt man konfokale Spiegel und erhält damit folgendes Strahlungsfeld:
Abb.: Strahlungsfeld eines konfokalen Resonators [6]
Abb.: Strahlungsfeld im Resonator [6]
Fabry-Pérot
Resonator
mit planaren
Spiegeln:
Hemisphärischer
Resonator:
Konfokaler
Resonator:
stabil
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instabil
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Lasermedien mit sehr hoher Verstärkung können auch mit nur einem Spiegel oder ganz ohne
Spiegel „lasern“ (Superstrahler, z.B. Stickstofflaser).
Mit dem Resonator lassen sich zudem einige Eigenschaften der Laserstrahlung einstellen:
1) Wellenlänge
Die Wellenlänge der Laserstrahlung hängt zunächst vor allem von dem benutzten Lasermedium ab. Gibt es in einem solchen Medium allerdings mehrere Laserübergänge (z.B.
He-Ne-Laser (vgl. 2.8 Abb. 2)), so lässt sich einer durch die Länge des Resonators auswählen:
Die Länge des Resonators L muss um eine Verstärkung zu bewirken einem ganzzahligen
Vielfachen der halben Laserwellenlänge entsprechen:
L = n⋅
λ
2
;
n = 1,2,3,...
Genau dann kann sich im Resonator eine stehende Welle ausbilden. Durch die Überlagerung der induzierten Wellen wird das Licht eben dieser einen Frequenz verstärkt.
Resonatorlänge L
Spiegel 1
Spiegel 2
λ/2
Auf ein und dieselbe Resonatorlänge L passen mehrere stehende Wellen, deren Wellenlänge dann aber entsprechend unterschiedlich ist.
Resonatorlänge L
Spiegel 1
Spiegel 2
λ/2
λ/2
Diese unterschiedlichen stehenden Wellen nennt man Resonator-Moden.
Da die spektrale Bandbreite ∆ν bei einem atomaren Übergang deutlich breiter als der Modenabstand ist, schwingt der Laser in verschiedenen Moden:
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
I
I
ν
Profil eines spontanen atomaren Übergangs
ν
Resonatormoden
Ein Laser hat demnach in der Regel ein Modenspektrum, das wie folgt aussieht:
I
Laserschwelle
(siehe unten)
γthr
ν
Durch interferometrische Bauteile wie sog. Etalons lässt sich ein Monomodenbetrieb, also
ein Betrieb, bei dem der Laser nur die Wellenlänge einer Mode emittiert bewerkstelligen.
2) Polarisation
Zwischen den beiden Spiegeln des Resonators gibt es die Möglichkeit das Lasermedium
durch einen Glaszylinder räumlich zu begrenzen. Durch kippen der Fenster im BrewsterWinkel lässt sich das Laserlicht linear polarisieren, da, wenn ein Lichtstrahl unter dem
Brewster- oder auch Polarisationswinkel auf eine Grenzfläche trifft, der reflektierte Teil
vollständig linear polarisiert ist. In diesem Fall bilden reflektierter und transmittierter
Strahl einen rechten Winkel.
Spiegel 1
Spiegel 2
Brewsterfenster
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
2.10 Laserschwelle
Da primär durch Auskopplung, aber auch durch andere Prozesse Verluste entstehen, beginnt
ein Laser erst ab einer bestimmten Intensität zu arbeiten, bei der diese Verluste kompensiert
werden. Diese Intensität nennt man Laserschwelle. Berücksichtigt man die Verluste durch
Auskopplung in den Reflektionskonstanten RSpiegel1 und RSpiegl2, sowie sämtliche andere Verluste in der Verlustkonstanten α(n), so ist die Intensität nach einem Umlauf in einem Resonator der Länge L gegeben durch:
Iν (2 L ) = Iν (0 ) ⋅ e (γ (ν )−α (ν ))2 L ⋅ RSpiegel1 ⋅ RSpiegel1
γ(ν) ist hierbei der Verstärkungsfaktor. Da die Verstärkung die Verluste kompensieren muss,
also die Intensität nach einem Umlauf gleich geblieben sein muss, gilt:
Iν (2 L ) ≥ Iν (0)
e (γ (ν )−α (ν ))2 L ⋅ RSpiegel1 ⋅ RSpiegel1 ≥ 1
⇔
Da α, RSpiegel1 und RSpiegel2 konstant sind, ist diese Bedingung nur von γ abhängig und da der
Laser ab dem, diese Gleichung erfüllenden, Faktor γ zu arbeiten beginnt, bezeichnet man diesen Wert mit γthr als Laserschwelle:
1
γ thr (ν ) = α (ν ) −
⋅ ln (RSpiegel1 ⋅ RSpiegel1 )
2L
2.11 Laser-Systeme, Helium-Neon-Gas-Laser
Es gibt inzwischen viele unterschiedliche Lasersysteme. Nachdem Theodore Maiman 1960
den ersten Laser (einen Rubin-Festkörperlaser) gebaut hatte, folgten zunächst Gaslaser
(Stickstoff-, CO2-Laser, He-Ne-Laser) und anschließend Farbstofflaser, bei denen das laseraktive Medium flüssig ist. In der folgenden Zeit wurde der spektrale Nutzbereich durch die Weiterentwicklung von Kristalltechnologien stark erweitert und so kamen durchstimmbare und
breitbandige Laser (z.B. Titan-Saphir-Laser) auf den Markt. Neben den kontinuierlichen
(Dauerstrich oder englisch continious-wave) Lasern wurden Anfang der 80er Jahren Ultakurzpulslaser (Impulsdauern von Pico- und Femtosekunden) und Ende der 80er Jahre Halbleiter-Laserdioden realisiert. In den 90er Jahren folgten Scheiben- und Faserlaser, die aufgrund
neuer Pumpgeometrien sehr hohe Laserleistungen (bis 20kW) erzielen.
Einsatz in der Medizin:
In der Medizin kommen viele verschiedene Lasersysteme sowohl in der Diagnostik, als auch
in der Therapie zum Einsatz. Die folgende Tabelle zeigt einige Laser mit ihren Einsatzbereichen in der Medizin:
Laser
Lasertyp
Anwendung in der Medizin
Excimer-Laser:
HL-Laser:
Argon-Laser:
He-Ne-Laser:
Titan-Saphir-Laser:
Nd: YAG
Farbstofflaser
Halbleiterlaser
Plasmalaser
Gaslaser
Festkörperlaser
Festkörperlaser
Hornhautoperationen
Hornhautscanner, Bodyscanner
Netzhautanheftung, Cytometrie
Durchflusscytometrie, Konfokalmikroskopie
unterschiedliche Operationen
Operationen am Auge
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Dabei emittieren die meisten Laser bei festen Wellenlängen gemäß der Laserübergänge des
jeweiligen Mediums. Ein paar Beispiele sind im folgenden Bild zusammen mit der Kurve der
Empfindlichkeit des menschlichen Auges (weiß) gezeigt:
Abb.: Wellenlängen unterschiedlicher Laser und Laserübergänge [33]
He-Ne-Laser
Einer der gängigsten Laser ist der Helium-Neon-Gas-Laser, welcher aufgrund der chemischen
Symbole für die Elemente Helium (He) und Neon (Ne) kurz nur He-Ne-Laser genannt wird.
Auch in der Medizin wird er bei unterschiedlichen Methoden (wie später gezeigt) angewendet. Er lässt sich gut zur Veranschaulichung der oben erklärten theoretischen Grundlagen verwenden:
Ein He-Ne-Laser ist grundsätzlich aus einem Glaszylinder aufgebaut, in dessen Inneren sich
unter vermindertem Druck das He-Ne-Gasgemisch befindet. In ihm findet auch die elektrische Entladung statt. An beiden Enden hat der Zylinder um den Brewster-Winkel gegen die
Zylinderachse gekippte Fenster. Somit kann dort nur Strahlung einer bestimmten Polarisationsrichtung reflexionsfrei austreten. Außerhalb des Zylinders liegen senkrecht zur Zylinderachse zwei Spiegel, zwischen denen die Strahlung so in sich reflektiert wird, dass sie den Zylinder vielfach durchläuft und bei jedem Durchgang Laserstrahlung induziert bzw. durch diese
kohärent verstärkt wird. Die Wellenlänge der sich hierbei ausbildenden stehenden Welle
hängt vom Abstand der Spiegel ab. Der Zylinder mit den Spiegeln stellt also einen Resonator
dar, der die Verstärkung und Emission in einem nur sehr schmalen Frequenzintervall (∆ν ≈
1Hz) bewirkt. Einer der beiden Spiegel ist zu einem sehr geringen Teil durchlässig, wodurch
die Laser-Strahlung kohärent und extrem monochromatisch in den Außenraum gelangt.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Abb.: Typischer Aufbau eines He-Ne-Lasers [8]
Beim He-Ne-Laser wird die Pumpenergie in der Gasentladung durch Elektronenstoß hauptsächlich den He-Atomen zugeführt, welche so vom Grundzustand in zwei metastabile Zustände mit großer Lebensdauer anhoben werden. Durch Stöße (sog. Stöße zweiter Art) wird
die Anregungsenergie der He-Atome auf die Ne-Atome übertragen, wobei für die Ne-Atome
eine Besetzungsinversion bestimmter Anregungsniveaus (Laserniveaus) gegenüber tiefer liegenden Energiezuständen (wie dem Grundzustand) erzeugt wird. Die Ne-Atome emittieren
dann Laserstrahlung im roten und infraroten Bereich des Spektrums (632,8; 1152 und
3391nm).
Abb.: Energieschema eines He-Ne-Lasers [8]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
3. Laser induzierte Fluoreszenz
In vielen Fällen lässt sich mit der Betrachtung einer Substanz oder eines Gewebes unter weißem Licht nicht erkennen, um was für eine Art Substanz oder Gewebe es sich handelt. In einigen Fällen hilft hier die Eigenschaft der Fluoreszenz mancher Moleküle, um diese oder Bereiche, an die sie gekoppelt sind, zu identifizieren.
Bei der laserinduzierten Fluoreszenz regt ein Laserstrahl die Moleküle in einen angeregten
Zustand an. Anders als beim Laser selber senden die Moleküle bei der Abregung nicht wieder
Licht der gleichen Wellenlänge aus, sondern etwas langwelligeres als das des Lasers.
3.1 Physikalische Grundlagen
3.1.1 Energieniveaus bei Molekülen
Ähnlich wie bei Atomen gibt es auch bei Molekülen nur diskrete Zustände (Energien) in denen sich das Molekül befinden kann. Diese sind jedoch komplexer, da zusätzlich zu den elektronischen Niveaus (wie beim Atom) noch vibratorisch und rotatorische Niveaus hinzukommen. Die Energieabstände zwischen elektronischen Zuständen sind am größten und liegen bei
einigen eV, die zugehörige Strahlung liegt somit im sichtbaren Bereich. Die Strahlung von
Schwingungsübergängen liegt mit etwa 3 bis 10µm im mittleren Infrarot. Die Energiedifferenzen sind bei Rotationsübergängen am geringsten. Die entsprechenden Wellenlängen sind
mit ca. 30 bis 150 µm im fernen Infrarot zu finden.
Elektronische Niveaus
Wie beim Atom besitzen Moleküle elektronische Niveaus, zwischen denen die Elektronen
durch Übergänge unter bestimmten Voraussetzungen wechseln können.
Die Energie eines elektronischen Zustandes wird mit Eel.(i) bezeichnet:
E = E el (i )
Vibratorische Niveaus
Ein Molekül kann im Gegensatz zum Atom auch zu Schwingungen angeregt werden. Dabei
schwingen die Atome des Moleküls auf unterschiedliche Art und Weisen, je nach Art des Moleküls um den Gleichgewichtsabstand r0. Ein Hantelförmiges Molekül aus zwei Atomen stellt
damit in erster Näherung einen harmonischen Oszillator dar.
