De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren

De novo synthetisierte Proteine mit
Metalloporphyrinkofaktoren
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin
Monika Fahnenschmidt
aus Sindelfingen
Dem Fachbereich 5 – Chemie –
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuß:
Vorsitzender: Prof. Dr. Schomäcker
Berichter: Prof. Dr. Lubitz
Berichter: Priv.-Doz. Dr. Schlodder
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2000
Berlin 2000
D 83
Abstract
Fahnenschmidt, Monika
De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren
Die Protein-de-novo-Synthese eröﬀnet vielfältige Möglichkeiten zur Konstruktion künstlicher
Proteinmodelle, die sowohl hinsichtlich theoretischer Fragestellungen zur Faltung und Funktion
natürlicher Proteine als auch für technische Anwendungen von großem Interesse sind.
In dieser Arbeit wurden verschiedene de novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren hergestellt und untersucht. Dem Design dieser Polypeptidmodule liegt ein VierHelix-Bündel als Faltungsmotiv zu Grunde, dessen einfache und kompakte Struktur gute Voraussetzungen zur Untersuchung der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung bietet.
Zur Konstruktion der Polypeptidmodule wurden einzelne lineare Peptide, die in wäßriger
Lösung amphiphile Helices ausbilden, mittels chemischer Festphasen-Peptidsynthese hergestellt
und auf einem Trägermolekül zu einem Vier-Helix-Bündel angeordnet. In den hydrophoben
Innenraum dieser Vier-Helix-Bündel konnten über Histidinseitengruppen Metalloporphyrinkofaktoren eingebunden werden. Durch den Einsatz unterschiedlicher Zentralmetallionen (Fe3+
(Hämin), Co3+ und Zn2+ ) konnten verschiedene funktionelle Eigenschaften in die Vier-HelixBündel eingeführt werden. Dabei zeigte sich, daß das Redoxpotential des Häminkofaktors durch
die Peptidumgebung beeinﬂußt werden kann und die Stabilität der Vier-Helix-Bündel gegenüber
dem denaturierenden Agenz Guanidinium-Hydrochlorid durch den Einbau des Kofaktors erhöht
wird. Das Co(III)porphyrin unterscheidet sich vom Hämin durch eine sehr langsame Reduktion
zu Co2+ , die mit der Freisetzung des Kofaktors in die wäßrige Lösung einhergeht. Durch den
Einbau des Zink(II)porphyrins in ein Vier-Helix-Bündel wurde ein wichtiger Schritt zur Entwicklung künstlicher Proteinmodelle für die Photosynthese realisiert. An diesem System wurde
der lichtinduzierte Elektronentransfer zu einem Chinon in Lösung gemessen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Charakterisierungsmethode auf der Basis der EPR- und
ENDOR-Spektroskopie ausgearbeitet, die eine detaillierte Beschreibung der Kofaktoreinbindung
in de novo synthetisierten Hämproteinen ermöglicht. Der Spin-Zustand, die g-Tensorhauptwerte
und die EPR-Linienbreite wurden herangezogen, um die axialen Liganden der Hämgruppe zu
identiﬁzieren und auf grundlegende Merkmale ihrer geometrischen Anordnung zu schließen. Die
Puls-ENDOR-Spektren der de novo synthetisierten Hämproteine und der Vergleich mit isotopenmarkierten Modellverbindungen zeigten, daß die ENDOR-Signale der Protonen der axialen
Histidinliganden hervorragend als spektroskopische Sonde zur Charakterisierung de novo synthetisierter Hämproteine eingesetzt werden können. Anhand orientierungsselektionierter ENDORSpektren in gefrorener Lösung wurde ihre Hyperfeinwechselwirkung mit einem eigens erstellten
Simulationsprogramm analysiert. Dies ermöglichte es, die Position der Protonen der axialen Histidinliganden im Koordinatensystem des g-Tensors zu bestimmen und damit detaillierte strukturelle Aussagen zur Bindungssituation des Kofaktors zu treﬀen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe der EPR- und ENDOR-Spektroskopie verschiedene de novo synthetisierte Hämproteine, die nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom
bc1 Komplexes modelliert wurden, charakterisiert. Es wurde festgestellt, daß nicht nur die Aminosäurezusammensetzung der einzelnen helicalen Bausteine, sondern auch das Designkonzept der
Vier-Helix-Bündel Einﬂuß auf die Einbausituation des Kofaktors nimmt. Dabei unterschied sich
die Faltung der Kofaktorbindungstasche in Templat-assoziierten synthetischen Proteine hinsichtlich der Orientierung der axialen Liganden von Vier-Helix-Bündeln, die auf der Selbstassoziation
einzelner helicaler Bausteine beruhen.
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröﬀentlicht
Wissenschaftliche Publikationen
1. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, H. K. Rau, W. Haehnel, W. Lubitz; Electron Paramagnetic Resonance and Electron Nuclear Double Resonance Spectroscopy of a Heme Protein
Maquette; Chem. Phys. Lett., 2000, 323, 329–339.
2. M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Characterization of de
novo designed heme proteins by EPR and ENDOR spectroscopy; Chem. Eur. J., 1999,
5, 2327–2334.
3. M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Spectroscopic Characterization of a de novo Synthesized Cytochrome b Model; in Magnetic Resonance
and Related Phenomena, D. Ziessow, W. Lubitz, F. Lendzian (editors), TU–Berlin 1998,
Vol. II, p. 824 – 825.
4. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; De novo Synthesized Proteins with
Metalloporphyrin Cofactors; in Vorbereitung.
Präsentationen auf internationalen Tagungen
1. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Characterization of De Novo Designed Heme Proteins; 2nd International Symposium of the Volkswagen–
Stiftung, April 16 – 18, 1998, Staﬀelstein.
2. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Models for Electron–Transfer
Proteins: EPR/ENDOR Spectroscopic Characterization of de novo Designed Heme Proteins; Twelfth International Conference on Photochemical Conversion and Storage of Solar
Energy, August 9 – 14, 1998, Berlin.
3. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Spectroscopic
Characterization of a de novo Synthesized Cytochrome b Model; Joint 29th AMPERE – 13th
ISMAR International Conference, August 2 – 7, 1998, Berlin.
4. M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Characterization of de
novo Designed Redox Active Proteins by EPR and ENDOR Spectroscopy; 3nd International
Symposium of the Volkswagen–Stiftung, April 7 – 10, 1999, Konstanz.
5. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Synthesis and Spectroscopy of de
novo Designed Heme Proteins; 3nd International Symposium of the Volkswagen–Stiftung,
April 7 – 10, 1999, Konstanz.
6. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Polypeptide Modules with Metalloporphyrin Cofactors for Electron Transfer Studies; 4nd International Symposium of the
Volkswagen–Stiftung, Juni 4 – 6, 2000, Wildbad Kreuth.
7. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; De novo Synthesized Proteins with
Metalloporphyrin Cofactors; 26th European Peptide Symposium, September 11 – 15, 2000,
Montpellier, France.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1
2 Protein-de-novo-Synthese
5
2.1
Syntheseprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2
Einbau von Kofaktoren
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Theoretische Grundlagen
6
11
15
3.1
EPR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
3.2
ENDOR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
3.3
EPR- und ENDOR-Messungen in gefrorenen Lösungen . . . . . . . . . . . . . . .
26
3.4
Elektronische Struktur von Häminkomplexen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
3.4.1
Low-spin Häminkomplexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
3.4.2
High-spin Häminkomplexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4 Materialien und Methoden
4.1
41
Synthese der Polypeptidmodule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
4.1.1
Automatische Festphasensynthese der Peptide . . . . . . . . . . . . . . . .
42
4.1.2
Modiﬁzierung der Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
4.1.3
Abspaltung der Peptide von der festen Phase . . . . . . . . . . . . . . . .
44
4.1.4
Zusammensetzen der einzelnen Peptid-Bausteine zum Vier-Helix-Bündel .
45
4.1.5
Einbau von Metalloporphyrinkofaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
4.1.6
Cytochrom b Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
4.2
Präparation von Modellverbindungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
4.3
Methoden zur Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
iii
iv
INHALTSVERZEICHNIS
4.4
4.3.1
Hochauﬂösende Flüssigkeitschromatogaphie (HPLC) . . . . . . . . . . . .
49
4.3.2
Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
4.3.3
Analytische Gelﬁltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
4.3.4
Circulardichroismus (CD) und Tryptophan-Fluoreszenz . . . . . . . . . .
50
4.3.5
UV/VIS-Absorptionsspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
4.3.6
Blitzlichtspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
4.3.7
EPR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
4.3.8
ENDOR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
Programme zur Auswertung der EPR- und ENDOR-Spektren . . . . . . . . . . .
55
4.4.1
EPR-Simulationsprogramm ELSI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
4.4.2
ENDOR-Simulationsprogramm SIMES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
5 Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer MetalloporphyrinBindungsstelle
61
5.1
Designkonzept der Polypeptidmodule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
5.2
Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
5.2.1
Aufbau der Vier-Helix-Bündel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
5.2.2
Stabilität der Polypeptidmodule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
68
Hämin als redoxaktiver Kofaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
5.3.1
Einbau des Hämins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
5.3.2
Redoxpotential des Kofaktors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
5.3.3
Stabilität der künstlichen Hämproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
5.3.4
EPR-spektroskopische Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
5.4
Einbau eines Kobaltporphyrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
85
5.5
Zink(II)porphyrin als Kofaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
5.5.1
UV/VIS-Absorptionsspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
5.5.2
EPR-Spektroskopie am Triplettzustand . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
5.5.3
Blitzlichtspektroskopie und Elektronentransfer . . . . . . . . . . . . . . .
93
Zusammenfassung und Schlußfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
98
5.3
5.6
6 Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
6.1
101
Designkonzept der Cytochrom b Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
INHALTSVERZEICHNIS
6.2
6.3
6.4
v
EPR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
6.2.1
Simulation der EPR-Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
6.2.2
Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte . . . . . . . . . . . . . . . . 110
6.2.3
Untersuchungen zur HALS-Spezies des MOP . . . . . . . . . . . . . . . . 113
ENDOR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
6.3.1
14 N
6.3.2
1H
und
15 N
ENDOR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
ENDOR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.3.2.1
Identiﬁzierung der ENDOR-Signale anhand von Modellkomplexen 121
6.3.2.2
Analyse der 1 H ENDOR-Spektren des ‘maquette’ . . . . . . . . 123
6.3.2.3
Gegenüberstellung der Cytochrom b Modelle . . . . . . . . . . . 130
Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
7 Zusammenfassung und Ausblick
141
Anhang
147
A EPR-Simulationsprogramm ELSI
147
A.1 Programm-Code für Linienverbreiterung durch ‘g-strain’ . . . . . . . . . . . . . . 147
A.2 Eingabe-Datei für ELSI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
B ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
155
B.1 Programm-Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
B.2 Eingabe-Datei für SIMES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Literaturverzeichnis
165
Kapitel 1
Einleitung
Proteine stellen eine der wichtigsten Klassen an Biomakromolekülen dar. Dies deutet bereits
ihr Name an, der von dem Griechischen Wort proteuo – ich nehme den ersten Platz ein – abstammt [1]. Fast alle biochemischen Prozesse in Lebewesen werden durch Proteine reguliert [2].
Als Enzyme katalysieren sie die enorme Vielfalt an chemischen Stoﬀwechselreaktionen in Zellen, die unter physiologischen Bedingungen ansonsten nicht möglich wären. Proteine dienen
als Speicher- und Transportsysteme von Elektronen oder Molekülen, wie beispielsweise Sauerstoﬀ, Glucose, Metallionen oder Lipiden. Als Hormone erfüllen Proteine wichtige Signalübertragungsfunktionen. Bei der Immunabwehr übernehmen Antikörper und Immunoglobine essentielle
Schutzfunktionen. Des weiteren spielen Proteine eine entscheidende Rolle in der Muskelkontraktion und beim Aufbau von Gewebe, Knochen oder Haaren.
Alle Proteine sind aus 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut, die über eine Amidbindung zu linearen Polypeptidketten verknüpft sind. In den meisten bekannten Proteinen liegt die
Kettenlänge bei etwa 100 bis 300 Aminosäuren, wobei sich einige Proteine jedoch aus mehreren
Polypeptidketten zusammensetzen oder deutliche längeren Ketten mit bis zu 1800 Einzelbausteinen (Myosin) enthalten können [2]. Durch die Faltung der linearen Polypeptidketten entstehen
dreidimensionalen Proteinstrukturen, in welche weitere organische Moleküle oder Metallionen
eingebunden sein können. Diese sogenannten Kofaktoren bilden häuﬁg das eigentlich katalytisch aktive Zentrum von Enzymen. Ihre funktionellen Eigenschaften werden entscheidend von
der Wechselwirkung mit der Proteinumgebung geprägt. Wie anhand von Hämproteinen zu sehen ist, kann auf diese Weise ein Kofaktor (Eisenprotoporphyrin IX) verschiedene Funktionen
1
2
1. Einleitung
ausüben [3]. In Hämoglobin und Myoglobin ermöglicht die Hämgruppe den Transport und die
Speicherung von Sauerstoﬀ [4]. In Katalasen, Peroxidasen und Oxygenasen hingegen ist sie an
der Umsetzung verschiedenster Stoﬀwechselprodukte beteiligt [5]. In Elektronentransferprozessen tritt die Hämgruppe als Kofaktor der Cytochrome mit einer außerordentlich weiten Spanne
an Redoxpotentialwerten (+400 bis −500 mV) auf [6, 7].
Die Zusammenhänge zwischen Aminosäuresequenz, Struktur und Funktion von Proteinen
zu erforschen, ist eine große Herausforderung. Neben einem tieferen Verständnis komplexer biochemischer Systeme eröﬀnet sich hier die Perspektive, die speziellen Eigenschaften von Proteinen technisch nutzbar zu machen. Die Erforschung der Wechselwirkung zwischen Kofaktoren
und ihrer Proteinumgebung ist dabei von zentraler Bedeutung. Der gezielte Einsatz von speziﬁschen Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen sollte es analog zu natürlichen Proteinen ermöglichen,
künstliche Systeme mit maßgeschneiderten funktionellen Eigenschaften zu konstruieren.
Neben der gentechnischen Modiﬁzierung von natürlichen Proteinen (Protein-Engineering)
gewinnt hierbei die chemische Synthese künstlicher Proteinmodelle (Protein-de-novo-Synthese)
zunehmend an Bedeutung. Da hier künstliche Proteine “von Neuem”, d. h. frei nach den eigenen
Modellvorstellungen entworfen werden können, verwendet man auch häuﬁg den Begriﬀ Proteinde-novo-Design.
Die Fortschritte, die im Bereich der Protein-de-novo-Synthese erzielt wurden, zeigen, daß es
mittlerweile möglich ist, Polypeptide herzustellen, die in kompakte dreidimensionale Strukturen
falten [8–10] und Kofaktoren binden können [11–13]. Die Weiterentwicklung dieser Systeme wird
durch interessante Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin (Impfstoﬀe, Medikamente) [14–16],
Mikro- und Nanotechnologie (biokompatible Oberﬂächen, artiﬁzielle Ionenkanäle) [17–19] oder
der Katalyse [20, 21] und Bioelektronik [22, 23] motiviert.
Da viele Aspekte der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung noch nicht geklärt sind, deren
Verständnis aber Voraussetzung für ein erfolgreiches Design funktioneller künstlicher Proteine ist, beschäftigt sich die hier vorliegende Arbeit mit der Untersuchung de novo synthetisierter
Proteine, die Kofaktoren aufnehmen können. Aufgrund der Vielseitigkeit der biologischen Funktion von Hämin, steht dieser Kofaktor dabei im Vordergrund. Voraussetzung zur Untersuchung
der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung ist eine möglichst genaue Kenntnis der Bindungssituation
des Kofaktors in seiner Proteinumgebung. Da die Hämgruppe in ihrem oxidierten Zustand (Fe3+ )
3
paramagnetisch ist, kann der Kofaktor selbst als spektroskopische Sonde in magnetischen Resonanzuntersuchungen eingesetzt werden. Zur Charakterisierung de novo synthetisierter Hämproteine werden hier die EPR- (Electron Paramagnetic Resonance) und ENDOR- (Electron Nuclear
Double Resonance) Spektroskopie herangezogen.
Im nächsten Kapitel wird zunächst ein Überblick über den Stand der Forschung auf dem
Gebiet der Protein-de-novo-Synthese gegeben. Dabei werden die Entwicklungen und Prinzipien
zum Design künstlicher Proteinmodelle vorgestellt, auf denen die vorliegende Arbeit aufbaut.
In Kapitel 3 werden die theoretischen Grundlagen zu den hier verwendeten Methoden der magnetischen Resonanzspektroskopie erläutert. Im Vordergrund steht dabei, wie die Meßgrößen der
EPR- und ENDOR-Spektroskopie hinsichtlich der elektronischen und geometrischen Struktur
künstlicher Hämproteine interpretiert werden können. Kapitel 4 (Materialien und Methoden)
faßt alle experimentellen Aspekte zur Durchführung der hier vorliegenden Arbeit zusammen.
Die Ergebnisse werden in den Kapiteln 5 und 6 vorgestellt. In Kapitel 5 werden de novo synthetisierte Proteine untersucht, die aus dem kompakten dreidimensionalen Strukturmotiv eines
Vier-Helix-Bündels aufgebaut sind und eine Bindungsstelle für Metalloporphyrine enthalten.
Diese Systeme wurden im Rahmen dieser Arbeit hergestellt, um den Einﬂuß der Aminosäurezusammensetzung auf die Struktur, Stabilität und Kofaktoreinbindung in de novo synthetisierten
Proteinen zu untersuchen. Durch den Einbau von Metalloporphyrinen mit unterschiedlichen Zentralmetallionen (Fe3+ (Hämin), Co3+ und Zn2+ ) können verschiedene funktionelle Eigenschaften
in die de novo synthetisierten Proteine eingeführt werden. Um zu erforschen, inwieweit sich diese Polypeptidmodule als Modellsysteme natürlicher Proteine einsetzen und funktionalisieren
lassen, werden die Bindungssituation und die Eigenschaften der Kofaktoren in der Polypeptidumgebung mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht. In Kapitel 6 liegt der
Schwerpunkt dagegen auf der magnetischen Resonanzspektroskopie. Hier werden verschiedene
de novo synthetisierte Hämproteine, die nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc1
Komplexes entworfen wurden, mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert. Ziel
der magnetischen Resonanzuntersuchungen ist eine detaillierte strukturelle Beschreibung der
Bindungssituation der Kofaktoren. Dabei wird untersucht, wie sich das Designkonzept von de
novo synthetisierten Proteinen auf den Einbau der Hämgruppen auswirken kann. Die Arbeit
schließt in Kapitel 7 mit einer Zusammenfassung der Ergebnisse und einem Ausblick für weitere
Perspektiven in der Protein-de-novo-Synthese.
4
Kapitel 2
Protein-de-novo-Synthese
Ziel der Protein-de-novo-Synthese ist die Konstruktion von künstlichen Proteinmodellen. Diese
Modellsysteme sind sowohl hinsichtlich grundlegender theoretischer Fragestellungen zur Struktur und Funktion von Proteinen, als auch für praktische Anwendungsmöglichkeiten in der
(bio)chemischen Katalyse, der Medizin oder Biotechnologie von großem Interesse. Entscheidend
für die Entwicklung der Protein-de-novo-Synthese war die Einführung der Festphasenpeptidsynthese durch Merriﬁeld, die eine Automatisierung der ansonsten aufwendigen chemischen Polypeptidsynthese ermöglichte [24]. Zur Konstruktion der Proteinmodelle lassen sich auch gentechnische Methoden (DNA-Rekombinationstechnik, Oligonucleotid-Synthese) einsetzen [25]. Der
Vorteil der chemischen Synthese liegt in der freien Wahl beliebiger Aminosäuresequenzen, die
auch nicht-natürliche Aminosäurederivate mit speziellen Eigenschaften (z. B. zur Metallionenbindung [26], als Fluoreszenzmarker oder Spinlabel [27, 28]) enthalten können.
Die Protein-de-novo-Synthese stellt eine zweifache Herausforderung dar. Die künstlich hergestellten Polypeptide sollen in eine deﬁnierte Struktur falten und speziﬁsche funktionelle Eigenschaften aufweisen. Der erste Abschnitt dieses Kapitels befaßt sich mit dem Problem der
Faltung der künstlichen Proteinmodelle. Hier werden verschiedene Strategien vorgestellt, die
eingesetzt werden, um in de novo synthetisierten Proteinen deﬁnierte Strukturen zu erzeugen.
Im zweiten Abschnitt geht es um die Einbindung von Kofaktoren, über die spezielle funktionelle
Eigenschaften in die de novo Proteine eingeführt werden sollen.
5
6
2. Protein-de-novo-Synthese
2.1
Syntheseprinzip
Bei 20 verschiedenen natürlichen Aminosäuren existieren für eine Polypeptidkette aus 100 Einzelbausteinen bereits 20100 Möglichkeiten verschiedener Aminosäuresequenzen [9]. Demgegenüber
sind in einer eukaryontischen Zelle jedoch “nur” etwa 105 Sequenzen in Form natürlicher Proteine realisiert [1, 29]. Es könnte also noch eine große Anzahl an Peptidsequenzen verborgen sein,
die zu Proteinen mit neuen Strukturen und damit neuen funktionellen Eigenschaften führen.
Wie Peptidbibliotheken1 mit willkürlich gewählten Aminosäuresequenzen zeigen [30], bilden jedoch nicht alle Polypeptidketten wohldeﬁnierte dreidimensionale Strukturen aus. Eine zentrale
Aufgabe des Protein-de-novo-Designs ist die Suche nach Aminosäuresequenzen, die in bestimmte Strukturen falten (“inverse folding problem” [31]). Der Einsatz von computerunterstützten
Modellrechnungen gewinnt bei dem Design künstlicher Proteinmodelle zunehmend an Bedeutung [32–34]. Durch die Synthese von Polypeptiden mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen
können die physikalischen Modellvorstellungen, die den Berechnungen zur Proteinfaltung zugrunde liegen, wiederum überprüft werden. Auf diese Weise können grundlegende Prinzipien
der Proteinfaltung in künstlichen Proteinmodellen herausgearbeitet werden.
Als Leitfaden für das Protein-de-novo-Design dienen die verschiedenen Organisationsebenen
von Proteinstrukturen, die in vier Ebenen gegliedert werden [1]. Die Primärstruktur gibt die Abfolge der Aminosäuren in einer Polypeptidkette an (Aminosäuresequenz). Die Sekundärstruktur beschreibt die lokale Gerüstkonformation der Polypeptidketten. Man unterscheidet dabei
z. B. helicale Bereiche von planaren Faltblattstrukturen, die untereinander durch Faltstellen
(Turns), Schlaufen (Loops) oder weniger geordnete Kettensegemente verbunden sein können.
In Abbildung 2.1 ist der Aufbau einer α-Helix und eines β-Faltblattes dargestellt. Diese Sekundärstrukturelemente ordnen sich in einer speziellen dreidimensionalen Struktur, der Tertiärstruktur, an. Die Anordnung verschiedener Polypeptidketten in Proteinen, die aus mehreren
Polypeptid-Untereinheiten bestehen, wird als Quartärstruktur bezeichnet.
Bei dem Design von de novo Proteinen werden im ersten Schritt Peptidblöcke mit hoher
Tendenz zur Bildung deﬁnierter Konformationen (α-Helices, β-Faltblattstrukturen oder Loops)
entworfen und im zweiten Schritt zu “kleinen Tertiärstrukturen” (Faltungseinheiten) zusammen1
Mit Peptidbibliothek bezeichnet man die Zusammenstellung einer großen Anzahl verschiedener Polypeptide,
die mittels gentechnischer Methoden oder über chemische Synthese erhalten wurden.
2.1 Syntheseprinzip
7
geführt. In Abbildung 2.2 wird dieses Aufbauprinzip schematisch erläutert.
Das Design der Sekundärstrukturelemente stützt sich auf die bisherigen Erkenntnisse, die
zur Proteinfaltung vorliegen. Im allgemeinen ist die Konstruktion von helicalen Strukturen, die
durch interne Wasserstoﬀbrücken des Peptidgerüstes stabilisiert werden und damit unabhängige
autonome Faltungseinheiten darstellen, einfacher als das Design von Faltblattstrukturen, die nur
zu ihrem nächsten Nachbarstrang Wasserstoﬀbrücken ausbilden können (siehe Abbildung 2.1).
Die Stabilisierung von Sekundärstrukturelementen hängt sowohl von kurzreichweitigen Wechselwirkungen (einzelne Aminosäuren scheinen bestimmte Konformationen zu bevorzugen) als auch
von langreichweitigen Wechselwirkungen der Aminosäuren untereinander ab.
Abbildung 2.1: Darstellung einer α-Helix (links) und einer β-Faltblattstruktur (rechts in Aufsicht und Seitenansicht) nach [35]. Die α-Helix wird durch fast lineare Wasserstoﬀbrückenbindungen zwischen CO und NH-Gruppen der Hauptkette stabilisiert. Die gesamte Struktur besitzt ein
stäbchenförmiges Aussehen, wobei die Aminosäureseitenketten nach außen ragen. Für eine HelixWindung werden 3,6 Aminosäuren benötigt. In β-Faltblattstrukturen werden Wasserstoﬀbrückenbindungen zwischen den CO- und NH-Gruppen verschiedener Ketten (hier antiparallel verlaufend)
gebildet. Die Seitenketten der Aminosäure stehen jeweils ober- und unterhalb der Ebene des Faltblattes.
8
2. Protein-de-novo-Synthese
&
}
Abbildung 2.2: Das Design von de novo Proteinen basiert auf dem Organisationsprinzip zur Klassiﬁzierung natürlicher Proteinstrukturen. Danach setzen sich dreidimensionale Proteinstrukturen aus
Sekundärstrukturelementen (α-Helices, β-Faltblattstrukturen) zusammen, die über kurze Peptidketten (Loops oder Turns) miteinander verbunden sind. Hierzu ist exemplarisch das Strukturmotiv eines
Zinkﬁngerproteins gezeigt, das zwei β-Faltblätter und eine α-Helix enthält.
Anhand statistischer und experimenteller Untersuchungen an Proteinen und Polypeptiden
wurden die Aminosäuren nach ihrer Tendenz, bestimmte Sekundärstrukturelemente auszubilden,
geordnet. Dazu wurde zum einen die relative Häuﬁgkeit des Auftretens bestimmter Aminosäuren
in Sekundärstrukturelementen als Kriterium herangezogen [36] oder der Einluß einzelner Aminosäuren auf die Sekundärstrukturausbildung durch ihren gezielten Austausch in Polypeptiden
nach dem Wirt-Gast-Prinzip untersucht [37]. Zur Konstruktion α-helicaler Peptidbausteine verwendet man daher beispielsweise sehr häuﬁg die Aminosäuren Alanin, Leucin und Lysin [9, 38].
Die Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten verschiedener Aminosäuren können die
Faltung eines Polypeptides entscheidend beeinﬂußen. Neben Wasserstoﬀbrückenbindungen und
elektrostatischen Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten [39] spielen dabei insbesondere
die hydrophoben Wechselwirkungen eine große Rolle. So ﬁndet man in natürlichen Proteinen
häuﬁg eine deﬁnierte Reihenfolge von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die in etwa
der Periodizität des jeweiligen Sekundärstrukturelementes entspricht (3,6 für α-Helices, 2,0 – 2,3
für β-Faltblätter) [40]. Anhand künstlicher Polypeptide, die ausschließlich Leucin und Lysin enthalten, konnte gezeigt werden, daß die Reihenfolge der Plazierung der hydrophoben Aminosäure
Leucin gegenüber dem hydrophilen Lysin, die Ausbildung verschiedener Sekundärstrukturelemente dirigieren kann [41]. Zur Konstruktion von kompakten, helicalen Strukturen hat sich
das Prinzip einer deﬁnierte Abfolge an hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren bereits bestens bewährt (binary-code Strategie) [42]. Auf diesem Wege konnten verschiedene amphiphile
2.1 Syntheseprinzip
9
α-Helices erhalten werden.
Amphiphile Sekundärstrukturelemente besitzen eine starke Neigung zur Selbstassoziation.
Dies kann zur Anordnung der einzelnen Peptidbausteine in eine übergeordnete dreidimensionale
Struktur ausgenutzt werden. Beispielsweise bilden amphiphile α-Helices in Wasser bevorzugt
tetramere Strukturen [42, 43]. Die treibende Kraft der Zusammenlagerung der einzelnen Helices liegt in der Ausbildung eines hydrophoben Innenraums (siehe Abbildung 2.3 und 2.4). Zur
Konstruktion eines Vier-Helix-Bündels können die einzelnen helicalen Peptidblöcke über Loops
oder Disulﬁdbrücken miteinander verbunden werden. Neben de novo synthetisierten Proteinen, die sich auf diese Verknüpfungsmethoden natürlicher Proteine beschränken, können in der
Protein-de-novo-Synthese auch weitere Methoden der organischen Chemie zur Quervernetzung
von Polypeptidbausteinen herangezogen werden. Von Mutter et al. [29,44] wurde ein Designkonzept eingeführt, in dem die Anordnung der einzelnen Peptidblöcke durch ihre Fixierung auf
einem Trägermolekül (Templat) dirigiert wird. Diese Templat-assoziierten synthetischen Proteine (TASP) haben eine nicht-natürliche Konnektivität der Polypeptidketten und sind somit nur
durch chemische Synthese zugänglich. Als Templat können Polypeptide [29,44,45] oder beliebige
andere Moleküle [46,47] mit geeigneter räumlicher Anordnung funktioneller chemischer Gruppen
zur Verankerung der Polypeptidblöcke dienen. Das Templat legt durch die kovalente Fixierung
der Peptidblöcke die Topologie der gesamten Faltungseinheit fest. Demgegenüber wird in dem alternativen Designkonzept, das auf der Selbstassoziation und linearen Verknüpfung der einzelnen
Peptidblöcke beruht, die Topologie des Vier-Helix-Bündels ausschließlich durch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Helices bestimmt. Dabei spielen insbesondere Packungseﬀekte,
hydrophile und
hydrophobe Bereiche
amphiphiler Helices
Abbildung 2.3: Aufsicht auf ein Vier-Helix-Bündel. Amphiphile Helices ordnen sich in Wasser
bevorzugt in tetrameren Strukturen an, wobei sich die hydrophoben Bereiche zusammenlagern und
sich die hydrophilen Seiten nach Außen kehren.
10
2. Protein-de-novo-Synthese
S S
Abbildung 2.4: Amphiphile Helices neigen zur Selbstassoziation und bilden in Wasser bevorzugt tetramere Strukturen aus, die sich hervorragend zur Konstruktion von künstlichen Vier-Helix-Bündeln
eignen. Links gezeigt ist ein Designkonzept, in welchem die helicalen Peptidblöcke analog zu natürlichen Proteinen über Loops oder Disulﬁdbrücken miteinander verbunden werden. Rechts ist ein
Templat-assoziiertes synthetisches Protein mit einer quervernetzten Struktur gezeigt, in welchem
die einzelnen Helices auf einem Trägermolekül (Templat) ﬁxiert werden.
d. h. die geometrische Anordnung der Seitenketten von Aminosäuren im hydrophoben Innenraum der Vier-Helix-Bündel, eine große Rolle [48, 49]. Von Vier-Helix-Bündeln, in denen die
Seitenketten der Aminosäuren eine deﬁnierte Konformation einnehmen, konnten die Strukturen
mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden [10, 50]. Andere Vier-Helix-Bündel liegen dagegen als molten globules vor, deren Seitenketten im hydrophoben Kern schlecht gepackt sind und
mehrere Konformationen annehmen können. In diesem Fall ﬁndet man im Unterschied zu einem
nativen Faltungszustand von Proteinen in den NMR-Spektren sehr breite Linien und einen langsamen Austausch der Amidprotonen [51]. Die unterschiedliche NMR-Charakteristik von molten
globules und deﬁnierten Strukturen, die nativen Faltungszuständen entsprechen, kann als Kriterium zur Bewertung des Design von de novo synthetisierten Proteinen herangezogen werden.
Neben dem Strukturmotiv des Vier-Helix-Bündels [9, 29, 38, 43, 45–53] konnten inzwischen
auch Strukturen, die β-Faltblätter enthalten in de novo synthetisierten Proteinen realisiert werden [54]. Dazu gehört auch das Zinkﬁngermotiv [8, 55, 56], das aus einer α-Helix, die sich über
eine Ebene aus zwei β-Faltblattstrukturen beugt, besteht (siehe auch Abbildung 2.2 für eine
vereinfachte schematische Darstellung). Wie der Name bereits zeigt, können Metallionen (Zn2+ )
eingelagert werden. Zur Einbindung von Kofaktoren wurde jedoch auch das Strukturmotiv des
Vier-Helix-Bündels erfolgreich eingesetzt.
2.2 Einbau von Kofaktoren
2.2
11
Einbau von Kofaktoren
Der Einbau des Kofaktors Hämin in künstliche Vier-Helix-Bündel durch die Arbeitsgruppen von
Dutton und DeGrado [11, 12] stellt einen bedeutenden Beitrag in der Protein-de-novo-Synthese
dar. Diese Systeme eröﬀneten die Möglichkeit, künstliche Enzymmodelle für Elektronentransfer
oder Katalyse herzustellen. Das Designkonzept der Vier-Helix-Bündel beruht auf der Selbstassoziation helicaler Polypeptidbausteine. Der Kofaktor Hämin wurde über die axiale Koordination
mit zwei Histidinresten in den Innenraum des Vier-Helix-Bündels eingebunden. Diese Koordination ﬁndet man auch häuﬁg in natürlichen Proteinen, wie beispielsweise Cytochrom b5 (siehe
Abbildung 2.5) [57, 58]. Entsprechend ihrer Zielsetzung werden diese Systeme als ‘maquettes’
bezeichnet. Der Begriﬀ ‘maquette’ steht im Englischen für Miniaturmodelle in der Architektur oder Kunst (Skulpturen). Im Französischen ist dieser Begriﬀ noch allgemeiner gefaßt und
schließt den Modellbau (z. B. Flugzeuge) mit ein. In den ‘maquettes’ sollen die Eigenschaften,
die für die Funktion natürlicher Proteine essentiell sind, in einfachen und kompakten Strukturen
erfaßt werden.
Die spektroskopischen und elektrochemischen Eigenschaften der ‘maquettes’ sind dem Verhalten natürlicher Hämproteine ähnlich [53]. So zeigt die Hämgruppe eine starke Aﬃnität zur
Bindung im de novo synthetisierten Protein. Außerdem wurden die de novo synthetisierten
Hämproteine als Modellsysteme eingesetzt, um den Einﬂuß protonierbarer Aminosäuren auf das
Redoxpotential des Kofaktors zu untersuchen [59].
Neben Hämin [11,12,59,62,63] wurden auch andere Kofaktoren, wie Flavine [64] und einzelne
Metallionen [65, 66] in künstliche Vier-Helix-Bündel eingebaut. Anhand von de novo synthetisierten Proteinen, deren Design sich an der Struktur des Ferredoxins orientiert, wurden die
Bedingungen, die zum Aufbau von Eisenschwefelclustern notwendig sind, untersucht [67–69].
In diesen Ferredoxin-‘maquettes’ bilden sich [4Fe-4S]2+/+ -Cluster, deren spektroskopische und
elektrochemischen Eigenschaften bakteriellen Ferredoxinen ähneln [70].
Der Kofaktor kann bei der Protein-de-novo-Synthese auch als strukturbildendes Element
eingesetzt werden. Beispielsweise wurde ein Porphyrinsystem (Coproporphyrin I) kovalent an
die helicalen Bausteinen eines Vier-Helix-Bündels gebunden. In Analogie zu photosynthetischen
Reaktionszentren bilden sich Porphyrin-Dimere, welche die Struktur des Vier-Helix-Bündels
zusätzlich stabilisieren [28, 71]. Des weiteren konnten durch die kovalente Anknüpfung von Por-
12
2. Protein-de-novo-Synthese
N
N
Fe
N
COOH
N
HOOC
Abbildung 2.5: Der Kofaktor Hämin besteht aus einem Tetrapyrrolring (Protoporphyrin IX) mit
einem Fe3+ -Ion als Zentralmetallion. Im reduzierten Zustand (Fe2+ -Ion) bezeichnet man das Metalloporphyrin auch als Häm. Ober- und unterhalb der Ebene des Porphyrinringes können zwei Moleküle
als axiale Liganden an das Zentralmetallion binden. In Proteinen dienen dazu häuﬁg Histidin (wie
rechts am Beispiel eines Strukturausschnittes von Cytochrom b5 gezeigt [58]) oder Methionin. Das
Fe3+ -Ion im Zentrum ist hier symbolisch als kleine Kugel gezeichnet. Der eﬀektive Ionenradius des
Fe3+ beträgt 0,55 Å bei 6-facher Koordination im low-spin Zustand [60]. Damit paßt es gut in die
Ringebene des Porphyrins [61].
2.2 Einbau von Kofaktoren
13
phyrinringen auch Systeme erhalten werden, in welchen ein Metalloporphyrin (mit Fe3+ , Co3+
oder Zn2+ als Zentralmetallion) von einer oder zwei Helices bedeckt wird [72–76]. Diese relativ
einfachen “Sandwich”-Verbindungen werden auch als Mimichrome bezeichnet. Die Komplexbildung von Metallionen mit Bipyridin, das kovalent an helicale Polypeptidketten ﬁxiert werden
kann, wurde ausgenutzt, um Strukturen zu erzeugen, die sich aus drei α-Helices zusammensetzen [77–79]. Verwendet man als Metallion Ru2+ , so entsteht bei der Zusammenlagerung der
Drei-Helix-Bündel ein photoaktiver Ruthenium(II)-tris-Bipyridin-Komplex, der sich hervorragend zur Untersuchung von lichtinduziertem Elektronentransfer eignet [80]. Der Aufbau dieser
Systeme entspricht dem Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine, wobei der
Kofaktor selbst als Templat dient. Damit werden Strukturbildung und Funktion direkt miteinander verbunden. Der Nachteil dieser Methode ist, daß die Eigenschaften des Kofaktors nur
noch bedingt durch die Polypeptidumgebung beeinﬂußbar sind, da sich dieser als Templat meist
außerhalb der Proteinumgebung beﬁndet.
In der Arbeitsgruppe Haehnel wurde das Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer
Proteine dagegen mit dem Einbau von Kofaktoren in den Innenraum von Vier-Helix-Bündeln
kombiniert [81]. Als Templat dient ein zyklisches Dekapeptid. Neben Hämin, das über zwei
axiale Histidinliganden koordiniert wird [13, 82], wurden auch Chlorophyllderivate (Zink(II)methylpheophorbide) über die kovalente Anknüpfung der Seitengruppen in den Innenraum von
Vier-Helix-Bündeln eingeführt [81]. Eines der de novo synthetisierten Hämproteine wurde an eine
Goldoberﬂäche gekoppelt, wodurch ein elektrischer Kontakt zwischen der Metalloberﬂäche und
dem redoxaktiven de novo Protein entsteht [22]. Mit diesen Systemen werden bioelektronische
Anwendungen ermöglicht [23]. Außerdem konnte durch die Fixierung eines Ruthenium(II)-trisbipyridin-komplexes an die Außenseite eines de novo synthetisierten Hämproteins ein Modellsystem zur Untersuchung von lichtinduziertem Elektronentransfer erhalten werden [83]. Aufgrund
der modularen Synthesestrategie, nach der das System schrittweise aus einzelnen helicalen Bausteinen auf dem Templat zusammengesetzt wird, wurde in der Arbeitsgruppe Haehnel die Bezeichnung MOP für modulares Protein eingeführt.
Während de novo synthetisierte Proteine bisher meist als Einzelstücke synthetisiert wurden, wurde mit Hilfe eines kombinatorischer Ansatzes eine neue Größenordnung in der Herstellung und Variation von modularen Proteinen erreicht [84]. Dieser Ansatz kombiniert die
14
2. Protein-de-novo-Synthese
“Spot-Synthese”2 mit dem Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine unter Verwendung verschiedenster Peptidbausteine. Dabei ist die Festphasensynthese von 462 Vier-HelixBündel-Proteinen auf Zellulosemembranen gelungen, die hinsichtlich der Bindungsaﬃnität und
des Redoxpotentials der Hämgruppe auf dem festen Zelluloseträger untersucht wurden. Dieser
Ansatz ist somit hervorragend zur Optimierung von Kofaktorbindungsstellen und der Faltung
der Polypeptidstrukturen, sowie zum Einstellen bestimmter funktioneller Eigenschaften in de
novo synthetisierten Proteinen geeignet.
In der hier vorliegenden Arbeit werden de novo synthetisierte Hämproteine, die in der Arbeitsgruppe Haehnel hergestellt wurden, mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert (Kapitel 6). Ziel dieser magnetischen Resonanzuntersuchungen ist eine möglichst detaillierte
Beschreibung der Einbausituation der redoxaktiven Kofaktoren. Des weiteren werden anhand
selbst synthetisierter Polypeptidmodule grundlegende Untersuchungen zur Einbindung von Metalloporphyrinen in Vier-Helix-Bündeln durchgeführt (Kapitel 5). Im Unterschied zu den de novo
synthetisierten Hämproteinen aus Kapitel 6 beschränken sich diese Systeme auf eine KofaktorBindungsstelle, was die gezielte Untersuchung speziﬁscher Kofaktor-Protein-Wechselwirkungen
erleichtert. Zur Unterscheidung werden diese Polypeptidmodule daher mit mMOP1 und mMOP2
bezeichnet, wobei das kleine m für mono steht. Durch die Einführung verschiedener Metalloporphyrine (mit den Zentralmetallionen Fe2+/3+ , Co2+/3+ , Zn2+ ) soll anhand dieser Polypeptidmodule die funktionelle Vielfalt de novo synthetisierter Proteine erweitert werden.
2
Bei der “Spot-Synthese” werden kleine deﬁnierte Flüssigkeitstropfen auf Zellulosemembranen verteilt. Die
Flüssigkeitstropfen enthalten chemische Reagentien mit mehreren funktionellen Gruppen, die zum einen zur Verankerung auf der porösen Membran dienen, und zum anderen zur weiteren Durchführung der gewünschten Reaktionen geeignet sein müssen.
Kapitel 3
Theoretische Grundlagen
Dieses Kapitel gibt eine kurze Einführung in die EPR- (Electron Paramagnetic Resonance) und
die ENDOR- (Electron Nuclear Double Resonance) Spektroskopie. Die EPR-Spektroskopie wird
auch häuﬁg als ESR-Spektroskopie für Electron Spin Resonance bezeichnet. Da beide magnetischen Resonanztechniken voraussetzen, daß mindestens ein ungepaarter Elektronenspin vorliegt,
werden sie zur Charakterisierung von freien Radikalen, intermediären radikalischen Reaktionsstufen oder paramagnetischen Metallionen und Komplexen solcher Metallionen eingesetzt.
Die theoretischen Grundlagen der EPR- und ENDOR-Spektroskopie sind in zahlreichen
Lehrbüchern und Monographien [85–91] ausführlich beschrieben. In den folgenden Abschnitten wird kurz auf die Meßprinzipien und die molekularen Wechselwirkungen, die der EPR- und
ENDOR-Spektroskopie zugrunde liegen, eingegangen. Ein wichtiger Schwerpunkt der hier vorliegender Arbeit liegt in der Untersuchung von de novo synthetisierten Hämproteinen hinsichtlich
der Koordination des Fe3+ -Zentralmetallions. Daher wird in Abschnitt 3.4 die geometrische und
elektronische Struktur von Häminkomplexen und deren Charakterisierung mittels magnetischer
Resonanzspektroskopie dargestellt.
3.1
EPR-Spektroskopie
Das Meßprinzip der EPR-Spektroskopie beruht auf der Ausrichtung von ungepaarten Elektronenspins in einem statischen Magnetfeld B0 . Die Energie eines magnetischen Momentes in einem
15
16
3. Theoretische Grundlagen
statischen Magnetfeld B0 ergibt sich in der klassischen Elektrodynamik zu [94]
E = −µe B0 .
(3.1)
Mit einem ungepaarten Elektronenspin S ist ein magnetisches Moment verbunden
µ̂e = −gβe Ŝ,
(3.2)
wobei βe das Bohrsche Magneton und Ŝ der Vektoroperator des Elektronenspins ist. Der sogenannte g-Wert gibt die Proportionalitätskonstante zwischen µ̂e und βe Ŝ an. Für ein freies Elektron ist g = ge = 2,0023. Analog zu Gleichung (3.1) wird für die Elektron-ZeemanWechselwirkung des Elektronenspins in einem äußeren Magnetfeld der Hamilton-Operator
H = −µ̂e B0 = gβe ŜB0
(3.3)
formuliert. Für einen freien ungepaarten Elektronenspin mit Spinquantenzahl S = 1/2 gibt es
zwei mögliche Orientierungen in einem statischen Magnetfeld, die durch die magnetischen Quan-
Energie
tenzahlen ms = +1/2 (“parallele” Ausrichtung) und ms = −1/2 (“antiparallele” Ausrichtung)
ms = +1/2
n+
hν = g βeB0
nms = -1/2
n+
n-
=
exp(- g βe B 0 /kT)
Magnetfeld
Abbildung 3.1: Elektron-Zeeman-Aufspaltung eines ungepaarten Elektronenspins S=1/2 in einem
statischen Magnetfeld B0 . Nach der Boltzmann-Verteilung besteht zwischen den beiden Energieniveaus ms = ±1/2 ein Besetzungsunterschied (n+ < n− ), so daß bei Einstrahlung elektromagnetischer
Strahlung der Frequenz ν = gβe B0 /h eine Netto-Absorption erfolgt. Voraussetzung dafür ist, daß
durch Relaxationsprozesse der Besetzungsunterschied auch während der Einstrahlung der elektromagnetischen Strahlung aufrecht erhalten werden kann, da sonst eine Sättigung des EPR-Signals
eintritt [87].
3.1 EPR-Spektroskopie
17
charakterisiert werden. Die energetische Aufspaltung ∆E = E+ − E− , die auch als ElektronZeeman-Aufspaltung bezeichnet wird, beträgt für diese beiden Niveaus
∆E = gβe B0 .
(3.4)
In einem EPR-Experiment werden durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen
Übergänge zwischen den beiden Spinniveaus induziert, wenn die Resonanzbedingung
hν = ∆E = gβe B0
(3.5)
erfüllt ist (siehe Abbildung 3.1). Bei einem statischen Magnetfeld von 350 mT und g = ge liegt
die Resonanzfrequenz bei ν 9.5 GHz und damit im X-Band (Wellenlänge λ 3 cm) des
Mikrowellenbereiches.
Die experimentellen Beobachtungen werden in der EPR-Spektroskopie häuﬁg in dem Formalismus des Spin-Hamilton-Operators wiedergeben. Der Spin-Hamilton-Operator faßt alle molekularen Wechselwirkungen zusammen, die zu dem magnetischen Resonanzspektrum beitragen und
wird so formuliert, daß er nur auf den Spinanteil der elektronischen Grundzustandswellenfunktionen wirkt. Die einzelnen Terme des Spin-Hamilton-Operators werden nun kurz vorgestellt.
Elektron-Zeeman-Wechselwirkung
Bei der EPR-spektroskopischen Charakterisierung von Übergangsmetallkomplexen ﬁndet man
deutliche Abweichungen von dem ge -Wert des freien Elektrons. Zusätzlich beobachtet man, daß
die Elektron-Zeeman-Aufspaltung von der Orientierung des molekularen Achsensystems im magnetischen Feld abhängt. Dies ist darin begründet, daß auch das Bahnmoment L eines Elektrons
ein magnetisches Moment besitzt (µ̂L = βe L̂), dessen Beitrag zur eﬀektiven Elektron-ZeemanAufspaltung in den Übergangsmetallkomplexen von der Spin-Bahn-Kopplung (λL̂Ŝ) und der
energetischen Aufspaltung der d-Orbitale abhängt [87, 88]. Im Spin-Hamilton-Operator lautet
der Term für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung
HEZ = βe B0 gŜ.
(3.6)
Dabei ist Ŝ der Vektoroperator des eﬀektiven Spins. In Analogie zu dem Zwei-Niveau-System
aus Abbildung 3.1 wird dem eﬀektiven Spin häuﬁg der Wert S=1/2 zugewiesen. Dies muß jedoch
nicht der Spinquantenzahl der eigentlichen Wellenfunktion des elektronischen Grundzustandes
18
3. Theoretische Grundlagen
entsprechen (siehe z. B. Abschnitt 3.4.2). Die Einﬂüsse von Spin- und Bahnmoment auf die
EPR-Spektren werden in der (3 × 3) Matrix g zusammengefaßt, welche traditionell als g-Tensor
bezeichnet wird [85,87]. Der g-Tensor ist kennzeichnend für die Symmetrie und die elektronische
Struktur eines Übergangsmetallkomplexes. In Abschnitt 3.4.1 wird anhand von low-spin Fe3+ Komplexen der Zusammenhang zwischen den g-Tensorhauptwerten und der Wellenfunktion des
elektronischen Grundzustandes näher erläutert. Dabei wird insbesondere gezeigt, wie aus den
g-Tensorhauptwerten Informationen über die axiale Ligandierung des Hämins erhalten werden
kann.
Nullfeldaufspaltung
Die Wechselwirkung mehrerer ungepaarter Elektronenspins führt auch in Abwesenheit eines
äußeren Magnetfeldes bereits zu einer Aufspaltungen der Energieniveaus des elektronischen
Grundzustandes. Daher spricht man auch von einer Nullfeldaufspaltung. Der entsprechende
Term im Spin-Hamilton-Operator ist
HZF S = ŜDŜ
(3.7)
mit dem sogenannten Nullfeldtensor D. Der Term HZF S wird auch häuﬁg in Form der Nullfeldparameter D und E ausgedrückt
HZF S = D Ŝz2 − 1/3 Ŝ2 + E Ŝy2 − Ŝx2 .
(3.8)
In organischen Molekülen, beispielsweise in photochemisch angeregten Triplettzuständen, wird
die Nullfeldaufspaltung in erster Linie durch die dipolare Wechselwirkung der ungepaarten Elektronenspins bestimmt. Damit können die Nullfeldparameter D und E zur Charakterisierung der
Elektronenspinverteilung in der Triplettwellenfunktion herangezogen werden (siehe Abschnitt
5.5.2). In Übergangsmetallkomplexen führt die Elektron-Elektron-Wechselwirkung im Zusammenspiel mit der Spin-Bahn-Kopplung zu Aufspaltungen der Energieniveaus des elektronischen
Grundzustandes. In Abschnitt 3.4.2 wird der Einﬂuß der Nullfeldaufspaltung auf die EPRSpektren von high-spin Fe3+ -Komplexen diskutiert.
Hyperfeinwechselwirkung
Die Wechselwirkung von Elektronen- und Kernspins bezeichnet man als Hyperfeinwechselwirkung. Voraussetzung ist, daß ein Kernspin mit I = 0 und damit ein magnetisches Moment für
3.1 EPR-Spektroskopie
19
den Kern vorliegt
µN = gN βN I,
(3.9)
mit dem Kern-Magneton βN und dem g-Faktor gN des entsprechenden Kerns. Im Vergleich zum
magnetischen Moment des Elektronenspins (siehe Gleichung (3.2)) ist das Vorzeichen positiv
und der Betrag des magnetischen Momentes des Kernspins wesentlich kleiner. Für ein Proton
beträgt das Verhältnis gN βN / ge βe beispielsweise 1 / 658.
Für die Wechselwirkung der magnetischen Momente des Elektronen- und Kernspins gilt [92]
H=−
1
(µ̂ r̂)(µ̂ r̂)
8π
.
µ̂e µ̂N δ(r̂) + 3 µ̂e µ̂N − 3 e 2 N
3
r
r
(3.10)
Dabei ist r̂ der Ortsoperator des Verbindungsvektors zwischen den beiden magnetischen Momenten. Im ersten Term von Gleichung (3.10) wird die Elektronenspindichte direkt am Kernort
ausgewertet. Dies setzt voraus, daß der elektronische Grundzustand s-Orbitalcharakter vorweist.
Für den Eigenwert des ersten Terms aus Gleichung (3.10) folgt [92]
E=−
8π
|ψ(0)|2 < µ̂e µ̂N >
3
(3.11)
mit der Aufenthaltswahrscheinlichkeit |ψ(0)|2 des ungepaarten Elektronenspins am Kernort (r
= 0). Diese sogenannte Fermi-Kontakt-Wechselwirkung ist isotrop und liefert Informationen
über die Spindichteverteilung in einem paramagnetischen Molekül. Aus dem zweiten Term von
Gleichung (3.10) können Informationen über die Abstände von Elektronen- und Kernspin gewonnen werden. In einem äußeren Magnetfeld orientieren sich die magnetischen Momente von
Elektronen- und Kernspin parallel zur Feldrichtung unter der Voraussetzung eines isotropen
g-Tensors für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung [93]. Wenn der Kern weit genug vom paramagnetischen Zentrum entfernt ist, um als lokalisierter Punktdipol behandelt zu werden, folgt
ein einfacher Ausdruck für die Energie der Hyperfeinwechselwirkung [94]
E=−
µe µN 2
3
cos
γ
−
1
.
r3
(3.12)
Dabei ist γ der Winkel zwischen dem äußeren Magnetfeld und dem Verbindungsvektor r zwischen
Elektronen- und Kernspin (siehe Abbildung 3.2.)
Im Formalismus des Spin-Hamilton-Operators wird die Hyperfeinwechselwirkung durch den
Term
HHF C = ŜAÎ
(3.13)
20
3. Theoretische Grundlagen
B0
µN
µe
γ
|r|
Abbildung 3.2: Links: In einem äußeren Magnetfeld B0 richten sich die magnetische Momente
von Elektronenspin µe und Kernspin µN parallel zur Feldrichtung aus. Die Voraussetzung hierfür
ist ein isotroper g-Wert für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung. Das äußere Feld B0 und der
Verbindungsvektor r zwischen µe und µN schließen den Winkel γ ein.
beschrieben. Dabei ist Î der Vektoroperator des Kernspins. Der Hyperfeintensor A kann formal
in einen isotropen Anteil aiso und einen spurfreien anisotropen Anteil A zerlegt werden
HHF C = aiso ŜÎ + ŜA Î.
(3.14)
Die isotrope Kopplungskonstante aiso beschreibt dabei entprechend Gleichung (3.10) die FermiKontakt-Wechselwirkung und ist proportional zur ungepaarten Elektronenspindichte am Kernort. Der Tensor A faßt die Hyperfeinwechselwirkungen zusammen, bei denen der Elektronenspin
nicht am Kernort lokalisiert ist. Für den einfachen Fall aus Gleichung (3.12) ist A axial. Die
Hauptwerte dieses Tensors, der in Abbildung 3.3 zur Veranschaulichung graphisch dargestellt
ist, sind in Frequenzeinheiten
a⊥ = −
βe ge βN gN
hr 3
(3.15)
und
a|| = −2a⊥ .
(3.16)
Für eine beliebige molekulare Orientierung zum äußeren Magnetfeld ergibt sich für den Wert
der dipolaren Hyperfeinwechselwirkung
a = a⊥ 3 cos2 γ − 1 .
(3.17)
3.1 EPR-Spektroskopie
21
a’
B0
a’
a’
N
|r|
Mn+
Abbildung 3.3: Lage der Hauptachsen a|| und a⊥ des axialen Hyperfeintensors A für eine beliebige
molekulare Orientierung im äußeren Magnetfeld. In der Punktdipolnäherung ist der Elektronenspin
am Zentralmetall Mn+ und der Kernspin am Kern N lokalisiert. Die Hauptachse a|| verläuft parallel
zum Verbindungsvektor zwischen dem Kern und dem Zentralmetall.
Kern-Zeeman-Wechselwirkung
Die Formulierung des Kern-Zeeman-Terms erfolgt analog zur Elektron-Zeeman-Wechselwirkung
HN Z = −βN gN B0 Î.
(3.18)
Der g-Faktor des Kernspins gN wird im folgenden jedoch immer als isotrope Konstante angesehen. Wenn Eﬀekte höherer Ordnung berücksichtigt werden und damit auch für den Kernspin
ein g-Tensor formuliert wird, spricht man von einer Pseudo-Kern-Zeeman-Wechselwirkung. Diese
wird dann eingeführt, wenn der Einﬂuß einer anisotropen Elektron-Zeeman-Wechselwirkung, die
sich über die Hyperfeinwechselwirkung auf die Quantisierungsrichtung des Kernspins auswirken
kann, berücksichtigt werden soll [90, 95].
Kern-Quadrupol-Wechselwirkung
Die Kern-Quadrupol-Wechselwirkung tritt nur bei Kernen mit I ≥ 1 auf. Dabei handelt es sich
nicht um eine magnetische Wechselwirkung, vielmehr führt hier der elektrische Feldgradient am
Ort des Kernes zu einer Wechselwirkung mit dem elektrischen Quadrupolmoment des Kerns.
Der entsprechende Term im Spin-Hamilton-Operator lautet
HQ = ÎQÎ.
(3.19)
22
3. Theoretische Grundlagen
In dem Hauptachsensystem des spurlosen Quadrupoltensors Q erhält man (in Frequenzeinheiten)
HQ =
e2 qQ
3Iˆz2 − Î2 + η(Iˆx2 − Iˆy2 ) .
4I(2I − 1)h
(3.20)
Die Größe Q ist das skalare Quadrupolmoment des jeweiligen Kernes. Der elektrische Feldgradient mit den Hauptwerten eqzz , eqyy und eqxx wird durch die z-Komponente eq = eqzz und
den Asymmetrieparameter η = (qxx − qyy )/qzz , der die Abweichungen von der axialen Symmetrie des Feldgradienten entlang der Hauptrichtung z wiedergibt, charakterisiert. Dabei gilt die
Konvention |eqzz | > |eqyy | > |eqxx |.
Da die Orientierung der Kern-Quadrupol-Wechselwirkung mit dem Kernspin verknüpft ist,
erscheint diese elektrostatische Wechselwirkung im Spin-Hamilton-Operator.
Für Kerne wie 14 N (I = 1), die in natürlichen Proteinen häuﬁg Bestandteil von axialen Liganden zur Einbindung paramagnetischer Kofaktoren darstellen, wurden die Parameter
e2 qQ
h
(als
Maß für die gesamte Quadrupolwechselwirkung) und η (als Geometrie-Parameter) in Abhängigkeit von der Umgebung des Kernspins gruppiert [96].
Alle hier aufgeführten Wechselwirkungen können in einem Spin-Hamilton-Operators zusammengefaßt werden
H = HEZ + HZFS + HHF C + HNZ + HQ
(3.21)
= βe B0 gŜ + ŜDŜ + ŜAÎ + βN gN B0 Î + ÎQÎ.
In Anwesenheit mehrerer Kernspins werden die entsprechenden Summen der Hyperfein-, KernZeeman- und Kern-Quadrupol-Wechselwirkung (z. B.
3.2
k
ŜAk Îk ) verwendet.
ENDOR-Spektroskopie
Das Prinzip der ENDOR-Spektroskopie soll an einem einfachen System mit einem Elektronenspin S = 1/2 und einem Kernspin I = 1/2 erläutert werden. Dabei werden sowohl die ElektronZeeman-Wechselwirkung als auch die Hyperfeinwechselwirkung als isotrop angenommen. Der
Spin-Hamilton-Operator dieses Systems lautet
H = βe ge B0 Ŝ + aiso ŜÎ − βN gN B0 Î.
(3.22)
3.2 ENDOR-Spektroskopie
23
In der Hochfeldnäherung (HEZ HHF C , HEZ HN Z ) sind die Spins entlang der Magnetfeldrichtung quantisiert und es ergibt sich für die Energie-Niveaus in Frequenzeinheiten
E
(ms , mI ) = νe ms − νN mI + aiso ms mI ,
h
(3.23)
νe = ge βe B0 /h
(3.24)
νN = gN βN B0 /h.
(3.25)
mit
und
Das Energieniveau-Schema, das für dieses System unter der Annahme einer positiven Hyperfeinkopplung (aiso > 0) folgt, ist in Abbildung 3.4 zu sehen. Für die erlaubten EPR- und
NMR-Übergänge ergeben sich jeweils zwei Linien
νEPR = |νe ± aiso /2|
(3.26)
νNMR = |νN ± aiso /2| .
(3.27)
und
Die EPR-Übergänge liegen für typische Feldstärken (100 bis 500 mT) im Frequenzbereich von
Mikrowellen und die NMR-Übergänge von Radiowellen.
Die ENDOR-Spektroskopie ist eine Doppelresonanzmethode, in der die Übergänge der Kernspins über die EPR-Spektroskopie detektiert werden. Dazu existieren sowohl cw- (continuous
wave) [89] als auch Puls-ENDOR-Verfahren [98]. In dieser Arbeit wurde eine Puls-ENDORSequenz nach Davies eingesetzt [99]. Dieses Verfahren beruht auf dem Transfer und der Detektion von Spinpolarisation und wird in Abbildung 3.5 erläutert. Die Spinpolarisation resultiert
aus den Besetzungsunterschieden zwischen verschiedenen Energieniveaus von EPR- und NMRÜbergängen. In Abbildung 3.5 wird der Besetzungsunterschied analog zu Abbildung 3.1 durch
schwarze (Überpopulation) und weisse Kästchen symbolisiert. Da die energetische Aufspaltung,
die nach der Boltzmann-Verteilung die Besetzung der einzelnen Niveaus bestimmt [87], zwischen den EPR-Übergängen wesentlichen größer als zwischen den NMR-Übergängen ist, wird
nur der Besetzungsunterschied zwischen den beiden unteren und oberen Paaren berücksichtigt. Die Davies-Puls-ENDOR-Sequenz wird in Abbildung 3.5 in drei Phasen aufgeteilt. Durch
den 180◦ -Puls in der Präparationsphase wird das Besetzungsverhältnis eines EPR-Überganges
24
3. Theoretische Grundlagen
| mS mI >
m I = -1/2
E/h
a/4
m s = +1/2
| +1/2 -1/2 >
νN
NMR I
|+1/2 +1/2>
m I = +1/2
EPR I
νe
EPR II
m I = -1/2
m s = -1/2
a/4
νN
|-1/2 -1/2 >
NMR II
m I = +1/2
|-1/2 +1/2 >
EZ
EZ+NZ
EZ+NZ
+HFC
Abbildung 3.4: Links: Energie-Niveau-Schema für ein S = 1/2, I = 1/2 System mit isotropem
g-Tensor und aiso > 0. Die Elektron-Zeeman-Aufspaltung (EZ) ist dabei wesentlich größer als die
Kern-Zeeman-Aufspaltung (NZ) und die Hyperfeinwechselwirkung (HFC). Die Wechselwirkungen
werden sukzessiv berücksichtigt. Rechts: Mit durchgezogenen Pfeilen sind die erlaubten EPR- und
NMR-Übergänge eingezeichnet (EPR: ∆ms = ±1, ∆mI = 0; NMR: ∆ms = ±0, ∆mI = 1). Die
Übergangsraten durch Relaxationsprozeße (inklusive Kreuzrelaxation: | + 1/2 − 1/2 >↔ | − 1/2 +
1/2 >, | + 1/2 + 1/2 >↔ | − 1/2 − +1/2 >) sind als gestrichelte Linien dargestellt [89].
(beispielsweise EPRI) invertiert. Die Detektion der Spinpolarisation erfolgt in dem Davies-PulsENDOR-Experiment mit einer Hahn-Echo-Sequenz [98]. Aufgrund der Inversion der Spinpolarisation detektiert man, wie in Abbildung 3.5 anhand Fall a (kein NMR-Übergang) gezeigt
ist, ein emissives Spin-Echo-Signal. Wird jedoch zwischen der Präparations- und Detektionsphase ein Radiofrequenzpuls eingestrahlt, der mit der Frequenz von NMRI (Fall b) oder NMRII
(Fall c) übereinstimmt, erfolgt ein Übergang innerhalb der Kernspinniveaus. Dadurch kommt
es zu einem Ausgleich der Polarisation der EPR-Übergänge. In der Detektionsphase wird nun
kein Echo beobachtet. In einem Puls-ENDOR-Experiment wird die Amplitude des invertierten
Echo-Signals in Abhängigkeit von der Frequenz des Radiofrequenzpulses aufgezeichnet.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Puls-ENDOR-Spektroskopie eingesetzt, um Hy-
3.2 ENDOR-Spektroskopie
25
180°
90°
180°
mw
180°
rf
Präparation
Polarisationstransfer
Detektion
νrf = ν NMRI/II
a.)
EPRI
b.)
νrf = ν NMRI
NMRI
c.)
νrf = ν NMRII
NMRII
Abbildung 3.5: Die Davies-Puls-ENDOR-Sequenz kann in drei Phasen aufgeteilt werden: Präparation, Polarisationstransfer und Detektion [97]. Zur Erläuerterung wird das Vier-Niveau-Schema
aus Abbildung 3.4 herangezogen. Die schwarzen und weissen Kästchen symbolsieren die Besetzungsunterschiede der einzelnen Energie-Niveaus. In der Präparationsphase wird durch einen selektiven
Mikrowellen-180◦-Puls die Polarisation eines EPR-Überganges (in diesem Beispiel EPRI) invertiert.
Es folgt ein Radiofrequenz-180◦-Puls, der bei passender Frequenz einen der beiden Übergänge der
Kernspins invertiert. In der Detektionsphase wird mit einer Hahn-Echo-Sequenz die Polarisation des
EPR-Überganges abgefragt. In Fall a (kein Kernübergang) wird ein emissives Spin-Echo-Signal detektiert, in Fall b und c wird bei Einstrahlung eines Radiofrequenzpuls passender Frequenz (NMRI
oder NMRII) kein Spin-Echo beobachtet. Ein resonanter 180◦-Radiofrequenz-Puls invertiert die Polarisation der NMR-Übergänge und führt zu einem Angleich der Populationen, die über EPRI detektiert
wird.
26
3. Theoretische Grundlagen
perfeinwechselwirkungen in de novo synthetisierten Hämproteinen zu messen. Dabei trägt das
Zentralmetallion Fe3+ selbst allerdings nicht zur Hyperfeinwechselwirkung bei, da das Hauptisotop Fe56 (natürliche Häuﬁgkeit 91,7 %) einen Kernspin von I = 0 besitzt. Über die Protonen und
Stickstoﬀkerne der Liganden (Porphyrin und axiale Liganden) können jedoch wertvolle strukturelle Informationen über die Koordinationssphäre des Fe3+ -Ions gewonnen werden [100, 101].
Diese Informationen sind aus der EPR-Spektroskopie nicht zugänglich. Die EPR-Linienbreiten
sind bei den Komplexen des Fe3+ -Ions viel zu groß, um diese Hyperfeinaufspaltungen detektieren
zu können. Abschnitt 4.4.1 stellt hierzu das Simulationsprogramm vor, das in dieser Arbeit zur
Analyse von EPR-Linienbreiten erstellt wurde. Die höhere spektrale Auﬂösung der ENDORSpektroskopie im Vergleich zur EPR-Spektroskopie wird jedoch durch eine geringere Empﬁndlichkeit erkauft. Prinzipiell sollte die Davies-Puls-ENDOR-Spektroskopie allerdings bei idealer
Inversion bzw. Polarisationstransfer die gleiche Signalintensität wie die EPR-Spektroskopie haben. Gegenüber der NMR-Spektroskopie hat die ENDOR-Spektroskopie den Vorteil, daß sie
selektiv in Bezug auf die paramagnetische Umgebung des Kofaktors ist, da nur die Kerne,
die eine Hyperfeinwechselwirkung mit dem Elektronenspin aufweisen, zum ENDOR-Spektrum
beitragen. Die indirekte Detektion über einen EPR-Übergang höherer Frequenz führt hier zu
einer Steigerung der Empﬁndlichkeit der Messung [89]. Der Vorteil der Detektion über einen
EPR-Übergang liegt bei Systemen mit ausgeprägter g-Anisotropie jedoch insbesondere in der
Möglichkeit, daß auch in ungeordneten Systemen (gefrorene Lösungen) bestimmte molekulare Orientierungen selektiert werden können [102–106]. Damit lassen sich Informationen über
die relative Lage der richtungsabhängigen Hyperfeinwechselwirkung im Koordinatensystem des
g-Tensors gewinnen [93, 107]. Im nächsten Abschnitt wird dies näher erläutert.
3.3
EPR- und ENDOR-Messungen in gefrorenen Lösungen
In einer Lösung liegt eine statistische Verteilung an Molekülorientierungen relativ zum äußeren Magnetfeld vor. Bei einer richtungsabghängigen Wechselwirkung, z. B. bei anisotropem gTensor, hängt die EPR-Linienposition von der Orientierung des paramagnetischen Moleküls im
Magnetfeld ab. Während in einer ﬂüssigen Lösung aufgrund der Rotation der paramagnetischen
Moleküle, die im allgemeinen schneller als die Zeitskala des EPR- oder ENDOR-Experimentes
ist [87], alle richtungsabhängigen Wechselwirkungen herausgemittelt werden, sieht man in einer
3.3 EPR- und ENDOR-Messungen in gefrorenen Lösungen
B0
27
gz
g eff
γ
α
gx
β
gy
Abbildung 3.6: Der g-Tensor (hier dargestellt durch ein Ellipsoid) kann beliebige Orientierungen
relativ zum äußeren Magnetfeld einnehmen. Der eﬀektive g-Wert für eine beliebige Orientierung
ergibt sich dabei aus den Hauptwerten des g-Tensors und den Winkeln α, β, γ, welche die Lage
des g-Tensors relativ zur Magnetfeldrichtung beschreiben: g = (gx2 cos2 α + gy2 cos2 β + gz2 cos2 γ)1/2
[94]. In einer gefrorenen Lösung liegt eine statistische Verteilung der molekularen Orientierungen
vor. Daraus resultiert ein Pulverspektrum, das expemplarisch als Absorptionsspektrum und seiner
ersten Ableitung gezeigt ist. EPR-Spektren werden aufgrund ihrer Aufnahmetechnik (phasensensitive
Detektion mit Feldmodulation) meist in der ersten Ableitung dargestellt [85].
gefrorenen Lösung eine Überlagerung der verschiedenen Resonanzpositionen. Diese sogenannten
Pulverspektren spiegeln die Verteilung der Molekülorientierungen wieder. In den hier untersuchten de novo synthetisierten Hämproteinen dominiert die g-Anisotropie das EPR-Spektrum,
ohne daß zusätzliche Hyperfeinaufspaltungen zu komplexen Linienmustern führen. Abbildung
3.6 zeigt, wie aus einem derartigen Pulverspektrum die Hauptwerte des g-Tensors direkt abgelesen werden können. Die Lage des g-Tensors in einem paramagnetischen Molekül, d. h. die
Richtungen der g-Tensorhauptachsen, können jedoch nur anhand von EPR-Messungen an Einkristallen erhalten werden. In vielen Fällen, so auch bei den de novo synthetisierten Hämproteinen,
sind jedoch keine Einkristalle verfügbar. Die Annahmen über die relative Lage des g-Tensors in
diesen Systemen basieren auf dem Vergleich mit Modellkomplexen und natürlichen Hämproteinen [108, 109].
Für die ENDOR-Spektroskopie in gefrorener Lösung bieten Systeme mit ausgeprägter gAnisotropie einen entscheidenden Vorteil. Ein ENDOR-Experiment wird immer an einer festgelegten Feldposition ausgeführt. Damit nehmen an dem ENDOR-Experiment nur diejenigen
28
3. Theoretische Grundlagen
molekularen Orientierungen teil, die an der festgelegten Feldposition einen EPR-Übergang aufweisen. An den Kanten des EPR-Spektrums, d. h. an der Feldposition von gz oder gx , tragen nur
diejenigen Moleküle zum EPR- und damit auch zum ENDOR-Spektrum bei, deren gz - bzw. gx Achse parallel zum äußeren Magnetfeld verläuft. Diese speziﬁsche Selektion von Molekülorientierungen ﬁndet man ansonsten nur in einem Einkristall. Für Feldpositionen im Bereich zwischen gz
und gx ﬁndet man eine Überlagerung deﬁnierter molekularer Orientierungen, die alle den gleichen
eﬀektiven g-Wert aufweisen. Diese Orientierungsselektion kann man sich zunutze machen, um
anhand von ENDOR-Messungen an verschiedenen Feldpositionen die Hauptwerte und die Lage
des Hyperfeintensors im Koordinatensystem des g-Tensors, der die räumliche Orientierung der
Moleküle relativ zum äußeren Magnetfeld festlegt, zu ermitteln [93, 106, 107]. Das Simulationsprogramm, das in dieser Arbeit zur Auswertung von ENDOR-Spektren de novo synthetisierter
Hämproteine erstellt wurde, ist in Abschnitt 4.4.2 beschrieben und wird zur Charakterisierung
eines de novo synthetisierten Hämproteins in Kapitel 6 eingesetzt.
3.4
Elektronische Struktur von Häminkomplexen
Das Zentralmetallion Fe3+ der Hämgruppe gehört zu den Übergangsmetallen mit einer 3dValenzelektronenschale. Im freien Ion sind die d-Orbitale energetisch entartet. In einem Komplex
kommt es jedoch durch elektrostatische oder auch kovalente Wechselwirkungen mit den Liganden zu einer Aufspaltung der d-Orbitale. Zur Ermittlung des elektronischen Grundzustandes
in Übergangsmetallkomplexen ist neben dem Ligandenfeldpotential auch die Elektron-ElektronWechselwirkung und die Spin-Bahn-Kopplung entscheidend [110].
Das Fe3+ -Ion wird in Häminkomplexen durch die vier Stickstoﬀatome des Porphyrins und
zwei zusätzliche axiale Liganden koordiniert. Für die nachfolgende Diskussion der elektronischen
Eigenschaften von Häminkomplexen wird zunächst davon ausgegangen, daß die Koordinationssphäre des Fe3+ -Ions eine oktaedrische Symmetrie aufweist. In dem oktaedrischen Ligandenfeld
spalten die 5 d-Orbitale in zwei Gruppen auf (siehe Abbildung 3.7). Die Orbitale dz 2 und dx2 −y2
zeigen direkt auf die Positionen der Liganden, während die Orbitale dxy , dxz und dyz dazwischen
liegen. Entsprechend ihrer “Symmetrie” im oktaedrischen Ligandenfeld werden die Orbitale dz 2
und dx2 −y2 als eg -Satz und die Orbitale dxy , dxz und dyz als t2g -Satz bezeichnet. Die Symbole
eg und t2g bezeichnen zwei irreduzible Darstellungen, die zu der Punktgruppe Oh gehören [111].
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
29
eg
dx2-y 2 ; dz2
z
t 2g
y
dyz ; dxz ; dxy
5
t 2g3 e g2
x
Oh
6
A 1g
S=5/2
t 2g
2
T 2g
S=1/2
Abbildung 3.7: Schema zur Besetzung der eg und t2g Orbitale für ein Fe3+ -Ion in einem oktaedrischen Ligandenfeld (Punktgruppe Oh ). Hier sind exemplarisch zwei Möglichkeiten der Orbitalbesetn
zung gezeigt. Unter den Elektronenkonﬁgurationen tm
2g eg mit m + n = 5 sind die Termsymbole in
der Punktgruppe Oh und die Gesamtspinquantenzahl S der Mehrelektronenzustände angegeben.
Nach dem Kristallfeldmodell kommt es zu einer Abstoßung der “Ladungsdichten” der d-Orbitale
des Zentralmetallions und den Liganden. Daraus resultiert eine energetische Aufspaltung der Orbitale des eg - und t2g -Satzes, die auch als Kristallfeldaufspaltung bezeichnet wird [110].
Zur Besetzung der fünf d-Orbitale (10 Spinorbitale) mit den fünf Elektronen der 3d5 Elektronenkonﬁguration des Fe3+ -Ions gibt es insgesamt 252 Möglichkeiten:
10
5



