Doktorarbeit Bijan Shahbazi

Aus dem Department Innere Medizin
Klinik für Innere Medizin II (Schwerpunkt: Gastroenterologie,
Hepatologie, Endokrinologie und Infektiologie)
der Albert-Ludwig-Universität Freiburg i. Br.
Adenovirale Überexpression von
Glycoprotein gp 96 in Tumorzellen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2011
von Bijan Shahbazi
geboren in Teheran/Iran
Dekanin:
Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
Erster Gutachter:
Prof. Dr. Leonhard Mohr
Zweiter Gutachter:
Prof. Dr. Christian Schlensak
Jahr der Promotion:
2014
INHALT
1.
Einleitung
1
1.1
Tumorimmunologie
1
1.2
Glycprotein 96 (gp96) ein Hitzeschockprotein
1
1.3
Immunologischer Einfluss von Hitzeschockproteinen gp96 und hsp 70
2
1.4
Vakzinierung mit gp96
3
1.5
MHC I Antigen Prozessierungsweg
4
1.6
Gentransfer mit adenoviralen Vektoren
5
1.7
Ziele der Arbeit
6
2.
Material und Methoden
7
2.1
Material und biologische Proben
7
2.1.1
Antibiotika
7
2.1.2
Antikörper und rekombinante Proteine
7
2.1.3
Chemikalien und Substanzen
7
2.1.4
Geräte und Verbrauchsmaterialien
9
2.1.5
Zellkulturmedien und Zellinien
10
2.1.6
Verwendete Plasmide
11
2.1.7
Software
13
2.2
Methoden
13
2.2.1
Zellbiologische Methoden
13
2.2.1.1
Kultivierung von Zellen
13
2.2.1.2
Bestimmung der Zellzahl
13
2.2.1.3
Kryokonservierung von Zellen
14
2.2.1.4
Auftauen von Zellen
14
2.2.2
Molekularbiologische Methoden
14
2.2.2.1
Untersuchung der DNA-Konstrukte
14
2.2.2.2
Transformation von E.coli mit Plasmid-DNA
14
2.2.2.3
Präparation zur Isolierung und Amplifikation von Plasmid-DNA
15
2.2.2.4
Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA/RNA
16
2.2.2.5
Analytischer Restriktionsverdau
16
2.2.2.6
Agarose-Gelelektrophorese
16
2.2.2.7
Restriktionsverdau
17
2.2.2.8
Elution von DNA-Fragmenten
17
2.2.2.9
Ligation von DNA-Fragmenten
18
INHALT
2.2.2.10 Calciumphosphat-Transfektion von Hepa1.6-, HEK 293-,
sowie 911-Zellen
18
2.2.3
Biochemische Methoden
19
2.2.3.1
Untersuchung der gp96-Protein-Expression
19
2.2.3.2
Zelllyse mit Triton-Lysepuffer
19
2.2.3.3
Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford assay
20
2.2.3.4
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
20
2.2.3.5
Western Blot
21
2.2.4
FACS-Analyse
22
2.2.4.1
Prinzip der Durchflußzytometrie (FACS)
22
2.2.4.2
MHCI Oberflächenexpression von Hepa1.6 Zellen
22
2.2.5
Indirekte Immunfluoreszenz-Zytologie
23
2.2.6
Virologische Methoden
24
2.2.6.1
Infektion mit rekombinanten Adenoviren
24
2.2.6.2
Herstellung des rekombinanten Adenovirus Adgp96
24
2.2.6.3
Amplifikation der rekombinanten Adenoviren
24
2.2.6.4
Aufreinigung von Adenoviren mittels doppelter Caesiumchloridgradienten 24
2.2.6.5
Bestimmung der Menge an viraler DNA mittels OD-Messung
2.2.6.6
Bestimmung des Virustiters mittels TCID50
25
(tissue culture infectious dose)
26
2.2.6.7
Aufkonzentrierung der Virussuspensionen
26
3.
Ergebnisse
27
3.1
Klonierung von Ad5gp96
27
3.1.1
Klonierung pcDNA 3.1(+) gp96
27
3.1.2
Subklonierung des gp96 in Transfervektor shCMV
30
3.1.3
Homologe Rekombination zwischen shCMVgp96 und adenoviraler DNA
31
3.2
Expression des Konstruktes pAd5gp96 in HEK 293 Zellen
33
3.2.1
Infektion von verschiedenen Zellinien mit Ad5gp96
34
3.3
Immunfluoreszenz Mikroskopie von Ad5gp96 infizierten Zellinien
35
Zusammenfassung der Klonierung von Ad gp96
37
3.4
Einfluß des gp96 auf die MHC I Expression
38
3.4.1
Oberflächenexpression des MHC I nach Interferon alpha
3.4.2
bzw. gamma Stimulation
38
MHC I Expression nach Ad5gp96 Infektion von Hepa1.6 Zellen
40
INHALT
4.
Diskussion
43
4.1
Der Vektor Ad5gp96 in der Gentherapie
43
4.2
Einfluß des gp96 auf das MHC I System
44
4.3
Überexpression von gp96 nach Ad5gp96 Infektion
47
4.4
Einsatzmöglichkeiten von Ad5gp96
48
5.
Zusammenfassung
50
6.
Literatur
51
7.
Danksagung
58
8.
Lebenslauf
59
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
aa
aminio acid
Abb.
Abbildung
Ad5gp 96
Adenovirus Typ 5 mit der cDNA von gp 96
APC
Antigen präsentierende Zellen
APS
Ammoniumperoxidisulfat
bp
Basenpaar
BSA
bovine serum albumin
CD
Cluster of Differentiation
CMV
Cytomegalievirus
DC
Dendritische Zellen
dH2O
zweifach destilliertes Wasser
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DMSO
Dimethylsulfoxid
ECL
enhanced chemoluminescence
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ER
endoplasmatisches Retikulum
ERAAP
ER assoziierte Aminopeptidase
FACS
fluorescence activated cell sorter
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
gp 96
Glykoprotein 96
HCC
hepatozelluläres Karzinom
Hsp
Hitzeschockprotein
IgG
Immunglobulin G
Lsg.
Lösung
mAb
monoklonaler Antikörper
MCS
Multiple cloning site
MFI
mean fluorescence intensity
MHC
major histocompatibility complex
min
Minute
MOI
multiplicity of infection
MW
molecular weight
NC
negative control
NK
natürliche Killerzelle
nm
Nanometer
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
NP40
Nonidet-40
N-terminal aminoterminal
OD
optische Dichte
ORF
offener Leserahmen
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS
phosphate bufferd saline
PCR
polymerase chain reaction
PE
Phycoerythrin
pfu
plaque forming unit
pH
potentia hydrogenii
PKR
double-stranded RNA-dependent protein kinase
PVDF
Polyvinyliden-Difluorid
rpm
revolutions per minute
RT
Raumtemperatur
SDS
sodium dodecyl sulfate
Tab.
Tabelle
TAP
Transporter associated with antigen processing
TGF
Transforming growth factor
Th1
T-Helferzelle
TLR
Toll-like-Receptor
Tris
Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
UTR
untranslatierte Region
v
volume
w
weight
EINLEITUNG
1
1. Einleitung
1.1 Tumorimmunologie
Maligne Tumoren exprimieren Tumorantigene, die entweder spezifisch für jeden individuellen Tumor sein können oder die überexprimierte tumorassozierte Antigene darstellen, die auch in geringem Umfang in normalen Geweben vorkommen (38, 54). Obwohl
das Immunsystem im Rahmen der Tumorprogression mit diesen Fremdantigenen
konfrontiert wird, kommt es natürlicherweise nur selten zu einer effizienten
Immunreaktion gegen das Tumorgewebe (41, 75). Hierbei spielen Mechanismen von
Tumorzellen, die eine Immunreaktion unterdrücken können, eine wichtige Rolle. Hierzu
gehören eine reduzierte MHC-Expression (71) oder die Expression von lokal immunsupressiven Faktoren, wie Tumor Growth Factor (67), Fas-Ligand (26) sowie die
Entstehung einer immunologischen Toleranz (35,22). Ein Durchbrechen dieser immunologischen Toleranz ist das Ziel immuntherapeutischer Ansätze der Tumortherapie. Für
die Induktion einer wirkungsvollen zellulären Immunreaktion gegen Tumoren spielen
folgende immunologische Mechanismen eine entscheidende Rolle, bei denen Antigen
präsentierende Zellen (APCs), und unter diesen vor allem dendritische Zellen (DCs),
eine Schlüsselposition einnehmen (9). Ein Tumor muß geeignete Tumorantigene exprimieren, die von den Vorläufer T-Zellen erkannt werden können. APCs müssen dann in
das Tumorgewebe eindringen, eine ausreichende Zahl von Tumorantigenen aufnehmen
und durch ein TH1 gewichtetes Zytokinmilieu derart aktiviert werden, daß sie die aufgenommenen Antigene zusammen mit kostimulatorischen Molekülen in den abhängigen lymphatischen Geweben auf MHC I und II Molekülen präsentieren. Normalerweise
finden sich in Tumoren nur sehr wenige Immunzellen, die zumeist auch nicht aktiviert
sind. Dadurch kommt es zu einer geringen Antigenpräsentation, die zudem ohne ausreichende Kostimulation zu einer Induktion von immunologischer Toleranz und Anergie
der spezifischen T-Zellen führt (22).
1.2 Glycprotein 96 (gp96) ein Hitzeschockprotein
Das gp96 ist ein Glycoprotein mit einem molekularen Gewicht von 96 kDa, welches sich
überwiegend in der Membran des endoplasmatischen Reticulums befindet. Es gehört
EINLEITUNG
2
zur Familie der cytosolischen Hsp 90 Chaperone. Obwohl vor nunmehr über 10 Jahren
demonstriert werden konnte, dass dieses Protein in die Reihe der Hitzeschockproteine
einzuordnen ist (36), ist die Liste der potentiellen Bindungspartner für gp96 relativ
überschaubar. Die meisten Bindungspartner dieses Chaperones gehören entweder zu
der Kategorie von Zelloberflächenproteinen bzw. zu -rezeptoren, wie z.B. MHC Klasse
II, die Integrine, die Toll like Rezeptoren oder zu Proteinen und Enzymen, welche in der
Modifikation von sekretorischen Proteinen involviert sind, wie die Golgi appartus casein
kinase oder die Bile salt dependent Lipase (78). Somit wird eine besondere Rolle in der
Modulation des Immunsystems dem gp96 zuteil.
1.3 Immunologischer Einfluss von Hitzeschockproteinen gp96 und hsp 70
Eine besondere Bedeutung wird den Hitzeschockproteinen zugeordnet, welche in
Zusammenhang gebracht werden als endogenen Adjuvantien oder "Gefahrsignalen"
(23) das Immunsystem zu modulieren (74), (38). Hsps werden von Zellen dann in verstärktem Maß exprimiert, wenn diese einem Stressor ausgesetzt sind, wie beispielsweise erhöhte Temperatur oder eine Infektion mit intrazellulären Pathogenen (38; 19).
Neben ihren vielfältigen Funktionen im Bereich der Proteinfaltung assoziieren sich hsps
mit antigenen Peptiden, die durch die proteolytische Aktivität des Proteasoms im
Zytoplasma entstehen (63); (5); (6) und sind intensiv an der Prozessierung und der
Präsentation von Antigenen beteiligt (33); (15); (56). Die hsps gp96 und hsp70 sind
bisher am besten bezüglich dieser immunologischen Funktionen charakterisiert worden. Beide hsps sind an der Prozessierung intrazellulärer Antigene über den MHC I
Präsentationsweg beteiligt. Gp96 ist im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert
und ist intensiv an der Beladung von MHC I Molekülen mit Peptiden beteiligt. Die gp96
assoziierten Peptide werden durch die Endocytose über den Oberflälchenrezeptor CD91
internalisiert und den MHC I Prozessierungsweg zugeführt (14). Eine weitere
Möglichkeit der MHC I Beladung besteht über die Fusionierung des Phagolysosoms mit
dem endoplasmatischen Reticulums (21) Das zytoplasmatische hsp70 scheint intrazellulär am ATP abhängigen, intrazellulären Transport von Peptiden zum TAP (transpoter
associated with antigen processing) (57) und eventuell an einer TAP- unabhängigen
Einschleusung von Peptiden in das ER beteiligt zu sein (49) und so zu einem effizienten Einschleusen von Peptiden in den MHC I Präsentationsweg beizutragen (61). Über
diese Mechanismen können hsp70 und gp96, wenn sie unter "Zellstress" (z.B. durch
EINLEITUNG
3
eine Infektion mit Pathogenen) hochreguliert werden, zu einer deutlichen Zunahme von
MHC I an der Zelloberfäche führen, was zu einer Steigerung der Immunogenität der
betroffenen Zellen führt (Abb. 1).
Abb 1. Die Funktion von „heat shock“ Proteinen bei der Antigenprozessierung. Abbildung variiert aus
Srivastava et al. 1994 (29).
1.4 Vakzinierung mit gp96
Mit der Vakzinierung von hsps, die aus Tumorzellen gewonnen wurden, konnte im
Tiermodell eine sehr potente spezifische Antitumorimmunität erzeugt werden (63),
(69); (64); (44). Diese Immunreaktion ist nicht gegen die "heat shock" Proteine selbst,
sondern spezifisch gegen die an sie gebundenen Peptide gerichtet, die von prozessierten Proteinen der Tumorzellen abstammten. Da hsps mit Peptiden des gesamten
Antigenrepertoires der Tumorzelle assoziieren, können nach Freisetzung von hsp/Peptid
- Komplexen, bei Zelltod der Tumorzelle, Peptide von Tumorantigenen gekoppelt an
hsps durch APCs aufgenommen werden. Nach Aufnahme in die APCs induzieren
hsp/Peptid-Komplexe eine potente Kreuzpräsentation (cross priming), wodurch es zur
Induktion einer zellulären Immunantwort kommt, die sowohl durch CD4+ als auch
CD8+ T-Lymphozyten vermittelt wird. Erste Untersuchungen sprechen dafür, daß die
Aufnahme von gp96/Peptid-Komplexen zu einer Aktivierung und Ausreifung von dendritischen Zellen (DCs) und von hsp70/Peptid-Komplexen zu einer gesteigerten
EINLEITUNG
4
Phagozytose von DCs führen (65), (12). Hsps haben neben ihrer Rolle bei der zellulären Antigenpräsentation auch eine große Bedeutung als natürliche Adjuvantien oder
"Gefahrensignale". Solche natürlichen Adjuvantien werden vor allem bei nekrotischem
Zelltod aus dem Zytoplasma freigesetzt und sind in der Lage, eine potente
Immunreaktion zu induzieren (23). Nach Freisetzung von hsp/Peptid Komplexen
kommt es sowohl zu der bereits beschriebenen Aktivierung von APCs nach Rezeptor
vermittelter Aufnahme von hsp/Peptid Komplexen als auch zur Aktivierung anderer
Immunzellen (Monocyten, Granulocyten), die mit einer erhöhten Zytokinausschüttung
reagieren (74). Mit Hilfe von Toll-like-Receptors (TLRs) kann gp96 zur Reifung von dentrischen Zellen (DC´s) führen (70). Apoptotischer Zelltod, in dessen Zusammenhang es
zu keiner oder nur geringfügiger Freisetzung zytoplasmatischer Bestandteile kommt,
scheint primär zu einer Toleranzinduktion zu führen (23),(62).