Die quantenmechanische Energie eines solchen ist:
E
1
E vib = hω ⋅ v +
2
Hierbei ist v die Vibrationsquantenzahl mit v = 0, 1, 2, …
Abb.: harmonischer Oszillator [2]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Reale Moleküle weichen aber z. T. stark von diesem Verhalten ab. Da sich die Atome aufgrund der immer stärker werdenden abstoßenden Coulombwechselwirkung nicht beliebig nah
kommen können, steigt das reale Potential für r → 0 zwar ebenso wie das Potential des harmonischen Oszillators steil an und geht gegen Unendlich, jedoch verliert auch die anziehende
Wechselwirkung ihre Wirkung, wenn die Atome sich zu weit von einander entfernen. Das
vibratorische Potential wird daher viel besser durch das sog. Morsepotential beschrieben:
E
(
E Morse = E 0 + E Dissoziation ⋅ 1 − e − a (r − r0 )
)
2
E0 ist die Nullpunktsenergie des Potentials, EDissoziation
die Dissoziationsenergie, r0 der Gleichgewichtsabstand
und a ein Parameter.
Mit Hilfe der Schrödingergleichung ergeben sich die
Energieniveaus dann zu:
r
1
h 2ω 2
E vib = hω ⋅ v + −
2 4 E Dissoziation
2
( )
1
⋅ v + + O v3
2
Abb.: Morsepotential mit diskreten Energieniveaus [2]
Rotatorische Niveaus
Für jeden einzelnen elektronischen Zustand gibt es eine solche vibratorische Potentialkurve
mit den entsprechenden vibratorischen Energieniveaus. Diese werden wiederum von mehreren rotatorischen Niveaus, die deutlich enger beieinander liegen, überlagert.
rˆ
J2
Die Rotationsenergie ist gegeben durch:
E rot =
2I
Hierbei ist I das Trägheitsmoment
I = µ ⋅ R2
mit der reduzierten Masse µ.
Der Drehimpuls ist gequantelt. Die Eigenwerte von J2 sind:
J ist die Drehimpulsquantenzahl:
J = 0, 1, 2, 3, …
rˆ
J2
→ J ( J + 1)h 2
Die quantenmechanisch Rotationsenergie eines Moleküls ist
damit:
J ( J + 1)h 2
E rot = E J =
2I
Abb.: Energieniveaus bei Molekülen
Den zwei elektronischen Energieniveaus sind die Vibrationsniveaus und
denen die Rotationsniveaus überlagert
[7]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Die Translationsenergie ist nicht gequantelt und wird daher im Termschema nicht dargestellt.
Während eines Übergangs kann sie als konstant angenommen werden.
Gesamtenergie
Die Gesamtenergie setzt sich nun aus allen drei Teilenergien zusammen:
1
h 2ω 2
EGes = E el (i ) + E vib + E rot = E el (i ) + hω ⋅ v + −
2 4 E Dissoziation
1 J ( J + 1)h 2
⋅v + +
2
2I
3.1.2 Optische Übergänge
Das Laserlicht ruft eine induzierte Absorption seiner elektromagnetischen Strahlung hervor,
wodurch die Moleküle von einem niedrigeren in ein höheres Energieniveau übergehen. Durch
strahlungslose Übergänge in ein tiefer gelegeneres Niveau verlieren sie einen Teil der gewonnen Energie wieder. Anschließend erfolgt ein optischer Übergang in das höchstliegende Niveau des elektronischen Grundzustandes, nicht aber in den Grundzustand selber. Bei diesem
Übergang gibt das Molekül einen Großteil seiner Energie in Form von elektromagnetischer
Strahlung wieder ab. Diese elektromagnetische Strahlung ist das Fluoreszenzlicht.
Welche Übergänge geschehen besagen u. a. die vom Atom her bekannten Auswahlregeln. Bei
Molekülen gilt:
∆v = ±1
D.h. es finden nur Übergänge zwischen benachbarten Schwingungsniveaus
statt. Dieses gilt streng genommen nur für den harmonischen Oszillator, bei
dem anharmonischen Potential sind mit abnehmender Wahrscheinlichkeit auch
∆v = ±2, ±3, … erlaubt.
∆S = 0
Ebenso wie beim Atom darf der Spin bei einem optischen Übergang nicht umklappen.
∆J = ±1
Der Drehimpuls darf sich ebenfalls nur um + oder -1 ändern.
Somit ist das Spektrum eines Moleküls viel linienreicher als das eines Atoms, da zu einer Änderung des elektronischen Zustand ein sog. Bandensystem gehört. Jede einzelnen Bande entspricht einem gleichzeitigen Schwingungsübergang beim elektronischen Übergang, und besteht wiederum aus einzelnen Spektrallinien, zu denen jeweils ein parallel zum elektronischen
Übergang und zum Schwingungsübergang stattfindender Rotationsübergang gehört.
3.1.3 Franck-Condon-Prinzip
Die Übergänge werden zudem durch das Franck-CondonPrinzip beschrieben. Dieses besagt, dass ein Übergang so
schnell geschieht, dass das Molekül seine momentanen
Atomabstände dabei nicht ändern kann. Im E(r)-Diagramm
sind die Übergänge daher stets senkrecht.
Mit anderen Worten bedeutet das, dass die wahrscheinlichsten Übergänge bei Kernabständen erfolgen, bei denen
die Aufenthaltswahrscheinlichkeit in den Schwingungszuständen am größten ist.
Abb.: Franck-Condon-Prinzip [30]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
3.1.4 Fluoreszenz
Bei der sog. Fluoreszenz wird ein Molekül im Grundzustand durch einfallende Strahlung in
einen energetisch höheren Zustand versetzt. Ein solches angeregtes Molekül kann auf verschiedene Arten die Energie wieder abgeben. Fluoreszierende Moleküle tun dieses auf eine
ganz bestimmte Art und Weise:
Zunächst wird ein Teil der gewonnen Energie innerhalb eines elektronischen Niveaus durch strahlungslose Übergänge in den vibratiorischen Grundzustand wieder
abgegeben. Anschließend folgt der
strahlende Übergang, bei welchem
das Molekül einen Großteil der
Energie wieder in Form von Strahlung abgibt. Diese ist jedoch nicht
so energiereich wie die anregende
Strahlung und somit langwelliger,
da zum Einen schon ein Teil der
Energie durch die strahlungslosen
Übergänge abgegeben wurde und
zum Anderen der strahlende Übergang nicht in den Grundzustand
zurückführt. Nach der Strahlungsabgabe befindet sich das Molekül
immer noch in einem angeregten,
aber schon im elektronischen
Grundzustand. Die weitere Abregung erfolgt wieder strahlungsfrei,
bis sich das Molekül wieder im
Grundzustand befindet. Da die
Wellenlänge der emittierten Fluoreszenzstrahlung für jedes Molekül charakteristisch ist, lassen sich anhand ihrer Moleküle voneinander unterscheiden.
Abb.: Fluoreszenzschema im E(r)Diagramm [6]
Die strahlungslose Energieabgabe kann bei einem Molekül auf mehrere Arten geschehen:
-
Durch Stöße kann Energie an die Umgebung abgegeben werden, während das Molekül im gleichen elektronischen Zustand verbleibt.
Auch strahlungslose Übergänge zwischen elektronischen Energieniveaus sind möglich. Sie erfolgen sehr schnell in 10-12s. Dieser Prozess wird mit internal conversion
bezeichnet.
Eine dritte Möglichkeit ist das sog. intersystem crossing, bei dem ein Molekül von einem Singulett- in einen Triplettzustand wechselt, was natürlich mit einer Umkehr des
Spins verbunden ist. Dieses ist optisch verboten und geschieht auch nur mit einer sehr
geringen Übergangswahrscheinlichkeit.
Die beiden zuletzt genannten Prozesse finden bei der Fluoreszenz nicht statt.
In den folgenden Bildern sind die Absorptions- und Emissionsbanden (mit entsprechendem
Wellenlängenmaximum) von drei Fluoreszenzmarkern sowie die Wellenlängen der anregenden Laserstrahlung gezeigt:
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Abb.: Fluoreszenzabsorptions- und –Emissionsprofil dreier handelsüblicher Fluoreszenzmolekülen mit jeweiligem Wellenlängenmaximum und den Wellenlängen der induzierenden Laser (jeweils oben im Bild) in nm [25]
DAPI: Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid
FITC: Fluoreszein Isothiocyanat
TRITC: Tetramethylrhodamin Isothiocyanat
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3.2 Methode
Die medizinisch genutzte laserinduzierte Fluoreszenz nutzt die Tatsache, dass große Biomoleküle z. T. selbst fluoreszieren oder zumindest eine fluoreszierende, chemische Gruppe durch
eine chemische Reaktion angehängt werden kann. Dadurch lassen sich die entsprechenden
Moleküle leicht mittels Fluoreszenz identifizieren.
Wie später unter 3.3 in den Anwendungen zu sehen ist dieses Verfahren sehr vielfältig. Da
sich die Methoden im Großen und Ganzen aber ähneln wird hier exemplarisch nur die Durchflusscytometrie erläutert.
Durchflusscytometrie (Flow Cytometry / FACS):
Die Durchflusscytometrie wird in der Literatur z.T. auch mit FACS (Fluorescent Activated
Cell Sorting) bezeichnet, was ein registriertes Markenzeichen der Firma Becton-Dickinson ist,
und wie „Tempo“ anstelle von Taschentuch genutzt wird. Der englische Name „Flow Cytometry“ bezeichnet die relativ junge Labortechnik der Unterscheidung unterschiedlicher Teilchen oder Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz.
Hierbei werden die unterschiedlichen Eigenschaften der Teilchen / Zellen untersucht,
während sie langsam hintereinander durch
eine dünne, meist gläserne Messkammer, die
sog. Flusszelle (engl.: „Flow Cell“) fließen. In
dieser Messkammer werden die Teilchen /
Zellen seitlich von einem Laserstrahl zur
Fluoreszenz angeregt. Das emittierte Licht
wird anschießend analysiert und die Zellen /
Teilchen gegebenenfalls durch CoulombWechselwirkung sortiert.
Abb.: Prinzipskizze eines
schließender Sortierung
[25] und handelsübliche
itische Fluoreszenzfilter
[29]
Flow Cytometers mit an(rechts)
dichro(unten)
Die Geräte zur Erstellung durchflusscytometrischer Analysen heißen gemäß der Methode
Durchflusscytometer (engl.: Flow Cytometer) oder wie oben beschrieben „FACS-Geräte“
bzw. kurz „FACS“.
Abb. (links): Durchflusscytometer der Firma
Beckman-Coulter
mit
Computer
zur
Datenauswertung [23]
Abb. (rechts): Becton Dickinson FACSAria Sorting Flow Cytometer [27]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Am Anfang einer jeden Messung gelangt die eigentliche Probe durch die Probennadelspitze in
eine schneller als die Probe selbst fließende „Hüll-Flüssigkeit“. Die dadurch erfolgende Beschleunigung bewirkt, dass die Partikel einzeln, nacheinander in Fokus des Laserstrahls gelangen. Die resultierende Strahlgeschwindigkeit liegt bei etwa 1-10m/s. So gelangen 1001000 Teilchen pro Sekunde in den Strahl.
Abb. (links): Überführung der Probe in einzelne Partikel durch Beschleunigung
mittels
Hüllflüssigkeit [24]
Abb. (rechts): Messkammer eines Durchflusscytometers [23]
Die Teilchen / Zellen kommen von oben (grauer Pfeil) und fließen hintereinander durch die eigentliche Flusszelle (die Strecke innerhalb der Flusszelle ist durch einen grauen Strich gekennzeichnet). Dabei werden die
Zellen von einem Laser von der Seite bestrahlt (blau eingezeichnet). Die
Größe der Kammer beträgt etwa 4 cm x 7 cm.
Im Laserstrahl geschehen zwei Prozesse, welche die Identifizierung der Teilchen ermöglichen. Das ist zum Einen die Streuung, welche in Vorwärts- und in Seitwärtsstreuung unterteilt
wird, und zum Anderen die Fluoreszenz.