Spinorbitale   10 
10!
= 252.

=

5!(10
− 5)!
5
Elektronen 
(3.28)
Abbildung 3.7 zeigt dazu exemplarisch zwei mögliche Besetzungen der d-Orbitale. Diese Besetzungen entsprechen den beiden elektronischen Grundzuständen, die im allgemeinen in Häminkomplexen gefunden werden [4, 108, 109, 112].
• high-spin Fe3+ : Bei einer kleinen Kristallfeldaufspaltung besetzen die Elektronen die dOrbitale analog zum freien Ion nach dem Prinzip der Spinmaximierung (Hundtsche Regel). Damit bildet der Term 6 A1g den Grundzustand mit einer Gesamtspinquantenzahl
S=5/2 (siehe Abbildung 3.7). Für diesen Schwachfeld-Fall wird in der Störungstheorie die
Elektron-Elektron-Wechselwirkung vor dem Ligandenfeldpotential berücksichtigt [113].
30
3. Theoretische Grundlagen
• low-spin Fe3+ : Bei einer großen Kristallfeldaufspaltung ist der Zustand 2 T2g mit einem
Gesamtspin S = 1/2 energetisch am günstigsten. In diesem Starkfeld-Fall betrachtet man
zuerst die Aufspaltung der einzelnen d-Orbitale im Potentialfeld der Liganden. Es resultieren Einelektronenwellenfunktionen, aus welchen anschließend unter Berücksichtigung der
Elektron-Elektron-Wechselwirkung Mehrelektronenzustände gebildet werden können [113].
In beiden Fällen wird die Spin-Bahn-Kopplung nachträglich als Störung eingeführt. Da die
hieraus resulierende Eigenfunktion des elektronischen Grundzustandes eine Linearkomination
aus den “ursprünglichen” Zuständen des Starkfeld- oder Schwachfeld-Falles darstellt, spricht
man auch von einer “Mischung” der elektronischen Zustände durch die Spin-Bahn-Kopplung.
A
O
R
C
O-
Aspartat/Glutamat
RS -
R
S
OCystein
Tyrosin
R
Methionin
N
R-NH 2
Histidin
Lysin
HN
N
N
Histidin
schwaches
starkes
Ligandenfeld
Ligandenfeld
B
X
Ligandenfeldstärke
Fe
X:
F
H2O
OH
N3
Im
CN
N
high-spin
low-spin
NH
Abbildung 3.8: A: Ligandenfeldstärke von Aminosäuren, die zur Koordination von Metallionen
in Frage kommen [116]. B: In Myoglobin ist der Kofaktor Hämin (grauer Balken) über die Seitengruppe eines Histidins in das Protein eingebunden. An die freie axiale Koordinationsstelle können
unterschiedliche Liganden X gebunden sein, die den Spin-Zustand des Fe3+ -Zentrallmetallions beeinﬂussen.
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
31
Welcher der beiden Spin-Zustände in einem Häminkomplex auftritt, hängt von seinen axialen Liganden ab. In Abbildung 3.8 (A) sind die Aminosäuren, die für eine Koordination von
Metallionen in Betracht kommen, nach ihrer Ligandenfeldstärke geordnet. In dieser Arbeit ist
insbesondere Histidin von Interesse, das als “starker Ligand” die Bildung des low-spin Zustandes begünstigt. Anhand von Myoglobin, in dem die Hämgruppe über eine Histidingruppe in das
Protein gebunden ist, wurde untersucht, welchen Spin-Zustand das Fe3+ -Ion in Abhängigkeit
von dem sechsten Liganden, der an die freie Koordinationsstelle des Kofaktors bindet, einnimmt
(siehe Abbildung 3.8 (B)) [114, 115].
Die beiden Spin-Zustände des Fe3+ unterscheiden sich sehr deutlich in ihren EPR-Spektren.
Für den high-spin-Zustand ﬁndet man einen axialen g-Tensor mit Hauptwerten bei g⊥ = 6 und g||
= 2. Der g-Tensor von low-spin Fe3+ -Komplexen ist rhombisch. Die Lage der g-Tensorhauptwerte
hängt dabei sehr stark von den axialen Liganden und ihrer geometrischen Anordnung im Komplex ab. Im folgenden wird gezeigt, wie die EPR-Spektren hinsichtlich der elektronischen Struktur der Fe3+ -Komplexe analysiert und interpretiert werden können.
3.4.1
Low-spin Häminkomplexe
Die hier dargestellte Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte von low-spin Fe3+ -Komplexen
folgt der Methode von Taylor [117]. Dabei wird vorausgesetzt, daß die energetische Aufspaltung
des t2g - und eg -Satzes groß genug ist, um nur den t2g -Satz zu behanden und Mischungen zwischen den Orbitalen des t2g - und eg -Satzes zu vernachlässigen. Ferner wird im folgenden anstelle der t52g -Elektronenkonﬁguration eine t12g -Lochkonﬁguration betrachtet. Dadurch vereinfacht
sich die Berechnung, da nun keine Mehrelektronen-Wechselwirkungen auftreten können. Abbildung 3.9 zeigt dazu die Aufspaltung der entsprechenden d-Orbitale des t2g -Satzes an. Weitere
geometrische Verzerrungen, d. h. Abweichungen von der zunächst angenommenen idealisierten
oktaedrischen Geometrie, werden durch die tetragonale (∆) und rhombische (V ) Aufspaltung
beschrieben. Die Symmetrie des Komplexes wird dabei von der Punktgruppe Oh hin zu D2h
erniedrigt. Die tetragonale Verzerrung verläuft entlang der Häminnormalen (der molekularen
z-Achse) und wird durch die unterschiedlichen Eigenschaften wie die Ligandenfeldstärke oder
der Bindungsabstand der axialen Liganden gegenüber dem Porphyrinring verursacht. Die rhombische Verzerrung, die die x, y Ebene des molekularen Achsensystems betriﬀt, kann durch asymmetrische axiale Liganden oder einer Verzerrung des Porphyrinringes auftreten.
32
3. Theoretische Grundlagen
Oh
t 2g
*
D4h
D 2h
xy
xy
∆
xz
V
+/−
Φ3
+/−
Φ2
xz,yz
yz
+/−
Φ1
Verzerrung des
Spin-Bahn-
Ligandenfeldes
Kopplung
hν
Zeeman-Wechselwirkung
Abbildung 3.9: Aufspaltung der d-Orbitale eines low-spin Fe3+ -Komplexes für eine t12g Lochkonﬁguration durch tetragonale und rhombische (∆ und V ) Verzerrung des oktaedrischen Komplexes und Spin-Bahn-Wechselwirkung. Die energetische Reihenfolge der Orbitale ist gegenüber der
t52g -Elektronenkonﬁguration invertiert. Der Bezugspunkt zur Deﬁnition der tetragonalen und rhombischen Verzerrung ist mit einem Stern (∗) gekennzeichnet.
Die Störung, die die Entartung des t2g -Satzes aufhebt, wird durch den Hamilton-Operator
H ausgedrückt
H = VV,∆ − λ l̂ ŝ.
(3.29)
Dabei steht VV,∆ für die zusätzliche tetragonale und rhombische Verzerrung und −λl̂ŝ für die
Spin-Bahn-Kopplung (mit negativen Vorzeichen, da eine Lochkonﬁguration betrachtet wird).
Die Kleinbuchstaben von ŝ und l̂ sollen betonen, daß der Störoperator auf Einteilchenwellenfunktionen wirkt. Die Basisfunktionen des t2g -Satzes setzen sich aus einem Ortsanteil und einem
Spinanteil zusammen. Dabei gehört zu |α > die magnetische Spinquantenzahl ms = +1/2 und
zu |β > entprechend ms = −1/2. Der Ortsanteil der Wellenfunktionen |xy >, |xz > oder |yz >
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
33
kann auch in magnetischen Bahnquantenzahlen |ml > ausgedrückt werden
|xy > =
|xz > =
|yz > =
(|2 > − | − 2 >)
1
√
i 2
− √12
− i√1 2
(|1 > − | − 1 >)
(3.30)
(|1 > + | − 1 >).
Die Matrixelemente, die sich mit dem Störoperator H und den alten Basisfunktionen des
t2g -Satzes ergeben, sind in Tabelle 3.1 zusammengefaßt. Die Basisfunktionen aus dem t2g -Satz
wurden dabei so zusammengestellt, daß zwei Blöcke aus jeweils 3 × 3 Untermatrizen (M+
und M− ) erhalten werden. Die sechs neuen Eigenfunktionen, die sich nach der Anwendung
des Störoperators H aus den sechs energetisch entarteten Spinorbitalen des t2g -Satzes bilden,
ordnen sich zu jeweils drei energetisch entarteten Paaren an
|Φ+
i > =
ai |yz α > −ibi |xz α > −ci |xy β >
(3.32)
|Φ−
i > = −ai |yz β > −ibi |xz β > −ci |xy α >,
wobei a2i + b2i + c2i = 1 und i = 1,2,3. Mit den Blockmatrizen M+ und M− und den Eigenfunktionen |Φ±
i > ergibt sich folgendes Eigenwertproblem
+
M + |Φ+
i > = Ei |Φi >
(3.33)
−
M − |Φ−
i > = Ei |Φi > .
Dieses Gleichungssystem wird jedoch nicht direkt gelöst. Ziel der Ligandenfeldanalyse ist es, die
Meßgrößen der EPR-Spektroskopie in eine Beziehung zur elektronischen Struktur der low-spin
Tabelle 3.1: Matrixelemente des Störoperators H mit Basisfunktionen aus dem t2g -Satz. Es bilden
sich zwei Blöcke aus den 3 × 3 Untermatrizen M+ und M− .
|yz α > |xz α > |xy β > −|yz β > |xz β > |xy α >
|yz α >
− V2
i
2λ
− 12 λ
0
0
0
|xz α >
− 2i λ
+ V2
i
2λ
0
0
0
|xy β >
− 12 λ
− 2i λ
∆
0
0
0
−|yz β >
0
0
0
− V2
i
2λ
− 12 λ
|xz β >
0
0
0
− 2i λ
+ V2
i
2λ
|xy α >
0
0
0
− 12 λ
− 2i λ
∆
(3.31)
34
3. Theoretische Grundlagen
Fe3+ -Komplexe zu setzen. Daher wird zuerst die energetische Aufspaltung der Funktionen |Φ+
1 >
und |Φ−
1 > durch die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung in einem äußeren Magnetfeld untersucht.
Die Übergänge, die in der EPR-Spektroskopie beobachtet werden, gehen von dem untersten
Paar |Φ±
1 > aus. Der Hamilton-Operator der Zeeman-Wechselwirkung unter Berücksichtigung
von Spin- und Bahnmoment lautet
H = βe B0 (l̂ + ge ŝ),
(3.34)
wobei der g-Wert des Elektronenspins im folgenden mit ge = 2 angenähert wird. Für ein Ma−
gnetfeld in z-Richtung ergibt sich beispielsweise für die Eigenfunktionen |Φ+
1 > und |Φ1 >
+
2
2
ˆ
Ez+ =< Φ+
1 |βe B0 (lz + 2ŝz )|Φ1 >= βe B0 −(a1 + b1 ) + c1
(3.35)
und entsprechend
−
2
2
ˆ
Ez− =< Φ−
1 |βe B0 (lz + 2ŝz )|Φ1 >= βe B0 (a1 + b1 ) − c1 .
(3.36)
Dabei werden direkt die Eigenwerte Ez+ und Ez− der Zeeman-Wechselwirkung erhalten, da die
−
−
+
ˆ
ˆ
gemischten Matrixelemente < Φ+
1 |βe B0 (lz + 2ŝz )|Φ1 > und < Φ1 |βe B0 (lz + 2ŝz )|Φ1 > jeweils
+
Null ergeben. Die energetische Aufspaltung der Funktionen |Φ−
1 > und |Φ1 > ist damit
∆Ez± = Ez− − Ez+ = βe B0 2(a1 + b1 )2 − 2c21 .
(3.37)
Zur Auswertung der EPR-Spektren, aus denen die Hauptwerte des g-Tensors abgelesen werden,
vergleicht man die Eigenwerte des Operators aus Gleichung (3.34), der auf die Wellenfunktionen
−
|φ+
1 > und |φ1 > angewendet wird, mit dem Elektron-Zeeman-Term aus dem Spin-Hamilton-
Operators (siehe Gleichung (3.6)), der auf einen ﬁktiven Spin (S = 1/2) wirkt. Im Formalismus
des Spin-Hamilton-Operators wird die energetische Aufspaltung für ein Magnetfeld entlang der
z-Richtung durch den Hauptwert gz des g-Tensors beschrieben
∆Ez = gz βe B0 .
(3.38)
Durch den Vergleich der beiden Gleichungen (3.37) und (3.38) kann man den Hauptwert gz
direkt ablesen. Nach diesem Verfahren erhält man auch alle übrigen g-Tensorhauptwerte in
Abhängigkeit von den Koeﬃzienten der Spinorbitale Φ±
1
gz = 2[(a1 + b1 )2 − c21 ]
gy = 2[(a1 + c1 )2 − b21 ]
gx = 2[a21 − (b1 + c1 )2 ].
(3.39)
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
35
Um das Experiment, also die gemessenen g-Tensorhauptwerte hinsichtlich der elektronischen
Struktur des low-spin Fe3+ -Komplexes zu interpretieren, benötigt man allerdings die dazu inverse
Beziehung
a1 =
(gz + gy )
8(gx + gy + gz )
(gz − gx )
b1 =
8(gx + gy + gz )
(gy − gx )
c1 =
(3.40)
.
8(gx + gy + gz )
Diese Koeﬃzienten kann man nun zur Lösung des Eigenwertproblems (siehe Gleichung 3.33)
einsetzen.

 




 



i
1
a1 
a1 
2λ −2λ  
 −V /2


 



i
 − i λ +V /2
·
 = E1 ·  −ib 
1 


2
2 λ   −ib1 
− 12 λ
− 2i λ
∆
−c1
−c1
(3.41)
Aus diesem Gleichungssystem erhält man den Eigenwert E1 , der die energetische Absenkung der
Wellenfunktionen |Φ±
1 > (bezüglich des Nullpunktes (∗) in Abbildung 3.9), welche die rhombische
Verzerrung des Ligandenfeldes und die Spin-Bahn-Kopplung beinhaltet.
+ c1 λ − V /2
E1 = − b12a
1
gx
− g + g − 1/2 λ − V /2.
=
z
y
(3.42)
Durch eine entsprechende Umformung folgt aus dem Gleichungssystem (3.41) in Zusammenhang
mit Gleichung (3.40) ein weiteres äußerst nützliches Ergebnis:
gy
gx
+
gz + gy
gz − gx
(3.43)
gz
gx
+
− V /(2λ).
gz + gy
gy − gx
(3.44)
V /λ =
∆/λ =
Dabei werden die Ligandenfeldparameter ∆ und V
(in Einheiten der Spin-Bahn-
Kopplungskonstante λ) in Abhängigkeit von den g-Tensorhauptwerten erhalten. Für ein freies
Fe3+ -Ion liegt λ bei etwa 420 cm−1 [109]. In einem Komplex verkleinert sich die Spin-BahnKopplung aufgrund kovalenter Wechselwirkungen, die zu einer zunehmenden Delokalisierung
des Elektrons führen.
Peisach und Blumberg unterzogen die EPR-Daten von über 500 verschiedenen Hämproteinen und Modellkomplexen einer Ligandenfeldanalyse [109, 118, 119] und stellten fest, daß sich
36
3. Theoretische Grundlagen
die low-spin Häminkomplexe anhand der Ligandenfeldparameter ∆/λ und V /λ (bzw. V /∆)
in Gruppen ordnen lassen, die mit der axialen Ligandierung des Hämins korrelieren. Anhand
der g-Tensorhauptwerte von natürlichen Hämproteinen konnten in vielen Fällen die axialen
Liganden des Hämins identiﬁziert werden [120–122]. In Abschnitt 6.2, der sich mit der EPRspektroskopischen Charakterisisierung de novo synthetisierter Hämproteine beschäftigt, wird im
Detail diskutiert, welche Rückschlüsse sich anhand der Ligandenfeldanalyse über die geometrische Anordnung der axialen Liganden ziehen lassen.
3.4.2
High-spin Häminkomplexe
Die folgende Diskussion zur Interpretation der EPR-Spektren von high-spin Häminkomplexen
geht von einem Ligandenfeld der D4h Symmetrie aus. Dies entspricht einer Symmetrieerniedrigung der idealisierten oktaedrischen Geometrie entlang der Häminnormalen. Damit wird berücksichtigt, daß sich die axialen Liganden in ihren elektronischen Eigenschaften von dem Porphyrinring unterscheiden können. Für eine weiterführende Diskussion der EPR-Spektroskopie von
high-spin Häminkomplexen unter Berücksichtigung einer rhombischen Verzerrung des Ligandenfeldes wird auf [4] verwiesen.
Der Grundzustand eines high-spin Fe3+ -Häminkomplexes ist 6 A1g mit einer Gesamtspinquantenzahl S = 5/2 und einem Gesamtbahndrehimpuls von L = 0. Damit ﬁndet innerhalb
des Grundzustandes keine Spin-Bahn-Wechselwirkung statt und der Grundzustand bleibt ohne
ein äußeres Magnetfeld 6-fach entartet. Der energetisch höherliegende 4 T1 Zustand kann jedoch
über die Spin-Bahn-Kopplung mit dem 6 A1g Zustand mischen. Bei einem oktaedrischen Ligandenfeld würde dies zu einer energetischen Erniedrigung des gesamten 6 A1g Zustandes führen [4].
Berücksichtigt man jedoch eine zusätzliche tetragonale Verzerrung (D4h ), die den 4 T1g Zustand
in 4 Eg und 4 A2g zerlegt, erhält man nach Berücksichtigung der Spin-Bahn-Kopplung eine Aufspaltung des elektronischen Grundzustandes 6 A1g . Da die Spin-Bahn-Kopplung nur als Störung
betrachtet wird, werden die Energie-Niveaus in Abbildung 3.10 nach wie vor nach der magnetischen Spinquantenzahl Ms klassiﬁziert. Das Aufspaltungsmuster, das sich für den elektronischen
Grundzustand des high-spin Hämkomplexes ergibt, kann mit dem Nullfeldparameter
λ2
D=
5
1
1
−
∆1 ∆2
(3.45)
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
37
und einem eﬀektiven Spin S = 5/2 in folgendem Spin-Hamilton-Operator wiedergegeben werden:
1
HZF S = D(Sz2 − S(S + 1)).
3
(3.46)
Für das Erscheinungsbild des EPR-Spektrums ist das Größenverhältnis zwischen der Nullfeldaufspaltung und der Elektron-Zeeman-Wechselwirkung von entscheidender Bedeutung. Abbildung 3.11 zeigt hierzu zwei Fälle. Üblicherweise ﬁndet man bei kleiner Nullfeldaufspaltung im
EPR-Spektrum fünf Linien, die der Auswahlregel ∆Ms = ±1 entsprechen. Bei high-spin Häminkomplexen ist die Nullfeldaufspaltung jedoch sehr oft extrem hoch. So liegt D typischerweise
bei etwa 10 cm−1 [109] Damit wird die Mikrowellenfrequenz des EPR-Experimentes zu einem
limitierenden Faktor. Im X-Band liegt die Mikrowellenfrequenz bei 3 cm−1 . Damit können nur
Übergänge zwischen den Niveaus Ms = ± 1/2 beobachtet werden. In diesem Fall liegt formal
Oh
D4h
λ LS
4E
Ms
+/- 1/2
+/- 3/2
4
+/- 1/2
+/- 3/2
g
4T
1g
A 2g
∆1 ∆2
6A
+/- 5/2
1g
4D
+/- 3/2
2D
+/- 1/2
Abbildung 3.10: Schema zur Aufspaltung der Energieniveaus eines high-spin Fe3+ -Komplexes
durch eine tetragonale Verzerrung und Spin-Bahn-Kopplung. Die Erniedrigung der Symmetrie von
Oh nach D4h führt zu einer energetischen Aufspaltung des angeregten Zustandes 4 T1g in die Zustände
4
Eg und 4 A2g . Durch die Spin-Bahn-Kopplung, die diese Zustände zum Grundzustand hinzumischt,
kommt es zur Nullfeldaufspaltung des elektronischen Grundzustandes.
38
3. Theoretische Grundlagen
Ms
A
+ 5/2
Energie
+ 3/2
Ms
+ 5/2
B
Energie
4D
- 5/2
+ 3/2
2D
-3/2
+1/2
-1/2
+1/2
4D
2D
-1/2
-3/2
- 5/2
Magnetfeld
Magnetfeld
0
0
Abbildung 3.11: Nullfeld- und Zeemanaufspaltung für zwei unterschiedliche S=5/2 Systeme. A Die
EPR-Übergänge mit der Auswahlregel ∆MS = ±1 werden für alle Niveaus der Ms Mannigfaltigkeit
beobachtet. B Die Nullfeldaufspaltung ist deutlich größer als die Mikrowellenfrequenz des EPRExperimentes (D > hν = gβe B0 ) , wodurch nur der Übergang des Ms = ± 1/2 Niveaus im EPRSpektrum beobachtet wird.
ein Zwei-Niveau-System vor. Für EPR-spektroskopische Untersuchungen von high-spin Häminkomplexen bei höheren Mikrowellenfrequenzen sei auf Ref. [123] verwiesen.
Für die Berechnung der Elektron-Zeeman-Wechselwirkung von high-spin Häminkomplexen
im X-Band wird nur der Ms = ±1/2 Unterraum des S = 5/2 Zustandes betrachtet. Mit den
Vektoroperatoren Ŝx , Ŝy und Ŝz erhält man die Matrizen der Elektron-Zeeman-Wechselwirkung
(H = ge βe B0 Ŝ mit ge 2) in die entsprechende Feldrichtung:



