Grundlagen der Zellulären Biochemie

Grundlagen der Zellulären Biochemie
Enzymkatalyse
Vorlesung zum Modul BCB P07
im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover
Prof. J. Alves, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH
Katalysemechanismen
Grundsätzlich katalysieren Enzyme Reaktionen mit den gleichen Mechanismen
wie sie chemische Katalysatoren auch nutzen. Sie sind durch die Evolution nur
häufig effizienter.
Typen katalytischer Mechanismen:
gezeigtes Beispiel:
Säure-Base-Katalyse
Spaltung von RNA RNAse A
Kovalente Katalyse
Spaltung von Proteinen durch Serinproteasen
Metallionenkatalyse
HCO3--Bildung durch Carboanhydrase
Elektrostatische Katalyse
Aldolspaltung durch Klasse II-Aldolasen
Nähe- und Orientierungseffekte
Oxidation von Fettsäuren durch AcylCoA-Dehydrogenase
Bindung des Übergangszustands
Bildung des Aminoadenylats durch die
Tyrosyl-tRNA-Synthetase
Es ist durchaus häufig, dass Enzyme gleich mehrere Mechanismen gleichzeitig
nutzen. Das liegt schon zum Teil in der Natur der Sache, da zum Beispiel die Bindung umzusetzender Substrate notwendigerweise auch ihre Orientierung bedingt.
Stabilität von DNA und RNA in alkalischer Lösung
Die Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in alkalischer Lösung verläuft durch
einen direkten Angriff von OH- auf das +-Phosphoratom über einen pentakoordinierten Übergangszustand.
Dadurch, dass das +-Phosphoratom von vier -Sauerstoffatomen umgeben ist, werden die angreifenden, negativ geladenen Hydroxylionen aber
bevorzugt abgestoßen und Phosphodiesterbindungen in DNA und RNA sind stabiler, als es die Hydrolyseenergie erwarten ließe.
In der RNA ist dafür aber
die 2´-OH-Gruppe so positioniert, dass sie einen
intramolekularen Angriff
starten kann, wenn sie
deprotoniert wird.
In alkalischer Lösung leitet also die Abstraktion eines Protons die
Selbstspaltung der RNA ein, während die DNA stabil ist. Deshalb hat
wohl die DNA die langfristige Speicherung genetischer Information
übernommen, als die Genome größer wurden.
Animation
RNA-Spaltung durch RNAse A
Die RNAsen unterstützen die Eigenspaltung der RNA durch Säure-Base-Katalyse.
In der RNAse agiert ein deprotoniertes Histidin als Base, die das Proton am 2´-OH
abstrahiert, sodass der Angriff am Phosphodiester erfolgen kann. Das 5´-O- der
Fluchtgruppe wird durch ein zweites, protoniertes Histidin (Säure) protoniert.
Dieses zweite Histidin leitet dann die Spaltung des
gebildeten zyklischen Phosphodiesters durch Wasser ein, bei dem beide Histidine in ihren Ausgangszustand zurück versetzt werden.
Das pH-Profil der RNAse A passt zu der Beteiligung
zweier Histidine an der Reaktion.
Serinproteasen
Serinproteasen enthalten eine katalytische Triade aus Aspartat, Histidin und Serin,
die das Serin für einen nukleophilen Angriff auf eine Peptidbindung aktiviert.
Aspartat und Histidin sind in
ihren pK-Werten weitgehend
angeglichen, sodass sie sich
ein Proton gleichwertig teilen.
Die resultierende Wasserstoffbrückenbindung ist besonders kurz.
So wird das Histidin in die Lage versetzt, das
Proton vom Serin zu übernehmen, sodass es mit
einem negativ geladenen Sauerstoff nukleophil
an Substraten angreifen kann.
Diese katalytische Triade ist wohl so gut an die
katalytischen Anforderungen angepasst, dass
sie sich in der Evolution mehrfach bei verschiedenen Enzymen gebildet hat. So findet man sie
in Peptidasen, Lipasen und Thioesterasen.
Ablauf der Proteolyse durch Serinproteasen
Serinproteasen katalysieren die
Spaltung von Proteinen durch
kovalente Katalyse.
In der katalytischen Triade wird
Serin durch Histidin deprotoniert (auch Säure-Base-Katalyse) und bildet durch nukleophilen Angriff auf die Carbonylgruppe eine kovalente Bindung
zur Aminosäure vor der zu spaltenden Peptidbindung.
Das Histidin protoniert die Aminogruppe, was zur Spaltung der
Peptidbindung führt.
Das C-terminale Teilpeptid dissoziiert ab und Wasser tritt an
seine Stelle.
Dieses wird vom Histidin zum
Angriff auf die Enzym-PeptidBindung durch Abstraktion eines Protons aktiviert.
So kann das Serin wieder freigesetzt und reprotoniert werden
und das N-terminale Peptid dissoziiert ab.
Spezifität der Serinproteasen
Serinproteasen sind spezifisch für
Aminosäurereste neben der zu spaltenden Peptidbindung.
Das beruht auf entsprechend ausgestatteten Bindungstaschen, die das
Substrat für die Katalyse fixieren.