1.) Streulicht
Ein Teilchen, das in den Laserstrahl gelangt, verursacht eine Streuung des Laserlichtes. Dabei
wird umso mehr Licht gestreut, umso größer das Teilchen ist, und umso mehr Strukturen sich
in dessen Inneren befinden. Dabei wird das Licht in unterschiedliche Richtungen gestreut.
Daher wird das Streulicht in der Regel an zwei Stellen gemessen:
Abb.: Streulichtdetektion [23]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
a) Vorwärtsstreulicht (fast in Richtung des ursprünglichen Strahls)
(engl.: Forward Light Scatter oder Low Angle Scatter)
Das Vorwärtsstreulicht ist primär von der Größe der Teilchen abhängig; kleine Teilchen verursachen ein kleines, große Teilchen ein großes Vorwärtsstreulichtsignal.
Abb.: Vorwärtzsstreulichtdetektion [23]
b) Seitwärtsstreulicht (etwa im rechten Winkel zum ursprünglichen Strahl)
(engl.: Side Scatter, Orthogonal Scatter oder Right Angle Scatter)
Auch das Seitwärtsstreulicht hängt stark von der Größe der Teilchen ab. Zusätzlich ist
es aber auch sehr stark von dem Inhalt einer Zelle abhängig. So streut eine Zelle, in
der sich sehr viele Lysosomen2 befinden, das Licht deutlich stärker seitwärts, als eine
Zelle mit nur sehr wenigen Lysosomen. Da nach Anfärbung der weißen Blutkörperchen die Lysosomen unter einem Lichtmikroskop als körnige Strukturen sichtbar werden, spricht man bei Lysosomenreichen Zellen auch von „körnigen Zellen“. Diese
Körner in der Zelle nennt man Granula und die Körnigkeit einer Zelle Granularität.
„Körnige Zellen“ (Zellen mit hoher Granularität / vielen Körnern) zeigen im Durchflusscytometer also eine starke, weniger „körnige Zellen“ eine schwache
Seitwärtsstreuung.
Dieses lässt sich am Beispiel weißer Blutkörperchen verdeutlichen:
Lymphozyt
Monozyt
Neutrophiler Granulozyt
klein, kaum Granula
groß, kaum Granula
groß, Granula
Abb.: Weiße Blutkörperchen: Lymphozyt, Monozyt und Neutrophiler Granulozyt [23]
2
Lysosomen: kleine, Enzymspeichernde Bläschen
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Abb.: Seitwärtsstreulichtdetektion [23]
Die Streulicht-Messergebnisse werden der Anschaulichkeit halber in einer sog. Dot-Plot Graphik dargestellt. Hierzu trägt man auf der x-Achse die Intensität des Vorwärts- und auf der yAchse des Seitwärtsstreulicht auf. So lassen sich anhand von Anhäufungen Zellen, die ähnliche Streulichteigenschaften haben, erkennen.
Am rechts stehenden Beispiel Streulicht-DotPlot erkennt man deutlich Ansammlungen gleicher oder ähnlicher Zellen. Dabei entspricht die
grüne Ansammlung: Lymphozyten
(klein, kaum Granula) → wenig FSC, wenig SSC
blaue Ansammlung: Monozyten
(groß, kaum Granula) → viel FSC, wenig SSC
rote Ansammlung: Neutrophilen Granulozyten
(groß, viel Granula)
→ viel FSC, viel SSC
Ein realer Streulicht-Dot-Plot sieht dabei nicht wie der oben stehende, sondern wie in der Abbildung links gezeigt, aus. Jeder Punkt entspricht einem
gemessenen Ereignis, also in der Regel
einer Zelle. Die Farben werden den
Punkten erst bei der Auswertung zugeordnet und haben nichts mit der Farbe
des Streu- oder Fluoreszenzlichtes zu
tun.
Abb.: realer Streulicht-Dot-Plot (links) und
anschaulicher Streulicht-Dot-Plot (Punkte entsprechen Teilchen) (oben) [23]
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2.) Fluoreszenzlicht
Zusätzlich zur Streulichtanalyse, mit der man wie gezeigt weiße Blutkörperchen unterscheiden kann, kommt nun noch die Fluoreszenzlichtanalyse, die eine Untersuchung einer Vielzahl
von Merkmalen auf den Blutzellen erlaubt. Hierzu ist folgendes nötig:
Um eine Zelle mittels Fluoreszenz auf ein bestimmtes Merkmal hin zu untersuchen, muss
diese Zelle (und zwar nur diese Zelle) fluoreszieren. Da die Zellen in der Regel von allein
nicht fluoreszent sind, muss der Zelle eine fluoreszierende Gruppe angehängt werden. Damit
sich die fluoreszierende Gruppe nicht an alle Arten von Zellen anhängt, geschieht dieses mit
einem Antikörper, der genau gegen das Merkmal gerichtet ist, auf welches die Zelle hin untersucht werden soll. Die fluoreszierende Gruppe wurde dabei zuvor dem Antikörper angehängt. Man nennt diesen Vorgang das Markieren einer Zelle.
Wie die Antikörper mit der fluoreszierenden Gruppe versehen werden ist nicht Gegenstand
dieses Vortrags. Es sei hier nur erwähnt, dass solche markierten Antikörper, die sich gegen
eine große Zahl von Zellmerkmalen richten, bei verschiedenen Firmen käuflich zu erwerben
sind.
Da jeweils nur Antikörper, die gegen ein bestimmtes Merkmal vorgehen, eingesetzt werden,
sind auch nur die entsprechenden Zellen markiert und werden durch die Fluoreszenz beim
Durchqueren des Laserstrahls sichtbar.
Eine mögliche, grün fluoreszierende Gruppe ist das sog. FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat),
eine andere, orange-farben fluoreszierende Gruppe ist das sog. PE (Phycorythrin).
Abb.: Handelsübliche Antikörper, die mit einer fluoreszierenden Gruppe
versehen wurden [23]
links: CD3 Antikörper (gegen T-Lymphozyten),
versehen mit FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat)
rechts: CD19 Antikörper (gegen B-Lymphozyten),
versehen mit PE (Phycorythrin)
Das Markieren der Zellen geschieht vor der Messung in einem Reagenzglas und benötigt eine
gewisse Zeit, die sog. Inkubationszeit.
Anschließend wird die vorbereitete Probe in das Durchflusscytometer gegeben und wie oben
beschrieben zerstäubt und gelangt so stark zerkleinert in den Laserstrahl. Durchquert eine
Zelle, die mit dem FITC-Antikörper markiert ist, den Laserstrahl, so leuchtet sie grün auf.
Eine orange-farben aufleuchtende Zelle ist dann eine mit einem PE-Anikörper markierte Zelle.
Abb.: Fluoreszenzlichtdetektion [23]
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Auch hier werden die Ergebnisse, wie bei den Streulichtsignalen in einem Dot-Plot dargestellt. Auch hier entspricht jeder Punkt einem gemessenen Ereignis, also einer Zelle. Dabei ist
die grüne FITC-Fluoreszenz auf der x-Achse und die orange-farbene PE-Fluoreszenz auf der
y-Achse aufgetragen. Die Farben der Punkte haben jedoch nichts mit der Fluoreszenzfarbe zu
tun, sie wurden wieder zur besseren Anschaulichkeit bei der Auswertung eingefärbt.
Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot eines gesunden Patienten
Die grün fluoreszierenden Zellen sind die sog. TLymphozyten, die orange-farben fluoreszierenden
Zellen die B-Lymphozyten. Die Mengenverhältnisse
sind die eines gesunden Patienten, also der Normalfall.
Die schwarzen Punkte entsprechen unmarkierten Zellen. Es sind demnach weder T-, noch B-Lymphozyten.
Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot [23]
In dem oben beschriebenen Prozess wurden
lediglich zwei unterschiedliche Typen von
Zellen durch den Einsatz von zwei verschiedenen Fluoreszenzmarkern mit der Durchflusscytometrie voneinander unterschieden.
Moderne Durchflusscytometer für den Routineeinsatz unterscheiden standardmäßig vier,
besonders gute sogar sechs, verschiedene
Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig. Experimentelle Geräte schaffen zehn oder mehr
Farben gleichzeitig, sind jedoch für den Routineeinsatz nicht geeignet.
Der oben stehende Streulicht-Dot-Plot zeigt deutlich, dass die durch Fluoreszenz in Unterarten unterschiedenen Lymphozyten nur einen kleinen Teil der Probe darstellen. Damit die anderen Teilchen (Monozyten und Neutrophilen Granulozyten) die Darstellung nicht stören,
werden sie bei der Auswertung ausgeblendet. Diesen Vorgang nennt man Gaten.
Abb.: Gaten [23]
Das Gaten wird von der Software, nach Selektion des Zelltypes im Streulicht-Dot-Plot mit der
Mouse, automatisch vorgenommen (siehe Abbildung oben).
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Abb.: Blick in das Innere eines Durchflusscytometers
Der bläuliche Laserstrahl verläuft horizontal. Das
obere Dreieck ist die Spitze, durch welche die Flüssigkeit in den Laserstrahl tropft, die rötlichen Punkte
sind fluoreszierende Partikel (links) [34]
Durchflusscytometer mit anschließender Zellsortierung (unten) [26]
Die meisten Durchflusscytometer
können neben der reinen Identifizierung der Teilchen / Zellen diese
auch voneinander trennen und sie
so sortieren. Dieses geschieht nach
der oben beschrieben Erkennung:
Durch einen scharfen Luftstrom
wird der quasi kontinuierliche
Strahl in einzelne Tropfen aufgeteilt. Der Analysator gibt nach gemessener Fluoreszenz das Signal
zur negativen Ladung des fluoreszierenden Teilchens. Nichtfluoreszierende Teichen werden positiv
geladen. In einem geladenen Kondensator werden die Teichen anschließend ihrer Ladung entsprechend aufgrund der CoulombWechselwirkung abgelenkt und so
in zwei unterschiedliche Behälter
geleitet.
In handelsüblichen Durchflusscytometern sind in der Regel drei unterschiedliche Gaslaser
verbaut. Wie in den Absorptions- und Emissions-Abbildungen der Fluoreszenz unterschiedlicher Marker unter 3.1.4 zu erkennen ist, sind mit einem Argon-, Krypton und einem HeliumNeon-Laser Anregungen vom Ultravioletten bis ins sichtbare Rote möglich. Zwar sind diese
Gaslaser nicht kontinuierlich durchstimmbar, lassen sich aber wegen der breitbandigen Absorption der Fluoreszenzmarker zur Anregung in diesem Bereich verwenden. Da jedoch keiner der drei erwähnten Laser einen Laserübergang im Bereich zwischen 360nm und 460nm
hat, besitzen die Durchflusscytometer zusätzlich noch eine bei etwa 400nm emittierende Laserdiode. Die Detektion der Fluoreszenzstrahlung erfolgt mittels Strahlteilern, Filtern und
Photomultiplierröhren.
3.3 Anwendungen
Die laserinduzierte Fluoreszenz findet in der Medizin zahlreiche Anwendungen. Um eine
Vorstellung von dieser Vielfalt zu bekommen, ohne den Rahmen des Vortrags zu sprengen,
kommt an dieser Stelle nur eine kurze Auflistung [19]:
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bei der automatischen Sequenzierung der DNA mit der Sanger-Methode hat jede der
vier terminierenden Basen eines DNA-Stückes ihren spezifischen fluoreszierenden
Marker. Wenn die markierten DNA-Moleküle getrennt werden, werden die Marker
durch UV-Licht angeregt, und die Identität der Marker wird anhand der Wellenlänge
des emittierten Lichtes festgestellt.
Die Verbindung Ethidiumbromid zeigt kaum Fluoreszenz, wenn sie in einer Lösung
ihre Konformation frei ändern kann. Durch Bindung an DNA wird die Fluoreszenz jedoch stark erhöht, was sie nützlich bei der Lokalisierung von DNA-Fragmenten
macht, z. B. bei der Agarose-Gelelektrophorese.