 



0 3βe Bx  
0 −i3βe By 
0 
 1βe Bz
, 
 und 
.
3βe Bx
0
i3βe By
0
0 −1βe Bz
(3.47)
Die energetische Aufspaltung der Elektron-Zeeman-Wechselwirkung ist damit in der x- und
y-Richtung dreimal größer als in der z-Richtung. Dieses Ergebnis läßt sich im Formalismus des
Spin-Hamilton-Operators mit einem eﬀektiven Spin S = 1/2 (obwohl für die Spinquantenzahl
3.4 Elektronische Struktur von Häminkomplexen
39
Abbildung 3.12: X-Band cw-EPR-Spektrum von Metmyoglobin in wässriger Lösung (100 mM
Natrium-Phosphatpuﬀer pH 7,5; Proteinkonzentration 1mM).
des elektronischen Grundzustandes S=5/2 gilt) und einem axialen g-Tensor beschreiben:
H = g|| βe Bz Ŝz + g⊥ βe Bx Ŝx + By Ŝy ,
(3.48)
wobei g|| = 2,0 und g⊥ = 6,0. Dies entspricht auch den experimentellen Beobachtungen. Wenn
die Feldrichtung B0 parallel zur Hämnormalen verläuft, zeigen die EPR-Spektren von high-spin
Häminkomplexen einen g-Wert von g|| = 2,0. Wenn B0 dagegen senkrecht zur Hämnormalen
orientiert ist, dann ist g⊥ = 6,0 [109, 112]. Abbildung 3.12 zeigt hierzu ein typisches EPRSpektrum eines high-spin Häminkomplexes am Beispiel des Hämproteins Metmyoglobin.
40
Kapitel 4
Materialien und Methoden
In der hier vorliegenden Arbeit wurden de novo synthetisierte Proteine hergestellt und deren
strukturellen und elektronischen Eigenschaften mit verschiedenen Methoden der optischen und
magnetischen Resonanzspektroskopie charakterisiert. In diesem Kapitel wird die Durchführung
dieser Experimente beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Polypeptidmodule
mMOP1 und mMOP2 synthetisiert, deren Aufbau und funktionellen Eigenschaften detailliert
in Kapitel 5 vorgestellt werden. Außerdem wurden verschiedene Modellkomplexe präpariert, die
als Vergleichssysteme die Charakterisierung der de novo synthetisierten Proteine unterstützen.
Die Cytochrom b Modelle, die in Kapitel 6 untersucht werden, wurden von Harald Rau und
Justus Adam aus der Arbeitgruppe Haehnel, Albert-Ludwigs-Unitversität Freiburg, dargestellt.
Zunächst wird in diesem Kapitel die Synthese der Polypeptidmodule mMOP1 und mMOP2
und die Präparation der Modellkomplexe beschrieben, gefolgt von den verschiedenen hier eingesetzten Techniken der optischen und magnetischen Resonanz-Spektroskopie. Zur Analyse der
magnetischen Resonanzspektren wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Simulationsprogramme
erstellt, die im letzten Abschnitt vorgestellt werden.
4.1
Synthese der Polypeptidmodule
Dieser Abschnitt konzentriert sich auf die experimentelle Durchführung der Synthese der Polypeptidmodule mMOP1 und mMOP2. Das zugrundeliegende Designkonzept wird nur kurz skizziert. Eine ausführliche Darstellung zum Design und dem Aufbau der Vier-Helix-Bündel ist in
Kapitel 5 gegeben (siehe z. B. Abbildung 5.1).
41
42
4. Materialien und Methoden
Die de novo synthetisierten Proteine mMOP1 und mMOP2 setzen sich aus einem Tem-
plat T und je zwei verschiedenen Helices Hb1 und Ha1 bzw. Hb1 und Ha2 zusammen. Dabei
entspricht mMOP1 dem Templat-assoziierten Vier-Helix-Bündel T(Hb1)2 (Ha1)2 und mMOP2
T(Hb1)2 (Ha2)2 . Die Aminosäuresequenz der einzelnen Bausteine lautet wie folgt:
T:
cyclo[C(Acm)-A-C(Trt)-P-G-C(Acm)-A-C(Trt)-P-G∼]
Hb1: (Mp)G-N-A-L-E-L-H-E-K-A-L-K-Q-L-E-E-L-L-K-K-L-NH2
Ha1: (Ac)N-L-E-E-L-L-K-K-L-Q-E-A-L-E-K-A-Q-K-W-L-K(Mp)-NH2
Ha2: (Ac)N-W-E-E-L-L-K-K-L-Q-E-A-L-E-K-A-Q-K-R-L-K(Mp)-NH2
Das Templat (T) wurde von Harald Rau synthetisiert und für diese Arbeit zur Verfügung
gestellt [13,81]. Es enthält vier Cysteingruppen mit den Schutzgruppen Acetamidomethyl (Acm)
und Trityl (Trt), welche vor der Kopplung der helicalen Peptide auf das Templat selektiv entfernt
werden können. Die linearen, helicalen Peptide Hb1, Ha1 und Ha2 wurden über eine automatisierte Festphasensynthese hergestellt, wobei der C-Terminus mit einer Amidgruppe (–NH2 )
versehen wurde. Über manuelle chemische Reaktionsschritte wurden die N-Terminii der abschirmenden Helices Ha1 und Ha2 acetyliert (Ac) und Maleinimidopropionsäuregruppen (Mp) an den
N-Terminus von Hb1 und die N H2 Seitenketten des Lysins am C-Terminus von Ha1 und Ha2
angebracht. Die Fixierung der helicalen Peptide auf das Templat erfolgte über die Kopplung von
Mp mit den SH-Gruppen der Cysteine auf dem Templat. Nach Abspaltung der Schutzgruppen
Trt wurden dazu zwei Hb1-Helices auf das Templat gekoppelt. Anschließend wurden die AcmSchutzgruppen entfernt und die Helices Ha1 bzw. Ha2 antiparallel zu Hb1 auf dem Templat
ﬁxiert.
In den folgenden Abschnitten werden die einzelnen Arbeitsschritte, die aus der automatischen Festphasensynthese der lineare Peptide, ihrer manuellen chemischen Modiﬁkation und der
Zusammensetzung zu einem Vier-Helix-Bündel auf dem Templat bestehen, vorgestellt.
4.1.1
Automatische Festphasensynthese der Peptide
Die Synthese der linearen, helicalen Peptide Hb1, Ha1 und Ha2 erfolgte an einem Syntheseautomaten (Milligan Modell 9050, Perseptive Biosystems) im kontinuierlichen Fluß-Verfahren.
4.1 Synthese der Polypeptidmodule
43
Es wurden Aminosäurederivate, deren Nα -Gruppe durch eine 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl
(Fmoc) Gruppe geschützt ist [124], eingesetzt (Nova Biochem, Bad Soden). Aminosäuren mit reaktiven Seitengruppen tragen zusätzliche Schutzgruppen, wie z. B. tert-Butyloxycarbonyl (tBoc),
tert-Butyl (tBu) oder Trityl (Trt), die im letzten Reaktionsschritt zusammen mit der Abspaltung
des Peptides von der festen Phase entfernt werden. Als feste Phase dient ein PolyethylenglycolPolystyrol Harz mit Polyamidlinkern (PAL-PEG/PS, Perseptive Biosystems, Wiesbaden). Damit trägt der C-Terminus aller hier synthetisierten Peptide eine Amidgruppe CO-NH2 anstelle
der Carbonsäure CO-OH. Das Harz (1,0 – 1,1 g, Beladungsdichte 0,16 mmol/g) wurde in N,NDimethylformamid (DMF) vorgequollen und in eine Glassäule gefüllt, über welche Reaktandenund Waschlösungen gepumpt wurden (typ. Flußrate 5 ml/min). Der Synthesezyklus besteht aus
der Abspaltung der Nα -Fmoc-Schutzgruppen mit einer 1:4 (v:v) Piperdin/DMF Lösung und
der Ankopplung der nächsten Aminosäure. Zur Ankopplung wurden die Aminosäuren in vierfachem Überschuß (entsprechend der Beladungsdichte des Harzes: 0,64 mmol) eingesetzt, mit
O-(Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetraﬂuoroborat (TBTU 205 mg, 0,64 mmol,
Nova Biochem) aktiviert und für 30 min in DMF über die Säule rezyklisiert. Der letzte Synthesezyklus schließt mit der Abspaltung der Fmoc-Gruppe des N-Terminus. Während der gesamten
Synthese wurde die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen über ihre Absorption bei 301 nm mit
einem festinstallierten Detektor verfolgt. Nach der Synthese wurde das Harz aus der Säule genommen, in eine Fritte überführt und mit DMF gewaschen. Die Peptide blieben zunächst am
Harz ﬁxiert und wurden durch weitere chemische Reaktionen manuell modiﬁziert.
4.1.2
Modiﬁzierung der Peptide
Zur Acetylierung der Nα -Aminogruppe am N-Terminus der Abschirmhelices Ha1 und Ha2 wurde
das Harz mit dem Peptid zu 20 ml einer Lösung aus 1:20 (v:v) Essigsäureanhydrid:DMF gegeben und für 40 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Harz in eine Fritte
überführt und mit DMF und Dichlormethan gewaschen.
Bevor die 3-Maleinimidopropionsäure (Mp) an die N H2 -Seitengruppe des C-terminalen Lysins der Abschirmhelices Ha1 und Ha2 gekoppelt werden können, muß die Schutzgruppe dieser reaktiven Seitengruppe abgespalten werden. Bei der Peptidsynthese wurde für das C-terminale Lysin ein Derivat mit einer Allyloxycarbonyl (Aloc)-Schutzgruppe eingesetzt, da diese in einem vorgezogenen Reaktionsschritt selektiv vor den anderen Schutzgruppen entfernt werden kann [125].
44
4. Materialien und Methoden
Zur Abspaltung der Aloc-Schutzgruppe wurden 100 ml 37:2:1 (v:v:v) Chloroform:Essigsäure:NMethylmorpholin Lösung angesetzt und in kleinen Portionen über das Peptidyl-Harz auf der
Fritte gegeben. Nach diesem Waschschritt wurde das Harz mit 20 ml der frisch angesetzten
Reaktionslösung in einen Rundkolben überführt und mit Argon entgast. Es wurden 560 mg
(0,5 mmol) tetrakis-(Triphenylphosphin)-Palladium(0) (Pd(PΦ3 )4 ) hinzugefügt. Bei etwa 1,0 g
Harz mit einer Beladungsdichte von 0,16 mmol/g entspricht dies einem 3-fachen Überschuß
an Pd(PΦ3 )4 pro Aloc-Schutzgruppe. Die Lösung wurde mit Ultraschall behandelt und für 2
Stunden geschüttelt (hellrote Verfärbung). Zum Entfernen des Katalysators Pd(PΦ3 )4 wurde
die Reaktionslösung auf eine Fritte überführt und abwechselnd mit 0,5 % Diisopropylethylamin
Lösung in DMF und 0,5 % Natrium-Diethyldithiocarbamat Lösung in DMF, sowie anschließend
reinem DMF gewaschen bis die Waschlösung farblos war.
Die Mp-Gruppe kann an die nun deblockierte Seitengruppe des Lysins am C-Terminus von
Ha1 und Ha2, sowie an den freien N-Terminus der Helix Hb1 gekoppelt werden. Dabei wurde das
Verfahren nach Atherton et al. [126] angewandt. 180 mg (1,1 mmol) Maleinimidopropionsäure
(entsprechend einem 6-fachen Überschuß an freien Aminogruppen der helicalen Peptide) wurden
in 1,5 ml DMF in einem Rundkolben angelöst. 200 µl (1,3 mmol) Diisopropylcarbodiimid wurden
hinzugefügt und die Lösung für 10 min inkubiert. Danach wurde das Peptidyl-Harz zugegeben,
die Lösung mit DMF bedeckt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde
auf eine Fritte überführt und mit DMF und Dichlormethan gewaschen und in einem Exsikkator
mehrere Stunden getrocknet.
4.1.3
Abspaltung der Peptide von der festen Phase
Bei der Abspaltung der Peptide von dem Harz werden gleichzeitig die Schutzgruppen reaktiver Seitenketten entfernt. Die Peptidyl-Harze wurden dazu mit 20 ml einer Stammlösung aus
92ml Triﬂuoressigsäure (TFA), 4 g 1,4-Dithio-D,L-threitol (DTT) und 4 ml Anisol versetzt.
Die Suspension wurde für 2 h bei Raumtemperatur gerührt und verfärbte sich dabei rötlich.
In einer Waschﬂasche wurden 120 ml Diethylether vorgelegt und in einem Eisbad kaltgestellt.
Die Reaktionslösung wurde über eine Fritte gegeben und im Diethylether als weißes Pulver
ausgefällt und für 1 h im Eisbad stehen gelassen. Der weisse Niederschlag wurde bei 5000 g
und 4◦ C für 5 min abzentrifugiert (Sorvall RC 5C, GSA Rotor, verschließbare GSA Stahlzentrifugenbecher). Der Überstand wurde sofort abgegossen. Das weiße Pellet wurde mit 20 ml
4.1 Synthese der Polypeptidmodule
45
vorgekühltem Diethylether resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde
insgesamt viermal wiederholt. Die Rohpeptide wurden im Vakuum getrocknet, durch präparative HPLC (Hochauﬂösende Flüssigkeitschromatogaphie, siehe Abschnitt 4.3.1) gereinigt und
anschließend lyophillisiert. Insgesamt wurden für die helicalen, linearen Peptide Ausbeuten von
80 % relativ zum Erwartungswert, der aus der Beladungsdichte des Harzes berechnet wurde,
erreicht.
Kleine Mengen an Peptidyl-Harz wurden für Voruntersuchungen während der einzelnen
Schritte vom Harz abgespalten. Mittels Massenspektrometrie (siehe Abschnitt 4.3.2) wurde kontrolliert, ob die einzelnen Reaktionsschritte vollständig abgelaufen sind. Dabei wurde festgestellt,
daß die Abspaltung der Schutzgruppe tBoc, die für die Aminosäure Trp in Helix Ha2 eingesetzt
wurde, in zwei Schritten erfolgt. Durch die Behandlung des Peptidyl-Harzes mit der Lösung
aus TFA:DTT:Anisol wird zunächst nur der tert-Butylrest freigesetzt. Erst nach nach längerem
Stehenlassen in saurer wäßriger Lösung entweicht auch die Oxycarbonylgruppe als CO2 aus der
Reaktionslösung. Das Rohpeptid von Ha2 wurde deshalb vor der Reinigung durch präparative
HPLC noch für 2 h in einer Lösung aus 0,1:16:84 (v:v:v) TFA:Acetonitril:H2 O stehen gelassen.
4.1.4
Zusammensetzen der einzelnen Peptid-Bausteine zum Vier-HelixBündel
Das Templat wurde von Harald Rau synthetisiert und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt [13, 81]. Die Trt-Schutzgruppen wurden mit einem Gemisch aus TFA und DTT (1 g DTT
auf 19 ml TFA) entfernt [81]. Die beiden entschützten SH-Gruppen des Templates wurden mit
den Mp-Gruppen der Helix Hb1 gekoppelt. Dazu wurden in einem Eppendorfreaktionsgefäß zu
14,5 mg Templat (14 µmol) 97 mg Helix Hb1 (31 µmol) hinzugefügt (leichter Überschuß an Hb1
1:2,2). Bei der Berechung der Massen ist zu beachten, daß die Peptide nach der HPLC-Reinigung
mit TFA beladen sind, die als Gegenionen zu positiv geladenen Aminosäureseitengruppen auftreten. Als Lösungsmittel wurde 1:2 (v:v) Acetonitril:Phosphatpuﬀer (50 mM, pH 7,0) verwendet
(1,5 ml). Die Reaktionslösung wurde mit Argon überdeckt und für 30 min geschüttelt. Eine
kleine Probenmenge wurde entnommen, um mit Hilfe der Massenspektrometrie zu kontrollieren, ob die Reaktion vollständig abgelaufen ist und als Produkt T(Acm)2 (Hb1)2 vorliegt. Die
Reaktionslösung wurde während dessen in ﬂüssigem Stickstoﬀ schockgefroren. Da das Massenspektrum nur geringfügige Reste an überschüßiger Helix Hb1 und kein freies Templat mehr
46
4. Materialien und Methoden
anzeigte, konnte die Synthese der modularen Proteine nach dem Auftauen der Reaktionslösung
direkt fortgeführt werden.
7 ml einer 10 % wäßrigen Essigsäurelösung, die mit Ammoniak auf pH 4,0 eingestellt wurde, wurden in einem Spitzkolben mit Argon entgast. Die Reaktionslösung der Acm-Abspaltung
und 115 mg (360 µM) Quecksilber(II)acetat wurden zugegeben, der pH-Wert kontrolliert und
1h gerührt. Anschließend wurde unter Argon 50 µl Mercaptoethanol und nach 10 min rühren
1 g (6,5 mmol) DTT zugegeben, um das Quecksilber auszufällen. Es bildete sich eine hellgraue
Suspension, die noch für zwei weitere Stunden gerührt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit
insgesamt 2 ml konzentrierter Essigsäure in mehrere Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Mit
einer Eppendorftischzentrifuge wurde der Niederschlag abzentrifugiert, je drei mal mit 10 %
Essigsäure gewaschen und entsorgt. Alle Überstände wurden vereinigt und direkt mittels präparativer HPLC gereinigt.
An das so isolierte Zwischenprodukt T(Hb1)2 wurden zur Synthese von mMOP1 zwei Ha1Helices und zur Synthese von mMOP2 entsprechend zwei Ha2-Helices angekoppelt. Dieser Reaktionsschritt wurde analog zur Fixierung von Hb1 auf das Templat T(Acm)2 bei pH 7,0 unter Argon durchgeführt. Dazu wurde das Zwischenprodukt T(Hb1)2 mit den entsprechenden
Abschirmhelices in 1:2 (v:v) Acetonitril/Phosphatpuﬀer gemischt. Die Abschirmhelices werden
dabei in leichtem Überschuß (1,1:1 Ha1 oder Ha2 pro Bindungsstelle) zugesetzt. Nach 30 min
wurde die Reaktion durch Zusatz von konzentrierter Essigsäure (200 µl auf 1,5 ml Reaktionslösung) gestoppt. Bei der Synthese von mMOP1 konnte die Verbindung T(Hb1)2 (Ha1)2
direkt durch präparative HPLC gereinigt werden. Bei mMOP2 enthielt die Hauptfraktion
des HPLC-Reinigungsschrittes, wie anhand eines Massenspektrums festgestellt wurde, neben
T(Hb1)2 (Ha2)2 noch überschüßige Helix Ha2. Die Mp-Gruppe von Ha2 wurde daraufhin durch
Zusatz von 2-Methyl-2-propanthiol desaktiviert, nachdem die Lösung der Hauptfraktion mit
NaHCO3 auf pH 7,0 eingestellt worden war. Die Einführung dieser hydrophoben Thiolgruppe
ermöglichte die Abtrennung und Isolierung des Endproduktes T(Hb1)2 (Ha2)2 in einem weiteren
präparativen HPLC-Reinigungsschritt. Die Polypeptidmodule mMOP1 und mMOP2 wurden
lyophilisiert und bei −70◦ C aufbewahrt.
4.1 Synthese der Polypeptidmodule
4.1.5
In
die
47
Einbau von Metalloporphyrinkofaktoren
Polypeptidmodule
mMOP1
und
mMOP2
wurden
die
Metalloporphyrine
Fe(III)protoporphyrin IX (Fe(III)PPIX), Zn(II)protoporphyrin IX (Zn(II)PPIX) und Co(II)protoporphyrin IX (Co(II)PPIX) eingebaut. Das Metalloporphyrin Fe(III)PPIX wird im
Folgenden auch als Hämin entsprechend seinem Trivialnamen bezeichnet. Fe(III)PPIX und
Zn(II)PPIX wurde von Aldrich und Co(II)PPIX von Bianca Rosengarten (Arbeitsgruppe
Haehnel, Freiburg) erhalten. Die Polypeptidmodule wurden in Konzentrationen von 50 µM in
50 mM TRIS/HCl-Puﬀer, pH 8,0 gelöst. Um eventuell vorhandene hydrophobe Kontaktstellen
aufzutrennen, wurde dabei zunächst etwas Acetonitril (max. 2 % des Endvolumens) auf das
ﬂockige Peptidlyophilisat gegeben. Die Metalloporphyrine wurden kurz vor ihrem Einbau in
Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Von diesen Stammlösungen (1 – 10 mM) wurde eine Portion,
die einem 1,1 – 1,5-fachen Überschuß an Porphyrin pro Bindungsstelle entspricht, langsam
in die Peptidlösung getropft. Nach 30 – 60 min Rühren wurde die Reaktionslösung über
eine Säule mit Sephadex G-25 medium Material (Pharmacia Biotech) gegeben, die zuvor mit
Phosphatpuﬀer (50 mM, pH 7,0) equilibriert wurde. Für kleine Probenmengen (5 ml) wurde
eine PD-10 Säule (Pharmacia) verwendet, um überschüssiges Porphyrin zu entfernen. Es folgte
eine Entsalzung der Probe durch eine zweite Gelﬁltration nach Equilibrieren der Säulen mit
destilliertem Wasser. Anschließend wurden die Proben lyophilisiert.
4.1.6
Cytochrom b Modelle
Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei weitere de novo synthetisierte Hämproteine (Cytochrom b Modelle) untersucht, die von Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Haehnel, Albert-LudwigsUniversität Freiburg, erhalten wurden. Kapitel 6 setzt sich mit der Charakterisierung dieser Systeme auseinander und beschreibt den Aufbau der Vier-Helix-Bündel anhand einer schematische
Darstellung in Abbildung 6.1. Zu den Cytochrom b Modellen gehört ein modulares Protein, genannt MOP, welches nach der modularen Strategie Templat-assoziierter synthetischer Proteine
von Harald Rau [13, 82] hergestellt wurde. Die Fixierung der Helices des MOP auf das Templat
erfolgte im Unterschied zu den Polypeptidmodulen mMOP1 und mMOP2 über Bromoacetylgruppen anstelle der Mp-Gruppen. Ein weiteres Cytochrom b Modell ist das ‘maquette’. Die
Synthese wurde ebenfalls von Harald Rau durchgeführt [127] und beruht auf einem Designkon-
48
4. Materialien und Methoden
zept von Robertson et al. [11]. Das dritte Cytochrom b Modell [α(H1)–α(H2)]2 wurde von J.
Adam mit einem gentechnischen Verfahren hergestellt [128].
4.2
Präparation von Modellverbindungen
Um die Charakterisierung der de novo Proteine zu unterstützen, wurden verschiedene Proben mit
Modellkomplexen hergestellt. Lösungsmittel vom Qualitätsgrad p.a. stammen von Roth (Karlsruhe) oder Merck (Darmstadt). Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma/Aldrich/Fluka
bezogen.
Häminkomplexe mit unterschiedlichen Liganden wurden zur Abschätzung des Mengenanteils
verschiedener Fe3+ Spin-Zustände in den EPR-Spektren der de novo Hämproteine (siehe Kapitel
5.3.4) hergestellt. Zunächst wurde eine Stammlösung aus 9 mg Fe(III)PPIX (13,8 µmol) in 1,2
ml DMSO angesetzt. Zu jeweils 200 µl der Häminstammlösung wurden 200 µl reines DMSO und
200 µl an 2 M Lösungen der Imidazolderivate Imidazol, 1-Methylimidazol, 2-Methylimidazol und
1,2 Dimethylimidazol in DMSO gegeben. Nach Durchmischung der Proben und Entfernung des
Sauerstoﬀs durch Einleiten von Argon wurden jeweils 200 µl entnommen, in EPR Probenröhrchen überführt und sofort mit ﬂüssigem Stickstoﬀ eingefroren. Die Konzentration an Hämin
beträgt in allen Proben 5,75 mM.
Für ENDOR-spektroskopische Untersuchungen wurden Fe(III)porphyrinsysteme (Protoporphyrin IX (PPIX), Octaethylporphyrin (OEP) und Tetraphenylporphyrin (TPP)) mit Imidazol ligandiert, das entweder vollständig protoniert, deuteriert oder mit
Das vollständig mit
15 N
15 N
2
markiert vorlag.
markierte Imidazol (99 %) wurde von Campro Scientiﬁc (Emmerich)
erworben. Die Isotopenmarkierung dient der Identiﬁkation von ENDOR-Signalen (siehe Kapitel 6.3). Typischerweise wurden 25 µmol an Fe(III)porphyrin mit einem 8-fachen Überschuß an
Imidazol (400 µmol) gemischt und in 500 µl Chloroform (mit Argon entgast) in einem Eppendorfreaktionsgefäß gelöst. Unter Argon wurden jeweils etwa 200 µl entnommen und in ein EPR
Röhrchen überführt. Die Proben wurden direkt in ﬂüssigem Stickstoﬀ eingefroren.
Das natürliche Hämprotein Metmyoglobin (Mb) wurde nach Addition eines Imidazolliganden
als weiteres Vergleichsystem für die de novo Hämproteine herangezogen (siehe Kapitel 6.2 und
6.3). Dazu wurden 17,7 mg (1 mmol) Mb (sperm whale, Sigma) und 17 mg (250 mmol) Imidazol
in 250 µl 2:3 Glycerol:Phosphatpuﬀer (pH 7,5, 100mM) gelöst. Mb, in welchem die Hämgruppe
4.3 Methoden zur Charakterisierung
49
durch Zn(II)PPIX ausgetauscht wurde (Arbeitsgruppe Willner, Jerusalem), wurde direkt in 3:2
Glycerol:Phosphatpuﬀer (pH 7,5, 50 mM) in einer Konzentration von 2 mM unter Argon gelöst.
4.3
4.3.1
Methoden zur Charakterisierung
Hochauﬂösende Flüssigkeitschromatogaphie (HPLC)
Die Reinigung und Analyse der Rohpeptide, die über die automatisierte Festphasensynthese hergestellt wurden, erfolgte als reversed phase HPLC an C-18 Kieselgel Materialien. Zur optimalen
Auftrennung wurde ein Gradientenverfahren der Lösungen 0,1 % TFA in destilliertem Wasser
(A) und 0,1:20:80 (v:v:v) TFA:H2 O:Acetonitril (B) eingesetzt.
Trennungen im analytischen Maßstab wurden an einer 600E Waters Anlage über Säulen mit
dem Material Poros-R1 oder Poros-R2 (Perseptive Biosystems) ausgeführt. Die Eluation der
Peptide wurde über die Absorption bei 215 nm mit einem Photodiodenarray Detektor (Waters
996) verfolgt. Damit kann festgestellt werden, ob bei der automatisierten Festphasenpeptidsynthese Nebenprodukte entstanden sind.
Die präparative Reinigung der Rohpeptide in Portionen bis zu 200 mg erfolgte an einem
Waters Model 4000-System, das mit einem Waters 486 Absorptionsdetektor ausgestattet war,
statt. Es wurde eine Delta-Pak-C18-PrepPAK-15 µm Säule (Waters) mit einer Flußrate von 50
ml/min eingesetzt.
4.3.2
Massenspektrometrie
Zur Überprüfung der Synthese und als Kriterium für die Reinheit der Polypeptide wurden ihre Massen bestimmt. Die Massenspektren wurden von Patrick Hörth aus der Arbeitsgruppe
Haehnel, Freiburg, an einem TSQ-700-Tanden-Quadrupol-Massenspektrometer (Finnigan) mit
Electrospray Interface aufgenommen. Die Peptide wurden dazu direkt in Lösung aus der Hauptfraktion der HPLC Reinigung entnommen oder als Lyophilisat mit 1:1 (v:v) Wasser:Methanol
mit einem Gehalt von 1 % Essigsäure aufgelöst. Die Auswertung der Spektren wurde mit den
Programmen Biomass Calculation und Biomass Deconvolution (Finnigan) durchgeführt. Die
Kalibrierung des Massenspektrometers erfolgte durch Apomyoglobin (Pferd) mit einer mittleren
Masse von 16950,5 Da.
50
4. Materialien und Methoden
4.3.3
Analytische Gelﬁltration
An einer 1050-Ti-HPLC-Anlage (Hewlett Packard) wurden Gelﬁltrationen zur Detektion einer
möglichen Aggregation der Polypeptidmodule durchgeführt. Als Säule wurde eine Superdex75-Gelﬁltrationssäule (Pharmacia) verwendet, die zuvor mit 50 mM Phosphatpuﬀer (pH 7,0,
100mM NaCl) equilibriert wurde. Die Peptide wurden mit einer Konzentration von etwa 20 µM
in 200 µl Portionen injiziert und mit einer Flußrate von 0,5 ml/min mit 50 mM Phosphatpuﬀer
(pH 7,0, 100 mM NaCl) eluiert. Die Eluation wurde über die Absorption bei 215 nm oder 410
nm verfolgt.
4.3.4
Circulardichroismus (CD) und Tryptophan-Fluoreszenz
Die CD-Spektroskopie gibt einen Hinweis auf die Helicalität der Polypeptidmodule. Die
Tryptophan-Fluoreszenz ist diagnostisch für die Hydrophobizität der Umgebung der aromatischen Aminosäure. Mit diesen beiden Methoden wird in Kapitel 5 die erfolgreiche Zusammenlagerung der Polypeptidmodule überprüft und die Stabilität ihrer Faltung untersucht.
CD-Spektren wurden an einem Jasco J-600 Spektralpolarimeter der Arbeitsgruppe Saenger,
FU-Berlin, im UV-Bereich (185 – 260 nm) in einer CD-Quarzküvette mit Schichtdicke 1 mm
aufgenommen. Die Konzentration der Peptidlösungen in 10 mM Phosphatpuﬀer (pH 7,0) betrug
etwa 10 µM.
Fluoreszenzspektren wurden mit einem Shimadzu Spektralphotometer am Fritz-HaberInstitut, Berlin aufgenommen. Die Anregung der Proben in Quarzglasküvetten mit Schichtdicke
5 mm erfolgte bei 280 nm. Die Fluoreszenzspektren wurden in einem Wellenlängenbereich von
290 nm bis 500 nm aufgenommen.
Die Stabilität der Faltung der modularen Proteine mMOP1 und mMOP2 und ihrer
Häminkomplexe wurde anhand des Einﬂusses des chaotropen Agenz Guanidinium-Hydrochlorid
(Gdn·HCl) auf die CD-, Fluoreszenz- und UV/VIS-Absorptionsspektren (siehe Abschnitt 4.3.5)
der jeweiligen Proben untersucht. Dazu wurden mehrere Konzentrationsreihen erstellt. Zu 50
µl einer etwa 100 µM Stammlösung an de novo Protein wurden insgesamt 0,5 – 1 ml an 50
mM Phosphatpuﬀer pH 7,0 und Gdn·HCl Stammlösung (6 – 8 molar) gegeben. Durch das Mischungsverhältnis von Puﬀer und Gdn·HCl wurde die Konzentration an denaturierendem Agenz
eingestellt. Die Proben wurden vor der Messung mindestens für 30 Minuten bei Raumtempera-
4.3 Methoden zur Charakterisierung
51
tur inkubiert. Die Konzentration c der Gdn·HCl Stammlösungen (in 100 mM Phosphatpuﬀer,
pH 7,0) wurde anhand des Brechungsindex bestimmt [129]:
c = 57, 15(∆n) + 36, 68(∆n)2 − 91, 60(∆n)3 ,
(4.1)
wobei ∆n für den Unterschied des Brechungsindex der Gdn·HCl Lösung zu destilliertem Wasser
bei gleicher Temperatur (hier 21◦ C) steht.
4.3.5
UV/VIS-Absorptionsspektroskopie
Die UV/VIS-Absorptionsspektroskopie wurde eingesetzt, um den Einbau der Kofaktoren zu
verfolgen, das Redoxpotential der Hämgruppen zu bestimmen und Denaturierungsexperimente
durchzuführen.
Optische Absorptionsspektren wurden an einem Cary 05 E Spektralphotometer (Varian) bei
Raumtemperatur gemessen. Vor der Messung einer Probe wurde eine Grundlinie des jeweils
verwendeten Puﬀers aufgenommen und gespeichert. Die Konzentration der Proben lag bei 1 –
10 µM.
Die Redoxtitrationen erfolgten in einer Küvette mit einem aufgeschmolzenen Aufsatz zur
Einführung der Elektroden, einer Ag/AgCl-Meßelektrode und einer Platin-Referenzelektrode. In
diese Küvette wurden 4 ml Probenlösung gegeben. Die Konzentration an de novo synthetisierten
Hämproteinen in 50 mM Phosphatpuﬀer (pH 7,0) wurde dabei so eingestellt, daß die Absorption
bei 410 nm zwischen 1,0 und 2,0 lag (Schichtdicke der Küvette 1 cm). Danach wurden je 10 µl an
Stammlösungen von Redoxmediatoren zugegeben, so daß in der Lösung 50 µM 2,5-Dihydroxy-pbenzochinon, 50 µM 2-Hydroxy-1,4-naphtochinon, 25 µM Anthrachinon-2,6-disulfonsäure und
12,5 µM Anthrachinon-2-sulfonsäure vorlagen. Das Meßgefäß wurde luftdicht abgeschlossen.
Über ein Septum wurde mit einer Stahlkanüle Argon in die Meßlösung geleitet. Die Lösung
wurde für eine Stunde entgast. Die Reduktion des Häminkofaktors erfolgte über Zugabe einer
Natriumdithionitlösung in kleinen Portionen (1 – 10 µl) mit einer Hamilton-Spritze über ein
Septum. Die Natriumdithionitlösung wurde jeweils frisch angesetzt aus 20 mg Natriumdithionit
und 5 ml 50 mM Phosphatpuﬀer (pH 7,0), der zuvor für eine Stunde mit Argon entgast wurde.
Das Potential wurde mit einem pH-Meter (Knick) bestimmt. Es wurde bis zu 5 Minuten gewartet
bis sich das Potential stabilisierte. Danach wurde ein UV/VIS-Spektrum im Bereich von 700 –
52
4. Materialien und Methoden
360 nm aufgenommen. Die Redoxtitration erfolgte in Potentialschritten von 5 – 20 mV. Nach der
vollständigen Reduktion mit Dithionit wurde die Probe durch Zugabe einer 100 mM K3 [Fe(CN)6 ]
Lösung schrittweise re-oxidiert. Während der gesamten Titration wurde ein Argonstrom über
die Meßlösung geführt.
Zur Auswertung wird die Absorptionsänderung bei 561 nm herangezogen und an eine NernstGleichung angepaßt [130]:
E = Em −
[Red]
RT
ln
.
nF
[Ox]
(4.2)
Die Anzahl n der Elektronen, die bei der Redoxreaktion übertragen werden, wird dabei auf 1
gesetzt. E ist das Potential der Lösung, das während der Titration gemessen wird und Em ist das
gesuchte Redoxpotential (Mittelpunktspotential). Die Größen R = 8,314 J K−1 mol−1 und F =
96 485 C mol−1 sind die Gaskonstante und die Faradaykonstante. Die Temperatur T entspricht
der Raumtemperatur (ca. 293 K ± 2 K). Das Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem Kofaktor
wird über die Absorption bei 561 nm bestimmt, wobei
[Red]
[Ox]
=
x
1−x
und x =
A561 −A561
ox
.
A561
−A561
ox
red
A561
ox
entspricht der Absorption der vollständig oxidierten Probe zu Beginn der Titration und A561
red
der Absorption der vollständig reduzierten Probe.
4.3.6
Blitzlichtspektroskopie
Mit Hilfe der Blitzlichtspektroskopie wurden Triplett – Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektren
verschiedener Systeme, die Zn(II)PPIX enthalten, aufgenommen. Mit einer Xenon-Blitzlampe
(Halbwertsbreite der Lichtblitze 15 µs, Wiederholrate 1 Hz) wurden die Proben angeregt und die
Änderung der Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge zeitlich verfolgt. Die Meßapparatur
besteht aus einer Wolfram-Halogenlampe (Osram 250 W), einem Gittermonochromator (Bausch
& Lomb, Bandbreite 3 nm) und einem Photomultiplier zur Detektion (EMI 9558 BQ). Zur
Abschirmung von Fluoreszenz- und Streulicht wurden Interferenz- und Kantenﬁlter (Schott),
teilweise auch Farbgläser (Schott), die jeweils auf die Wellenlänge des Meßlichtes abgestimmt
wurden, vor den Detektor gesetzt. Vor der Xenon-Blitzlampe wurde im Meßbereich von 380 –
500 nm ein OG515 Kantenﬁlter (Schott) angebracht. Bei Wellenlängen von 500 – 700 nm wurde
das Anregungslicht durch ein Blauglas (CS96-4, Corning) geﬁltert. Zur Aufnahme der Zeitspuren
wurde ein Transientenrekorder (Tektronix TDS 320) eingesetzt.
Die Temperierung der Proben auf 77 K erfolgte mit einem Stickstoﬀ-Kryostaten (Oxford). Als
4.3 Methoden zur Charakterisierung
53
Lösungsmittel wurde 2:1 (w:w) Glycerol:Phosphatpuﬀer (50mM, pH 7,0) eingesetzt. Die Konzentration der Proben wurde so eingestellt, daß das Absorptionsmaximum bei 426 nm zwischen
A = 1,0 und 2,0 bei einer (Schichtdicke der Küvette 1 cm) lag. In Schritten von 5 bis 10 nm wurde die Wellenlänge des Meßlichtes variiert. Jeder Meßpunkt entspricht der Mittelung mehrerer
Transienten (10 – 100), aus denen durch die Anpassung des zeitlichen Verlaufs die Amplituden
der Absorptionsdiﬀerenzspektren ermittelt wurden. Die Anpassung erfolgte mit zwei Exponentialfunktionen, deren Zeitkonstanten über den gesamten Wellenlängenbereich konstant gehalten
wurden. Zur Auftragung der Absorptionsdiﬀerenzspektren wurde jeweils die Hauptkomponente
mit der längeren Zeitkonstante gewählt (siehe Abschnitt 5.5.3).
Außerdem wurde mit Hilfe der Blitzlichtspektroskopie der Elektronentransfer von optisch
angeregtem Zn(II)PPIX, das entweder in mMOP1 oder zum Vergleich in Myoglobin eingebaut
war, zu 2-Anthrachinonsulfonsäure (AQS) untersucht. Dazu wurde die Kinetik der Absorptionsänderung bei einer Wellenlänge von 674 nm verfolgt.
Eine 75 µM AQS Stammlösung wurde in destilliertem Wasser angesetzt und die Konzentration anhand der Absorption bei 330 nm überprüft [131]. In eine verschließbare Küvette wurden
1,5 ml an etwa 5 µM Zn(II)PPIX-mMOP1 bzw. Zn(II)PPIX-Myoglobin Lösung in 50 mM Phosphatpuﬀer pH 7,0 gegeben. Zur enzymatischen Entfernung des Sauerstoﬀs wurden jeweils 10
µl an 1M Glucose, 10 mg/ml Katalase (2750 units/mg, Rinder Leber, Sigma) und 100 mg/ml
Glucoseoxidase (18,5 units/mg, Aspergillus niger, Sigma) zugefügt. Die Küvette wurde unter
einem Argon-Strom verschlossen. Über ein Septum wurde die AQS-Stammlösung in Portionen
von 5 – 20 µl mit einer Hamiltonspritze in die Küvette gegeben.
Anhand der Zeitspuren, die mit Hilfe des Transientenrekorders aufgezeichnet wurden, konnte
die Bildung von oxidiertem Zn(II)PPIX+·, das als Produkt durch den lichtinduzierten Elektronentransfer entsteht, verfolgt werden. Der Anstieg der Absorption nach dem Anregungsblitz
wurde mit einer Exponentialfunktion angepaßt, womit die Reaktionsrate des Elektronentransfers zwischen Zn(II)PPIX und AQS bestimmt werden konnte (siehe Abschnitt 5.5.3).
4.3.7
EPR-Spektroskopie
Die EPR-Spektroskopie wurde zur Charakterisierung der Einbausituation von paramagnetischen Kofaktoren (Hämin, Abschnitt 5.3.4, und 6.2) oder paramagnetischen Zuständen (TriplettZustand von Zn(II)PPIX, Abschnitt 5.5.2) eingesetzt.
54
4. Materialien und Methoden
X-Band cw-EPR-Spektren wurden an einem ESP 300E Spektrometer (Bruker) aufgenom-
men. Die Mikrowellenfrequenz wurde mit einem Hewlett-Packard 5352 B Mikrowellenzähler
bestimmt. Die Magnetfeldstärken wurden mit einem NMR-Teslameter (ER 035, Bruker) gemessen. Wie anhand einer Diphenyl-picryl-hydrazyl (DPPH) Standardprobe (g = 2,0037 [85])
überprüft wurde, lag die Genauigkeit in der Bestimmung der Feldwerte bei 0,1 mT. Die Temperierung der Proben erfolgte mit einem Helium-Durchﬂußkryostaten (E9 Oxford Instruments),
der an ein Temperatur-Kontrollgerät (ITC4 Oxford Instruments) angeschlossen wurde. Bei den
Häminkomplexen erwiesen sich Temperaturen von 10 bis 20 K für maximale Signalintensitäten
als günstig. Die Mikrowellenleistung lag bei 1 – 5 mW. Es wurde eine Feldmodulation von 1
mT mit einer Modulationsfrequenz von 100 kHz eingesetzt. Bei den verwendeten Resonatoren
der Firma Bruker (TE102 Standardresonator ER 4102 ST, TE104 Doppelresonator (ER 4105
DR) und TE102 Dual-Mode-Resonator (ER 4116 DM)) lag die Mikrowellenfrequenz bei 9,4 –
9,7 GHz. Die Aufnahmezeit richtete sich nach der Probenkonzentration und lag zwischen 5 und
15 Minuten. Zur Herstellung der EPR-Proben der de novo synthetisierten Hämproteine wurde
das Lyophilisat in 300 – 500 µl Phosphatpuﬀer (50mM, pH 7,0) aufgenommen und kurz mit
Ultraschall behandelt. Die Konzentration der Proben lag bei etwa 1 mM. Etwa 200 µl wurden
entnommen, in ein EPR-Probenröhrchen abgefüllt und in ﬂüssigem Stickstoﬀ schockgefroren.
Die Herstellung der EPR-Proben der Modellkomplexe ist in Abschnitt 4.2 beschrieben.
Transiente EPR-Spektren des Triplett-Zustandes des Kofaktors Zn(II)PPIX wurden durch
direkte Anregung der Proben bei 532 nm im Resonator (dielektrischer Ring, ER 4118 X-MD5W1, Bruker) mit einem Nd:YAG Laser (Spectra Physics GCR 130) erhalten. Der Laser wurde
mit einer Wiederholrate von 10 Hz und einer Leistung von 5mJ pro Puls betrieben. Die Detektion der transienten Signale erfolgte direkt (d. h. ohne Modulationstechniken) mit Hilfe eines
digitalen Oszilloskops (LeCroy 9450A). Die Aufzeichung der Spektren an einem Bruker ESP
380 E Spektrometer wurde durch ein Programmmodul gesteuert, welches in der Arbeitsgruppe
Lubitz erstellt wurde [132].
Zur EPR-spektroskopischen Charakterisierung des modularen Proteins Zn(II)PPIX-mMOP1
wurden 2,0 mg an Lyophilisat in 100 µl 3:2 Glycerol:Phosphatpuﬀer (50mM, pH 7,0) gelöst. Die
Lösung wurde unter Argon in ein EPR-Röhrchen überführt und direkt in ﬂüssigem Stickstoﬀ eingefroren. Die Probe wurde in einem Helium-Kryostaten (CF 935 Oxford Instruments) mit einem
Temperaturkontrollgerät (ITC4 Oxford Instruments) auf 80 K temperiert. Die Messung erfolgte
4.4 Programme zur Auswertung der EPR- und ENDOR-Spektren
55
bei einer Mikrowellenleistung von 200 µW und einer Mikrowellenfrequenz von 9,7 GHz innerhalb
von 15 Minuten. Bei der Aufnahme der Zn(II)PPIX-Myoglobin Probe, die als Vergleichssystem
zum de novo Protein vermessen wurde, wurden identische Meßparameter verwendet.
4.3.8
ENDOR-Spektroskopie
Die ENDOR-Spektroskopie wurde in Kapitel 6 zur Charakterisierung de novo synthetisierter
Hämproteine eingesetzt. Die X-Band Puls-ENDOR-Spektren wurden an einem Bruker ESP
380E Spektrometer aufgenommen, das mit einem ESP 360D-P Puls-ENDOR-Einsatz ausgestattet war. Es wurde ein Resonator der Firma Bruker (ER 4118X-MD-5-W1-EN) eingesetzt.
Die Radiofrequenz wurde durch einen ENI A 500 verstärkt. Die Temperatur der Puls-ENDORMessungen lag bei 5K. Die Temperierung der Proben erfolgte über einen Helium Kryostaten
(CF935 Oxford Instruments) und ein Temperatur-Kontrollgerät (ITC4 Oxford Instruments). Zur
Aufnahme der Spektren wurde eine Davies-Puls-ENDOR Sequenz eingesetzt (siehe Abschnitt
3.2) [99]. Die Verstärkung der Mikrowellenpulse, die über einen Wanderfeldröhrenverstärker (MSquare Microtek M300) erfolgte, wurde so eingestellt, daß ein π-Puls eine Länge von 112 ns und
ein π/2-Puls eine Länge von 56 ns hat. 1 µs nach dem ersten Mikrowellen-π-Puls wurde ein
Radiofrequenzpuls mit einer Länge von 8 µs gesetzt. Nach einer Wartezeit von 3 µs folgte eine
Hahn-Echo-Sequenz zur Detektion des ENDOR-Eﬀektes. Der Abstand τ der beiden Pulse der
Hahn-Echo-Sequenz (π−τ −π/2) betrug etwa 300 ns. Die gesamte Davies-Puls-ENDOR-Sequenz
wurde mit einem Zeitabstand von 2 – 10 ms wiederholt. Die Aufnahmezeit der Spektren lag bei
1 bis zu 24 Stunden.
4.4
Programme zur Auswertung der EPR- und ENDORSpektren
4.4.1
EPR-Simulationsprogramm ELSI
Zur Analyse der EPR-Pulverspektren wurde ein Simulationsprogramm für ein Spin S=1/2 System unter Berücksichtigung verschiedener Mechanismen der Linienverbreiterung, wie Relaxation, unaufgelöste Hyperfeinwechselwirkung [86] und g-strain [133], geschrieben. Das Programm
bekommt daher den Namen ELSI für EPR Linienbreiten Simulation. Der Programmcode (siehe
56
4. Materialien und Methoden
Anhang) wurde in C geschrieben.
In gefrorener Lösung ﬁndet man eine statistische Verteilung an Orientierungen der paramagnetischen Moleküle relativ zum äußeren Magnetfeld B0 . Diese Situation wird in der Simulation durch die äquivalente Beschreibung einer einzigen paramagnetischen Spezies unter dem
Einﬂuß verschiedener Feldorientierungen wiedergegeben. Diese Feldorientierungen werden im
folgenden durch die Winkel θ0 und φ0 , den Polar- und Azimutalwinkeln im Koordinatensystem
der g-Tensorhauptachsen, beschrieben. Da jede Orientierung in einem statistischen Pulver gleich
wahrscheinlich ist, wird zur Erfassung der Raumrichtungen in der Simulation eine Spirale [134]
oder alternativ ein Netz [135] gleichmäßig um eine Einheitskugel gelegt. Für jede Orientierung
(θ0 , φ0 ) wird die Resonanzposition, die Intensität und Linienbreite des EPR-Überganges berechnet. Daraus erhält man ein Histogramm, in dem die Häuﬁgkeit (gewichtet mit der Intensität)
des Auftretens einer Resonanzposition erfaßt wird. Dieses Histogramm wird mit Linienformfunktionen (einer Gauß- oder einer Lorentzfunktion) gefaltet.
Bei anisotropem g-Tensor ergibt sich der eﬀektive g-Wert einer Orientierung (θ0 , φ0 ) zu:
g=
(gx hx )2 + (gy hy )2 + (gz hz )2 ,
(4.3)
mit hx = sin θ0 cos φ0 , hy = sin θ0 sin φ0 , hz = cos θ0 . Die Intensität des EPR-Überganges ist proportional zu < g12 >, dem Quadrat des eﬀektiven g-Wertes des eingestrahlten Mikrowellenfeldes
B1 [86]:
< g12 >= [gx2 gy2 sin2 θ0 +gy2 gz2 (sin2 φ0 +cos2 θ0 cos2 φ0 )+gz2 gx2 (cos2 φ0 +cos2 θ0 sin2 φ0 )]/2g2 . (4.4)
Die Feldstelle des Resonanzposition B0 ergibt sich aus dem g-Wert aus Gleichung (4.3) zu:
B0 =
hνe
.
βe g
(4.5)
Bei der Transformation zur Feldskala nach Gleichung (4.5), ist darauf zu achten, daß die Intensität mit einem Faktor 1/g gewichtet werden muß [136, 137].
Bei einer homogenen Linienverbreiterung im EPR-Spektrum, d. h. wenn die Lebenszeit des
angeregten Zustandes bzw. die Spin-Gitter-Relaxationszeit des Spinsystems die Linienbreite bestimmt, wird die Linienform durch eine Lorentzfunktion beschrieben:
f=
1
1
.
πσB 1 + [B−B0 ] 2
σB
(4.6)
4.4 Programme zur Auswertung der EPR- und ENDOR-Spektren
57
Die Linienbreite σB auf der Feldskala hängt dabei von der Resonanzfeldposition B0 ab:
σB =
h
B0
σν =
σν ,
gβe
νe
(4.7)
wobei σν , die Linienbreite auf der entsprechenden Frequenzskala, konstant und proportional zur
Relaxationsrate des Spinsystems ist [86].
Inhomogene Linienverbreiterungen, die z. B. durch ein inhomogenes äußeres Magnetfeld, unaufgelöste Hyperfeinwechselwirkungen oder dipolare Wechselwirkungen von benachbarten Spinsystemen auftreten können, werden in der Simulation durch Gaußfunktionen beschrieben:
[B − B0 ]
1
exp −1/2
f=√
σB
2π σB
2 .
(4.8)
Für anisotrope Hyperfeinwechselwirkungen setzt sich die Linienbreite aus drei Linienbreitenparameter (σBi ) zusammen. Die Orientierungsabhängigkeit der Linienbreite entspricht dabei
einer Hyperfeinwechselwirkung, deren Hauptachsen kolinear zu den g-Tensorhauptachsen verlaufen [86]:
2
=
σB
1 4 2 2
g h σ .
g4 i=x,y,z i i Bi
(4.9)
Die strukturelle Heterogeneität innerhalb der paramagnetischen Probe kann ebenfalls zur
Linienverbreiterung führen. Da die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung unmittelbar von der geometrischen und elektronischen Struktur des Komplexes abhängt (siehe Abschnitt 3.4.1), machen
sich Verzerrungen in der Koordinationssphäre des Zentralmetallions direkt in einer Variation der
EPR-Linienpositionen bemerkbar. Dieses Phänomen wird als g-‘strain’ bezeichnet [138].
In dem statistischen g-strain-Modell von Hagen et al. [133,135] wird der g-Wert, der an einer
bestimmten Feldposition detektiert wird, durch statistische Variationen von Systemvariablen
(z. B. Bindungsabstände und Winkel in einem paramagnetischen Molekül) zu einer Funktion
von Zufallsvariablen xi . Damit ist der g-Wert eine statistischen Größe g(x1 , x2 , ..., xn ), deren
Wertebereich durch eine Gaußverteilung mit der Varianz σg2 beschrieben werden kann. Als Linienformfunktion wird daher eine Gaußfunktion mit der Standardabweichung σg als Linienbreite
verwendet. Für die Varianz σg2 ergibt sich:
σg2
=
n δg 2
i=1
δxi
σi2
+2
n δg
δg
j>i
δxi
δxj
rij σi σj .
(4.10)
Dabei steht σi2 für die Varianz der einzelnen Zufallsvariablen xi und rij für die Korrelationskoeﬃzienten zwischen verschiedenen Zufallsvariablen xi und xj .
58
4. Materialien und Methoden
In dem hier verwendeten g-strain-Modell werden die g-Tensorhauptwerte als Zufallsvariablen
xi herangezogen [139]. Mit Gleichung (4.3) und (4.10) erhält man für die Varianz σg2 :