1.5 MHC I Antigen Prozessierungsweg
Über den Haupthistokompatibilitätskomplex werden eine Vielfalt von Peptiden auf der
Zelloberfläche den CD8+ T-Zellen präsentiert (53); (77). Diese Peptide können sowohl
aus intrazellulären Proteinen als auch von viralen, bakteriellen oder mutierten Genen
transformierter Zellen bzw. auch von transplantiertem Gewebe stammen. Die
Anwesenheit von fremden Peptiden unter denen, die normalerweise auf der
Zelloberfläche präsentiert werden, ermöglicht es den CD 8 T-Zellen die betroffenen
Zellen zu eliminieren.
Die Prozessierung von Peptiden zur Beladung des MHC I Moleküls erfolgt über zwei verschiedene Wege. Der Eine führt über das ER und der Andere über das Cytoplasma (20;
53). Die Vereinigung beider Wege wird durch das TAP hergestellt, wodurch die
Beladung des MHC I im ER beginnen kann(31). Dazu wird das Peptid auf dessen N-terminale Flanke auf 8 Residuen durch die ER assoziierte Aminopeptidase (ERAAP) gekürzt
(52; 79). Viele Studien weisen darauf hin dass Hitzeschockproteine als Chaperone für
die Peptide dienen, um diese vor dem Abbau durch cytosolische Proteasen zu schützen
(59). Obwohl die intrazelluläre Beladung der MHC I Moleküle durch Hsp assoziierte
Antigene schlussendlich nicht genau geklärt ist, zeigen Untersuchungen, dass Hsp
assoziierte Antigene ausreichen, um eine CD+8 T-Zellantwort über MHC I auszulösen
(13). Wie in den Untersuchungen von Randow und Seed (2001) gezeigt, führt eine
Mutation in dem gp96 korrespondierenden Gen Locus der pre B Zellinie zur
EINLEITUNG
5
Rückhaltung bzw. Supremierung von TLR-Rezeptoren auf der Zelloberfläche.
Veränderungen bezüglich der Oberflächenmoleküle wie das H-Kb, ein MHC I Molekül
oder CD 44, ein Exportmolekül, wurden nach dieser Mutation nicht beobachtet (46).
Fraglich ist nun, ob entgegen der früheren Untersuchungen, die mittels einer Mutation
durchgeführt wurden, eine transiente Überexpression an gp96 einen Einfluß auf die
MHC I Oberflächenstrukturen von Zellen ausüben würde. Hierfür ist ein adäquater
Gentransfer erforderlich.
1.6 Gentransfer mit adenoviralen Vektoren
Rekombinante Adenoviren werden eingesetzt, wenn hohe Expressionsniveaus eines
Genproduktes in z.B. Zellkulturen benötigt werden. Sie werden deshalb gerne in der
Immuntherapie als virale Vaccine, oder auch in der Gentherapie verwendet. Die vielfältigen Anwendungsberreiche der Adenoviren ergeben sich aus ihrer hohen Stabilität in
vitro und in vivo, den hohen Virustitern, die bei der Produktion erreicht werden können, sowie ihrer Fähigkeit, Zellen unterschiedlichster Gewebe unabhängig von der
Zellproliferation sehr effektiv transduzieren zu können (25). Das 36 kb große adenovirale Genom kodiert für eine Vielfalt viraler Gene, die zum Teil deletiert werden können,
wie das E1 und E3 Gen. Durch die Deletion des E1 Gens ist das Adenovirus nur in Zellen
zur Replikation fähig, die über eine stabile Transfektion des E1 Gens in ihren Genom
verfügen (z.B. 293-Zellen). Die E3-Region ist an der Modulation der Infektionsabwehr
durch den Wirt beteiligt. Das Adenovirion kann bis zu 105% der Länge des WildtypGenoms verpacken; das bedeutet bei dem rekombinanten, humanen Adenovirus Typ5
mit einer Genomlänge von ca. 36 kb eine Aufnahmekapazität von ungefähr 1,8-2,0 kb
fremder DNA (25).Das von replikationsdefekten rekombinanten adenoviralen Vektoren
auf nicht-komplementierende Zielzellen übertragene defekte virale Genom verweilt
normalerweise episomal, wodurch das übertragene Gen (Transgen) lediglich transient
exprimiert wird. Es erfolgt keine Produktion neuer viraler Partikel. Die Herstellung
rekombinanter Adenoviren erfolgt in der Regel durch eine homologe Rekombination
zwischen dem zu übertragenden Nukeinsäureabschnitt und dem viralen Genom. Durch
die komplementären Regionen der Plasmide wird eine Rekombination zum vollständigen Virusgenom begünstigt. Rekombinante Klone werden durch Restriktionsverdau
identifiziert und die DNA anschließend in 293-Zellen transfiziert. Die rekombinanten
Adenoviren werden daraufhin in 293-Zellen expandiert, mittels Cäsium-Chlorid-
EINLEITUNG
6
Gradienten gereinigt und der Virustiter durch Plaque-Assay bestimmt. Der Nachweis
der korrekten Expression der Proteine durch die adenoviralen Vektoren erfolgt mittels
Western Blot aus dem Zellysat transduzierter Zellen sowie mittels Immunfluoreszenz.
1.7 Ziele der Arbeit
In vielen experimentellen Studien konnte eine spezifische antitumoraler Effekt mit
gp96 assoziierten Peptiden nachgewiesen werden. Dabei wird über MHC I eine CD 8+
T-Zellantwort ausgelöst. Sowohl gp96 als auch MHC I befinden sich im endoplasmatischen Reticulum. In wieweit gp96 an der MHC I Regulierung und dessen Beladung mit
Peptiden direkt beteiligt ist, bleibt Gegenstand der Forschung.
In diesem Zusammenhang sollte in der vorliegenden Arbeit ein adenoviraler Vektor kloniert werden, der in der Lage ist, die cDNA von gp96 in verschiedenen Tumorzellinien
zu transduzieren.
Die korrekte Genexpression des rekombinanten Adenovirus Typ5 mit der cDNA von
gp96 (Ad5gp96) sollte mittels Western-Blot Analyse des Lysates von Ad5gp96 infizierten Tumorzellen erfolgen. Die Lokalisation der transgenen Überexpression von gp96
nach einer Ad5gp96 Infektion sollte mithilfe der Immunfluoreszenz Mikroskopie analysiert werden.
Funktionell sollte geklärt werden, ob eine Veränderung der MHC I Expression auf der
Zelloberfläche durch eine Überexpression an gp96 zu beobachten ist.
7
MATERIAL UND METHODEN
2. Material und Methoden
2.1 Material und biologische Proben
2.1.1 Antibiotika
Ampicillin (50 µg/ml)
Kanamycin (50 µg/ml)
Penicillin (100 U/ml)
Sigma, Deisenhofen
Penicillin/Streptomycin (100 µg/ml)
Invitrogen, Karlsruhe
2.1.2 Antikörper und rekombinante Proteine
Anti-GRP94 (Ab-1)
NeoMarkers, Fremont, CA, USA
Anti-GRP94 (H-212)
Santa Cruz Biotechnology, INC.
Anti-HSP 70 (W27)
Santa Cruz Biotechnology, INC.
Anti-ß-Actin (AC-15)
Sigma, Saint Louis, MI, USA
Anti-H-2Kb/H-2Kd
BD Biosciences
PE Anti-Maus-IgG
BD Biosciences
Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG
Molecular Probes Invitrogen
detetction technologies
Anti-Maus-IgG Peroxidase
Amersham
Anti-Ratte-IgG Peroxidase
Amersham
2.1.3 Chemikalien und Substanzen
Acrylamid 30% / Bisacrylamid 37, 5:1
Bio-Rad, München
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Sigma, Taufkirchen
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Bio-Rad, München
Bacto-Agar
Difco, Detroit
Bacto-Yeast Extract
Difco, Detroit
Bradford Reagenz (Dye Reagent)
Bio-Rad, München
8
MATERIAL UND METHODEN
ß-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt
Bovines Serum Albumin (BSA)
Sigma, Taufkirchen
Ciprobay
Bayer, Leverkusen
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Merck, Darmstadt
Dubecco's modified Eagle's Medium (DMEM)
Biochrom, Hamburg, Gibco BRL
ECL™ plus detection reagent
Amersham Biosciences Europe,
Freiburg
Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA)
Merck, Darmstadt
Essigsäure
Merck, Darmstadt
Ethanol
Merck, Darmstadt
FACS Lysing solution
Becton Dickinson, Heidelberg
Glycerol
Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum (FCS)
PAN Biotech, Aidenbach
Methanol
Merck, Darmstadt
Natriumcholrid
Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Merck, Darmstadt
Nonindent-P40
Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz
NaCl 0,9 %
Delta-Pharma, Pfullingen
Non essential amino acids (NEAA)
Invitrogen, Karlsuhe
Optimem-1
Invitrogen, Karlsruhe
phosphate buffered saline (PBS) Tabletten
Sigma, Deisenhofen
Ponceau-Rot (w/v) 0,2 %
Serva, Heidelberg
Propanol
Merck, Darmstadt
Proteaseinhibitoren
Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz
Rainbow Marker
Amersham Biosciences Europe,
Freiburg
Rinderserumalbumin (BSA), pH 5,2
Sigma, Deisenhofen
Streptomycin (100 µg/ml)
Sigma, Deisenhofen
Saponin
Sigma, Deisenhofen
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin)
Sigma, Taufkirchen
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Sigma, Deisenhofen
Trockenmilchpulver
Merck, Darmstadt
Trypsin/EDTA
PAN Biotech, Aidenbach
9
MATERIAL UND METHODEN
Trypanblau
Sigma, Deisenhofen
Tween 20
Sigma, Deisenhofen
2.1.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Autoklav Hiclave
Wolf, Geislingen
Auflichtfluoreszenzmikroskop
Leica, Benzheim
Begasungsbrutschrank Hera cell 240
Heraeus, Hanau
Biomax-MR Filme
Sigma (Kodak), Deisenhofen
Bioreader-3000 Pro
BioSys, Karben
Durchlichtmikroskop
Leica, Benzheim
Elektrophorese-Kammer
Biorad, München
Eppendorf-Röhrchen
Eppendorf, Hamburg
Erlenmeyerkolben
Corning Incorporated, Corning, USA
Expositionskassetten
Sigma (Kodak), Deisenhofen
FACS-Gerät: FACScalibur flow cytometer
Becton Dickinson, Heidelberg
FACS-Röhrchen
Becton Dickinson, Heidelberg
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 35
Zeiss, Jena
Gefrierschrank -80°C
(New Brunswick Scientific)
Innova, Nürtingen
Gewebekulturflaschen/platten: Cellstar
Greiner, Solingen
Heizblock DB-2D
Techne, Multimed, Kirchheim
Inkubatoren: Heraeus Instruments
Heraeus, Hanau
Kryoröhrchen
Becton Dickinson, Heidelberg
Kävetten Halb-Mikro
Greiner, Solingen
Laminar Flow (Hera safe)
Heraeus, Hanau
LSM 410 Laserscanningmikroskop
Carl Zeiss, Jena
Magnetrührer
Janke & Kunkel, Staufen
Molkulargewichtsstandards " SDS-PAGE"
Bio-Rad, München
Neubauer-Zählkammer
Marienfeld, Bad Mergentheim
Poly-L-Lysin Objektträger
Sigma, Deisenhofen
PH-Meter: 761 Colimatic
Knick, Berlin
Photometer: UV/VIS Spectrometer
Lambda Bio
Perkin Elmer, Darmstadt
10
MATERIAL UND METHODEN
Pipetten, Pipettenspitzen
Gilson, Frankreich
Pipettierhilfe pipetus-akku
Hirschmann, Eberstadt
PVDF-Immobilon-P
Millipore, Bedford, MA, USA
Rotationsmikrotom Rotocut 800
Leica, Nussloch
Rotor SW 28
Beckman, München
S2-Sicherheitswerkbank
Heraeus, Hanau
Spektrophotometer Ultrospec 3000
Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
Sterilfilter: Stericup Vakuum-Filter
Schleicher und Schüll, Dassel
Tischzentrifuge 5415C
Eppendorf, Hamburg
Trans Blot Semy Dry Transfer Cell/
POWER Pac 200
Biorad, München
Ultraschallgerät: SONIFIER B-12
Cell Disrupter
Branson, Danburry, CO, USA
Ultrazentrifuge Optima LE-80K
Beckman, München
Vortexer Genie2
Scientific Industries, Bohemia, USA
Wasserbad A100
Lauda, Lauda-Königshofen
Whatmann-3 MM-Papier
Schleicher & Schuell, Dassel
Zentrifuge, Multifuge 3 S-R
Heraeus, Hanau
Zentrifugenröhrchen: 15 ml, 50 ml
Falcon, B D, Heidelberg
2.1.5 Zellkulturmedien und Zellinien
Dulbeccos Glutamax Medium (DMEM)
(+ 10% fötales Kälberserum (FCS), 5%
Nicht-essentielle Amionosäuren, 100 U/ml
Penicillin, 0,1 g/l Streptomycin)
Life Technologies, Karlsruhe
Fötales Kälberserum (FCS)
PAA, Linz, Österreich
Nonessentiell-Aminoacids-Lösung
Life Technologies, Karlsruhe
RPMI Medium (+ siehe DMEM)
Life Technologies, Karlsruhe
Trypsin/ EDTA (0,5 g/ 0,2 g)
PAN, Aidenbach
MATERIAL UND METHODEN
11
Hepa 1-6
Diese Hepatomzellen leiten sich vom BW7756 Tumor ab. Sie sezernieren unter anderem Albumin, Alpha-Fetoprotein, Alpha1-Antitrypin sowie Amylase.
Medium: DMEM-10/Pen/Strept/NEAA.
CRL-1830, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA.
HEK 293
Die Zelllinie wird aus humanen embryonalen Nierenzellen durch Transformation mit Ad
5 gewonnen.
Medium: DMEM-5/Pen/Strept/NEAA.
CRL-1573, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA.
911
Die Zelllinie wird aus humanen embryonalen Retinazellen durch Transformation mit Ad
5 gewonnen.
Medium: DMEM-10/Pen/Strept/NEAA.
Crucell Holland B.V., Leiden, Niederlande.
2.1.6 Verwendete Plasmide
pGEM3Zf(-) / gp96
Der Vektor pGEM3Zf(-) wurde als ein Standard Klonierungsvektor für gp96 benützt und
zur weiteren Subklonierung der cDNA von gp96 verwendet. Der Vektor besitzt einen
SP6 und eine T7 RNA Polymerase Promoter, so dass eine in die " multiple cloning site"
(MCS) klonierte cDNA abgelesen und translatiert werden kann. Diese befindet sich
innerhalb Alpha-peptid Kodierungsstelle von ß-Galaktosidase so dass bei einer
Insertion in die MCS der rekombinante Klon über die Verfärbung der Bakterienkolonie
selektiert werden kann.
pcDNA3.1(+)
Mit dem pcDNA3.1(+) Vektor ist sowohl eine stabile wie auch eine transiente
Expression des zu untersuchenden Gens in Zellen möglich. Das pcDNA3.1(+) Plasmid
verfügt über einen humanen Cytomegalie Virus Promoter, wodurch sehr hohe Überexpressionsraten des erwünschten Proteins in Säuger- Zellen erreicht werden können.