Die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin fluoreszieren bei Anregung
durch UV-Licht, wobei auch bei Proteinen und Peptiden, die diese Aminosäuren enthalten, Fluoreszenz beobachtet werden kann.
Auf dem DNA-Chip wird Fluoreszenz verwendet.
Fluoreszierende Proteine wie das GFP (Green fluorescent protein) dienen als Marker
für verschiedenste biologische Vorgänge innerhalb der Zellen wie zum Beispiel die
Genexpression.
Die Aktivierung eines fluoreszierenden Akzeptors nach Fluoreszenzanregung eines
benachbarten Donors durch Fluorescence resonance energy transfer (FRET) wird in
der Biochemie und der Zellbiologie zu Abstandsmessungen im Nanometerbereich genutzt.
FISH (Fluorescence in situ hybridization) Chromosomenanalyse
Beobachtung einzelner Moleküle mittels Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
Tumor und Rheuma Diagnostik
Vier weitere mehr oder weniger wichtige Anwendungsgebiete sollen hier trotzdem etwas genauer dargestellt werden:
3.3.1 HIV und Leukämie Diagnose mit dem Durchflusscytometer
HIV Diagnose:
In dem unten gezeigten Beispiel ist die HIV-Infektion des 30-jähreigen Patienten bereits bekannt. Um jedoch ein Bild von der Leistungsfähigkeit seiner Abwehrkräfte zu bekommen,
wurde die Anzahl der CD4-positiven T-Lymphozyten, den sog. Helferzellen gemäß der oben
beschriebenen Methode der Durchflusscytometrie bestimmt. Dabei erkennt man, dass beim
HIV-infizierten Patienten eine deutliche Verminderung der Helferzellen im Vergleich zum
Normalfall vorliegt.
Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot von gesundem und HIV-Patienten (oben) [23]
und große Anzahl weißer Blutkörperchen (rechts) [23]
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Leukämie Diagnose:
Bei einem 70-jährigen Patienten wurde mikroskopisch eine erhöhte
Anzahl weißer Blutkörperchen (14000/µl) festgestellt. Durch eine
anschließende durchflusszytometrische Analyse der Lymphozyten
lässt sich erkennen, dass es sich dabei fast ausschließlich um BLymphozyten handelt. Bei einem gesunden Menschen überwiegen
die T-Lymphozyten.
Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot von gesundem und Leukämie-Patienten [23]
Von den vielen möglichen Ursachen lässt sich so auf Leukämie (Blutkrebs) schließen, wobei
zur näheren Bestimmung noch weitere durchflusszytometrische Analysen mit unterschiedlichen Markern durchgeführt.
3.3.2 Speiseröhrenkrebs Diagnostik
Bei Sodbrennen und Erbrechen können durch Magensäure, die in die Speiseröhre gelangt,
deren Schleimhautzellen geschädigt werden, was zu Speiseröhrenkrebs führen kann. Solche
geschädigten Zellen oder sogar Tumorzellen lassen sich unter dem weißen Licht eines gewöhnlichen Endoskops nicht erkennen. Besprüht man die Speiseröhre jedoch kurz vor der
Untersuchung mit einer fluoreszierenden Vorstufe des Zellfarbstoffes, so haftet diese verstärkt
an den erkrankten Zellen an. Mit einem Laser am Endoskop werden die Zellen so gezielt zur
Fluoreszenz angeregt und können so von den gesunden unterschieden werden. Anhand der
Stärke der Fluoreszenz sind sogar Früh- und Vorstadien zu erkennen. (Näheres zu dieser Methode siehe HS-Vortrag Endoskopie von Patrick Litzbarski.)
Abb.: Speiseröhrentumore sind unter Weißlicht nicht erkennbar, fluoreszieren unter dem Laser aber rot [10]
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3.3.3 Spermiensortierung mit dem Durchflusscytometer
Die Laserfluoreszensspektroskopie wird auch zur Diagnose des „Geschlechtes“ der männlichen Spermien eingesetzt.
Schon in der Vergangenheit versuchten Menschen, das Geschlecht ihres Nachwuchses zu
beeinflussen. So drehten sich zum Beispiel im alten Griechenland Männer beim Beischlaf
nach rechts, um einen Sohn zu zeugen. Mit dem gleichen Ziel banden sich im 18. Jahrhundert
Franzosen den linken Hoden ab.
Heute hat die Wissenschaft eine technische Methode entwickelt, die in Form einer Spermiensortiermaschine realisiert wurde.
Hierzu muss man zunächst verstehen, wie das Geschlecht des Kindes zustande kommt. Bestimmt wird das Geschlecht durch die Gonosomen3 der Eltern. Die Gonosomen werden ihrem
Aussehen nach als X- bzw. Y-Chromosomen bezeichnet. Bei der Kombination XX ist das
Geschlecht des Kindes weiblich, bei XY männlich. Die Eizelle der Mutter enthält immer ein
X-Chromosom, während die Samenzellen in ihrem Kern entweder ein X- oder ein YChromosom tragen. Welches Geschlecht das Kind haben wird, hängt also davon ab, welche
der Samenzellen zur Befruchtung der Eizelle gelangt.
Hier greift die Spermiensortiermaschine ein, um das Geschlecht zu beeinflussen. Microsort
nennt sich dieses Verfahren, welches sich die unterschiedliche Größe der Chromosomen zunutze macht, um den männlichen Samen nach X- und Y-Chromosomen aufzuteilen. Da das
X-Chromosom bei allen Säugetieren reicher an genetischem Material ist, als das männliche
Y-Chromosom, ist "weiblicher" Samen größer.
In einem sog. Flow Cytometer werden die Samenzellen mittels fluoreszierender Farbstoffe
und einem ultravioletten Laser durch das unter dem Laser hellere Leuchten des größeren XSamens unterschieden und anschließend getrennt. Die Schwangerschaft erfolgt dann über
künstliche Befruchtung. Die Trefferquote liegt bei Töchtern bei etwa 93%, beim ersehnten
Sohn bei nur 73%. Das ist zum einen auf die bessere Erkennbarkeit der Samenzellen mit XChromosom zurückzuführen, zum andern auf die größere Erfahrung, denn in den USA wünschen sich wesentlich mehr Eltern Mädchen.
Dieses Verfahren wird seit etwa 1985 bei Tieren und seit 1995 in Amerika auch bei Menschen
angewendet. Die einzige Auflage ist dabei, dass ein Paar bereits
ein gemeinsames Kind hat, bevor es das Geschlecht des zweiten
auswählen darf. Die Kosten für einen Versuch betragen etwa 2200
US $. In Deutschland ist wie in einigen anderen Ländern dieses
Verfahren verboten, während einige Länder, wenn die Gefahr einer
Erbkrankheit besteht, die von fehlerhaften Genen auf einem
Geschlechtschromosom ausgeht, eine Ausnahme machen.
Abb.: Künstliche Befruchtung [26]
3.3.4 Immunfluoreszenz
In der Immunologie werden Antikörper durch eine chemische Reaktion mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen. Die Antikörper binden auch mit dieser Gruppe noch an
die mikroskopischen Objekte, die sie bekämpfen. Durch Anregung und anschließende Beobachtung der Fluoreszenz lassen sich so zum Einen die Orte, an die die Antikörper binden,
und zum Anderen sogar die Antikörper-Konzentration quantitativ bestimmen.
3
Gonosomen: Geschlechtschromosomen
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4. Lasertomographisches Scannen (LTS)
Mit Lasern lassen sich Körper heutzutage in kürzester Zeit präzise vermessen bzw. Oberflächen abscannen. Die Analyse der daraus ermittelten Daten gibt Ärzten (insbesondere Orthopäden) die Möglichkeit Krankheiten für den Patienten unkompliziert und schmerzfrei zu diagnostizieren.
4.1 Methode
In der Medizin gibt es zwei unterschiedliche Laserscanning Methoden, die in unterschiedlichen Bereichen ihre Anwendung finden:
1) 3D-Laserscanning
Beim 3D-Laserscanning werden mit der sog. Lichtschnitttriangulation die Konturen und Oberflächen des Scanobjekts digital mit Kameras erfasst und von einem Computer ausgewertet.
Dabei entsteht eine diskrete Menge von 3D-Abtastpunkten, die sog. Punktwolke. Die Koordinaten der gemessenen Punkte werden aus den Winkeln und der Entfernung in Bezug zum
Ursprung (Gerätestandort) ermittelt. Dabei erreichen moderne Lasermessysteme eine Punktegenauigkeit von bis zu 1mm am Objekt.
Es gibt auch Laserscanner mit Phasenmessverfahren. Diese nehmen zusätzlich zu den Punktkoordinaten die Intensitätswerte der Oberflächen auf.
Abb.: 3D-Laserscan-Prinzip [36]
Das System besteht also aus einer ortsfesten
Digitalkamera, die auf das ebenfalls ortsfeste
Objekt gerichtet ist. Der von ihr auf das Objekt zeigende feste Vektor wird hier mit c bezeichnet. Ein Linien-Laser befindet sich von
der Kamera aus gesehen am festen Punkt d,
kann jedoch seinen Kopf um den Winkel φ
drehen. Die Ebene, welche der Laserlinie mit
dem Laserursprung bildet, wird von den beiden Vektoren l1 und l2 aufgespannt. Die Rotation des Lasers um seinen Ursprung geschieht
um den Vektor l1 mit dem Winkel φ, d.h. l2
ändert sowohl seine Länge, als auch seine
Richtung, während l1 seine Richtung stets beibehält.
Legt man den Ursprung eines kartesischen
Koordinatensystems in den Ausgangspunkt
des Lasers wie in der Skizze dargestellt, so
dreht der Vektor l2 in der xy-Ebene um den
Winkel φ, während l1 senkrecht dazu in zRichtung zeigt. Die beiden Vektoren sind also:
0
l1 = 0 ,
1
− sin (ϕ )
l 2 = cos(ϕ )
0
Abb.: Laserscanervektoren [36]
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Da die Kamera nun nicht nur aus einem Detektorpunkt, sondern einem 2 dimensionalen
Array , einem CCD Chip besteht, gibt es nicht
nur einen c Vektor von der Kamera zum Objekt, sondern n × m Stück:
0 1 2 3 4
…
n
0
1
2
3
4
…
Abb.: 3D-Laserscan-Vektoren [36]
m
Der CCD Chip liegt nun in einer zur z-Achse parallelen Ebene, d.h. die einzelnen Pixelvektoren
sind im Idealfall durch die Optik alle parallel und stehen senkrecht auf dieser Ebene. Sie können also durch einen Vektor cij in dieser Ebene zu dem Pixel (i,j) und den oben erwähnten cVektor ausgedrückt werden.
r
r r
c~ij = cij + c
r
Die Vektoren c~ij beginnen also an unterschiedlichen Koordinaten auf dieser Ebene, nämlich den
einzelnen Pixels des CCD Chips. Denkt man sich den Koordinatenursprung in die Mitte des
Pixels (0,0) und die Achsen entlang der (0,0→n) bzw. (0→m,0) Linie, so sind die Zeiger auf
die Standpunkte gegeben durch die Vektoren cij:
x
c00 = 0
y0
x
c01 = 0
y1
......
......
x
c 0 m = 0
ym
x
c10 = 1
y0
x
c11 = 1
y1
x
c 20 = 2
y0
x
c 21 = 2
y1
x
c1m = 1
ym
x
c 2 m = 2
ym
....
....
....
x
c n 0 = n
y0
x
c n1 = n
y1
......
......
x
c nm = n
ym
Ein Computerprogramm durchsucht dann das,
für einen bestimmten Winkel φ aufgezeichnetes Bild Zeile für Zeile nach dem Laserreflex.
