Mikrobiologisches Praktikum im Grundmodul GM12

Mikrobiologisches Praktikum
im Grundmodul GM12
2017
Mikrobiologie
der Technischen Universität Kaiserslautern
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Inhaltsverzeichnis
1
1.1
2
2.1
2.2
3
4
4.1
4.2
5.
5.1
5.2
Beschreibung der Praktikumsversuche
Untersuchung der Bodenflora
Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe
Untersuchung der Flora des Mund- und Nasenraumes
Isolierung von Streptococcus spp.
Isolierung von Staphylococcus spp.
Wachstum von Bakterien.
Erstellen einer Wachstumskurve.
Antibiotische Substanzen
Erstellen eines Antibiogramms von E. coli und Staphylococcus carnosus
Lantibiotika Produktion von Staphylococcus
Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale
Katalase
Verwertung von Zuckern
Anhang
Material, Medien, Lösungen
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BESCHREIBUNG DER PRAKTIKUMSVERSUCHE
Vorbemerkung:
Eine wesentliche Voraussetzung für mikrobiologische Experimente ist das sterile Arbeiten. Durch Vorsichtsmaßnahmen
soll gewährleistet werden, dass Mikroorganismen, die sich in der Luft, auf Oberflächen, auf Personen befinden, keinen
Eingang in die Experimente finden.
Ebenso ist darauf zu achten, dass die Bakterien, die aus der Umwelt (Boden, Körper) isoliert und vermehrt wurden, nicht
unkontrolliert im Labor weiterverbreitet werden. Vor allem die Kontamination von Personen mit den Isolaten sollte
vermieden werden. Dementsprechend sollte mit bakteriellen Kulturen vorsichtig und ruhig umgegangen werden.
Steriles Arbeiten:
Sterile Gefäße immer geschlossen halten, zum Gebrauch so kurz wie möglich öffnen. Das Öffnen geschieht stets in der
Nähe der Bunsenbrennerflamme. Vorher werden Flaschen und Reagenzgläser kurz am Hals abgeflammt, damit dort warme
Luft das Eindringen kalter, unsteriler Luft verhindert. Vor dem Schließen wird der Gefäßrand kurz abgeflammt. Nicht über
geöffnete Gefäße greifen, da Keime hineinfallen können. Die Gefäßdeckel wenn möglich in der Hand behalten.
Pipettenbehälter werden nur zur Entnahme geöffnet; Pipetten vor Gebrauch kurz durch die Bunsenbrennerflamme ziehen.
Falls die Pipette berührt wird, nicht mehr benutzen.
Allgemein ist Zugluft zu vermeiden, da die Wirkung der Erwärmung in der Umgebung des Bunsenbrenners zerstört wird.
1. Untersuchungen zur Bodenflora
1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe
1 g Bodenprobe wird in einer Schüttelflasche mit 99 ml sterilem 0.9 % NaCl durch 5-minütiges Schütteln suspendiert und
dann davon die Verdünnungsstufen 10-3, 10-4 und 10-5 hergestellt. Davon und von der 10-2 Verdünnung werden jeweils
0.1ml auf LB Agar Platten ausgestrichen. Inkubation der Platten über Nacht bei 37°C. Durch Auszählen der bewachsenen
Platten wird anschließend die Keimzahl pro Gramm Boden bestimmt.
Die Organismen aus einigen Kolonien werden einem Katalase Test (5.1) unterzogen.
Anlegen einer Verdünnungsreihe:
Verdünnungsschritte:
1:100
Verdünnungsstufe:
1:10
10-2
1:10
10-3
1:10
10-4
10-5
0,1 ml der Verdünnungsstufen 10-2, 10-3 , 10-4 und 10-5 werden auf LB-Agar mittels eines Drigalski-Spatels ausgestrichen.
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Ausplattieren mit dem Drigalski Spatel:
1. Bakteriensuspension auf die Mitte einer Agar Platte geben. Sofort weiterarbeiten. Nicht lange stehen lassen, da die
Flüssigkeit einziehen könnte.