MATERIAL UND METHODEN
12
Der Vektor pcDNA3.1(+) wurde zur Subklonierung des gp96 Gens in pGEM-3Zl(-)-gp96
auf dem pShuttle-CMV benützt. Die Selektion erfolgt über dessen Ampicillin
Resistenzgen.
pShuttle-CMV
Das pShuttle-CMV ist ein adeno Transfervektor mit einer Multiklonierungsstelle unter
der Kontrolle des humanen CMV promotor, wodurch es zu einer konstituiven Überexpression des zu untersuchenden Gens kommt. Mit diesem Plasmid ist es durch die
homologe Rekombination in einem Bakterium möglich das zu untersuchende Gen in die
adenovirale DNA einzubringen. Somit kann in einem weiteren Schritt die adenovirale
DNA mit dem subklonierten Gen in QBI-293A Zellen transfeziert werden, wodurch die
rekombinante Adenovirusexpression unter den stabil transfezierten E1-Gen des QBI293A Zellen
stattfinden kann. Der Vektor pShuttle-CMV trägt das Ressistenzgen für
Kanamycin, wodurch die Selektion erreicht werden kann.
pAdEasy-1
pAdEasy-1 ist ein 33.4 kb großes Plasmid, welches das Genom des Adenovirus Serotyp
5 (Ad5) enthält mit den Deletionen des E1-Genbereich sowie der E3-Region. Durch die
homologe Rekombination in Bakterien zwischen dem Transfervektor pShuttle-CMV mit
dem zu untersuchenden Gen und pAdEasy Vektor, wird das Gen auf das pAdEasy
Plasmid im Bereich des deletierten E1-Gens übertragen. Dieses neue rekombinante
Plasmid wird später in QB1-293 A Zellen transfeziert. Die transfizierten Zellen enthalten in ihren Genom das zur Generation und Expression des rekombinanten adenoviralen Vektors
erforderliche E1-Gen. Das pAdEasy-1 Plasmid verfügt über ein Ampicillin
Resistenzgen, wodurch die Selektion erreicht werden kann.
Rekombinante Adenoviren
Ad5-Easy Vektor sowie Ad5-EV Leervektor wurden von der Firma Genzyme, Cambridge,
MA, USA erworben.
In Adenovirus Typ 5 (Ad5) kloniertes rekombinantes Glycoprotein 96 (gp96) unter der
Kontrolle des CMV Promoters (Ad5gp96).
13
MATERIAL UND METHODEN
2.1.7 Software
Adope Acrobat 5.0
Adope Systems Incororated,
San Jose, CA, USA
Cellquest 3.11 und Cellquest Pro (FACS)
Becton Dickinson, Heidelberg
Microsoft Office Professional 2000
Microsoft Corporation, Redmond,
CA, USA
Zeiss-LSM Image Browser Version 2.8
Carl Zeiss, Jena
2.2 Methoden
2.2.1 Zellbiologische Methoden
Alle Zellkulturarbeiten wurden an einer Sterilbank durchgeführt.
2.2.1.1 Kultivierung von Zellen
Zellen wurden in Schalen oder Flaschen aus Kunststoff bei 37°C und 5 % CO2 Zufuhr
im Heraeus Brutschrank inkubiert. Da sich die adhärent als Monolayer wachsenden
Zellen bei 100 %-iger Konfluenz aufgrund ihrer Kontaktinhibition nicht mehr teilen und
absterben, erfolgte die Passagierung je nach Wachstumsverhalten 2 - 3 mal pro Woche.
Dabei wurden 80 - 90 % konfluente Zellen nach Abnahme des Kulturmediums mit PBS
gewaschen, mit Trypsin/EDTA versetzt und für 2 - 3 Minuten bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurden die vom Boden abgelösten Zellen in Kulturmedium resuspendiert
und in einer Verdünnung von 1:4 bis 1:10 neu ausplattiert.
2.2.1.2 Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zellzahl einer Kultur werden Neubauer-Zählkammern verwendet,
wobei die Zellzahl nach folgender Formel bestimmt wird:
Zellzahl/ml = N · X · 104
N: Zellanzahl in einem Quadrat von 4 · 4 Feldern
X: Verdünnungsfaktor
MATERIAL UND METHODEN
14
2.2.1.3 Kryokonservierung von Zellen
Zellen wurden nach der Zählung gewaschen und in einer Dichte von 107 /ml in
Einfriermedium (DMEM-10 mit 10 % DMSO) aufgenommen. In Kryoröhrchen überführt
wurden sie zunächst in einem Styroporbehälter bei - 80° C gelagert, um Schäden durch
zu schnelles Abkühlen zu vermeiden. Nach einem Tag wurden sie in der Gasphase über
flüssigem Stickstoff auf Dauer umgelagert.
2.2.1.4 Auftauen von Zellen
Zellen wurden nach vorsichtiger Entnahme aus dem Stickstofftank sofort in einem
Wasserbad mit 37°C aufgetaut und in 10 ml warmes Kulturmedium überführt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1200 rpm wurde der Überstand verworfen, das Zellpellet
in Kulturmedium aufgenommen und in Kulturflaschen mit einer Dichte von 1 x 106
Zellen/ml ausgesät.
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.2.1 Untersuchung der DNA-Konstrukte
Die DNA-Konstrukte, pcDNA3.1(+)gp96, shCMVgp96 sowie pAd5gp96 wurden kloniert.
Sie wurden nach Transformation von kompetenten E.coli und Kultivierung eines selektionierten Klons über ein Säulenverfahren gereinigt und nach Restriktionsverdau mittels Gelelektrophorese untersucht.
2.2.2.2 Transformation von E.coli mit Plasmid-DNA
Unter Transformation versteht man die Aufnahme von DNA durch Bakterienzellen. Da
sie unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang DNA aufnehmen, müssen
sie physikalisch oder chemisch behandelt werden, so dass dieser Vorgang wirksam
durchgeführt werden kann. Nach einer solchen Behandlung werden die Zellen als ‚kompetent' bezeichnet. Die hier verwendeten Bakterien wurden nach der RbCl-Methode
hergestellt.
MATERIAL UND METHODEN
15
LB-Medium:
12,5 g Luria Broth Base (Invitrogen, Karlsruhe)
A. bidest. ad 500 ml, autoklavieren
LB Platten mit Ampicillin:
6,25 g LB-Medium
4 g BactoTM Agar (DIFCO, Becton Dickinson)
A. bidest. ad 250 ml, autoklavieren
Das Medium ins Wasserbad mit 45 - 50°C stellen, Ampicillin zu einer
Endkonzentration von 1 µg/ml zugeben, auf Petrischalen verteilen,
bei 4°C lagern.
Für die Transformation wurden kompetente E.coli des Stammes DH5 (Invitrogen,
Karlsruhe) auf Eis aufgetaut. Je nach Konzentration wurde 1 µg der DNA mit 80µl der
kompetenten Zellen gemischt und eine Stunde auf Eis inkubiert. Während dieser Zeit
wurden Selektions-Agarplatten entsprechend der Antibiotikaresistenz des Vektors auf
37°C vorgewärmt. Die Proben wurden bei 42°C für 45 Sekunden Hitze-geschockt, um
die Aufnahme von DNA zu verstärken, danach sofort für zwei Minuten auf Eis abgekühlt
und nach Zugabe von 1 ml LB-Medium bei 37°C für eine Stunde auf dem Schüttler bei
220 rpm gestellt. In unterschiedlicher Verdünnung wurden die Transformationsansätze
auf den vorgewärmten Selektions-Agarplatten ausplattiert und über Nacht im
Brutschrank bei 37°C inkubiert.
2.2.2.3 Präparation zur Isolierung und Amplifikation von Plasmid-DNA
Etwa 5 ml mit einem Antibiotikum versetztes LB-Medium (z.B. Ampicillin 1 µg/ml)
wurde mit einer Bakterienkolonie aus der vorherigen Transformation beimpft und über
Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 240 rpm inkubiert. Die Aufarbeitung der DNA aus
diesen Bakterien erfolgte mittels des "QIAGEN plasmid mini kit" (Qiagen, Hilden), entsprechend den Angaben des Herstellers. Das Prinzip der Extraktion und Reinigung von
DNA beruht auf der alkalischen Lyse der Bakterien und der AnionenaustauschChromatographie.
Für die Herstellung größerer Mengen an DNA wurde das "QIAGEN plasmid mega kit"
(Qiagen, Hilden) verwendet, welches nach dem gleichen Prinzip funktioniert. Dazu wurden 2 - 4 l LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum versetzt und mit 2 - 4 ml
Bakterienkultur über Nacht beimpft. Anschließend wurden die Bakterien pelletiert, in
einem RNase A-haltigen Puffer resuspendiert und mit Lyse- sowie Neutralisationspuffer
16
MATERIAL UND METHODEN
behandelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand mit DNA auf eine äquilibrierte
Säule gegeben, gewaschen und eluiert. Mit Isopropanol versetzt wurde die DNA bei 4°C
pelletiert, mit 70 % EtOH gewaschen und nach Zentrifugation getrocknet.
Am Ende
des Vorgangs wurde die DNA in NaCl aufgenommen und bei - 20°C aufbewahrt.
2.2.2.4 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA/RNA
Die optische Dichte der DNA in verschiedenen Verdünnungen wurde mittels
Spektrophotometrie (Ultrospec 3000, Amersham Pharmacia Biotec) bei 260 nm gemessen. Um die Reinheit der DNA zu bestimmen, wurde die optische Dichte bei 280 nm
gemessen und der Quotient OD 280 nm/OD 260 nm gebildet. Bei reiner DNA liegt dieser Wert zwischen 1.8 und 2.0.
2.2.2.5 Analytischer Restriktionsverdau
Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die doppelsträngige DNA erkennen
und sie sequenzspezifisch schneiden.
Verwendete Restriktionsendonukleasen (New England Biolabs):
- XbaI, KpnI, Nhe I für pcDNA3.1(+),pcDNA3.1(+)gp96, shCMV, shCMVgp96,
- PstI für pAd5-Easy, pAd5gp96
- XbaI
Für einen analytischen Restriktionsansatz wurden 0,2 - 2 µg DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen und den dafür vorgesehenen Puffern für 1 Stunde bei 37°C
inkubiert.
2.2.2.6 Agarose-Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung von Molekülen nach ihrer Größe. DNA
Fragmente von mehr als ca. 300 bp werden in Agarose-Gelen aufgetrennt, wobei die
Agarose eine netzartige Matrix bildet, durch die kleinere geladene Moleküle bei Anlegen
einer Spannung schneller wandern als größere Moleküle.
Sollen DNA-Fragmente von ca. 300 bp bis 2.500 bp aufgetrennt werden, wird ein
Agarose-Gel mit einer Konzentration von 1% gegossen. Dabei werden pro 10 ml 0,5x
TAE-Puffer 0,1g Agarose eingesetzt, in der Mikrowelle gelöst und nach Zugabe von 0,1
g/ml Ethidiumbromid in eine Gelkammer mit Plastikkämmen gegossen. Diese werden
nach Abkühlung der Agarose entfernt und das Gel mit ausreichend 0,5x TAE-Puffer
17
MATERIAL UND METHODEN
überschichtet. Die DNA-Proben werden vor dem Auftragen mit 6x Ladepuffer versetzt.
Die Elektrophorese wird bei 80 - 100 Volt durchgeführt.
0,5x TAE-Puffer:
6x Ladepuffer:
Tris-Acetat 20 mM
Bromphenolblau 0,25%
EDTA 0,5 mM
Xylenecyanol FF 0,25%
Glycerol 30%
2.2.2.7 Restriktionsverdau
Alle Enzyme und die entsprechenden Reaktionspuffer waren von New England Biolabs
erworben und entsprechend der Anleitung angewendet. Für die analytischen
Restriktionsexperimente wurden in der Regel ca. 1 µg DNA und jeweils 10 Units einer
jeden gewünschten Endonuklease in einem Endvolumen von 20 µl 1X Restriktionspuffer
eingesetzt. Bei einer Klonierung werden Enzyme, die in verschiedenen Puffern ihre
optimale Aktivität erreichen, in der Regel nacheinander verwendet. [Für die hier verwendeten Restriktionskombinationen aber ist es möglich einen NEB Puffer zu wählen
bei der das 1. Enzym zu 100% und das 2. mindestens zu 75% ihre maximale
Enzymaktivität erreichen kann, wie es z.B. dies für NHEI und NotI Dopellverdau der Fall
ist.]
Zum Schneiden der DNA wird der Ansatz 1 - 2 h mit den entsprechenden
Restriktionsendonukleasen bei 37°C inkubiert. Dabei werden die entsprechenden von
NEB mitgelieferten Puffer, gegebenfalls mit BSA, verwendet.
2.2.2.8 Elution von DNA-Fragmenten
Die DNA wird nach dem Restriktionsverdau auf einem Agarosegel aufgetrennt und zur
Elution das QIAEX II Gel Extraction Kit von Qiagen verwendet. Die DNA wird aus einem
möglichst kleinen Volumen Agarose eluiert. Um mutagene Effekte des UV-Lichtes zu
verhindern, wird nur ein kleiner Teil der Spur des Gels unter UV-Licht gelegt und die
entsprechende Bande ober- und unterhalb markiert. Nach Ausschneiden des DNAFragmentes aus der nicht exponierten Spur mittels eines Skalpells wird die Agarose
gewogen und für Fragmente zwischen 100 - 4.000 bp mit 300µl Buffer QX1 pro 100 mg
Gel versetzt. Bei größeren Fragmenten werden zusätzlich 200µl Wasser pro 100 mg Gel
dazugegeben. Außerdem werden bei einer DNA-Menge bis 2µg 10µl der QIAEX IISuspension verwendet, bei größeren Mengen 30µl. Der Ansatz wird für mindestens 10
min bei 50°C unter regelmäßigem Schütteln inkubiert, bis sich die Agarose vollständig
18
MATERIAL UND METHODEN
aufgelöst und die DNA an die in der Suspension enthaltenen Partikel gebunden hat.
Nach Zentrifugation bei 13.000 rpm für 30 sec wird das Sediment einmal mit 500µl
Puffer QX1 und zweimal mit 500µl ethanolhaltigem Puffer PE gewaschen. Das Sediment
wird solange getrocknet, bis es vollständig weiß gefärbt ist. Zur Elution der DNA von
den Partikeln wird das Sediment in 20µl Wasser eluiert und der Ansatz für Fragmente
bis zu einer Größe von 4.000 bp 5 min bei RT inkubiert, größere Fragmente werden bei
50°C inkubiert. Nach Zentrifugation bei 13.000 rpm für 30 sec enthält der Überstand
die DNA, die dann für eine Ligation eingesetzt werden kann.
2.2.2.9 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Konstruktion der verschiedenen Plasmide wurde die T4-DNA-Ligase und der
Ligationspuffer von NEB eingesetzt. In der Regel wurden 50 ng Plasmid mit einem 25fachen molarem Überschuß an Fragment in einem Endvolumen von 10µl mit 1 Unit
T4-DNA-Ligase für mindestens 2h bei RT und anschließend über Nacht bei 14 C° inkubiert. Die T4-DNA-Polymerase arbeitet dabei in jedem von NEB gelieferten
Restriktionsenzym-Puffer.
Zur Kontrolle wird immer auch ein Ligationsansatz ohne Fragment durchgeführt, das
Volumen wird entsprechend mit ddH2O eingestellt.
Besondere Bedingungen ergaben sich für die blunt-Ligatinonen. Hier muß zunächst der
linearisierte Plasmid Vektor durch die Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) an dessen
5'- Phosphat Gruppe dephosphoryliert werden (Chaconas und van de Sande,
1980). Dieser Schritt verhindert die Rezirkulation des Vektors. Dazu wird 1 Unit von
CIP
für
die
Dephophorylierung
von
1
pmol
linearisierter
DNA
in
ein
1x
Dephosphorylierungs Puffer bei 37° Grad verwendet. Die Inkubationszeit beträgt 1h.