Dieser ist aufgrund der starken Intensität und
deutlichen Rotfärbung leicht von den anderen
Pixels zu unterscheiden. Das für einen Winkel
aufgenommene Bild wird dabei wie in der
Abbildung links durchsucht. Das Programm
speichert die so ermittelten Vektoren zu den
Laserreflexen. Im nebenstehenden Beispiel
also:
c06, c15, c25, c34, c44, c54, c65, c75
Abb.: Laserlinie im Bild finden [36]
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Nun hat der Computer alle Informationen, die er benötigt, um die dreidimensionale Laserlinie
zu berechnen. Dazu bedient er sich für jeden einzelnen der oben ermittelten Pixel einfacher
Vektoraddition:
r
r
r r
λ ⋅ c = d + η ⋅ l1 + µ ⋅ l 2
r
c Richtungsvektor des Kamperapixels
r
d1 Positionsvektor des Lasers von der Kamera aus
r
l1 Erster Laserstrahlvektor
r
l 2 Zweiter Laserstrahlvektor
Dieses ist ein Gleichungssystem mit drei Unbekannten (λ, η and µ), welches aber eindeutig zu
lösen ist, da die Vektoren dreidimensional sind und man somit auch 3 Gleichungen hat.
cx d x
l1x
l2 x
λ ⋅ c y = d y + η ⋅ l1 y + µ ⋅ l 2 y
c d
l
l
z z
1z
2z
Objekt
r
l1
r
l2
r
c
r
d
Laser
CCD Chip
λ ⋅ c x = d x + η ⋅ l1x + µ ⋅ l 2 x
⇒ λ ⋅ c x = d x + η ⋅ l1x + µ ⋅ l 2 x
λ ⋅ c = d + η ⋅ l + µ ⋅ l
x
x
1x
2x
⇒ λ, η, µ
Anschließend wird mit dem nächsten Bild aus der Laserstellung φ + ∆φ genauso verfahren.
Hierbei gibt der Schrittmotor die Information, um welchen Winkel ∆φ er sich gedreht hat, an
den Computer weiter, so dass jener diese Information mit dem Bild verknüpfen kann.
Anschließend werden die aus allen Bildern gewonnenen Daten vom Computer wieder zu einem
dreidimensionalen Bild zusammengesetzt. Dabei werden durch das Verbinden der einzelnen
Punkte der gewonnenen Punktwolke Maschen geschaffen. Das Einfärben dieser Maschenflächen liefert dann die Oberfläche.
Für das Verbinden der einzelnen Punkte
gibt es in professioneller Scannersoftware
komplizierte Algorithmen, um die Oberfläche möglichst glatt und detailgetreu
darzustellen. Ein einfaches System ist es,
die benachbarten Punkte zu Drei- oder
Vierecken zu verbinden.
Unter benachbarten Punkten versteht
man, dass ein Punkt in Linie x in einem
Bild t in der Nähe eines Punktes der gleichen Linie x in Bild t+1 liegt. Ebenso
liegt ein Punkt in ein und demselben Bild
Abb.: Prinzip des Erstellens der Maschen [36]
t in Linie x in der Nähe des Punktes in
Linie x+1, da die Laserlinie kontinuierlich ist.
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Durch die gleichzeitige Aufnahme eines Farbbildes ist
es professioneller Scannersoftware möglich, die entstandenen Maschenflächen
mit der entsprechenden Farbe auszufüllen und so ein
möglichst realistisches dreidimensionales Modell zu
erschaffen.
Abb.: 3D-Laserscanning mit einem Bodyscanner
Durch Verbinden der Punkte entstehen
Maschen, die mit Farbe aufgefüllt eine
reale Oberfläche darstellen [N14]
Nicht alle Laserscanner arbeiten mit rotierenden Linienlasern. Bei vielen bewegt sich der Laserkopf linear auf einer Führungsschiene.
Die maximale Auflösung eines Laserscanners ist durch die Auflösung der Kamera und die
Schrittgenauigkeit des Schrittmotors bestimmt.
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2) Konfokales Laserscanning (CLSM confocal laser scanning microscope)
Das konfokale Laserscanning ist ebenfalls ein dreidimensionales Laserscanning-Verfahren,
welches in der Medizin in der Augenheilkunde und in der Mikroskopie eingesetzt wird.
Hierbei wird ein Laserstahl über einen Strahlteiler auf das Objekt gelenkt und in die Probe
hineinfokussiert. Von dort aus wird er wieder reflektiert und fällt durch das gleiche Objektiv
durch den Strahlteiler, den er zum Teil ohne Ablenkung passiert. Hinter dem Strahlteiler befindet sich eine kleine Punktblende unmittelbar vor dem Detektor. In der Regel sind die Detektoren Photomultiplier Röhren (Photo-Multiplier-Tubes PMT) oder CCD Chips. Somit liegen Anregungs- und Detektionsfokus konfokal, also übereinander. Aufgrund dieser Anordnung wird nur Licht detektiert, welches aus der Brennebene reflektiert wurde. Optische Informationen, die nicht aus dieser Ebene kommen werden zweifach unterdrückt:
1) Da die Beleuchtungsintensität außerhalb des Fokus sehr schwach ist, werden Informationen außerhalb der Brennebene erst gar nicht abgefragt.
2) Das aus anderen Ebenen stammende Licht wird nicht auf die Lochblende fokussiert
und erscheint dort somit als Scheibe, die fast komplett geblockt wird (gestrichelte Linie)
Abb.: Konfokalmikroskop-Prinzip (oben) [19]
Die Dicke der Brennebene hängt von der Schärfentiefe des verwendeten Mikroskops ab. Die
nebenstehende Abbildung zeigt deutlich, dass eine größere Öffnung in der Lochblende eine dickere Brennebene bewirkt. Diese führt allerdings
zu einer geringeren Schärfe.
Abb.: Prinzipskizzen eines Konfokal-Mikroskop mit kleiner (links) und großer (rechts) Lochblende. Links: Nur das
aus der Fokusebene reflektierte Licht (blau) löst ein Signal
in der Photo-Multiplieer-Röhre (PMT) aus. Rechts: Auch
Licht aus höheren Ebenen löst ein Signal aus.
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Um nun ein Bild der gesamten Brennebene zu erhalten muss diese Ebene in x- und yRichtung abgerastert werden. Da nur bei der Untersuchung von Proben im Labor (z.B. Blutproben) das Untersuchungsobjekt bewegt werden kann, wird bei Untersuchungen am Menschen der Laserstrahl mit Spiegeln über diese Ebene gelenkt.
Abb.: Konfokales Scannen einer Brennebene: Durch das
drehen der x- und y-Spiegel rastert der Laser die gesamte Ebene ab [25]
Das schnellstmögliche Durchscannen einer Linie geschieht mit einem sich drehenden Polygonspiegel, da jede Spiegelseite den Laserstrahl über eine Linie führt.
Es wird also nur das das Licht aus der Brennebene detektiert, so dass ein Schnittbild aus nur
dieser Ebene entsteht. Verändert man den Fokus, so scannt man eine andere Ebene. Durch das
Zusammensetzen dieser Ebenen auf dem Computer erhält man einen dimensionalen Datensatz.
Es ist auch möglich anstelle eines Lasers weißes Licht zu benutzen, um auch Farbabbildungen
mit einem konfokalen Mikroskop zu erhalten. Hierbei lässt sich das Licht allerdings nicht mit
so hohen Intensitäten auf das Objekt fokussieren. Dadurch verlängert sich die Beobachtungszeit. Um dieses zu kompensieren besitzen konfokale Weißlichtmikroskope in der Regel mehrere parallele Strahlengänge, wodurch mehrere Stellen auf der Probe gleichzeitig gescannt
werden können.
4.2 Anwendungsbereiche
4.2.1 Netzhautscanning (Laser-Scanning Ophthalmoscope)
Um die Netzhaut zu scannen benutzt man in der Regel ein Laser-Scanning Ophthalmoscope,
welches das auf dem Verfahren des konfokalen Laserscannings basiert. Hiermit lassen sich
Tumore, ebenso wie die Form / Krümmung der Hornhaut bestimmen.
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Abb.: Prinzipskizze eines konfokalen LaserOphthalmoskop (oben) [14]
Die Scaneinrichtung besteht aus zwei galvanisch verschiebbaren Spiegelen, welche die Fokalebene in xund in y-Richtung abrastern.
Abb.: Kammerwinkeltumor (links) [14]
An der starken Reflexion (blau) kann man sehen, dass
hier ein optisch dichteres Gewebe vorliegt, woraus
man auf einen Tumor schließen kann.
4.2.2 Gewebe Laser-Mikroskopie
Nun werden in konfokale Lasermikroskope nicht nur zur in vivo Untersuchung verwendet.
Ein sehr großer Teil dieser Mikroskope ist für die Untersuchung einzelner Proben im Labor
ausgelegt. Dabei wird die unter 3.2 dargestellte laserinduzierte Fluoreszenz mit der Technik
des konfokalen Lasermikroskops verbunden und so die Stärken beider Verfahren ausgenutzt.
Der grundsätzliche Aufbau entspricht dem
eines gewöhnlichen konfokalen Lasermikroskops. Der Unterschied liegt darin,
dass neben dem normal reflektierten Laserlicht auch aus Fluoreszenz stammendes
Licht detektiert werden kann. Dazu strahlt
der Laser mit einer bestimmten, zur Fluoreszenz anregenden Wellenlänge auf den
Probenfokus ein, während das aus der Fluoreszenz dieser Stelle stammende langwelligere Licht hinter der Lochblende, wie oben
beschrieben, detektiert wird.
Abb.: Prinzip eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops [25]
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Hierbei ist es aufgrund der Technik des
Konfokalmikroskops möglich, durch das
Abrastern der Ebenen bei unterschiedlichen
Fokussierungen
ein
dreidimensionales
Fluoreszenzbild des Gewebes zu erzeugen.
Medizinern ist es dadurch möglich, in
entnommenen Gewebeproben Tumorzellen zu
diagnostizieren.
Abb.: Rot fluoreszierende Zellkerne mit grün
fluoreszierenden Zellwänden [25]
4.2.3 Bodyscanning
Das 3D Laserscanning findet im Bodyscanning seine Anwendung. Das Bodyscanning ist ein
3D Laserscanningverfahren, bei dem der komplette menschliche Körper mit Hilfe eines Lasers vermessen wird. Hierzu fahren Laserlinien aus vier, um den Patienten herum angeordneten Türmen gleichzeitig den Körper von oben nach unten ab. In den Türmen befinden sich
ebenfalls die festen digitalen Kameras, welche den Vorgang aufzeichnen. Ein Computerprogramm wertet die Bilder aus, indem es anhand der Kameraposition und der Position der Laserlinie den Ort der Reflexion des Laserstrahls (die jeweilige Stelle des menschlichen Körpers) berechnet.
Abb. (unten): Mit dem dreidimensionalen Abbild lassen sich am Computer
Bewegungen simulieren und so mögliche Krankheiten diagnostizieren. [37]
Abb. (oben): Frau im Bodyscanner und ihr drei dimensionales digitales
Abbild [37]
Das Verfahren dauert nur wenige Sekunden, in denen der Patient bewegungslos in der Mitte
der Säulen stehen muss. Die gesamte Auswertung samt Diagnose kann vom Arzt anschließend bequem am Computer geschehen.
Ein Orthopäde kann den Patienten so virtuell am Computer drehen und ihn von allen Seiten
betrachten, ohne dass der Patient dazu anwesend ist oder vielleicht für ihn anstrengende oder
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
unangenehme Bewegungen machen muss. So können Haltungsschäden und Längendifferenzen der Gliedmaßen leicht erkannt und diagnostiziert werden.
Dieses Verfahren wird über den medizinischen Einsatz hinaus auch noch in kommerziellen
Bereichen genutzt:
1) Zum einen kann man heutzutage häufig beim Fahrradkauf auf diese Technik zurückgreifen, um problemlos das richtige Fahrrad zu finden. Aus den durch das Bodyscanning gewonnen Daten lässt sich die optimale Fahrrad und Sitzposition finden und das
richtige Zubehör ermitteln, um die Druckbelastung auf die Hals- und die untere Lendenwirbelsäule, Hand- und Kniegelenke sowie die Sitzknochen zu minimieren.