2. Drigalski Spatel in eine Schale mit reinem Ethanol tauchen. Ethanol abtropfen lassen.
3. Spatel durch die Flamme eines Bunsenbrenners ziehen. Am
Spatel verbliebenes Ethanol abbrennen lassen. Spatel nicht
extrem erhitzen.
4. Spatel am Rand auf den Agar auftupfen, um den Spatel Glas vollständig abzukühlen.
Bakteriensuspension gleichmäßig auf dem Agar verteilen. Eine Weile aufrecht
stehen lassen. Danach umdrehen und inkubieren.
2.1 Isolierung von oralen Streptokokken (Streptococcus spp.)
Mit einem sterilen Wattestäbchen werden Abstriche von der Mundschleimhaut auf einer D-Blutagar Platte ausgestrichen..
Die Platte wirdbei 37°C über Nacht inkubiert.
Nach der Inkubation sollen die Kolonien der unterschiedlichen Ausstriche verglichen werden. Die Koloniemorphologie und
und eventuell auftretende Hämolyse sollen beschrieben werden. Die Zellen von unterschiedlichen Kolonien werden einem
Katalasetest unterzogen.
In diesen Ausstrichen können sich verschiedene Streptokokken, wie z.B. Streptococus mitis, S. oralis, S. mutans, S.
salivarius befinden. Andere bakterielle Spezies können unter Umständen ebenfalls vorhanden sein.
2.2 Isolierung von Staphylokokken
Mit einem sterilen Wattestäbchen wird ein Abstrich des Nasenraumes auf einer Baird-Parker-Agar Platte ausgestrichen.
Zusätzlich können weitere Abstriche, z.B. Ohr, Haut, Haaransatz angefertigt werden. Platten über Nacht bei 37°C bebrüten.
Schwarze, gut wachsende Kolonien auf Baird-Parker-Agar stellen Staphylococcus aureus dar, graue, langsamer
wachsende Kolonien sind wahrscheinlich Staphylococcus epidermidis oder andere Staphylokokken. Einige Kolonien
werden einem Katalase Test (5.1) unterzogen.
3. Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve
In dem Versuch soll das Wachstum bakterieller Kulturen durch die Messung der optischen Dichte verfolgt werden. In einer
wachsenden Bakterienkultur wird durch Zellteilung die Zahl der Organismen erhöht, was zu einer Zunahme der Trübung
des Mediums führt. Die Messung der Trübung, d.h. der optischen Dichte kann daher zur Bestimmung des bakteriellen
Wachstums genutzt werden.
Drei Röhrchen mit 5 ml Kulturmedium werden mit je 0.5 ml Übernachtkultur oder Glycerinkultur von drei Test Bakterien,
Escherichia coli, Staphylococcus carnosus und Streptococcus pneumoniae, beimpft. Von den beimpften Kulturen wird im
Photometer die optische Dichte bei 600 nm (OD600) bestimmt.. Danach werden die Kulturen ohne Belüftung bei 37°C im
Wasserbad inkubiert und in Intervallen von. 45 Min. – 60 Min. wird die OD600 gemessen. Die erhaltenen Werte werden auf
sog. Halb-logarithmisches Papier aufgetragen. Die Einteilung der Zeitachse erfolgt linear, das Auftragen der OD600 erfolgt
dagegen logarithmisch. Im linearen Teil der Kurve kann die Verdopplungszeit abgelesen und damit die Wachstumsrate
bestimmt werden.
Die Kulturen werden nach dem Ende der Messungen am Nachmittag in den 37°C Brutraum gestellt. Am nächsten Morgen
werden die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Zum Abschluss der Wachstumskurve wird noch einmal die OD600
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gemessen. Zwei der Kulturen werden für die Versuche zur Antibiotikaresistenz und für den Lantibiotikaversuch
weiterverwendet.