Die Deaktivierung des CIP erfolgt durch die Inkubation des Ansatzes bei 65°C für 10
Minuten.
Anschließend
wurde
der
dephosphorylierte
Plasmid
Vektor
mittels
Gelelektrophorese aufgereinigt. Nach Transformation (siehe 2.2.2.2) von DH5a-Zellen
mit 5µl dieses Ligationsansatzes wird die isolierte Plasmid-DNA auf eine korrekte
Integration des zu klonierenden DNAFragmentes durch einen Restriktionsverdau (siehe
2.2.2.8) hin getestet.
2.2.2.10 Calciumphosphat-Transfektion von Hepa1.6-, HEK 293-,
sowie 911-Zellen
Der Transfektionsansatz setzt sich folgendermaßen zusammen:
112,5 µl ddH2O (steril) mit 10 µg DNA,
19
MATERIAL UND METHODEN
12,5 µl 2,5 M CaCl2,
125 µl HBS-Lösung.
Nach Zugabe der HBS-Lösung muß der Ansatz sofort gut geschüttelt werden. Das
Medium der zu transfizierenden Zellen wird durch 2 ml DMEM (10% FCS, 1% PS) mit
25 µM Chloroquin ersetzt. Dann wird der Transfektionsansatz gleichmäßig auf die
Zellen verteilt. Im Mikroskop ist das Calciumphosphat-Präzipitat der DNA zu erkennen.
Nach Inkubation für 6-7 h wird das Medium durch frisches DMEM (10% FCS, 1% PS)
ersetzt.
HBS-Lösung:
NaCl
280 mM
HEPES
50 mM
Na2HPO4
1,5 mM
pH 7,05
2.2.3 Biochemische Methoden
2.2.3.1 Untersuchung der gp96-Protein-Expression
HEK 293 Zellen, Hepa 1-6 Zellen sowie 911 Zellen wurden mit Adgp96 mit einer MOI
von 10 transduziert. Die gp96-Protein-Expression der transduzierten Zellen wurde mit
der, der nicht infizierten Zellen der selben Zellreihe verglichen.
Dazu wurde zunächst nach der Zelllyse die Proteinkonzentration mittels Bradford Assay
bestimmt.
Anschließend
wurden
die
Proben
über
eine
SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt, auf eine PVDF Membran übertragen und
mit Antikörpern behandelt. Durch Chemilumineszenz wurden die gesuchten Proteine
auf einem Röntgenfilm detektiert.
2.2.3.2 Zelllyse mit Triton-Lysepuffer
Die mit gekühltem PBS gewaschenen Zellpellets wurden für 30 Minuten in TritonLysepuffer mit Proteinaseninhibitor auf Eis inkubiert und dabei alle 5 Minuten durch
Vortexen durchmischt.
Nach anschließender Zentrifugation wurden die Überstände der Proben, in welchen sich
freie Proteine befinden, in Bradford assay sowie SDS-PAGE eingesetzt oder bei - 80°C
aufbewahrt.
20
MATERIAL UND METHODEN
Triton-Lysepuffer:
50 mM Tris-HCl
5 mM EDTA
150 mM NaCl
1 % Triton
25x Proteaseinhibitor
2.2.3.3 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford assay
Das
Prinzip
des
Assays
beruht
auf
der
photometrischen
Bestimmung
der
Farbumschlagsreaktion von Coomassie Blue bei Bindung an Proteinen.
Zur Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford werden als Standard 0, 2, 4 und
8 µg sowie je 2 µl der zu bestimmenden Proteinlösung mit 1 ml einer 1:5-verdünnten
Bradford-Lösung gut gemischt und 10 min inkubiert. Danach wird die Absorption bei
595 nm gemessen und daraus der Proteingehalt unter Berücksichtigung des
Verdünnungsfaktors berechnet.
2.2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Für die SDS-PAGE zur Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht wurde
ein 10 %-iges Trenngel und ein 5 %-iges Sammelgel gegossen.
50 - 100 µg Proteinproben wurden mit Lämmli-Puffer versetzt und für 5 bis 10 Minuten
bei
99°C
denaturiert.
Die
elektrophoretische
Auftrennung
erfolgte
in
einer
Minigelanlage (Mini-Protean II Cell, Biorad) bei konstanter Spannung von 120 V, bis die
Bromphenolblaubande des Ladepuffers das untere Ende des Trenngels erreicht hatte.
Als
Protein-Molekulargewichtsmarker
diente
der
Rainbow-Marker
(Amersham Biosciences Europe, Freiburg).
Sammelgel
10%-iges Trenngel
40% Acrylamid
1 ml
5 ml
2% Bisacrylamid
0,5 ml
1,3 ml
Tris-HCl (1 M, pH6,8)
1, 25 ml
Tris-HCl (1,5 M, pH8,8)
5 ml
SDS 10%
0,1 ml
0,2 ml
ddH2O
7,15 ml
8,5 ml
zur Polymerisation je 1% APS-Lösung (10% w/v) und 0,1% TEMED
"RPN
800"
21
MATERIAL UND METHODEN
Lämmli-Probenpuffer:
Glycin
192 mM
Tris
25 mM
SDS
0,1%
2.2.3.5 Western Blot
Für
den
Transfer
der
Proteine
nach
dem
Semi-Dry-Verfahren
wurde
das
Polyacrylamidgel auf eine PVDF Membran (Immobilon P, Millipore) gelegt, die in
Methanol eingeweicht und in Transferpuffer äquilibriert wurde und mit in Transferpuffer
getränkten Blottingpapieren (GB002, Schleicher & Schuell) umschlossen, wobei die
Membran zur Anode und das Gel zur Kathode zeigte. Nach dem Blot für etwa 1 Stunde
bei 160 mA wurden die Proteinbanden in Ponceau-Red-Lösung visualisiert.
Zur Absättigung freier Stellen auf der Membran wird diese für 45 min bei RT mit einer
Blockierlösung (5 % Milchpufferlösung in PBS-T) geschüttelt. Die Inkubation mit dem
ersten spezifischen Antikörper erfolgt in der Regel über Nacht bei 4°C unter Schütteln
in PBS-T mit 5% Milchpulver. Zur Entfernung nicht gebundener Antikörper wird die
Membran einmal mit dH2O und dreimal mit PBS-T für jeweils 5 min (PVDF-Membran
jeweils 15 min) geschüttelt. Im Anschluß erfolgt eine Inkubation für 60 min bei RT mit
dem zweiten isotyp-spezifischen und Peroxidase konjugierten Antikörper in PBS-T.
Die Membran wird anschließend einmal kurz mit dH2O, dreimal mit PBS-T jeweils 5 min
(PVDF-Membran jeweils 15 min) gewaschen und mit ECL-Lösung für 1 min inkubiert.
Die an dem Sekundärantikörper kovalent gebundene HRP oxidiert das Luminol in der
ECL-Mischung, das dabei Licht emittiert und so den in einer Röntgenfilmkassette
(Kodak, Rochester, USA) auf die Membran aufgelegten Audiographiefilm färbt. Die
Belichtungszeit lag zwischen zwei Sekunden und 30 Minuten.
Zur Kontrolle, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden, wurde die PVDFMembran mit Mouse anti-ß-actin (AC-15, Sigma) und anschließend mit Anti-mouse
IgG-peroxidase (NXA 931, Amersham) inkubiert.
Puffer/Lösungen:
10x Transferpuffer:
48 mM Tris/Base
39 mM Glyzin
0,37 % (v/v) SDS (10 %)
A. bidest. ad 1000 ml
22
MATERIAL UND METHODEN
20 % Methanol frisch zugeben
Waschpuffer:
PBS/Tween 20 (0,05 %) (v/v)
Ponceau-Red-Lösung:
2 % Ponceau
2,5 % Essigsäure
A. bidest.
ECL™ plus detection reagent (Amersham Biosciences Europe, Freiburg)
2.2.4 FACS-Analyse
2.2.4.1 Prinzip der Durchflußzytometrie (FACS)
Die FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting, Durchflußzytometrie) dient der
quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen.
Hierzu werden fluoreszenz-markierte Zellen in einer Einzelzellsuspension an einem
monochromatischen
Laserstrahl
vorbeigeleitet,
wobei
Streulicht
und
Fluoreszenzimpulse entstehen. Daraus werden mittels zwei Parametern, der
Seitwärtsstreuung SSC (side scatter) als Maß für die Granularität und der
Vorwärtsstreuung FSC (forward scatter) als Maß für die Zellgröße, unterschiedliche
Eigenschaften der Zelle abgeleitet. Die Fluorochrom-konjugierten Antikörper binden
spezifisch an die jeweiligen Oberflächenstrukturen der an die Zellen gebundenen
Proteine, wobei die Farbstoffmenge proportional zur Anzahl der gebundenen Moleküle
ist. Allerdings können nur relative Fluoreszenzen gemessen werden, d.h. es sind nur
Aussagen über die relative, aber nicht über die absolute Anzahl der gebundenen
Molküle möglich.
2.2.4.2 MHCI Oberflächenexpression von Hepa1.6 Zellen
Zur Analyse der MHCI Oberflächenexpression von Ad5gp96 transduzierter Hepa1.6
Zellen werden 1x10E5 Zellen jeweils nach einer Transduktionszeit von 24h, 48h und
72h für 2min. bei 2500 rpm und 4C° abzentrifugiert. Dann erneut in 1ml steriler PBSLösung resuspendiert und wieder abzentrifugiert. Das Sediment wurde dann in 1ml
PBS/30% FCS Lösung resuspendiert und für 30 min. inkubiert. Im Anschluß mit dem
Waschpuffer (PBS/5% FCS/ 0.5% BSA und 0.1% NaN3) gewaschen. Das Sediment wird
in 20µl Waschpuffer mit 0.5µg H2Db/ H2Kb Antikörper bei 4 C° für 30min inkubiert.
MATERIAL UND METHODEN
23
Nach einmaligen waschen mit 1ml Waschpuffer erfolgt die Inkubation mit dem sekundären R-PE konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper für 30 min. bei 4 C°. Erneut wird
ein Waschvorgang durchgeführt. Die Zellen werden anschließend in FACS-FIX
Fixierlösung fixiert und in ein Polystyrol- Rundbodenröhrchen aufgenommen. FACSMessung erfolgt für R-PE im FL-2 Kanal. Die zellgbundene Fluoreszenz wurde mit einem
FACScalibur flow cytometer ermittelt. Dieses Prgramm erstellt Histogramme von jeder
Probe und kalkuliert die "mean fluorescence intensty" (MFI) von jeder Zellpopulation,
welche direkt mit der Oberflächendichte der and die Hepatozyten gebundenen R-PE
markierten MHCI (H-2Kb/H-2Db) Molekülen korreliert.
Lösungen:
FACS-FIX Fixierlösung:
8,5 g NaCl
10 g Paraformaldehyd (1 %)
A. bidest. ad 1000 ml
mit NaOH auf pH 7,4 einstellen
2.2.5 Indirekte Immunfluoreszenz-Zytologie
Bei der immunzytochemischen Beurteilung von Ad5gp96 transduzierten Zellen wurden
zunächst sterile Deckgläschen in 6- Loch Kulturschalen mit Kulturmedium aufgefüllt
und Zellen hinzugefügt. Nach 24h Inkubationszeit und gnügend hohe Zelldichte wurden
diese mit einer MOI von 10 transduziert. Nach 48h wurden die Zellen aus der Kultur
entnommen mit steriler PBS Lösung gewaschen und danach mit PBS/3.5%
Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS/ 0.05% Saponin
Lösung 20 min. permeabilisiert. Für die Darstellung der gp96 Expression nach einer
Ad5gp96 Transduktion wurden die Zellen mit dem polyklonalen Hasen-Anti-GRP94Antikörper (H-212) mit einer 1:100 Verdünnung in PBS Lösung für 1h bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligen Waschen mit sterilem PBS erfolgte eine
weitere Inkubation mit dem 1:200 verdünnten Detektionsantikörper Anti-Hasen-IgG/
Alexa 488-konjugiert. Vor der Analyse mittels geeigneter Immunfluoreszenz
Mikroskopie wurden die Objektträger mit einem antifade Reagenz (Fluoroguard) behandelt, um das Photobleaching zu minimieren. Mit Hilfe des Computerprogramms ZeissLSM Image Browser erfolgte die Auswertung der digitalen Bilder.
MATERIAL UND METHODEN
24
2.2.6 Virologische Methoden
2.2.6.1 Infektion mit rekombinanten Adenoviren
Infektionen werden in einem bestimmten Verhältnis von Viruspartikeln pro Zelle durchgeführt und wird mit der Bezeichnung MOI (multiplicity of infection) beschrieben. In
der Regel werden bei MOI von 10 - 20 alle Zellen zur gleichen Zeit infiziert und nach
ein bis zwei Tagen tritt ein zytopathischer Effekt auf.
Nach Bestimmung der Zellzahl wurden 293 Zellen mit Virusinokulum dünn überschichtet und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Dabei wurden die Schalen alle 10 Minuten
geschwenkt, um gleichmäßige Benetzung der Zellen mit Virus zu gewährleisten.
Anschließend wurde das Infektionsmedium abgenommen und neues Medium dazugegeben.
2.2.6.2 Herstellung des rekombinanten Adenovirus Adgp96
Die Herstellung des adenoviralen Konstruktes Adgp96ss erfolgte nach dem AdEasy
Protokoll von Qbiogene.
2.2.6.3 Amplifikation der rekombinanten Adenoviren
Zu Beginn der Amplifikation wurden 60 - 70 % konfluente 293 Zellen in zwei 250 ml
Flaschen jeweils mit MOI von 5 mit adenoviralem Stock infiziert. Nach etwa drei Tagen,
wenn ein zytopathischer Effekt zu beobachten war, wurden die Zellen durch dreimaliges Auftauen und Einfrieren lysiert. Nach Abzentrifugieren von Zellrückständen wurde
das Lysat zum Infizieren größerer Mengen an 293 Zellen mit MOI von etwa 25 eingesetzt. Wenn genügend Zellen (30 - 50 x 600 ml Flaschen) infiziert wurden, wurden sie
geerntet und die Überstände mit 40 % Ammonium Sulfat präzipitiert, um die virale
Ausbeute zu erhöhen (Schagen et al. 2000). Virushaltige Überstände wurden stets
durch einen 0,22 µm Filter (Millex GP Filter, Millipore) steril filtriert und bei -80°C aufbewahrt.
2.2.6.4 Aufreinigung von Adenoviren mittels doppelter
Caesiumchloridgradienten
Die Aufreinigung beinhaltet einen diskontinuierlichen CsCl Gradient, der die zelluläre
Kontamination und defekte Viruspartikel entfernt und einen kontinuierlichen Gradient,
der intakte von defekten Viruspartikeln trennt, sowie Auswaschen von CsCl durch entsalzende Dialyse.
25
MATERIAL UND METHODEN
Für
den
diskontinuierlichen
Virussuspension
auf
CsCl
Gradienten
1,4
und
wurde
CsCl
1,2
in
einem
vorsichtig
Polyallomerröhrchen
überschichtet.
Nach
Fraktionierung durch Zentrifugation für 90 Minuten bei 23000 rpm und 4°C wurde die
Bande aus infektiösen Viruspartikeln mit einer Kanüle aspiriert und anschließend mit
PBS mindestens 1:1 verdünnt, um auf die optimale Dichte für den kontinuierlichen
Gradienten
einzustellen.