3
3
2
+2
h2i h2j gi gj rij σgi σgj  /(2g2 ).
σg2 =  h4i gi2 σgi
i=1
(4.11)
j>i
Damit ergibt sich für jede Orientierung (θ, φ) eine eigene Linienbreite σg . Die Faltung des Histogramms mit der Gaußfunktion ﬁndet direkt auf der g-Skala statt. Nach der Transformation
in die Feldskala erhält man aus den symmetrischen Gaußlinien der g-Skala asymmetrische Linienformen, wie sie typisch für das Auftreten von g-strain in EPR-Spektren sind [137, 139]. Für
negative Korrelationskoeﬃzienten kann σg2 gegen Null gehen. Um das Auftreten von Singularitäten im berechneten Spektrum zu vermeiden, wird eine konstante Linienbreite hinzuaddiert,
in welcher zusätzliche inhomogene Linienverbreiterungen (z.B. durch unaufgelöste Hyperfeinwechselwirkung) im Spektrum berücksichtigt werden [135].
Die Eingabedatei zur Simulation der EPR-Pulverspektren enthält die Mikrowellenfrequenz,
den Feldbereich und die Anzahl der Datenpunkte des zu berechnenden Spektrums. Damit wird
die Einteilung der Feldskala des Histogrammes bestimmt (Auﬂösung = Anzahl der Datenpunkte
/ Feldbereich). Weiterhin benötigt werden die g-Tensorhauptwerte der paramagnetischen Spezies und die entsprechenden Linienbreitenparameter (σν , σBi oder σgi , rij ). Die Ausgabe des
berechneten EPR-Spektrums erfolgt in zwei ASCII-Dateien, die das Absorptionsspektrum bzw.
dessen erste Ableitung als x,y Paare (Feldposition, Intensität) enthalten.
4.4.2
ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
Um Aussagen über die geometrische Struktur von Übergangsmetallkomplexen anhand ihrer
1H
ENDOR-Spektren treﬀen zu können, wurde ein Simulationsprogramm erstellt, welches die
ENDOR-Resonanzpositionen der Protonen direkt in Beziehung zu ihrer Position im g-TensorKoordinatensystem setzt. Das Programm wird SIMES genannt für Simulation von ENDOR
Spektren. Die theoretischen Grundlagen beruhen auf einer Veröﬀentlichung von Goldfarb et
al. [140]. Der Programmcode ist im Anhang zu ﬁnden.
Da ENDOR-Spektren immer an einer festgelegten Feldposition aufgenommen werden, wird
zunächst nach den Orientierungen (θ0 , φ0 ) gesucht, die zum EPR-Spektrum an der entsprechenden Feldposition (Bﬁx ) beitragen. Bei der Selektion dieser Orientierungen wird eine inhomogene
4.4 Programme zur Auswertung der EPR- und ENDOR-Spektren
59
Linienverbreiterung des EPR-Spektrums mit einer Gaußkurve der Halbwertsbreite ±δB berücksichtigt. Für jede dieser Orientierungen wird die ENDOR-Resonanzfrequenz der Protonen bis
zur zweiten Ordnung berechnet:
νENDOR = (± 1/2 A − νH )2 + 1/4 C 2
1/2
.
(4.12)
Dabei ist die Larmorfrequenz νH der Protonen gegeben durch
νH = (gN βN Bﬁx )/h.
(4.13)
Die Größen A und C setzen sich zusammen aus
A = aiso + a⊥ (3 cos2 γ − 1)
(4.14)
C = 3 a⊥ sin γ cos γ.
(4.15)
und
Dabei
entspricht
aiso
der
isotropen
Kopplungskonstanten
für
die
Fermi-Kontakt-
Wechselwirkung. Die dipolare Hyperfeinwechselwirkung durch den Raum (d. h. der Elektronenspin beﬁndet sich nicht direkt am Kernort) wird in der Punktdipolnäherung durch
a⊥ und den Winkel γ zwischen der Magnetfeldrichtung und dem Verbindungsvektor 6r des
Elektronen- und Kernspins beschrieben (siehe Abschnitt 3.1).
a⊥ =
geﬀ βe gN βN
.
hr 3
(4.16)
Dabei wird durch den eﬀektiven g-Wert geﬀ in Gleichung (4.16) berücksichtigt, daß bei einem
anisotropen g-Tensor das magnetische Moment des Elektrons von der molekularen Orientierung
und damit der Feldposition Bﬁx abhängt. Die Auswirkungen der g-Tensor-Anisotropie auf die
Quantisierungsrichtung des Elektronenspins wird jedoch vernachlässigt [93]. Für den Winkel γ
zwischen der Richtung des äußeren Magnetfeldes und dem Verbindungsvektor 6r zwischen dem
Proton und dem Elektronenspin ergibt sich:
cos γ = cos θ0 cos ψ + sin θ0 sin ψ cos(φ0 − φ).
(4.17)
Die Position des Protons wird im Koordinatensystem der g-Tensorhauptachsen durch den Abstand r und die Polarwinkel ψ und φ beschrieben. In Abbildung 4.1 ist dazu gezeigt, wie die
60
4. Materialien und Methoden
gz
B
θ0
φ0
γ
H
ψ
r
φ
gy
gx
Abbildung 4.1: Position eines Protons (H) im Koordinatensystem des g-Tensors. Der Verbindungsvektor 6r zwischen dem Elektronenspin (lokalisiert am Metallzentrum) und dem Proton wird durch
den Abstand |6r| = r und die Polarwinkel ψ und φ im Koordinatensystem des g-Tensors beschrie6 schließen einen Winkel γ ein. Die
ben. Der Vektor 6r und die Richtung des äußeren Magnetfeldes B
Polarwinkel θ0 und und φ0 legen die Magnetfeldorientierung bezüglich des g-Tensors fest.
Lage des Verbindungsvektors 6r zwischen dem Elektronenspin und dem Proton relativ zum Koordinatensystem des g-Tensors und dem äußeren Magnetfeld festgelegt wird.
Aus den berechneten ENDOR-Resonanzfrequenzen wird ein Histogramm gebildet. Die Intensität eines ENDOR-Überganges wird gleich eins gesetzt. Damit gibt das Histogramm direkt die
relativen Häuﬁgkeiten des Auftretens einer ENDOR-Resonanzposition an. Es folgt eine Faltung
mit einer Gauß- oder Lorentzfunktion konstanter Linienbreite.
Die Eingabedatei für das ENDOR-Simulationsprogramm enthält die Mikrowellenfrequenz,
die g-Tensorwerte und die Feldpositon Bﬁx mit der Linienbreite δB zur Selektion der Orientierungen. Die Position des Protons im g-Tensorachsensystem wird durch die Polarkoordinaten
r, ψ, φ zusammen mit der isotropen Kopplung aiso eingegeben. Außerdem muß der Frequenzbereich, die Anzahl der Datenpunkte und die Linienbreite der gewählten Linienformfunktion
für das zu berechnende ENDOR-Spektrum angegeben werden. Die Ausgabe erfolgt analog zum
EPR-Simulationsprogramm in Form von ASCII-Dateien des Absorptionsspektrums und seiner
ersten Ableitung.
Kapitel 5
Charakterisierung von
Polypeptidmodulen mit einer
Metalloporphyrin-Bindungsstelle
In diesem Kapitel werden de novo synthetisierte Proteine mit einer Bindungsstelle für Metalloporphyrine vorgestellt. Dem Design dieser Polypeptidmodule liegt ein Vier-Helix-Bündel als
Strukturmotiv zu Grunde, welches auch in natürlichen Proteinen unterschiedlichster Funktion
auftritt [141, 142]. Die einfache, kompakte Struktur der Vier-Helix-Bündel und die Möglichkeit,
Kofaktoren in den Innenraum einzubinden, bieten gute Voraussetzungen zum Entwurf künstlicher Proteinmodelle [12]. Von besonderem Interesse sind dabei Modellsysteme für Hämproteine.
Der redoxaktive Kofaktor Hämin übt in natürlichen Hämproteinen vielfältige Funktionen aus,
wie den Transport und die Speicherung von Sauerstoﬀ (Hämoglobin, Myoglobin), Elektronentransfer (Cytochrome) und Katalyse (Peroxidase, Katalase) [3]. Neben dem redoxaktiven Kofaktor Hämin wurden auch Kobalt- und Zinkporphyrine zur Einführung weiterer Funktionen in
eines der Polypeptidmodule eingebaut. Die Systeme wurden auf eine Kofaktorbindungsstelle beschränkt, um die Wechselwirkung zwischen der Polypeptidumgebung und dem Kofaktor gezielt
untersuchen zu können. Die Möglichkeiten und Grenzen, künstliche Polypeptidmodule mit wohldeﬁnierten Eigenschaften herzustellen und als Modellsysteme natürlicher Proteine einzusetzen,
sollen aufgezeigt werden.
Zunächst werden das Designkonzept und die Aufbauprinzipien der Vier-Helix-Bündel vor61
62
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
gestellt. Es folgt die Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule. Anschließend wird die
Einbausituation der Kofaktoren und ihre Eigenschaften im Polypeptidmodul mittels optischer
und EPR-Spektroskopie untersucht.
5.1
Designkonzept der Polypeptidmodule
Abbildung 5.1 zeigt eine schematische Darstellung der hier untersuchten de novo Proteine. Das
Designkonzept beruht auf der modularen Synthesestrategie Templat–assoziierter synthetischer
Proteine, das von Mutter et al. [44] eingeführt wurde. Als Templat (T) dient ein zyklisches Dekapeptid, an dessen Cysteinreste die α–helicalen Peptide über Maleinimidopropionsäuregruppen
gekoppelt werden. Die Synthese ist in Abschnitt 4.1 beschrieben. Auf dem Templat stehen benachbarte Helices analog zu natürlichen Vier-Helix-Bündeln jeweils antiparallel zueinander. Das
Vier-Helix-Bündel aus Abbildung 5.1 besteht aus zwei verschiedenen Helix-Typen. Die mit Hb
bezeichneten Helices binden die Metalloporphyrinkofaktoren über die Koordination mit HistidinSeitengruppen. Die Helices Ha dienen zur Abschirmung der Bindungstasche.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Polypeptidmodule synthetisiert. Sie werden, wie bereits in Kapitel 2 erläutert wurde, mit mMOP1 und mMOP2 bezeichnet. MOP steht dabei für
modulares Protein und das kleine m für mono, da nur eine Bindungsstelle für Metalloporphyrinkofaktoren vorliegt. Die modulare Synthesestrategie der Templat–assoziierten synthetischen Proteine ermöglicht es, die Systeme aus einzelnen Bausteinen zusammenzusetzen. So folgen mMOP1
und mMOP2 aus dem gemeinsamen Zwischenprodukt T(Hb1)2 mit zwei an das Templat T gekoppelten Bindungshelices Hb1. Sie unterscheiden sich in ihrer Abschirmhelix (Ha1 und Ha2),
wobei mMOP1 dem Polypeptidmodul T(Hb1)2 (Ha1)2 und mMOP2 T(Hb1)2 (Ha2)2 entspricht.
Für die helicalen Peptide Ha1 und Ha2 wurden unterschiedliche Aminosäuresequenzen gewählt,
um zu untersuchen, ob und wie sich die Aminosäure-Zusammensetzung der Vier-Helix-Bündel
auf die funktionellen Eigenschaften der Polypeptidmodule auswirkt.
Die Zusammensetzung der helicalen Peptide Hb1, Ha1 und Ha2 ist in Abbildung 5.2 anhand
einer helicalen Netzdarstellung gezeigt. Die hydrophilen Aminosäuren sind dabei grau unterlegt, um zu verdeutlichen, daß die Helices amphiphil sind. Die Aminosäure-Zusammensetzung
der Peptide wurde insgesamt so gewählt, daß Aminosäuren wie Alanin (A), Leucin (L), Lysin (K) und Glutamat (E), die eine hohe Helixbildungstendenz aufweisen [37], dominieren. Die
5.1 Designkonzept der Polypeptidmodule
63
Abbildung 5.1: Das Designkonzept der Vier-Helix-Bündel beruht auf der modularen Synthesestrategie Templat–assoziierter synthetischer Proteine [44]. An das Polypeptidmodul kann ein Metalloporphyrin über die Ligandierung mit zwei Histidinresten gebunden werden. Die Pfeile auf den Helices
Ha und Hb zeigen vom N- zum C-Terminus.
Aminosäure Asparagin (N) wurde an den N-Terminus gesetzt. Dies unterstützt die Faltung
der Peptide zu einer Helix, da die Seitenkette des Asparagins Wasserstoﬀbrücken zu den nicht
abgesättigten Amidprotonen der ersten Helixwindung ausbilden kann [143]. Bei der Zusammenlagerung des Vier-Helix-Bündels ist die Ausbildung eines hydrophoben Innenraums mit den
apolaren, aliphatischen Aminosäuren Alanin und Leucin eine treibenden Kraft. Die polaren, hydrophilen Aminosäuren Lysin und Glutamat an der Außenseite des Vier-Helix-Bündels sorgen
für die Wasserlöslichkeit der Polypeptidmodule. Lysin und Glutamat wurden in einem Abstand
von vier Aminosäuren zueinander positioniert und bilden Salzbrücken aus, deren Dipolmoment
dem Makrodipol der Helix entgegengerichtet ist. Dieser Makrodipol entsteht in α-Helices aufgrund der parallelen Ausrichtung der polaren Amidgruppen entlang der Helixachse [144]. Der
positive Pol beﬁndet sich dabei am N-Terminus. Die positive Ladung der freien Aminogruppe
am N–Terminus und die negative Ladung der Carboxygruppe am C-Terminus würden den Ma-
64
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Templat
δ
Hb1
C
Ha1
K
L
+
δ
L
K
K
δ
K
L
E
E
Q
E
K
Q
L
K
L
A
Q
E
A
L
E
K
K
K
H
L
E
L
L
L
E
E
A
+
δ
R
A
L
N
W
W
L
-
Ha2
L
G
L
W
N
N
Ac
Templat
Abbildung 5.2: Zusammensetzung der Helices Hb1 und Ha1 des mMOP1. Beide Helices sind amphiphil. Die polaren Aminosäuren Lysin (K) und Glutamat (E) bilden an der Außenseite des VierHelix-Bündels Salzbrücken (gestrichelte Linien) aus. Das Dipolmoment dieser Salzbrücken ist dem
Makrodipol der Helices, dessen positiver Pol am N-Terminus liegt, entgegengerichtet. Helix Hb1
enthält ein Histidin (H) zur Koordination von Metalloporphyrinen. Ha2 unterscheidet sich von Ha1
durch den Austausch der Aminosäuren Tryptophan (W) gegen Arginin (R) und Leucin (L) gegen
Tryptophan (W).
krodipol verstärken und damit destabilisierend wirken. Deshalb wurden diese Ladungen durch
Amidbildung am C-Terminus und die Acetylierung des N-Terminus in Ha1 und Ha2 blockiert.
Zur Koordination der Metalloporphyrine wurde in den hydrophoben Bereich der Helix Hb1
ein Histidin (H) eingeführt. Damit beﬁnden sich im Innenraum der Vier-Helix-Bündel zwei
Histidinreste auf gleicher Höhe. Analog zu natürlichen Cytochrom b Proteinen kann so eine Hämgruppe durch zwei axiale Histidinliganden in die Polypeptidmodule eingebunden werden. Neben dem Kofaktor Hämin wurden die Metalloporphyrine Co(III)protoporphyrin IX und
Zn(II)protoporphyrin IX, welche ebenfalls über Histidin ligandiert werden können, in das Polypeptidmodul mMOP1 eingebaut.
5.2 Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule
65
Die Abschirmhelices Ha1 und Ha2 unterscheiden sich durch den Austausch von Tryptophan
(W) gegen Arginin (R) in der Nähe der Hämbindungsstelle. Da sich die aromatische Aminosäure
Tryptophan jedoch gut als Marker in Fluoreszenz- und UV/VIS-Absorptionsmessungen einsetzen
läßt, wurde diese Aminosäure in Ha2 anstelle eines Leucins am N-Terminus wieder eingeführt.
Im Folgenden wird untersucht, ob die Positionierung der zwei unterschiedlichen Aminosäuren
Tryptophan und Arginin in der Umgebung der Hämbindungstasche Einﬂuß auf die Eigenschaften
des Kofaktors nehmen kann.
5.2
5.2.1
Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule
Aufbau der Vier-Helix-Bündel
Abbildung 5.3 zeigt die Massenspektren der hier synthetisierten Polypeptidmodule mMOP1
und mMOP2. Die hieraus ermittelten Massen von 11488,9 ± 0,4 Da (A, mMOP1) und
11574,3 ± 0,4 Da (B, mMOP2) bestätigen die korrekte Zusammensetzung der leeren Polypeptidmodule hinsichtlich ihrer Primärstruktur. Erwartet werden Massen von 11489 Da für mMOP1
und 11575 Da für mMOP2. Darüberhinaus zeigen die Massenspektren eine hohe Reinheit der
modularen Proteine an. Mittels analytischer Gelﬁltration konnte gezeigt werden, daß die VierHelix-Bündel in wäßriger Lösung monomer vorliegen.
Aussagen zur Sekundärstruktur der de novo synthetisierten Proteine wurden aus
Circulardichroismus-Spektren erhalten. Abbildung 5.4 zeigt das CD-Spektrum von mMOP1 (A)
und mMOP2 (B). Die Spektren wurden in einem Wellenlängenbereich aufgenommen, in dem
die elektronischen π - π ∗ und n − π ∗ Übergänge der Amidgruppe des Polypeptidgerüstes liegen.
In der chiralen Umgebung einer α-Helix unterscheiden sich die Extinktionskoeﬃzienten dieser
elektronischen Übergänge bei der Einstrahlung von rechts und links zirkular polarisiertem Licht.
Anhand von CD-Spektren, in welchen die Diﬀerenz der Absorption von rechts und links zirkular
polarisierten Lichtes aufgezeichnet wird, können unterschiedliche Sekundärstrukturelemente in
Proteinen identiﬁziert werden [145]. Beide CD-Spektren in Abbildung 5.4 zeigen die typischen
Merkmale von α–Helices [75, 146]. So tritt bei 222 nm und 208 nm ein Doppelminimum und bei
etwa 192 nm eine starke positive Bande auf. Der Nulldurchgang liegt in beiden Spektren bei 201
nm. Im Unterschied zu den hier gezeigten CD-Spektren mit α–helicalen Merkmalen würde man
für 310 –Helices erwarten, daß das Minimum bei 208 nm deutlich stärker ausgeprägt ist als das
66
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.3: Massenspektren der Vier-Helix-Bündel mMOP1 (A) und mMOP (B). Unter
Berücksichtigung der Protonierung, die zur Auﬂadung Z der Polypeptide führt, wurden die Massen M = 11488,9 ± 0,4 Da (A) und M = 11574,3 ± 0,4 Da (B) ermittelt. Diese stimmen mit der
Aminosäure-Zusammensetzung der modularen Proteine überein. (Bei der Auswertung der Massenspektren wird nach der gemeinsamen Basis von [ M/Z × Z − Z ] gesucht.)
5.2 Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule
67
Abbildung 5.4: Circulardichroismus von mMOP1 (A) und mMOP2 (B). Die CD-Spektren zeigen
die typischen Merkmale kurzer α–Helices [146].
Minimum bei 222 nm [75].
Die Wellenlänge maximaler Fluoreszenzintensität λm der Aminosäure Tryptophan kann zur
Charakterisierung der Umgebung und Positionierung dieser Aminosäure im Polypeptidmodul
herangezogen werden. In unpolaren, hydrophoben Proteinregionen liegt λm zwischen 330 und
332 nm, an Proteinoberﬂächen dagegen zwischen 350 nm und 355 nm [147]. In den Polypeptidmodulen mMOP1 und mMOP2 wurden λm -Werte von 349 nm und 346 nm ermittelt. Dies
zeigt an, daß sich die Aminosäure Tryptophan in beiden Polypeptidmodulen im hydrophoben
Innenraum der Vier-Helix-Bündel beﬁndet, aber nicht vollständig gegen Wassermoleküle abgeschirmt wird. Entweder ragt der Tryptophanrest teilweise aus dem Polypeptidmodul heraus oder
68
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
der Innenraum des Vier-Helix-Bündel ist nicht kompakt genug, um Wassermoleküle herauszudrängen. Ein ähnliches Verhalten mit λm -Werten von 344 nm bis 349 nm wurde auch in anderen
künstlichen Vier-Helix-Bündeln gefunden [51].
5.2.2
Stabilität der Polypeptidmodule
Zur Untersuchung der Stabilität der leeren Polypeptidmodule wurden mMOP1 und mMOP2
dem chaotropen Agenz Guanidiniumhydrochlorid (Gdn·HCl) ausgesetzt. Die Intensität des CDSignals bei 222 nm (Θ222 ) und die Lage des Fluoreszenzmaximums von Tryptophan (λm ) wurden
als Kriterien für die Denaturierung der de novo Proteine herangezogen. Mit steigender Gdn·HCl
Konzentration wurde dabei die Abnahme des CD-Signals bis hin zur Grundlinie beobachtet.
Dies zeigt den Verlust an deﬁnierter Sekundärstruktur (Helicalität) des gesamten Polypeptidmoduls an. Die Lage des Fluoreszenzmaximums von Tryptophan verschob sich langwellig bis
hin zu λm = 354 nm, was einer vollständigen Freilegung dieser Aminosäure in die wäßrige Phase
entspricht. Durch Verdünnen der vollständig denaturierten Proben konnte gezeigt werden, daß
der Entfaltungsprozeß reversibel ist.
Abbildung 5.5 zeigt den Anteil f an gefaltetem Protein in Abhängigkeit von der Gdn·HCl
Konzentration. Der Anteil f an gefaltetem Protein wurde dabei jeweils unabhängig voneinander aus der Abnahme des CD-Signals bei 222 nm und der Verschiebung der Wellenlänge der
maximalen Tryptophan-Fluoreszenz berechnet:
f=
Φobs − Φe
.
Φg − Φe
(5.1)
Dabei geben Φg und Φe die entsprechende Meßgröße (d. h Θ222 oder λm ) in vollständig gefaltetem und entfaltetem Zustand an. Φobs steht für die jeweilige Meßgröße bei einer bestimmten
Gdn·HCl Konzentration. Der Verlauf dieser Denaturierung wurde an ein Zwei-Zustands-Modell
angepaßt [129,148]. Es wird angenommen, daß die Polypeptidmodule ohne Zusatz von Gdn·HCl
in einem deﬁnierten, vollständig gefalteten Zustand (f = 1) vorliegen. In Abhängigkeit von der
Gdn·HCl Konzentration stellt sich ein Gleichgewicht zwischen vollständig gefaltetem und entfaltetem Zustand ein. Die freie Energie für die Denaturierung bei einer bestimmten Gdn·HCl
Konzentration ist dann
∆Gobs = −RT lnK = −RT ln[(1 − f )/(f )].
(5.2)
5.2 Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule
69
1
f
A
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
5
6
7
8
[GdnHCl]
1
f
B
0
0
1
2
3
4
[GdnHCl]
Abbildung 5.5: Denaturierung der Polypeptidmodule mMOP1 (A) und mMOP2 (B) durch Zugabe von Gdn·HCl. Als Meßgrößen dienen die Intensität des CD-Signals bei 222 nm (Θ222 , schwarze
Vierecke) und die Wellenlänge der maximalen Tryptophanﬂuoreszenz (λm ,
◦). Der Anteil f
an ge-
faltetem Polypeptidmodul ergibt sich zu: f = (Φobs − Φe )/(Φg − Φe ), wobei Φ die entsprechende
Meßgröße, d. h. Θ222 oder λm angibt. Φobs wurde jeweils bei einer bestimmten Gdn·HCl Konzentration aufgezeichnet, Φg wurde ohne Gdn·HCl Zusatz im gefalteten Zustand und Φe im vollständig
entfalteten Zustand bei maximaler Gdn·HCl Konzentration gemessen. Die gestrichelten Hilfslinien
geben die Gdn·HCl Konzentration bei f = 0,5 an, wobei c1/2 (mMOP1) = 5,05 M und c1/2 (mMOP2)
= 4,25 M.
70
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Ferner wird eine lineare Abhängigkeit der freien Entfaltungsenergie von der Konzentration des
denaturierenden Agenz angenommen [149]:
∆Gobs = ∆GH2 O − m cGdn·HCl .
(5.3)
Die Steigung m ist dabei ein Maß für die Kooperativität der Denaturierung und ∆GH2 O entspricht der freien Energie, die aufgebracht werden muß, um das Polypeptidmodul in wäßriger
Lösung (ohne Zusatz von Denaturant) zu entfalten. Damit ist −∆GH2 O ein Maß für die Stabilität der de novo synthetisierten Proteine. Die Kooperativität m gibt an, wie stark die Stabilität
der Polypeptide im Verlauf einer Denaturierung von der bereits vorliegenden Entfaltung beeinﬂußt wird. Bei einem stark kooperativen Entfaltungsprozeß führen bereits kleine Störungen in
der gefalteten Struktur zu einer eﬀektiven Denaturierung. Es wurde festgestellt, daß die Kooperativität m von der Oberﬂäche abhängt, die bei der Entfaltung freigelegt wird und mit der
Lösungsmittelumgebung in Kontakt tritt [149]. In natürlichen Proteinen wurden m-Werte im
Bereich von 2 kJ mol−1 M−1 bis hin zu 40 kJ mol−1 M−1 ermittelt [150].
Für die hier untersuchten Polypeptidmodule ergeben sich bei einer Temperatur von 20◦ C
freie Entfaltungsenergien von ∆GH2 O = 22,4 (± 2,1) kJ/mol (mMOP1) und ∆GH2 O = 16,3 (±
1,4) kJ/mol (mMOP2). Die Kooperativität ist dabei m = 4, 4 (± 0,4) kJ mol−1 M−1 (mMOP1)
und m = 3, 8 (± 0,3) kJ mol−1 M−1 (mMOP2).
Die Kooperativität m der Entfaltung von mMOP1 und mMOP2 liegt innerhalb des Wertebereichs von 2 – 12 kJ mol−1 M−1 , der für kurze Vier-Helix-Bündel typisch ist [47, 51, 83].
Die freie Energie der Entfaltung von mMOP1 und mMOP2 ist im Vergleich zu anderen künstlichen Vier-Helix-Bündeln nicht sehr hoch. Es werden Werte bis zu ∆GH2 O = 100 kJ/mol erreicht [47,51,53]. Es ist jedoch zu beachten, daß mMOP1 und mMOP2 eine leere Bindungstasche
für einen Metalloporphyrinkofaktor enthalten und das Design nicht hinsichtlich der Stabilität
der leeren Polypeptidmodule optimiert wurde.
Insgesamt erweist sich mMOP1 als etwas resistenter gegenüber der Denaturierung als
mMOP2. So liegt der Anteil f an gefaltetem Protein für mMOP2 bei einer Gdn·HCl Konzentration von 4,25 M bereits bei 50 %, während für mMOP1 entsprechend 5,05 M Gdn·HCl benötigt
werden. Da die Packung der hydrophoben Reste im Innenraum von Vier-Helix-Bündeln einen
entscheidenden Einﬂuß auf die Stabilität der de novo Proteine hat [48], ist anzunehmen, daß die
unterschiedliche Positionierung des Tryptophan mit einer großen aromatischen Seitengruppen
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
71
zur unterschiedlichen Stabilisierung von mMOP1 und mMOP2 beiträgt.
5.3
Hämin als redoxaktiver Kofaktor
Über den Einbau des Metalloporphyrin Hämin in die de novo synthetisierten Proteine wird
eine funktionelle Gruppe eingeführt. Das Zentralmetallion des Kofaktors kann zwei Oxidationszustände einnehmen – Fe2+ (Häm) und Fe3+ (Hämin) – und ist damit redoxaktiv. Die de
novo synthetisierten Hämproteine werden im folgenden über optische und EPR-Spektroskopie
charakterisiert.
5.3.1
Einbau des Hämins
Der Einbau des Metalloporphyrins Hämin kann über die Aufnahme von UV/VISAbsorptionsspektren verfolgt werden. Abbildung 5.6 zeigt die Spektren von Hämin-mMOP1
(A) und Hämin-mMOP2 (B) im oxidierten und reduzierten Zustand. Die UV/VISAbsorptionsspektren von Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2 sind nahezu identisch. In Abbildung (A) ist zusätzlich das Absorptionsspektrum des freien Hämins in wäßriger Lösung gezeigt.
Im Gegensatz zur schmalen Soret-Bande des eingebauten Hämins mit einem Maximum bei 413,5
nm tritt hier eine breite Bande um 370 nm auf, die auf die Aggregation des freien Hämins in
wäßriger Lösung zurückzuführen ist [72]. Durch Zugabe von festem Natriumdithionit (ca. 0,1
mg) in die Küvette erfolgt die sofortige Reduktion der de novo synthetisierten Hämproteine.
Dabei verschiebt sich die Soret Bande zu 428 nm und zwei nun deutlich separierte Banden bei
531 nm (β–Bande) und 561 nm (α–Bande) treten auf.
Die UV/VIS-Absorptionsspektren der de novo synthetisierten Hämproteine aus Abbildung
5.6 sind typisch für Cytochrom b Systeme [152, 153]. Der deutliche Unterschied zwischen dem
Spektrum des Hämins in wäßriger Lösung und des eingebauten Metalloporphyrins belegt den
Einbau des Kofaktors in die Polypeptidmodule. Bei den nachfolgenden Untersuchungen zur
Stabilität der de novo Hämproteine in Abschnitt 5.3.3 wird der Unterschied in der Absorption bei
413,5 nm herangezogen, um die Freisetzung von Hämin mit steigender Gdn·HCl Konzentration
oder Änderung des pH-Wertes zu verfolgen.
Zur Bestimmung des Redoxpotentials des Häminkofaktors in Abschnitt 5.3.2 wird dagegen die Absorptionsänderung bei 561 nm verwendet, da hier die größte relative Änderung im
72
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.6: Optische Spektren von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2 (B) im oxidierten (Fe3+ , durchgezogene Linie) und reduzierten (Fe2+ , gestrichelte Linie) Zustand. Das Spektrum
von freiem Hämin (Fe3+ ) in wäßriger Lösung ist in breit gestrichelter Linie in Abbildung (A) zum
Vergleich gezeigt. Die mit α und β bezeichneten Peaks und die Soret-Bande (im oxidierten Zustand
bei 413,5 nm) stammen von verschiedenen elektronischen π–π ∗ Übergängen des Porphyrinsystems
(siehe z. B. [151]).
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
73
UV/VIS-Absorptionsspektrum zwischen oxidiertem und reduziertem Zustand vorliegt.
Auch nach dem Einbau des Kofaktors Hämin bleiben die α-helicalen Merkmale der CDSpektren der de novo synthetisierten Hämproteine erhalten. Gegenüber den leeren Polypeptidmodulen wurde jedoch eine kurzwellige Verschiebung der Wellenlänge maximaler Fluoreszenz
der aromatischen Aminosäure Tryptophan um etwa 5 nm festgestellt. Die Werte für λm liegen
nun bei 346 nm für Hämin-mMOP1 und bei 342 nm für Hämin-mMOP2. Ursache hierfür kann
die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Porphyrinring und der aromatischen Seitengruppe des Tryptophans sein. Weiterhin ist durch den Einbau des Kofaktors eine dichtere Packung
des hydrophoben Innenraums des Vier-Helix-Bündels zu erwarten. Damit ist der Ausschluß von
Wassermolekülen besser gewährleistet.
Mittels analytischer Gelﬁltration wurde untersucht, ob die Polypeptidmodule nach dem Einbau des Kofaktors weiterhin monomer vorliegen. Für Hämin-mMOP2 konnte dies bestätigt werden. Hämin-mMOP1 neigt dagegen zur Bildung von Aggregaten. Durch Anziehungskräfte zwischen den Vier-Helix-Bündeln kommt es zu einer Zusammenlagerung von Polypeptidmodulen,
die vor der Hauptfraktion der monomeren de novo Proteine eluiert werden. Diese konnten jedoch
durch Inkubation in Gdn·HCl (1 – 2 M) aufgelöst werden.
5.3.2
Redoxpotential des Kofaktors
Die Redoxtitration von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2 (B) sind in Abbildung 5.7
zu sehen. Durch Anpassung an eine Nernstgleichung mit einem Einelektronenübergang (n=1)
wurden die Halbwertspotentiale zu −164 (± 10) mV (A) und −153 (± 5) mV (B) bestimmt. Die
Fehlerangabe berücksichtigt hier neben der Standardabweichung der Anpassung an die Nernstkurve (σ = ± 4 mV und σ = ± 2 mV) auch systematische Fehler (z. B. beim Ablesen der
Absorptionsänderung oder des Potentials). Die hier ermittelten Werte sind typisch für Redoxpotentiale, die bisher in de novo synthetisierten Hämproteinen erreicht wurden (−100 bis
−200 mV) [11, 13, 53]. Das etwas positivere Redoxpotential von Hämin-mMOP2 im Vergleich
zu Hämin-mMOP1 kann mit dem Austausch der Aminosäure Tryptophan gegen Arginin erklärt werden. Die positive Ladung der Seitengruppe von Arginin trägt über die elektrostatische
Wechselwirkung mit den Propionsäureresten des Hämins zu einer Erhöhung des Redoxpotentials bei. Allerdings kann auch eine hydrophobe Wechselwirkung der aromatischen Aminosäure
Tryptophan mit dem Kofaktor das Redoxpotential erhöhen.
74
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Absorptionsänderung bei 561 nm
A
B
-350 -300 -250 -200 -150 -100
-50
0
50
E [mV]
Abbildung 5.7: Redoxtitration von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin–mMOP2 (B), verfolgt durch
die Absorptionsänderung bei 561 nm. Zunächst erfolgte die schrittweise Reduktion durch Zugabe
einer Dithionitlösung (•). Anschließend wurde mit einer Ferricyanidlösung reoxidiert (weisse Vierecke). Die Redoxtitrationen stimmen in reduzierender und oxidierender Richtung in etwa überein.
Angesichts der großen Redoxspanne natürlicher Hämproteine von + 400 mV bis − 500 mV [7]
ist der Unterschied zwischen dem Redoxpotential von Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2 nicht
besonders stark ausgeprägt. Neben speziellen Wechselwirkungen des Kofaktors mit einzelnen
Aminosäuren in der Bindungstasche wird das Redoxpotential von der axialen Ligandierung der
Hämgruppe und der Polarität und Polarisierbarkeit der Peptidumgebung beeinﬂußt [154–156].
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
75
Ferner spielt die Abschirmung des Kofaktors vor der wäßrigen Lösungsmittelphase eine entscheidende Rolle zur Einstellung des Redoxpotentials. Hämproteine, bei denen der Kofaktor dem
Lösungsmittel exponiert ist, besitzen analog zu Modellkomplexen in Wasser Redoxpotentiale
von etwa −200 mV [157]. Die demgegenüber leicht erhöhten Redoxpotentiale der Polypeptidmodule mMOP1 und mMOP2 zeigen, daß auch in künstlichen Vier-Helix-Bündeln eine gewisse
hydrophobe Abschirmung des Kofaktors möglich ist. Eine möglichst kompakte Struktur des hydrophoben Innenraums der Vier-Helix-Bündel ist Voraussetzung für die gezielte Untersuchung
der Redoxpotentiale in Abhängigkeit von der Aminosäure-Zusammensetzung. Durch das Eindringen von Wassermolekülen in die Proteinumgebung können elektrostatische Wechselwirkungen kompensiert werden, die das Redoxpotential aufgrund von Ladungen polarer Aminosäuren
ansonsten prägen würden [158].
5.3.3
Stabilität der künstlichen Hämproteine
Die Stabilität der de novo synthetisierten Hämproteine Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2
gegenüber dem chaotropen Agenz Gdn·HCl wurde untersucht und mit den leeren Polypeptidmodulen (siehe Abschnitt 5.2.1) verglichen. Neben der Intensität des CD-Signals bei 222 nm
und der Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums von Tryptophan λm wurde hier zusätzlich die
Intensität der UV/VIS-Absorption bei 413,5 nm in Abhängigkeit von der Gdn·HCl Konzentration verfolgt. Somit stehen drei Kriterien für die Denaturierung der de novo synthetisierten
Hämproteine zur Verfügung. Die Abnahme von Θ222 zeigt den Verlust der Helicalität des gesamten Polypeptidmoduls an. Die langwellige Verschiebung von λm beruht auf der Freilegung
der aromatischen Aminosäure Tryptophan in die wäßrige Phase. Die Abnahme der Absorption
bei 413,5 nm ist diagnostisch für die Freisetzung des Kofaktors.
Wie Abbildung 5.8 zeigt, ergibt sich für alle drei Meßgrößen der gleichen Verlauf der Denaturierung. Damit erfolgt die Entfaltung des Polypeptidmoduls simultan zur Freisetzung des
Kofaktors. Dies zeigt an, daß ein intaktes Vier-Helix-Bündel mit festgelegter Positionierung der
Histidingruppen entscheidend für die Einbindung des Kofaktors ist. Die Abhängigkeit der Denaturierung von der Gdn·HCl Konzentration wurde an ein Zwei-Zustands-Modell angepaßt (siehe
Abschnitt 5.2.1). Tabelle 5.1 gibt einen Überblick über die freien Entfaltungsenergien ∆GH2 O
und Kooperativitäten m, die für die Polypeptidmodule in dieser Arbeit ermittelt wurden im
Vergleich zu natürlichen Hämproteinen.
76
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
1
f
A
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
5
6
7
8
[GdnHCl]
1
f
B
0
0
1
2
3
4
[GdnHCl]
Abbildung 5.8: Die Denaturierung mit Gdn HCl von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2
(B) wurde jeweils unabhängig über die Absorption bei 413,5 nm (∇), die Elliptizität bei 222 nm
(schwarze Vierecke) und die Verschiebung der Fluoreszenzwellenlänge des Tryptophans (◦) verfolgt.
Die Berechnung des jeweiligen Anteils an gefaltetem Protein f erfolgte analog zu Abbildung 5.5. Die
Polypeptidmodule mit eingebautem Hämin sind erst bei Gdn·HCL Konzentration von 5,15 M (A)
bzw. 4,52 M (B) zur Hälfte entfaltet.
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
77
Hämin-mMOP1 ist analog zu den leeren Polypeptidmodulen gegenüber Gdn·HCl etwas stabiler als Hämin-mMOP2. Für beide Polypeptidmodule ﬁndet man jedoch durch den Einbau des
Kofaktors eine deutliche Erhöhung der Stabilität. Im leeren Polypeptidmodul ragen zwei polare
Histidingruppen lose in den hydrophoben Innenraum der Vier-Helix-Bündel, während die Histidingruppen bei der Einlagerung des Hämins als axiale Liganden fest an diesen Kofaktor koordiniert sein sollten. Durch die axiale Ligandierung werden die beiden gegenüberliegenden Helices
gegeneinander ﬁxiert. Damit trägt der Kofaktor zur Fixierung und Stabilisierung der Struktur der Vier-Helix-Bündel bei. Darüberhinaus sollte der Einbau des Hämins zu einer besseren
Raumfüllung und kompakteren Struktur des hydrophoben Innenraums der Vier-Helix-Bündel
führen.
In natürlichen Hämproteinen führt der Einbau des Kofaktors ebenfalls zur Stabilisierung
der Proteinstruktur. Tabelle 5.1 enthält die freien Entfaltungsenergien der Apo- und Holoform
von Myoglobin und Cytochrom b562 . Die Stabilisierung der Proteine durch den Einbau des Kofaktors liegt in dergleichen Größenordnung wie für mMOP1 und mMOP2. In den künstlichen
Proteinmodellen nimmt die freie Entfaltungsenergie durch den Einbau des Kofaktors um etwa
9 kJ/mol zu. Bei Myoglobin und Cytochrom b562 liegt der Unterschied der Apo- und Holoform
in der freien Entfaltungsenergie bei 17 kJ/mol und 14 kJ/mol. In natürlichen Hämproteinen
ist eine Vorformung der Struktur in der Apo-Form und die anschließende Stabilisierung durch
Tabelle 5.1: Freie Entfaltungsenergien ∆GH2 O , Kooperativitäten m und Gdn·HCl Konzentrationen
c1/2 für eine Entfaltung von 50 % von de novo synthetisierten und natürlichen Hämproteinen
∆GH2 O [kJ/mol]
m [kJ mol−1 M−1 ]
c1/2 [M]
mMOP1
22,4 (± 2,1)
4,4 (± 0,4)
5,1
Hämin-mMOP1
31,4 (± 2,6)
6,1 (± 0,5)
5,2
mMOP2
16,3 (± 1,4)
3,8 (± 0,3)
4,3
Hämin-mMOP2
25,0 (± 1,7)
5,6 (± 0,4)
4,5
Apomyoglobin [159]
12,6 (± 1,3)
12,6 (± 1,3)
1,1
Myoglobin [159, 160]
29,3 (± 2,1)
18,8 (± 1,3)
2,0
Apocytochrom b562 [161, 162]
13,4 (± 2,1)
24,3
1,1
Cytochrom b562 [161]
27,6 (± 2,1)
—
—
78
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
den Einbau des Kofaktors günstig für eine eﬀektive und deﬁnierte Zusammensetzung des Holoproteins [163]. Während die freien Entfaltungsenergien der natürlichen Hämproteine und der
künstlichen Polypeptidmodule in der gleichen Größenordnung liegen, zeigen sich in der Kooperativität und damit auch dem Wert c1/2 Unterschiede. Die Kooperativität der Entfaltung ist für die
natürlichen Systeme, deren Struktur ausschließlich durch die Wechselwirkung der Aminosäuren
untereinander stabilisiert wird, höher. In den Polypeptidmodulen mMOP1 und mMOP2 ist die
Anordnung der einzelnen helicalen Bausteine bereits durch ihre künstliche Fixierung auf ein
Templat eingeschränkt.
Neben einer intakten Bindungsstelle mit zwei Histidinliganden auf etwa gleicher Höhe
im Vier-Helix-Bündel, ist auch der pH-Wert der Lösung entscheidend für eine Einbindung des Kofaktors in die de novo synthetisierten Hämproteine. Mit Hilfe der UV/VISAbsorptionsspektroskopie konnte gezeigt werden, daß der Kofaktor in einem pH-Bereich von
pH 5 – 10 stabil in den Polypeptidmodulen eingebunden bleibt. Bei niedrigerem pH-Wert erfolgt die Freisetzung des Hämins aufgrund der Protonierung der Histidinliganden. Bei höherem
pH-Wert konkurrieren die Hydroxylionen erfolgreich mit den Histidingruppen um die Koordinationsstellen des Hämins. Dieses Verhalten wurde auch bei anderen de novo synthetisierten
Hämproteinen festgestellt [59]. Die weiteren Charakterisierungen der de novo synthetisierten
Hämproteine erfolgten durchwegs in wäßrigem Phosphatpuﬀer (50 – 100 mM) bei pH 7,0.
5.3.4
EPR-spektroskopische Charakterisierung
Die EPR-Spektroskopie wurde eingesetzt, um die Bindungssituation der Häminkofaktoren in
den Polypeptidmodulen zu charakterisieren. Dabei sollen insbesondere die axialen Liganden des
Hämins eindeutig identiﬁziert und die Geometrie ihrer Koordination bestimmt werden.
Zunächst werden hier die EPR-Spektren von Modellkomplexen gezeigt, welche die Bindungssituationen exemplarisch wiedergeben, die in den Polypeptidmodulen auftreten könnten. Der
Kofaktor Hämin bzw. Fe(III)protoporphyrin IX liegt dazu frei in Lösung (A) sowie 2-fach ligandiert mit Imidazol (B) oder 1,2–Dimethylimidazol (C) vor. Die EPR-Spektren dieser drei
Modellkomplexe in Abbildung 5.9 unterscheiden sich sehr deutlich voneinander. EPR-Spektrum
(A) ist typisch für den high-spin Zustand des Fe3+ -Zentralmetallions mit einem Gesamtspin von
S = 5/2. Der g-Tensor ist axial mit den Komponenten g⊥ = 6,0 und g|| = 2,0 [108]. Durch die
Koordination mit den starken Liganden Imidazol (B) bzw. 1,2–Dimethylimidazol (C) ﬁndet ein
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
79
Abbildung 5.9: X-Band cw-EPR-Spektren von Häminmodellkomplexen gleicher Konzentration (5,3
mM) in DMSO: Fe(III)PPIX (A), Fe(III)PPIX(Im)2 (B) und Fe(III)PPIX(1,2-DiMeIm)2 (C). Die
Modellkomplexe zeigen einen typischen high-spin (A), regulären low-spin (B) und hoch-anisotropen
low-spin (C) Zustand an [164]. Durch die 20-fach vergrößerte Darstellung von Spektrum (C) gegenüber (A) tritt das Hintergrund-Signal des rhombischen Eisens bei g = 4,3 (paramagnetische
Verunreinigung) stärker hervor. Ferner sind in Spektrum (C) geringfügige Reste einer high-spin und
einer regulären low-spin Spezies enthalten.
80
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Übergang in den low-spin Zustand mit einem Gesamtspin S = 1/2 statt. Das EPR-Spektrum
von bis–Imidazol–Fe(III)PPIX (B) zeigt einen rhombischen g-Tensor mit gz = 2,9, gy = 2,3 und
gx = 1,5. Dieses EPR-Spektrum ist diagnostisch für einen regulären low-spin Fe3+ -Komplex,
in dem die Ebenen der axialen Imidazol-Liganden parallel zueinander orientiert sind [165]. Im
Unterschied dazu ist in bis-1,2-Dimethylimidazol-Fe(III)PPIX (C) diese Anordnung der axialen Liganden durch die Methylgruppen sterisch gehindert [164]. Im EPR-Spektrum (C) tritt
neben geringfügigen Resten an high-spin und regulärem low-spin Fe3+ bei gmax = 3,5 ein breites Signal auf. Dieses Signal wird einer sogenannten hoch-anisotropen low-spin (HALS) Spezies
zugeordnet [166] und zeigt eine verdrehte oder auch verkippte Stellung der axialen Liganden
an [165,167]. Die gmax -Komponente entspricht dem gz -Wert des Komplexes. Die beiden anderen
Komponenten gy und gx sind stark verbreitert und im EPR-Spektrum nicht aufzulösen [165].
Da alle drei Proben dieselbe Konzentration an Hämin aufweisen (5,75 mM), kann anhand
der EPR-Spektren aus Abbildung 5.9 ein Anhaltspunkt zur Quantiﬁzierung unterschiedlicher
Fe3+ -Zustände gewonnen werden. So verbirgt sich hinter dem relativ schwachen gmax -Signal der
HALS-Spezies ein beachtlicher Mengenanteil der Probe. Ein deutliches g⊥ -Signal eines high-spin
Fe3+ -Zustandes, der mit S=5/2 ein hohes Übergangsdipolmoment besitzt, wird dagegen schon
von einer äußerst geringen Konzentration dieser Spezies hervorgerufen.