4. Antibiotische Substanzen
4.1 Erstellen eines Antibiogramms
In diesem Versuch wird das Antibiogramm von Escherichia coli als Vertreter Gram-negativer Bakterien und von
Staphylococcus carnosus als Vertreter Gram-positiver Bakterien erstellt. Für diesen Test werden die E. coli und S. carnosus
Kulturen der ersten Wachstumskurve benutzt. Jeweils 0,1 ml der Kulturen werden auf je eine LB-Agar Platte mit dem
Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die ausplattierte Flüssigkeit soll dann für ca. 1 Stunde in den Agar einziehen.. Danach
werden 6 Filterplättchen, die verschiedene Antibiotika enthalten, auf die Platte aufgebracht und diese über Nacht bei 37°C
bebrütet. Zur Auswertung wird die Größe der Hemmhöfe bestimmt. In diesem Versuchsteil wird die Wirkung von
Cephalotin (ein Cephalosporin), Chloramphenicol, Erythromycin , Rifampin, Streptomycin und Tetracyclin untersucht.
4.2 Produktion von Lantibiotika durch Staphylococcus
Eine Gruppe von antibakteriellen Peptiden zeichnet sich durch das Vorhandensein von Lanthionin aus und werden deshalb
als Lantibiotika bezeichnet. Lantibiotika werden von einer Reihe von Bakterien produziert, unter anderem von
verschiedenen Staphylokokken. In dem Versuch werden vier Staphylokokken auf die Produktion von Lantibiotika
untersucht. Dazu werden je 0.1 ml der unter 3. beschriebenen Kulturen von E. coli und von S. carnosus auf eine LB-Agar
Platte ausgestrichen (Drigalski). Nach Eintrocknen (ca. 1 Stunde) werden die verschiedenen Staphylokokken mit einem
sterilen Zahnstocher oder mit der Impföse von der Agar Platte abgenommen und in einer Linie über die vorplattierten
Testplatten gestrichen. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Hemmhöfe zeigen die Produktion von
Lantibiotika an.
5. Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale
5.1 Nachweis von Katalase
Das Enzym Katalase produziert aus H2O2 Sauerstoff und Wasser. Das Vorhandensein von Katalase kann mit verdünnter
H2O2-Lösung (3% in H2O) getestet werden. Man tropft die Lösung entweder auf Kolonien auf Agar-Platten oder man
überträgt eine Impföse Bakterien auf einen Objektträger und tropft dort die H2O2-Lösung auf. Das Aufschäumen
(Sauerstoffbildung) zeigt die Katalase Aktivität an. In dem Experiment sollen Katalase Tests mit Eigenisolaten (Boden,
Mund, Nase, 1.1, 1.2, 2.1, 2.2) durchgeführt werden.
5.3 Verwertung von Zuckern
Die Verwertung von Zuckern wird häufig durch die Bildung von Säure angezeigt. Eine Reihe von Nachweisen zur
Zuckerverwertung beruht auf dem Nachweis der Säureproduktion durch geeignete pH Indikatoren.
5.3.1 Nachweis der Lactose-Verwertung; Nachweis der ß-Galactosidase Aktivität
Zum Nachweis der Lactose-Verwertung werden zwei Agar Platten eingesetzt, Chinablau-Lactose Agar und MacConkey
Agarplatten. In beiden Agarplatten ist Lactose enthalten. Der Abbau der Lactose wird in beiden Platten durch ein Ansäuern
des Mediums mit Hilfe von pH-Indikatoren angezeigt. Auf Chinablau-Lactose Agar erscheinen Lactose-fermentierende
Organismen blau, auf MacConkey Agar dunkelrot.
Chinablau-Lactose Agar enthält keine Hemmstoffe, er ist also geeignet für Gram-positive und Gram-negative Bakterien,
MacConkey Agar enthält dagegen Gallensalze und Kristallviolett, wodurch das Wachstum von Gram-positiven Bakterien
gehemmt wird.
Die Aktivität der ß-Galactosidase, des Enzyms, das für die Spaltung von Lactose in Glucose und GaLactose verantwortlich
ist, kann auf Agar Platten nachgewiesen werden, die das chromogene Substrat X-Gal ((5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-DGalactopyranoside) enthalten. Die Aktivität der ß-Galactosidase ist an der Entwicklung einer blauen Farbe erkennbar.
Die zu testenden Organismen werden auf den Platten mit der Impföse ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
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Anhang
Material, Medien, Lösungen
Nährböden/Medien
Die Angaben gelten, wenn nicht anders vermerkt, für 1 l dest. Wasser. Zur Verfestigung Zusatz von 1,5 % (g/v) Agar.