Danach
erfolgte
nochmals
die
Überschichtung
der
Virussuspension auf CsCl 1,4 und CsCl 1,2. Nach Zentrifugation für 16 Stunden bei
23000 rpm und 4°C wurden die infektiösen Viruspartikeln aspiriert und mittels
Zelluloseestermembran (Spectra/Por, Spectrum Lab) dialysiert, um CsCl-Salze zu entfernen. Anschließend wurde die Virussuspension steril filtriert und in Aliquots bei - 80°C
aufbewahrt.
Caesiumchloridgradient:
CsCl 1,4: 58 g CsCl, 87 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,9
CsCl 1,2: 26,8 g CsCl, 92 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,9
5 ml Spritze, 20 G Kanüle
Dialysepuffer:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
2 mM MgCl2
4 % Sucrose
2.2.6.5 Bestimmung der Menge an viraler DNA mittels OD-Messung
Die Proben in verschiedenen Verdünnungen sowie der Dialysepuffer wurden mit VirionLysepuffer versetzt für 10 Minuten bei 56°C auf dem Schüttler inkubiert. Die dabei freigesetzten viralen DNAs wurden anschließend durch Messung der optischen Dichte bei
260 nm erfasst. Der OD-Wert liegt um den Faktor 100 höher als der mittels Plaque
Assay bestimmten Titer in PFU/ml und ermöglicht eine indirekte Einschätzung der
Menge an Viruspartikeln, wobei nicht unterschieden werden kann, ob diese infektiös
oder defekt sind.
Virion Lysepuffer:
0,1 % SDS
10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
1 mM EDTA
MATERIAL UND METHODEN
26
2.2.6.6 Bestimmung des Virustiters mittels TCID50 (tissue culture infectious
dose)
96-Lochplatten wurden mit 100µl 911 Zellen in einer Konzentration von 2 x 105/ml
DMEM-10 ausplattiert. Nach Absetzen der Zellen wurden am folgenden Tag 100µl Viren
in log-Verdünnungsstufen von 10-4 bis 10-15 dazupipettiert und für 10 - 14 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Lochplatten mit cytopathischem Effekt gezählt und der
Virustiter mittels Endpunktverdünnungsmethode nach Kärber (1931) berechnet.
TCID50 / ml = 101 + d (S - 0,5)
d = Log 10 der Verdünnung (= 1 für eine 10-fache Verdünnung)
S = Summe der Gesamtzahl der Testansätze mit CPE/Gesamtzahl der
Testansätze pro Verdünnungsreihe ab 10-1 bis zur höchsten Verdünnung
mit beobachtetem CPE
Umformung von TCID50 / ml in PFU/ml:
10x TCID50 / ml = 10x - 0,7 PFU/ml
* Der TCID50-Wert liegt 0,7 Log höher als der mittels Plaque Assay
bestimmten Titer in PFU/ml.
2.2.6.7 Aufkonzentrierung der Virussuspensionen
Um einen höheren Titer zu bekommen, wurden Virussuspensionen mittels Amicon
Ultra-4 Centrifugal Filter Units (Millipore, Eschborn) aufkonzentriert. Die Filterröhrchen
wurden zunächst mit 4 ml 0,1 N NaOH und anschließend zweimal mit 4 ml PBS jeweils
für 10 Minuten bei 2500 U zentrifugiert. Diese Vorbehandlung ist notwendig, um die in
der Filtermembran vorhandene Spur von Glycerin zu entfernen. Nach Zentrifugation
der Proben wurde der Titer bis auf etwa 10-fach konzentriert.
ERGEBNISSE
27
3. Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wird die Synthese des rekombinanten adenoviralen Vektors
Ad5gp96 mit klassischen Methoden der Klonierung dargestellt. Des Weiteren werden
Untersuchungen zur molekular biologischen Charakterisierung des neuen Virus Ad gp96
beschrieben. Darüber hinaus werden experimentelle Daten zur Expression von MHC I
nach der Transduktion von Ad5gp96 gezeigt.
3.1 Klonierung von Ad5gp96
3.1.1 Klonierung pcDNA 3.1(+) gp96
Zur Klonierung der cDNA von gp96 in die adenovirale DNA ist zunächst eine
Subklonierung der cDNA des gp96 auf einen Transfervektor (shCMV Vektor) erforderlich. Dieser Schritt ist für eine Rekombination zwischen shCMVgp96 und der adenoviralen DNA erforderlich. Da die cDNA des gp96 in pGEM-Z übergeben wurde, musste die
cDNA des gp96 in pcDNA 3.1(+) umkloniert werden, welche die erforderlichen
Schnittstellen für kpn I und Not I auf dessen Multiklonierungsstelle besitzt. Diese werden später für die weitere Umsetzung in shCMV Transvervektor benötigt. Die
Umklonierung der cDNA des gp96 erfolgte durch den Verdau des pGEM-Z gp96 und des
pcDNA 3.1(+) Leervektor mit Bam H I, wobei pcDNA 3.1(+) anschließend mittels CIP
an der BamH I Schnittstelle dephosphoryliert wurde, um daraufhin die Ligation mit der
cDNA des gp96 zu ermöglichen. Kompetente Bakterien wurden anschließend transformiert und mittels Ampicillin-Resistenz selektiert. Von 24 untersuchten Kolonien, bei
denen die unverdauten Plasmide mit den unbehandelten pcDNA 3.1(+)Leervektor
(Spur 25) und den pGEM-Z gp96 (Spur 26) verglichen wurden, zeigten 17 Kolonien ein
größeres Gewicht als pcDNA 3.1(+) mit 5,43 kbp und pGEM-Z gp96 mit 5,6 kbp. (Abb.
1 B)
28
ERGEBNISSE
A
BamH I
Kpn I
cDNA gp96
pGEM-Z
Kpn I
BamH I
$
$
Not I
cDNA gp96
pcDNA3.1(+)
B
EcoR I
$ $
$ $
$
$
$
$
$ $ $
$ $ $ $
10 kbp
5 kbp
2,5 kbp
1,5 kbp
0,9 kbp
Kolonie
1
24
25
26
Abb. 1 A. Schema der Klonierungsstrategie für pcDNA3.1(+)gp96. Im ersten Schritt wurde die gp96-cDNA
von pGEM-Zgp96 in den Vektor pcDNA3.1(+) umkloniert. B. Die DNA von 24 Kolonien wurde mittels TENSMiniprep isoliert. Jeweils 1µg DNA wurde mit 6x Ladepuffer versetzt. Die Ansätze und 1 µg 1kb-DNA Marker
wurden auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt. (Evtl. positive Kolonien sind mit
pcDNA3.1(+), Nr. 26: pGMZ-gp96)
"
markiert; Nr. 25:
29
ERGEBNISSE
Zur weiteren Analyse, um sicherzustellen, dass bei den untersuchten Kolonien die cDNA
des gp96 auch tatsächlich in der pcDNA 3.1(+) vorhanden ist, wurde ein Verdau des
neuen Vektors pcDNA 3.1(+) gp96 mit BamH I durchgeführt. Hierdurch entstanden 2
Fragmente, eines mit 5,43 kbp und eines mit 2,4 kbp. Zum Vergleich wurde pcDNA
3.1(+) (Spur 13) und pGEM-Z gp96 (Spur 14) mit BamH I geschnitten.
Das gp96 Fragment ließ sich bei allen Kolonien detektieren. (Abb. 2 A)
Aufgrund der Tatsache, dass der Verdau mit BamH I zu glatten Enden an den
Schnittstellen der DNA führt, muß nach der Ligation der cDNA des gp96 mit pcDNA
3.1(+) die Orientierung des gp96 Fragments in pcDNA 3.1(+) ermittelt werden. Hierfür
ist eine Restriktionsanalyse mit Ecor I und Not I erforderlich. Bei richtiger Orientierung
der cDNA von gp96 resultiert ein Fragment von 1724 bp und bei falscher Orientierung
eines mit 685 bp.
Bei 50% der untersuchten Kolonien konnte eine korrekte Orientierung der cDNA von
gp96 in pcDNA 3.1(+) gp96 nachgewiesen werden. (Abb. 2 B)
A
10 kbp
5 kbp
2,5 kbp
gp96 2409 bp
13
14
B
10 kbp
5 kbp
2,5 kbp
2 kbp
1724 bp
1,5 kbp
685 bp
0,6 kbp
Abb. 2 A. Restriktionsverdau mit BamHI. Je 1µg DNA wurden mit BamHI in einem 10 µl Ansatz für 1 h
verdaut. B. Die Restriktionsanalyse mit EcorI und NotI erfolgte ebenfalls in einem 10 µl Ansatz und 1h
Inkubationsdauer. Alle Proben wurden mit 6x Ladepuffer versetzt und auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt.
30
ERGEBNISSE
3.1.2 Subklonierung des gp96 in Transfervektor shCMV
Damit durch den Transfervektor shuttle CMV die homologe Rekombination mit dem
pAd-Easy Vektor durchgeführt werden kann, um die erwünschte cDNA des gp96 unter
der Kontrolle des humanen CMV Promotor, in die adenovirale DNA einführen zu können,
wurde die cDNA von gp96 in shCMV umgesetzt. Hierfür wurde zunächst die cDNA aus
dem Vektor pcDNA3.1(+) durch einen Restriktionsverdau mit Kpn I und Not I herausgeschnitten, aus dem Gel aufgereinigt und anschließend in den entsprechend vorbereiteten shCMV Vektor ligiert (Abb. 3 A).
Die Bakterien mit dem neuen Plasmid wurden mittels Kanamycinresistenz selektiert.
Der Nachweis einer erfolgreichen Klonierung wurde durch den Doppelverdau des neuen
Vektors shCMVgp96 mit Pac I und KpnI erbracht. Es konnte dabei neben einem charakteristisch 948 bp großen Fragment eines mit 2929 bp nachgewiesen werden (Spur 3).
Weiterhin wurde durch den Verdau mit Kpn I und Not I die cDNA von gp96 mit 2409
bp in den ausgewählten Kolonien dargestellt (Spur 2) (Abb. 3 B).
A
BamH I
Kpn I
Not I
cDNA gp96
pcDNA3.1(+) gp96
Pac I
Kpn I
Pme I
Not I
Pme I
Pac I
cDNA gp96
shCMV
B
10 kbp
5 kbp
2,5 kbp
2929 bp
2409 bp
0,9 kbp
948 bp
1
2
3
Abb. 3 A. Schema der Klonierungsstrategie für shCMVgp96. B. Doppelverdau zum einen mit KpnI+NotI und
zum anderen mit PacI+KpnI. Die Inkubationszeit betrug bei allen Ansätzen 1h. Alle Proben wurden mit 6x
Ladepuffer versetzt und auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt.
ERGEBNISSE
31
3.1.3. Homologe Rekombination zwischen shCMVgp96 und adenoviraler DNA
Für die homologe Rekombination wurde der shuttle CMV gp96 Vektor einem
Partialverdau mit Pme I unterzogen, da dieser sowohl eine Schnittstelle in dem Vektor
besitzt als auch in der cDNA von gp96. Nur bei einem Schnitt des Pme I an dessen vorgesehener Schnittstelle in den shCMV Vektor sind die recA positiven E.coli Bakterien
vom Typ BJ 5183 zur homologen Rekombination fähig, woraus nach einer
Cotransformation der Bakterien mit pAd Easy Plasmid ein Kanamycin resistentes
pAd5gp96 Vektor entstanden ist.
Bei einen Verdau von Pme I in gp96 kann das Kanamycin Resistenzgen nicht gelesen
werden bzw. eine Rekombination ist nur bedingt möglich, da hierfür der rechte Arm der
Ad5 homologen Sequenz auf den shCMV Plasmid in diesen Fall nicht freigesetzt wird
und somit nicht für die homologe Rekombination zur Verfügung stehen kann, wodurch
die cotransformierten Bakterien bei einer Kultivierung auf einer Kanamycin Agar-Platte
untergehen würden. (Abb. 4 A)
Bei dem Vergleich des aus der Rekombination hervorgegangenen pAd5gp96 Vektors
mit shCMVgp96 nach einem Restriktionsverdau mit Pac I zusammen mit Kpn I und Xba
I, konnte die cDNA von gp96 bei 2409 bp dargestellt werden (Abb. 4 B). Auch die weitere Analyse des pAd5gp96 Vektor mit pAd Easy 1 Leervektor über einen Verdau mit
Bstx I bestätigte die erfolgreiche Rekombination (Spuren 2 A, B). Hierbei entstanden
bei dem Verdau des pAd Easy 1 Vektors 6 Fragmente, die zwischen 1399 bp und 11921
bp groß sind (Spur 2 C). Wohingegen bei pAd Easy 1 gp 96, wie erwartet, nur 5
Fragmente nachzuweisen waren, da hier das 8237 bp große Fragment zusammen mit
der cDNA von gp96 ein 10646 bp großes DNA Bruchstück gebildet hat, welches bei der
elektrophoretischen Auftrennung auf einem 1%-igen Agarosegel in annährend derselben Größe erscheint wie das 11921 bp großes Bruchstück, wodurch diese als eine
zusammen gefasste Bande zu sehen sind (Spuren 2 A, B).
Nicht zuletzt hat auch der enzymatische Verdau mit Pac I 2 charakteristische
Fragmente von ca. 4,5 kbp und 35 kbp ergeben. Damit konnte gezeigt werden, dass
die Rekombination zwischen dem Origin of replication des pAdEasy 1 Vektors und dem
rechten Arm der Ad5 homologen Sequenz von shCMVgp96 statt gefunden hat (Spur 3
A, B). Die cDNA des gp96 konnte nach einem Restriktionsverdau mit Pac I zusammen
mit Kpn I und Xba I bei dem aus der Rekombination hervorgegangenen pAd5gp96, wie
der Vergleich zur ebenso behandelten shCMVgp96 zeigt, dargestellt werden (Spuren 4
A, B und D)
32
ERGEBNISSE
A
B
A
B
C
D
35 kbp
10 kbp
5 kbp
4500 bp
2,5 kbp
2409 bp
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
Abb. 4 A Schema der Rekombination von shCMVgp96 mit Ad-Easy Vektor. B Restriktionsanalyse mit Bstx I,
Pac I , Pac I+Kpn I+Xba I. Die Inkubationszeit betrug bei allen Ansätzen 1h. Alle Proben wurden mit 6x
Ladepuffer versetzt und auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt.
33
ERGEBNISSE
3.2. Expression des Konstruktes pAd5gp96 in HEK 293 Zellen
Zur transienten Expression von gp96 wurden 4 ausgewählte Konstrukte des pAd5gp96
in HEK 293 Zellen mittels der Calcium-Phosphat-Transfektionsmethode eingeführt.
Die HEK 293 Zellen beinhalten in ihrem Genom das zur Replikation des Adenovirus
erforderliche und von den pAdEasy1 deletierte E1 Gen, wodurch die Vermehrung von
Ad5gp96 Viren erst stattfinden kann. Der Überstand der transfizierten Zellen wurde auf
4 neue HEK 293 Zellkulturen gegeben. Ein Teil dieser Zellen wurden nach 9 Tagen mit
dem Detergenz-Triton 1%ig lysiert. Das gesamte Zellysat wurde auf einer SDS-Page
aufgetrennt und im Immunoblot nach Inkubation mit monoklonalen anti gp96 Ratten
Antikörper und monoklonalen anti Hsp 70 Maus Antikörper untersucht. Wie in der folgenden Abb. 5 zu sehen ist, ist bei allen Konstrukten eine im Durchschnitt 3- bis 4-fach
verstärkte Expression an gp96 im Vergleich zu nicht Ad5gp96 infizierten Zellen zu
sehen (Spur 1-4).