Trypsin
Tatsächlich wird der tetraedrische Übergangszustand nach dem Angriff des Serins am stärksten gebunden (auch Katalyse durch Stabilisierung des Übergangszustands).
Zymogene
Es wäre fatal für die Zellen, wenn die im Pankreas produzierten Verdauungsproteasen schon intrazellulär aktiv wären.
Deshalb werden sie als inaktive Vorstufen (Zymogene) gebildet, deren Substratbindungstaschen
deformiert sind.
Sie werden erst im Darm durch limitierte Proteolyse (Spaltung an einzelnen spezifischen Peptidbindungen) aktiviert.
Ähnlich laufen die Aktivierungen inaktiver Vorstufen
bei der Blutgerinnung und
der Komplementaktivierung im Blut sowie der Aktivierung der Caspasen zur
Auslösung der Apoptose.
Dabei handelt es sich aber
um kaskadenartig sich
ausbreitende Aktivierungen, bei denen eine Protease die nächste aktiviert
und so weiter.
Metallionenkatalyse: Carboanhydrase
Man unterscheidet Metalloenzyme, in denen meist Übergangsmetallionen (Fe2+,
Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ oder Co3+) fest gebunden sind, von Metall-aktivierten Enzymen, die locker Metallionen aus der Lösung (Na+, K+, Mg2+oder Ca2+) anlagern.
In Metalloenzymen spielen die Kationen auch
eine wichtige strukturelle Rolle, da sie mehrere
Aminosäuren als Liganden auf engem Raum
zusammen bringen, die sich sonst oft anders
anordnen würden.
Metallionen können auf unterschiedliche Weise
an der Katalyse beteiligt sein.
Sie können in Redoxreaktionen reversibel Elektronen aufnehmen / abgeben. Carboanhydrase
Sie können Wassermoleküle als Liganden aufnehmen, ihre Deprotonierung unterstützen und als OHfür Reaktionen zur Verfügung stellen.
So beschleunigt die Carboanhydrase deutlich die
Bildung von Hydrogencarbonat durch den nukleophilen Angriff von OH- aus der Hydrathülle des gebunden Zn2+-Ions.
Eine Reihe von Hydrolasen arbeiten so als Metallaktivierte Enzyme.
Enzymatische Katalyse in Aldolasen der Klasse II
Die katalytischen Zentren von Enzymen sind generell komplementär zu den zu
bindenden Substraten aufgebaut. Dabei werden vor allem auch Gegenladungen
zu geladenen Teilbereichen der Substrate angeboten. Geschieht dies bevorzugt
für sich aufbauende Ladungen im Übergangszustand handelt es sich um eine
Elektrostatische Katalyse.
Aldolasen katalysieren
reversibel die Aldolspaltung bzw. Aldolkondensation, indem
sie das intermediär
gebildete Enolat stabilisieren.
Basenkatalyse
Mehrfach geladene Kationen sind
natürlich besonders gut geeignet,
negative Ladungen zu stabilisieren
(auch Metallionenkatalyse).
Tatsächlich wird das Enolat des
Übergangszustandes am stärksten gebunden (auch Katalyse
durch Stabilisierung des Übergangszustands).
Oxidation von Fettsäuren durch Acyl-CoA-Dehydrogenasen
Gerade in Redoxreaktionen ist es notwendig, die Reaktionspartner in optimaler
Weise zueinander zu positionieren, damit Elektronen und evtl. auch H+-Ionen
übertragen werden können: Katalyse durch Nähe- und Orientierungseffekte.
Als Beispiel ist hier eine Acyl-CoA-DeMittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase
hydrogenase gezeigt, die die erste
Reaktion der ß-Oxidation von Fettsäuren im Mitochondrium katalysiert.
Dabei werden zwei Elektronen aus der gesättigten Kohlenwasserstoffkette auf ein enzymgebundenes Flavin-Coenzym übertragen.
Die beiden Reaktionspartner müssen sich dazu nicht direkt berühren. Für ein
„Tunneln“ der Elektronen reicht eine entfernte minimale Überlappung von Orbitalen aus.
Tyrosyl-tRNA-Synthetase
An der Tyrosyl-tRNA-Synthetase wurde zum ersten Mal etabliert,
wie man durch zielgerichtete Mutagenese auf die Bedeutung
einzelner Aminosäuren für die Katalyse zurückschließen kann.
Die Beladung einer tRNA mit der zugehörigen Aminosäure erfolgt in zwei Schritten. Zuerst wird AMP unter Abspaltung von
Pyrophosphat an die Aminosäure in einer Anhydridbindung gebunden. Dann wird sie unter Abspaltung von AMP auf das CCAEnde der tRNA übertragen.
Aus der Struktur folgte, dass das Pyrophosphat im Übergangszustand ein Threonin und ein Histidin als neue Bindungspartner
gewinnt.
Die Mutagenese dieser beiden Aminosäuren veränderte Vmax
deutlich aber ließ beide KM-Werte fast unbeeinflusst.
Damit war nachgewiesen, dass die Katalyse über die Stabilisierung des Übergangszustands läuft.
R.J. Leatherbarrow, A.R. Fersht & G. Winter PNAS USA 82 (1985) 7840-7844