2) Einige Bekleidungsgeschäfte nutzen den Bodyscanner um Körpermaße für Maßgeschneiderte Kleidungsstücke zu gewinnen. Online-Versandhäuser streben an, mit Hilfe
dieser Technik, dem Kunden eine virtuelle Warenanprobe am „eigenen Körper“ zu
ermöglichen.
Der primäre Kostenfaktor beim Bodyscanning ist der Anschaffungspreis, welcher bei etwa
100.000 Euro liegt. Somit ist es mit 20 – 40 Euro pro Messung ein relativ preiswertes Verfahren.
Feetscanning:
Analog zum Bodyscanning gibt es auch die Möglichkeit lediglich die Füße zu scannen. Dazu
stellt sich der Patient mit einem Fuß in den Fußscanner auf eine Glasplatte. Wie beim Bodyscanning wird auch hier der Fuß mit einer Laserlinie abgefahren und der Vorgang von ortsfesten Digitalkameras aufgezeichnet. Die Laser und die Kameras befinden sich hier unter dem
Fuß sowie seitlich schräg oberhalb des Fußes. Krankhafte Fußformen wie Senkfüße, Knickfüße, Spreizfüße oder Kombinationen aus den bereits genannten, können so einfach diagnostiziert werden. Die so bereits gewonnenen Daten können direkt zur Erstellung von z.B. Schuheinlagen genutzt werden.
Abb.: Funktionsprinzipskizze des Fußscanners: In der
Mitte befindet sich der zu messende Fuß auf einer
Glasplatte. Darunter und links und rechts von ihm
liegen die fahrbaren Laser. Das ganze Bild ist aus der
Sichtweise einer der Kameras dargestellt. [37]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
5. Optische Kohärenztomographie (OCT)
Ein diagnostisches Verfahren zur in vivo tomographischen Darstellung von Gewebe, stellt die
optische Kohärenztomographie dar. Da aufgrund der starken Lichtstreuung des menschlichen
Gewebes konfokale Laserscanner/-mikroskope kaum in das Gewebe eindringen können benötigt man eine neue Technik, die in der OCT gefunden wurde. Auch hier ist sind Laser die
Lichtquellen, welche das „Hineinschauen in den Menschen“ ermöglichen.
Optische Kohärenztomographie heißt auf Englisch Optical Coherence Tomography und wird
daher mit OCT abgekürzt. Es handelt sich hierbei um ein nicht-invasives4, bildgebendes Verfahren, welches in der Medizin hauptsächlich zur Diagnose von Netzhautkrankheiten eingesetzt wird.
5.1 Physikalische Grundlagen
5.1.1 Elektromagnetische Wellen, Intensität, Interferenz
Die Fähigkeit von Wellen sich gegenseitig zu überlagern nennt man Interferenz. Dabei spricht
man von konstruktiver Interferenz, wenn sich zwei Wellenberge überlagern und destruktiven
Interferenz bis hin zur Auslöschung, wenn sich ein Wellenberg mit einem Wellental überlagert.
Licht als elektromagnetische Welle wird, wie unter 2.1 bereits erwähnt, durch die Gleichungen einer ebenen Welle beschrieben:
rr
r r
r
E (r , t ) = E 0 ⋅ e i (kr −ωt ) ,
rr
r r
r
B(r , t ) = B0 ⋅ e i (kr −ωt )
Hierbei sind E(r,t) und B(r,t) die Feldstärken am Ort r zur Zeit t, E0 und B0 die Amplituden, k
der Wellenvektor (zeigt in Ausbreitungsrichtung) und ω die Kreisfrequenz. Aufgrund der Geometrie des Michelsoninterferometers (siehe unten) wird hier nur die Ortsabhängigkeit in eine
Raumrichtung (hier z-Richtung) betrachtet. Zurzeit t = 0 hat das elektrische Feld die Form:
r
r
E ( z ) = E 0 ⋅ e i⋅kz
Das reelle elektrische Feld E(t) wird nun zum besseren Verständnis durch das komplexe Feld
A(t) ersetzt:
+∞ r
∞ r
r
r
r
+ i 2πνt
F (ν ) = ∫ E (t )⋅ e −i 2πνt dt = F ∗ (− ν )
mit
A (t ) = ∫ F (ν ) ⋅ e
dν
0
−∞
Somit enthält A(t) nur die Anteile positiver Frequenzen ν des elektrischen Feldes E(t), das
durch den Realteil von A(t) bestimmt ist:
r
r
E (t ) = 2 ⋅ Re A (t )
Die Intensität ist dort dann:
( )
4
Bei nicht-invasiven Verfahren verändert der Messstrahl weder chemische noch sonstige Eigenschaften des
Messobjektes.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
r
r
r 2
r
r
I = E (z )⋅ E ∗ ( z ) = E ( z ) = ∫ E ( z )⋅ E ∗ ( z ) ⋅ dz
z
Entsprechend gilt für zwei aufgeteilte Wellen, die Probenwelle EProbe und die Referenzwelle
EReferenz mit der zusätzlichen optischen Weglängendifferenz ∆z:
r
r
E Pr obe ( z ) = E Pr obe 0 ⋅ e i⋅kz
r
r
E Re ferezn ( z + ∆z ) = E Re ferenz 0 ⋅ e i⋅k ( z + ∆z )
und
Gemäß dem Superpositionsprinzip ist die örtliche Feldstärke, die sich aus den jeweiligen Einzelfeldern ergibt, gegeben durch:
r
r
r
E ( z , ∆z ) = E Pr obe (z ) + E Re ferenz ( z + ∆z )
Daraus folgt für die Intensität:
r
r
2
I (z , ∆z ) = E Pr obe ( z ) + E Re ferenz ( z + ∆z )
r
r
r
r
2
2
= E Pr obe ( z ) + E Re ferenz ( z + ∆z ) + 2 ⋅ E Pr obe (z ) ⋅ E Re ferenz ( z + ∆z )
r
r
r
r
r
r
= E P ( z ) ⋅ E P∗ ( z ) + E R ( z + ∆z ) ⋅ E R∗ ( z + ∆z ) + 2 ⋅ E P∗ ( z ) ⋅ E R ( z + ∆z )
= I P ( z ) + I R ( z + ∆z ) + 2 ⋅ I P I R cos(k∆z )
144
42444
3
IM
IM ist die Intensitätsmodulation und k⋅∆z die Phasendifferenz zwischen Proben und Referenzlicht. Ist die Phasendifferenz gerade ein ganzzahlige Vielfaches von 2⋅π, so sind beide Wellen
in Phase und der Modulationsterm und somit auch die Gesamtintensität wird maximal (konstruktive Interferenz). In dem Fall, dass die Phasendifferenz ein ganzzahliges Vielfaches von
π/2 ist, sind die Wellen um 90° phasenverschoben und der Modulationsterm verschwindet.
Sind die Phasen um ein ungerades ganzzahliges Vielfaches von π verschoben, so wird der
Modulationsterm negativ und die Gesamtintensität minimal (destruktive Interferenz).
Phasendifferenz
k∆z = n ⋅ 2π
k∆z = (2n + 1)
π
2
k∆z = (2n + 1) ⋅ π
Gesamtintensität
n = 0, 1, 2, …
⇒ cos(k∆z ) = 1
I = IP + IR + 2 IPIR
n = 0, 1, 2, …
⇒ cos(k∆z ) = 0
I = IP + IR
n = 0, 1, 2, …
⇒ cos(k∆z ) = −1
I = IP + IR − 2 IPIR
Aus der maximalen und minimalen Gesamtintensität lässt sich der Kontrast bei einer solchen
Intensitätsmodulation im Interferometer berechnen:
K (ontrast ) =
I max − I min
I max + I min
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mit
I max = I P + I R + 2 I P I R ,
I min = I P + I R − 2 I P I R
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
5.1.2 Michelson-Interferometer
Das Interferometer nach Michelson ist gemäß unten stehender Abbildung aufgebaut. Hierbei
wird das Licht aus der Quelle durch einen Strahlteiler in den sog. Probensstrahl und den sog.
Referenzstrahl aufgeteilt. Während das Licht des Referenzstrahls den Weg zwischen dem
Stahlteiler und einem dielektrischen Spiegel und wieder zurück läuft, legt der Probenstrahl
den Weg zur Probe, wo er reflektiert wird, und wieder zurück zum Strahlteiler zurück. Dort
werden beide Strahlen wieder zusammengeführt und mögliche Interferenzen werden vom
Detektor erfasst.
Abb.: Michelson Interferometer:
Die Abbildung zeigt den Strahlengang von
der Quelle (Source) bis zum Detektor
(Detector) in einem OCT-Michelson Interferometer (links) [18]
Prinzipieller Aufbau eines OCT-Michelson-Interferometers (unten) [16]
Handelt es sich bei dem Licht um
monochromatische Laserstrahlung mit
großen Kohärenzlängen, so wird ständig
eine Intensitätsmodulation, abhängig von der Stellung des Referenzspiegels, detektiert. Dieses
geschieht, weil sich das Laserlicht kohärent überlagert und bei Wegdifferenzen von
(2n+1)⋅λ/2 destruktiv überlagert, bzw. bei Wegdifferenzen von n⋅λ verstärkt.
In der Weißlichtinterferometrie benutzt man aber gezielt breitbandiges Licht, welches eine
sehr Kurze Kohärenzlänge aufweist. So kann es nur dann zu Interferenzen kommen, wenn die
Wegdifferenz ∆s der beiden Strahlen kleiner als die Kohärenzlänge Lc ist (∆s < Lc).
Im menschlichen Körper wird Licht sehr stark mehrfach
gestreut, wodurch die Information, der Tiefe der ersten
Streuung verloren geht. Um nun mehrfach gestreute
Photonen von einfach gestreuten Photonen unterscheiden zu
können, wählt man eine Lichtquelle mit einer kurzen
Kohärenzlänge. Weil mehrfach gestreute Photonen eine
deutlich größere Wegdifferenz zurücklegen, als direkt zurück
gestreute Photonen, interferieren sie bei einer kurzen Kohärenzlänge nicht mehr mit dem Referenzphoton. So lassen sie
sich von den direkt zurück gestreuten Photonen unterscheiden.
Abb.: Streuung der Photonen im menschlichen Gewebe [16]
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Dieses wird in der optischen Kohärenztomographie ausgenutzt, um die gewünschten Tiefeninformationen zu bekommen.
Die Interferenz der Signale aus beiden Armen des Michelson-Interferometers ergibt ein Muster, aus dem man die relative optische Weglänge innerhalb eines einzelnen Tiefensignals (AScan) ermitteln kann. In den eindimensionalen Rasterverfahren wird der Strahl dann transversal in einer oder zwei Richtungen geführt, womit sich ein flächiges Bild (B-Scan) oder ein
dreidimensionales Tomogramm (C-Scan) aufnehmen lässt.
Abb.: Gewinnung eines 3D-Datensatzes aus OCT-Schnittbidern [12]
Damit ist die axiale von der lateralen bzw. die longitudinale von transversalen Auflösung entkoppelt (im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie). Die axiale Auflösung ist damit
nur durch die Bandbreite des verwendeten Lichtes begrenzt, d.h. hohe Auflösung (kleine Details können aufgelöst werden) wird mit großen Bandbreiten erreicht.
Hierzu sind besondere Lichtquellen nötig, da die Kohärenzlänge die Auflösung bestimmt.
5.1.3 Lichtquellen kurzer Kohärenzlänge, Auflösung
Die Wahl der Lichtquelle ist für dieses Verfahren also essentiell. Um eine möglichst kleine
Kohärenzlänge und somit eine hohe Auflösung zu erreichen, benötigt man Strahlungsquellen
mit einer möglichst breiten Spektralverteilung. Diese sollte möglichst Gaußförmig sein.