Die dargestellte hsp 70 Expressionsniveau ist bei allen untersuchten Zellen gleich. Die
Inkubation mit monoklonalen anti-ßActin Maus Antikörpern zeigt die gleichmäßige
Verteilung an Lysaten in den einzelnen Proben. Somit konnte nachgewiesen werden,
dass die aus den pAdEasy1 gp96 hervorgegangenen Ad5gp96 Adenoviren zur Infektion
von HEK 293 Zellen und zur Induktion von gp96 fähig sind.
Nach der Amplifizierung des Ad5gp96 Virus in HEK 293 Zellen, wurden diese durch
einen Caesium Clorid Gradienten über die Ultrazentrifugation isoliert. Die Titrierung des
Virus ergab nach einer 2 wöchigen Inkubation mit HEK 293 Zellen einen Titer von 1x
1010 PFU/ml.
kDa
105
gp96
75
hsp70
50
ß-Aktin
35
Abb.5 50 µg des Gesamtlysats der mit Ad5gp96 infizierten 293 Zellen (Spuren 1-4) zusammen mit nicht infizierten Zellen (Spur 5) bzw. von 293 Zellen, die mit dem Lysat von nicht infizierten Zellen (Spur 6) inkubiert
wurden mittels SDS-Page aufgetrennt. Die Membran wurde mit anti-gp96 monoklonalen Ratten Ak, anti-hsp
70 monoklonalen Maus AK und anti-ßActin Maus AK inkubiert.
34
ERGEBNISSE
3.2.1. Infektion von verschiedenen Zellinien mit Ad5gp96
Zur Bestimmung, ob die isolierten Ad5gp96 Adenoviren auch andere Zellinien neben
HEK 293 Zellen infizieren können, wurden 911 Zellen, welche auch in ihrem Genom das
zur Replikation erforderliche Gen E1 besitzen, mit einer MOI von 1 für 48h infiziert. Das
Lysat dieser Zellen wurde auf dem selben Weg, wie bereits oben beschrieben, gewonnen und analysiert. Die Abbildung zeigt deutlich die Bildung des gp96 bei ca. 96 kDa
nach der Induktion durch Ad5gp96 infizierten 911 Zellen (Spur 2). (Abb. 6)
kDa
105
gp96
75
50
ß-Aktin
35
Abb. 6 50 µg Gesamtlysat von nicht infizierten 911 Zellen (Spur 1) und von Ad5gp96 infizierten Zellen (Spur
2) wurden über eine SDS-Page aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrocellulose Membran übertragen.
Anschließend wurden gp96 und ß-Actin mittels monoklonalen Antikörper detektiert.
Um die Expression von gp96 nach der Infektion mit Ad5gp96 Adenoviren in Zellinien zu
untersuchen, die nicht über das E1 Gen verfügen und somit nicht zur Amplifikation von
Ad5gp96 Virus in der Lage sind, wurden Hepa1.6 Zellen mit einer MOI von 10 mit
Ad5gp96 für 48h infiziert. In der selben Weise wurden weitere Hepa1.6 Zellen mit Ad
EV, d.h. dem Adenovirus ohne die cDNA von gp96, infiziert.
In Abb. 7 ist die Westernblotanalyse nach der Inkubation mit monoklonalen
Antikörpern gegen gp96 und ß Actin zu sehen. Der Western Blot zeigt, dass die
Infektion mit dem Vektor Ad EV, also ohne die cDNA des gp96, im Vergleich zu nicht
infizierten Hepa1.6 Zellen zu keiner erhöhten Expression von gp96 führt (Spuren 2 und
3). Somit konnte gezeigt werden, dass nur mit dem Vektor Ad5gp96 Virus die gp96
Expression induzierbar ist (Spur 1).
kDa
105
gp96
75
50
35
ß-Aktin
Abb. 7 50 µg Gesamtlysat von Hepa1.6 Zellen 48h nach einer Ad5gp96 Infektion (Spur 1) und von Ad-EV
Viren infizierten Hepa1.6 Zellen (Spur 2) wurden mit dem Lysat von nicht infizierten Hepa1.6 Zellen (Spur
3) über einer SDS-Page aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose Membran geblottet und mit monoklonalen anti
gp96 Ratten Antikörper und anti-ßActin Maus Antikörper detektiert.
35
ERGEBNISSE
3.3. Immunfluoreszenz Mikroskopie von Ad5gp96 infizierten Zellinien
Zur weiteren Charakterisierung von Ad5gp96 Viren wurden 911 Zellen für 48h infiziert
und die gp96 Expression mittels der Immunfluoreszenz Mikroskopie untersucht. Dazu
wurden die Zellen mit 4%-igem Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurde die
Membran der Zellen mit den Detergenz Saponin 0,1 % permeabilisiert und danach mit
polyklonalen anti gp96 Hasen Antikörpern inkubiert. Der Nachweis der anti gp96
Antikörperbindung wurde mit Hilfe monoklonaler Alexa markierter anti Hasen IgG
Antikörper durchgeführt. Erwartungsgemäß wurde typischerweise eine retikuläre
Verteilung von gp96 deutlich, da dieser in der Membran des endoplasmatischen
Reticulums lokalisiert ist, welches durch den anti gp96 Antikörper erkannt wurde (Abb.
8 A). Die Ad5gp96 infizierten Zellen zeigten ein ähnliches Muster unter dem
Immunfluoreszenz Mikroskop nur mit einer deutlich stärkeren Intensität und
Vernetzung. Diese Befunde weisen somit auf eine erhöhte Expression von gp96 in der
Membran des endoplasmatischen Reticulums nach einer Ad5gp96 Infektion hin. (Abb.
8 B)
Aufgrund der zu vernachlässigenden Kreuzreaktion zwischen dem Sekundären mit
Alexa konjugierten Antikörper und den Bestandteilen der 911 Zellen, kann eine spezifische Bindung des primären anti gp96 Antikörpers angenommen werden. (Abb. 8 C,
D)
Abb. 8 Darstellung der gp96 Expression 48h nach
Adgp96-Infektion von 911 Zellen vs. nicht infizierte
Zellen. Nach der Fixierung und Permebealisierung
wurden die Zellen mit polyklonalen gp96 Hasen
Antikörper inkubiert. Gebundene Antikörper wurden
mit Alexa konjugierten anti-Hasen IgG Antikörpern
A
B
komplexiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop
sichtbar gemacht. A: Native 911 Zellen, B: 911 Zellen
48 h nach Ad5gp96 Transfektion, C: Nichtinfizierte
911 Zellen und D: Ad5gp96 infizierte 911 Zellen nach
Inkubation mit den sekundären polyklonalen Alexa
konjugierten Antikörper
C
D
36
ERGEBNISSE
Eine weitere Untersuchung zeigte bei der Ad5gp96 Infektion von Hepa1.6 Zellen mit
einer
MOI
von
10
ein
ähnliches
Expressionsmuster
von
gp96
unter
dem
Fluoreszenzmikroskop.
Hierbei wurden die selben Methoden und Antikörper verwendet, wie bei der bereits
oben
beschriebenen
Untersuchung
der
911
Zellen.
Allerdings
ist
die
Fluoreszenzintensität bei den Hepa1.6 Zellen stärker, da auch die Grundexpression von
gp96 ausgeprägter zu sein scheint als bei den 911 Zellen, wie in der Abbildung zu
sehen ist (Abb 9 A). Im Vergleich zwischen nicht infizierten Zellen zu Ad5 EV infizierten Hepa1.6 Zellen, die somit nur mit der adenoviralen Hülle ohne die Fähigkeit zur
Auslösung einer vermehrten gp96 Expression infiziert wurden, ist zu erkennen, dass
auch bei dieser Untersuchung die Induktion von gp96 nicht durch die Bestandteile
des Adenovirus beeinflusst wird, was sich auch in der annährend gleichen
Fluoreszenzintensität der beiden Zellpopulationen widerspiegelt (Abb 9 B).
Nur die Infektion mit Ad5gp96 führt zu einer gesteigerten gp96 Expression (Abb 9 C).
Die alleinige Inkubation mit Alexa konjugierten sekundären Antikörpern von Ad5gp96
infizierten Hepa1.6 Zellen führt zu keinem beträchtlichen Signalunterschied zu nicht
infizierten Zellen, wodurch belegt werden konnte, dass die Fluoreszenzintensität nicht
durch den cytopathischen Effekt der Adenoviren und damit nicht durch die Abrundung
der Zellen bedingt ist. (Abb 9 D, E)
Abb. 9 Darstellung der
gp96 Expression 48h nach
Adgp96
Infektion
von
Hepa1.6 Zellen vs. nicht
infizierte Zellen. Nach der
Fixierung und Permebeali-
A
B
C
sierung wurden die Zellen
mit
polyklonalen
gp96
Hasen Antikörpern inkubiert.
Gebundene
Anti -
körper wurden mit Alexa
konjugierten
IgG
anti-Hasen
Antikörpern
kom -
plexiert und unter dem
D
E
Fluoreszenzmikroskop
sichtbar gemacht.
A: Native Hepa 1.6 Zellen, B: 48 h nach Ad5 EV tranfizierte Hepa 1.6 Zellen, C: Hepa 1.6 Zellen 48h nach
Ad5gp96 Infektion, D: Ad5gp96 infizierte und E: untransfizierte Hepa 1.6 Zellen nach Inkubation mit der
sekundären polyklonalen Alexa konjugierten Hasen Antikörper
37
ERGEBNISSE
Zusammenfassung der Klonierung von Ad gp96
Wie bereits erläutert, wurde die cDNA von gp96 in mehreren Subklonierungsschritten
von dem pGEM-Z gp96 Plasmid in pcDNA3.1(+) gp96 und anschließend in shCMVgp96
umgesetzt. Durch die homologe Rekombination konnte die cDNA des gp96 in die DNA
des pAd Easy 1 (pAd 5 delta E1/E3) eingeführt werden.
Die erfolgreiche Klonierung des Ad gp96 wurde in mehreren Untersuchungsschritten
durch die Restriktionanalysen des Plasmids Ad Easy 1 gp96 in Kap.3.1. gezeigt.
Die Infektiösität und Amplifizierbarkeit des rekombinanten Ad5gp96 Virus konnte in
HEK 293 Zellen und 911 Zellen über den Western Blot in Kap 3.2 nachgewiesen werden.
Die mittels Ultrazentrifugation über einen Caesium Chlorid Gradienten isolierten
Ad5gp96 Viren führten zu einer Induktion von gp96 in Hepa1.6 Zellen. Hierbei konnte
durch
2
verschiedene
Methoden,
dem
Western
Blot
in
Kap
3.2
und
der
Fluoreszenzmikroskopie in Kap 3.3, demonstriert werden, dass die gesteigerte
Expressionsrate von gp96 nur durch die Infektion mit Ad5gp96 ausgelöst und nicht
durch
andere
adenovirale
Bestandteile
beeinflusst
wird.
Damit
konnte
die
Funktionalität des Ad5gp96 Virus durch verschiedene Analyseverfahren verifiziert
werden.
Es wurde somit ein adenoviraler Vektor erstellt, der dazu in der Lage ist, verschiedene
Zielzellen, wie z.B. Tumorzellen, zu infizieren und damit eine gezielte gp96 Expression
zu induzieren. Dadurch sind weitere Untersuchungen im Bereich der Gentherapie in
vitro und in vivo möglich. Die Wirkungen einer gp96 Überexpression auf Tumorzellen
bzw. deren Einfluß auf die Antigenpräsentierung könnten u.U. weitere Aufschlüsse
über die Bedeutung von gp96 für das Immunsystem und dessen Funktionsweise
geben.
Auch
Fragen
bezüglich
möglicher
Interaktionen
zwischen
gp96
und
Oberflächenproteinen, wie das MHC I System, könnten hierdurch genauer betrachtet
werden.
ERGEBNISSE
38
3.4 Einfluß des gp96 auf die MHC I Expression
Zur Untersuchung welchen Einfluß eine transiente Überexpression an gp96 auf die MHC
I Oberflächenstrukturen von Zellen ausüben würde, muß zunächst die Induzierbarkeit
der MHC I Strukturen von Hepa1.6 Zellen ermittelt werden. Dazu wurden die Zellen mit
INF alpha bzw. gamma behandelt und anschließend zur Beurteilung der MHC I
Oberflächenstrukturen mittels FACS Analyse bestimmt.
3.4.1 Oberflächenexpression des MHC I nach Interferon alpha bzw. gamma
Stimulation
Mit dem Ziel, genauere Kenntnis über die MHC I Expressionsmuster nach IFN alpha
bzw. IFNgamma Gabe zu gewinnen, wurden Hepa1.6 Zellen in Doppelansätzen 48h
nachdem sie ausgesäht wurden jeweils mit 500 IU/ml IFN alpha bzw. 50 ng/ml IFN
gamma behandelt. Sowohl die INF alpha/gamma behandelten Hepa1.6 Zellen als auch
die unbehandelten Zellen wurden 24, 48 und 72h nach der IFN Gabe einer FACS
Analyse unterzogen. Dazu wurden die zu untersuchenden Proben mit monoklonalen
Maus anti H2Db/H2Kb Antikörpern inkubiert und mit PE-konjugierten anti Maus IgG
detektiert. Die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der Zellen erfolgte im
Fl-2 Kanal im Durchflußzytometer.
Zur Bestimmung des Hintergrundsignals wurden Zellen nur mit den sekundären PE-IgG
Antikörpern inkubiert (Abb. 10 A). Dieser Wert lag zu allen Untersuchungszeitpunkten
in etwa zwischen MFI von 3,42 und 4,94. Auch die MHC I Grundexpression bei den nicht
IFN behandelten Zellen verhielt sich relativ konstant (Abb. 10 B). Die Werte hierfür
überschritten nicht einen MFI von 35,46 und lagen nicht tiefer als 33,32 während des
gesamten Beobachtungszeitraum. Die MHC I Expression nach IFN alpha Induktion
erreichte ihren maximalen Wert bereits nach 48h (MFI=105,09).
Nach 72h nahm dieser Wert wieder ab (Abb. 10 C), wohingegen bei den IFN gamma
induzierten Zellen die MHC I Oberflächenexpression zu diesen Zeitpunkt eine steigende Tendenz aufwies (Abb. 10 D).
Auch die Expressionsrate von MHC I lag bei 3- bis 4-fach höheren Werten im Vergleich
zu IFN alpha induzierten Zellen (MFI= 313,4) (Abb. Histo. zu allen Zeitpunkten).
39
Zellzahl
ERGEBNISSE
A
B
C
D
MHC I
Abb. 10 MHC I Oberflächenexpression 72h nach IFN alpha bzw. gamma Induktion von Hepa1.6 Zellen. Die
Hepa1.6 Zellen (1x10E5) wurden anschließend mit PBS-30% FCS geblockt und dann gewaschen. Die MHC I
Expression wurde mittels Durchflußzytometrie und monoklonalem Maus-Anti-H2Db/H2Kb-Antikörper und PEkonjugiertem Anti-Maus-IgG detektiert. Die Fluoreszenzintensität und relative Zellzahl (Counts) sind auf der
X- bzw. Y-Achse angegeben.
40
ERGEBNISSE
Im
folgenden
Diagramm
sind
alle
Werte,
die
während
des
gesamten
Beobachtungszeitraums bestimmt worden sind, dargestellt. Hieraus lässt sich zusammenfassend die deutlich schwächere und kürzere Wirkung von IFN alpha im Vergleich
zu IFN gamma auf die MHC I Induktion von Hepa1.6 Zellen ableiten. Diese Ergebnisse
führten dazu, in den weiteren Versuchen die MHC I Expression von IFN gamma stimulierten Hepa1.6 Zellen zum Vergleich von MHC I nach Ad5gp96 infizierten Zellen heranzuziehen (Abb. 11).