LB-MEDIUM / LB-AGAR
Zusammensetzung:
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
(g/l)
10,0
5,0
10,0
(Agar
15,0)
LB-X-Gal Agar Platten
Zugabe von 60µg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-Galactopyranosid).
THB-Medium (Todd-Hewitt Broth)
Komplex-Medium zur Anzucht von verschiedenen Bakterien, u.a. Streptococcus pneumoniae.
Zusammensetzung:
Herzinfusion
Pepton
Glucose
Natriumcarbonat
Natriumchlorid
Dinatriumphosphat
ad 1000ml
3,1 g
20,0 g
2,0 g
2,5 g
2,0 g
0,4 g
D-AGAR
(Blutagarplatten für S. pneumoniae oder Streptococcus mitis)
Zusammensetzung:
(g/l)
Glucose
Bactopepton
Neopepton
Yeast-extract (Hefe-Extract)
NaCl
Tris
AGAR
1
10
5
1,25
5
1,25
16,5
Pro 100 ml Medium werden 3 ml defibriniertes Schafsblut zugegeben gut durchmischt und dann umgehend die Platten
gegossen. Zu heißer Agar führt zum Platzen der Erythrocyten und zu einer Braunfärbung der Platten!
BAIRD PARKER AGAR
Verwendungszweck: Nachweis von Staphylococcus aureus.
Schwarze Kolonien zeigen die aerobe Reduktion von Tellurit zu metallischem Tellur an. Natriumpyruvat und Glycin
wirken auf Staphylokokken wachstumsfördernd, während Lithiumchlorid und Tellurit auf die übrige Begleitflora hemmend
wirkt.
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Zusammensetzung:
(g/l)
Pepton aus Casein 10,0; Fleischextrakt 5,0; Hefeextrakt 1,0; Natriumpyruvat 10,0; Glycin 12,0; Lithiumchlorid 5,0; Agar
15,0.
Zubereitung: 58 g des Trockennährbodens werden in 950 ml destilliertem oder voll-entsalztem Wasser suspendiert, 15 min
eingeweicht, zum Lösen vorsichtig erhitzt und 1 min gekocht. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven bei 121°C für 15
min. Danach wird das Medium auf ca. 48 - 55°C abgekühlt. Danach 50 ml einer Eigelb-Tellurit Emulsion zugeben.
CHINABLAU LACTOSE AGAR
Nährboden zur Unterscheidung Lactose-positiver und Lactose-negativer Mikroorganismen sowie zur Keimzahlbestimmung
in Milch.
Wirkungsweise:
Der Nährboden ohne Hemmstoffe enthält Lactose als C-Quelle, deren Abbau zu Säure vom pH-Indikator Chinablau durch
einen Farbumschlag von farblos nach blau angezeigt wird.
Zusammensetzung:
Fleischextrakt
Pepton aus Casein
Natriumchlorid
Lactose
Chinablau
Agar
(g/l)
3,0
5,0
5,0
10,0
0,375
12,0
pH 7,0  0,2
Zubereitung:
35,5 g /Liter, durch Erhitzen lösen, 15 min autoklavieren
MacConkey Agar
Der Agar ist ein Selektivmedium zur Isolierung und zum Nachweis von Enterobakterien in klinischem Material, Wasser,
Milch, Milchprodukten und anderen Nahrungsmitteln.
Wirkungsweise:
Durch Kristallviolett und Gallesalze werden die Grampositiven Keime weitgehend unterdrückt. Die Lactose dient zur
Differenzierung von Lactose-positiven und -negativen Bakterien. Lactose-abbauende Mikroorganismen bilden Säure. Die
Reduktion des pH wird durch Neutralrot angezeigt. Lactose-positive Kolonien sind dunkelrot.
Zusammensetzung:
MacConkey-Agar (in g/l) (Mengen für 1 Liter):
Bacto Pepton 20,0
Bacto Gallensalze 3,0
NaCl 5,0
Neutralrot 0,03
Kristallviolett 0,001
Lactose 10,0
Agar 13,5
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