Abbildung 5.10 zeigt die X-Band cw-EPR-Spektren der de novo synthetisierten Hämproteine Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2 (B). Beide EPR-Spektren werden von low-spin
Fe3+ -Signalen dominiert. Bei g⊥ = 6,0 tritt ein schwaches high-spin Fe3+ -Signal auf, dessen g|| Komponente bei g = 2,0 von anderen paramagnetischen Verunreinigungen verdeckt wird. Der
geringe Anteil an high-spin Fe3+ (< 1 % ) zeigt, daß der Kofaktor nahezu vollständig in die Polypeptidmodule eingebaut wurde. In den de novo synthetisierten Hämproteinen liegt somit eine
starke axiale Koordination des Kofaktors durch zwei Histidingruppen vor. Die Einbindung des
Hämins in das Polypeptidmodul ist jedoch sehr heterogen. Neben den Signalen eines regulären
low-spin Fe3+ -Zustandes treten im Bereich von g = 3,0 – 3,5 typische HALS-Signale auf, die in
Abbildung 5.10 durch eine graue Schraﬀur unterlegt sind. Die Aufspaltung der gz -Komponente
des low-spin Zustandes (markiert durch zwei Pfeile in Abbildung 5.10) zeigt ferner an, daß das
reguläre low-spin Spektrum mindestens zwei verschiedene Spezies enthält.
Die Simulation der EPR-Spektren von Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2 (gestrichelte
Linie in Abbildung 5.10) setzt sich insgesamt aus zwei low-spin Spezies und zwei HALS-Spezies
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
81
Abbildung 5.10: X-Band cw–EPR-Spektren von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2 (B).
Die Simulation (gestrichelte Linie) von (A) setzt sich aus zwei low-spin Spezies mit gz,y,x = 2,94,
2,27, 1,53 (21 %) und gz,y,x = 2,83, 2,27, 1,57 (16 %) sowie zwei HALS-Spezies mit gz,y,x = 3,55,
2,00, 0,80 (15 %) und gz,y,x = 3,15, 2,00, 0,80 (48 %) zusammen. Für die Simulation von (B)
wurden zwei low-spin Spezies mit gz,y,x = 2,94, 2,28, 1,55 (32 %) und gz,y,x = 2,83, 2,28, 1,53 (13
%) sowie zwei HALS-Spezies mit gz,y,x = 3,67, 2,00, 0,80 (21 %) und gz,y,x = 3,30, 2,00, 0,80 (34
%) eingesetzt. Die Spektren wurden per Auge angepaßt. Die Genauigkeit in der Abschätzung der
relativen Mengenanteile liegt bei etwa 10%. Bei g = 2.0 treten paramagnetische Verunreinigungen
in den EPR-Spektren auf.
82
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
zusammen. Dabei wurde jeder Spezies in der Simulation ein g-strain Mechanismus zur Linienverbreiterung zugrunde gelegt (siehe Abschnitt 4.4.1). Nach dem g-strain Mechanismus führt
Mikroheterogeneität in der Umgebung der paramagnetischen Spezies zu einer statistischen Variation ihrer g-Tensorhauptwerte und damit zur inhomogenen Linienverbreiterung. Jedem gTensorhauptwert gi (i=x,y,z) ist eine Gaußsche Normalverteilung mit Standardabweichung σgi
zugeordnet. Zur Simulation der EPR-Spektren von Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2 war
es nicht ausreichend eine paramagnetische Spezies mit stark erhöhtem g-strain einzusetzen. Die
statistische Verteilung der g-Tensorwerte nach Gaußscher Normalverteilung ist zu gleichmäßig,
um die Konturen der EPR-Spektren wiederzugeben. Da aus den gemessenen EPR-Spektren
nur der gmax -Wert der HALS-Spezies entnommen werden konnte, wurden für die restlichen gTensorkomponenten der HALS-Spezies typische Literaturwerte aus Mößbaueruntersuchungen
an Modellkomplexen verwendet [165]. Für die stark verbreiterten HALS-Signale wurden Werte
von σgz = 0,12 – 0,22 und σgy = σgx = 0,40 angesetzt. Die Linienbreitenparameter der low-spin
Spezies liegen in einem Wertebereich von σgz = 0,03 – 0,05, σgy = 0,01 – 0,04 und σgx = 0,05 –
0,08.
In den Simulationen liegt der Anteil der HALS-Spezies bei 63 (± 10) % für Hämin-mMOP1
und bei 55 (± 10) % für Hämin-mMOP2. Der Vergleich mit den EPR-Spektren der Modellkomplexe aus Abbildung 5.9 führt zu einer ähnlichen Abschätzung von mindestens 50 % HALS. Somit
zeigen beide Polypeptidmodule eine Verteilung an Konformeren, die sich in der Orientierung der
axialen Liganden unterscheiden. Neben einer Koordination des Hämins durch Histidingruppen,
deren Ebenen nahezu parallel zueinander orientiert sind, treten auch Bindungssituationen auf,
in denen die Histidinliganden gegeneinander verdreht oder verkippt sind. Da die Polypeptidmodule mMOP1 und mMOP2 nur eine Bindungstasche für den Kofaktor Hämin enthalten, muß
die Heterogeneität der EPR-Spektren durch unterschiedliche Faltungszustände der Vier-HelixBündel hervorgerufen werden. Strukturelle Fluktuationen zwischen unterschiedlichen Konformeren können bei den tiefen Temperaturen (20 K) in den gefrorenen Lösungen der EPR-Proben
nicht mehr auftreten.
Um Einﬂuß auf den Faltungszustand der Polypeptidmodule zu nehmen, wurde das chaotrope Agenz Gdn·HCl eingesetzt. Abbildung 5.11 zeigt die EPR-Spektren von Hämin-mMOP1
und Hämin-mMOP2 nachdem die Proben aus Abbildung 5.10 aufgetaut, mit Gdn·HCl versetzt
(Endkonzentration 2,5 M) und wieder eingefroren wurden. Bei Hämin-mMOP1 tritt dabei eine
5.3 Hämin als redoxaktiver Kofaktor
83
drastische Verringerung der Heterogeneität im EPR Spektrum ein. Das EPR-Spektrum (A) zeigt
fast ausschließlich eine reguläre low-spin Spezies mit gz,y,x = 2,89, 2,29, 1,57 und relativ schmalen Linien mit σgx ,gy ,gz = 0,04, 0,02, 0,04. Damit liegt eine deﬁnierte Einbindung des Kofaktors
Hämin in mMOP1 vor. Die Koordination des Hämins erfolgt über zwei Histidingruppen, deren
Ebenen parallel zueinander orientiert sind. Das EPR-Spektrum von Hämin-mMOP2 (B) setzt
sich dagegen nach wie vor aus mehreren Spezies zusammen. Zur Simulation des EPR-Spektrums
wurde eine high-spin Fe3+ (3 %), eine reguläre low-spin Fe3+ (47 %) und zwei HALS-Spezies
(50 %) eingesetzt. Das Auftreten der high-spin Fe3+ -Spezies zeigt an, daß bereits ein geringer Anteil des Hämins durch die denaturierende Wirkung des Gdn·HCl in Lösung freigesetzt
wurde. Darüberhinaus kommt es durch den Zusatz von Gdn·HCl zu einer Verschiebung der
g-Tensorhauptwerte der regulären und hoch-anisotropen low-spin Spezies.
Wie ist der Einﬂuß des Gdn·HCl auf die Faltungszustände von Hämin-mMOP1 und HäminmMOP2 zu erklären? Beide de novo synthetisierten Hämproteine werden durch Salzbrücken
und die Minimierung der hydrophoben Oberﬂäche stabilisiert. Das chaotrope Agenz Gdn·HCl
stört diese Wechselwirkungen und trägt so zum Entfalten der Strukturen bei. Wenn Konformere
unterschiedlicher Stabilität vorliegen, werden die suboptimal gefalteten, instabileren Strukturen
zuerst vollständig aufgelöst. Das freigesetzte Hämin kann dann in unbesetzte Polypeptidmodule
eingelagert werden, die eine höhere Stabilität aufweisen. Die entfalteten Polypeptidmodule könnten sich dann erneut zu Vier-Helix-Bündeln mit optimierter Struktur zusammenlagern und den
Kofaktor Hämin aufnehmen. Bei Hämin-mMOP1 hat dieser Prozeß zu einer deutlichen Verbesserung in der Speziﬁtät der Bindungssituation von Hämin geführt. Bei Hämin-mMOP2 ist dies
auch bei Variation der Gdn·HCl Konzentration nicht gelungen. Ehe es zur Auﬂösung ungünstig
gefalteter Konformere kommt, wird in diesem Polypeptidmodul der Kofaktor Hämin in Lösung
freigesetzt. Wie bereits anhand der Denaturierungsexperimente in Abschnitt 5.3.3 festgestellt
wurde, ist Hämin-mMOP1 im Vergleich zu Hämin-mMOP2 gegenüber einer Entfaltung mit
Gdn·HCl stabiler.
Möglicherweise spielt bei Hämin-mMOP1 auch die Tendenz Aggregate zu bilden eine Rolle, während bei Hämin-mMOP2 keine Zusammenlagerungen der Vier-Helix-Bündel festgestellt
wurde (siehe Abschnitt 5.3.1). Wie mit Hilfe der analytischen Gelﬁltration gezeigt werden konnte, kann durch Inkubation mit Gdn·HCl die Ausbildung von Aggregaten der Polypeptidmodule
Hämin-mMOP1 zurückgedrängt werden. In diesem Fall trägt das denaturierende Agenz Gdn·HCl
84
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.11: X-Band cw–EPR-Spektren von Hämin-mMOP1 (A) und Hämin-mMOP2 (B)
nach Zusatz von Guanidiniumhydrochlorid (2,5 M) mit Simulation (gestrichelte Linie). Während
Spektrum (A) einen reinen low-spin Zustand mit gz,y,x = 2,89, 2,29, 1,57 (100 %) zeigt, treten in
Spektrum (B) zusätzlich high-spin und HALS-Signale auf. Die Simulation von Spekrum (B) setzt
sich zusammen aus einer high-spin Spezies mit gz,y,x = 6,0, 6,0, 2,0 (3%), einer low-spin Spezies mit
gz,y,x = 2,93, 2,27, 1,51 (47%) und zwei HALS-Spezies mit gz,y,x = 3,25, 2,00, 0,80 (8%), gz,y,x =
3,80, 2,00, 0,80 (42%). Die Signale bei g = 2.0 sind paramagnetischen Verunreinigungen zuzuordnen.
5.4 Einbau eines Kobaltporphyrins
85
zur Separation der Vier-Helix Bündel voneinander bei, in dem es die Wechselwirkungen zwischen
verschiedenen Polypeptidmodulen aufbricht.
Die g-Tensorhauptwerte stehen in fester Beziehung zur elektronischen Struktur der lowspin Fe3+ -Komplexe. Wie in Abschnitt 3.4.1 gezeigt wurde, kann auf der Basis der Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte [117] auf die Besetzung und energetische Aufspaltung der
d-Orbitale des Zentralmetallions Fe3+ geschlossen werden. Damit zeigt die Verschiebung der
g-Tensorhauptwerte durch den Zusatz von Gdn·HCl strukturelle Veränderungen des Faltungszustandes der Bindungstasche an. Da bei der hier auftretenden Überlagerung verschiedener Spezies die Zuordnung der g-Tensorhauptwerte jedoch nicht eindeutig ist, werden die Ergebnisse der
Ligandenfeldanalyse hier nicht im Detail aufgelistet, sondern kurz zusammengefaßt.
Die Parameter der Ligandenfeldanalyse liegen in einem Wertebereich der typisch für bisHistidin-ligandiertes Hämin ist. Die tetragonale Aufspaltung ∆/λ, welche ein Maß für die Stärke
der axialen Liganden ist [165], liegt zwischen 3,0 und 3,4. Die rhombische Aufspaltung V/λ der
regulären low-spin Spezies erreicht Werte von 1,9 bis 2,1. Für die HALS-Spezies verringert sich,
wie für eine verdrehte Anordnung der Histidinebenen zu erwarten, die rhombische Aufspaltung
zu Werten zwischen 0,8 und 1,0 [165]. Im nächsten Kapitel, in dem der Schwerpunkt auf den
magnetischen Resonanzmethoden liegt, wird näher auf die Interpretation von Ligandenfeldparametern in bis-Histidin-ligandierten Häminkomplexen eingegangen.
5.4
Einbau eines Kobaltporphyrins
Durch den Austausch des Zentralmetallions Fe3+ gegen Co2+ können neue funktionelle Eigenschaften in die Polypeptidmodule eingeführt werden. Das Übergangsmetallion Co2+ ist ebenfalls redoxaktiv. In den Proteinen Hämoglobin und Myoglobin wurde die Hämgruppe gegen
Co(II)protoporphyrin IX (Co(II)PPIX) ausgetauscht, um die reversible Sauerstoﬀbindung zu
untersuchen [169,170]. Darüberhinaus kann der Kofaktor Co(II)PPIX als neue paramagnetische
Sonde zur Charakterisierung der Polypeptidmodule eingesetzt werden. In Untersuchungen an
Modellkomplexen zeigte sich, daß die Hyperfeinwechselwirkung des ungepaarten Elektronenspins
mit dem Zentralmetall (59 Co trägt einen Kernspin von I = 7/2) sowie mit dem koordinierenden Stickstoﬀatom axialer Imidazol-Liganden direkt aus den EPR-Spektren zugänglich ist (siehe
auch Ref. [171–173]).
86
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Zunächst sollte geklärt werden, ob sich Co(II)PPIX überhaupt in künstliche Vier-Helix-
Bündel mit einer bis-Histidin-Bindungstasche einbauen läßt. Für diese Versuche wurde das Polypeptidmodul mMOP1 eingesetzt.
Co(II)PPIX in wäßriger Lösung neigt zur Oxidation durch den Luftsauerstoﬀ [174]. Bei
den ersten Einbauversuchen wurde daher Co(III)PPIX-mMOP1 erhalten. Abbildung 5.12 (A)
zeigt die UV/VIS-Absorptionsspektren des freien Kofaktors Co(III)PPIX und von Co(III)PPIXmMOP1. Durch den Einbau des Kofaktor verschiebt sich die Soret-Bande von 418 nm auf 426
Abbildung 5.12: (A): UV–VIS Spektrum des Kobaltporphyrins in wäßriger Phosphatpuﬀerlösung
pH 7,0 (– –) und durch Zusatz von Dithionit im reduzierten Zustand (· · · ). Eingebaut im oxidierten
Zustand im Polypeptidmodul mMOP1 (—). (B): Reduktion von Co(III)PPIX-mMOP1 mit festem
Natriumdithionit nach 0 min, 3 min, 7 min, 15 min, 30 min und 60 min.
5.4 Einbau eines Kobaltporphyrins
87
nm. Außerdem nimmt die Intensität der α-Bande bei 570 nm gegenüber der β-Bande bei 535
nm ab. Während bei Fe(III)PPIX-mMOP1 durch den Zusatz von Dithionit eine spontane und
vollständige Reduktion des Zentralmetallions eintritt, reagiert Co(III)PPIX-mMOP1 nur sehr
langsam mit Dithionit. Abbildung 5.12 (B) zeigt die spektralen Veränderungen, die bei Zugabe
von festem Natriumdithionit innerhalb einer Stunde beobachtet wurden. Die Soret-Bande bei
426 nm verliert an Intensität, während bei etwa 401 nm eine neue Bande auftritt. Im Bereich
der α- und β-Bande verbreitert sich das Spektrum. Löst man Kobaltporphyrin unter Zusatz
von Dithionit in wäßriger Lösung (Abbildung 5.12 (A)), erhält man Co(II)PPIX im reduzierten
Zustand. Die Soret-Bande des Kofaktors liegt kurzwellig verschoben bei 401 nm. Bei Zugabe des
Polypeptidmoduls treten keine signiﬁkanten spektralen Veränderungen auf. Damit kann nicht
nachgewiesen werden, ob ein Einbau im reduzierten Zustand erfolgt. Kommt die Lösung nun
mit Luftsauerstoﬀ in Kontakt wird der Kofaktor sofort oxidiert und man erhält das UV/VISAbsorptionsspektrum von Co(III)PPIX-mMOP1.
Bei der Gelﬁltration der Proben wurde festgestellt, daß das Polypeptidmodul den Kofaktor
nur im oxidierten Zustand fest einbindet. Unter Sauerstoﬀausschluß und reduzierenden Bedingungen wurde eine Trennung des Kofaktors auf der Säule vom Polypeptidmodul beobachtet. Dies
bedeutet, daß die langsame Reduktion mit der Freisetzung des Kofaktors in die Lösungsmittelumgebung einhergeht. Die Ursache für die geringe Stabilität und die langsame Reduktion des
Kobaltporphyrin im Polypeptidmodul ist die unterschiedliche elektronischen Struktur des Zentralmetallions Co2+ (d7 ) und Co3+ (d6 ). Während Co2+ -Komplexe im allgemeinen eine 5-fache
Koordination vorziehen, ist Co3+ meist 6-fach ligandiert [175]. Bei Co3+ -Komplexen wirken
insbesondere starke Liganden stabilisierend, da ein low-spin Zustand mit einer geschlossenen
t62g Unterschale gebildet werden kann. Da sich im Vier-Helix-Bündel mMOP1 zwei HistidinSeitengruppen auf gleicher Höhe gegenüberstehen, wird der oxidierte Zustand durch die axiale
Koordination des Zentralmetallions mit diesen beiden starken Liganden gegenüber dem reduzierten Zustand energetisch oﬀenbar deutlich begünstigt.
Das Ziel, eine zu Hämin komplementäre EPR-Probe in das Polypeptidmodul einzuführen,
wurde nicht erreicht. Co3+ -Komplexe sind in ihrem low-spin Zustand diamagnetisch mit einem
Gesamtspin von S=0. Diese Untersuchung zeigt jedoch deutlich, daß die elektronischen Eigenschaften des Zentralmetallions und seine Wechselwirkung mit den axialen Liganden der Polypeptidumgebung die Einbindung eines Metalloporphyrins in die Vier-Helix-Bündel entscheidend
88
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
beeinﬂußt. Für eine stabile Einbindung von Co(II)PPIX wäre eine Bindungstasche mit nur einem
Histidinrest vermutlich günstiger. In den natürlichen Hämproteinen Myoglobin und Hämoglobin, in welchen der Kofaktor Hämin durch Co(II)PPIX ausgetauscht werden konnte, wird das
Kobaltporphyrin über die axiale Koordination mit einem Histidin (dem proximalen Histidin)
in die Proteinmatrix eingebunden [170, 176]. Allerdings weisen auch diese natürlichen Systeme
eine äußerst langsame Reduktionskinetik auf, wenn zunächst Co(III)PPIX in das Apoprotein
eingebaut wird [170]. Dies wird über die Notwendigkeit konformationeller Änderungen der Proteinumgebung bei der Reduktion des Kofaktors erklärt [177]. Der oxidierte Zustand unterscheidet sich dabei durch die zusätzliche Koordination eines zweiten Histidinliganden (dem distalen
Histidin) an das Zentralmetallion Co3+ vom reduzierten Zustand. Im Gegensatz zu dem künstlichen Vier-Helix-Bündel mMOP1 verbleibt der reduzierte Kofaktor Co(II)PPIX auch nach der
Reorganisation der Bindungstasche im Protein.
5.5
Zink(II)porphyrin als Kofaktor
Zn2+ unterscheidet sich von den beiden anderen Zentralmetallionen Fe2+/3+ und Co2+/3+ der
bisher hier untersuchten Metalloporphyrinkofaktoren durch seine geschlossene d10 -Unterschale.
Die Eigenschaften der beiden typischen Übergangsmetallionen Fe2+/3+ und Co2+/3+ werden im
wesentlichen durch ihre d-Valenzelektronen bestimmt und werden für redoxchemische Umwandlungen eingesetzt, die aus dem Grundzustand erfolgen. Zn(II)protoporphyrin IX kann dagegen
nach Anregung mit sichtbarem Licht als Donator in lichtinduzierten Elektronentransferprozessen eingesetzt werden. In Kombination mit geeigneten Akzeptormolekülen wie z.B. Chinonen
könnten so Polypeptidmodule realisiert werden, die sich als Modellsysteme der Photosynthese
einsetzen lassen. Als erster Schritt zur Entwicklung dieser neuen Systeme wurde Zn(II)PPIX in
das Vier-Helix-Bündel mMOP1 eingebaut. Die Untersuchung beschränkt sich auf eines der beiden Polypeptidmodule (mMOP1), da hier zunächst im Vordergrund steht, ob sich diese neuen
Elektronentransfersysteme prinzipiell realisieren lassen.
Im Folgenden soll zunächst der Einbau des Kofaktors Zn(II)PPIX in das Polypeptidmodul
mMOP1 nachgewiesen und charakterisiert werden. Parallel dazu wurde Myoglobin (Zn(II)Mb)
untersucht, in welchem die Hämgruppe durch Zn(II)PPIX ausgetauscht wurde. Damit kann ein
Vergleich zwischen dem künstlichen Vier-Helix-Bündel und einem bereits gut charakterisierten
5.5 Zink(II)porphyrin als Kofaktor
89
Proteingerüst durchgeführt werden.
5.5.1
UV/VIS-Absorptionsspektroskopie
Der Einbau des Kofaktors Zn(II)PPIX in das Polypeptidmodul kann direkt über die UV/VISAbsorptionsspektroskopie nachgewiesen werden. Abbildung 5.13 (A) zeigt das Spektrum des
freien Kofaktors im direkten Vergleich zu Zn(II)PPIX-mMOP1. Neben der ausgeprägten SoretBande bei 425 nm unterscheidet sich das Spektrum des Kofaktors im Polypeptidmodul durch
die Intensitätszunahme der β-Bande (551 nm) gegenüber der α-Bande (587 nm) von freien
Zn(II)PPIX in wäßriger Lösung. Das Intensitätsverhältnis der α- und β-Bande mit 9α /9β < 1 ist
diagnostisch für die axiale Koordination des Zn(II)porphyrins mit einer Stickstoﬀbase [178,179].
Auch die UV/VIS-Absorptionsspektren von Zn(II)PPIX-Imidazol und Zn(II)Mb aus Abbildung
5.13 (B) zeigen dieses Merkmal.
Das UV/VIS-Absorptionsspektrum von Zn(II)PPIX-mMOP1 weist eine größere Ähnlichkeit zum einfachen Modellkomplex Zn(II)PPIX-Imidazol auf als zu Zn(II)Mb. Das Derivat des
natürlichen Proteins besitzt eine äußerst schmale Soret-Bande bei 428 nm sowie deutlich strukturierte α- und β-Banden bei 596 nm und 553 nm. Das natürliche Proteingerüst bietet somit
eine speziﬁschere Umgebung als das Vier-Helix-Bündel mMOP1.
5.5.2
EPR-Spektroskopie am Triplettzustand
Zn(II)porphyrinsysteme sind in ihrem Grundzustand diamagnetisch mit einem Gesamtspin S=0.
Nach optischer Anregung entsteht durch ‘Intersystem Crossing’ aus dem angeregten Singulettein Triplettzustand mit Gesamtspin S=1. Dieser kurzlebige Triplettzustand kann über zeitaufgelöste EPR-Spektroskopie charakterisiert werden kann.
Abbildung 5.14 zeigt die transienten cw-EPR-Spektren der Triplettzustände von
Zn(II)PPIX-mMOP1 (A, B) und Zn(II)PPIX-Myoglobin (C) im Bereich der |∆M| = 1
Übergänge. Die EPR-Spektren sind charakteristisch für Pulverspektren von Triplettzuständen
mit Nullfeldtensoren rhombischer Symmetrie. Beide Spektren zeigen von der Tief- zur Hochfeldseite ein Polarisationsmuster aaa-eee aus absorptiven und emissiven Linien. Dieses für
Zn(II)porphyrinsysteme typische Polarisationsmuster [180, 181] zeigt an, daß die Bildung des
Triplettzustandes durch ‘Intersystem Crossing’ mit bevorzugter Bevölkerung des Tz -Niveaus
90
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.13: UV-VIS-Absorptionsspektrum des freien Kofaktors Zn(II)PPIX in Phosphatpuﬀer
pH 7,0 (– –) und eingebaut im Polypeptidmodul mMOP1 (—) (A). Zum Vergleich ist in (B) das
Absorptionsspektrum von Zn(II)Myoglobin (—) und von Zn(II)PPIX-Imidazol (– –) gezeigt.
5.5 Zink(II)porphyrin als Kofaktor
91
Abbildung 5.14: Transiente EPR-Spektren von Triplett-Zuständen des Zn(II)PPIX-mMOP1 (A
ohne Gdn·HCl, (B) mit 1 M Gdn·HCl) und Myoglobin (C), in welchem das Hämin durch
Zn(II)protoporphyrin IX ausgetauscht wurde (Zn(II)Mb). Die Spektren wurden nach optischer Anregung (532 nm) bei 80 K aufgenommen. Die Nullfeldparameter |D| und |E| können aus den EPRSpektren direkt abgelesen werden (siehe Text). Bei g = 2.0 (346 mT) deutet sich eine radikalische
Spezies unbekannten Ursprungs an.
92
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
erfolgt [179]. Die daraus resultierende Spinpolarisation hat eine Lebensdauer im Bereich von
einigen µs.
Das Spektrum (A) von Zn(II)PPIX-mMOP1 wurde in Glycerin:H2 O 3:2 aufgenommen. Anschließend wurde die Probe aufgetaut und Gdn·HCl zugesetzt (Endkonzentration 1M). Nach
dem Einfrieren der Probe wurde Spektrum (B) gemessen. Bei einer 1M Gdn·HCl Konzentration sollte der Kofaktor, wie UV/VIS-spektroskopischen Untersuchungen zeigen, noch im Polypeptidmodul gebunden sein. Die beiden transienten EPR-Spektren des Zn(II)PPIX-mMOP1
unterscheiden sich leicht in ihrer spektralen Ausdehnung. Sie zeigen jedoch beide im Vergleich
zu Zn(II)Mb in Spektrum (C) relativ breite Linien.
Die EPR-Spektren enthalten Informationen über die dipolare Wechselwirkung der beiden ungepaarten Elektronenspins des Triplettzustandes, die zu einer Nullfeldaufspaltung führen (siehe
Abschnitt 3.1). Die Nullfeldparameter |D| und |E| der Triplettzustände aus Abbildung 5.14 wurden direkt durch Ablesen aus den Spektren ermittelt. Für Zn(II)PPIX-mMOP1 ohne Zusatz an
Gdn·HCl ergibt sich |D| = 351(± 10) × 10−4 cm−1 , |E| = 58 (± 10) × 10−4 cm−1 aus Spektrum
(A) und mit Zusatz an Gdn·HCl folgt |D| = 360(± 10) × 10−4 cm−1 , |E| = 61 (± 10) × 10−4
cm−1 aus Spektrum (B).1 Die Nullfeldparameter |D| = 350(± 5) × 10−4 cm−1 , |E| = 67 (± 5)
× 10−4 cm−1 von Zn(II)Mb aus Spektrum (C) sind in guter Übereinstimmung mit Literaturwerten [179, 180]. Der Nullfeldparameter |D| ist ein Maß für die Ausdehnung der elektronischen
Wellenfunktion des Triplettzustandes [87]. Er liegt in einem Wertebereich von 350 (± 20) × 10−4
cm−1 , der typisch für den Makrozyklus Protoporphyrin IX ist [179, 182]. Der Nullfeldparameter
|E| gibt die Verzerrung des Systems ausgehend von einer tetragonalen Symmetrie an [87]. Für
Zn(II)porphyrinsysteme ﬁndet man |E|-Werte in einem Bereich von 0 – 70 × 10−4 cm−1 [182],
wobei der Nullfeldparameter |E| für eine quadratisch planare Geometrie gegen Null geht. Im
Falle des eingebauten Zn(II)PPIX führt die axiale Ligandierung über Histidin-Seitengruppen
und die Konjugation der Vinylgruppen an der Peripherie des Porphyringrundgerüstes zu einer
rhombischen Verzerrung des Systems [179].
Das transiente EPR-Spektrum von Zn(II)Mb (C) hebt sich von den beiden Spektren des
Zn(II)PPIX-mMOP1 (A, B) durch schärfere Konturen ab. Damit sind die Nullfeldparameter
in Zn(II)Mb besser deﬁniert, was auf einen speziﬁscheren Einbau des Kofaktors im natürlichen
Proteingerüst im Vergleich zu dem Polypeptidmodul schließen läßt. Da bei Hämin-mMOP1
1
Der Umrechnungsfaktor zwischen der Feldskala (mT) und der Einheit 10−4 cm−1 beträgt 9,35.
5.5 Zink(II)porphyrin als Kofaktor
93
durch den Zusatz von Gdn·HCl eine Verbesserung hinsichtlich eines wohldeﬁnierten Einbaus
des Kofaktors erzielt werden konnte (siehe Abbildung 5.11), wurde auch zu dem Polypeptidmodul Zn(II)PPIX-mMOP1 Gdn·HCl zugegeben. Dabei wurde jedoch in dem dazugehörigen
EPR-Spektrum (B) keine Reduktion der Linienbreite festgestellt. Stattdessen nimmt die spektrale Ausdehnung und damit der eﬀektive Wert des Nullfeldparameters |D| leicht zu. Da der
Nullfeldparameter |D| ein Maß für die Ausdehnung der Triplettwellenfunktion ist, könnte sich
die Konformation des Porphyrinringes verändert haben. Die Zunahme von |D| spricht dabei für
einen Übergang von einer leicht gebogenen zu einer planaren Konformation. Dies kann von einer
Aufweitung der Bindungstasche oder gar einer Freisetzung des Kofaktors herrühren.
Bei dem Vergleich der Nullfeldparameter |D| und insbesondere |E| mit Literaturwerten ist
darauf zu achten, daß in Triplettzuständen von Porphyrinsystemen dynamische Jahn-Teller Verzerrungen auftreten können, die zu einer Variation der Nullfeldparameter in Abhängigkeit von
der Temperatur führen [183]. Die hier untersuchten Proben zeigen jedoch in Übereinstimmung
mit anderen EPR-spektroskopischen Untersuchungen an Zn(II)protoporphyrin IX im Bereich
von 5 bis 80 K keine signiﬁkanten spektralen Veränderungen.
5.5.3
Blitzlichtspektroskopie und Elektronentransfer
Abbildung 5.15 (A) zeigt das Triplett−Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektrum von Zn(II)PPIXmMOP1 und Zn(II)Mb, das mit Hilfe der Blitzlichtspektroskopie erhalten wurde. Diese Spektren
wurden aus Zeitspuren, die bei einzelnen Wellenlängen aufgenommen wurden, ermittelt. Der
Bildausschnitt (B) zeigt dazu exemplarisch den zeitliche Verlauf der Absorptionsänderung bei
460 nm von Zn(II)PPIX-mMOP1 und Zn(II)Mb nach der Blitzlichtanregung. Bei 460 nm zeigt
der Triplettzustand des Zinkporphyrins eine starke Absorption. Die Zeitspuren beider Proben,
die den Zerall des Triplettzustandes nach der Blitzlichtanregung wiedergeben sollten, lassen sich
jedoch nur mit biexponentiellen Funktionen anpassen. Dieses Verhalten wurde für Zn(II)Mb
bereits festgestellt [184]. Da in gefrorener Lösung bei 77 K dynamische Prozesse, die auf der
Kollision verschiedener Reaktionspartner beruhen, auszuschließen sind, liegt vermutlich eine
zweite Spezies im Grundzustand oder dem angeregten Zustand vor. Neben einer Verzerrung des
Porphyringerüstes [184] ist auch eine bereits vorliegende photochemische Schädigung der Probe
durch Luftsauerstoﬀ denkbar [185]. Die Hauptkomponente der Zeitspuren mit einer über den
gesamten Wellenlängenbereich konstanten Halbwertszeit von 17,0 ms für Zn(II)Mb bzw. 19,4 ms
94
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.15: (A): Triplett-Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektren bei 77 K von Zn(II)PPIXmMOP1 (- -•- -) und Zn(II)Mb (––). (B): Der Bildausschnitt zeigt die Zeitspuren bei 460 nm
und ihre Anpassung an biexponentielle Funktionen mit Halbwertszeiten von t1 =17,0 ms (Anteil
ˆ
t2 =3,4 ms (A2 =10%)
ˆ
bei Zn(II)Mb (obere Spur) und t1 =19,4 ms (A1 =76%),
ˆ
t2 =5,6 ms
A1 =90%),
(A2 =24%)
ˆ
bei Zn(II)PPIX-mMOP1 (untere Spur).
für Zn(II)PPIX-mMOP1 wird dem Zerfall des ersten angeregten Triplettzustandes zugeordnet
[184, 186]. Um das Triplett−Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektrum in Abbildung 5.15 (A) zu
erhalten, wurde die relative Amplitudenänderung dieser Zeitkomponente gegen die Wellenlänge
aufgetragen.
Die Triplett−Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektren geben die Änderung der Absorption
ausgehend vom elektronischen Singulett-Grundzustand nach der Anregung in den Triplettzustand wieder. Wenn der angeregte Triplettzustand bei einer bestimmten Wellenlänge eine höhere
Absorption aufweist als der Grundzustand, wird eine positive Absorptionsänderung aufgezeichnet. Im anderen Fall sieht man in den Triplett−Singulett Absorptionsdiﬀerenzspektren eine
negative Bande, die der Ausbleichung der hier dominierenden Absorptionsbande des SingulettGrundzustandes entspricht. In Abbildung 5.15 (A) sind neben dem Ausbleichen der Soret-Bande
5.5 Zink(II)porphyrin als Kofaktor
95
(bei circa 425 nm), die für Zn(II)Mb etwas schmaler als für Zn(II)PPIX-mMOP1 ausfällt, auch
die α- und β-Banden bei etwa 590 nm und 550 nm deutlich zu erkennen. Eine positive Absorptionsänderung tritt im Bereich von 440 nm bis 530 nm auf. In diesem Wellenlängenbereich besitzt
der Triplettzustand höhere Extinktionskoeﬃzienten der optischen Übergänge als der SingulettGrundzustand.
Mit Zn(II)Mb wurden bereits einige Untersuchungen zum lichtinduzierten Elektronentransfer in ﬂüssiger Lösung durchgeführt [184–187]. Dabei wurde Anthrachinon-2-sulfonsäure (AQS)
als Elektronenakzeptor eingesetzt. Hier soll nun der lichtinduzierte Elektronentransfer zwischen
Zn(II)PPIX eingebaut im mMOP1 und AQS mit Hilfe der Blitzlichtspektroskopie untersucht
werden. Zur Beobachtung der lichtinduzierten Elektronentransferreaktion zwischen Zn(II)PPIX
und AQS hat sich die Beobachtungswellenlänge 674 nm als vorteilhaft herausgestellt. Das
Zn(II)porphyrinradikalkation zeigt in diesem Wellenlängenbereich eine Absorption [186,188,189].
Damit wird anstelle des Zerfalls des Eduktes, dem Zn(II)porphyrin-Triplettzustand, die Bildung
des Produktes, das Zn(II)porphyrinradikalkation, verfolgt.
In Abbildung 5.16 sind die Zeitspuren bei 674 nm von Zn(II)PPIX-mMOP1 (A) und ZnMb
(B) gezeigt. Die obere Spur zeigt jeweils den Zerfall des Triplettzustandes ohne Zusatz von AQS.
In der unteren Spur, die nach einem Zusatz von AQS (Konzentration 2,4 µM) aufgezeichnet wurde, ist dagegen die Bildung einer neuen Spezies zu sehen. Da der Anstieg der Absorption durch
den Zusatz von AQS bei einer für Zn(II)porphyrinradikalkationen typischen Beobachtungswellenlänge erfolgt, handelt es sich hier um die Entstehung des Produktes der Elektronentransferreaktion zwischen dem angeregten Triplettzustand des Zn(II)PPIX und AQS. Da dies sowohl für
Zn(II)PPIX-mMOP1 als auch Zn(II)Mb beobachtet werden konnte, ist belegt, daß der Kofaktor
Zn(II)PPIX auch im Polypeptidmodul zu lichtinduziertem Elektronentransfer fähig ist.
Schema 5.17 zeigt ein vereinfachtes Reaktionsschema für den Elektronentransfer zwischen
dem Triplettzustand von Zn(II)PPIX (T , ) und AQS (Q) hin zum Produkt (P ), das dem Radikalkation des Zn(II)PPIX entspricht. Die Zerfallsprozesse des Triplettzustandes, wie die strahlungslose Desaktivierung, Phosphoreszenz und weitere Löschprozesse außerhalb der Elektronentransferreaktion mit AQS werden in der Zerfallsrate 1/τ0 zusammengefaßt. Das Produkt P entsteht nur intermediär und zerfällt mit einer Rate 1/τ , . Zur Vereinfachung wird angenommen, daß
dieser Zerfallsprozeß nach einer Reaktion 1. Ordnung abläuft. Innerhalb dieses Schemas erhält
man für den Konzentrationsverlauf des Triplettzustandes T , und des intermediären Produktes
96
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
Abbildung 5.16: Einﬂuß von Anthrachinon-2-sulfonsäure (AQS) auf die Zeitspuren bei λ = 674
nm von Zn(II)PPIX-mMOP1 (A) und Zn(II)Mb (B). Ohne AQS wird die Kinetik der Absorption durch die prompte Bildung und den Zerfall des Triplettzustandes dominiert (obere Spur); mit
2,4 µM AQS wird die langsame Bildung und den Zerfall des Zn(II)porphyrinradikalkations (untere
Spur). Die Bildungsgeschwindigkeit (ermittelt durch Anpassung mit Exponentialfunktionen werden
bei verschiedenen AQS Konzentrationen aufgetragen (siehe Bildausschnitt).
5.5 Zink(II)porphyrin als Kofaktor
97
P folgende Zeitabhängigkeit [190]:
[T , ] = [T0, ]exp(−t/τ )
[P ] =
(5.4)
kq [Q][T0, ]
(exp(−t/τ ) − exp(−t/τ , ))
1/τ , − 1/τ
(5.5)
mit
τ = (1/τ0 + kq [Q])−1 .
(5.6)
Der Anstieg und der Zerfall des Zn(II)porphyrinradikalkations wird damit durch zwei Exponentialfunktionen wiedergegeben. Für den Elektronentransferprozeß ist insbesondere die Zeitkonstante τ der ersten ansteigenden Exponentialfunktion von Interesse. Trägt man τ −1 gegen
die Konzentration an AQS auf, so erhält man aus der Steigung die sogenannte Löschkonstante kq . Beide Systeme ergeben relativ ähnliche Werte für kq mit 4,5 (± 1,0) × 108 M−1 s−1 für
Zn(II)PPIX-mMOP1 (A) und 4,8 (± 1,0) × 108 M−1 s−1 für ZnMb (B). Dies ist jedoch nur eine
grobe Näherung, da in der Blitzlichtspektroskopie auch andere bei 674 nm absorbierende Spezies
zu den Zeitspuren beitragen, deren Extinktionskoeﬃzienten, Lebenszeiten und Mengenverhältnisse jedoch meist nicht bekannt sind. So tritt beispielsweise bereits in Anwesenheit geringer
Mengen von Restsauerstoﬀ eine langlebige Spezies auf, was eine photochemische Schädigung der
Probe anzeigt [185,187]. Die Literaturwerte für den lichtinduzierten Elektronentransfer zwischen
Zn(II)Mb und AQS liegen im Bereich von 2,1 × 108 M−1 s−1 bis 2,9 × 108 M−1 s−1 [184–186]
und sind damit etwas niedriger als der hier ermittelte Wert.
T*
1
τ0
k q [Q]
P
1
τ’
Abbildung 5.17: Vereinfachtes Reaktionsschema für einen Elektronentransfer zwischen einem angeregten Triplettzustand T und einem Elektronenakzeptor (Q) zum Produkt P . Dabei ist kq die
Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransferreaktion, 1/τ0 und 1/τ , sind die Zerfallsraten von
T und P .
98
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
5.6
Zusammenfassung und Schlußfolgerungen
Mittels chemischer Festphasenpeptidsynthese wurden zwei Polypeptidmodule mit jeweils einer
Bindungsstelle für Metalloporphyrinkofaktoren hergestellt. Diese Systeme wurden durch die Fixierung von vier helicalen Peptiden auf einem Trägermolekül (Templat) als Vier-Helix-Bündel
entworfen. Entsprechend ihrem Designkonzept zeigen diese de novo synthetisierten Proteine in
den Circulardichroismus-Spektren eine helicale Sekundärstruktur. Das Zusammenlagerung zu
dem Strukturmotiv eines Vier-Helix-Bündels wird durch die Ausbildung eines hydrophoben Innenraums unterstützt. Die Fluoreszenzeigenschaften der Aminosäure Tryptophan lieferten einen
Hinweis auf die erfolgreiche Zusammensetzung des Vier-Helix-Bündels. Die kurzwellige Verschiebung der Wellenlänge maximaler Fluoreszenz gegenüber einem wäßrigen Medium zeigt die
Abschirmung des hydrophoben Innenraums vor dem Eindringen von Wassermolekülen an. Um
die Stabilität der de novo synthetisierten Proteine zu untersuchen wurden Denaturierungsexperimente mit Guanidiniumhydrochlorid zur Entfaltung der Polypeptidmodule durchgeführt. Es
zeigte sich, daß die Stabilität der Vier-Helix-Bündel durch den Einbau des Metalloporphyrins
Hämin deutlich erhöht wird. Der Einbau von Hämin erfolgt über die axiale Ligandierung mit
zwei Histidinresten in dem hydrophoben Innenraum und trägt damit zur Fixierung der Struktur
des Vier-Helix-Bündels bei.
Mittels EPR-Spektroskopie wurde die Bindungssituation des Kofaktors charakterisiert. Dabei konnte der Einbau des Hämins über eine starke axiale Koordination mit zwei axialen Histidinliganden eindeutig nachgewiesen werden. Es zeigte sich jedoch auch eine ausgeprägte Heterogeneität in der Bindungssituation des Hämins. Neben einer parallelen Anordnung der Ebenen der
axialen Histidinliganden ﬁndet man auch eine verdrehte bzw. verkippte Orientierung der beiden
Liganden. Die Ursache dieser Heterogeneität könnte in dem Designkonzept Templat-assoziierter
synthetischer Proteine liegen, das für die Vier-Helix-Bündel angewandt wurde. Die künstliche
Verzweigung, die durch die Fixierung der einzelnen helicalen Bausteine auf das Templat eingeführt wird, würde demnach der Faltung des Polypeptidmoduls geometrische Restriktionen
auferlegen. Dies führt zu einer Verteilung unterschiedlicher Konformere mit suboptimal gefalteten Hämbindungstaschen. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß die Heterogeneität der Proben
durch chaotrope Agenzien beeinﬂußbar ist. Bei einem der beiden hier untersuchten Polypeptidmodule ist es durch den Zusatz von Guanidiniumhydrochlorid gelungen, einen Faltungszustand
5.6 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen
99
des Vier-Helix-Bündels mit wohldeﬁnierter Einbausituation des Kofaktors Hämin zu erreichen.
Das Vorliegen verschiedener Konformere der de novo synthetisierten Hämproteine stellt die
Verwendung eines Zwei-Zustand-Modells in Frage, welches häuﬁg zur Analyse der Entfaltung
natürlicher und de novo synthetisierter Proteine eingesetzt wird [129, 148, 149]. Dieses einfache
Modell geht von einem deﬁnierten, gefalteten Ausgangszustand aus, der kooperativ und direkt,
d. h. ohne das Auftreten metastabiler Intermediate, denaturiert wird. Unter dem Vorbehalt, daß
der Mechanismus zur Stabilisierung und Entfaltung natürlicher Proteine und synthetischer Polypeptidmodule sicherlich komplexer verläuft, wurde das Zwei-Zustands-Modell zur Gegenüberstellung der de novo synthetisierten Vier-Helix-Bündel mit natürlichen Systemen eingesetzt.
Es zeigte sich, daß die Stabilität der künstlichen Polypeptidmodule durchaus mit natürlichen
Hämproteinen, wie dem Myoglobin oder Cytochrom b562 vergleichbar ist.
Die Optimierung des Designs der Vier-Helix Bündel hinsichtlich einer eindeutigen Faltung
und insbesondere einer wohldeﬁnierten Konformation der Hämbindungstasche ist ein wichtiger
Aspekt für weiterführende Arbeiten. Im Prinzip sind die Polypeptidmodule hervorragend dazu
geeignet, anhand systematischer Variationen der Aminosäurezusammensetzung den Einﬂuß der
Proteinumgebung auf die funktionellen Eigenschaften der Kofaktoren zu untersuchen. Hierbei
muß jedoch beachtet werden, daß in einer ﬂüssigen Lösung verschiedene Faltungszustände der
Polypeptidmodule vorliegen können, wodurch nur die mittleren Eigenschaften der Verteilung
der unterschiedlichen Konformere gemessen werden.
Die beiden hier untersuchten de novo synthetisierten Hämproteine unterscheiden sich in der
Positionierung der aromatischen Aminosäure Tryptophan und der Einführung eines polaren Arginins voneinander. Es zeigt sich, daß bereits der Austausch einzelner Aminosäuren einen Eﬀekt
auf die Stabilität der Polypeptidmodule und die Eigenschaften des Kofaktors hat. Die freien Entfaltungsenergien der beiden Polypeptidmodule unterscheiden sich um etwa 6 kJ/mol. Außerdem
wurden zwei verschiedene Redoxpotentiale von −164(±10) mV und −153(±5) mV bestimmt.
Da diese Redoxpotentiale oberhalb des typischen Wertes von −200 mV für Häminkomplexen in
wäßriger Lösung liegen, kann man von einer hydrophoben Abschirmung des Kofaktors in den
Polypeptidmodulen ausgehen. Die Abschirmung des Kofaktors im Innenraum der Vier-HelixBündel vor polaren Wassermolekülen ist eine wichtige Voraussetzung, um die Wechselwirkung
zwischen Kofaktor und Polypeptidumgebung gezielt beeinﬂußen zu können. Ansonsten würden
beispielsweise elektrostatische Wechselwirkungen, die im Design der de novo synthetisierten Pro-
100
5. Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle
teine eingeplant wurden, kompensiert.
Neben dem Austausch einzelner Aminosäuren ist auch eine Veränderung des Kofaktors
möglich. In dieser Arbeit wurde neben Hämin auch Co(III)PPIX und Zn(II)PPIX in ein Polypeptidmodul eingebaut. Durch den Austausch von Fe3+ gegen Zn2+ als Zentralmetallion
konnten neue Eigenschaften in die künstlichen Proteinmodelle eingeführt werden. So läßt sich
Zn(II)PPIX als Donator für lichtinduzierte Elektronentransferprozesse einsetzten. Nach einer
Charakterisierung des optisch angeregten Triplettzustandes des Zn(II)PPIX mittels optischer
und EPR-Spektroskopie, wurde der Elektronentransfer zwischen dem eingebauten Zn(II)PPIX
und einem Chinon, das in die Lösung zugesetzt wurde, nachgewiesen. Zur Weiterentwicklung der
Systeme bietet sich die feste Fixierung des Elektronenakzeptors im Vier-Helix-Bündel an. Der
Abstand und die Orientierung der beiden Reaktionspartner könnte dann kontrolliert und gezielt
verändert werden, mit dem Ziel mechanistische Untersuchungen zu Elektronentransferprozessen
in Polypeptidumgebungen durchzuführen. Hierzu müsste jedoch zunächst eine Bindungstasche
für das Chinon entworfen und realisiert werden. Der in dieser Arbeit gezeigte Einbau des Elektronendonators Zn(II)PPIX ist ein wichtiger Schritt für neue Modellsysteme für lichtinduzierte
Elektronentransferprozesse, die eine essentielle Funktion in biologischen Prozessen, wie z. B. der