Abb. 11 MHC I Expression nach IFN alpha bzw. gamma Induktion von Hepa1.6 Zellen über einen
Beobachtungszeitraum von 24h, 48h und 72h. Gezeigt ist die Inkubation von Hepa1.6 Zellen mit den PE konjugierten Anti-Maus-IgG Antikörper jeweils die 1. Säule, dann die MHC I Expression ohne IFN Einfluß jeweils
die 2. Säule, schließlich die mit IFN alpha behandelteten Zellen, jeweils die 3. Säule, im Vergleich zu IFN
gamma, jeweils die 4. Säule in den Beobachtungszeitabständen von 24h. Die Werte sind als Mittelwert von
MFI +/- Standardabweichung aus 2 Ansätzen pro Experiment dargestellt.
3.4.2 MHC I Expression nach Ad5gp96 Infektion von Hepa1.6 Zellen
Um die Fragestellung überprüfen zu können, ob mit einer transienten Überexpression
von gp96 ein direkter Einfluß auf die MHC I Oberflächenexprssion zu beobachten ist,
wurden Hepa1.6 Zellen in Doppelansätzen mit Ad5gp96 infiziert. Mit der selben
Virusmenge, nämlich MOI von 10, wurden Hepa1.6 Zellen mit Ad EV Adenoviren infiziert, die, wie bereits oben erwähnt, nicht in der Lage sind eine gp96 Expression zu
41
ERGEBNISSE
induzieren. Hierdurch würden eventuelle Veränderungen der MHC I, die nicht durch die
Beteiligung von gp96 ausgelöst würden, erfasst werden. Zum Vergleich der
Induzierbarkeit von MHC I wurde IFN gamma in der bereits oben beschriebenen Weise
(Kapitel 3.4.1) eingesetzt. Auch bei der Bestimmung des Hintergrunds wurde genauso
verfahren wie in Kapitel 3.4.1 dargestellt. Die MHC I Expression ist hier ebenfalls über
einen Zeitraum von 24, 48 und 72h nach der Ad5gp96 Infektion bzw. IFN Behandlung
von Hepa1.6 Zellen entsprechend untersucht worden.
Die in Abbildung 12 gezeigten Histogramme machen deutlich, dass die Zellpopulationen
der Ad5gp96 infizierten Zellen auch nach 72h im Vergleich zu den Ad EV infizierten und
den nicht infizierten Zellen keinen Unterschied bezüglich ihrer MHC I Expression aufweisen.
Hepa 1.6
A
Hepa 1.6 +
Adgp96
B
Hepa 1.6 +
Ad-EV
C
Monoklonale PE-konjugierte Anti-Maus-IgG
Hepa 1.6
D
Hepa 1.6 +
Adgp96
Hepa 1.6 +
Ad-EV
F
Zellzahl
E
Monoklonale Maus-Anti-H2Db/H2Kb-Antikörper und PE-konjugierte Anti-Maus-IgG
Hepa 1.6 +
IFN gamma
G
Monoklonale Maus-Anti-H2Db/H2Kb-Antikörper und PE-konjugierte Anti-Maus-IgG
MHC I
Abb. 12 MHC I Oberflächenexpression 72h nach Adgp96 bzw. Ad-EV Infektion von Hepa1.6 Zellen im Vergleich
zu IFN gamma behandelten bzw. unbehandelten Hepa1.6 Zellen. Die Hepa1.6 Zellen (1x10E5) wurden anschließend
mit
PBS-30%
FCS
geblockt
und
dann
gewaschen.
Die
MHC
I
Expression
wurde
mittels
Durchflußzytometrie und monoklonalem Maus-Anti-H2Db/H2Kb-Antikörper und PE-konjugiertem Anti-Maus-IgG
detektiert. Die Fluoreszenzintensität und relative Zellzahl (Counts) sind auf der X- bzw. Y-Achse angegeben.
ERGEBNISSE
42
Alle Meßwerte, die während des gesamten Beobachtungszeitraums erhoben wurden,
sind im folgenden Diagramm zusammengefasst worden (Abb. 13). Die Werte für die
mittlere Fluoreszenzintensität liegt bei den Ad5gp96 (Säule 5) bzw. Ad EV (Säule 6)
infizierten und den nicht infizierten Hepa1.6 Zellen (Säule 4) im Durchschnitt bei ca.
15,6. Die MHC I Expression war zu allen Zeitpunkten sehr gut induzierbar, wenn man
dazu die Werte für die mittlere Fluoreszenzintensität der IFN gamma behandelten
Zellen (Säule 7) vergleicht. Die niedrigen MFI Werte für die Hintergrundsignale (Säulen
1-3) zeigen, dass die zythopathischen Effekte der Adenoviren keine Beeinträchtigung
für die erhobenen Messwerte darstellen.
Abb. 13 MHC I Expression nach Ad5gp96 bzw. Ad-EV Infektion (MOI 10) von Hepa1.6 Zellen im Vergleich
zu IFN gamma induzierten Hepa1.6 Zellen vs. unbehandelte Zellen über einen Beobachtungszeitraum von
24h, 48h und 72h. Gezeigt werden in den Säulen 1-3 des jeweiligen Beobachtungszeitpunkts nicht infizierte
Hepa1.6 Zellen vs. Ad5gp96 bzw. Ad-Ev infizierte Zellen, inkubiert mit den PE konjugierten Anti-Maus-IgG
Antikörper, in den Säulen 4-6 sind in der selben Reihenfolge die MHC I Expression von nicht infizierten
Hepa1.6 vs. Ad5gp96 bzw. Ad-EV infizierten Zellen zu sehen im Vergleich zu IFN gamma behandelten Zellen
in Säule 7 in den vorgegebenen Beobachtungszeiträumen von jeweils 24h. Die Werte sind als Mittelwert von
MFI +/- Standardabweichung aus 2 Ansätzen pro Experiment dargestellt.
Aus diesen Beobachtungen lässt sich entnehmen, dass die transiente Überexpression
von gp96 nicht zur Induktion von MHC I Oberflächenexpression führt.
43
DISKUSSION
4. Diskussion
4.1 Der Vektor Ad5gp96 in der Gentherapie
In dieser Arbeit konnte die erfolgreiche Klonierung und Isolierung eines neuen adenoviralen Vektors dargestellt werden, der in der Lage ist, ein immunomdulatorisch sehr
wirksames Protein, das gp96, in unterschiedlichen Zielzellen zu induzieren (Kap. 3.2).
Bei der Charakterisierung des Ad5gp96 Virus konnte mittels der Immunfluorezenz
Mikroskopie das typische reticuläre Expressionsmuster des gp96 nach einer Ad5gp96
Infektion in unterschiedlichen Zellinien gezeigt werden. Somit konnte die verstärkte
Expression von gp96 im endoplasmatischen Reticulum demonstriert werden (Kap. 3.3).
Weitere Lokalisationen, wie sie von Altmeyer (1996)in anderen Zellkompartimenten wie
den Cytosol oder der Zelloberfläche (3;10) gezeigt wurden, konnten mit der
Immunfluoreszenz Mikroskopie nicht dargestellt werden. Auch andere Kompartimente
wie der Nucleus (73) oder den Golgi Apparat (17) sind mit der hier angewendeten
Methode nicht zur Darstellung gekommen.
Die Verwendung von Adenoviren hat viele Vorteile. Zum einen können sowohl in vitro
als auch in vivo mittels Adenoviren viel besser und effizienter ausgesuchte Gene in
sich teilende und auch nicht teilende Zellen transduziert werden. Damit wird, im
Vergleich zu Zellen, die mit Plasmiden des zu untersuchenden Gens mit kationischen
Trägermaterialien, wie z.B. Liposomen oder Polymeren, transfiziert wurden, eine stärkere Expression an den erwünschten Proteinen ausgelöst (37). Zum anderen lassen sich
Adenoviren in großen Mengen herstellen und aufreinigen (25), wobei es sehr verschiedene Wege hierzu gibt, die sich in ihrer Effizienz deutlich unterscheiden (siehe BD sciences und AdEasy-Protokolle). Die Isolierung und Aufreinigung des Ad5gp96 Virus
wurde hier mittels des Caesium-Chlorid-Dichte-Gradienten per Ultrazentrifugation
erreicht. Bei dieser Methode müssen allerdings einige Nachteile in Kauf genommen werden. Zum einen ist, aufgrund der langen Prozedur bis zur Aufreinigung, der enorm hohe
Zeitaufwand zu nennen, der bis über 24h dauern kann. Zum anderen die hohe
Verlustrate an Adenoviren, die sich aus den einzelnen Zentrifugationsschritten und
der
anschließenden
Dialyse
zur
Entfernung
des
CsCl
ergeben.
Neuere
Aufreinigungsmethoden versprechen diesbezüglich Abhilfe, denn sie werden nach chromatographischen Prinzipien durchgeführt, wodurch sich die äußerst zeitintensiven
DISKUSSION
44
Reinigungsschritte verkürzen und sich die Verlustraten senken lassen, da viele
Zwischenschritte dabei entfallen (BD-Biosciences).
Die Internalisierung der Adenoviren in die Zielzelle erfolgt über den CoxackieAdenovirus Rezeptor (CAR), über welchen die meisten Säugerzellen ubiquitär verfügen
(11).
Allerdings besitzen Zellen des lymphatischen Systems keine bis nur geringe Mengen an
CAR, so dass diese mit deutlich höheren MOI-Werten infiziert werden müssen (66).
Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgt auf transgener Ebene, da das adenovirale Genom mit dem zu untersuchenden Gen nicht stabil in die DNA der Zielzellen
integriert wird.
Die adenovirale DNA wird extrachromosomal über dessen Terminalen Protein (TP), welches kovalent zu den Enden des viralen DNA gebunden ist, stabil im Nucleus gehalten
(invitrogen-FAQ). In sich schnell teilenden Zellen kann das rekombinante Protein 24h
nach der Transduktion detektiert werden. Die maximale Expression, welche mit der
Expressionsrate des gp96 nach Ad5gp96 Infektion von unterschiedlichen Zielzellen
(Kap. 3.2) übereinstimmt, wird aber erst nach 48 bis 96h postransduktional beobachtet (invitrogen-FAQ).
Aus den genannten Gründen wird sehr leicht ersichtlich, welche Bedeutung adenovirale Vektoren für die Gentherapie bzw. für die Genforschung haben (2001).
4.2 Einfluß des gp96 auf das MHC I System
Gp96 ist ein Glykoprotein das 96 kDa groß ist und zur Familie der Hsp 90 Chaperone
gehört.
Das Gen des gp96 ist auf Chromosom 12 lokalisiert und kodiert ein 803 Aminosäuren
großes Protein. Das C-terminale Ende besitzt eine KDEL Sequenz, welche dafür verantwortlich ist, dass sich gp96 überwiegend im ER Lumen befindet (3), wobei das gp96
scheinbar nicht mit der ER Membran assoziiert ist (30).
Das gp96 läßt sich durch unterschiedliche Stressbedingungen induzieren, wie z.B. im
Hungerzustand der Zelle bei Glucosemangel , oder bei einer Ca2+-Depletion im endoplasmatischen Reticulum (73), auch durch die Hemmung des Proteasoms wird die
Expressionsrate deutlich verstärkt (18). Des Weiteren führt die Überexpression an
missgefalteten Proteinen zu einer verstärkten Translation von gp96 (45). Die Sekretion
von Antikörpern führt bei B-Zellen zu einer erheblichen Steigerung an gp96 Expression
45
DISKUSSION
(32). In vielen spontanen wie auch in chemisch induzierten Tumoren wurde eine verstärkte Aktivierung des gp96 Promoters festgestellt (47). INF gamma führt zur Überexpression von gp96 (4).
Eine Mutation des Genlocus für das gp96 führt bei prä B-Zellinien zur Retention von
Oberflächenproteinen wie die Toll like Rezeptoren (TLR 1, TLR2, TLR4), den Integrinen
wie CD11a, wobei keinerlei Wirkung auf z.B. H-kb beobachtet werden konnte (46).
Die Vaccinierung mit gp96, isoliert aus Tumoren, führt zur tumorspezifischen
Immunität (60). Hierbei wurde die immunogene Wirkung des gp96 auf dessen
Fähigkeit zur Peptidbindung zurückgeführt (58). Die gp96 Peptidkomlexe wurden von
Antigen präsentierenden Zellen aufgenommen, was im Anschluß über MHC I zur
Kreuzreaktion mit CD8+ T Zellen führte (61). Die Immunisierung mit aus Tumoren
stammendem gp96 ruft eine T Zell vermittelte anti Tumor Immunität hervor (69).
Peptide aus Tumorantigenen sowie Peptide aus viralen und bakteriellen Antigenen können an gp96 gebunden werden (59) und über MHC I eine CD8+ T Zellantwort auslösen
(15; 63).
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Peptiden an Chaperonen,
wie gp96, bereits ausreicht, um eine CD8+ T Zellantwort auszulösen (13).
Die Aufnahme von gp96 assoziierten Peptiden erfolgt über CD91 Rezeptoren auf der
Zelloberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (14). Nach der Endocytose der
Hitzeschockproteinpeptidkomplexe können die Peptide über MHC I Oberflächenproteine
zur Auslösung einer CD8+ T Zellantwort führen.
Die peptidbindende Domäne wurde sowohl auf der C-terminalen wie auch auf der Nterminalen Seite lokalisiert, wobei die N-terminale Seite eine prädominierende Rolle für
die Peptidbindung zu haben scheint (71). Die Bindungsaffinität ist abhängig von der
Größe der Peptide. Größere Intermediate neigen sehr leicht zur Dissoziation. Dagegen
können sich kürzere Peptidketten nur sehr schwer von der Bindungsstelle lösen (15).
Der Major-Histokompatibilitäts-Komplex der Klasse I (MHC I) bindet ein breites
Spektrum an Peptiden. Diese können von vielen unterschiedlichen intrazellulären
Proteinen, oder von viralen bzw. bakteriellen Proteinen, von mutierten Genprodukten
aus transformierten Zellen sowie auch von allogenen Zellmaterial stammen. Auf zwei
Wegen werden die Peptide für die MHC I Beladung vorbereitet. Zum einen im Cytosol
über das Proteasom, zum anderen im endoplasmatischen Reticulum über ER assoziierte
Amionpeptidasen
(20;
53).
Beide
Wege
werden
miteinander
durch
den
Peptidtransporter TAP verbunden. Wie im Einzelnen die Peptide im Cytosol vor dem
Abbau durch Peptidasen geschützt werden und im ER die Peptide an das MHC I Molekül
DISKUSSION
46
gebunden werden, ist nicht ganz geklärt. Viele Untersuchungen aber konnten zeigen,
dass die Hitzeschockproteine sowohl des Cytosols als auch des endoplasmatischen
Reticulums, wie das gp96 als Chaperone für die antigenen Peptide dienen und zu einen
CD8+ T Zellantwort via MHC I führen können (13).
Aufgrund der Tatsache, dass IFN gamma sowohl zur Induktion von gp96 als auch zur
Hochregulierung von MHC I führt, hat sich in diesem Kontext die Frage gestellt, ob
nicht u.U. ein direkter Zusammenhang beider Vorgänge bestehen kann. Unterstützt
wird dieser Gedanke auch von der Tatsache, dass sich beide Proteine im endoplasmatischen Reticulum befinden und bei der Peptidvorbereitung zur Oberflächen
Präsentierung beteiligt sind.