Zu Beginn der OCT 1993 wurden Laserdioden verwendet, die unterhalb der Laserschwelle
betrieben wurden, um eine kurze Kohärenzlänge bei einem hohen Kohärenzgrad zu erhalten.
Die Zentralwellenlänge lag bei diesen Laserdioden bei 670nm, ihre Lichtleistung war kleiner
als 100µW. Die Weiterentwicklung der Lichtquellen führte zum gepulsten Ti:Saphir Laser bei
einer Wellenlänge von 800nm, der entsprechend der kurzen Pulsdauer im Femtosekundenbereich ebenfalls kurze Kohärenzlängen produzierte. Aus Kosten- und Wartungsgründen wurden die Lichtquellen mit Hilfe der Halbleiter- und Lasertechnik weiterentwickelt. Heutzutage
werden Superlumineszenzdioden (häufig mit SLD abgekürzt) mit einer Zentralwellenlänge
zwischen 815 und 835nm sowie 1300nm verwendet.
Das Prinzip von Halbleiterlichtquellen ist die sog. Injektionslumineszenz. Dabei erfolgt in
einem flussgepolten pn-Übergang eine strahlende Rekombination von Elektronen und Löchern. Hierbei werden die Ladungsträger von außen über den Injektionsstrom zugeführt. Mit
steigendem Injektionsstrom nimmt die Zahl der pro Zeiteinheit rekombinierenden LadungsHauptseminar Experimentalphysik SS 2006
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träger zu und damit auch die Lichtleistung der Diode. Bei zu großem Injektionsstrom wird die
Diode aufgrund der thermischen Überlastung zerstört.
Superluminiszenzdioden sind Halbleiterlaserdioden mit einem, oben beschriebenen, pnÜbergang, aber ohne einen optischen Resonator. Somit werden sie unterhalb der Laserschwelle betrieben werden, so dass keine Laseraktion auftreten kann. Da die Resonatorfunktion bei
Halbleiterlaserdioden an den glatten Oberflächen aufgrund des großen Brechungsindexdifferenz HL - Luft von alleine auftritt, muss dieser Übergang verändert werden. Dazu werden auf
die HL-Oberfläche sog. Anti-Reflektions-Schichten aufgebracht. Sie bestehen in der Regel
aus mehreren λ/4-Plätchen, die eine destruktive Interferenz in Reflektionsrichtung bewirken.
Auflösung
Die axiale Auflösung lässt sich nun mit der folgenden Formel (hergeleitet aus dem Fourierverhältnis zwischen Korrelationsbreite und spektraler Breite, gemessen bei voller Breite auf
halber Höhe) berechnen:
2 ⋅ ln (2 ) ⋅ λ20
∆z =
π ⋅ ∆λ
Hier bei ist ∆z die axiale Auflösung, λ0 die zentrale Wellenlänge und ∆λ die volle spektrale
Bandbreite bei halber Höhe des Spektrums.
Superlumineszenzdioden mit einer Zentralwellenlänge zwischen 815 und 835nm sowie
1300nm und einer spektralen Breite von ∆λ = 20, 22 bzw. 40-45nm haben somit eine Kohärenzlänge von etwa 15µm.
Abb.: Axiale Auflösung in der OCT bei variierender Bandbreite und zentraler Wellenlänge für unterschiedliche
Lichtquellen [19]
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5.2 Methode
Die optische Kohärenztomographie ist ein interferometrisches, Bildgebendes Messverfahren,
welches das Innere des Gewebes bis zu einigen mm tomographisch darstellen kann.
Da Photonen, die in biologisches Gewebe eindringen, vielfach gestreut werden, sind Menschen undurchsichtig. Licht, das von Gewebe zurückgestreut wird, enthält so gut wie keine
Informationen über innere Gewebestrukturen mehr. Mit der OCT gelingt es jedoch, genau
diejenigen Lichtteilchen herauszufiltern, die ins Gewebe eingedrungen sind, dort genau einmal gestreut wurden und anschließend das Gewebe wieder verlassen haben. Diese Lichtteilchen transportieren Informationen über die Position der Gewebestrukturen, an denen sie gestreut wurden.
Da das Menschliche Gewebe sehr viel Wasser enthält, werden die meisten Photonen stark
gestreut und für die Messung unbrauchbar. Die kurze Kohärenzlänge der Photonen gewährleistet nun, dass wirklich nur die Photonen, die direkt zurückgestreut wurden gemessen werden. Zudem werden bei der OCT Superluminiszenzdioden mit Zentralwellenlängen im nahen
Infraroten verwendet, da Wasser dort sehr wenig absorbiert.
Bei der OCT werden die genau einmal im Gewebe gestreuten Lichtteilchen anhand ihrer Interferenzfähigkeit herausgefiltert. Dazu wird ein Lichtstrahl mit einer Kohärenzlänge von nur
ca. 10µm senkrecht zur Gewebeoberfläche eingestrahlt und das zurückgestreute Licht mit
Hilfe einer interferometrischen Anordnung nach Art eines Michelson-Interferometers analysiert. Nur einfach gestreutes Licht, dessen Wegstrecke sich vor der des Referenzarms des Interferometers um weniger als die Kohärenzlänge unterscheidet, trägt zum Interferenzsignal
bei.
Sind die optischen Wege der beiden Photonen (Proben- und
Referenzphoton) gleichlange, so wird am Detektor ein Interferenzbild gemessen. Bei konstruktiver Interferenz ist die Intensität sehr groß (IDetektor=Imax). Bei destruktiver Interferenz wird
keine Intensität gemessen (IDetektor=0). Ist der optische Wegunterschied größer als die Kohärenzlänge der Lichtquelle, wird
am Detektor kein Interferenzbild, sondern lediglich die dort
ankommende Gesamtintensität des reflektierten Lichts (IDetektor=Imax/2).
Wenn der Referenzspiegel in eine Richtung (mit einem Piezotranslator) bewegt wird, wird das Interferenzbild innerhalb
der Kohärenzlänge moduliert. Die Detektion dieser Modulation IM wird elektronisch demoduliert, so dass die Einhüllende
der Modulation aufgenommen wird. Diese gibt dann Auskunft
darüber, aus welcher Tiefe das Photon reflektiert wurde.
Abb.: OCT Messung an einem Objekt aus Glas und einem Streuer [13]
a) Aufbauskizze des Objektes
b) Modulationsamplitude eines einzelnen OCT A-Scanns
c) Gesamtes OCT-Bild aus vielen A-Scanns
Das gemessene OCT-Signal ist die Intensität I in Abhängigkeit von der Zeit t und wird als
Zeitdomänen-Signal (Time-Domain TD) bezeichnet. Diese Intensität I(t) ist über die FourierTransformation mit der Intensität abhängig von der Frequenz I(ν) verknüpft. Dieses Signal
wird als Frequenzdomänen-Signal (Frequency Domain FD) bezeichnet.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Abb.: TD Signal und die
Fouriertransformierte davon, das FD-Signal [19]
Einfach ausgedrückt, bedeutet dies, dass man entweder den Referenzarm in der Länge verändert und kontinuierlich die Intensität der Interferenz messen ohne auf das Spektrum Rücksicht
zu nehmen (Time Domain) oder die Interferenz der einzelnen spektralen Komponenten erfassen (Frequency Domain). Dieses Verfahren wurde erst durch die Verfügbarkeit von schnellen,
empfindlichen Kameras und schnellen Rechnern ermöglicht. Hierzu wird noch ein dispersives
Element (Gitter oder Prisma) benötigt, welches die unterschiedlichen spektralen Komponenten (Licht unterschiedlicher Frequenzen) räumlich separiert. Für das Licht jeder einzelnen
Frequenz wird ein eigener Detektor benötigt, weshalb hier line-arrays oder CCD-Chips zum
Einsatz kommen.
Abb.: Frequenzdomänen OCT – Prinzip mit [19]
Im Gegensatz zum Zeitdomänen OCT befindet sich
der Spiegel des Referenzarms in Ruhe und das
Interferenzsignal wird nach Wellenlängen räumlich
separiert und von einer Serie von Detektoren ausgelesen.
Der Vorteil der FD-Verfahren liegt in der einfachen und schnellen simultanen Messung. Die
vollständige Information über die Tiefe wird hier simultan ermittelt, ohne ein bewegliches
Teil zu benötigen. Dadurch lässt sich sowohl die Geschwindigkeit erhöhen, als auch ein mechanisch weniger anfälliges Gerät bauen. Grundsätzlich sind auch simultane Messungen in
der Zeitdomäne möglich, diese erfordern aber nichtlineare Prozesse, die nur bei relativ hohen
Lichtintensitäten funktionieren. Dies widerspricht aber der hochsensitiven Messung bei Messsignalleistungen unterhalb des Nanowattbereichs.
Tiefeninformation:
In der Frequenzdomäne ist die Messtiefe über die Fouriertransformation mit der Abtastrate
verküpft. Hohe Abtastraten bzw. hohe Anzahl von Pixels eines Detektors innerhalb des gleichen Spektralbereiches erhöhen den Bereich in dem mehrere Objekte eindeutig voneinander
unterschieden werden können.
Die räumliche Auflösung in Strahlrichtung entspricht daher der Kohärenzlänge des verwendeten Lichtes. Die kontinuierliche Variation der Referenzarmlänge in Kombination mit lateralem Vorschub der Optik erlaubt schließlich die Darstellung von 2-dimensionalen Schnittbildern senkrecht zur Gewebeoberfläche.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Dargestellt wird die räumliche Verteilung des Streukoeffizienten. Ab einer Tiefe von ca. 2mm
lassen sich die Interferenzoszillationen, die durch die kontinuierliche Veränderung der Referenzarmlänge provoziert werden, nicht mehr aus dem Untergrund der mehrfach gestreuten
Lichtteilchen herausfiltern, da die Zahl der bis in diese Tiefe vorgedrungenen genau einmal
gestreuten Teilchen nur noch sehr gering ist.
Die Schnittbilder werden analog zur Sonographie im A-Modus aufgenommen und zu zweidimensionalen Tiefenschnitten (B-Modus) zusammengesetzt (siehe oben).
In der Praxis wird die starre Apparatur
des Michelson-Interferometers z. T.
durch Lichtwellenleiter ersetzt. Dieses
macht zum Einen das mühsame Arretieren der Strahlengänge überflüssig
und beseitigt deren Empfindlichkeit
gegenüber Erschütterungen und erlaubt
zum Andern die OCT auch an nicht
direkt zugängigen Körperstellen anzuwenden. Hierbei ersetzt ein optischer
Koppler (50:50) den Strahlteiler.
Abb.: Herstellung eines optischen Kopplers aus
mehreren Lichtwellenleitern [42]
Messtiefen und benutzte Wellenlängen bei unterschiedlichen Materialien:
Material
Zentralwellenlänge
des verwendeten Lichts
Durchschnittliche Messtiefe
NIR*
< mehrere cm
biologische Proben (hoher Wasseranteil)
Dermatologie (Haut)
830nm
< 1,5mm
1300nm
< 2,0mm
*Im nahen Infrarot-Bereich (NIR) ist der Absorptionskoeffizient von Wasser relativ gering.
Tabelle: Messtiefe und Zentralwellenlänge [13]
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
5.3 Anwendungsbereiche
5.3.1 Ophthalmologie5
Im Bereich des vorderen
Augenabschnittes werden
mit der OCT die Hornhautdicke, -krümmung und Defekte der Hornhaut dargestellt. Im Bereich des hinteren Augenabschnittes sind
Untersuchungen der Ausdehnung von Netzhautablösungen,
Makulalöchern6,
Netzhautödeme7, Dicke der
Nervenfaserschicht und Neovaskularisationen8 klinisch
Routine.