Photosynthese, einnehmen.
Kapitel 6
Magnetische Resonanz
Untersuchungen an Cytochrom b
Modellen
Dieses Kapitel behandelt die Charakterisierung von de novo synthetisierten Hämproteinen mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie. Diese Methoden der magnetischen Resonanzspektroskopie wurden bereits erfolgreich zur Aufklärung der Struktur und Funktion natürlicher Hämproteine eingesetzt [108,191]. Zur Charakterisierung von de novo synthetisierten Hämproteinen wurde
bislang die EPR-Spektroskopie [11,12,76], nicht jedoch die ENDOR-Spektroskopie herangezogen.
In dieser Arbeit wird die Kombination beider Techniken angewandt mit dem Ziel, eine möglichst
detaillierte Beschreibung der Einbausituation des redoxaktiven Kofaktors in den de novo synthetisierten Hämproteinen zu erhalten. Die Auswertung der EPR-Spektren schließt in dieser Arbeit
die Simulation der EPR-Linienbreiten und die Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte mit
ein und geht damit über die bisherigen qualitativen Interpretationen der EPR-Spektren de novo
synthetisierter Hämproteine hinaus.
Im ersten Abschnitt wird kurz der Aufbau der de novo synthetisierten Hämproteine beschrieben, die nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc1 Komplexes entworfen wurden.
Der Schwerpunkt des Kapitels liegt auf der EPR- und ENDOR-spektroskopischen Charakterisierung der Systeme. Insbesondere wird dabei auch der Einﬂuß unterschiedlicher Designkonzepte
auf die Bindungssituation des Häminkofaktors untersucht. Neben Metmyoglobin, in welchem
101
102
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
die Hämgruppe mit Imidazol ligandiert wurde, werden auch isotopenmarkierte Modellkomplexe als Vergleichsysteme herangezogen. In den EPR-Spektren werden der Spin-Zustand, die gTensorhauptwerte und die Linienbreiten analysiert, um die Koordinationssphäre des Hämins zu
beschreiben. Die Ermittlung der Hyperfeinwechselwirkungsparameter von Protonen und Stickstoﬀkernen aus den ENDOR-Spektren liefert darüberhinaus detaillierte Strukturinformationen
zum Abstand und der räumlichen Anordnung der axialen Liganden des Hämins.
6.1
Designkonzept der Cytochrom b Modelle
Die de novo synthetisierten Hämproteine, die in diesem Kapitel untersucht werden, wurden
nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc1 Komplexes modelliert. Der Cytochrom
bc1 Komplex übernimmt als elektronenvermittelnder Enzymkomplex eine wichtige Funktion in
der mitochondrialen und bakteriellen Atmungskette, sowie in der Elektronentransportkette der
Photosynthese von Bakterien [192]. Der Elektronentransport über den Cytochrom bc1 Komplex
ist an die Ausbildung eines elektrochemischen Potentialgradienten gekoppelt, der die Synthese
von ATP antreibt [193,194]. Der Kern der Cytochrom b Untereinheit wird von vier transmembranen Helices (A, B, C und D) gebildet. Er enhält zwei Hämgruppen, die von den beiden Helices B
und D über je zwei Histidinreste gebunden werden. Die kompakten Hämbindungstaschen im hydrophoben Innenraum der Cytochrom b Untereinheit bieten sich optimal zur Modellierung eines
künstlichen Vier-Helix-Bündels an. In den de novo synthetisierten Hämproteinen sollen dabei
wesentliche Merkmale des hydrophoben Kerns der Cytochrom b Untereinheit erhalten bleiben.
Die Außenschicht des Vier-Helix-Bündels wird im Design dagegen von hydrophilen Aminosäuren
gebildet, um ein wasserlösliches Modellsystem für Cytochrom b herzustellen.
In Abbildung 6.1 ist eine schematische Darstellung der drei Cytochrom b Modelle gezeigt,
die in diesem Kapitel untersucht werden. Das modulares Protein MOP (A) ist ein Templatassoziiertes synthetisches Protein [13, 82]. Vier helicale Bausteine werden auf einem zyklischen
Dekapeptid zu einem Vier-Helix-Bündel verknüpft. Die de novo Proteine [α(H1)–α(H2)]2 (B)
und ‘maquette’ (C) beruhen auf einem anderen Designkonzept [11,128]. Hier werden jeweils zwei
Helices über einen Loop aus den Aminosäuren G-P-N-G (B) oder eine Cysteinbrücke (C) zu Dimeren verknüpft, die sich zu Vier-Helix-Bündeln zusammenlagern. Die Orientierung der beiden
Dimerhälften zueinander wird dabei von den Wechselwirkungen zwischen den Helices bestimmt
6.1 Designkonzept der Cytochrom b Modelle
103
A
B
C
S
S
S
S
Abbildung 6.1: Schematische Darstellung der Cytochrom b Modelle MOP (A), [α(H1)–α(H2)]2
(B) und ‘maquette’ (C). Die Helices sind als Tonnen dargestellt, wobei die Pfeile vom N- zum
C-Terminus zeigen. Das Designkonzept des modularen Protein MOP (A) entspricht einem Templatassoziierten synthetischen Protein. Die hämbindendende Helix H1 und die abschirmende Helix H2
werden antiparallel auf einem zyklischen Peptid, das als Templat dient, ﬁxiert. Bei [α(H1)–α(H2)]2
(B) werden die beiden Helices H1 und H2 mit einem Loop verknüpft. Durch Aggregation dieser
Dimere bildet sich ein Vier-Helix-Bündel. Das ‘maquette’ (C) enthält nur einen Helixtyp. Hier erfolgt
die Verknüpfung zu Dimeren durch Cysteinbrücken. Während das MOP (A) und [α(H1)–α(H2)]2
(B) je zwei bis-Histidin-Bindungstaschen für Hämin enthalten, besitzt das ‘maquette’ (C) vier bisHistidin-Bindungstaschen, die jedoch in der hier untersuchten Probe im Mittel nur etwa zweifach
besetzt sind.
104
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
und ist nur bedingt vorhersagbar. Abbildung 6.1 (B,C) zeigt nur eine mögliche Ausrichtung
dieser Dimere im Vier-Helix-Bündel zueinander. Im Gegensatz dazu werden beim MOP die Orientierung aller helicalen Bausteine über ihre Vernetzung mit einem zyklischen Dekapeptid als
Templat eindeutig festgelegt. Das MOP und [α(H1)–α(H2)]2 enthalten zwei verschiedene Helixtypen, eine hämbindende Helix H1 und eine abschirmende Helix H2. Die hämbindende Helix
H1 orientiert sich an den Helices B und D des Kerns der Cytochrom b Untereinheit. Die andere
Helix H2 wurde nach den Helices A und D des natürlichen Hämproteins modelliert. Die Aminosäuresequenzen von H1 und H2 sind für MOP und [α(H1)–α(H2)]2 identisch. Das ‘maquette’
enthält im Unterschied zum MOP und [α(H1)–α(H2)]2 nur einen Helixtyp, der nach den Helices
B und D der Cytochrom b Untereinheit entworfen wurde. Die Aminosäurezusammensetzung der
Helix des hier untersuchten ‘maquettes’ entspricht der Sequenz von Robertson et al. [11] bis
auf den Austausch eines Leucins (L) gegen ein Lysin (K) an Position 28. Tabelle 6.1 gibt die
Aminosäurezusammensetzung der einzelnen Helices der Cytochrom b Modelle wieder.
Die Stabilisierung der Vier-Helix-Bündel folgt in allen drei Systemen gemeinsamen Prinzipien. Die Zusammensetzung der Aminosäuren wird so gewählt, daß sich amphiphile Helices
ausbilden. Der Ausschluß von Wasser durch Bildung eines hydrophoben Innenraums wird zur
treibenden Kraft der Zusammenlagerung der de novo Proteine. Im Innenraum der Vier-HelixBündel ﬁndet man die hydrophoben, apolaren Aminosäuren Leucin (L) und Alanin (A), die
eine hohe Helixbildungstendenz aufweisen [195, 196]. Die polaren und geladenen Aminosäuren
Glutamat (E) und Lysin (K) bilden die hydrophile Außenschicht. Sie wurden bevorzugt in einem
Abstand von vier Aminosäuren positioniert, um Salzbrücken auszubilden. Die Dipolmomente der
Salzbrücken sind entgegengesetzt zum Helixdipol ausgerichtet und stabilisieren damit die Helix
(siehe auch Abschnitt 5.1).
Der Einsatz zweier verschiedener Helices in MOP und [α(H1)–α(H2)]2 bietet im Vergleich
zum Design des ‘maquettes’ vielfältigere Möglichkeiten zur Konzeption der Vier-Helix-Bündel.
Dies ist insbesondere bei der Modellierung der Hämbindungstaschen von Vorteil. So enthalten
MOP und [α(H1)–α(H2)]2 dem natürlichen System entsprechend nur zwei Häminbindungsstellen. Während das Peptid H1 die Histidinreste zur Koordination des Hämins bereitstellt, soll H2
die Hämbindungstasche vom Lösungsmittel Wasser abschirmen. Im natürlichen Cytochrom b
liegen den Histidinliganden je zwei Glycinreste gegenüber [192]. In den Modellsystemen wurden
die Aminosäuren Glycin ebenfalls so positioniert, daß sie sich im Vier-Helix-Bündel auf gleicher
6.2 EPR-Spektroskopie
105
Tabelle 6.1: Aminosäuresequenzen der helicalen Bausteine der Cytochrom b Modelle MOP, [α(H1)–
α(H2)]2 und ‘maquette’. Die Aminosäure Histidin (H), dient zur Koordination des Kofaktors Hämins.
Der Abstand der Histidine beträgt 14 Aminosäuren analog zum natürlichen Cytochrom bc1 Komplex
[192]. Außerdem wurden die stark konservierten Aminosäuren Phenylalanin (F) und Arginin (R) in
H1 (Position 15 und 25) und in die Helix des ‘maquettes’ (Position 17 und 27) eingeführt. Das
Phenylalanin trennt die beiden Hämbindungstaschen voneinander und Arginin kann die Ladung der
Propionsäuregruppe des Hämins abschirmen.
MOP und [α(H1)–α(H2)]2 :
5
10
15
20
25
H1:
G-G-E-L-R-E-L-H-E-K-L-A-K-Q-F-E-Q-L-V-K-L-H-E-E-R-A-K-K-L
H2:
L-E-E-L-W-E-E-G-E-E-L-A-K-K-L-Q-E-A-L-E-K-G-K-K-L-A-K
‘maquette’:
C-G-G-G-E-L-W-K-L-H-E-E-L-L-K-K-F-E-E-L-L-K-L-H-E-E-R-K-K-K-L
5
10
15
20
25
Höhe zum Histidin beﬁnden. Dabei wird H2 antiparallel zu H1 ausgerichtet. Das ‘maquette’
enthält insgesamt vier Häminbindungsstellen, wobei in der hier untersuchten Probe im Mittel
nur zwei mit Hämin besetzt sind.
6.2
EPR-Spektroskopie
Die Hämgruppe ist in ihrer oxidierten Form paramagnetisch und kann damit als EPRspektroskopische Sonde zur Charakterisierung der de novo synthetisierten Hämproteine eingesetzt werden. Die EPR-Spektren der de novo Proteine werden dabei dem Hämprotein
Metmyoglobin-Imidazol (MbIm) gegenübergestellt.
6.2.1
Simulation der EPR-Spektren
Abbildung 6.2 zeigt die X-Band cw-EPR-Spektren der Cytochrom b Modelle und MbIm. Die
EPR-Spektren zeigen deutliche low-spin Fe3+ -Signale mit g-Tensorwerten bei gz = 2,9 bis 3,0, gy
106
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
= 2,3 und gx = 1,5 (siehe Tabelle 6.2). Im EPR-Spektrum des MOP (A) ist bei g 3,5 noch eine
Schulter zu sehen, die wie in Kapitel 5.3.4 erläutert wurde, diagnostisch für eine HALS-Spezies
(hoch anisotrope low-spin Spezies) ist. Die schwachen Signale bei g = 4,3 sind rhombischem
Eisen [197] und bei g = 2,0 weiteren paramagnetischen Verunreinigungen zuzuordnen. Bei g =
6,0 sieht man das g⊥ -Signal einer high-spin Fe3+ -Spezies, deren g|| -Signal bei g = 2,0 teilweise
von den paramagnetischen Verunreinigungen verdeckt wird. Die high-spin Spezies tritt in allen
Systemen in vernachlässigbar geringer Menge auf (< 1%).
Die Detektion des low-spin Zustandes in allen drei Cytochrom b Modellen stellt einen eindeutigen Nachweis für den speziﬁschen Einbau der Hämgruppen über eine starke axiale Koordination
mit zwei Histidinliganden dar. Wenn nur schwache Liganden zur Koordination zur Verfügung
stehen, wie z.B. bei freiem Hämin in wäßriger Lösung [119] oder wenn nur ein Histidinligand
an das Hämin koordiniert ist, wie in Metmyoglobin [100], so tritt der high-spin Zustand auf.
Bindet man eine zweite Imidazolgruppe als sechsten Ligand der Hämgruppe [198], so ﬁndet ein
Übergang zum low-spin Zustand statt [115], wie er auch in Abbildung 6.2 (D) beobachtet wird.
Die EPR-Spektren wurden mit dem in Abschnitt 4.4.1 beschriebenen Simulationsprogramm
ELSI ausgewertet. Die relativ großen Linienbreiten, die bei den de novo synthetisierten Hämproteinen in der Größenordnung von 10 mT liegen, konnten nur mit dem g-strain Mechanismus
plausibel wiedergeben werden. Dieser Mechanismus wird auch als die Hauptursache für die
Linienverbreiterung in EPR-Spektren natürlicher Hämproteine angesehen [139, 199]. Elektronenspinrelaxation oder unaufgelöste Hyperfeinwechselwirkungen können als Ursache der Linienverbreiterung ausgeschlossen werden. Bei einer Linienbreite von 10 mT müsste die Elektronenspinrelaxationszeit im Bereich weniger ns liegen oder es müssten Hyperfeinwechselwirkungen in
einer Größenordnung von 280 MHz auftreten. Dies ist jedoch im Widerspruch zu den weiter unten beschriebenen Puls-ENDOR-Experimenten. Die Hyperfeinwechselwirkungen, die dort für die
low-spin Fe3+ -Komplexe ermittelt wurden, liegen alle unterhalb von 10 MHz. ElektronenspinEcho-Experimente, die zur Optimierung der Puls-ENDOR-Sequenz durchgeführt wurden, zeigen, daß die transversale Elektronenspinrelaxationszeit im Temperaturbereich der EPR- und
ENDOR-Messungen (5 – 20 K) über 100 ns betragen muß.1
Nach dem g-strain Mechanismus führen strukturelle Variationen in der Umgebung einer
1
Zur Unterscheidung der longitudinalen und transversalen Elektronenspinrelaxationszeit (T 1 und T 2) siehe [87]
oder auch Seite 133.
6.2 EPR-Spektroskopie
107
Abbildung 6.2: X-Band cw-EPR-Spektren der de novo synthetisierten Hämproteine MOP (A),
[α(H1)–α(H2)]2 (B), ‘maquette’ (C) und Metmyoglobin–Imidazol (MbIm D). Die Simulation der
Fe3+ low-spin Spektren ist in gestrichelten Linien gezeigt und beruht auf einem g-strain Mechanismus
zur Linienverbreiterung (siehe Abschnitt 4.4.1). Die Simulationsparameter sind in Tabelle 6.2 zu
ﬁnden.
108
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
Tabelle 6.2: EPR-Daten der künstlichen Hämproteine und Metmyoglobin-Imidazol (MbIm) aus Abbildung 6.2. Die g-Tensorhauptwerte gi (i = x,y,z) und Linienbreitenparameter σgi wurden aus der
Simulation der EPR-Spektren erhalten. Zur Wiedergabe der spektralen Formen des EPR-Spektrums
des MOP mußte die Simulation aus mehreren Spezies zusammengesetzt werden. Die Ligandenfeldparameter V /λ und ∆/λ folgen aus der Analyse der g-Tensorhauptwerte [117].
g-Tensorwerte
Linienbreite
Ligandenfeldparameter
gz
2,97
σgz
0,06
V/λ
1,84
low-spin
gy
2,27
σgy
0,03
∆/λ
3,27
(30 %)
gx
1,51
σgx
0,08
V/∆
0,56
gz
3,12
σgz
0,07
V/λ
1,69
low-spin
gy
2,27
σgy
0,03
∆/λ
3,54
(16 %)
gx
1,51
σgx
0,08
V/∆
0,48
gz
3,25
σgz
0,12
V/λ
0,98
HALS
gy
2,00
σgy
0,42
∆/λ
2,42
(40 %)
gx
0,82
σgx
0,42
V/∆
0,40
gz
3,60
σgz
0,06
V/λ
0,87
HALS
gy
2,00
σgy
0,42
∆/λ
2,76
(14 %)
gx
0,82
σgx
0,42
V/∆
0,31
gz
2,95
σgz
0,04
V/λ
1,85
gy
2,24
σgy
0,02
∆/λ
3,41
gx
1,51
σgx
0,04
V/∆
0,54
gz
2,92
σgz
0,03
V/λ
1,95
gy
2,28
σgy
0,02
∆/λ
3,27
gx
1,54
σgx
0,04
V/∆
0,60
gz
2,96
σgz
0,05
V/λ
1,85
gy
2,26
σgy
0,02
∆/λ
3,32
gx
1,51
σgx
0,04
V/∆
0,56
MOP
[α(H1)-α(H2)]2
‘maquette’
MbIm
6.2 EPR-Spektroskopie
109
paramagnetischen Spezies zu einer Verbreiterung der EPR-Signale. Bei den hier untersuchten
Häminkomplexen kann man sich dazu ein Ensemble vieler verschiedener Subspezies vorstellen,
die sich in der Geometrie der axialen Ligandierung und damit auch in ihren g-Tensorhauptwerten
unterscheiden. In dem hier verwendeten g-strain Modell werden die strukturellen Variationen
durch eine statistische Verteilung der g-Tensorhauptwerte der paramagnetischen Probe beschrieben [133]. Die EPR-Linienbreite wird damit durch eine Gaußsche Normalverteilung der
g-Tensorhauptwerte gi mit den Standardabweichungen σgi bestimmt. In Tabelle 6.2 sind die
Simulationsparameter zusammengefaßt. Die σ-Werte von [α(H1)–α(H2)]2 und ‘maquette’ sind
dem natürlichen Hämprotein MbIm ähnlich. Das MOP zeigt demgegenüber deutlich breitere
Linien. Während für [α(H1)–α(H2)]2 , ‘maquette’ und MbIm die statistische Verteilung der gTensorhauptwerte einer einzigen regulären low-spin Spezies ausreichend zur Beschreibung der
strukturellen Heterogeneität ist, stößt das hier verwendete Modell zur Linienverbreiterung bei
der Simulation des EPR-Spektrums des MOP an seine Grenzen. Um die spektrale Form des
EPR-Spektrums korrekt wiederzugeben, mußte die Simulation aus insgesamt vier verschiedenen Spezies zusammengesetzt werden. Dieses Verfahren wurde auch bei den Polypeptidmodulen
Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2 in Kapitel 5 angewandt, die ebenfalls eine stark ausgeprägte Heterogeneität in ihren EPR-Spektren aufweisen.
Um die langgestreckte Schulter des HALS-Signals mit einem nahtlosen Anschluß zur gz Komponente des regulären low-spin Zustandes zu erhalten, wurden zwei HALS-Spezies eingesetzt, die durch ein ﬂaches gmax -Signal (g 3.0) und breite gx - und gy -Komponenten gekennzeichnet sind. Der leicht schräge Anstieg der breiten gz -Komponente des regulären lowspin Zustandes wurde aus zwei regulären low-spin Spezies zusammengesetzt. Die asymmetrische
Form der gy -Komponente, die an der Tieﬀeldseite eher spitz ist und an der Hochfeldseite breit
ausläuft, konnte in der Simulation jedoch nicht wiedergegeben werden. In der Simulation ist
die gy -Komponente des regulären low-spin Zustandes symmetrisch bezüglich ihres Nulldurchgangs. Für die gx - und gy -Komponenten der HALS-Spezies wurden typische Literaturwerte aus
Mößbaueruntersuchungen an Modellkomplexen eingesetzt [81,165]. In Mößbaueruntersuchungen,
die in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. F. Parak, Technische Universität München, an einem mit
57 Fe(III)PPIX
angereicherten MOP durchgeführt wurden, wurde ebenfalls neben der regulären
low-spin Spezies eine HALS-Spezies detektiert [81]. Die g-Tensorhauptwerte gz = 2,94, gy = 2,27,
gx = 1,52 (regulärer low-spin, 56 %) und gz = 3,5, gy = 1,99, gx = 0,82 (HALS, 44 %), die diesen
110
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
beiden Spezies zugewiesen wurden, weichen etwas von den Ergebnissen der EPR-Spektren aus
Abbildung 6.2 ab. Aus beiden Untersuchungen folgt jedoch ein Mengenanteil von insgesamt etwa
50 (± 10) % HALS. Dieser relativ hohe Anteil der HALS-Spezies ist in Übereinstimmung mit
den EPR-Untersuchungen an den Modellkomplexen aus Abschnitt 5.3.4, welche bereits zeigten,
daß sich hinter einer relativ ﬂachen Schulter ein beachtlicher Mengenanteil einer HALS-Spezies
verbergen kann.
Im folgenden sollen die strukturellen Ursachen, die zu den unterschiedlichen g-Tensorwerten
der Cytochrom b Modelle und insbesondere zum Auftreten verschiedener Spezies im EPRSpektrum des MOP führen, näher untersucht werden.
6.2.2
Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte
Nach der Ligandenfeldanalyse von Taylor [117], die in Kapitel 3 vorgestellt wurde, besteht ein
direkter Zusammenhang zwischen den g-Tensorhauptwerten und der energetischen Aufspaltung
der besetzten d-Orbitale in low-spin Fe3+ -Komplexen. Eine schematische Darstellung der Aufspaltung der besetzten d-Orbitale ist in Abbildung 6.3 zu sehen. Dabei gibt ∆ die tetragonale
und V die rhombische Verzerrung des Komplexes ausgehend von einer oktaedrischen Idealgeometrie an. Das Koordinatensystem der d-Orbitale wird anhand der g-Tensorhauptachsen festgelegt.
EPR-Messungen an Einkristallen von low-spin Häminkomplexen und natürlichen Hämproteinen
zeigen, daß die gz -Achse parallel zur Häminnormalen und die gx - und gy -Achse in der Ebene des
Prophyrinringes liegen [108,109]. Damit ist festgelegt, daß das dxy -Orbital in der Porphyrinebene
liegt und dyz und dxz senkrecht auf der Porphyrinebene stehen [200, 201]. Die tetragonale Aufspaltung ∆ separiert das dxy -Orbital von den beiden anderen besetzten d-Orbitalen aufgrund der
unterschiedlichen Ligandenfeldstärken des Porphyrins und der axialen Liganden. Die rhombische
Aufspaltung V, die das dxz - und dyz -Orbital voneinander trennt, wird hauptsächlich durch die
Wechselwirkung dieser d-Orbitale mit dem π-System des axialen Liganden verursacht [201]. Sie
hängt stark von der relativen Orientierung der axialen Liganden ab. Stehen die beiden Histidinebenen parallel zueinander, wie in Abbildung 6.3 dargestellt, so geht nur das dyz -Orbital eine
Wechselwirkung mit dem π-System der axialen Liganden ein. Für diese Bindungssituation ist die
rhombische Aufspaltung maximal. Bei bis-Histidin-ligandiertem Hämin sind Werte bis V /λ 2 zu erwarten [165]. Bei bis-Histidin-ligandiertem Hämin mit stark verdrehten oder verkippten
Histidinebenen nimmt die rhombische Aufspaltung deutlich ab, da bei einer senkrechten Stellung
6.2 EPR-Spektroskopie
111
z
d yz
V
N
d yz
d xz
∆
Fe
y
N
d xy
Abbildung 6.3: Links: Aufspaltung der drei untersten besetzten d-Orbitale in low-spin Fe3+ Komplexen. dxy ist von dxz und dyz durch die tetragonale Aufspaltung ∆ getrennt. dxz und dyz
sind durch die rhombische Aufspaltung V voneinander separiert. Rechts: Schematische Darstellung
eines bis-Imidazol-Hämin-Komplexes nach Ref. [200, 201]. Das halbbesetzte dyz -Orbital geht eine
Wechselwirkung mit dem π-System des axialen Liganden ein. In dieser idealisierten Darstellung steht
die gz -Achse senkrecht auf der Porphyrinebene. Die Ebenen der Histidinliganden sind zueinander
parallel und stehen senkrecht auf der gy -Achse.
der Histidinebenen zueinander sowohl das dyz - als auch das dxz -Orbital mit dem π-System der
axialen Liganden wechselwirken können. Wie mit Hilfe der Ligandenfeldanalyse gezeigt werden
konnte, geht für diese Orientierung der Wert V /λ gegen Null und die gz -Komponente erreicht
Werte bis gz = 3,8, wie sie diagnostisch für eine HALS-Spezies sind [165].
Abbildung 6.4 zeigt die beiden unterschiedlichen Bindungssituationen einer regulären lowspin Spezies und einer HALS-Spezies. Die relative Anordnung der axialen Liganden zueinander
hat sich bei der Ligandenfeldanalyse verschiedener Modellkomplexe als der wesentliche geometrische Faktor zur Beeinﬂussung der Ligandenfeldparameter und damit der g-Tensorhauptwerte
herausgestellt [165–168, 202, 203]. Innerhalb der regulären low-spin Spezies kann auch die Positionierung der Ebenen der Histidinliganden relativ zu den Stickstoﬀatomen des Porphyrinringes
einen Einﬂuß auf die g-Tensorhauptwerte und die Orientierung der gx - und gy -Achse innerhalb der Porphyrinebene nehmen (siehe Abbildung 6.11) [200,204]. Darüberhinaus können auch
Wasserstoﬀbrückenbindungen [201,205] und Verzerrungen des Porphyrinringes [200] die Lage der
g-Tensorhauptwerte zusätzlich beeinﬂussen. Dabei sollten sich Wasserstoﬀbrücken zum H-Atom
112
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
A
N
B
N
N
N
N
Fe
Fe
N
N
N
N
N N
Abbildung 6.4: Geometrische Anordnung der axialen Liganden von bis-Histidin-ligandiertem
Hämin. A: Für eine parallele Anordnung der beiden Ebenen der axialen Liganden erhält man eine
reguläre low-spin Spezies. B: Bei einer Verdrehung (oder Verkippung) der Histidinliganden resultiert
eine HALS-Spezies.
des nichtkoordinierenden Stickstoﬀatoms des Histidins in erster Linie auf die tetragonale Aufspaltung ∆ auswirken. Durch eine Deprotonierung des Histidins nimmt seine Ligandenfeldstärke
zu (siehe auch Abbildung 3.8), was sich in einer leichten Verkürzung des Bindungsabstandes zum
Fe3+ -Ion des Porphyrins äußert (circa 3%) [201].
Die Ergebnisse der Ligandenfeldanalyse der Cytochrom b Modelle sind ebenfalls in Tabelle
6.2 (in Einheiten der Spinbahnkopplungskonstante λ) zusammengefaßt. Die Ligandenfeldparameter der regulären low-spin Spezies sind typisch für bis-Histidin-ligandiertes Hämin mit in etwa
parallelen Histidinebenen [165]. Die tetragonale Aufspaltung ∆, die ein Maß für die Stärke der
axialen Liganden darstellt, liegt für alle untersuchten Systeme bei ∆/λ = 3,3 – 3,4. Die rhombische Aufspaltung V der regulären low-spin Spezies erreicht hohe Werte. Für [α(H1)–α(H2)]2
und MbIm liegt V /λ bei etwa 1,85. Dies entspricht auch in etwa der oberen Grenze für die
reguläre low-spin Spezies des MOP. Für das ‘maquette’ ist die rhombische Aufspaltung mit V /λ
= 1,95 besonders hoch und deutet auf eine nahezu perfekt parallele Orientierung der Histidinliganden hin. Die geringere rhombische Aufspaltung von MOP, [α(H1)–α(H2)]2 und MbIm zeigt
eine leichte Verdrehung der Histidinebenen gegeneinander an. Für MbIm wird dies durch die
6.2 EPR-Spektroskopie
113
Röntgenstruktur [198, 206] bestätigt.
Die Ligandenfeldparameter, die für die HALS-Spezies des MOP aus den g-Tensorhauptwerten
der EPR-Simulation berechnet wurden, sind im Einklang mit einer verdrehten und leicht verkippten Geometrie der Histidinliganden. So nimmt neben der rhombischen Aufspaltung (V/λ
= 0,87 – 0,98), die eine verdrehte Anordnung der Histidinebenen anzeigt, auch die tetragonale
Aufspaltung (∆/λ = 2,76 – 2,42) gegenüber den regulären low-spin Fe3+ -Komplexen ab, was
auf einen vergrößerten Abstand der axialen Histidinliganden durch eine verkippte Anordnung
hinweist.
Das MOP zeigt damit eine ausgeprägte strukturelle Heterogeneität in der Bindungssituation
der Häminkofaktoren. Neben einer Koordination mit nahezu parallelen Histidinebenen, wie sie
auch in den Cytochrom b Modellen ‘maquette’ und [α(H1)–α(H2)]2 gefunden wird, liegen auch
Konformere mit verdrehten Histidinebenen vor.
6.2.3
Untersuchungen zur HALS-Spezies des MOP
Um das Auftreten der HALS-Spezies im MOP näher zu untersuchen, wurden weitere EPRspektroskopische Versuche durchgeführt, die hier zusammengefaßt werden.
Um herauszuﬁnden, ob die reguläre low-spin Spezies und die HALS-Spezies simultan oder
sequentiell in das MOP eingebaut werden, wurde der Beladungsgrad des MOP mit Hämin variiert. Es wurden vier Proben benutzt, in denen das Verhältnis von Hämin zu den Bindungsstellen
im MOP 0,5:2, 1:2, 1,5:2 und 2:2 betrug. Die EPR-Spektren dieser Proben sind in Abbildung
6.5 zu sehen. Ihre spektrale Form ist nahezu identisch. Der Mengenanteil der HALS-Spezies ist
damit unabhängig von der Häminbeladung und liegt bei 50 ± 10 %.
Da das MOP zwei Bindungstaschen besitzt, liegt es bei einem HALS-Anteil von etwa 50 %
nahe zu vermuten, daß sich die beiden Bindungstaschen hinsichtlich der Einbausituation des
Kofaktors voneinander unterscheiden. In diesem Modell setzt der konstante Mengenanteil der
HALS-Spezies bei unterschiedlicher Häminbeladung voraus, daß die Bindungsaﬃnität der beiden
Häminbindungstaschen identisch ist.
Für das MOP wurden zwei Redoxpotentiale von −110 mV und −170 mV bestimmt [13].
Elektrochemische Messungen an einem MOP, das auf eine Goldoberﬂäche gekoppelt wurde, legen nahe, daß das Hämin in der Nähe des Templates das positivere Redoxpotential von −110 mV
aufweist [22]. Über die Korrelation der EPR-Signale mit dem Redoxpotential wäre eine Zuord-
114
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
Abbildung 6.5: X-Band cw-EPR-Spektren des MOP mit unterschiedlicher Häminbeladung. Das
Verhältnis von Hämin zu den Bindungsstellen im MOP beträgt 0,5:2 (A), 1:2 (B), 1,5:2 (C) und 2:2
(D).
nung zwischen der Einbausituation (HALS oder reguläre low-spin Spezies) zu einer der beiden
Bindungstaschen des MOP möglich. Diese Versuche sind bislang aufgrund der geringen Probenmengen jedoch noch nicht möglich.
Bei der Zuordnung der HALS-Spezies zu einer der beiden Bindungstaschen im MOP ist zu
beachten, daß in den EPR-Spektren der Polypeptidmodule Hämin-mMOP1 und Hämin-mMOP2
(Abschnitt 5.3.4) ebenfalls HALS und reguläre low-spin Signale auftreten, obwohl diese de novo
synthetisierten Hämproteine nur eine Bindungstasche besitzen. Dies zeigt, daß in den künstlichen
Vier-Helix-Bündeln die Faltung einer Bindungstasche bereits heterogen sein kann. Die HALS
und die reguläre low-spin Spezies könnten damit auch statistisch im MOP verteilt sein. Hier
wird jedoch angenommen, daß die Bindungssituation der HALS-Spezies mit verdrehten oder
verkippten Histidinliganden in erster Linie bei der templatnahen Bindungstasche auftreten wird.
Die Beweglichkeit der Helices ist in dieser Bindungstasche durch die Fixierung auf das Templat
6.2 EPR-Spektroskopie
115
stärker eingeschränkt als bei der weiter entfernten Bindungstasche.
Da die HALS-Signale bei Hämin-mMOP1 durch den Einsatz des chaotropen Agenz Gdn·HCl
eliminiert werden konnten (siehe Abbildung 5.11), wurde auch beim MOP der Einﬂuß von
Gdn·HCl auf die EPR-Spektren untersucht. Abbildung 6.6 zeigt dazu die EPR-Spektren des
MOP ohne Gdn·HCl (A) und mit 0.5 M Gdn·HCl (B, Simulation C). Bei einer Gdn·HCl Konzentration von 0.5 M ist die Faltung des Vier-Helix-Bündels MOP noch stabil [13]. Durch die
Zugabe an Gdn·HCl werden die regulären low-spin Fe3+ -Signale etwas schmaler. Es treten zwei
Abbildung 6.6: X-Band cw-EPR-Spektren des MOP ohne Zusatz von Gdn·HCl (A) und mit 0.5
M Gdn·HCl (B). Die Simulation (C) von Spektrum (B) enthält vier verschiedene Spezies: high-spin
Fe3+ (3 %), low-spin Fe3+ (67 %) und zwei HALS-Spezies mit gmax = 3,65 (20 %) und gmax = 3,20
(10 %).
116
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
getrenne HALS-Signale bei gmax = 3,65 und gmax = 3,20 auf. Auch beim MOP nimmt das
chaotrope Agenz Gdn·HCl Einﬂuß auf den Faltungszustand des Vier-Helix-Bündels. Es kommt
jedoch im Unterschied zu Hämin-mMOP1 nicht zu einer vollständigen Eliminierung der HALSSignale. Der Anteil an HALS-Spezies liegt im günstigsten Fall bei etwa 30 %. Bei einer weiteren
Zugabe an Gdn·HCl gewinnt das high-spin Fe3+ -Signal bei g = 6.0 an Intensität, was die Freisetzung des Kofaktors und damit die Entfaltung des Vier-Helix-Bündels anzeigt. In der Probe
mit 0.5 M Gdn·HCl liegt der Anteil der high-spin Spezies erst bei etwa 3 %.
Das Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine scheint besonders anfällig
für das Auftreten von HALS-Signalen und einer insgesamt eher heterogenen Bindungssituation
des Kofaktors zu sein, da dies sowohl für die Polypeptidmodule aus Kapitel 5 als auch für
das MOP festgestellt wurde. Außerdem treten die HALS-Signale ausschließlich in den EPRSpektren des MOP auf, obwohl die helicalen Bausteine von MOP und [α(H1)–α(H2)]2 identisch
sind (siehe Tabelle 6.1). In der abschließenden Diskussion dieses Kapitels in Abschnitt 6.4 werden
die Vor- und Nachteile der unterschiedlichen Designkonzepte der Cytochrom b Modelle einander
gegenübergestellt.
6.3
ENDOR-Spektroskopie
Ziel der ENDOR-spektroskopischen Untersuchung der Cytochrom b Modelle ist die Ermittlung von Hyperfeinwechselwirkungen zwischen dem ungepaarten Elektronenspin und benachbarten Kernspins. Bei den Cytochrom b Modellen sind
1H
und
14 N
ENDOR-Resonanz-
Signale des Hämin-Kofaktors und der axialen Histidinliganden zu erwarten. Von besonderem Interesse zur Charakterisierung der Einbausituation des Hämins ist die Identiﬁkation der
ENDOR-Resonanzen der axialen Liganden. Zur eindeutigen Zuordnung dieser Signale wurden
zunächst ENDOR-Messungen an isotopenmarkierten Modellkomplexen durchgeführt. Verschiedene Fe(III)-Porphyrinsysteme, wie Protoporphyrin IX (PPIX), Octaethylporphyrin (OEP) und
Tetraphenylporphyrin (TPP) wurden mit Imidazol ligandiert, welches entweder protoniert, deuteriert oder mit
15 N
markiert vorlag.
Da in allen hier untersuchten Systemen die ENDOR-Resonanzen der Stickstoﬀkerne und
Protonen deutlich voneinander getrennt sind, werden ihre ENDOR-Spektren im folgenden separat diskutiert. Dabei wird am Beispiel des ‘maquettes’ jeweils demonstriert, wie die ENDOR-
6.3 ENDOR-Spektroskopie
117
Resonanz-Signale der einzelnen Kernspins identiﬁziert und ausgewertet werden können. Darauf
aufbauend werden anschließend die ENDOR-Spektren aller Cytochrom b Modelle und MbIm
einander gegenübergestellt und diskutiert. Das ‘maquette’ wurde aus den Cytochrom b Modellen für eine ausführliche Analyse der ENDOR-Spektren ausgewählt, da es anhand der EPRspektroskopischen Charakterisierung den geringsten g-strain und damit eine deﬁnierte Einbausituationen des Kofaktors aufweist. Da mit der Puls-ENDOR-Spektroskopie im Vergleich zur
cw-ENDOR-Technik bei den de novo synthetisierten Hämproteinen eine bessere Auﬂösung erzielt wurde, werden im folgenden Puls-ENDOR-Spektren gezeigt. Die Puls-ENDOR-Spektren
wurden mit einer Davies-Puls-ENDOR-Sequenz aufgenommen [99], die in Abschnitt 3.2 vorgestellt wurde.
6.3.1
14
N und
15
N ENDOR-Spektroskopie
Abbildung 6.7 zeigt den
14 N
ENDOR-Bereich (1 – 5 MHz) der Puls-ENDOR-Spektren von
PPIX(Fe)Im+
2 (A, B) und dem ‘maquette’ (C). Die Spektren wurden in der Nähe der gz Feldposition (g = 2,93, 236,5 mT) aufgenommen. Der Modellkomplex PPIX(Fe)Im+
2 wurde mit
Imidazol hergestellt, dessen beide Stickstoﬀpositionen entweder mit 14 N (A) oder 15 N (B) besetzt
sind. Die Markierung des Modellkomplexes dient zur Unterscheidung der ENDOR-Resonanzen
der axialen Liganden von denen des Porphyrins. Die
14 N
und
15 N
Kerne besitzen einen ande-
ren Kernspin und einen anderen gN -Faktor, woraus unterschiedliche Resonanzpositionen in den
ENDOR-Spektren resultieren, die zu einer Identiﬁzierung der ENDOR-Signale führen sollten.
Das Puls-ENDOR-Spektrum des Komplexes mit
14 N
Imidazol (A) zeigt drei Signale bei 2,1
MHz, 3,0 MHz und 4,5 MHz (± 0,1 MHz). An der Flanke des relativ breiten Signals bei 2,1 MHz
ist bei etwa 1,6 MHz noch eine ﬂache Schulter zu sehen. Verwendet man 15 N markiertes Imidazol
so verschwindet der Peak bei 2,1 MHz in Spektrum (B). Damit muß dieses Signal von einem 14 N
Atom der axialen Imidazolliganden stammen. Die ENDOR-Resonanzen, die in beiden Spektren
bei 1,6 MHz, 3,0 MHz und 4,5 MHz auftreten, werden den
14 N
Atomen des Porphyrinsystems
zugeordnet. Neben den drei Signalen des Porphyringerüstes zeigt der mit 15 N markierte Komplex
eine ﬂache Schulter bei etwa 2,6 MHz. Außerdem ist das Signal bei 4,5 MHz im Vergleich zu
Spektrum (A) verbreitert. Es wird daher angenommen, daß ein ENDOR-Resonanz-Signal des
15 N
Imidazols, wie in Abbildung 6.7 skizziert, von der
überlagert wurde. Dem
15 N
14 N
ENDOR-Resonanz des Porphyrins
Imidazol werden ENDOR-Resonanzen bei 2,6 MHz und 4,6 MHz
118
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
(± 0,3 MHz) zugeordnet.
Die hier getroﬀenen Zuordnungen der Puls-ENDOR-Signale sind in Übereinstimmung
mit einer cw-ENDOR-Untersuchung an low-spin Fe(III)porphyrin-Komplexen von Scholes
et al. [207]. In dieser Arbeit wurde die Detektion der
durch die zusätzliche
15 N
15 N
Imidazol ENDOR-Resonanzen
Markierung des Porphyringerüstes in dem Komplex bis-Imidazol-
Fe(III)coproporphyrintetramethylester erreicht.
Für einen
14 N
Kernspin mit I = 1 sind an der gz -Feldposition vier Signale zu erwarten [207]:
ν = 1/2|Azz | ± 3/2|Qzz | ± ν14 N .
(6.1)
Azz und Qzz bezeichnen die Tensorwerte der Hyperfein- und Quadrupolwechselwirkung, die an
der gz -Kante ermittelt werden. Diese Werte sind nicht zwangsläuﬁg identisch mit den Hauptwerten der entsprechenden Tensoren. Aufgrund der hohen Symmetrie der Fe(III)porphyrinkomplexe
mit gz entlang der Häminnormalen, ist allerdings anzunehmen, daß für den Stickstoﬀkern des
axialen Imidazols tatsächlich die Az (bzw. Qz ) Hauptachse und für 14 N Porphyrin entsprechend
eine dazu orthogonale Komponente erhalten wird.
Die Aufspaltung der
14 N
ENDOR-Signale für das Porphyrin ist in Abbildung 6.7 eingezeich-
net. Für die Hyperfein- und Quadrupolwechselwirkung wurde |14 Azz |P or = 6,1 ± 0,2 MHz und
|14 Qzz |P or = 0,5 ± 0,2 MHz ermittelt. Die Larmorfrequenz der 14 N Kerne an der gz -Feldposition
ist ν14 N = g14 N βN B = 0,73 MHz.
Für die axialen Imidazolliganden konnte nur ein
14 N
ENDOR-Signal identiﬁziert werden.
Die Hyperfeinwechselwirkung kann jedoch indirekt über die Analyse der
Resonanzen des markierten Modellkomplexes abgeschätzt werden. Für
15 N
15 N
Imidazol ENDOR
mit einem Kernspin
von I = 1/2 liegen die ENDOR Resonanzfrequenzen an der gz -Feldposition bei:
ν = |1/2Azz ± ν15 N |.
(6.2)
Der Abstand der beiden 15 N ENDOR-Signale (bei 2,6 MHz und 4,6 MHz) entspricht der doppelten Larmorfrequenz der
15 N
Kerne ν15 N = g15 N βN B = 1,02 MHz. Damit ergibt sich nach Glei-
chung (6.2) eine Hyperfeinaufspaltung von |15 Azz |Im = 7,2 ± 0,4 MHz. Mit den magnetischen
Momenten von
15 N
und
14 N
(g15 N = −0, 566, g14 N = 0,403), mit welchen die Hyperfeinwechsel-
wirkung skaliert, ergibt sich |14 Azz |Im = 5,1 ± 0,3 MHz. Diese Hyperfeinwechselwirkung wird
6.3 ENDOR-Spektroskopie
119
Abbildung 6.7: 14 N Puls-ENDOR-Spektren von PPIX(Fe)Im2 (A, B) und dem ‘maquette’ (C) an
der Feldposition 236,5 mT, g = 2,93. Der Modellkomplex wurde mit
hergestellt. Die Aufspaltung der ENDOR-Resonanzen der
im Texte näher erläutert.
14
N und
15
14
N (A) und
15
N (B) Imidazol
N Kerne sind eingezeichnet und
120
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
dem Stickstoﬀkern des Imidazolliganden zugeordnet, der direkt an das Hämin koordiniert ist.
Für den weiter entfernten Stickstoﬀkern des Imidazols ist diese relativ hohe Hyperfeinwechselwirkung unwahrscheinlich [208]. Nach Gleichung (6.1) kann man ausgehend von der Peakposition
bei 2,1 MHz und der Hyperfeinwechselwirkung |14 Azz |Im = 5,1 ± 0,3 MHz auf zwei mögliche
Werte für die Quadrupolwechselwirkung zurückschließen. Es ergibt sich entweder |14 Qzz |Im =
0,77 MHz oder |14 Qzz |Im = 0,17 MHz. Die erste Möglichkeit mit |14 Qzz |Im = 0,77 MHz wird
hier vorgezogen, da sich mit diesem Wert ein ENDOR-Linienmuster ergibt, welches mit den experimentellen Spektren vereinbar ist. Die berechneten Linienpositionen liegen bei 0,7 MHz, 2,1
MHz, 3,0 MHz und 4,5 MHz. Die Linienpositionen bei 3,0 MHz und 4,5 MHz überlappen mit den
ENDOR-Resonanzen des Porphyrins. Das ENDOR-Signal bei 0,7 MHz ist schwer zu beobachten,
da ENDOR-Übergänge niedriger Frequenz meist eine geringere Intensität aufweisen [207]. So zeigen auch die ENDOR-Spektren aus Abbildung 6.7, daß sowohl bei 15 N Imidazol als auch bei den
14 N
Kernen des Porphyrins die ENDOR-Signale bei niedriger Frequenz schwächer und breiter
sind als die entsprechenden hochfrequenten Signale. Die Quadrupolwechselwirkung |14 Qzz |Im =
0,77 MHz entspricht außerdem einem e2 Qq/h Parameter von 2,3 MHz, der innerhalb des engen
Wertebereichs liegt, der für den koordinierenden Stickstoﬀkern in verschiedenen Imidazol-MetalKomplexen gefunden wurde [96, 208].
In diesem Abschnitt werden nur die ENDOR-Spektren gezeigt, die an der gz -Kante aufgenommen wurden. ENDOR-Messungen an anderen Feldpositionen wiesen noch stärkere Überlagerungen von ENDOR-Resonanzen auf, wobei die Beiträge des Porphyrinringes stark dominieren.
Dabei konnten keine weiteren ENDOR-Signale der axialen Liganden identiﬁziert werden. PulsENDOR-Messungen am Modellkomplex TPP(Fe)Im+
2 , der ebenfalls mit
14 N
und
15 N
Imidazol
hergestellt wurde und eine hohe Symmetrie aufweist, lieferten keine weitere Auﬂösung und damit
Zuordnungsmöglichkeit in den ENDOR-Spektren. Vielmehr wurden trotz der unterschiedlichen
Substituenten in der Peripherie des Porphyrins fast identische Signale wie für PPIX(Fe)Im+
2
erhalten. Aus der
14 N
ENDOR-Spektroskopie können damit nur eingeschränkte Informationen
zur axialen Ligandierung des Hämins erhalten werden.
Das ENDOR-Spektrum des ‘maquette’ (C) besitzt eine auﬀallend hohe Ähnlichkeit zum
Spektrum (A) des Modellkomplexes PPIX(Fe)Im+
2 mit
14 N
Imidazol. Die Zuordnung der
ENDOR-Signale wird daher direkt übernommen. Die hohe Ähnlichkeit in den ENDORResonanzen der Porphyrinstickstoﬀkerne zwischen dem Modellkomplex und dem de novo synthe-
6.3 ENDOR-Spektroskopie
121
tisierten Hämprotein zeigt, daß der Einbau des Hämins in die Polypeptidumgebung keinen signiﬁkanten Eﬀekt auf die Hyperfein- und Quadrupoltensoren und damit die elektronische Struktur
des Hämins hat. Der Vergleich der ENDOR-Spektren von PPIX(Fe)Im+
2 mit dem ‘maquette’
ermöglicht die Identiﬁkation eines
14 N
ENDOR-Signals des axialen Histidinliganden im de novo
synthetisierten Hämprotein. Auch die anderen Cytochrom b Modelle MOP und [α(H1)–α(H2)]2
sowie MbIm zeigen dieses
14 N
ENDOR-Signal des axialen Histidinliganden bei etwa 2,1 MHz
(± 0,1 MHz). Damit ist der Einbau des Kofaktors Hämin in den de novo Proteinen über die
axiale Histidinkoordination, auf welche schon aus den EPR-spektroskopischen Untersuchungen
geschlossen wurde, bestätigt.