Da die meisten Untersuchungen diesbezüglich mit Mutationen des gp96 durchgeführt
wurden, war es von Interesse, welchen Einfluß eine transiente Überexpression an gp96
in diesen Fall auf das MHC I System ausüben könnte.
Aus den oben hervorgegangenen Erkenntnissen und auch angesichts der Lokalisation
beider Moleküle im endoplasmatischen Reticulum stellte sich die Frage, ob eine Überexpression von gp96 in Hepa1.6 Zellen einen direkten Einfluß auf die MHC I Expression
ausüben würde. Die Ergebnisse aus Kap. 3.4.2 zeigten jedoch keine direkte
Wechselwirkung zwischen einer transienten Überexpression von gp96 und der
Induktion der MHC I Oberflächenexpression in Hepa1.6 Zellen. Diese Ergebnisse
bekräftigen die Darstellungen von Randow und Seed, wonach eine Mutation des
Genlocus von gp96 in prä B Zellen zu keinem Effekt auf die H-kb Expression führte
(46).
Die Untersuchungen von Blachere könnten allerdings den Hinweis dafür geben, dass die
sehr starke Peptidbindung zwischen kurzkettigen Peptiden und gp96 dafür verantwortlich sind, dass sich die MHC I Expression nicht verändert hat, da sich die Peptide nicht
von gp96 loslösen können. Für die MHC I Peptidpräsentierung sind aber genau Peptide
mit 8 bis max. 10 Residuen erforderlich. Außerdem ist für eine MHC I Überexpression
eine vermehrte Peptidvermittlung notwendig (51).
Hier setzt auch der Ansatz von Nicchitta an, der die Frage aufwirft, ob eine solche
Bindungsaffinität überhaupt zur Antigenpräsentierung geeignet ist, wenn bereits die
Loslösung der Peptidbindung derart energieaufwendig ist (41). Auch die Tatsache, dass
die Halbwärtszeit von freien Peptiden im Cytosol der Zelle nur wenige Sekunden
beträgt, da diese von einer breiten Spektrum von Endo-und Exopeptidasen zu freien
Aminosäuren hydrolysiert werden (50), trägt in diesen Zusammenhang dazu bei, den
antitumoralen Effekt des gp96 auf andere Bereiche des Immunsystems zurückzuführen
DISKUSSION
47
(41). Auch ist es denkbar, dass nicht genügend Peptide als Substrate vorhanden waren,
wodurch nach der Michaelis Menton Gleichung keine weitere Hochregulierung von MHC
I auf der Zelloberoberfläche von Hepa1.6 Zellen stattfinden konnte, da u.U. ein
Missverhältnis zwischen Substrat und Liganden Menge besteht. Auch hierbei könnte die
sehr schnelle Abbaurate von Peptiden im Cytosol der Zelle eine Rolle spielen.
4.3 Überexpression von gp96 nach Ad5gp96 Infektion
Die gesteigerte Expressionsrate an gp96 nach Ad5gp96 Infektion konnte in mehreren
Zellreihen, wie die 911 Zellen, 293 embryonalen Nierenzellcarzinomzellen und Hepa1.6
Tumorzellen gezeigt werden (Kap 3.2 und 3.3). Die Expressionsrate fiel in allen
Zellreihen unterschiedlich stark aus. Am stärksten war diese in 911 Zellen zu beobachten. Bei 293 Zellen und Hepa1.6 Zellen fiel die Translationsrate annähernd gleich aus
und war schwächer ausgeprägt als bei 911 Zellen, trotz des CMV Promoters im Ad5gp96
Plasmid. Bei allen Zellen könnte, aufgrund des CMV Promoters, von einer deutlich höheren Expression an gp96 ausgegangen werden. Eine Erklärung, weshalb die gp96
Expression nicht deutlich prominenter ausgefallen ist, könnte die Tatsache sein, dass
gp96 im "Unfolded Protein Response"(UPR)-Weg involviert ist. Hierbei handelt es sich
um einen Reaktionsmechanismus der Zelle, bei dem die Zelle auf Stressituationen, die
zu einer Missfaltung und damit zur Accumulation von Proteinen im endoplasmatischen
Reticulum führen, mit der Induktion von Genen reagiert, die mit einer erhöhten
Expression von BiP, gp96 und Calreticulin einhergehen, also Chaperone, die sich im ER
befinden. Diese Zellantwort wird unter dem Überbegriff UPR zusammengefasst (24).
Die UPR ist somit ein Versuch der Zelle, der Störung der posttranslationalen
Modifikation, verursacht durch Stressbedingungen, wie z.B. Energiemangel nach
Hungerzuständen der Zelle, entgegenzuwirken (43). Dabei wird in der Zelle die
Translation generell in Folge des UPR herunter gefahren. Hierdurch gewinnt die Zelle
Zeit, um die missgebildeten Proteine über das Proteasom im Cytosol abzubauen (75).
Bei einer andauernden UPR, sprich wenn das Problem der Proteinfaltung nicht gelöst
werden kann, wird die Apoptose der Zelle ausgelöst (28). Die Reduzierung der
Proteinsynthese in Säugerzellen erfolgt über die vermehrte Phosphorylierung vom
Translations Initiations Faktor eIF2alpha (27). Die Phosphorylierung von eIF2alpha
widerum ist abhängig von der Aktivierung des in der ER Membran lokalisierten
Proteinkinase PERK. Somit ist es der Zelle möglich, in einer Stresssituation in der G1-
48
DISKUSSION
Phase zu verharren und damit den Zellzyklus zu stoppen. Hierdurch kann die Zelle Zeit
gewinnen, um entweder die Homeostase der Zelle wieder herzustellen oder die
Apoptose einzuleiten
(43). In diesem Zusammenhang könnte die Untersuchung des
Aktivierungszustandes des PERK bzw. der Phosphorylierungsgrad des eIF2alpha
Aufschluß darüber geben, ob die Induktion von gp96 von der Zelle nicht als ein UPR
Signal betrachtet wird und dadurch die gp96 Expressionsrate nicht deutlich stärker
ansteigen kann. Auch die MHC I Regulierung nach der Infektion von Ad5gp96 könnte
deshalb unverändert geblieben sein.
Diese Blockade der Protein-Biosynthese in der G1-Phase nach einer UPR-Auslösung
könnte auch einen Einfluß auf die MHC I Expression nach Ad5gp96 Infektion haben, da
die schwere Kette des MHC I ein biphasisches Expressionsmuster genau in der G1Phase hat (2).
Das MHC I Komplex ist aber in vielen soliden Tumoren herunter reguliert, wodurch die
Tumorzellen der Immunüberwachung durch T-Zell Erkennung entgehen (34). Über
die
Folgen
einer
Senkung
der
MHC
I
Oberflächenexpression
wurden
viele
Untersuchungen durchgeführt. Im Gegensatz dazu gibt es nur wenige Erkenntnisse
über den genauen Ablauf, wie es zu dieser Herunterregulierung von MHC I bei den
Tumorzellen kommt. Hierbei könnte dem UPR-System und dem gp96, abhängig von
dem Phosphorylierungsgrad des eIF2alpha, eine bedeutende Rolle zuteil werden.
4.4 Einsatzmöglichkeiten von Ad5gp96
Die
Möglichkeiten,
Ad5gp96
in
gentherapeutischen,
wie
auch
in
andere
Untersuchungsfelder einzusetzen, sind sehr vielfältig. Sie ergeben sich aus den
Eigenschaften des gp96 und dessen Involvierung in verschiedenste immunologische und
auch nicht-immunologische Prozesse, und der Möglichkeit einer gezielten Expression
durch einen adenoviralen Vektor. Dadurch wird gewährleistet, dass nach einer Ad5gp96
Infektion die gp96 Induktion nur in situ stattfinden kann, und die dadurch entstandenen
Effekte wären dann allein der gp96 Überexpression zuzusprechen. Somit wäre man in
der Lage, andere Wechselwirkungen, wie sie durch Proteinkontaminationen bei der elektrophoretischen Isolierung von gp96 entstehen könnten, zu vermeiden (48). Auch LPS
Kontaminationen könnten dann weitestgehend ausgeschlossen werden, da die gp96
Expression in der Zelle stattfindet (41). Zahlreiche Untersuchungen beruhen allerdings
auf der Verwendung von elektrophoretisch gereinigtem gp96 (55).
DISKUSSION
49
Die Frage, ob bei der Tumorrückbildung nach Gabe von gp96, welches aus
Tumormaterialien isoliert wurde, auf dessen Bindung von tumoreigenen Peptiden
beruht, wofür Srivastava einige sehr beeindruckende Daten gezeigt hat, oder ob nicht
andere Komponenten des Immunsystems hierfür in Betracht kommen, worauf sich die
Ergebnisse von Nicchitta stützen, könnten mit der Ad5gp96 Infektion von Mäusen nach
der Implantierung von Tumorgewebe, aus den oben genannten Gründen besser beurteilt werden. Bei diesen in vivo Versuch wäre es außerdem möglich, weitere
Zusammenhänge zwischen gp96 und andere Bestandteilen des Immunsystems zu
beleuchten. Hier könnten auch in vivo Untersuchungen bezüglich der Reifung von dentritischen Zellen durchgeführt werden, denn die gp96 Expression beeinflusst die TLR
Regulierung (46), die wiederum in Zusammenhang steht mit der Reifung von dentritischen Zellen (16). Eine direkte Aktivierung von dentritischen Zellen durch die Gabe von
gp96 über TLR 2/4 in vitro konnte bereits nachgewiesen werden (70). Weitere
Untersuchungen nach einer Infektion von Tumorzellen mit Ad5gp96 in Mäusen könnten
Hinweise auf ähnliche Mechanismen in vivo geben. Auch der potentielle Einfluß von
gp96 auf andere zelluläre Bestandteile des Immunsystems, wie die Natürlichen
Killerzellen, die eine Schlüsselrolle bei der Tumorverdrängung haben (68), könnten so
in vivo erfasst werden. Die Tatsache, dass die Gabe von gp96 zu einer erhöhten
Produktion von TNF alpha und INF gamma in peripheren lymphatischen Organen führt,
wäre ein Grund die Expression von MHC I auf den verschiedenen Immunzellen nach der
Ad5gp96 Infektion von Tumorzellen in Mäusen in vivo zu untersuchen (8).
Die Untersuchungen von M.L. Albert zeigen, dass MHC I auch mit Peptiden von sterbenden Zellen beladen werden, ohne zuvor eine cytosolische Prozessierung zu durchlaufen. Die Beladung könnte dabei über die Fusionierung des Phagosoms mit dem
endoplasmatischen Reticulum erfolgen (21). In Anlehnung an diese Ergebnisse könnte
hier eine weitere Involvierungen von gp96 in der MHC I Prozessierung in vitro untersucht werden. Dazu könnten mit Ad5gp96 infizierte Tumorzellen bestrahlt und anschließend mit DC´s inkubiert werden, um im Anschluß die MHC I Oberflächenexpression der
exponierten DC Zellen zu untersuchen. Hierüber könnten neue Erkenntnisse über die
Beteiligung von gp96 und Antigenpräsentierung gewonnen werden.
Auch die Wechselwirkungen zwischen dem UPR System und gp96, wie sie oben bereits
erläutert wurde, könnten näher erörtert werden. Somit ergeben sich für den neuen
Vektor Ad5gp96 eine Reihe interessante Untersuchungsfelder, die sich auch außerhalb
der Gentherapie befinden können.
50
ZUSAMMENFASSUNG
5. Zusammenfassung
Die immunomodulatorische Wirkung von gp96 und dessen Beteiligung an Prozessierung
über den MHC I Weg zur Präsentation von intrazellulären Antigenen sowie die
Auslösung antitumoralen Immunantwort durch die Assoziation von Antigenen mit gp96
sind in verschiedenen
experimentellen Arbeiten und Untersuchungen nachgewiesen
worden. In der vorliegenden Arbeit wurde die cDNA des gp96 in die adenovirale DNA
des Transfervektors mit den klassischen Verfahren der Molekularbiologie kloniert, um
einen adäquaten Gentransfer in hepatozellulären Tumorzellen wie Hepa1.6 zu ermöglichen und den Einfluß von verstärkter gp96 Expression auf die MHC I Expression zu
untersuchen.
Die Charakterisierung des neuen Transfervektors pAd-gp96 erfolgte in HEK-293. Nach
Transfektion zeigte sich eine deutlich gesteigerte Synthese des gp96 im Immunoblot.
Die Infektiosität der aus der Amplifikation hervorgegangenen Ad5gp96 Adenoviren
konnten an verschiedenen Zellinien (911-Zellen und die Hepa1.6 Zellen) nachgewiesen
werden.
Auch die Lokalisation der verstärkten gp96 Expression nach der Infektion mitAd5g96
in verschiedenen Zellreihen war durch die typische reticuläre Zeichnung in der
Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem endoplasmatichen Retikulum vereinbar. Die
Differenz der Fluoreszenzintensität zwischen den Ad5gp96 infizierten und nichtinfizierten Zellen fiel bei 911-Zellen deutlich stärker aus als bei Hepa1.6 Zellen.
Der mögliche Effekt der gp96 Überexpression auf die MHC I Oberflächenexpression
wurde durchflußzytometrisch untersucht.
Nach Interferon gamma war eine deutliche Induzierbarkeit des MHC I bei Hepa1.6
Zellen festzustellen, die erwartungsgemäß auch erheblich stärker ausfällt als nach
Interferon alpha Induktion. Die weiteren Untersuchungen nach der Infektion von
Hepa1.6 Zellen mit Ad5gp96 Adenoviren zeigen jedoch im Vergleich zu der Interferon
gamma stimulierten Hepa1.6 Zellen keine gesteigerte Expression des MHC I
Oberflächenmolküls. Die Untersuchungen weisen somit darauf hin, dass eine isolierte
gp96 Überexpression keinen Einfluß auf die Induzierbarkeit von MHC I ausübt. Dennoch
bleibt es weiteren Untersuchungen vorbehalten, ob hierfür nicht auch andere Ursachen
in Frage kommen wie z.B. die Tatsache, dass es aufgrund der starken Assoziation zwischen kleinen Peptiden und gp96 es nicht zur ausreichenden Dissoziation kommt, um
eine vermehrte Peptidvermittlung zu erzielen und damit eine verstärkte MHC I
Expression zu induzieren.
LITERATUR
51
6. Literatur
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DANKSAGUNG
58
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. L. Mohr für die sehr gute Betreuung und
Unterstützung, sowie für die Erstellung des Erstgutachtens und die Korrektur der
Dissertation.
Bei Herrn Prof. Dr. C. Schlensak bedanke ich mich herzlich für die Übernahme des
Zweitgutachtens.
Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. H. E. Blum danke ich für die Möglichkeit in
seiner Abteilung zu promovieren.
Herrn Dr. rer. nat. J. Knauber danke ich für das Korrekturlesen der Arbeit.
Ein ganz besonderes Dankeschön geht an meine Lebensgefährtin, die mich mit großer
Geduld und Zuspruch durch die letzten Jahre und diese Arbeit hindurch begleitet hat.
Ein besonderer Dank gilt auch meiner Familie und meinen Freunden, die durch ihre
humorvolle Art und aufmunternden Worte auf besondere Weise zum Gelingen der
Arbeit beigetragen haben.
LEBENSLAUF
Die Seite 59 (Lebenslauf) enthalten persönliche Daten. Sie sind deshalb
nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.
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