Abb.: Patientin (rechts) an einem OCT der Firma Zeiss mit der Ärztin vor dem Monitor (links). Auf dem Monitor ist der Befund eines Makulaloches zu erkennen. [38]
Zur Untersuchung der Netzhaut ist die OCT das am Besten geeignete Verfahren. Als nichtinvasives Verfahren ist sie auch bei der lichtempfindlichen Netzhaut unbedenklich, da sie mit
breitbandigem Licht mit deutlich geringeren Energiedichten als beispielsweise ein Laser arbeitet. Einen weiteren Vorteil bietet das kontaktfreie Messen, da die Netzhaut hinter dem
Glaskörper des Auges liegt, welcher das optisch kohärente Licht kaum stört, während die
Hochfrequenz-Ultraschallwellen bei der Sonographie viel zu stark durch ihn gebeugt werden.
Mit der OCT lässt sich also die beste Auflösung der Netzhaut erzielen, ohne sie dabei zu verletzen.
Die Netzhaut ist mit dem Film
eines Photoapparates vergleichbar,
es ist die lichtempfindliche Schicht.
Die Aderhaut ist die Unterlage,
welche die Netzhaut teilweise
ernährt. Die stärkste Reflektion
zeigt das Pigmentepithel.
Abb.: Aufbau des Auges (oben)
In einem OCT-Bild wird die Retina (Netzhaut) um die Fovea herum
in einem Schnittbild dargestellt [14]
5
Foto der Netzhaut mit Fovea (dunkel) in der Mitte und dem gelben
Fleck (Sehnerv) rechts (links)
Das OCT-Bild wird von links nach rechts durchgescannt [5]
Ophthalmologie: Augenheilkunde
Makulalöcher: Löcher in der Netzhaut
7
Netzhautödeme: Wassereinlagerungen in der Netzhaut
8
Neovaskularisationen: Gefäßneubildung, Gefäßwucherung
6
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Das OCT-Bild eines gesunden Patienten sieht wie folgt aus:
Abb.: OCT-Bild eines gesunden Patienten mit
histologischem Schnitt der Netzhaut [4]
Bei einem kranken Patienten sieht das
Bild etwas anders aus. Rechts sind drei
Beispiele unterschiedlicher Krankheitsbefunde gezeigt [5]:
A: Bestandteile des Blutes treten innerhalb der Netzhaut aus, was anhand der
schwarzen Kreise und der starken Reflektion (rot) darüber.
B: In der Netzhaut befindet sich eine
Bluteinlagerung, die auch im direkten
Bild (oben links in der Ecke) zu sehen
ist, dort kann man allerdings nicht die
Schwellung und den Grund der Schwellung erkennen. Blut reflektiert stark,
daher erlaubt die OCT solche Diagnosen.
C: Man erkennt deutlich die Einlagerung einer Flüssigkeit (oft Wasser) hier
ist es eine „Enzündungsfüssigkeit“.
5.3.2 Dermatologie9
Neben der Auflichtmikroskopie und der hochauflösenden Sonographie kommt die OCT zur
nicht-invasiven morphologischen Untersuchung der Haut zum Einsatz. Hierbei lassen sich mit
der Auflichtmikroskopie mit einer ca. sechzigfachen Vergrößerung oberflächliche Pigmentver-änderungen und Gefäßmuster näher begutachten. Mit der hochauflösenden Sonographie
gelingt bei Frequenzen von 20 bis 50MHZ eine Differenzierung von Strukturen innerhalb des
9
Dermatologie: Lehre von der Haut und ihren Erkrankungen (Hautheilkunde)
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Koriums10, wobei die Epidermis aufgrund einer zu geringen Auflösung von 40 bis 100µm
nicht ausreichend dargestellt wird.
Da jedoch viele Hauterkrankungen wie entzündliche Dermatosen und Tumore im Wesentlichen epidermale Veränderungen zeigen, kommt hier die OCT zum Einsatz. Sie kann ohne
Nebenwirkungen die obersten Hautschichten (das Stratum corneum11, die lebende Epidermis12 und obere Dermis13) mit einer Messauflösung von etwa 15µm bei einer Messtiefe bis
2mm morphologisch darstellen. Eine solche Untersuchung ist sonst lediglich mit der Histologie möglich, welche jedoch einen invasiven Eingriff mit entsprechenden Nebenwirkungen
und Risiken wie Entzündung, Blutung und Narbenbildung erfordert.
Abb.: OCT-Schnittbild der Haut an einer Fingerkuppe. Man erkennt
deutlich die schraubenförmigen Schweißdrüsen (links) [19]
Abb.: Unterschiedliche Hautschichten mit bis zur Basalmembran14 eingedrungenen Tumoren (rechts) [16]
5.3.3 Urologie und HNO-Heilkunde
Durch den endoskopischen OCT-Einsatz können körperinnere Oberflächen untersucht werden. Dabei lässt sich in der Urologie beispielsweise die Infiltrationstiefe und Lage von Blasentumoren mittels OCT feststellen, was insofern von Interesse ist, als dass oberflächliche
Tumore vom Arzt leicht abgeschabt werden können und tief gewachsene nicht.
5.3.4 Zahnheilkunde
In der Zahnheilkunde kann Karies oder eine Zahnschmelzverletzung mit der OCT frühzeitig
detektiert werden. Zudem lassen sich Heilungsprozesse am Übergang vom Zahnfleisch zum
Zahn bei Parodontosepatienten begutachten. Im Jahre 2002 wurde dieses Verfahren allerdings
noch nicht praktiziert.
10
Korium: Lederhaut
Stratum corneum: Hornhautschicht
12
lebende Epidermis: Oberste Schicht der Oberhaut (Epidermis)
13
Obere Dermis: Oberste Schicht der Unterhaut (Dermis)
14
Basalmembran: Schicht zwischen Oberhaut und Unterhaut
11
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5.4 Vor- und Nachteile der OCT
Anforderungen an OCT-Geräte für die Diagnostik:
-
hohe axiale Auflösung
hohe Messtiefe
kontaktfreies Messen
hohe Empfindlichkeit
Zusätzliche Anforderungen für die Anwendung der OCT in der Praxis:
-
einfache Bedienbarkeit (möglichst seltenes Nachjustieren)
flexible Erreichbarkeit des Probenortes (Patient)
kurze Messdauer (so klein, dass Bewegungen (Atmung, Herzschlag, etc.) nicht relevant sind)
Vergleich mit anderen nicht-invasiven, Bildgebenden, diagnostischen Verfahren:
Verfahren
konfokale Mikroskopie
Sonographie
OCT
Auflösung
Messtiefe
Darstellung von
ca. 1µm
ca. 100µm
einzelnen Zellen
bis zu 16µm
1mm
ca. 15µm
1,5mm
große Strukturen im
Gewebe
kleine Blutgefäße,
Zellverbände, Gewebeschichten
Tabelle: Erreichbare Messtiefe und Auflösung unterschiedlicher Verfahren im Vergleich [13]
Vor- und Nachteile der Verfahren im direkten Vergleich:
Verfahren
Vorteile
Nachteile
von OCT gegenüber:
konfokale Mikroskopie
- höhere Messtiefe
Sonographie
- OCT misst berührungslos
- keine direkten Informationen über Art des Gewebes
-
(z.B. offene Wunden messen)
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6. Resume - Perspektive
Der Vortrag hat gezeigt, wie nützlich Laser in der medizinischen Diagnostik sind, und wie
vielfältig sie eingesetzt werden. Und die Möglichkeiten sind noch lange nicht ausgeschöpft.
Vieler Orts wird stets weiter nach neuen Möglichkeiten gesucht, Krankheiten frühzeitig und
unproblematisch zu diagnostizieren, um sie anschließend therapieren zu können.
So erhoffen sich einige Mediziner und Wissenschaftler in baldiger Zukunft mit kleinen, handlichen Durchflusscytometern Krankheiten durch einfaches Beleuchten eines Blutgefäßes in
der Nase oder dem Ohr zu diagnostizieren. Bei Astronauten wäre so eine völlig unkomplizierte Ferndiagnose möglich.
Abb.: Zukunftsvisionen: Handliche Durchflusscytometer zur schnellen, unkomplizierten Diagnose direkt am
Menschen, ohne Blutproben zu entnehmen [28]
Ein Laser ist aber nicht nur zur Diagnose geeignet. Viele Krankheiten lassen sich durch gezieltes Bestrahlen mit einem Laser behandeln.
So lässt sich beispielsweise bei der OCT nach einer erfolgreichen Diagnose eines Netzhautproblems das Problem häufig durch Therapie ebenfalls mit einem LASER beheben.
Laser können bei einer Vielzahl verschiedener Erkrankungen der Netzhaut und Aderhaut eingesetzt werden. Netzhautlöcher können z.B. durch „Punktschweißen“ versiegelt und so die
gefährliche Netzhautablösung verhindert werden. Bei der Zuckerkrankheit kommt es durch
undichte bzw. krankhaft wuchernde Blutgefäße ebenfalls zu gefährlichen Veränderungen, die
mit dem Laser angegangen werden können.
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
7. Quellen- und Literaturverzeichnis
Literatur:
[1]
Lasers and Electro-Optics (Fundamentals and Engineering) – Christopher C. Davis, Cambridge University Press 1996, New York (USA)
[2]
Optische Spektroskopie (Eine Einführung) – Werner Schmidt, Wiley-VCH, 2000, Weinheim (Germany)
[3]
Laserspektroskopie (Grundlagen und Techniken) – Wolfgang Demtröder, Springer, 2000, Berlin
(Germany)
[4]
Optical Coherence Tomography of Macular Diseases – Vishali Gupta, Amod Gupta, Mangat R. Dogra, Taylor & Franci, 2004, New Delhi (India)
[5]
Optical Coherence Tomography of Ocular Diseases – Joel S Schuman, Carmen A. Puliafito, James G.
Fujimoto, Slack incorporated, 2004, Thorofare (USA)
[6]
Laser – Fritz Kurt Kneubühl, Markus Werner Sigrist, Teubner, 1988, Stuttgart (Germany)
[7]
Skript Experimentalphysik IV, Prof. Dr. R. Courths, SS2005 (Universität Duisburg-Essen)
[8]
Skript Physikalisches Praktikum für Anfänger, Dr. J. Kästner, SS 2005 (Universität Duisburg-Essen)
[9]
Skript Laserphysik, Prof. Dr. W. Kleemann, SS 2006 (Universität Duisburg-Essen)
[10]
Fluoreszenzdiagnostik und Photodynamische Therapie - B.M. Lippert, S. Schmidt, J.A. Werner, Marburger Laser-Zentrum, 2000, Aachen (Germany)
[11]
Progress in Biomedical Optics and Imaging Vol. 1, No. 31: Photon Migration, Diffuse Spectroscopy,
and Optical Coherence Tomography: Imaging and Functional Assessment – Stefan AnderssonEngels, James G. Fujimoto, Juli 2000, Amsterdam (Nederlands)
[12]
Progress in Biomedical Optics and Imaging Vol. 5, No. 5: Coherence Domain Optical Methods and
Optical Coherence Tomography in Biomedicine VIII – Valery V. Tuchin, Joseph A. Izatt, James G.
Fujimoto, Januar 2004, San Jose (California, USA)
[13]
Optische Kohärenztomographie: Dispersive Einflüsse und Anwendungen in der medizinischen Diagnostik – Eva Maria Lankenau (Inauguraldissertation zur Erlangung der Dokrorwürde der Medizinischen Universität zu Lübeck) Lübeck 2002
[14]
Untersuchungen von Hornhaut, Kammerwinkelregion, Iris und Linse mit dem Laser Tomographic
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der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität Tübingen) Tübingen 1990
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Hochauflösendes Laser Scan Ophthalmoskop: Aufbau und Analyse eines digitalen Bildgebenden
Systems zur Darstellung der menschlichen Netzhaut – Andreas Plesch (Inauguraldissertation zur
Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich – Mathematischen Fakultät der RuprechtKarls-Universität Heidelberg) Heidelberg 1986
[16]
Eignung der flächenhaften Detektion zur Erweiterung der optischen Kohärenztomographie an stark
streuenden dermalen Strukturen – Aristotel Razvan Lavar (Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm) Ulm 1999
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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik
Internet:
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