6.3.2
6.3.2.1
1
H ENDOR-Spektroskopie
Identifizierung der ENDOR-Signale anhand von Modellkomplexen
Abbildung 6.8 zeigt 1 H Puls-ENDOR-Spektren des Modellkomplexes PPIX(Fe)Im+
2 , die an den
Feldstellen g = 2,85 (243 mT, A), g = 2,47 (280 mT, B), g = 2,28 (304 mT, C) und g = 1,54
(450 mT, D) aufgenommen wurden. PPIX(Fe)Im+
2 wurde mit protoniertem Imidazol (Spektren
in der oberen Spur) und deuteriertem Imidazol (jeweils untere Spur in A bis D) hergestellt. Die
1H
ENDOR-Resonanz-Signale liegen in etwa symmterisch zur Larmorfrequenz νH der Protonen
und zeigen eine starke Feldabhängigkeit. Die ENDOR-Spektren, die an der Feldposition g=2,85
nahe der gz -Kante des Komplexes aufgenommen wurden (A), werden von Signalen dominiert,
deren Linienaufspaltung unter 2 MHz liegt. Sie treten bei der Komplexierung des Hämins mit
protoniertem und deuteriertem Imidazol auf und sind damit den Protonen der Hämgruppe zuzuordnen. Die 1 H Puls-ENDOR-Spektren an den Feldstellen g = 2,47 (B) und g = 2,28 (C) zeigen
im Spektrum der protonierten Verbindung deutliche ENDOR-Signale mit Linienaufspaltungen
über 2 MHz. Da diese Signale im Spektrum des Modellkomplexes PPIX(Fe)Im+
2 mit deuteriertem Imidazol nicht auftreten, ist eine klare Zuordnung der Signale a/a’, b/b’ und c/c’ aus
Abbildung 6.8 zu den Protonen des axialen Imidazolliganden möglich. In den ENDOR-Spektren,
die an der Feldposition g = 1,54 nahe der gx -Kante aufgenommen wurden, sind ebenfalls Unterschiede zwischen den ENDOR-Spektren der protonierten und deuterierten Verbindung zu
erkennen. Die Zuordnung der Signale wird hier jedoch durch die geringere Linienaufspaltung
und die Überlagerung mit den ENDOR-Signalen des Hämins erschwert.
122
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
Abbildung 6.8: 1 H Puls-ENDOR-Spektren des Modellkomplexes PPIX(Fe)Im+
2 aufgenommen bei
g = 2,85, 234 mT (A), g = 2,47, 280 mT (B), g = 2,28, 304 mT (C) und g = 1,54, 450 mT (D).
Der Modellkomplex wurde mit protoniertem (obere Spur) und deuteriertem (untere Spur) Imidazol
hergestellt. ENDOR-Signale mit Hyperfeinaufspaltungen größer als 2 MHz (grau schraﬃert) treten
nur in den ENDOR-Spektren des Komplexes mit protoniertem Imidazol auf. Die Signale a/a’, b/b’
und c/c’ sind damit den Imidazolprotonen zuzuordnen. Die Larmorfrequenz der Protonen νH ist
10,35 MHz (A), 11,92 MHz (B), 12,94 MHz (C) und 19,16 MHz (D).
6.3 ENDOR-Spektroskopie
123
Neben PPIX(Fe)Im+
2 wurden weitere Modellkomplexe mit protoniertem und deuteriertem
+
1
Imidazol hergetellt, wie OEP(Fe)Im+
2 und TPP(Fe)Im2 . Ihre H Puls-ENDOR-Spektren zei-
gen im spektralen Bereich der Hyperfeinaufspaltungen über 2 MHz eine hohe Ähnlichkeit zu
PPIX(Fe)Im+
2 . So wurden an den Feldpositionen g = 2,47, 280 mT und g = 2,28, 304 mT
Signale detektiert, die den ENDOR-Resonanzen a/a’, b/b’ und c/c’ der Imidazolprotonen im
Modellkomplex PPIX(Fe)Im+
2 entsprechen. Scholes et al. [207] konnten durch selektive Deuterierung der Imidazolliganden von TPP(Fe)Im+
2 mittels cw-ENDOR-Spektroskopie zeigen, daß
die Signale a/a’ und c/c’ dem Imidazolproton H5 und b/b’ dem Imidazolproton H2 zuzuordnen
sind. Diese beiden Protonen (siehe Abbildung 6.10) besitzen den kürzesten Abstand zum Fe3+ Zentralmetallion des Porphyrins. Nach den Röntgentstrukturen von Modellkomplexen [209,210]
beträgt der Abstand zu Fe3+ für H2 und H5 etwa 3,25 Å, für H3 und H4 dagegen über 5 Å.
Die meso-Protonen2 des Porphyrins besitzen einen Abstand von etwa 4,5 Å zum Zentralmetallion [207]. Damit ist für H2 und H5 die stärkste Elektron-Kern Dipol-Dipol Wechselwirkung der
Protonen in den low-spin Fe3+ -Komplexen zu erwarten. Der große Einﬂuß dieser anisotropen
Wechselwirkung spiegelt sich in der ausgeprägten Feldabhängigkeit der ENDOR-Signale wieder.
Die ENDOR-Signale a/a’, b/b’ und c/c’ mit Aufspaltungen über 2 MHz werden daher den Protonen H2 und H5 des axialen Imidazolliganden zugeordnet. Die ENDOR-Signale der Imidazolprotonen H3 und H4 überlappen dagegen mit den ENDOR-Resonanzen der Porphyrinprotonen
mit geringerer Linienaufspaltung.
Da die ENDOR-Signale der Protonen H2 und H5 in den 1 H Puls-ENDOR-Spektren der
Modellkomplexe gut aufgelöst und eindeutig zu detektieren sind, werden sie im folgenden als
spektroskopische Sonde für die Charakterisierung der de novo synthetisierten Hämproteine eingesetzt. Über ihre dipolare Hyperfeinwechselwirkung sollen strukturelle Aussagen zur Bindungssituation des Hämins in den de novo synthetisierten Proteinen getroﬀen werden.
6.3.2.2
Analyse der 1 H ENDOR-Spektren des ‘maquette’
Abbildung 6.9 zeigt die 1 H Puls-ENDOR-Spektren des de novo synthetisierten Hämproteins
‘maquette’. Die Spektren wurden bei g = 2,93 (236,5 mT, A), g = 2,47 (280 mT, B) und g =
2,28 (304 mT, C) aufgenommen. In der Nähe der gx -Feldposition wurde kein Spektrum aufge2
Mit meso-Protonen werden die Protonen an den vier Methinbrücken zwischen den vier Pyrrolringen des
Porphyrins bezeichnet [211].
124
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
Abbildung 6.9: 1 H Puls-ENDOR-Spektren des ‘maquettes’ aufgenommen bei 236,5 mT, g = 2,93
(A), 280 mT, g = 2,47 (B) und 304 mT, g = 2,28 (C). Die ENDOR-Signale liegen in etwa symmetrisch
zur Larmorfrequenz der Protonen νH von 10,07 MHz (A), 11,92 MHz (B) und 12,94 MHz (C). Die
ENDOR-Resonanzen der Histidinprotonen H2 und H5 werden mit a/a’, b/b’ und c/c’ bezeichnet. Ihr
Beitrag zu den ENDOR-Spektren wurde simuliert (Spuren unterhalb der experimentellen Spektren
für H2 : · · ·, H5 : − − und die Addition der Beiträge von H2 und H5 : —).
6.3 ENDOR-Spektroskopie
125
nommen, da die geringe EPR-Intensität an dieser Feldposition zu einer extrem langen Aufnahmezeit der ENDOR-Spektren führen würde, um ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erzielen, das
mit den anderen Spektren in Abbildung 6.9 vergleichbar wäre. Die ENDOR-Untersuchungen der
Modellkomplexe zeigt, daß der hier gewählte Feldbereich zwischen gz und gy für die Detektion
der Signale der axialen Ligandenprotonen besonders gut geeignet ist.
Die ENDOR-Spektren des ‘maquette’ sind fast identisch mit denen des Modellkomplexes
PPIX(Fe)Im+
2 mit protoniertem Imidazol aus Abbildung 6.8. Allerdings sind in der Mitte der
1H
Puls-ENDOR-Spektren des ‘maquettes’ ENDOR-Signale der Proteinmatrix zu erkennen, die
oﬀensichtlich nicht beim Modellkomplex auftreten. Die ENDOR-Signale a/a’, b/b’ und c/c’, die
diagnostisch für die Protonen H2 und H5 des axialen Liganden sind, sind an den Feldstellen
g = 2,47 (B) und gy = 2,28 (C) klar zu erkennen. Um die Hyperfeinwechselwirkung dieser
beiden Protonen im ‘maquette’ zu analysieren, wird ihr Beitrag zu den ENDOR-Spektren in
Abbildung 6.9 simuliert. Das Simulationsprogramm SIMES, das für diesen Zweck erstellt wurde,
wurde bereits in Abschnitt 4.4.2 vorgestellt. Hier werden nur kurz die Parameter, die in die
Simulation eingehen, erläutert.
Maßgeblich für die Größe der dipolaren Hyperfeinwechselwirkung ist der Betrag r des Verbindungsvektors 6r zwischen dem Proton und dem Fe3+ -Zentrum. Dabei wird in der hier verwendeten
Punkt-Dipol-Näherung angenommen, daß der Elektronenspin am Fe3+ -Kernort lokalisiert ist.
Abbildung 6.10 zeigt am Beispiel des Protons H2 , wie die Position des Protons zur Berechnung
der dipolaren Hyperfeinwechselwirkung zwischen Elektronen- und Kernspin im Koordinatensystem des g-Tensors festgelegt wird. Dabei ist ψ2 der Winkel zwischen dem H2 -Fe Abstandsvektor
r62 und der gz -Achse. φ2 gibt den Winkel zwischen der gx -Achse und der Projektion von r62 in
die gx – gy Ebene an.
Um konkrete Strukturaussagen zur axialen Koordination des Hämins im ‘maquette’ treﬀen
zu können, müssen die g-Tensorhauptachsen in Beziehung zum molekularen Koordinatensystem
der low-spin Fe3+ -Komplexe gesetzt werden. Wie bereits in Abschnitt 6.2 erwähnt wurde, ist
aus EPR-Messungen an Einkristallen bekannt, daß in low-spin Häminkomplexen die gz -Achse
parallel zur Hämnormalen zeigt und die beiden anderen g-Tensorhauptachsen in der Porphyrinebene liegen [108, 109, 115]. Mit der Annahme, daß diese allgemeinen Merkmale von low-spin
Häminkomplexen auch auf das ‘maquette’ zutreﬀen, können die Winkel ψ und φ, die aus der
Simulation der ENDOR-Spektren erhalten werden, direkt in die Struktur des Häminkomplexes
126
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
übertragen werden.
Die Simulationsparameter, die für die Histidinprotonen H2 und H5 ermittelt wurden, sind
in Tabelle 6.3 zusammengefaßt. Da der Abstand r zwischen dem Proton und dem ungepaarten Elektronenspin die Größe der Linienaufspaltungen sehr stark beeinﬂußt, kann dieser Wert
mit einer relativ hohen Genauigkeit von ± 0,10 Å bestimmt werden. Die Feldabhängigkeit der
ENDOR-Spektren wurde eingesetzt, um die Winkel ψ und φ zu ermitteln. Die ENDOR-Spektren
aus Abbildung 6.9 wurden alle mit den Werten ψ2 = 45◦ , φ2 = 20◦ und ψ2 = 45◦ , φ2 = 200◦
simuliert. Die Genauigkeit der Ermittling der Winkelparameter kann auf ± 5◦ abgeschätzt werden, da der feldabhängige Verlauf der ENDOR-Spektren nur innerhalb dieses Wertebereiches
gut wiedergegeben werden konnte.
Die Simulation der Beiträge von H2 und H5 zu den ENDOR-Spektren des ‘maquettes’ ist
in Abbildung 6.9 gezeigt. An der Feldposition g = 2,93 (A) ist der Beitrag von H2 und H5
gz
H
3
N
H2
5H
N
r2
gy
ψ2
Fe
H
N
ε2
δ
gx
φ2
H
1
N
H
Abbildung 6.10: Koordination von Hämin mit zwei Histidinresten. Die Position des Histidinprotons
H2 im Koordinatensystem des g-Tensors wird durch den Abstand r vom Fe3+ -Ion und die Winkel
2
ψ2 und φ2 festgelegt.
6.3 ENDOR-Spektroskopie
127
Tabelle 6.3: Simulationsparameter für die Histidinprotonen H2 und H5 der ENDOR-Spektren des
‘maquettes’ aus Abbildung 6.9. Die geometrischen Parameter r, ψ und φ sind in Abbildung 6.10 am
Beispiel von H2 deﬁniert, a gibt die isotrope Fermi-Kontakt-Wechselwirkung an.
iso
H2
H5
r
3,25 ± 0,10 Å
3,25 ± 0,10 Å
ψ
45◦ ± 5◦
45◦ ± 5◦
φ
20◦ ± 5◦
200◦ ± 5◦
aiso
−1, 1 ± 0,2 MHz
−0, 3 ± 0,2 MHz
kaum zu detektieren. Hier zeigt die Simulation einen ﬂachen Peak, der unsymmetrisch zur Larmorfrequenz liegt.3 Die Signale von H2 und H5 sind an der Feldposition g = 2,47 (B) dagegen
deutlich zu erkennen und liegen im ENDOR-Spektrum und seiner Simulation symmetrisch zur
Larmorfrequenz der Protonen. In Spektrum (C) an der Feldposition g= 2,28 nimmt die Linienaufspaltung der Histidin-Signale im Vergleich zu Spektrum (B), das bei g = 2,47 erhalten
wurde, ab. Außerdem erscheinen die Signale auf der Seite der niedrigen Frequenz etwas ﬂacher
und breiter. Diese Merkmale werden ebenfalls in der Simulation reproduziert.
Die geometrischen Parameter r, ψ und φ für H2 und H5 sind sich sehr ähnlich. Damit ergibt
sich eine symmetrische Bindungssituation mit einer fast identischen dipolaren Wechselwirkung
für die beiden Histidinprotonen. In den ENDOR-Spektren werden jedoch unterschiedliche Linienpositionen für H5 und H2 beobachtet. Ursache für diese Separation ist eine unterschiedliche isotrope Fermi-Kontakt-Wechselwirkung, wobei |aiso (H2 )| > |aiso (H5 )|. In Übereinstimmung mit
der cw-ENDOR-spektroskopischen Untersuchung an selektiv deuteriertem TPP(Fe)Im+
2 [207]
werden die Linienpositionen a/a’ und c/c’ dem Proton H5 und b/b’ dem Proton H2 zugeordnet.
Anhand von Simulationen mit dem Programm SIMES kann demonstriert werden, wie mit der
Erhöhung des Betrages von |aiso | die Separation der Peaks a/a’ und c/c’ abnimmt bis – wie für
H2 – nur noch ein Peak (b/b’) auftritt.
Zunächst mag der Unterschied in der isotropen Fermi-Kontakt-Wechselwirkung für H2 und
H5 erstaunen. Es ist jedoch zu beachten, daß aufgrund des zweiten Stickstoﬀatoms im Imi3
Die unsymmetrische Lage der Peakposition relativ zur Larmorfrequenz ist auf die Berücksichtigung der zweiten
Ordnung in der Berechnung der Hyperfeinwechselwirkung zurückzuführen (siehe Abschnitt 4.4.2).
128
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
dazolring keine Symmetriebeziehung (z. B. in Form einer Spiegelebene) zwischen H2 und H5
besteht. Vielmehr ist anzunehmen, daß sich der Unterschied in der isotropen Hyperfeinkopplung direkt in der elektronischen Struktur des π-Systems des Histidinliganden wiederspiegelt.
In low-spin Häminkomplexen beﬁndet sich die ungepaarte Elektronenspindichte hauptsächlich
in dem dyz Orbital des Fe3+ . Dieses kann mit dem π-System des Imidazolringes eine π-Ligand
→ d-Metall Wechselwirkung eingehen [201] (siehe auch Abbildung 6.3 zur Ligandenfeldanalyse
der g-Tensorhauptwerte). Die ungepaarte Elektronenspindichte erreicht das 1s-Orbital von H2
oder H5 über die indirekte Spinpolarization. Der höhere Betrag von |aiso (H2 )| zeigt dabei eine
höhere ungepaarte Elektronenspindichte in dem p -Orbital an, das zu H2 direkt benachbart
z
ist, während das zu H5 benachbarte pz -Orbital eine geringere ungepaarte Elektronenspindichte aufweist. Diese unterschiedliche Spindichteverteilung wurde auch in NMR-spektroskopischen
Untersuchungen an anderen Modellkomplexen und low-spin Hämproteinen gefunden [212, 213].
Im folgenden sollen die geometrischen Parameter, die aus der Simulation der ENDORSpektren des ‘maquette’ erhalten wurden, in Hinblick auf die Struktur der Koordination des
Häminkofaktors analysiert werden. Abbildung 6.10 skizziert eine Bindungssituation, in der die
2
Koordination des Hämins Über das N Atom des Histidins erfolgt. Diese Bindungssituation
ist in Einklang mit den geometrischen Simulationsparametern, die einen kurzen Abstand der
Protonen H2 und H5 von 3,25 ± 0,10 Å zum Zentralmetallion festlegt. Da zur Simulation der
ENDOR-Spektren ein Parametersatz mit den beiden Protonen H2 und H5 ausreichte, müssen
die beiden axialen Histidinliganden symmetrisch zueinander im gleichen Abstand zu Fe3+ liegen.
Ein unterschiedlicher Bindungsabstand müßte sich durch neue Linienaufspaltungen im ENDORSpektrum bemerkbar machen, da die Aufspaltung der ENDOR-Signale sehr stark vom Abstand
2
1
r abhängt. Neben dem N Atom stünde im Prinzip auch das Nδ Atom des Histidins zur Ko1
ordination von Hämin zur Verfügung. Eine Koordination über das Nδ Atom des Histidins kann
jedoch anhand der ENDOR Simulationsparameter ausgeschlossen werden, da sich in diesem Fall
nur ein Proton (H2 ) in direkter Nachbarschaft zum koordinierenden Stickstoﬀatom beﬁnden
würde, das zu den Linienaufspaltungen größer als 2 MHz beitragen könnte. Außerdem würde
1
eine Koordination über das Nδ Atom aufgrund der sterischen Hinderung des CH2 -Fragmentes
der Aminosäure zu einer verdrehten Anordnung der beiden Histidinebenen führen. Aus der
Ligandenfeldanalyse der g-Tensorhauptwerte des ‘maquettes’ wurde jedoch auf eine nahezu perfekt parallele Orientierung der beiden Histidinebenen zueinander geschlossen. Damit ist die
6.3 ENDOR-Spektroskopie
129
in Abbildung 6.10 skizzierte Bindungssituation sowohl in Einklang mit den Ergebnissen der
EPR-Spektroskopie als auch mit der Analyse der ENDOR-Spektren. In Röntgenstrukturen von
low-spin Metalloporphyrin-Modellkomplexen [201] wird ebenfalls häuﬁg eine parallele Anordnung der axialen Ligandenebenen gefunden. Dabei stehen die beiden Imidazolliganden über ein
Inversionszentrum zueinander in Beziehung. Nach den Ergebnissen der ENDOR-Simulationen
sind für die beiden Histidinliganden im ‘maquette’ zwei Orientierungen möglich. Die Ebenen der
Histidinliganden bilden einen Winkel von etwa 0◦ oder 180◦ (± 10◦ ) zueinander.
Unter der Annahme, daß die gz -Achse auch im ‘maquette’ parallel zur Häminnormalen
verläuft [108,109], können die geometrischen Simulationsparameter direkt in das molekulare Koordinatensystem der low-spin Häminkomlexe übertragen werden. Wie anhand Abbildung 6.10
2
2
zu sehen ist, entsprechen die Winkel ψ2 und ψ5 dann den Bindungswinkeln N -Fe-H2 und N Fe-H5 . Beide Bindungswinkel betragen 45◦ ± 5◦ , was mit einer symmetrischen Ligandierung, bei
2
der die N -Fe Verbindungsachse auf der Hämnormalen liegt, in Einklang ist. Aus den geometri2
schen Parametern r und ψ von H2 und H5 folgt ein Abstand der N -Fe Bindung von 2,0 ± 0,2
Å. Die Simulationsparameter φ2 = 20◦ ± 5◦ und φ5 = 200◦ ± 5◦ geben die Projektion des axialen
Liganden Histidin auf die Ebene des Porphyrinringes an. φ2 und φ5 unterscheiden sich um 180◦ ,
was für einen planaren Histidinring zu erwarten ist. Die Projektion des Histidinliganden auf den
Porphyrinring bildet einen Winkel von φ = 20◦ zur gx -Achse.
In low-spin Häminkomplexen wurde auf der Basis der Ligandenfeldanalyse eine Beziehung
zwischen der Lage der Histidinebene relativ zu den N-Fe-N-Verbindungsachsen des Porphyrinringes und der gx -Achse gefunden [204]. Abbildung 6.11 erläutert dieses Prinzip, welches hier
auf das ‘maquette’ angewandt wird. Wenn der axiale Ligand um einen Winkel +γ von einer der
N-Fe-N-Achsen des Porphyrins weggedreht wird (Rotation im Gegenuhrzeigersinn), so bildet
die gx -Achse einen Winkel von −γ zu derselben N-Fe-N-Achse (Rotation im Uhrzeigersinn). Der
Winkel φ = 20◦ , der aus der Simulation folgt, entspricht einem kleinen γ-Wert von 10◦ . Röntgenstrukturen von Metalloporphyrinsystemen zeigen, daß die axialen Imidazolligganden tatsächlich
eine ekliptische Position zur N-Fe-N-Verbindungsachse des Porphyrins bevorzugen [214]. Die Simulationsparameter der ENDOR-Spektren des ‘maquettes’ mit γ = 10◦ sind in Übereinstimmung
mit einer fast ekliptischen Position der axialen Histidinliganden zur N-Fe-N-Verbindungsachse
des Porphyrins.
130
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
gy
N
N
+γ
φ
N
gx
−γ
N
Abbildung 6.11: Projektion des axialen Histidinliganden auf die Porphyrinebene nach Ref. [204].
Wenn die Projektion des Histidins einen Winkel +γ (Drehung im Gegenuhrzeigersinn) mit einer der
N-Fe-N-Verbindungsachsen des Porphyrins einschließt, liegt die gx -Achse in einem Winkel von −γ
(Rotation im Uhrzeigersinn) zur selben N-Fe-N-Verbindungsachse. Der Winkel φ = 2 γ entspricht
dem Winkel zwischen der Projektion des Histidinliganden und der gx -Achse.
Anhand der ausführlichen Analyse der ENDOR-Spektren des ‘maquettes’ konnte gezeigt
werden, daß mit Hilfe der ENDOR-Spektroskopie detaillierte Strukturinformationen gewonnen
werden können. Die nun folgende Gegenüberstellung der ENDOR-Spektren der Cytochrom b
Modelle stützt sich auf die Ergebnisse dieser Analyse.
6.3.2.3
Gegenüberstellung der Cytochrom b Modelle
Abbildung 6.12 zeigt 1 H Puls-ENDOR-Spektren der Cytochrom b Modelle MOP (A), [α(H1)–
α(H2)]2 (B), ‘maquette’ (C) und von MbIm (D), die bei g = 2,28, 304 mT aufgenommen wurden.
Diese Feldposition entspricht in etwa dem gy -Wert der regulären low-spin Fe3+ -Komplexe der
Proben. Entscheidend für die Wahl der Feldposition war, daß ENDOR-Signale der axialen Histidinprotonen detektiert werden können und durch die hohe EPR-Intensität an gy ein gutes
Signal-zu-Rausch Verhältnis in den ENDOR-Spektren erzielt werden kann.
Die ENDOR-Spektren der Cytochrom b Modelle und MbIm zeigen deutliche Signale mit Linienaufspaltungen größer als 2 MHz. Dieser in Abbildung 6.12 grau unterlegte spektrale Bereich
ist, wie die ENDOR-Untersuchungen an den Modellkomplexen und dem ‘maquette’ zeigen, dia-
6.3 ENDOR-Spektroskopie
131
Abbildung 6.12: 1 H Puls-ENDOR-Spektren der Cytochrom b Modelle MOP (A), [α(H1)–α(H2)]2
(B), ‘maquette’ (C) und des Hämproteins MbIm (D). Die Spektren wurden an der Feldposition 304
mT, g = 2,28 aufgenommen. Dies entspricht einer Larmorfrequenz ν0 der Protonen von 12,94 MHz.
Die ENDOR Resonanzen der Histidinprotonen H2 und H5 sind grau unterlegt. Die Signale a/a’ und
c/c’ sind H5 zuzuordnen. Das Signal b/b’ stammt von H2 .
132
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
gnostisch für die axialen Histidinprotonen H2 und H5 . Die Linienaufspaltungen der Signalpaare
a/a’ und b/b’ liegen in allen Spektren bei etwa 2,5 ± 0,2 MHz und 3,2 ± 0,2 MHz. Die Intensität
des Signalpaares c/c’ ist jeweils deutlich schwächer als für a/a’ und b/b’. Seine Linienaufspaltung
liegt bei etwa 5,0 ± 0,3 MHz.
Die Detektion der axialen Histidinprotonen H2 und H5 in den ENDOR-Spektren von MOP
und [α(H1)–α(H2)]2 zeigt, daß das Hämin auch in diesen Cytochrom b Modellen über das
2
N Atom des Histidins koordiniert wird. Für MbIm ist aus Röntgenstrukturdaten bereits be2
kannt [198,206], daß der native Histidinligand ebenfalls über das N Atom an das Hämin bindet.
Der Vergleich der ENDOR-Spektren von MbIm mit den Cytochrom b Modellen bestätigt und
unterstützt damit die bereits getroﬀene Signalzuordnung in den de novo synthetisierten Hämproteinen.
Da die Aufspaltung der ENDOR-Linien innerhalb der Cytochrom b Modelle sehr ähnlich ist,
wird angenommen, daß sich die Histidinprotonen H2 und H5 in Analogie zum ‘maquette’ in
2
einem Abstand von etwa 3,25 ± 0,2 Å vom Zentralmetallion beﬁnden. Daraus wird ein FeN Bindungsabstand von etwa 2,0 ± 0,3 Å für die Cytochrom b Modelle MOP und [α(H1)–α(H2)]2
und für MbIm abgeschätzt. Aus der Röntgenstruktur von MbIm folgt ein Bindungsabstand von
2
2,04 Å für den FeN -Bindungsabstand des Histidins und von 2,17 Å für das Imidazol [198].
Trotz grundlegender struktureller Gemeinsamkeiten in der Bindungssituation des Hämins zeigen die ENDOR-Spektren der drei Cytochrom b Modelle auch Unterschiede an. So sind MOP und
[α(H1)–α(H2)]2 dem MbIm hinsichtlich der spektralen Form etwas ähnlicher als das ‘maquette’,
das wiederum stärker den einfachen Modellkomplexen gleicht. Die Signale a und b sind beim
MOP und [α(H1)–α(H2)]2 jeweils intensiver und schmäler als a’ und b’, wobei das Signal b besonders markant aus den Spektren hervortritt. Dabei zeigt das MOP (A) die schärfsten Linien
im ENDOR-Spektrum, obwohl es in den EPR-Spektren die größte Linienbreite anzeigt.
In der EPR-Spektroskopie konnte die Linienbreite durch die Simulation mit einem g-strain
Mechanismus zur Linienverbreiterung direkt als Maß für die Heterogeneität der Bindungssituation des Kofaktors herangezogen werden. In der ENDOR-Spektroskopie ist die Analyse der
Linienform jedoch deutlich komplexer. Es ist aber zu erwarten, daß eine ausgeprägte strukturelle Heterogeneität auch in ENDOR-Spektren zur Linienverbreiterung beiträgt, da sich Variationen in den Bindungswinkeln und Abständen der low-spin Fe3+ -Komplexe direkt auf die
Hyperfeinwechselwirkung und damit auf die ENDOR-Linienposition auswirken sollten. Aller-
6.3 ENDOR-Spektroskopie
133
dings hängt die Verteilung der ENDOR-Resonanzpositionen in der gefrorenen Lösung auch
entscheidend von den molekularen Orientierungen ab, die an einer bestimmten Feldposition
selektiert wurden. In Abhängigkeit von den konkreten strukturellen Parametern Ψ und Φ und
den g-Tensorhauptwerten erhält man mit einer Gaußfunktion konstanter Linienbreite mit dem
Programm SIMES eine unterschiedlich breite Auﬀächerung der ENDOR-Linienpositionen. Die
Linienform der ENDOR-Spektren wird daher hier nicht ausgewertet.
Der Vergleich zwischen dem EPR- und ENDOR- Spektrum des MOP weist auf eine spezielle
Anforderung der Puls-ENDOR-Spektroskopie hin. Das EPR-Spektrum des MOP zeigt im Unterschied zu den anderen hier untersuchten Systemen eine beträchtliche Menge einer HALS-Spezies
(etwa 50 % der Probe). ENDOR-Signale von Protonen der HALS-Spezies wurden jedoch nicht
beobachtet. Es wird daher vermutet, daß die HALS-Spezies aufgrund eines anderen Relaxationsverhalten im Vergleich zur regulären low-spin Spezies nicht zu den Puls-ENDOR-Spektren
beiträgt. Unterstützt wird diese Annahme durch cw-EPR-Untersuchungen zum Sättigungsverhalten der beiden verschiedenen Spezies im MOP. Die Signale der HALS-Spezies konnten im
Unterschied zur regulären low-spin Spezies auch unter extremen Bedingungen (4 K und hohe
Mikrowellenleistung) nicht gesättigt werden, was auf eine sehr kurze longitudinale Relaxationszeit (T 1, Spin-Gitter-Relaxation) des Elektronenspins in der HALS-Spezies hinweist. Dies
erklärt auch, warum in field-swept-echo Experimenten die HALS-Signale nur äußerst schwach
angedeutet sind. Die EPR-Signale werden hier analog zu der Puls-ENDOR-Messung mit Hilfe
einer Hahn-Echo-Sequenz detektiert (siehe Abschnitt 3.2). Für die Detektion des Hahn-Echos
ist die transversale Relaxationszeit (T 2, Spin-Spin-Relaxation) entscheidend, wobei im allgemeinen T 2 ≤ T 1 gilt.4 Bei einem Abstand von etwa 300 ns zwischen dem π/2- und dem πMikrowellenpuls der Hahn-Echo-Sequenz tritt für die HALS-Spezies vermutlich bereits ein Verlust an Signalintensität aufgrund der schnellen transversalen Elektronenspinrelaxation ein. Der
Puls-Abstand von etwa 300 ns wurde hinsichtlich der Detektion regulärer low-spin Fe3+ -Signale
optimiert und möglichst kurz gewählt. Aus meßtechnischen Gründen kann der Puls-Abstand
nicht weiter reduziert werden.
4
Während sich bei der longitudinalen Relaxation (in Feldrichtung) die Besetzungsverhältnisse der Elektronen-
spins ändern, wobei ein Energieaustausch mit der Umgebung (Gitter) von Nöten ist, sind bei der transversalen
Relaxation nur die Phasenbeziehungen der Elektronenspins, die im Vektormodell um die Feldrichtung präzedieren,
betroﬀen [87].
134
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
6.4
Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Charakterisierungsmethode auf der Basis der EPR- und
ENDOR-Spektroskopie ausgearbeitet, die eine detaillierte, strukturelle Beschreibung der Bindungssituation des Hämins in de novo synthetisierten Hämproteinen ermöglicht. Die EPRspektroskopischen Untersuchungen von de novo synthetisierten Hämproteinen [12, 62, 75] beschränkten sich bisher auf die Detektion des Spin-Zustandes und die qualitative Interpretation
der g-Tensorhauptwerte. In dieser Arbeit wurde die Auswertung der EPR-Spektren durch ein
Simulationsprogramm (ELSI) erweitert, das neben der Analyse der EPR-Linienbreiten auch die
Quantiﬁzierung verschiedener Spin-Zustände erlaubt. Darüberhinaus wurde hier erstmals die
ENDOR-Spektroskopie auf de novo synthetisierte Hämproteine angewandt. Die ENDOR-Signale
von Stickstoﬀkernen und Protonen der axialen Histidinliganden und des Hämins konnten durch
den Vergleich mit isotopenmarkierten Modellkomplexen identiﬁziert werden. Dabei wurde festgestellt, daß sich die ENDOR-Signale der axialen Histidinprotonen H2 und H5 hervorragend als
spektroskopische Sonden zur Charakterisierung der axialen Häminkoordination eignen. Sie sind
kennzeichnend für die elektronische und geometrische Struktur der Fe3+ -Komplexe und lassen
sich ohne störende Überlagerung anderer Signale (z. B. des Hämins oder der Proteinmatrix)
detektieren. Zur Auswertung dieser ENDOR-Signale wurde ein weiteres Simulationsprogramm
(SIMES) erstellt, das die ENDOR-Linienpositionen in eine direkte Beziehung zur Position der
Protonen im Koordinatensystem des g-Tensors (lokalisiert am Fe3+ -Zentrum) setzt.
Die drei de novo synthetisierten Hämproteine MOP, [α(H1)–α(H2)]2 und ‘maquette’, die
in diesem Kapitel mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie untersucht wurden, wurden nach
dem Kern der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc1 Komplexes entworfen. In dem
Innenraum dieser Vier-Helix-Bündel beﬁnden sich bis-Histidin-Bindungsstellen zur Einbindung
von Hämin. Die Designkonzepte der Cytochrom b Modelle sind unterschiedlich (siehe Abbildung
6.1). In dem ‘maquette’ werden zwei identische Helices über eine Disulﬁdbrücke miteinander
verknüpft, während in [α(H1)–α(H2)]2 zwei verschiedene Helices über einen Loop miteinander
verbunden sind. Diese Dimere lagern sich in beiden Cytochrom b Modellen frei zu Vier-HelixBündeln zusammen. Im Unterschied hierzu werden die helicalen Bausteine des MOP fest auf ein
cyclisches Dekapeptid als Templat ﬁxiert.
Die Detektion des low-spin Zustandes in den EPR-Spektren der Cytochrom b Modelle stellt
6.4 Diskussion
135
einen eindeutigen Nachweis für die starke axiale Koordination des Hämins mit zwei Histidinliganden dar und belegt damit den Einbau des Kofaktors. Im EPR-Spektrum des MOP treten
neben den Signalen des regulären low-spin Zustandes zusätzliche Signale einer hoch-anisotropen
low-spin Spezies (HALS) auf. Die EPR-spektroskopischen Daten der regulären low-spin Komplexe konnten konsistent mit detaillierten Strukturinformationen aus der ENDOR-Spektroskopie
ergänzt werden. Die Koordination des Hämins erfolgt in allen drei Cytochrom b Modellen über
2
das N Atom des Histidins mit einem Abstand von 2,0 ± 0,2 Å zum Fe3+ -Zentrum des Hämins.
Das ‘maquette’ zeichnet sich von den beiden anderen Cytochrom b Modellen durch eine
äußerst schmale EPR-Linienbreite und eine speziﬁsche, hochsymmetrische Koordination des
Hämins aus. Die Ebenen der axialen Liganden sind hier parallel zueinander orientiert und stehen nahezu ekliptisch zu einer der N-Fe-N-Verbindungsachsen des Porphyrins. Die einfache Zusammensetzung aus nur einem Helixtyp und die hohe Flexibilität der freien Zusammenlagerung
helicaler Dimere könnte günstig für die Faltung optimaler Hämbindungstaschen sein. Dabei ist
anzunehmen, daß die Komplexbildung der bis-Histidin-Ligandierung des Hämins die ﬂexible
Struktur des Vier-Helix-Bündels entscheidend beeinﬂußt. Die Bindungssituation der regulären
low-spin Spezies der beider Cytochrom b Modelle MOP und [α(H1)–α(H2)]2 weicht durch eine
leichte Verdrehung der Histidinebenen von der nahezu perfekten Symmetrie der axialen Ligandierung im ‘maquette’ ab. Ihre hohe Ähnlichkeit zum natürlichen Hämprotein MbIm führt zu
der Vermutung, daß neben der reinen Komplexbildung hier auch die Polypeptidumgebung die
Faltung der Bindungstaschen beeinﬂußt.
Es ist jedoch zu beachten, daß in der hier untersuchten ‘maquette’-Probe nicht alle Bindungsstellen besetzt sind (nur etwa zwei Hämgruppen auf insgesamt vier Bindungstaschen). Bei einer
höheren Häminbeladung können auch in ‘maquettes’ Anzeichen einer heterogenen Häminkoordination auftreten. So zeigt das EPR-Spektrum [62] des Vier-Hämin-‘maquettes’ von Robertson
et al. [11] ein typisches HALS-Signal bei gmax = 3,5. Das Vorliegen der HALS-Spezies ist diagnostisch für eine Häminkoordination, in der die Ebenen der axialen Liganden senkrecht gegeneinander verdreht und zusätzlich gegen die Hämnormalen verkippt sind. Bei einer vollständigen
Beladung eines ‘maquettes’ mit vier Hämgruppen stehen die einzelnen Kofaktoren in enger
Nachbarschaft zueinander, was die Zusammenlagerung des Vier-Helix-Bündels behindern und
damit zum Auftreten der HALS-Signale führen könnte. Ein Vorteil der geringeren Häminbeladung des hier untersuchten ‘maquettes’ liegt darin, daß diejenigen Bindungstaschen, die optimal
136
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
hinsichtlich der Einbindung des Hämins gefaltet sind, bevorzugt besetzt werden können.
Die Gegenüberstellung von MOP und [α(H1)–α(H2)]2 ist besonders interessant, da beide Cytochrom b Modelle die gleiche Aminosäurezusammensetzung der helicalen Bausteine besitzen.
Ihre EPR-Spektren unterscheiden sich dennoch durch das Auftreten einer zusätzlichen HALSSpezies (etwa 50 % der Probe) und erhöhten g-strain im Spektrum des MOP. Durch die Zugabe
des chaotropen Agenz Gdn·HCl konnte das Auftreten der HALS-Signale auf etwa 30 % zurückgedrängt aber nicht vollständig eliminiert werden. Das Auftreten und der Mengenanteil der
HALS-Spezies ist im Unterschied zum ‘maquette’ unabhängig vom Beladungsgrad des de novo
synthetisierten Hämproteins. Eine plausible Erklärung für die besondere Bindungssituation der
Häminkofaktoren im MOP ist durch die Fixierung der Helices auf ein Templat und ihre damit
eingeschränkte Beweglichkeit gegeben. Der Faltung des Vier-Helix-Bündels werden geometrische
Restriktionen auferlegt, die zu einer erhöhten strukturellen Heterogeneität und schließlich zu einer verdrehten Anordnung der axialen Liganden führen kann. Die Bindungstasche, die näher am
Templat liegt, sollte dabei stärker von den geometrischen Restriktionen betroﬀen sein und zu
den HALS-Signalen führen.
HALS-Spezies treten auch in natürlichen Hämproteine auf. So zeigen die EPR-Spektren
des Cytochrom bc1 Komplexes zwei HALS-Signale bei gmax = 3,78 und gmax = 3,45, die den
Hämgruppen der Cytochrom b Untereinheit zugeordnet werden konnten [167, 215]. Die Röntgenstruktur des Cytochrom bc1 Komplexes [216] zeigt in Übereinstimmung zur Interpretation
der EPR-Spektren zwei bis-Histidin-ligandierte Hämgruppen mit einer senkrecht verdrehten
und einer verkippten Anordnung der Histidinliganden. Abbildung 6.13 zeigt dazu einen Strukturauschnitt der Cytochrom b Untereinheit. Die Geometrie der axialen Ligandierung wird hier
durch die Faltung der natürliche Proteinumgebung induziert.
Bei der Gegenüberstellung der de novo synthetisierten Cytochrom b Modelle mit dem natürlichen System, dessen Vier-Helix-Kern der Cytochrom b Untereinheit als Vorlage für das Design
der künstlichen Vier-Helix-Bündel herangezogen wurde, ist zu beachten, daß sich die beiden
Vier-Helix-Strukturen in äußerst unterschiedlichen Umgebungen beﬁnden. Im natürlichen System ist die Cytochrom b Untereinheit Teil eines großen Proteinverbandes, der in eine lipophile Membran eingebettet ist. Die künstlichen Vier-Helix-Bündel wurden dagegen mit einer
hydrophilen Außenschicht versehen und direkt in einer wäßrigen Puﬀermedium gelöst. Diese
äußerst verschiedenen Umgebungsbedingungen wirken sich auch auf die Einbindung und die
6.4 Diskussion
137
Abbildung 6.13: Strukturauschnitt des Cytochrom bc1 Komplexes [217]. Gezeigt ist die Koordination der beiden Hämgruppen der Cytochrom b Untereinheit über jeweils zwei Histidinseitengruppen.
Zwei der insgesamt vier Helices des reaktiven Kernes der Cytochrom b Untereinheit sind durch ein
graues Band angedeutet. Bei der Hämgruppe auf der rechten Seite stehen die beiden Ebenen der
Histidinseitengruppen senkrecht zueinander. Bei der Hämgruppe auf der linken Seite sind die Ebenen
der axialen Liganden zusätzlich deutlich gegen die Hämnormale verkippt.
Eigenschaften der Kofaktoren aus. Das Design einer hydrophilen Außenschicht der de novo
synthetisierten Hämproteine ermöglicht jedoch einfache experimentelle Rahmenbedingungen,
zur Untersuchung der Eigenschaften von Kofaktoren in einer Proteinumgebung. Das vorrangige
Ziel der Herstellung der künstlichen Vier-Helix-Bündel liegt demnach nicht in einer möglichst
identischen Nachahmung natürlicher Systeme. Sie dienen vielmehr dazu, anhand eines überschaubaren Strukturmotivs, die funktionellen Eigenschaften von Kofaktoren hinsichtlich ihrer
Wechselwirkung mit der Polypeptidumgebung zu untersuchen. Das Herstellungsverfahren über
chemische Festphasen-Peptid-Synthese (bzw. auch gentechnische Verfahren, wie bei [α(H1)–
138
6. Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen
α(H2)]2 [128]) erlaubt eine gezielte Variation der Aminosäurezusammensetzung, um speziﬁsche
Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen auszutesten und zu beeinﬂussen. Bei den Cytochrom b Modellen, die in dieser Arbeit mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert wurden,
zeigte sich allerdings, daß nicht nur die Wahl der Aminosäurezusammensetzung, sondern auch
das Designkonzept entscheidend für die Einbausituation und die Eigenschaften von Kofaktoren
sein kann. Im folgenden werden die Vor- und Nachteile der unterschiedlichen Designkonzepte
von ‘maquette’, [α(H1)–α(H2)]2 und MOP einander zusammenfassend gegenübergestellt.
Hinsichtlich der Synthese besitzt das ‘maquette’ den einfachsten Aufbau. Es wird nur ein
Helixtyp hergestellt. Die Disulﬁdverbrückung zu helicalen Dimeren erfolgt durch Oxidation an
Luft und die Vier-Helix-Bündel werden durch die freie Zusammenlagerung dieser Dimere erhalten. Damit entfallen für die Synthese eines ‘maquettes’ viele Reinigungs- und Syntheseschritte,
die beispielsweise für die Herstellung eines MOP benötigt werden. Zur Herstellung eines MOP
werden verschiedene Helices synthetisiert, über manuelle Reaktionsschritte mit Kopplungsgruppen modiﬁziert und separat gereinigt, da die Ausbildung des Vier-Helix-Bündels über selektive
chemische Kopplungsreaktionen erfolgt.
Durch die Beschränkung auf einen Helixtyp im Designkonzept des ‘maquettes’ sind die
Möglichkeiten, die Aminosäurezusammensetzung zu variieren, stark eingeschränkt. Hier bietet
das Designkonzept von [α(H1)–α(H2)]2 , in dem zwei verschiedene Helixtypen über einen Loop
verknüpft werden, sowie die modulare Synthesestrategie des MOP, in welchem bei geeigneten
Kopplungsgruppen bis zu vier verschiedene Helices an ein Templat gebunden werden können,
eine deutlich größere Vielfalt in der Wahl der Aminosäurezusammensetzung.
Die Topologie des gesamten Vier-Helix-Bündels hängt bei [α(H1)–α(H2)]2 wie auch bei dem
‘maquette’ ausschließlich von den Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Helices ab. Damit
ist die gegenseitige Orientierung der helicalen Bausteine nicht eindeutig vorhersagbar. Für eine
gezieltere Festlegung der Vier-Helix-Bündel-Topolgie könnten die beiden Verknüpfungsmethoden
(Loop und Disulﬁdbrücke) jedoch auch kombiniert werden. Es existieren bereits Vier-HelixBündel, in denen zwei über einen Loop verknüpfte helicale Dimere durch eine Disulﬁdbrücken
zusammengehalten werden [53].
Der Einsatz des Templates im Designkonzept des MOP bietet den Vorteil, daß die Orientierung der Helices durch ihre Fixierung am C- oder N-Terminus an das Templat eindeutig festgelegt
werden. Das Designkonzept des MOP ist außerdem hervorragend für den Einsatz kombinatori-
6.4 Diskussion
139
scher Synthesestrategien geeignet. Nach dem Baukastenprinzip der modularen Synthesestrategie
können einzelne helicale Bausteine beliebig ausgetauscht werden. Über die Fixierung der modularen Proteine auf Filterpapierträger ist eine kombinatorische Synthese in der Arbeitsgruppe
Haehnel bereits realisiert worden (siehe auch Kapitel 2) [84]. Die modularen Proteine können
auf dem Filterpapier mit Hilfe eines Lichtleiters optisch charakterisiert werden. Allerdings, und
dies zeigte erst die EPR-spektroskopische Untersuchung des MOP, beeinﬂußt die Fixierung der
Helices auf einem Templat die Faltung der Kofaktorbindungstasche. Um das Designkonzept
der Templat-assoziierten synthetischen Proteine hinsichtlich einer speziﬁschen und deﬁnierten
Faltung der Kofaktorbindungstaschen zu optimieren, könnten beispielsweise modulare Proteine
untersucht werden, in denen sich jeweils eine Hämin-Bindungsstelle in unterschiedlicher Entfernung zum Templat beﬁndet. Außerdem könnten verschiedene Linker, die sich in ihrer Länge
oder Flexibilität unterscheiden, zwischen den Helices und dem Templat eingesetzt werden.
140
Kapitel 7
Zusammenfassung und Ausblick
Ziel der Protein-de-novo-Synthese ist es, anhand künstlicher Proteinmodelle ein tieferes
Verständnis der Struktur und Funktion komplexer natürlicher Proteine zu gewinnen und in
technischen Anwendungen nutzbar zu machen. Von besonderem Interesse sind dabei Systeme,
die Kofaktoren einbinden können, da diese oft das katalytisch aktive Zentrum natürlicher Proteine bilden. Über die Wechselwirkung mit der Proteinumgebung werden die Eigenschaften der
Kofaktoren beeinﬂußt und hinsichtlich ihrer Funktion optimiert.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden de novo synthetisierte Proteine, die Metalloporphyrinkofaktoren binden können, hergestellt und mit verschiedenen spektroskopischen Methoden
untersucht. Dadurch sollten die Möglichkeiten und Grenzen aufgezeigt werden, diese de novo
synthetisierten Proteine als künstliche Proteinmodelle einzusetzen.
Das Designkonzept der hier untersuchten de novo synthetisierten Proteine beruht auf dem
Strukturmotiv eines Vier-Helix-Bündels. Dieses kompakte und einfache Strukturmotiv bietet
gute Voraussetzungen, um den Einﬂuß der Polypeptidumgebung auf die Eigenschaften von
Kofaktoren zu untersuchen. Durch den Einbau von Metalloporphyrinen mit unterschiedlichen
Zentralmetallionen können verschiedene funktionelle Eigenschaften in die de novo synthetisierten Proteine eingeführt werden. Im Vordergrund dieser Arbeit steht der redoxaktive Kofaktor
Hämin, der in natürlichen Proteinen eine außerordentlich große Vielfalt an Funktionen ausübt.
Die künstlichen Proteinmodelle wurden nach der Synthesestrategie Templat-assoziierter synthetischer Proteine aufgebaut. Mittels chemischer Festphasen-Peptidsynthese wurden lineare
Peptide hergestellt, die in wäßriger Lösung amphiphile Helices ausbilden. Über die Kopplung
141
142
7. Zusammenfassung und Ausblick
an ein zyklisches Dekapeptid als Templat wurden wasserlösliche Vier-Helix-Bündel erhalten,
die einen hydrophoben Innenraum zur Einbindung von Kofaktoren aufweisen. Der Vorteil der
Synthesestrategie dieser Templat-assoziierten synthetischen Proteine liegt in ihrem modularen
Aufbau und der eindeutigen Festlegung der relativen Anordnung der einzelnen Peptidbausteine.
Mittels Circulardichroismus und Tryptophan-Fluoreszenz wurde die Ausbildung helicaler
Sekundärstrukturelemente und das Vorliegen des hydrophoben Kerns der Vier-Helix-Bündel
nachgewiesen. Mit diesen Methoden wurde auch die Stabilität der künstlichen Vier-Helix-Bündel
gegenüber dem denaturierenden Agenz Guanidinium-Hydrochlorid untersucht. Die Entfaltung
der de novo synthetisierten Proteine mit Guanidinium-Hydrochlorid ist reversibel. Analog zu
natürlichen Hämproteinen wird die Stabilität der Vier-Helix-Bündel durch die Einbindung des
Kofaktors erhöht.
In natürlichen Hämproteinen ist die Lage des Redoxpotentials des Kofaktors von essentieller
Bedeutung für einen eﬀektiven und kontrollierten Ablauf biologischer Elektronentransferprozesse. In diesen natürlichen Systemen wird das Redoxpotential durch die Wechselwirkung mit
der Proteinumgebung optimal eingestellt. Es zeigte sich, daß das Redoxpotential der Hämgruppe auch in den künstlichen Vier-Helix-Bündeln durch die Variation einzelner Aminosäuren in
der Polypeptidumgebung beeinﬂußt werden kann. Eine gezielte Einstellung des Redoxpotentials
durch speziﬁsche Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen sollte damit auch in künstlichen Proteinmodellen im Prinzip möglich sein. Dies erfordert jedoch neben einer ausreichenden hydrophoben
Abschirmung der Kofaktorbindungstasche eine speziﬁsche Kofaktoreinbindung. Hier zeigte die
EPR-spektroskopische Charakterisierung der Templat-assoziierten synthetischen Proteine, daß
in den künstlichen Proteinmodellen eine Verteilung an Konformeren vorliegt, die sich hinsichtlich
der Geometrie der axialen Häminkoordination unterscheiden. Die Hämgruppe wird über zwei
Histidinseitengruppen gebunden, die sowohl parallel als auch senkrecht gegeneinander verdreht
angeordnet sind. Eine speziﬁsche Kofaktoreinbindung mit parallel orientierten Histidinliganden
konnte jedoch in einem der Templat-assoziierten synthetischen Hämproteine durch Behandlung
mit Guanidinium-Hydrochlorid erzielt werden.
Neben Fe3+ wurden auch Co3+ und Zn2+ als Zentralmetallionen der Porphyrinsysteme eingesetzt. Der Austausch des Zentralmetallions Fe3+ gegen Co3+ führte hinsichtlich der Redoxaktivität zu einem ganz anderen Verhalten der Polypeptidmodule. Während sich das Hämin (Fe3+ )
spontan durch den Zusatz an Dithionit zu Häm (Fe2+ ) reduzieren läßt, wird der oxidierte Co3+ -
143
Zustand durch die axiale Ligandierung mit zwei Histidinliganden gegenüber dem reduzierten
Co2+ -Zustand stark stabilisiert. Die äußerst langsam verlaufende Reduktion geht hier mit der
Freisetzung des Kofaktors in die wäßrige Lösung einher.
Durch den Einbau von Zink(II)porphyrin in ein Vier-Helix-Bündel wurde ein wichtiger
Schritt zur Entwicklung künstlicher Photosynthesemodelle realisiert. Dieser Metalloporphyrinkofaktor konnte als Elektronendonator für lichtinduzierte Elektronentransferprozesse eingesetzt werden. Mit Hilfe der Blitzlichtspektroskopie wurde der Elektronentransfer zu einem
Chinon in ﬂüssiger Lösung gemessen und mit Myoglobin, in dem die Hämgruppe durch ein
Zink(II)porphyrin ausgetauscht wurde, verglichen. Der Triplett-Zustand des Zink(II)porphyrins,
der den Ausgangszustand des Elektronentransferprozesses in den künstlichen Proteinmodellen
darstellt, wurde mittels transienter EPR-Spektroskopie durch in situ Lichtanregung charakterisiert.
Neben den de novo synthetisierten Proteinen mit einer Metalloporphyrin-Bindungsstelle,
wurden in der hier vorliegenden Arbeit weitere Vier-Helix-Bündel, die zwei Hämgruppen enthalten, mittels magnetischer Resonanzspektroskopie untersucht. Diese Systeme wurden alle nach
der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc1 Komplexes modelliert, unterscheiden sich jedoch in ihrem Designkonzept. Neben Templat-assoziierten synthetischen Proteinen lagen auch
Vier-Helix-Bündel vor, die auf der Selbstassoziation einzelner Helices beruhen, welche über
Disulﬁdbrücken oder Peptid-Schlaufen zu Dimeren verknüpft sind. Eine möglichst detaillierte
Kenntnis der Kofaktor-Bindungssituation ist eine wichtige Voraussetzung, um die de novo synthetisierten Hämproteine als künstliche Proteinmodelle einsetzen zu können. Daher wurde im
Rahmen dieser Arbeit eine Charakterisierungsmethode auf der Basis der EPR- und ENDORSpektroskopie ausgearbeitet, die eine detaillierte Beschreibung der Bindungssituation des paramagnetischen Kofaktors in de novo synthetisierten Hämproteinen ermöglicht, und auf die
Cytochrom b Modelle angewandt.
Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde über die Detektion des low-spin Fe3+ -Zustandes
der eindeutige Nachweis für den Einbau des Hämins über die axiale Koordination mit zwei
Histidinseitengruppen in den Cytochrom b Modellen erbracht. Die Ligandenfeldanalyse der gTensorhauptwerte und die Simulation der EPR-Spektren mit einem g-strain Mechanismus zur
Linienverbreiterung mit einem eigens erstellten Programm, ermöglichten es, Aussagen zur geometrischen Anordnung der axialen Liganden und zur Heterogeneität der Kofaktoreinbindung zu
144
7. Zusammenfassung und Ausblick
treﬀen. Das Templat-assoziierte synthetische Protein wies demnach die größte Heterogeneität in
der Einbausituation der Kofaktoren von den verschiedenen Cytochrom b Modellen auf. Neben
einer regulären low-spin Spezies, die eine in etwa parallele Anordnung der axialen Histidinebenen anzeigt, wurden auch Signale einer hoch-anisotropen low-spin Spezies (HALS) detektiert.
Das Auftreten der HALS-Spezies ist, wie anhand der Ligandenfeldanalyse erläutert wurde, diagnostisch für eine stark verdrehte oder verkippte Anordnung der Ebenen der axialen Liganden.
Diese Bindungssituation ﬁndet man zum Teil auch in natürlichen Hämproteinen. Die Cytochrom
b Modelle, die auf der freien Zusammenlagerung helicaler Dimere beruhen, zeigten dagegen ausschließlich reguläre low-spin Signale mit einem geringen g-strain und damit eine hoch-speziﬁsche
Kofaktoreinbindung.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals ENDOR-Spektren von de novo synthetisierten Hämproteinen aufgenommen. Dazu wurde die Davies-Puls-ENDOR-Technik eingesetzt. Die
ENDOR-Signale von Protonen und Stickstoﬀkernen der axialen Histidinliganden und des Hämins
wurden durch den Vergleich mit isotopenmarkierten Modellverbindungen identiﬁziert. Dabei
stellte sich heraus, daß sich die ENDOR-Signale der Protonen der axialen Liganden hervorragend
als spektroskopische Sonde zur Charakterisierung der Einbausituation des paramagnetischen Kofaktors einsetzen lassen. Diese ENDOR-Signale sind diagnostisch für die geometrische und elektronische Struktur der low-spin Fe3+ -Komplexe und konnten ohne Überlagerung mit Signalen
des Hämins oder der Proteinmatrix detektiert werden. Um die Leistungsfähigkeit der ENDORSpektroskopie zu demonstrieren, wurde ein Cytochrom b Modell mit wohldeﬁnierter Kofaktoreinbindung ausführlich analysiert. Durch orientierungsselektionierte ENDOR-Messungen in
gefrorener Lösung und den Vergleich der experimentellen Daten mit Simulationen konnten die
Positionen der Histidinprotonen im Koordinatensystem des g-Tensors ermittelt werden. Zu diesem Zweck wurde ein Simulationsprogramm erstellt, das die ENDOR-Signale in direkten Zusammenhang mit den strukturellen Daten (Abstände und Polarwinkel im Koordinatensystem des
g-Tensors) stellt. Zusätzlich wurde die Analyse der ENDOR-Spektren der Cytochrom b Modelle
durch den Vergleich mit Puls-ENDOR-Spektren von Metmyoglobin-Imidazol unterstützt, von
dem eine Röntgenstruktur vorliegt. Anhand der ENDOR-spektroskopischen Charakterisierung
wurde darauf geschlossen, daß in den regulären low-spin Komplexen der Cytochrom b Modelle
2
das N Atom in einem Abstand von 2,0 ± 0,2 Å an das Fe3+ -Zentrum des Hämins bindet.
Die EPR- und ENDOR-spektroskopischen Untersuchungen der verschiedenen Cytochrom b
145
Modelle zeigten, daß nicht nur die Aminosäurezusammensetzung, sondern auch das Designkonzept einen Einﬂuß auf die Faltung der Kofaktorbindungstasche nehmen kann. Bei Templatassoziierten synthetischen Proteinen ist zu beachten, daß der Vorteil, den dieses Designkonzept
hinsichtlich der Kontrolle der relativen Anordnung der einzelnen Peptidbausteine bietet, auch
geometrische Restriktionen bei der Faltung der Kofaktorbindungstasche beinhaltet. Vier-HelixBündel, die auf der freien Zusammenlagerung einzelner Peptidbausteine beruhen, besitzen demgegenüber eine höhere Flexibilität in der Faltung der Kofaktorbindungstaschen. Diese Art der
Zusammenlagerung wird von der Natur bevorzugt.
Ausblick
Der Ansatz de novo synthetisierte Proteine als Modellsysteme komplexer natürlicher Proteine
einzusetzen ist sehr vielversprechend. Es stellt jedoch nach wie vor eine anspruchsvolle Herausforderung dar, wohldeﬁnierte Bindungstaschen für einen speziﬁschen Kofaktoreinbindung in
künstlichen Proteinmodellen zu modellieren. Für die Optimierung der Bindungstaschen von Kofaktoren wird in künftigen Arbeiten die kombinatorische Synthese an Bedeutung gewinnen, da
hiermit Variationen der Aminosäurezusammensetzung in großem Maßstab durchgeführt werden
können. In der Arbeitsgruppe Haehnel wird dieser Ansatz zur Zeit eingesetzt, um ein Modellsystem für Cytochrom P450 zu konstruieren. Die Hämgruppe soll hier im Unterschied zu der
bisher vorherrschenden bis-Histidin-Koordination über einen Cysteinliganden in die künstlichen
Proteinmodelle eingebunden werden.
Ausgehend von dem Vier-Helix-Bündel, in welches in dieser Arbeit ein Zink(II)porphyrin
eingebaut wurde, könnten einfache Modellsysteme für Proteine, die an der Photosynthese beteiligt sind, konstruiert werden. Dazu müßte noch eine Bindungstasche für ein Chinon entworfen
werden. Dabei bietet sich eine kovalente Anknüpfung des Chinons im Verlauf der chemischen
Synthese an. Die gezielte Variation der elektronischen Eigenschaften (z. B. Redoxpotentiale) und
Abstände der Kofaktoren könnte eine systematische Untersuchung der Elektronentransferprozesse in künstlichen Proteinmodellen eröﬀnen. Der Vorteil dieser Systeme gegenüber einfachen
chemischen Modellverbindungen liegt darin, daß auch der Einﬂuß des Proteinmediums auf den
Elektronentransferprozeß studiert werden kann. Dazu könnten verschiedene theoretische Modellvorstellungen zum Elektronentransfer in Proteinen einander gegenübergestellt werden. Moser et
146
7. Zusammenfassung und Ausblick
al. (siehe [218]) haben gezeigt, daß die Geschwindigkeit des Elektronentransfers in etwa exponentiell mit dem Abstand von Donator und Akzeptor abnimmt. Das Medium, in dem der Elektronentransfer stattﬁndet wird durch eine Dämpfungskonstante β berücksichtigt. Das gesamte
Protein wird dabei als ein glasartiges Medium mit einer einheitlichen Dämpfungskonstante von
β 1.4 Å−1 betrachtet. Bei Beratan und Onuchic (siehe [219]) spielt dagegen die Zusammensetzung des Proteins eine wichtige Rolle. Bei dem Elektronentransferweg durch das Protein werden unterschiedliche strukturelle Elemente, wie kovalente Bindungen, Wasserstoﬀbrücken und
“through space jumps” berücksichtigt. Anhand der chemisch synthetisierten Polypeptidmodule
sollte es möglich sein, den Einﬂuß der Proteinkomposition auf den Elektronentransfer gezielt zu
untersuchen. Durch die Variation der Aminosäurezusammensetzung werden speziﬁsche Einﬂüße
von Wasserstoﬀbrücken oder aromatischen Aminosäuren in den künstlichen Proteinmodellen zu
experimentell zugänglichen Parametern.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines von vielen möglichen Strukturmotiven – Vier-HelixBündel mit Metalloporphyrinkofaktoren – gezielt herausgegriﬀen. Neben der Konstruktion anderer Faltungsmotive bietet es sich für weiterführende Arbeiten an, auch andere Kofaktoren
in unterschiedlichen Kombinationen einzuführen oder nicht-natürlicher Bausteine mit de novo
synthetisierten Proteinen zu verknüpfen. Durch die Fixierung auf (Metall-) Oberﬂächen ergeben
sich interessante Anwendungsmöglichkeiten für die Bioelektronik oder für den Aufbau bioaktiver
Chips. Die Möglichkeiten der Protein-de-novo-Synthese sind damit mindestens so vielfältig wie
die Welt der natürlichen Proteine, die den künstlichen Systemen als Vorlage dienen.
Anhang A
EPR-Simulationsprogramm ELSI
In Abschnitt 4.4.1 wurden die Grundzüge des EPR-Simulationsprogrammes ELSI beschrieben. In
diesem Anhang wird der Programmcode für das Modul der Linienverbreiterung durch ‘g-strain’
aufgelistet. In dieser Arbeit hat sich der ‘g-strain’ als Hauptursache für die Linienverbreiterung in
den EPR-Spektren der de novo synthetisierten Hämproteine herausgestellt (siehe z. B. Abschnitt
6.2). Anschließend folgt ein Beispiel für eine Eingabedatei des Programmes.
A.1
Programm-Code für Linienverbreiterung durch ‘g-strain’
/* EPR-Linienbreiten Simulationsprogramm ELSI
/*
Programmmodul g-strain
/* von Monika Fahnenschmidt (1998) nach einer
/*
Veröffentlichung von W. Hagen et al.
/*
J. Magn. Res. 61 (1985) 220
*/
*/
*/
*/
*/
#include<stdio.h>
#include</usr/include/math.h>
#define DEBUG_SPIRAL 0
#define DEBUG_G_SPEKTRUM 1
/*
/*
/*
/*
/*
/*
Gibt die Spirale, die zur Erfassung aller */
molekularen Orientierungen eines Pulverspektrums */
um die Einheitskugel gelegt wird, in der Datei */
‘‘testspiral’’ aus. */
Gibt das EPR-Spektrum auf der g-Skala in der */
Datei ‘‘testg’’ aus. */
#define pi 3.14159
#define beta_e 9.27402e-24
#define Planck_constant 6.62618e-34
double *g_spectrum;
double *B_spectrum;
double *ableitung;
147
148
A. EPR-Simulationsprogramm ELSI
double *field;
double g_sweep;
double g_min, g_max;
/* Simulationsparameter der Eingabedatei: */
double microwave_frequency;
double points;
double field_min;
double field_sweep;
double d_angel;
char linetype;
double g1, g2, g3;
double sg1, sg2, sg3;
double r12, r23, r13;
double zero_width_protector;
double scale;
/* Prototypen der Funktionen und Programmaufbau: */
void prn_info(char *pgm_name);
void input(char *inputfile); /* Einlesen der Eingabe-Datei */
int spiral(double d);
/* Spirale, um eine gleichmaesige Verteilung an */
/* molekularen Orientierungen zu erzeugen */
void resonance(double theta, double phi); /* Berechnung der Resonanzposition, */
/* Intensitaet und Linienbreite. */
void create_g_spectrum(double *s_g, double g, double I_g, double lw_g);
/* Spektrum auf der g-Skala */
double calculate_lineshape_factor(int x, double lw);
/* Berechnung der Linienbreite */
void transpose_g2B(double *s_g, double *s_B, double *a_B, double *field_position);
/* Transformation zur B-Skala */
void output(double *field_position, double *s, double *a, char *Spektrum, char *Ableitung);
/* Datenausgabe */
void prn_info(char *pgm_name){
printf("%s%s%s%s%s\n", "Usage: ", pgm_name, " Parameter ",
"Spektrum ", "Ableitung ");
}
void create_g_spectrum(double *s_g, double g, double I_g, double lw_g)
{
double x;
int linemax;
double line;
int j;
int i;
/* Grenzwert zur Berechnung und Faltung mit der Linienformfunktion */
linemax = (int) 6.0 * lw_g * ((points-1)/g_sweep);
/* Konversion des g-Wertes g in den Datenpunkt j des Histogrammes */
A.1 Programm-Code für Linienverbreiterung durch ‘g-strain’
149
x = (g - g_min) * ((points-1)/g_sweep);
j = (int) x;
x -= j;
/* 0 <= x > 1 */
/* Histogramm und Faltung mit der Linienform */
if((j >= 0) && (j < points))
for(i=0; i < linemax; i++){
line = calculate_lineshape_factor(i,lw_g);
if( (j+i) < points)
s_g[j + i] += I_g * (1 - x) * line;
if( (j-i) > 0 && i != 0)
s_g[j - i] += I_g * (1 - x) * line;
}
j++;
if((j >= 0) && (j < points))
for(i=0; i < linemax; i++){
line = calculate_lineshape_factor(i,lw_g);
if( (j+i) < points)
s_g[j + i] += I_g * (x) * line;
if( (j-i) > 0 && i != 0)
s_g[j - i] += I_g * (x) * line;
}
}
void resonance(double theta, double phi)
{
double Uebergangsmatrix_element;
double g;
double h1, h2, h3;
double qu_sigma_g;
double sigma_g;
h1 = sin(theta) * cos(phi);
h2 = sin(theta) * sin(phi);
h3 = cos(theta);
g = sqrt((g1*h1) * (g1*h1) + (g2*h2) * (g2*h2) + (g3*h3) *
qu_sigma_g = (pow(h1,4) * pow(g1,2) * sg1*sg1
+ pow(h2,4) * g2*g2 * sg2*sg2
+ pow(h3,4) * g3*g3 * sg3*sg3
+ 2* h1 * h1 * h2 * h2 * g1 *g2 * (r12) * sg1
+ 2* h1 * h1 * h3 * h3 * g1 *g3 * (r13) * sg1
+ 2* h3 * h3 * h2 * h2 * g3 *g2 * (r23) * sg3
/ ( g * g );
/* zur Berechnung von qu_sigma_g siehe:
*/
/* W. Hagen in Advanced EPR (Editor: A. Hoff) Seite 795 */
if(qu_sigma_g < 0) {
fprintf(stderr,"Warning: sigma_g^2 < 0 !!!\n");
}
else
sigma_g = sqrt(qu_sigma_g) + zero_width_protector;
(g3*h3));
* sg2
* sg3
* sg2)
150
A. EPR-Simulationsprogramm ELSI
Uebergangsmatrix_element=
(g1*g1 * g2*g2 * sin(theta)*sin(theta) + g2*g2 * g3*g3 *
(sin(phi)*sin(phi) + cos(theta)*cos(theta) * cos(phi)*cos(phi)) +
g3*g3 * g1*g1 * (cos(phi)*cos(phi) + cos(theta)*cos(theta) *
sin(phi)*sin(phi))) / (2*g*g);
/* zur Berechnung des Uebergangsmatrix_element siehe:
*/
/* J. R. Pilbrow, Transition Ion Electron Paramagnetic Resonance, Seite 222 */
create_g_spectrum(g_spectrum, g, Uebergangsmatrix_element, sigma_g);
}
int spiral(double d)
{
double theta_0, theta_1;
double phi_0, phi_1;
double st_0, st_1;
double u,v,w;
int counter = 0;
#if DEBUG_SPIRAL
FILE *tfp;
tfp = fopen("testspiral","w");
#endif
/* Theta und Phi geben Orientierung des Molekuels relativ zum B-Feld an. */
theta_0 = theta_1 = pi/2;
phi_0 = phi_1 = 0;
/* Algorithmus zur Berechnung der Orientierungen: */
/* siehe C. Gessner, Disertation TU-Berlin 1996 */
while (theta_1 > 0.0)
{
resonance(theta_0,phi_0);
st_0 = sin(theta_0);
theta_1 = theta_0 - (d*d)/(2*pi*st_0);
st_1 = sin(theta_1);
phi_1 = phi_0 + d/st_0 + 1/sqrt(2) * (d/st_1 - d/st_0);
theta_0 = theta_1;
phi_0 = phi_1;
if(phi_0 > 2*pi) phi_0 -= 2* pi;
counter++;
#if DEBUG_SPIRAL
u = sin(theta_0) * cos(phi_0);
v = sin(theta_0) * sin(phi_0);
w = cos(theta_0);
fprintf(tfp,"%.4f %.4f %.4f\n",u,v,w);
#endif
A.1 Programm-Code für Linienverbreiterung durch ‘g-strain’
151
}
#if DEBUG_SPIRAL
fclose(tfp);
#endif
return counter;
}
double calculate_lineshape_factor(int x_step, double lw_g)
{
double exponent;
double lsf; /*lineshape_factor */
exponent =
(1.0 * x_step * g_sweep/(points-1)/lw_g);
switch(linetype){
case ’D’: /* Deltafunktion */
if(x_step == 0) lsf = 1.0;
else lsf = 0.0;
break;
case ’G’: /*Gaussfunktion */
lsf = 1.0/(sqrt(2 * pi) * lw_g) * exp(- 1.0/2.0 * exponent * exponent);
break;
case ’L’: /*Lorentzfunktion */
lsf = 1.0/(pi*lw_g) * 1.0 / (1 + exponent*exponent);
break;
}
return lsf;
}
void transpose_g2B(double *s_g, double *s_B, double *a_B, double *field_position)
{
double g_raster; /* Rasterpunkt im Histogramm der g-Skala */
int i;
/* Berechnung der Feldposition und Intensitaet auf der B-Skala
*/
/* siehe W. Hagen in Advanced EPR (Editor: A. Hoff) Seite 802-803 */
for(i=0; i<points; i++){
g_raster = i * g_sweep/(points -1) + g_min;
field_position[i] = 10000 * (Planck_constant * microwave_frequency)/
(beta_e * g_raster);
s_B[i] = g_raster * s_g[i];
}
/* Berechnung der ersten Ableitung */
for(i=0; i<points; i++)
a_B[i] = (s_B[i+1] - s_B[i-1])/(field_position[i+1] - field_position[i-1]);
}
void output_g(double *s_g)
152
A. EPR-Simulationsprogramm ELSI
{
FILE *tfp;
int i;
tfp = fopen("testg", "w");
for(i=0;i <points; i++)
fprintf(tfp,"%d %.4f\n",i, s_g[i]);
fclose(tfp);
}
void output(double *field_position, double *s, double *a, char *Spektrum,
char *Ableitung)
{
FILE *ofpa, *ofpb;
int i;
ofpa = fopen(Spektrum, "w");
ofpb = fopen(Ableitung, "w");
for(i = 0; i < points; i++){
fprintf(ofpa,"%.4f %.4f\n",field_position[i],(scale * s[i]));
fprintf(ofpb,"%.4f %.4f\n",field_position[i], (scale* a[i]));
}
fclose(ofpa);
fclose(ofpb);
}
void input(char *inputfile)
{
int i;
FILE *ifp;
char *cntrl_string;
ifp = fopen(inputfile,"r");
cntrl_string =
"Microwave Frequency (Hz): %lf Field Start Value (Gauss): %lf Field Sweep Width
(Gauss): %lf Points: %lf Increment for Spiral: %lf Linetype %*s %*s %*s %*s %c
Linewidthparameter: sg1: %lf sg2: %lf sg3: %lf r12: %lf r23: %lf r13: %lf
g1: %lf g 2: %lf g3: %lf zero-width-protector: %lf scale: %lf ";
if(fscanf(ifp, cntrl_string, &microwave_frequency, &field_min,
&field_sweep, &points, &d_angel, &linetype, &sg1, &sg2, &sg3,
&r12, &r23, &r13, &g1, &g2, &g3, &zero_width_protector, &scale) != 17)
fprintf(stderr,"Reading input file failed!\n");
if(!(B_spectrum = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
A.1 Programm-Code für Linienverbreiterung durch ‘g-strain’
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
if(!(g_spectrum = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
if(!(ableitung = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
if(!(field = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
g_max = Planck_constant*microwave_frequency/(beta_e* field_min/10000);
g_min = Planck_constant*microwave_frequency/
(beta_e*(field_min+field_sweep)/10000);
g_sweep = g_max - g_min;
}
main(int argc, char **argv)
{
int n_orientations;
if(argc != 4 ){
prn_info(argv[0]);
exit(1);
}
input(argv[1]);
n_orientations= spiral(d_angel);
printf("Anzahl der Orientierungen: %d\n",n_orientations);
#if DEBUG_G_SPEKTRUM
output_g(g_spectrum);
#endif
transpose_g2B(g_spectrum, B_spectrum, ableitung, field);
output(field, B_spectrum, ableitung, argv[2], argv[3]);
}
153
154
A.2
A. EPR-Simulationsprogramm ELSI
Eingabe-Datei für ELSI
Microwave Frequency (Hz):
Field Start Value (Gauss):
Field Sweep Width (Gauss):
Points:
9.4338e9
1000.0
4000.0
1024
Increment for Spiral:
0.01
Linetype (D(elta), G(auss) or L(orentz)): G
Linewidthparameter:
sg1: 0.05
sg2: 0.03
sg3: 0.05
r12: -0.95
r23: -0.95
r13: 0.95
g1:
g2:
g3:
1.50
2.24
2.93
zero-width-protector: 0.01
scale: 3.8
Anmerkung: Der zero-width-protector wird zur Linienbreite σg auf der g-Skala addiert, um
zu verhindern, daß die Gesamtlinienbreite für negative Korrelationskoeﬃzienten rij (i,j = 1,2,3)
gegen Null geht (siehe Abschnitt 4.4.1). Der Zahlenwert Increment for Spiral bestimmt die
Schrittweite der Spirale über die Einheitskugel, die zur Erfassung der molekularen Orientierungen des Pulverspektrums dient (siehe auch Abbildung B.1). Je kleiner der Zahlenwert, desto
mehr Orientierungen werden berücksichtigt. Die Anzahl der molekularen Orientierungen wird als
Information am Ende des Programmes ausgeben. Bei einem Zahlenwert von 0.01 für Increment
for Spiral werden beispielsweise 62 835 Orientierungen in der Simulation berücksichtigt.
Anhang B
ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
Das ENDOR-Simulationsprogramm SIMES wurde in Abschnitt 4.4.2 vorgestellt. Hier folgt eine
Auﬂistung des Programmcodes und ein Beispiel für eine Eingabedatei.
B.1
/*
/*
/*
/*
Programm-Code
Simulationsprogramm fuer ENDOR-Spektren SIMES */
von Monika Fahnenschmidt (1999) nach einer
*/
Veroeffentlichung von D. Goldfarb et al.
*/
J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 2686
*/
#include<stdio.h>
#include</usr/include/math.h>
#define DEBUG_SPIRAL 0
#define DEBUG_NET
0
/*
/*
/*
/*
/*
#define DEBUG_DATA 0
/*
#define DEBUG_ORIENTSEL 0 /*
/*
/*
gibt die Spirale bzw. das Netz um die */
Einheitskugel, die zur Erfassung der */
molekularen Orientierungen des */
Pulverspektrums dient, in eine Datei aus */
(testspiral bzw. testnetz). */
Histogramm (ohne Linienformfunktion) */
gibt die molekularen Orientierungen wieder, */
die am ENDOR-Experiment an der ausgewählten */
Feldstelle (Parameter: field_value) teilnehmen.
#define pi 3.14159
#define beta_e 9.27402e-24
#define Planck_constant 6.62618e-34
double *spectrum;
double *ableitung;
double *data;
double linemax;
int counter_fieldvalue=0;
int counter_spiral=0;
double a_perp;
155
*/
156
B. ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
double larmor;
double geff;
/* Simulationsparameter der Eingabedatei: */
double microwave_frequency;
double field_value;
double field_intervall;
int points;
double start;
double sweep_width;
int spiral_type;
double d_angel;
int sp_theta, sp_phi;
char linetype;
double linewidth;
double g1, g2, g3;
double distance, theta_N, phi_N, a_iso;
double scale;
/* Prototypen der Funktionen: (Programmstruktur) */
void prn_info(char *);
void input(char *); /* Einlesen der Eingabe-Datei */
void spiral(double d_angle); /* Spirale oder Netz um die Einheitskugel */
void spiral_2(int m_theta, int m_phi)
void resonance(double theta, double phi); /* Berechnung der ENDOR */
/* Resonanzposition f"ur die selektierten */
/* Orientierungen der gewählten Feldposition. */
void create_data(double frequency, double weight, double *data);
/* Histogramm */
void output_data(double *d); /* Falls DEBUG_DATA 1, Ausgabe des Histogrammes */
void convolute(double *d, double *s, double *a);
/* Berechnung einer Linienform */
double calculate_lineshape_factor(int center, int x_step);
void output(double *s, double *a, char *S, char *A);
/* Ausgabe der berechneten ENDOR-Spektren */
void prn_info(char *pgm_name)
{
printf("%s%s%s%s%s\n", "Usage: ", pgm_name, " Parameter ",
"Spektrum ", "Ableitung ");
}
void create_data(double f, double w, double *d)
{
double x;
int j;
/* Frequenzwert f wird in Aufnahmepunkt j konvertiert */
x = (f - start) * ((points-1)/sweep_width);
j = (int) x;
B.1 Programm-Code
x -= j;
157
/* 0 <= x > 1 */
/* Histogramm: */
if((j >= 0) && (j < points))
d[j] += w * (1 - x);
j++;
if((j >= 0) && (j < points))
d[j] += w * x;
}
void resonance(double theta, double phi)
{
double
double
double
double
double
double
double
field;
g;
h1, h2, h3;
A,C;
CosGamma, SinGamma;
freq;
exponent, weight;
h1 = sin(theta) * cos(phi);
h2 = sin(theta) * sin(phi);
h3 = cos(theta);
g = sqrt((g1*h1) * (g1*h1) + (g2*h2) * (g2*h2) + (g3*h3) * (g3*h3));
field = 10000 * (Planck_constant * microwave_frequency)/( beta_e * g);
/* Liegt der Feldwert (field) im Intervall des EPR Spektrums, das im */
/* ENDOR Experiment angeregt wird? */
if( ((field_value-0.5*field_intervall) < field) &&
((field_value+0.5*field_intervall) > field) ){
counter_fieldvalue++;
#if DEBUG_ORIENTSEL
printf("%.4f %.4f 1.0\n",theta, phi);
#endif
/* Der Feldbereich, fuer den die Orientierungen selektiert werden, wird */
/* mit einer Gaussfunktion (als EPR-Linienbreite) gewichtet. */
exponent = (field_value-field)/(2.345*field_intervall);
weight = exp(- 1.0/2.0 * exponent * exponent);
/* ENDOR-Frequenz: */
CosGamma=cos(theta)*cos(theta_N)+sin(theta)*sin(theta_N)*cos(phi-phi_N);
SinGamma=sqrt(1-CosGamma*CosGamma);
A=a_iso + a_perp*(3*CosGamma*CosGamma-1);
C=3*a_perp*SinGamma*CosGamma;
freq=sqrt((0.5*A-larmor)*(0.5*A-larmor) + 0.25 *C*C);
create_data(freq, weight, data);
freq=sqrt((-0.5*A-larmor)*(-0.5*A-larmor) + 0.25 *C*C);
158
B. ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
create_data(freq, weight, data);
}
}
void spiral(double d)
{
double
double
double
double
theta_0, theta_1;
phi_0, phi_1;
st_0, st_1;
u,v,w;
#if DEBUG_SPIRAL
FILE *tfp;
tfp = fopen("testspiral","w");
#endif
/* Theta und Phi geben Orientierung des Molekuels relativ zum B Feld an. */
theta_0 = theta_1 = pi/2;
phi_0 = phi_1 = 0;
/* Algorithmus zur Berechnung der Orientierungen: */
/* siehe C. Gessner, Disertation TU-Berlin 1996 */
while (theta_1 > 0.0)
{
resonance(theta_0,phi_0);
counter_spiral++;
st_0 = sin(theta_0);
theta_1 = theta_0 - (d*d)/(2*pi*st_0);
st_1 = sin(theta_1);
phi_1 = phi_0 + d/st_0 + 1/sqrt(2) * (d/st_1 - d/st_0);
theta_0 = theta_1;
phi_0 = phi_1;
if(phi_0 > 2*pi) {phi_0 -= 2* pi;}
#if DEBUG_SPIRAL
u = sin(theta_0) * cos(phi_0);
v = sin(theta_0) * sin(phi_0);
w = cos(theta_0);
fprintf(tfp,"%.4f %.4f %.4f\n",u,v,w);
#endif
}
#if DEBUG_SPIRAL
fclose(tfp);
#endif
}
/* Alternatives Netz (nach Hagen et al., J. Magn. Reson. 61 (1985) 220-244): */
void spiral_2(int m_theta, int m_phi)
{
B.1 Programm-Code
int i,j;
double theta, cos_theta, phi, d_cos_theta, d_phi;
double u,v,w;
#if DEBUG_NET
FILE *tfp;
tfp = fopen("testnetz","w");
#endif
d_cos_theta = -2.0/m_theta;
d_phi = 2.0 * pi / m_phi;
cos_theta = 1.0 - 3.0/(2.0 * m_theta);
phi = (7.0/8.0)*d_phi;
for(i=0; i<m_theta; i++){
for(j=0; j<m_phi; j++){
theta = acos(cos_theta);
resonance(theta,phi);
#if DEBUG_NET
u = sin(theta_0) * cos(phi_0);
v = sin(theta_0) * sin(phi_0);
w = cos(theta_0);
fprintf(tfp,"%.4f %.4f %.4f\n",u,v,w);
#endif
phi += d_phi;
counter_spiral++;
}
cos_theta += d_cos_theta;
}
#if DEBUG_NET
fclose(tfp);
#endif
}
void output_data(double *d)
{
FILE *ofp;
int i;
double field_position;
ofp = fopen("testdata", "w");
for(i = 0; i < points; i++){
field_position = i*sweep_width/(points-1) + start;
fprintf(ofp,"%.4f %.4f\n",field_position,scale*d[i]);
}
fclose(ofp);
}
159
160
B. ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
double calculate_lineshape_factor(int center, int x_step)
{
double exponent;
double lw;
double lsf; /*lineshape_factor */
lw = linewidth;
exponent = x_step * sweep_width/(points-1) / lw;
switch(linetype){
case ’G’: /*Gaussfunktion */
lsf =
1.0/(sqrt(2 * pi) * lw) * exp(- 1.0/2.0 *
exponent * exponent);
break;
case ’L’: /*Lorentzfunktion */
lsf =
1.0/(pi*lw) * 1.0 / (1 + exponent*exponent);
break;
}
return lsf;
}
void convolute(double *d, double *s, double *a)
{
int i,j;
double lineshape_factor;
for(i=0; i< points; i++){
lineshape_factor = calculate_lineshape_factor(i,0);
s[i] = d[i] * lineshape_factor;
for(j=1; j < linemax; j++){
if( (i-j) > 0){
lineshape_factor = calculate_lineshape_factor((i-j),j);
s[i] += d[i-j] * lineshape_factor;
}
}
for(j= 1; j < linemax; j++){
if( (i+j) < points){
lineshape_factor = calculate_lineshape_factor((i+j),j);
s[i] += d[i+j] * lineshape_factor;
}
}
}
/* Ableitung */
for(i=0; i<(points); i++)
B.1 Programm-Code
161
*(a+i) = 0.0;
for(i=(1); i<(points-1); i++){
a[i]= 0.5 * (s[i+1] - s[i-1]);
}
}
void output(double *s, double *a, char *Spektrum, char *Ableitung)
{
FILE *ofpa, *ofpb;
int i;
double field_position;
ofpa = fopen(Spektrum, "w");
ofpb = fopen(Ableitung, "w");
for(i = 0; i < points; i++){
field_position = i*sweep_width/(points-1) + start;
fprintf(ofpa,"%.4f %.4f\n",field_position, (scale * s[i]));
fprintf(ofpb,"%.4f %.4f\n",field_position, (scale * a[i]));
}
fclose(ofpa);
fclose(ofpb);
}
void input(char *inputfile)
{
int i;
double factor;
FILE *ifp;
char *cntrl_string;
ifp = fopen(inputfile,"r");
cntrl_string =
"Microwave Frequency (Hz): %lf Field Value (Gauss): %lf Field Intervall (Gauss): %lf
Start Value (MHz): %lf Sweep Width (MHz): %lf Points: %d Spiral Type (1 or 2): %d
Increment for Spiral (1): %lf Steps for Spiral (2): %d %d Linetype %*s %*s %*s %c
Linewidth (MHz): %lf g1: %lf g 2: %lf g3: %lf r (A): %lf theta_N: %lf phi_N: %lf
a_iso (MHz): %lf scale: %lf";
if(fscanf(ifp, cntrl_string, &microwave_frequency, &field_value,
&field_intervall, &start, &sweep_width, &points, &spiral_type,
&d_angel, &sp_theta, &sp_phi, &linetype, &linewidth,
&g1, &g2, &g3, &distance, &theta_N, &phi_N, &a_iso, &scale)
!= 20)
fprintf(stderr,"Reading input file failed!\n");
162
B. ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
if(!(spectrum = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
if(!(ableitung = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
{fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");}
if(!(data = (double*)malloc(points *sizeof(double))))
fprintf(stderr,"Not enough memory!\n");
for(i=0; i<points; i++) data[i] = 0.0;
linemax = (int) 4*points*linewidth/sweep_width;
factor = 39.49;
/* (mu_0:4pi) x (beta_e x g_N x beta_N) : (h *1E-30)*/
/* -> Einheit MHz fuer HF Tensor*/
theta_N = theta_N * pi/180; /* Konversion ins Bogenmass */
phi_N = phi_N * pi/180;
geff=(10000*Planck_constant * microwave_frequency)/(field_value*beta_e);
a_perp=geff*factor/(distance*distance*distance);
larmor=field_value/234.866;
printf("effektiver g-Wert: %.3lf\n", geff);
printf("A_dip: %.3lf MHz\n",a_perp);
printf("Larmorfrequenz der Protonen: %.3lf MHz\n",larmor);
}
main(int argc, char **argv)
{
if(argc != 4 ){
prn_info(argv[0]);
exit(1);
}
input(argv[1]);
if(spiral_type == 1)
spiral(d_angel);
else
spiral_2(sp_theta,sp_phi);
#if DEBUG_DATA
output_data(data);
#endif
convolute(data, spectrum, ableitung);
output(spectrum, ableitung, argv[2], argv[3]);
printf("counter field_value: %d\n", counter_fieldvalue);
printf("counter spiral: %d\n", counter_spiral);
}
B.2 Eingabe-Datei für SIMES
B.2
163
Eingabe-Datei für SIMES
Microwave Frequency (Hz): 9.5e9
Field Value (Gauss): 3393.8
Field Intervall (Gauss): 50
Start Value (MHz): 0.0
Sweep Width (MHz): 25.0
Points:
1024
Spiral Type (1 or 2): 2
Increment for Spiral (1):
Steps for Spiral (2): 100 100
0.01
Linetype (G(auss) or L(orentz)): G
Linewidth (MHz):
1.0
g1: 1.50
g2: 2.24
g3: 2.93
r (A): 3.25
theta_N: 45.0
phi_N: 20.0
a_iso (MHz): -0.30
scale: 10.0
Anmerkung: Der Benutzer kann hier zwischen zwei verschiedenen Routinen zur Erfassung der
molekularen Orientierungen des Pulverspektrums auswählen: Spiral Type (1 or 2) (siehe
Abbildung B.1).
164
B. ENDOR-Simulationsprogramm SIMES
A
1
1
0.8
0.9
0.6
0.8
0.4
0.7
0.2
0.6
0
0.5
-0.2
0.4
-0.4
0.3
-0.6
0.2
-0.8
0.1
-1
0
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
B
1
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
-0.2
-0.2
-0.4
-0.4
-0.6
-0.6
-0.8
-0.8
-1
-1
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Abbildung B.1: A Spiral Type 1: Spirale über die halbe Einheitskugel berechnet mit einem Inkrement von d = 0.1 nach Ref. [134]. B Spiral Type 2: Netz über die ganze Einheitskugel berechnet
mit mθ = 17 und mφ = 19 (mθ , mφ : Anzahl der Schritte für die Variation der Raumwinkel θ und φ
der Einheitskugel, Anzahl der Orientierungen: mθ × mφ ) nach Ref. [139].
Literaturverzeichnis
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Danksagung
Herrn Prof. Dr. W. Lubitz möchte ich für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die spannende
und vielfältige Themenstellung und Betreuung dieser Arbeit danken.
Priv. Doz. Dr. E. Schlodder hat den Mitbericht übernommen. Ich bedanke mich auch für die
angenehme Zusammenarbeit bei den optischen Messungen der Zinkporphyrinsysteme.
Priv. Doz. Dr. R. Bittl hat mit klarem Blick viele interessante Anregungen zu dieser Arbeit
gegeben. Ich bedanke mich für viele physikalische Erläuterungen zur magnetischen Resonanzspektroskopie und die praktische Einführung in die Meßtechnik der EPR- und Puls-ENDORSpektroskopie.
Ohne die Zusammenarbeit mit Prof. Dr. W. Haehnel und seiner Arbeitsgruppe wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Ihnen verdanke ich die Cytochrom b Modelle sowie die Möglichkeit,
eigene Peptidsynthesen in Freiburg durchführen zu können. Dabei möchte ich mich insbesondere bei Dr. Harald Rau für die Anleitung zur Synthese und Rosi Loyal für ihre praktische
Unterstützung bedanken. Patrick Hoerth hat für mich die Massenspektren der Peptide aufgenommen. Durch Dr. Harald Rau, Rosi Loyal, Dr. Niels deJonge und ihre weiteren KollegInnen
hatte ich einen sehr netten Aufenthalt in Freiburg.
Der Volkswagen-Stiftung danke ich für die ﬁnanzielle Unterstützung zur Durchführung dieser Arbeit im Rahmen des Schwerpunktprogrammes: “Intra- und Intermolekularer Elektronentransfer”. Die Tagungen, die im Rahmen dieses Schwerpunktprogrammes stattgefunden haben,
waren sehr anregend.
Rafael Jordan hat mich bei den Redoxtitrationen und bei Corel Draw Zeichnungen beraten.
Für seine Hilfsbereitschaft möchte ich mich herzlich bedanken. Marianne Çetin hat mich mit
viel Geschick bei den Blitzlichtmessungen unterstützt. Dem Engagement von Dirk Linke und
Dr. J. Franke verdanke ich die Möglichkeit, Circulardichroismus- und Fluoreszenzmessungen
durchführen zu können.
Bei Herrn Prof. Dr. U. E. Steiner möchte ich mich für die Vermittlung vieler theoretischer
Grundlagen während meiner Diplomarbeit bedanken, die sich auch für diese Arbeit als äußerst
nützlich erwiesen haben.
Die Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Lubitz – Günther Bleifuß, Beatrix Blümel, Marc (Han-
nes) Brecht, Celine Elsäßer, Dr. Robert Fiege, Stefanie Foerster, Dr. Catherine Fursman, Irene
Geisenheimer, Wulf Hofbauer, Michael Kammel, Matthias Kolberg, Dr. Ludwig Krabben, Rolf
Kunert, Dr. habil. G. Laßmann, Dr. F. Lendzian, Francesco Milano, Dr. J. Messinger, Dr. Frank
Müh, Kai Schäfer, Claudia Schulz, Matthias Stein, Christian Teutloﬀ, Olga Trofantschuk, Dr.
Heike Witt, Dr. Stephan G. Zech und Dr. Alfonso Zoleo – sorgten mit ihrer Hilfsbereitschaft für
eine angenehme Arbeitsatmosphäre und eine fröhliche, aufmunternde Stimmung.
Den Jongleuren von Circulum e. V., den Damen vom Schlachtensee und allen Freunden
danke ich für die netten, abwechslungsreichen Nebenbeschäftigungen.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, meiner Oma und Christof für ihre Unterstützung
und die Lebensfreude, die sie vermitteln. Ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.
Lebenslauf
Name
Geburtsdatum
Geburtsort
Eltern
Monika Fahnenschmidt
19.12.70
Sindelﬁngen
Gerhard Fahnenschmidt
Mechthild Fahnenschmidt
Ausbildung
1977 – 1981
Grundschule Eschenried, Sindelﬁngen
1981 – 1990
Gymnasium in den Pfarrwiesen, Sindelﬁngen
5/1990
Abitur
1990 – 1993
Chemiestudium an der Universität Konstanz
1993 – 1994
Auslandsstudienaufenthalt an der
Oregon State University, USA
1994 – 1996
7/1996
10/1996
Chemiestudium an der Universität Konstanz
Diplom in Chemie
Beginn der Dissertation an der Technischen
Universität Berlin
Tätigkeiten
1993
freie Mitarbeiterin in einem archeobotanischen Labor
11/1995 & 09/1996
wissenschaftliche Hilfskraft an der Universität Konstanz
1996 – 2000
wissenschaftliche Mitarbeiterin am Max-Volmer-Institut
für Biophysikalische Chemie und Biochemie der
Technischen Universität Berlin

Zugehörige Unterlagen

Topologische K

Lösungsskizze - (IGPM) | RWTH Aachen

De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren

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